STANOVENÍ LIPIDŮ A ZASTOUPENÍ MASTNÝCH KYSELIN V OBILCE JEČMENE

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

STANOVENÍ LIPIDŮ A ZASTOUPENÍ MASTNÝCH KYSELIN V OBILCE JEČMENE DETERMINATION OF LIPIDS AND FATTY ACID PROFILE IN A BARLEY CARYOPSIS

DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS

AUTOR PRÁCE

Bc. JANA CVRKOVÁ

AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR

BRNO 2010

Ing. ZDENĚK SVOBODA

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání diplomové práce Číslo diplomové práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:

FCH-DIP0343/2009 Akademický rok: 2009/2010 Ústav chemie potravin a biotechnologií Bc. Jana Cvrková Chemie a technologie potravin (N2901) Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010) Ing. Zdeněk Svoboda doc. RNDr. Ivana Márová, CSc.

Název diplomové práce: Stanovení lipidů a zastoupení mastných kyselin v obilce ječmene

Zadání diplomové práce: 1. Zpracování literární rešerše zaměřené na: a) Metabolismus mastných kyselin v obilce ječmene b) Možnosti stanovení lipidů a mastných kyselin v obilce ječmene 2. Optimalizace extrakce lipidů z obilky ječmene 3. Optimalizace stanovení profilu mastných kyselin v obilce ječmene 4. Stanovení lipidů a zastoupení mastných kyselin různých odrůdách ječmene

Termín odevzdání diplomové práce: 14.5.2010 Diplomová práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce.

----------------------Bc. Jana Cvrková Student(ka)

V Brně, dne 1.12.2009

----------------------Ing. Zdeněk Svoboda Vedoucí práce

----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Diplomová práce se zabývá stanovením obsahu lipidů a profilu mastných kyselin v obilce ječmene (Hordeum vulgare). V teoretické části je popsána syntéza mastných kyselin a jejich degradace v rostlinném materiálu, dále pak možnosti extrakce lipidů a jejich stanovení, a možnosti stanovení mastných kyselin. V experimentální části byla optimalizována metoda extrakce lipidů na automatickém extraktoru Fex®IKA a stanovení mastných kyselin metodou GC-FID. Pro analýzu mastných kyselin zde byly porovnávány dvě kapilární kolony SLB-IL 100 a Supelcowax. Na základě obsahu lipidů a zastoupení mastných kyselin v obilce ječmene bylo srovnáváno dvacet odrůd ječmene z ročníku 2008 a dvacet odrůd ječmene z ročníku 2009. Diplomová práce byla realizována ve Výzkumném ústavu pivovarském a sladařském a. s. v Brně.

ABSTRACT The diploma thesis deals with the determination of lipids and fatty acid profile in a barley caryopsis.(Hordeum vulgare). The theoretical part describes the synthesis of fatty acids and their degradation in plant material, secondly, it described the possibilities of lipid extraction and their determination and the possibilities of determination of fatty acids. In the experimental part method of lipid extraction on automated extractor Fex®IKA and determination of fatty acids by GC-FID were optimized. For analysis of fatty acids two capillary columns SLB-IL 100 and Supelcowax were compared. Twenty varieties of barley from the year 2008 and twenty varieties from the year 2009 were compared based on the content of lipids and the representation of fatty acids in a barley caryopsis. The diploma thesis was realized in the Research Institute of Brewing and Malting, Plc. in Brno.

KLÍČOVÁ SLOVA Mastné kyseliny,lipidy, extrakce lipidů, plynová chromatogrfie, ječmen

KEYWORDS Fatty acid, lipids, extraction of lipids, gas chromatogrphy, barley

3

CVRKOVÁ, J. Stanovení lipidů a zastoupení mastných kyselin v obilce ječmene. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2010. 62 s. Vedoucí diplomové práce Ing. Zdeněk Svoboda.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana FCH VUT.

…….………………….. podpis studentky

PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Zdeňkovi Svobodovi za trpělivost, vstřícnost a odborné vedení při realizaci této práce. Dále děkuji zaměstnancům Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského v Brně a konzultantce doc. RNDr. Ivaně Márové, CSc, za ochotu a cenné rady. Bc. Jana Cvrková

4

OBSAH 1

ÚVOD ........................................................................................................................................................... 7

2

TEORETICKÁ ČÁST ................................................................................................................................ 8 2.1

LIPIDY A MASTNÉ KYSELINY ................................................................................................................. 8

2.1.1

Lipidy .............................................................................................................................................. 8

2.1.2

Mastné kyseliny ............................................................................................................................... 8

2.2

JEČMEN............................................................................................................................................... 10

2.3

METABOLISMUS LIPIDŮ V ROSTLINÁCH .............................................................................................. 10

2.3.1

Biosyntéza mastných kyselin v rostlinách...................................................................................... 11

2.3.2

Biosyntéza triacylglycerolů rostlin................................................................................................ 14

2.4

ODBOURÁNÍ MASTNÝCH KYSELIN ....................................................................................................... 14

2.4.1 2.4.2 2.5

Degradace lipidů v semenech rostlin lipázami a lipoxygenásou................................................... 16 MOŽNOSTI STANOVENÍ LIPIDŮ ............................................................................................................ 17

2.5.1

Příprava vzorků před extrakcí lipidů ............................................................................................ 17

2.5.2

Extrakce lipidů z různých vzorků................................................................................................... 18

2.5.2.1

Extrakce podle Folshe ......................................................................................................................... 18

2.5.2.2

Soxhletova metoda stanovení lipidů.................................................................................................... 19

2.5.2.3

Soxtec.................................................................................................................................................. 19

2.5.2.4

ANKOM XT10 Extraktor....................................................................................................................... 19

2.5.2.5

MAE – Extrakce pomocí mikrovln...................................................................................................... 20

2.5.2.6

SPE – extrakce na pevné fázi .............................................................................................................. 20

2.5.2.7

SFE – Suprkritická fluidní extrakce .................................................................................................... 21

2.5.2.8

Fex® IKA extrakce............................................................................................................................... 21

2.5.3

Analytická separace a identifikace/kvantifikace lipidů ................................................................. 22

2.5.3.1

Chromatografické metody ................................................................................................................... 23

2.5.3.2

Hmotnostní spektrometrie ................................................................................................................... 23

2.5.3.3

Nukleární magnetická rezonance - NMR ............................................................................................ 25

2.6

MOŽNOSTI STANOVENÍ MASTNÝCH KYSELIN ...................................................................................... 25

2.6.1

Možnosti přípravy methylesterů mastných kyselin (FAME) .......................................................... 26

2.6.1.1

Kysele katalyzovaná esterifikace a transesterifikace ........................................................................... 26

2.6.1.2

Bazicky katalyzovaná esterifikace a transesterifikace ......................................................................... 27

2.6.2

3

β-oxidace mastných kyselin a glyoxalátový cyklus v rostlinných semenech.................................. 14

Stanovení methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií ............................................. 27

2.6.2.1

Nástřikový systém ............................................................................................................................... 27

2.6.2.2

Chromatografická kolona .................................................................................................................... 28

2.6.2.3

Detektory pro plynovou chromatografii .............................................................................................. 28

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .................................................................................................................... 30 3.1

VZORKY JEČMENŮ .............................................................................................................................. 30

3.2

POUŽITÉ LABORATORNÍ VYBAVENÍ A CHEMIKÁLIE ............................................................................. 30

3.2.1

Laboratorní přístroje a pomůcky .................................................................................................. 30

3.2.2

Chemikálie .................................................................................................................................... 31

3.2.3

Plyny.............................................................................................................................................. 31

3.3

PRACOVNÍ POSTUP STANOVENÍ LIPIDŮ ................................................................................................ 31

3.4

PRACOVNÍ POSTUP PŘÍPRAVY METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN................................................... 32

5

3.5

ANALÝZA METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN (FAME) METODOU GC-FID ................................... 32

3.6

VALIDACE METODY ............................................................................................................................ 32

3.6.1

4

Validace ........................................................................................................................................ 32

3.6.2

Opakovatelnost.............................................................................................................................. 33

3.6.3

Linearita........................................................................................................................................ 33

3.6.4

Mez deekce (LOD - limit of detection) .......................................................................................... 33

3.6.5

Mez stanovitelnosti (LOQ – limit of quantification)...................................................................... 33

3.6.6

Statistické vyhodnocení naměřených dat....................................................................................... 33

3.6.6.1

Aritmetický průměr ............................................................................................................................. 33

3.6.6.2

Směrodatná odchylka .......................................................................................................................... 34

3.6.6.3

Relativní směrodatná odchylka ........................................................................................................... 34

VÝSLEDKY A DISKUZE ........................................................................................................................ 35 4.1

OPTIMALIZACE EXTRAKCE PRO STANOVENÍ OBSAHU LIPIDŮ V OBILCE JEČMENE ................................ 35

4.1.1

Optimalizace množství extrakčního rozpouštědla ......................................................................... 35

4.1.2

Optimalizace doby trvání cyklu..................................................................................................... 35

4.1.3

Optimalizace počtu cyklů .............................................................................................................. 35

4.2

VALIDAČNÍ PARAMETRY – OPAKOVATELNOST EXTRAKCE .................................................................. 36

4.3

OPTIMALIZACE STANOVENÍ PROFILU MASTNÝCH KYSELIN V OBILCE JEČMENE ................................... 36

4.3.1 4.3.2 4.4

Výběr kolony.................................................................................................................................. 36 Optimalizace metody GC-FID....................................................................................................... 39 VALIDAČNÍ PARAMETRY METODY GC-FID ........................................................................................ 39

4.4.1

Opakovatelnost.............................................................................................................................. 39

4.4.2

Mez detekce a mez stanovitelnosti................................................................................................. 39

4.4.3

Linearita........................................................................................................................................ 41

4.5

STANOVENÍ OBSAHU LIPIDŮ V RŮZNÝCH ODRŮDÁCH JEČMENE.......................................................... 43

4.6

STANOVENÍ PROFILU MASTNÝCH KYSELIN V OBILCE JEČMENE ........................................................... 44

5

ZÁVĚR ....................................................................................................................................................... 47

6

LITERATURA .......................................................................................................................................... 48

7

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ...................................................................................................... 51

8

PŘÍLOHY .................................................................................................................................................. 53

6

1

ÚVOD

Ječmen je hlavní surovinou pro výrobu sladu a následně piva. Mastné kyseliny obsažené v obilce ječmene jsou důležitým zdrojem chuťových a vonných látek v pivu. Oxidace nenasycených mastných kyselin (zejména kyseliny linolenové) v ječmenu vede k tvorbě hydroperoxidů, které pak podléhají dalším reakcím a nakonec vedou k těkavým, vysoce aromaticky aktivním aldehydům, jako je trans-2-nonenal, který způsobuje lepenkovou chuť piva. Tato oxidace je způsobena především účinkem enzymu lipoxygenasy. Stanovení obsahu lipidů a profilu mastných kyselin v obilce ječmene je důležité pro zjištění přítomnosti a obsahu mastných kyselin podléhajících oxidaci, které jsou prekurzorem senzoricky aktivních látek. Pro stanovení obsahu lipidů v obilce ječmene je nejpoužívanějším způsobem izolace extrakce, přičemž je využíváno jak konvenčních metod extrakce (dle Soxhleta, Folche), tak i moderních metod (SFE, SPE, extrakce na fluidním loži). Ke stanovení profilu mastných kyselin se nejvíce využívá plynové chromatografie s různými detektory, nejčastěji s plamenově-ionizačním detektorem nebo s hmotnostním spektrometrem. Cílem diplomové práce bylo zpracování rešerže zaměřené na metabolismus mastných kyselin v obilce ječmene a možnosti stanovení lipidů a mastných kyselin v obilce ječmene. Dalším cílem bylo optimalizovat metodu extrakce lipidů a stanovení profilu mastných kyselin z obilky ječmene. Po optimalizaci obou metod byl stanoven obsah lipidů a zastoupení mastných kyselin v různých odrůdách ječmene.

7

2

TEORETICKÁ ČÁST

2.1 Lipidy a mastné kyseliny Lipidy (z řeckého lipos - tuk) jsou různorodou skupinou látek biologického původu, které jsou velmi málo polární. Jsou nerozpustné ve vodě, ale rozpouští se v nepolárních rozpouštědlech. Patří mezi ně různé tuky, oleje, některé vitamíny, hormony a nebílkovinné složky membrán [4]. Lipidy jsou důležitou součástí výživy všech organismů. Slouží především jako zdroj energie. Mají také funkci ochrannou. Například vosk tvoří ochranný film na listech rostlin, který je chrání před vysušením a mikrobiologickým napadením. Mastné kyseliny jsou nedílnou součástí lipidů, dodávají jim mastnou, olejovou nebo voskovou povahu [3]. Jsou také bohatým zdrojem aromatických látek. 2.1.1 Lipidy Lipidy jsou definovány jako přírodní sloučeniny obsahující esterově vázané mastné kyseliny o více než třech atomech uhlíku v molekule [1] (Obr. 2.1.1). Podle chemického složení se lipidy řadí do třech tříd: 1) homolipidy – sloučeniny mastných kyselin a alkoholu 2) heterolipidy – kromě mastných kyselin a alkoholu obsahují další kovalentně vázané sloučeniny (např. kys. fosforečná ve fosfolipidech) 3) komplexní lipidy – homolipidy, heterolipidy, kromě kovalentních vazeb obsahují i vazby fyzikální (např. vodíkové můstky, hydrofobní interakce) [1, 2].

Obr. 2.1.1 Obecný vzorec triglyceridu; R = acyl MK Dále se můžou lipidy dělit na polární a neutrální. K neutrálním lipidům patří estery glycerolu (acylglyceroly), steroly a jejich estery a volné mastné kyseliny. Polární lipidy zahrnují fosfolipidy a další heterolipidy. Tento systém dělení je založen hlavně na chování sloučenin při chromatografickém dělení [1]. 2.1.2 Mastné kyseliny Mastné kyseliny jsou alifatické monokarboxylové kyseliny s dlouhým, až na výjimky nevětveným řetězcem, tvořeným většinou 4 až 26 atomy uhlíku. V přírodě bylo nalezeno více než 50 různých mastných kyselin. Přírodní mastné kyseliny jsou tvořeny především sudým počtem atomů uhlíku [3].

8

Podle charakteru vazeb se mastné kyseliny dělí na: • nasycené mastné kyseliny Jsou běžnou složkou přírodních lipidů. Tvoří zpravidla rovný, nerozvětvený řetězec, nejčastěji o sudém počtu atomů uhlíku. V lipidech potravin jsou hlavními kyselinami palmitová a stearová (Obr. 2.1.2).

Obr. 2.1.2 Vzorec kyseliny stearové •

nenasycené mastné kyselin s jednou dvojnou vazbou (monoenové)

Liší se navzájem podle počtu atomů uhlíku, polohy dvojné vazby a její prostorové konfigurace, která bývá u přirozených sloučenin zpravidla cis, méně často trans [1]. První dvojná vazba se zpravidla objevuje mezi atomy uhlíku C9 a C10 [4]. Nejvýznamnější z nich jsou kyseliny olejová, palmitolejová, eruková atd. (Obr. 2.1.3).

Obr. 2.1.3 Vzorec kyseliny olejové •

nenasycené mastné kyseliny s několika dvojnými vazbami (polyenové)

U polyenových mastných kyselin existují také polohové i prostorové isomery. Zvláštní význam mají mastné kyseliny s konjugovanými vazbami (kyselina linolová), které mají antikarcinogenní účinky (Obr. 2.1.4). Méně se vyskytují mastné kyseliny s třemi až šesti dvojnými vazbami. Mezi nejvýznamnější patří kyselina linolenová (3 dvojné vazby), arachidonová (4 dvojné vazby) a EPA (eikosapentaenová, 5 dvojných vazeb).

Obr. 2.1.4 Vzorec kyseliny linolové •

mastné kyseliny s trojnými vazbami a s různými substituenty (rozvětvené, cyklické, s kyslíkatými, sirnými nebo dusíkatými funkčními skupinami)

Tyto mastné kyseliny jsou ve srovnání s předchozími v potravinářství i ve výživě méně důležité [1].

9

2.2 Ječmen Ječmen setý (Hordeum vulgare L.) je jednou z nejstarších kulturních rostlin (Obr. 2.2.1). Pochází z území dnešní Etiopie, odkud se rozšiřoval do celého světa. Ve střední Evropě se ječmen dvouřadý pěstoval již od 3. tisíciletí př. n. l. [20]. Botanicky patří ječmen do čeledi lipnicovitých trav. Je to jednoletá ozimá rostlina, vysoká 70 – 120 cm s dutým stéblem, děleným na 5 – 7 článků. Všechny kulturní ječmeny se řadí pod druh ječmen setý (Hordeum vulgare) a dělí se na dva typy – dvouřadý a víceřadý. V našich podmínkách se pěstují převážně jarní formy dvouřadého ječmene [20, 21]. Obilka ječmene Obilka ječmene je žlutá, většinou pluchatá, ale existují i nahé, bezpluché formy. Víceřadé ječmeny mají obilky delší, hrubé a nepravidelné, obě krajní obilky klásku jsou prohnuté. Obilky dvouřadého ječmene jsou širší a pravidelné. Obilky obsahují 8-16 % bílkovin, 60 – 70 % sacharidů, 1 – 3 % tuků, 3 – 5 % vlákniny a 2 – 3 % popelovin [21].

Obr. 2.2.1 Hordeum vulgare[22]

2.3 Metabolismus lipidů v rostlinách Lipidy jsou podstatnou složkou ve všech rostlinných buňkách. Vegetativní buňky rostlin obsahují 5 – 10 % lipidů v sušině. Tyto lipidy jsou z velké části obsaženy v membránách buněk, tvořených fosfolipidovou dvojvrstvou. Membrány tvoří hlavní bariéru buněk, která je dělí od okolního prostředí. Jsou také prostředím pro mnoho významných procesů, včetně sběru světla, transportu elektronů a fotosyntézy. Triacylglycerolová struktura (všechny tři pozice glycerolu jsou esterifikované s MK) není vhodná pro tvorbu membrán, ale představuje hlavní formu ukládání lipidů v semenech mnoha rostlin. Tyto lipidy tvoří více než 60 % jejich sušiny. Epidermální buňky (buňky krycích pletiv) obsahují kutikulární lipidy, které poskytují hydrofobní bariéru rostlin, která zabraňuje ztrátám vody a je určitou formou ochrany vůči patogenům a nežádoucím enviromentálním podmínkám.

10

Menší množství mastných kyselin slouží jako prekurzory rostlinných hormonů (jasmonová kyselina) a k acylaci některých membránových proteinů. Lipidy jsou strukturně velice rozdílné sloučeniny, a proto i biosyntetické dráhy jsou rozdílné. 2.3.1 Biosyntéza mastných kyselin v rostlinách Biosyntéza mastných kyselin je primární metabolickou dráhou, protože se nachází v každé buňce rostliny, a je nezbytná pro její růst. Inhibice syntézy mastných kyselin je pro buňku letální. Hlavními mastnými kyselinami rostlin jsou ty, které mají řetězec dlouhý především 16 nebo 18 atomů uhlíku a mají jednu až tři cis dvojné vazby. Mastné kyseliny se v buňkách téměř nikdy nevyskytují jako volné mastné kyseliny. V membránách se vyskytují převážně ve formě esterů glycerolu (glycerolipidy). Hlavním místem syntézy MK u rostlin jsou plastidy. V tomto ohledu je proces biosyntézy lipidů v rostlinách v zásadě odlišný od syntézy lipidů u živočichů a hub, které produkují MK především v cytosolu. Tím, že je syntéza MK lokalizovaná v plastidech, musí mít rostliny určité mechanismy k transportu MK z plastidů do jiných míst v buňce. Všechny atomy uhlíku, které se nachází v mastných kyselinách, jsou odvozeny od acetyl-koenzymu A (acetyl-CoA) přítomného v plastidech. Koncentrace acetyl-CoA v chloroplastech je asi 30 – 50 µmol, což je dostačující pro syntézu MK jen na pár vteřin. Nicméně asociace (nashromáždění) acetyl-CoA zůstává relativně konstantní, jak při světelné fázi, tak i při fázi temné[5]. Acetyl-CoA může být tvořen v plastidech různými reakcemi, ale přesný podíl acetyl-CoA z každé reakce se stále diskutuje. Připouští se ale, že velká část z acetyl-CoA je odvozena od glukózy-6-fosfátu a z pyruvátu (respektive fosofenolpyruvátu), který je transportován z cytoplasmy do plastidů (Obr. 2.3.1) [6]. První reakcí biosyntézy MK je tvorba malonyl-CoA z acetyl-CoA a CO2 (Obr. 2.3.2) za katalýzy acetyl-CoA karboxylasy. Tato reakce probíhá ve dvou krocích, které jsou katalyzované jediným enzymovým komplexem. Acetyl-CoA karboxylasa obsahuje dvě podjednotky, na každou z nich je kovalentně k lysinovým zbytkům proteinu přes ε-aminokyselinu navázán biotin, který má v tomto případě funkci nosiče CO2. Tento enzym určuje rychlost biosyntézy MK a jeho aktivita je regulována. Aktivovaný CO2 je transportován biotinem k acetyl CoA a tím je syntetizován malonyl-CoA [5, 8].

11

Obr. 2.3.1 Dráhy pro plastidovou syntézu škrobu a mastných kyselin z prekurzorů v cytosolu [7]

Obr. 2.3.2 Biosyntéza malonyl-CoA; Enz = enzym acetyl-CoA karboxylasa [9] Acetyl-CoA vstupuje do biosyntetické dráhy nejen jako substrát pro acetyl-CoA karboxylasu, ale také jako iniciátor kondenzační reakce (Obr. 2.3.3; reakce 3). Přenos malonylu od CoA za tvorby malonyl-ACP, který je donorem uhlíkových atomů pro všechny následné elongační reakce, je katalyzován malonyl CoA:ACP (acyl carrier protein) transacylasou (Obr. 2.3.3; reakce 2). Po každé kondenzaci, za tvorby 3-ketoacyl-ACP,

12

následuje redukce, dehydratace a opět redukce, za katalýzy 3-ketoacyl-ACP reduktasy, 3-hydroxyacyl-ACP dehydratasy a enoyl-ACP reduktasy (Obr. 2.3.3; reakce 4, 5, 6)

Obr. 2.3.3 Reakce biosyntézy nasycených MK [5]

Obr. 2.3.4 Desaturace MK [8] 13

Po dalších šesti obrátkách v cyklu vzniká primárně palmitát. Prodlužování mastných kyselin je ukončeno, když je ACP oddělen od acylové skupiny [4,5]. Pro vznik různě dlouhých, nasycených i nenasycených MK, je využíváno různých kombinací desaturačních a kondenzačních reakcí (Obr. 2.3.4). 2.3.2 Biosyntéza triacylglycerolů rostlin Molekuly triacylglycerolů jsou syntetizovány v tukových buňkách savců i rostlin z L-glycerol-3-fosfátu a esterů acyl-CoA. Zdrojem pro tvorbu L-glycerol-3-fosfátu je redukovaný dihydroxyacetonfosfát NAD+-dependentní glycerolfosfátdehydrogenasou. Dihydroxyacetonfosfát pochází z glykolýzy. Složení mastných kyselin v molekule triacylglycerolu v rostlinných druzích závisí na přírodních podmínkách, především na teplotě. Obecným pravidlem je, že rostliny v chladném klimatu produkují vyšší poměr nenasycených mastných kyselin [23].

2.4 Odbourání mastných kyselin K degradaci mastných kyselin ve většině organismů dochází především prostřednictvím β-oxidace. U savců dochází k β-oxidaci v mitochondriích a v peroxisomech. U rostlin a hub jsou hlavním místem β-oxidace mastných kyselin peroxisomy, kde jsou snadno oxidovány mastné kyseliny s dlouhým řetězcem [9,16]. Peroxisomy jsou organely přítomné v buňce přibližně jeden týden během klíčení [18]. Jsou to sférické organely specializované na oxidační reakce. Peroxisomy se rovněž podílejí na metabolismu tuků a účastní se části fotorespiračního cyklu. Dalším typem mikrotělísek jsou glyoxysomy, které obsahují enzymy glyoxylatové dráhy konvertující mastné kyseliny na cukry. Např. isocytrátlyasa a malátsyntasa umožňují rašícím semenům převádět jejich triacylglyceroly přes acetyl-CoA na glukózu, čímž je poskytnuta energie nutná pro růst [17]. Mastné kyseliny prochází β-oxidací za vzniku acetyl-CoA, který potom může být inkorporován do zásobních sacharidů přes glyoxalátový cyklus. Tyto metabolické dráhy jsou nezbytné k udržení glukoneogenese iniciované degradací rezervních nebo strukturálních lipidů. 2.4.1 β-oxidace mastných kyselin a glyoxalátový cyklus v rostlinných semenech V glyoxysomech jsou mastné kyseliny degradovány cestou β-oxidace na acetyl-CoA, který je v glyoxalátovém cyklu metabolizován na sukcinát přes dekarboxylační krok v citrátovém cyklu. Sukcinát je potom použit pro glukoneogenezi nebo syntézu dalších metabolických meziproduktů. Glyoxyzomální β-oxidace mastných kyselin je opakující se sekvence čtyř reakcí: oxidace (dehydrogenace) acyl-CoA oxidasou (AO), hydratace enoyl-CoA hydratasou kombinovanou s druhou oxidací 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenasou a na konec thiolýza 3-ketoacyl-CoA thiolasou (TH). FAD spojený s acyl-CoA oxidasou nepřenáší elektrony do dýchacího řetězce, ale přímo ke kyslíku, bez znovuzískání chemické energie (ATP). Kyslík je redukován na peroxid vodíku, který je postupně rozložen katalázou (CAT). Dehydrogenasa produkuje NADH2 a thiolasa používá CoA k přenosu posledních dvou uhlíkových atomů z 3-ketoacylCoA za tvorby acyl-CoA (Obr. 2.4.1).

14

Když jsou zásobní lipidy metabolizovány během klíčení, acetyl-CoA produkovaný v β- oxidaci v glyoxysomech je přenesen do glyoxalátového cyklu, který může být považován za anabolickou variantu citrátového cyklu. Glyoxalátový cyklus převádí dvě molekuly acetyl-CoA na jednu molekulu sukcinátu. Glyoxalátovy cyklus zahrnuje dva specifické enzymy, jmenovitě isocitrát lyasu (IL) a malát syntasu (MS) a tři enzymy se stejnou aktivitou jako v Krebsově cyklu – citrátsyntasu (CS), akonitasu (AC) a malát dehydrogenasu (MD). Každá obrátka cyklu zahrnuje začlenění dvou dvouuhlíkatých molekul a výsledkem je čtyřuhlíkatá molekula, sukcinát. Ten je transportován z glyoxysomu do mitochondrie, kde je konvertován přes Krebsův cyklus na oxalacetát, který je pak snadno využit v glukoneogenezi (Obr. 2.4.1). Redukované kofaktory produkované během β-oxidace a glyoxalátového cyklu, NADH2 a FADH2, nemají přímý přístup do mitochondriálního elektron-transportního systému. Proto musí být reoxidovány postupně pro obě dráhy, aby si zachovali svoji funkci. Acyl-CoA oxidasa dovolí, aby elektrony byly přeneseny přímo na kyslík, což vede ke vzniku peroxidu vodíku. Peroxid vodíku je rozložen buď katalasou (CAT) uvnitř glyoxysomu nebo askorbát-specifickou peroxidasou (AP) a askorbát reduktázou (AR). Regenerace askorbátu je dosažena použitím NADH2 jako donoru elektronu. Výsledkem glyoxosomálního metabolismu je produkce různých reaktivních druhů jako jsou O2-·, H2O2 a askorbát volný radikál. Zároveň glyoxysomy obsahují vhodné detoxikační enzymy, jako je katalasa a enzymy (AP a AR) umístěné v membránách, které mohou chránit proti buněčnému poškození [19].

Obr. 2.4.1 β-oxidace a glyoxalátový cyklus v glyoxysomech; Asc – askorbát, Asc·-askorbát volný radikál [19]

15

2.4.2 Degradace lipidů v semenech rostlin lipázami a lipoxygenásou Rostlinná semena obsahují dva typy lipidů: zásobní a funkční. Zásobní lipidy, speciálně triglyceridy slouží jako zásobárna energie při mobilizaci specifických enzymů při „zranění“, nákaze a dalších stresujících faktorech nebo při klíčení. Když jsou semena poškozena nesprávným skladováním nebo jsou vystaveny určitým mikroorganismům, může dojít k degradačním reakcím lipidů. Tyto reakce mohou být katalyzovány jejich vlastními endogenními enzymy nebo enzymy mikroorganismů v závislosti na enviromentálních podmínkách a/nebo výrazném poškození. Lipasa a lipoxygenasa jsou dva hlavní enzymy ovlivňující degradaci lipidů v semenech. Hydrolýza triglyceridů je katalyzována lipasami, které jsou všudypřítomné. Mezi nepříznivé efekty patří především změny v chuti a aroma potravin, rostoucí acidita olejů a uvolnění nenasycených mastných kyselin, které jsou oxidovány lipoxygenasami. Lipoxygenasa je specifická v tom, že reaguje jen s cis, cis-1,4-pentadiennovou strukturou, jako je linolová, linolenová nebo arachidonová kyselina, degraduje je buď na volné kyseliny, triglyceridy nebo methyl (ethyl) estery. Primární produkty jsou opticky aktivní cis-trans-konjugované hydroperoxidy. Tyto hydroperoxidy jsou tvořeny radikálovým mechanismem a jsou buď rozloženy, nebo dále oxidovány na sekundární produkty jako jsou alkoholy, kyseliny, ketony a/nebo aldehydy, které mohou nepříznivě ovlivnit nutriční hodnotu, aroma, chuť a kvalitu potraviny (Obr. 2.4.2) [26] . V uskladněném pivu je základní složkou podílející se na žluklé chuti aldehyd trans-2-nonenal. Mechanismus tvorby trans-2-nonenalu v pivu je enzymatická nebo nenezymatická oxidace a oxidace volných mastných kyselin, kde svou roli sehrává právě lipoxygenasa [27].

Obr. 2.4.2 Produkty oxidace mastných kyselin; LOX = lipoxygenasa, DES = divinylether syntasa, POX = peroxygenasa, HPL = hydroperoxid lyasa, EAS = epoxy alkohol syntasa, AOS = allen oxid syntasa

16

2.5 Možnosti stanovení lipidů Při analýze potravin stačí často stanovit celkové množství lipidů. Zpravidla se používá některá standardizovaná metoda pro příslušný materiál, nebo pro rychlé rutinní stanovení se volí některé fyzikální metody [10]. Pro stanovení složení lipidové fáze se většinou musí lipidy izolovat šetrnějšími postupy než při stanovení celkových lipidů a extrakt se frakcionuje různými chromatografickými metodami. Složení fází se pak zjistí vhodnými mikrometodami [2]. V zásadě analytický postup pro stanovení jednotlivých lipidových sloučenin zahrnuje tři základní kroky: 1) extrakce ze vzorku 2) analytická separace 3) identifikace a kvantifikace (Obr. 2.5.1) [24].

Obr. 2.5.1 Různé kroky v analýze lipidů z různých vzorků a techniky, které můžeme použít [24]. LLE – liquid-liquid extrakce; SPE – extrakce na pevné fázi; SFE – superkritická fluidní extrakce; MAE – extrakce pomocí mikrovln; PFE – přetlaková fluidní extrakce 2.5.1 Příprava vzorků před extrakcí lipidů Jako u každé chemické analýzy je vlastní vzorkování a uchování vzorku podstatným krokem pro získání správných výsledků. Ideální vzorek by měl mít identické vlastnosti ve všech částech materiálu, ze kterého je odebírán. V praxi je dostačující, když vlastnosti vzorku odpovídají větší části materiálu podle povahy testu. Příprava vzorku pro analýzu lipidů závisí na typu potraviny a povaze lipidů. Extrakce lipidů ze vzorku by měla

17

být provedena co nejdříve, aby se minimalizovaly následné změny. Okamžitá extrakce není vždy možná, proto je nutné uchovávat vzorky při nízkých teplotách v uzavřených nádobách. Schopnost vyextrahovat lipidy z vysušeného vzorku také závisí na velikosti částic. Proto zmenšení velikosti částic zvětšuje plochu, která umožňuje těsnější kontakt s rozpouštědlem a tím zvyšuje množství vyextrahovaných lipidů (např. pomletí obilnin před extrakcí). Při mletí by nemělo docházet ke ztrátám vlhkosti ani tuku ze vzorku. V některých případech se vzorek homogenizuje přímo s extrakčním rozpouštědlem (nebo systémem rozpouštědel). Ke zvýšení množství vyextrahovaných lipidů z potravinové matrice je často před extrakcí potřeba použít kyselou nebo alkalickou hydrolýzu. Tato hydrolýza je určena k rozrušení kovalentních a iontových vazeb lipidů s proteiny a sacharidy a stejně tak k zastavení tvorby tukových emulzí. [25,28] 2.5.2 Extrakce lipidů z různých vzorků Materiál, z něhož složku extrahujeme, se musí obvykle rozmělnit. Rozpouštědlo většinou volíme tak, aby se v něm co nejselektivněji rozpouštěla složka, kterou chceme izolovat [11]. Pro řadu případů stačí metoda podle Soxhleta (a jeho modifikace) s použitím různých rozpouštědel jako jsou hexan, petrolether, dithylether nebo chloroform. Rozpouštědla se musí odstraňovat při teplotě do 60 °C za sníženého tlaku, aby nedošlo k rozkladu extraktu [2]. Ideální metoda extrakce tuhých vzorků by měla být rychlá, jednoduchá, levná a výtěžnost analytů kvantitativní bez jejich ztráty a degradace. Nevýhodou „klasické“ extrakce tuhé matrice kapalnými rozpouštědly je dlouhá doba extrakce (několik hodin až dnů) a nutnost používat vysoce čistá rozpouštědla, která jsou mnohdy zdravotně závadná a dochází obvykle k jejich úniku do životního prostředí [12]. Složení lipidového extraktu závisí na způsobu extrakce a obzvláště na druhu rozpouštědla. Nepolární rozpouštědla (např. hexan, petrolether, nebo nadkritický oxid uhličitý) mohou být použita na extrakci jednoduchých neutrálních lipidů (např. estery mastných kyselin a acylglyceroly). Komplexní a polární lipidy (např. fosfolipidy, lipoproteiny, glykolipidy a volné mastné kyseliny) vyžadují více polární rozpouštědla (např. methanol nebo acetonitril). Při extrakci tuků z potravin a různých biologických tkání, hlavně u lipidů spojených s proteiny, je nezbytné předchozí hydrolýza okolního materiálu, zvláště pokud je zapotřebí kvantitativní izolace. 2.5.2.1 Extrakce podle Folshe Pro extrakci podle Folshe byla navržena jako extrakční činidla různá rozpouštědla nebo jejich kombinace. Nejčastější kombinací rozpouštědel je směs chloroformu a methanolu ve dvoukrokové extrakci. Tuto kombinaci rozpouštědel přiblížil v 50. letech Folch, který používal k extrakci chloroform:metanol v poměru 2:1 a velké množství solného roztoku na vymytí nelipidických složek. Na počátku extrakce podle Folshe je systém rozpouštědel binární, v průběhu extrakce se stane ternárním systémem, zahrnujícím chloroform, methanol a vodu v různých poměrech, v závislosti na obsahu vody ve vzorku. Přídavek soli do média je zdrojem tvorby emulzí, což je jedna z hlavních nevýhod této metody [24]. Proto byla tato metoda později modifikována tak, aby byla extrakce lipidů co možná nejúčinnější.

18

2.5.2.2 Soxhletova metoda stanovení lipidů Extrakce Soxhletovou metodou je brána jako standard, se kterým se často srovnávají novější extrakční metody [12]. Je to metoda vhodná pro analýzu olejnin a podobných materiálů bohatých na neutrální lipidy s nízkým obsahem vody [2]. Aparatura sestává z baňky, Soxhletova přístroje a chladiče (Obr. 2.5.2). Nejprve se uchytí do stojanu spodní baňka a naplní se rozpouštědlem. Nad ní se připojí Soxhletův extraktor a opatrně se do něj vloží extrakční patrona s náplní (extrakční patrona je buď papírová, nebo skleněná). Na horní zábrus Soxhletova extraktoru se nakonec připevní chladič. Rozpouštědlo ve spodní baňce se zahříváním odpařuje a kondenzuje uvnitř chladiče. Odtud kape na extrakční patronu a postupně zaplňuje Soxhletův extraktor. Po dosažení hladiny přepadu rozpouštědlo odteče do spodní baňky [13]. Tento proces je opakován, dokud nejsou všechny komponenty ze vzorku vyextrahovány [12]. Soxhletova extrakce není kontinuální metodou, ale vsádkovým systémem s opakujícími se extrakcemi [14].

Obr. 2.5.2 Soxhletův extraktor [15] 2.5.2.3 Soxtec Soxtec je automatická extrakční metoda, která je použitelná pro mnoho typů vzorků. U extrakce surových tuků je tato metoda považována za empirickou. To znamená, že konečného a správného výsledku může být dosaženo pouze po úpravě podmínek nebo obdobnou variantou této metody. V porovnání s klasickou Soxhletovou metodou má Soxtec tyto výhody: • extrakční čas je zkrácen z 6 – 48 hodin na 2 – 3 hodiny • objem rozpouštědla vztažený na extrakci klesl z 250 – 500 ml na 40 – 50 ml • může být extrahováno 6 vzorků najednou [28, 34] 2.5.2.4 ANKOM XT10 Extraktor ANKOM XT10 Extraktor provádí extrakci hrubého tuku s použitím běžných rozpouštědel např. petrolether. Extrahovanými sloučeninami jsou především triacylglyceroly. Analýza je prováděna měřením ztráty hmoty následkem extrakce tuku nebo oleje ze vzorku uzavřeného v sáčku s filtrační kapacitou v rozmezí 1 – 3 mikrony. Filtrační sáček 19

má dostatečnou pórovitost umožňující rychlý průchod rozpouštědel a je vyrobený z polymerní hmoty, která snadno odolává vysokým teplotám a používaným rozpouštědlům. Kvantitativní izolace realizovaná filtračním sáčkem umožňuje dávkové zpracování vzorků, což umožňuje extrahovat najednou větší počet vzorků. Výhodou této metody je: • zrychlení extrakčního procesu • automatizace extrakčního procesu • až 10 vzorků zpracovaných současně [37]. 2.5.2.5 MAE – Extrakce pomocí mikrovln Extrakce pomocí mikrovln využívá mikrovlnné energie, o frekvenci přibližně 2,5 GHz, k ohřevu organického rozpouštědla, které je v kontaktu se vzorkem. Existují dva typy systému. Rozpouštědlo muže být vyhříváno buď v otevřeném systému (MAE za atmosférického tlaku) nebo v uzavřeném systému (pressurized – MAE). Druhý jmenovaný způsob umožňuje rychlý ohřev rozpouštědla na teplotu vysoko nad jeho bod varu, a tím tak snížit čas extrakce z hodin na minuty. Výhodou této extrakce je: • lze stanovit i 12 vzorků najednou • spotřeba rozpouštědla je 30 – 50 ml. U tohoto typu extrakce je však důležitý výběr rozpouštědla. Rozpouštědlo musí být schopné absorpce toho typu energie a obrátit ji na energii ve formě tepla [38]. 2.5.2.6 SPE – extrakce na pevné fázi Použití extrakce na pevné fázi pro přípravu vzorků lipidů je dobrou alternativou k extrakci kapalina/kapalina. Touto technikou mohou být vzorky rozděleny na různé třídy lipidů na základě rozdílné polarity komponent. Na přípravu vzorků se používají extrakční kolonky na jedno použití o různých velikostech a náplních sorbentů. Sorbenty mohou být polární, nepolární a iontově-výměnné. SPE se opírá o mechanismus kapalinové chromatografie. Kapalný vzorek je veden přes SPE kolonku a sloučeniny ze vzorku jsou zachyceny sorbentem v koloně. Poté jsou nežádoucí příměsi z kolonky selektivně odstraněny promytím správně zvoleným rozpouštědlem. Nakonec jsou sledované analyty znovuzískány elučním rozpouštědlem v podobě vysoce čistého extraktu (Obr. 2.5.3). Výhodou této metody je: • nižší spotřeba rozpouštědla • zkrácení doby přípravy vzorku • vyšší výtěžnost analytu [30,40].

20

Obr. 2.5.3 Princip SPE; extrakce polárních lipidů polárním rozpouštědlem za použití nepolárního sorbentu 2.5.2.7 SFE – Suprkritická fluidní extrakce Alternativou extrakce organickým rozpouštědlem je superkritická fluidní extrakce (SFE – Supercritical Fluid Extraction), kdy k extrakci pevného vzorku používáme nadkritickou (superkritickou) tekutinu, běžný oxid uhličitý. Je to rychlá, selektivní metoda vhodná pro extrakci karotenoidů, lipidů, chuťových a vonných sloučenin, kontaminantů a dalších látek [29,30,31]. Oxid uhličitý má kritickou teplotu 31 °C a kritický tlak 7 149 kPa. Nadkritický oxid uhličitý je ideálním rozpouštědlem pro analyty. Je nepolární, a proto rozpouští nepolární a málo polární sloučeniny [30]. Použití oxidu uhličitého má velké výhody: • je bezpečný a netoxický • snadno proniká matricí (nízká viskozita) • lehce se odstraňuje a nezanechává rezidua • je bez chuti a bez zápachu • je levný a běžně dostupný • rozpouštěcí síla se může ovlivnit změnou teploty a tlaku [29,32,33]. Nevýhodou SFE je požadavek na vysokou čistotu extrakčního média a vysoké náklady na zařízení. SFE se obvykle provádí při nízkých teplotách, z čehož vyplývá, že je vhodná i ke studiu tepelně labilních látek [32]. 2.5.2.8 Fex® IKA extrakce Tento extraktor je založen na principu extrakce na fluidním loži (FBE – fluized bed extraction). Využití nachází při extrakci půd, léčiv, textilií, potravin, zvířecích tkání, uhlí atd. Jeho výhodami je: • zkrácení času extrakce o 90 % • snižuje se objem rozpouštědla, tím i cena extrakce • můžou být extrahovány 4 vzorky najednou • vše je kontrolováno a řízeno počítačem

21

Princip extrakce je následující:
Fáze 1: Rozpouštědlo se zahřívá až k bodu varu a odpařuje se. Páry rozpouštědla pronikají přes filtr a vzorek do extrakční trubice.
Fáze 2: Páry rozpouštědla kondenzují na chladiči a zkondenzované rozpouštědlo kape na vzorek a zůstává v prostoru extrahovaného materiálu. Horké páry kontinuálně pronikají vzorkem, a tím udržují zkondenzované rozpouštědlo při teplotě varu, což umožňuje intenzivní extrakci za horka. Tato technika zajišťuje po celou dobu efektivní extrakci.
Fáze 3: Prostřednictvím PC je zastaveno vyhřívání. Po uvolnění solenoidového ventilu začne chladicí kapalina proudit do chladícího a vyhřívacího bloku. Ochlazení a kondenzace rozpouštědla vytvoří vakuum ve spodní nádobě, poté se z extrakční trubice přes filtr do spodní nádoby nasaje extrakční kapalina. Celý proces se může podle individuálních požadavků několikrát opakovat [35, 36] (Obr. 2.5.4).

Obr. 2.5.4 Fex®IKA; princip extrakce [36] 2.5.3 Analytická separace a identifikace/kvantifikace lipidů V současné době existuje široké spektrum možností analýzy lipidů, včetně NMR spektroskopie, MS s přímým nástřikem, FT-IR spektrometrie, GC-MS, LC-MS, 2D-chromatografie-MS a CE-MS.

22

2.5.3.1 Chromatografické metody TLC – Chromatografie na tenké vrstvě Tenkovrtvá chromatografie byla již od 50. let 20. stol. používána k analýze lipidů a k tomuto účelu je využívána dodnes. V klasické TLC separace složek závisí na distribuční rovnováze složek mezi pevnou fází tvořenou adsorbentem (oxid křemičitý nebo hlinitý) a mobilní fází tvořenou kapalným rozpouštědlem. Složky lipidů, které interagují silněji s absorbentem, mají tendenci pohybovat se relativně pomaleji vzhledem k těm, které interagují slaběji [24,39]. Tato chromatografie metoda nachází uplatnění při dělení neutrálních lipidů a fosfolipidů. HPLC – Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Kapalinová chromatografie (LC) nebo vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) má široké uplatnění v oblasti analýzy lipidů z toho důvodu, že existuje velké množství HPLC metodik pro analýzu lipidů. V oblasti chromatografie jsou definovány dva režimy v závislosti na relativní polaritě dvou chromatografických fází: 1) LC s normální fází (NP-LC), která obvykle vede k rozdělení lipidů do základních tříd podle složení 2) LC s obrácenou fází (RP-LC), která je vhodnou metodou pro stanovení polohových izomerů triacylglycerolů a pro rychlou analýzu volných mastných kyselin nebo methylesterů mastných kyselin (FAME´s), včetně stanovení konjugované kyseliny linolové (CLA), a pro identifikaci geometrických izomerů (např. CLA a jejich metabolitů) z velkého množství různých biologických vzorků. Detektory HPLC pro analýzu lipidů jsou založeny na detekci indexu lomu (RID), evaporatin light-scattering detekci (ELSD), elektrochemické detekci (ECD), potlačené vodivostní detekci-suppressed conduktivity dection (SCD), a nejnověji Charged aerosol detekci (CAD). Detektor ELSD se používá jako univerzální detektor, který reaguje na jakýkoliv analyt, který je méně těkavý než mobilní fáze, má nízké pozadí signálu, je kompatibilní s širokou škálou rozpouštědel, a umožňuje eluční gradient (na rozdíl od detektoru indexu lomu), a signál je nezávislý na stupni nasycení a délce acylového řetězce (na rozdíl od detektoru UV). V posledních letech se objevují detektory vybavené laserem jako světelným zdrojem. Evaporative laser light scattering detection (ELLSD) je citlivější, stabilnější a má reprodukovatelnější výsledky než ELSD [24]. GC – Plynová chromatografie Lipidy jsou tradičně analyzovány plynovou chromatografií s plamenově-ionizačním detektorem (FID). K dělení lipidů na frakce je méně použitelná, protože lipidy jsou málo těkavé. Tento „problém“ se dá vyřešit derivatizací vzorku, což může zahrnovat více reakčních kroků. Příprava vzorku může zahrnovat před-rozdělení lipidových tříd, hydrolýzu, derivatizaci nebo pyrolýzu [2,24]. 2.5.3.2 Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie (MS) je založena na separaci iontů v magnetickém nebo elektrickém poli. MS obvykle zahrnuje čtyři důležité kroky: 1) nástřik, 2) ionizaci molekul vzorku 23

3) separaci iontů na základě jejich hmotnosti (m/z), 4) detekce a uchování a interpretace výsledků. Existují různé druhy hmotnostních spektrometrů, které se liší typem ionizace a hmotnostního analyzátoru. V oblasti analýzy lipidů se využívá MS s přímým nástřikem a separační techniky ve spojení s MS [24,41]. (Obr. 2.5.5) Separační techniky ve spojení s MS Důležitým aspektem pro analýzu MS je, aby ionizační energie byla převedena přímo k analytu. Ionizační zdroje jsou klasifikovány podle výsledného stupně fragmentace. Tvrdé ionizační techniky (EI – elektronová ionizace) poskytují spektra bohatá na menší fragmenty. Měkké ionizační techniky (např. CI, FAB, MALDI, ESI, FD, APCI a APPI) poskytují větší fragmenty [24]. MS bylo často používáno při analýze lipidů ve spojení s EI-GC nebo EI-LC. V dnešní době se k MS přidávají především měkké ionizační techniky, protože při tvrdých ionizačních technikách dochází k rozpadu na malé fragmenty a při identifikace molekul a určení uhlíkaté kostry mastných kyselin je příliš zdlouhavé. Chemická ionizace (CI) ve spojení s GC-MS je vhodná k analýze mastných kyselin. Nejvíce využívané ionizační techniky ve spojení s kapalinovou chromatografií jsou FAB, ESI, APCI, APPI a MALDI. FAB-MS je využíván ke stanovení intaktních lipidů (molekulová hmotnost > 400). ESI se využívá ke ionizaci komplexních směsí lipidů a částečně k ionizaci polárních lipidů (např. fosfolipidy, sfingolipidy). APCI a APPI je zvláště užitečné pro analýzu nepolárních lipidů (např. triacylglycerolů, sterolů a esterů mastných kyselin). Tato instrumentální metoda snadno produkuje ionty s mírnou fragmentací velkých neutrálních molekul (např. triacylglycerolů). Po ionizaci vzorku lipidu, jsou ionty separovány na základě jeho m/z na hmotnostním analyzátoru. Mezi hlavní druhy analyzátorů, které lze použít pro analýzu lipidů patří: kvadrupól (Q), iontová past (IT), kvadrupólová-iontová past (QIT), tripl-kvadrupólová (QQQ), Time-of-flight (TOF), kvadrupólové- Time-of-flight (Q-TOF), FT ion cyklotron rezonance (FT-ICR), Orbitrap (OT) a iontové pasti-Orbitrap (IT-OT) [24].

24

Obr. 2.5.5 Hmotnostní spektrometrie – čtyři důležité kroky 2.5.3.3 Nukleární magnetická rezonance - NMR Nukleární magnetická rezonance (NMR) se stala univerzální metodou pro analýzu lipidů. Umožňuje určování struktury, kvalitativní a kvantitativní analýzy definovaných molekul a dokonce i složité směsi. Relativní množství a částečné určení majoritní lipidové třídy (diacylglyceroly, triglyceridy, fosfolipidy, sfingolipidy a steroidy) může být stanoveno okamžitě z 1H spektra z nefrakcionovaných extraktů lipidů. Metodou NMR je možné také stanovit stupeň nasycení (13C NMR) [24,42].

2.6 Možnosti stanovení mastných kyselin V dnešní době je analýza mastných kyselin plynovou chromatografií (GC) jednou z nejrozšířenějších technik na poli biochemie a analýzy potravin. Před vlastní analýzou mastných kyselin nebo esterů glycerolu je nutné převést je na těkavé methyl estery (FAME), které se rozdělují plynovou chromatografií s použitím polyesterů jako stacionární fáze a detekují plamenově-ionizačním detektorem (FID) [2,43]. Kromě techniky plynové chromatografie existují i další analytické metody, které mají svoji tradici v moderním výzkumu mastných kyselin. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je pravděpodobně nejvšestrannější technikou a je využívána jak k analýze, tak i k preparativní separaci mastných kyselin. Mastné kyseliny mohou být rozděleny metodou HPLC na základě jejich polarity (kolony s normální nebo obrácenou fází), stupně nasyceni (silver-ion HPLC) nebo chirality (chirální HPLC).

25

Také chromatografie na tenké vrstvě (TLC) je často používána pro pre-separaci mastných kyselin nebo lipidových tříd. Kombinací těchto technik může být využito k prozkoumání strukturních vlastností lipidů, jako je poziční rozložení mastných kyselin na jejich glycerolové kostře. Tyto poznatky mohou velice důležité k pochopení biologických funkcí konkrétních mastných kyselin [43]. 2.6.1 Možnosti přípravy methylesterů mastných kyselin (FAME) Existuje velké množství druhů derivátů mastných kyselin používaných k analýze mastných kyselin a ještě více způsobů jak tyto deriváty připravit. Jednoznačně nejdůležitějšími z nich jsou methylesterové deriváty (Obr. 2.6.1), které jsou standardy pro profil mastných kyselin v plynové chromatografii. Ostatní alkoholy s nízkou molekulovou hmotností jako je ethanol, butanol nebo isopropanol mají určitý význam pro speciální použití, ale methyl estery jsou nejlepší volbou pro dlouhé polynenasycené řetězce mastných kyselin [44]. O O O O O

H3C R1 R2

O O

R3

katalyzátor / catalyzer

+ 3 H3C OH

OH OH

+

H3C

O

O

O

R1 R2

O

OH H3C

O

R3

Obr. 2.6.1 Rovnice esterifikační reakce 2.6.1.1 Kysele katalyzovaná esterifikace a transesterifikace Volné mastné kyseliny jsou esterifikované a O-acyl lipidy transesterifikované jejich zahříváním v nadbytku bezvodého metanolu za přítomnosti kyselého katalyzátoru. Nejčastějším a nejmírnějším činidlem je 5% chlorovodík v bezvodém methanolu. Toto činidlo bývá nejčastěji připravováno probubláváním plynného chlorovodíku do bezvodého metanolu. Jednodušší způsob přípravy tohoto činidla je pomalé přidávání acetyl chloridu do chlazeného bezvodého methanolu. Obvykle se reagent zahřívá se vzorkem lipidu pod zpětným chladičem asi 2 hodiny, ale může být také zahříván v uzavřené zkumavce při vyšších teplotách kratší dobu. Stejným způsobem a stejnou rychlostí jako u methanolického chlorovodíku, lze transesterifikovat lipidy 1 – 2 % roztokem koncentrované kyseliny sírové v methanolu. Příprava je velice jednoduchá a je tedy upřednostňována při esterifikaci volných mastných kyselin. Pokud se s činidlem zachází neobratně, může dojít k rozkladu některých polynenasycených mastných kyselin. Fluorid boritý (12 – 14%) je také používán jako transesterifikační katalyzátor a zejména jako rychlý prostředek esterifikace volných mastných kyselin. Toto činidlo má omezenou trvanlivost, i když je uchováváno v chladu, a použitím starých nebo příliš koncentrovaných roztoků vede často k tvorbě artefaktů a ke ztrátám značného množství polynenasycených mastných kyselin.

26

2.6.1.2 Bazicky katalyzovaná esterifikace a transesterifikace O-acyl lipidy jsou transesterifikovány velmi rychle v prostředí bezvodého methanolu v přítomnosti basického katalyzátoru. Nejpoužívanějším bazickým katalyzátorem je 0,5 M roztok methoxidu sodného v bezvodém methanolu, který se připraví jednoduše rozpuštěním čerstvého, čistého sodíku v bezvodém methanolu. Jako katalyzátor lze použít i methoxid nebo hydroxid draselný. Tyto činidla jsou stabilní i několik měsíců při pokojové teplotě, zvláště pokud je na jeho přípravu použit methanol bez kyslíku (methanol oxigen-free). Reakce je velmi rychlá, např. fosfoglyceridy jsou zcela transesterifikovány během několika minut při pokojové teplotě [45]. 2.6.2 Stanovení methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií Plynová chromatografie je separační metodou, při níž dochází k distribuci plynů a par separovaných látek mezi mobilní a stacionární fázi. Cílem chromatografického procesu je rozdělit vzorek na jednotlivé složky. Nosný plyn protéká kolonou a unáší s sebou nastříknutý vzorek. Při tom dochází k interakci mezi vzorkem a stacionární fází, při čemž jsou jednotlivé složky různě pevně zadržovány. Podle stupně zadržení pak vystupují dříve či později. Složky opouštějící kolonu vstupují do detektoru. Signál z detektoru se vyhodnocuje a z časového průběhu intenzity signálu se určí druh a kvantitativní zastoupení složek. Doba, která uplyne od okamžiku vnesení vzorku do výstupu inertní, nesorbované složky, se nazývá mrtvý čas (tM) a doba průchodu sorbované látky se označuje jako retenční (eluční) čas (tR) [54]. Plynový chromatograf obsahuje tyto hlavní části: • zásobník plynné fáze • zařízení na regulaci tlaku, resp. průtoku plynné fáze • dávkovací zařízení • chromatografickou kolonu • termostat se zařízením pro izotermickou analýzu a pro analýzu s programovanou změnou teploty • detektor • zařízení na zpracování a záznam signálu detektoru a vyhodnocení analýzy [11]. 2.6.2.1 Nástřikový systém Nástřik vzorků je důležitým krokem v separaci látek plynovou chromatografií. Systém pro nástřik vzorku lze rozdělit zhruba do dvou skupin: odpařovací injektory (s děličem toku a bez děliče toku) a on-column injektory [45,52]. Nástřik technikou split = s děličem toku Tato technika se pro nástřik FAMEs používá nejčastěji. Vzorek je zaveden do horké nástřikové komory, kde se smísí s nosným plynem, část vzorku jde do kolony a zbytek je odveden. Hlavní nevýhodou této techniky je diskriminace (změna složení vzorku) vysocevroucích a nízko-vroucích sloučenin. Přirozeně se vyskytující mastné kyselin mají řetězec dlouhý obvykle 4 až 24 atomů uhlíku, a proto širokou škálu bodu varu. Diskriminaci sloučenin lze předejít použitím automatického vysokorychlostního nástřiku, malého objemu

27

vzorku, nízkou koncentrací vzorku, vysokou nástřikovou teplotou (250 – 300 °C) a vhodného tvaru nástřikového insertu [30,52]. Nástřik technikou splitless = bez děliče toku Vzorek je zaveden do horké nástřikové komory, kde je určitou dobu odpařována poté je unášen přímo do kolony Tato technika se využívá k analýze zředěných vzorků a relativně velkých objemů, které je nutno použít pro stopovou analýzu [30]. PTV injektor PTV injektor (programed – temperature vaporizing) je speciální typ injektoru, který může být použit ve více provozních režimech – chladný/horký split nástřik, chladný/horký splitless nástřik. Výhodou tohoto injektoru je možnost rychlé programovatelné změny teploty. On-column Při on-column technice je kapalný vzorek bez předehřátí a smíchání s nosným plynem nanášen přímo do kolony. Je to technika vhodná pro ultrastopovou analýzu řady těkavých i netěkavých analytů. Výhodou této techniky je úplné vyloučení diskriminace vzorku [52,53]. 2.6.2.2 Chromatografická kolona V plynové chromatografii se pro stanovení FAMEs používají kapilární kolony, jejichž rozlišovací schopnost závisí na několika faktorech, jako je polarita stacionární fáze, délka kolony, vnitřní průměr a tloušťka filmu. Separaci FAMEs lze provádět s různými typy kapilárních kolon tj. s nepolárními, polárními a vysoce-polárními stacionárními fázemi. Polarita stacionární fáze má vliv na retenční časy FAMEs (hlavně polynenasycených mastných kyslein). Kolona by měla být zvolena v závislosti na vzorku, který je analyzován. Obecně platí, že schopnost rozlišení FAMEs, především polynenasycených mastných kyselin, je nejvyšší u kolon s vysocepolární stacionární fází. Nevýhodou těchto kolon ale je, že mají nízkou tepelnou stabilitu. Středně polární stacionární fáze umožňují přijatelné rozdělení FAMEs z biologických vzorků jako je plazma, membrány erytrocytů a z rybích olejů. Tyto kolony mají relativně vysokou rozlišovací schopnost a jsou poměrně tepelně stabilní [52]. Nepolární stacionární fáze mají dobrou tepelnou stabilitu, ale nižší rozlišovací schopnost. 2.6.2.3 Detektory pro plynovou chromatografii S výjimkou několika málo detektorů používaných v GC, byla většina vynalezena právě pro tuto techniku. Celkově existuje velké množství detektorů, které se v plynové chromatografii používají. Mnoho „vynalezených“ detektorů je založeno na tvorbě iontů, nejpopulárnějším z nich se stal FID – plamenově-ionizační detektor. Mezi další používané detektory patří TCD (tepelně vodivostní detektor), ECD (detektor elektronového záchytu), NPD (dusík-fosforový detektor, PID (fotoionizační detektor), FPD (plamenově fotometrický detektor), AED (atomový emisní detektor) atd. [55].

28

FID – plamenově ionizační detektor FID detektor je nejpoužívanější detektor v plynové chromatografii a je příkladem ionizačního detektoru, který byl vynalezen přímo pro plynovou chromatografii (Obr. 2.6.2). Ve FID je vzorek nejdříve spalován plamenem vzniklým hořením vodíku v syntetickém vzduchu. V plameni se tvoří ionty a volné elektrony. Nabité částice v nosném plynu vytvářejí měřitelný tok proudu v prostoru mezi dvěma elektrodami detektoru. Výsledný tok proudu má větší intenzitu než tok proudu vzniklého při průtoku pouze čistého nosného plynu a vodíku. Rozdíl změřeného signálu podává přesnou informaci o vzorku, protože proud je přímo úměrný ionizaci, která závisí na složení vzorku. Plamenoionizační detektory jsou extrémně citlivé a mají široký rozsah linearity. Jejich nevýhodou je pouze destrukce vzorku. Důležitým aspektem je výběr nosného plynu k převedení vzorku z injektoru přes kolonu do detektoru. Nosný plyn musí být inertní a nesmí se adsorbovat na materiál kolony. Jako nosné plyny se obvykle používají helium nebo dusík nebo také vodík. Další nezbytné plyny pro funkci FID detektoru jsou vodík a syntetický vzduch. A tyto plyny slouží jako palivo a oxidační plyn pro proces spalování. Nečistoty, zvláště uhlovodíky, vlhkost a kyslík působí rušivě, snižují citlivost a mohou zhoršit mez detekce Jejich obsah v pomocných plynech proto musí být pod stanoveným limitem [55, 56]. Pro zvýšení citlivosti detektoru se používá dusík jako přídavný plyn (make-up).

Obr. 2.6.2 Plamenově ionizační detektor [56]

29

3

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

3.1 Vzorky ječmenů Vzorky ječmenů, ročník 2008 a 2009, byly dodány ze šlechtitelské stanice. Seznam stanovovaných odrůd uvádí tabulka 3.1.1. Tab. 3.1.1 Seznam stanovovaných odrůd Č. vzorku

Odrůda

Č. vzorku

Odrůda

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Wikingett Troon Cruiser Bellevue Biatlon Mauritia Ebson NFC Tipple Westminster Publican

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Marthe Maltasia Lissane Musikant Xanadu Jersey Malvaz Binder Tepelský Ratbořský

3.2 Použité laboratorní vybavení a chemikálie 3.2.1 Laboratorní přístroje a pomůcky • Automatický extraktor Fex®IKA (IKA, Něměcko) • Rotační vakuová odparka IKA®RV 10 digital (IKA, Něměcko) • Horkovzduná sušárna Venticell (BMT, ČR) • Ultrazvuk (Tesla, ČR) • Analytickké váhy s přesností na 0,001g (Mettler Toledo, USA) • Předvážky s přesností na 0,01g • Laboratorní mlýnek na jemné mletí (Retsch, Německo) • Plynový chromatograf Trace Ultra s FID detektorem (Thermo Scientific, USA) • Autosampler AS3000 (Thermo Scientific, USA) • Kapilární kolona SLB-IL 100 (60 m x 0,25 mmI.D., 0,25mm; Supelco, USA) • Kapilární kolona Supelcowax 100 (60 m x 0,25 mmI.D., 0,25mm; Supelco, USA) • PC • Odměrný válec 100 ml, kádinky 150 ml • Mikropipety 300 µl (Hamilton, USA), pipety skleněné 1; 2 a 5 ml • Jednorázová plastová Pateurova pipeta • Zkumavky 10 ml se skleněnou zábrusovou zátkou • Exikátor, váženka, filtrační papír • Jednorázové plastové Eppendorfové mikrozkumavky 2 ml • Vialky pro head space 2 ml (CRS, USA), hliníkové uzávěry se septem 10 mm (PTFE/silicone), uzavírací kleště

30

3.2.2 Chemikálie • Petrolether (Lach-Net, Ltd, ČR), CAS 101316-46-5 • Isooktan (Sigma-Aldrich, USA), CAS 540-84-1 • Metanol (Sigma-Aldrich, USA), CAS 67-56-1 • KOH (ML Chemica, ČR), CAS 1310-58-3 • NaHSO4 (Sigma-Aldrich, USA), CAS 7681-38-1 • Směsný standard methylesterů mastných kyselin - FAME mix 37 (Sigma-Aldrich, USA) Všechny použité chemikálie byly použity v čistotě p. a. nebo vyšší. 3.2.3 Plyny • Helium – čistota 5,0 • Vodík – čistota 5,0 • Vzduch – čistota 4,5 • Dusík – čistota 4,5

3.3 Pracovní postup stanovení lipidů Použitelnost metody Metoda je vhodná pro analýzu tuků v ječmeni, sladu a podobných materiálech bohatých na neutrální lipidy s nízkým obsahem vody. Princip Provede se extrakce lipidů z rozemletého ječmene nebo sladu petroletherem v extrakčním přístroji fex®IKA dive-in kontrol. Rozpouštědlo se odpaří a vysušené extrakty se zváží. Pracovní postup Naváží se 5 ± 0,001 g zrna ječmene nebo sladu rozemletého na laboratorním mlýnku pro jemné mletí a vzorek se zabalí do filtračního papíru, který se vloží do extraktoru. Našroubuje se předem vysušená a zvážená baňka se skleněnými kuličkami (30 min při 105 °C, chlazení v exsikátoru), do které se odměří 60 ml petroletheru. Po sestavení extrakční aparatury se nechá vzorek automaticky extrahovat v 8 cyklech (75°C/15 min, chlazení na 25 °C) po dobu asi 2 hodin. Po extrakci se zbylé rozpouštědlo odpaří na vakuové rotační odparce při 45 °C. Pak se baňka s vyextrahovaným tukem suší 2 hodiny při 105 °C v sušárně. Po ochlazení v exsikátoru se baňka zváží s přesností na 0,001 g. Výpočet a vyhodnocení Lp =

H ⋅ 100 n

Ls =

L p ⋅ 100 s

kde: Lp je obsah tuků v původním vzorku (%), Ls je obsah tuků v sušině vzorku (%), H je hmotnost baňky s tuky – hmotnost prázdné baňky (g), n je navážka ječmene nebo sladu (g), s je sušina ječmene nebo sladu (%). Výsledek se uvádí v procentech na dvě desetinná místa.

31

3.4 Pracovní postup přípravy methylesterů mastných kyselin Použitelnost metody Metoda je vhodná pro analýzu tuků obsahující mastné kyseliny počínaje C4. Podmínkou je, že obsah volných mastných kyselin ve vzorku musí být menší než 2 %. Princip Triacylglyceroly jsou rozpuštěny v izooktanu a převedeny na methylestery transesterifikací s hydroxidem draselným. Po ukončení reakce je hydroxid draselný neutralizován hydrogensíranem sodným, aby se zamezilo zmýdelňování methylesterů. Příprava methanolického roztoku hydroxidu draselného (2mol/l) Za mírného ohřívání se rozpustí 13,1 g KOH ve 100 ml absolutního metanolu. Přidá se větší množství bezvodého síranu sodného k vysušení roztoku. Po 30 minutách se roztok přefiltruje. Pracovní postup K analýze mastných kyselin se použije tuk vyextrahovaný optimalizovanou metodou extrakce na fluidním loži (bez sušení). Vyextrahovaný tuk se dokonale rozpustí v 1 ml izooktanu. Do zkumavky se zábrusovým uzávěrem se napipetuje 300 µl směsi a 4 ml izooktanu. Automatickou pipetou se přidá 200 µl methanolického roztoku KOH a zkumavky se uzavřou. Směsí ve zkumavce se silně třepe po dobu asi 30 sekund. Po počátečním zákalu způsobeném oddělením glycerolu se reakční směs postupně vyčeří. Do roztoku se přidá asi 1 g hydrogensíranu sodného a znovu se intenzivně třepe po dobu 15 sekund, aby se zneutralizoval hydroxid draselný. Po usazení soli se do 2 ml vialky odebere horní izooktanová vrstva. Ta obsahuje asi 15 mg/ml methylesterů mastných kyselin a může se přímo nastříknout k analýze do GC.

3.5 Analýza methylesterů mastných kyselin (FAME) metodou GC-FID Analýza FAME byla provedena optimalizovanou metodou GC-FID na koloně SLB-IL 100. K analýze byl dávkován pomocí autosampleru 1µl připravených methylesterů mastných kyselin za podmínek, které jsou uvedeny v tabulce 4.3.1. Výsledky byly vyhodnoceny v programu Chrom-Card jako procentuální obsah mastných kyselin obsažený ve vzorku. Za stejných podmínek metody byl stanoven limit detekce, limit stanovitelnosti a byla ověřena linearita v rozmezí koncentrací FAME 2 – 30 µg/ml.

3.6 Validace metody U metody stanovení FAME byla provedena validace v rozsahu stanovení validačních parametrů: opakovatelnost, linearita, rozšířená nejistota měření, mez detekce a mez stanovitelnosti.

3.6.1 Validace Validace je stanovení a provedení činností nezbytných k tomu, aby bylo prokázáno, že analytický proces nebo jeho část probíhá standardním způsobem tak, že odchylky během procesu a parametry výsledků splňují požadovaná kritéria [50].

32

3.6.2 Opakovatelnost Opakovatelnost vyjadřuje těsnost souhlasu mezi výsledky nezávislých měření stejného analytu provedených stejnou metodou, stejným experimentátorem, na stejném přístroji, na stejném místě, za stejných podmínek v krátkém časovém intervalu. Opakovatelnost je vlastností metody, ne výsledku [46]. 3.6.3 Linearita Linearita je chápána jako přímková závislost mezi dvěma náhodnými proměnnými, tj. odezvou instrumentace (analytickým signálem) a koncentrací analytu. Těsnost vzájemné závislosti dvou náhodných proměnných charakterizuje korelační koeficient [47]. 3.6.4 Mez deekce (LOD - limit of detection) Mez detekce individuálního analytického postupu je definována jako nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být detekováno, nikoliv však stanoveno jako exaktní hodnota. Mez detekce odpovídá koncentraci, pro kterou je analytický signál statisticky významně odlišný od šumu a vyjadřuje se jako trojnásobek šumu základní linie: h LOD = 3 ⋅ n m kde: hn …… šum na základní linii m …… směrnice kalibrační přímky (f (c) = h, kde h je závislost výšky píku na koncentraci) 3.6.5 Mez stanovitelnosti (LOQ – limit of quantification) Mez stanovitelnosti individuálního analytického postupu je definována jako nejnižší koncentrace analytu, která může být stanovena jako exaktní hodnota se stanovenou přesností [48]. Mez stanovitelnosti odpovídá koncentraci, při které je přesnost stanovení taková, že dovoluje kvantitativní vyhodnocení a vyjadřuje se jako desetinásobek šumu základní linie: h LOQ = 10 ⋅ n m kde: hn …… šum na základní linii m …… směrnice kalibrační přímky 3.6.6 Statistické vyhodnocení naměřených dat V rámci statistického vyhodnocení naměřených dat byly použity následující statistické parametry: aritmetický průměr, směrodatná odchylka a relativní směrodatná odchylka. 3.6.6.1 Aritmetický průměr Aritmetický průměr se obvykle značí vodorovným pruhem nad názvem proměnné a je definován vztahem [49]: x=

n 1 (x1 + x 2 + ... + xn ) = 1 ∑ xi n n i =1

33

3.6.6.2 Směrodatná odchylka Uvádí se ve stejných jednotkách, v jakých je vyjádřena veličina x a charakterizuje rozptýlení jednotlivých hodnot xi kolem aritmetického průměru. Směrodatná odchylka je mírou přesnosti série paralelních výsledků a je definována vzorcem [49]:

s=

1 n ( x i − x )2 ∑ n − 1 i =1

3.6.6.3 Relativní směrodatná odchylka Relativní směrodatná odchylka udává procentuální rozptýlení od aritmetického průměru, uvádí se v procentech a je definována vzorcem [49]: sr =

34

s ⋅ 100[%] x

4

VÝSLEDKY A DISKUZE

Hlavním cílem experimentální části této práce bylo optimalizovat extrakci lipidů z obilky ječmene, optimalizovat stanovení profilu mastných kyselin v obilce ječmene a stanovit obsah lipidů a zastoupení mastných kyselin v různých odrůdách ječmene. Extrakce lipidů ze vzorků byla prováděna na automatickém extraktoru Fex®IKA a profil mastných kyselin byl stanoven metodou GC-FID za optimalizovaných podmínek. Seznam methylesterů mastných kyselin ve standardu FAME mix 37 je uveden v příloze 1.

4.1

Optimalizace extrakce pro stanovení obsahu lipidů v obilce ječmene

Pro extrakci lipidů v obilce ječmene bylo optimalizováno množství extrakčního rozpouštědla, doba trvání cyklu a počet cyklů. Optimalizované parametry extrakce jsou uvedeny v tabulce 4.1.1. Jako Extrakční rozpouštědlo byl zvolen petrolether. Opakovatelnost extrakce byla ověřena se vzorkem odrůdy ječmene Lissane.

Tab 4.1.1 Optimalizované parametry extrakce Množství extrakčního rozpouštědla

Doba trvání cyklu

počet cyklů

60 ml

15 min

8

4.1.1 Optimalizace množství extrakčního rozpouštědla Množství extrakčního rozpouštědla bylo zvoleno takové, aby byl vzorek při extrakci v extrakční trubici celý ponořený ve vroucím rozpouštědle, a aby zůstal dostatečný objem extrakčního činidla v extrakční baňce. 4.1.2 Optimalizace doby trvání cyklu Doba trvání extrakčního cyklu byla získána experimentálně a byla zvolena tak, aby byl vzorek při extrakci dokonale ponořen ve vroucím rozpouštědle v extrakční trubici. 4.1.3 Optimalizace počtu cyklů Optimální počet cyklů extrakce se stanovil ze závislosti počtu cyklů na vyextrahovaném množství lipidů ze vzorku. Tuto závislost zobrazuje graf 4.1.1.. Z grafu vyplývá, že do 7. cyklu extrakce množství vyextrahovaných lipidů roste a od 8. cyklu je množství vyextrahovaných lipidů relativně lineární. Zvolený počet cyklů byl 8, protože při vyšším počtu cyklů by už nedocházelo k nárůstu množství vyextrahovaných lipidů a jen by se prodlužovala doba extrakce. Naměřená data uvádí tabulka 4.1.2. Tab 4.1.2 Naměřená data pro optimalizaci počtu cyklů extrakce Cyklus

m tuku v sušině (%)

Cyklus

m tuku v sušině (%)

1 2 3 4 5 6

0,975 1,258 1,320 1,490 1,521 1,551

7 8 9 10 11 12

1,619 1,612 1,595 1,585 1,582 1,605

35

Optimalizace extrakce tuků ze sladu 1,800 1,600 1,400

lipidy

1,000

m

1,200

0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

počet cyklů

Graf 4.1.1 Optimalizace počtu cyklů extrakce

4.2 Validační parametry – opakovatelnost extrakce Opakovatelnost byla stanovena ze 7 extrakcí. Pro opakovatelnost metody extrakce byl zvolen vzorek ječmene odrůdy Lissane. Naměřené hodnoty, směrodatnou odchylku a relativní směrodatnou odchylku uvádí tabulka 4.2.1.

Tab 4.2.1 Opakovatelnost extrakce Č. extrakce 1 2 3 4 5 6 7 Průměr směrodatná odchylka relativní směrodatná odchylka

m tuku v sušině (%) 1,87 1,82 1,78 1,85 1,55 1,84 1,98 1,81 % 0,12 % 6,62 %

4.3 Optimalizace stanovení profilu mastných kyselin v obilce ječmene Pro stanovení methylesterů mastných kyselin (FAME) metodou GC-FID byl optimalizován výběr kolony, metoda GC – FID - teplotní program a průtok nosného plynu.

4.3.1 Výběr kolony Pro separaci jednotlivých methylesterů mastných kyselin metodou GC – FID byly testovány dvě kapilární kolony: SLB-IL 100 a SUPELCOWAX. Metodika stanovení esterů mastných kyselin byla testována na standardu FAME mix 37.

36

Kolona SUPELCOWAX SUPELCOWAX 10 je polární kolona vhodná pro analýzu methylesterů mastných kyselin (FAMEs), potravin, chuťových a vonných sloučenin, alkoholů a aromatických látek. Tato kolona je založena na jedné z nejpoužívanějších polárních fází - carbowaxu. Kolona SLB-IL 100 Tato vysoce polární kolona má dobrou tepelnou stabilitu a vysokou stabilitu stacionární fáze. Je vhodná ke stanovení methylesterů mastných kyselin a umožňuje rozdělení cis/trans izomerů methylesterů mastných kyselin. SLB-IL100 je první světově komerčně dostupnou kapilární GC kolonou s iontovou stacionární fází. Při porovnání chromatogramů separace standardu FAME mix 37 je pro náš účel kapilární kolona SLB-IL 100 vhodnější k separaci methyl esterů mastných kyselin, protože viditelně vykazuje dokonalejší separaci jednotlivých analytů (Obr. 4.3.1) a je schopna rozlišit kyselinu olejovou a elaidovou (Obr. 4.3.3).

Obr. 4.3.1 Chromatogram standardu FAME mix 37 na koloně SLB-IL 100

37

Obr. 4.3.2 Chromatogram standardu FAME 37 mix na koloně Supelcowax

Supelcowax

Obr. 4.3.3 Srovnání dělení cis/trans izomerů methylesterů mastných kyselin na dvou kapilárních kolonách (metyl estery kyseliny olejové - 17 a elaidové - 18)

38

4.3.2 Optimalizace metody GC-FID Pro stanovení FAME metodou GC-FID byl experimentálně optimalizován teplotní program a průtok nosného plynu tak, abychom dosáhli požadované separace a tvaru píků. Píky mají mít gausovský tvar a neměly by tzv. frontovat ani chvostovat. Změnou teploty lze ovlivnit míru separace, nastavením správného průtoku lze ovlivnit tvar píků. Optimalizované parametry metody GC-FID uvádí tabulka 4.3.1. Tab 4.3.1 Optimální parametry metody GC-FID Plynový chromatograf

Trace Ultra

Nosný plyn/ průtok

He/ konst. 1,5 ml/min

Ostatní plyny/ průtok

H2/ 40 ml/min, vzduch/ 350 ml/min, make-up N2/ 10 ml/min

Teplota pece

50 °C

Teplota injektoru

250 °C

Teplota FID detektoru

250 °C

Objem nástřiku

1 µl

Splitovací průtok

60 ml/min

Split-less time

0,8 min

Teplotní program

Celkový čas analýzy

kolona SLB-IL 100 40 °C→220 °C (rampa 4 °C/min) 10 min kolona Supelcowax 40 °C→220 °C (rampa 4 °C/min) 10 min 52,5 min

4.4 Validační parametry metody GC-FID Pro stanovení jednotlivých validačních parametrů byl použit standard FAME mix 37. Byla stanovována opakovatelnost, mez detekce, mez stanovitelnosti a linearita metody.

4.4.1 Opakovatelnost Opakovatelnost pro všechny analyty byla ověřována na standardu o koncentraci 100 mg/ml. Měření bylo provedeno 5x. Průměr, směrodatná odchylka a relativní směrodatná odchylka byly vypočteny podle statistických vzorců (viz kapitola 3.6.6) a jsou uvedeny v tabulce 4.4.1. Metoda je opakovatelná, pokud relativní směrodatná odchylka všech výsledků, získaných ve stejné laboratoři stejným pracovníkem podle stejného pracovního postupu provedená v krátkém časovém intervalu, nepřesáhne hodnotu 10,00 % [54]. Relativní směrodatná odchylka naměřených dat byla v rozmezí 0,98 – 3,63 %. To znamená, že metoda splňuje podmínku opakovatelnosti a je vhodná ke stanovení mastných kyselin. 4.4.2 Mez detekce a mez stanovitelnosti Hodnoty meze detekce a meze stanovitelnosti jsou uvedeny v tabulce 4.4.2.

39

Tab 4.4.1 Opakovatelnost metody

40

MK

Retenční čas

průměr (plocha píku)

směrodatná odchylka (plocha píku)

relativní směrodatná odchylka (%)

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 17 20 19 23 21 22 24 30 25 26 31 28 27 32 35 29 33 36 37 34

10.70 14.86 19.03 20.98 22.86 24.61 26.30 27.39 27.86 28.97 29.42 30.23 30.81 31.66 32.26 32.68 32.91 33.47 34.01 34.56 34.84 35.29 35.46 35.99 36.54 37.17 37.23 37.35 37.73 37.82 38.28 38.57 38.83 39.44 40.01 41.15

1727003 1978389 2120467 1068817 2171083 1086706 2153547 1068876 1060427 1061062 3134470 993056 933190 1022655 2003503 1019924 2044819 990748 1001040 960275 2023564 952768 1001752 1013269 979489 1967306 959879 920375 1031565 861673 984864 878712 922038 1892852 953766 772450

21643 20576 21158 10703 21170 11491 23934 12412 11732 12134 35227 10713 10385 11505 23878 12980 24755 12802 12146 12203 31478 13975 15779 17199 15161 54893 34834 13767 19592 21940 20048 14458 17269 39628 20820 14539

1,25 1,04 1,00 1,00 0,98 1,06 1,11 1,16 1,11 1,14 1,12 1,08 1,11 1,13 1,19 1,27 1,21 1,29 1,21 1,27 1,56 1,47 1,58 1,70 1,55 2,79 3,63 1,50 1,90 2,55 2,04 1,65 1,87 2,09 2,18 1,88

Tab 4.4.2 Mez detekce a mez stanovitelnosti jednotlivých methylesterů mastných kyselin Číslo MK

LOQ (µg/ml)

LOD (µg/ml)

Číslo MK

LOQ (µg/ml)

LOD (µg/ml)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

1 1 1 0,5 1 0,5 1 0,5 0,5 0,5 1,5 0,5 0,5 0,5 1 0,5 1 0,5 0,5

0,2 0,4 0,4 0,2 0,5 0,2 0,5 0,2 0,2 0,2 0,7 0,2 0,2 0,2 0,5 0,2 0,5 0,2 0,2

20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 –

1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0,5 0,5 1 –

0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 0,2 0,3 0,2 0,1 0,1 –

4.4.3 Linearita Pro stanovení linearity byl použit směsný standard FAME mix 37 v rozmezí koncentrací methylesterů mastných kyselin 2 – 30 µg/ml. Kalibrační křivka byla sestrojena ze závislosti plochy píku na koncentraci jednotlivých methylesterů mastných kyselin, následně byla získána rovnice regrese a vypočtena hodnota spolehlivosti. Ukázky naměřených dat pro methylestery kyseliny palmitové (č. 12) a kyseliny linolové (č. 19) jsou uvedeny v tabulce 4.4.3 a jejich kalibrační křivky jsou zobrazeny v grafech 4.4.1 a 4.4.2. Hodnoty spolehlivosti pro všechny FAME jsou uvedeny v tabulce 4.4.4. Tab 4.4.3 Hodnoty pro sestrojení kalibrační křivky kyselina palmitová (č. 12) koncentrace (µg/ml) plocha píku 6 12 18 24 30

135538 410641 669813 905003 1153633

kyselina linolová (č. 19) koncentrace (µg/ml) plocha píku 2 4 6 8 10

30877 110137 193367 259408 333696

41

Graf 4.4.1 Závislost plochy piku na koncentraci kyseliny palmitové

Graf 4.4.2 Závislost plochy piku na koncentraci kyseliny linolové

42

Tab 4.4.4 Hodnoty spolehlivosti pro jednotlivé methylestery mastných kyselin MK

hodnota spolehlivosti R2

MK

hodnota spolehlivosti R2

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 17 20

0,9968 0,9957 0,9970 0,9972 0,9989 0,9996 0,9999 0,9999 0,9998 0,9997 0,9992 0,9995 0,9988 0,9990 0,9975 0,9971 0,9978 0,9983

19 23 21 22 24 30 25 26 31 28 27 32 35 29 33 36 34 37

0,9985 0,9990 0,9968 0,9988 0,9975 0,9967 0,9974 0,9977 0,9835 0,9978 0,9982 0,9896 0,9933 0,9981 0,9971 0,9868 0,9912 0,9950

Hodnota korelačního koeficientu nesmí klesnout pod hodnotu 0,98 [47]. Hodnota spolehlivosti R2 se pohybuje u měřených mastných kyselin v rozmezí 0,9835 – 0,9999, tudíž lze říci, že linearita je prokázána a metodu lze použít i pro kvantifikaci.

4.5 Stanovení obsahu lipidů v různých odrůdách ječmene Optimalizovanou metodou extrakce na automatickém extraktoru Fex®IKA bylo vyextrahováno 20 odrůd ječmene z ročníku 2008 a 20 odrůd ječmene z ročníku 2009. Obsah vyextrahovaných lipidů u obou ročníků je uveden v tabulce 4.5.1 a graficky zobrazen v grafu 4.5.1. Obsah lipidů v odrůdách ječmene ročníku 2008 i 2009 je ve většině případů stejný nebo se liší jen málo. Největší rozdíl je patrný u odrůdy Marthe, Wikingett, Binder a Belleuve. Rozdíl činí 0,69 % tuku v sušině u odrůdy Marthe, 0,46 % u odrůdy Wikingett, 0,36 % u odrůdy Binder a 0,22 % v odrůdě Belleuve.

43

Tab 4.5.1 Obsah lipidů v odrůdách ječmene - ročník 2008 a 2009 Tuk (g) Tuk (%) Tuk v sušině (%) Sušina (%) odrůda 2008 2009 2008 2009 2008 2009 2008 2009 Wikingett Troon Cruiser Bellevue Biatlon Mauritia Ebson NFC Tipple Westminster Publican Marthe Maltasia Lissane Musikant Xanadu Jersey Malvaz Binder Tepelský 421 Ratbořský

0,09 0,08 0,08 0,06 0,07 0,07 0,07 0,07 0,08 0,08 0,11 0,08 0,07 0,07 0,07 0,08 0,09 0,06 0,07 0,08

0,07 0,07 0,06 0,07 0,07 0,07 0,08 0,07 0,08 0,09 0,08 0,08 0,07 0,07 0,08 0,09 0,09 0,08 0,07 0,07

1,69 1,50 1,56 1,15 1,45 1,48 1,42 1,47 1,49 1,62 2,18 1,66 1,40 1,39 1,43 1,53 1,84 1,19 1,32 1,53

1,28 1,36 1,26 1,35 1,36 1,38 1,53 1,31 1,44 1,73 1,56 1,48 1,31 1,38 1,48 1,61 1,80 1,52 1,38 1,44

1,90 1,69 1,76 1,29 1,63 1,67 1,60 1,65 1,69 1,83 2,45 1,89 1,58 1,57 1,60 1,72 2,07 1,35 1,48 1,72

1,44 1,52 1,42 1,51 1,53 1,54 1,72 1,47 1,62 1,94 1,76 1,67 1,47 1,55 1,67 1,82 2,02 1,71 1,55 1,62

89,19 88,71 88,58 88,63 88,95 88,77 88,86 88,91 88,50 88,46 88,79 88,11 88,75 88,78 88,94 88,69 88,82 88,44 89,28 88,84

89,10 89,40 89,10 89,30 89,00 89,20 89,00 89,00 88,80 89,00 88,70 88,80 89,00 89,20 88,70 88,80 89,00 88,80 88,90 89,10

Vlhkost (%) 2008 2009 10,81 11,29 11,42 11,37 11,05 11,23 11,14 11,09 11,50 11,54 11,21 11,89 11,25 11,22 11,06 11,31 11,18 11,56 10,72 11,16

10,90 10,60 10,90 10,70 11,00 10,80 11,00 11,00 11,20 11,00 11,30 11,20 11,00 10,80 11,30 11,20 11,00 11,20 11,10 10,90

Porovnání obsahu lipidů v odrůdách ječmene ročník 2008 a 2009 2,50 2,00 1,50 % 1,00 0,50

W

ik in ge tt Tr oo C n ru is Be er l le vu e Bi at lo M n au rit ia Eb s N FC on T W e s i ppl e tm in st Pu er bl ic an M ar th e M al ta s Li ia ss a M ne us ik an Xa t na du Je rs ey M al va z B Te in pe de r ls ký 42 R 1 at bo řs ký

0,00 2008 2009

Graf 4.5.1 Grafické porovnání obsahu lipidů v odrůdách ječmene- ročník 2008 a 2009

4.6 Stanovení profilu mastných kyselin v obilce ječmene Po vyextrahování lipidů z obilek ječmene byly triacylglyceridy převedeny na methyl estery mastných kyselin a jejich analýza byla provedena optimalizovanou metodou GC-FID na koloně SLB-IL 100. Procentuální obsah jednotlivých mastných kyselin byl vyhodnocen

44

programem Chrom-Card. Chromatogram odrůdy ječmene Jersey je na obrázku 4.6.1., kde můžeme pozorovat majoritní zastoupení mastných kyselin: kyselina palmitová (č. 12), stearová (č. 16), olejová (č. 17), linolová (č. 19) a α-linolenová (č. 22). Zpracovaná data jsou uvedena v příloze 2 a grafické porovnání vybraných mastných kyselin ve všech odrůdách ječmene ročníku 2008 a 2009 je uvedeno v příloze 3.

Obr. 4.6.1 Chromatogram odrůdy ječmene Jersey Obsah kyseliny myristové (č. 8) byl v odrůdách Wikingett, Troon a Cruiser znatelně větší v ročníku 2009 oproti ročníku 2008. Odrůdy s vyšším obsahem této mastné kyseliny v ročníku 2008 jsou Biatlon, Maltasia, Jersey. Odrůda Tepelský 421 měla nejvyšší obsah této kyseliny, a to 0,39 %. V ročníku 2009 byl ve všech odrůdách ječmene stanoven větší obsah kyseliny pentadekanové (č. 10) než v ročníku 2008. Největší obsah této mastné kyseliny byl zjištěn u odrůdy Mauritia, 0,17 %. U odrůd Belevue, NFC Tripple a Malvaz nebyla kyselina pentadekanová detekována. Obsah kyseliny palmitové (č. 12) je v obou ročnících (2008, 2009) vyrovnaný. Obsah této mastné kyseliny se pohybuje od 18,78 – 28,15 %. Rozdíly v obsahu kyseliny stearové (č. 16) byly pozorovány u odrůd Wikingett, Troon, Cruiser a Binder, kdy byl obsah této mastné kyseliny větší v ročníku 2009. U odrůd Bellevue, Maltasia, Lissane, Musikant a Tepelský 421 byl obsah kyseliny stearové větší v ročníku 2008. Nejvyšší obsah kyseliny stearové byl naměřen u odrůdy Maltasia, 1,91 %. Obsah kyseliny olejové (č. 17) byl větší u všech odrůd v ročníku 2008, s výjimkou odrůdy Tepelský 421, v níž byl obsah kyseliny olejové vyšší v ročníku 2009. Nejvyšší obsah této mastné kyseliny byl prokázán v odrůdě Malvaz, 18,77 %. V obou ročnících byl pozorován vyrovnaný obsah kyseliny linolové (č. 19), jen u odrůdy Bellevue je obsah této mastné kyseliny znatelně nižší v ročníku 2009 (42,33 %).

45

Kromě odrůdy Bellevue byl obsah kyseliny α-linolenové (č. 22) vyšší u všech odrůd ječmene v ročníku 2009. Její nejvyšší obsah vykazovala odrůda Cruiser, ročník 2009. Naopak obsah kyseliny cis-11,14-eikosadienové (č. 25) byl u všech odrůd ječmene větší v ročníku 2008. Její obsah v ročníku 2008 je průměrně 8 krát větší než v ročníku 2009. U odrůd Maltasia, Xanadu, Jersey, Tepelský 421 a Ratbořský nebyl obsah kyseliny behenové (č. 31) detekován v ročníku 2009. U odrůdy Malvaz nebyl detekován obsah této mastné kyseliny ani v jednom z ročníků. Nejvyšší obsah kyseliny behenové byl zaznamenán u odrůdy Mauritia (0,13 %), ročník 2009. Ve většině případů byl obsah kyseliny erukové (č. 32) vyšší u odrůd ječmene z ročníku 2009. Největší rozdíl v obsahu této mastné kyseliny byl pozorován u odrůd Xanadu, Jersey a Malvaz. Nejvyšším obsahem kyseliny lignocerové (č. 36) se vyznačuje odrůda Malvaz v ročníku 2008. Větší rozdíly v obsahu kyseliny lignocerové byly stanoveny v odrůdách Bellevue, Musikant (vyšší obsah mastné kyseliny v ročníku 2008) a Maltasia (vyšší obsah mastné kyseliny v ročníku 2009). V odrůdách Lissane a Xanadu nebyla tato kyselina detekována. Obsah kyseliny nervonové (č. 37) byl v obou ročnících byl relativně vyrovnaný. Určité rozdíly byly zaznamenány u odrůd Tepelský 421, Maltasia, Publican a Westminster. Nejvyšší obsah této mastné kyseliny byl u odrůdy Marthe a Malvaz (0,05 %). Zastoupení a obsah mastných kyselin v jednotlivých odrůdách ječmene je velmi podobný v obou ročnících, s výjimkou kyseliny cis-11,14-eikosadienové. Tento rozdíl mohl být způsoben odlišnými podmínkami růstu a klimatickými podmínkami v roce 2009, kdy bylo v letních měsících poměrně deštivé počasí a tepleji než v roce 2008. Z výše uvedeného vyplývá, že rozdíl v obsahu mastných kyselin v obilce ječmene pravděpodobně není záležitostí odrůd, ale ročníků a podmínek, za kterých byly pěstovány.

46

5

ZÁVĚR

Tato diplomová práce se věnovala stanovení obsahu lipidů a profilu mastných kyselin v obilce ječmene. Mastné kyseliny jsou zdrojem žádoucích i nežádoucích aromatických látek v pivu. Jednou z nežádoucích látek je trans-2-nonenal, který vzniká oxidací mastných kyselin a způsobuje lepenkovou chuť piva. Proto má stanovení obsahu lipidů a profilu mastných kyselin své opodstatnění. V teoretické části diplomové práce je zpracována rešerše o metabolismu lipidů v rostlinném materiálu (syntéza a dagradace mastných kyselin), o způsobech extrakce lipidů z matrice a jejich následném stanovení. Dále zde byly shrnuty možnosti stanovení mastných kyselin a stručně popsána metoda GC-FID. Experimentální část této diplomové práce byla především věnována stanovení obsahu lipidů a profilu mastných kyselin ve dvaceti odrůdách ječmene z ročníku 2008 a dvaceti odrůdách z ročníku 2009. Lipidy byly stanoveny moderní optimalizovanou metodou extrakce na fluidním loži na automatickém extraktoru Fex®IKA. Obsah lipidů v odrůdách ječmene ročníku 2008 i 2009 je ve většině případů stejný nebo se liší jen málo. Nejvyšší obsah tuků v sušině obsahovala odrůda Marthe, 2,45 %, z ročníku 2008. Před samotným stanovením profilu mastných kyselin bylo nutné vzorky vyextrahovat a optimalizovat metodu GC-FID. Velká pozornost byla věnována výběru kolony. Byly porovnávány dvě kapilární kolony: SLB-IL 100 a Supelcowax. Ke stanovení byla vybrána kolona SLB-IL 100, protože vykazovala dokonalejší separaci analytů při stejných podmínkách a stejné době analýzy. Optimalizovanou metodou GC-FID bylo stanoveno v obilce ječmene procentuální zastoupení mastných kyselin ve formě jejich methylesterů. Nejvýše zastoupenou mastnou kyselinou byla kyselina linolová s průměrným obsahem 55,03 % v roce 2008 a 53,91 % v roce 2009. Mezi další majoritně zastoupené mastné kyseliny v obilce ječmene patří kyselina palmitová s průměrným obsahem 22,72 % v roce 2008 a 23,10 % v roce 2009, olejová s průměrným obsahem 1,47 % v roce 2008 a 1,32 % v roce 2009 a α-linolenová s průměrným obsahem 13,78 % v roce 2008 a 12,56 % v roce 2009. Obsah mastných kyselin v jednotlivých odrůdách je v obou ročnících relativně vyrovnaný. Výjimkou je kyselina cis-11,14-eikosadienová, které je ve všech odrůdách přibližně 8 krát více v ročníku 2008 než v ročníku 2009.

47

6 [1] [2] [3]

[4] [5] [6] [7]

[8]

[9] [10] [11] [12] [13]

[14] [15]

[16]

[17]

[18]

48

LITERATURA VELÍŠEK, J. Chemie potravin 1. 2. vyd. Tábor: OSSIS, 2002. 344 s. ISBN 80-86659-00-3. HÁLKOVÁ, J., RUMÍŠKOVÁ, M., RIEGLOVÁ, J. Analýza potravin. 2. vyd. Újezd u Brna: Ivan Straka, 2001. 101 s. ISBN 80-86494-02-0. VODRÁŽKA, Z. Biochemie pro studenty středních škol a všechny, které láká tajemství živé přírody. 1. vyd. Praha: Scientia, spol s r. o., pedagogické nakladatelství, 1998.164 s. ISBN 80-7183-083-6. KLOUDA, P. Základy biochemie. 1. vyd. Ostrava: nakladatelství Pavel Klouda, 2000. 155 s. ISBN 80-86369-00-5. OHLROGGEAV J., BROWSEB J. Lipid Biosynthesis. The Plant Cell. 1995. Vol. 7, pp. 957-970. US Patent 7230160 - Lipid metabolism regulators in plants. [cit. 2010-02-12]. Dostupné z: http://www.patentstorm.us/patents/7230160/fulltext.html KRUGER J. N., HILL S. A., RATCLIFFE G. R. Regulation of primary metabolic pathways in plants. Netherlands: Kluwer Academic publishers, 1999. 311 s. ISBN 0-7923-5494-X. FIALOVÁ, L. Metabolismus lipidů. Biosyntéza mastných kyselin a triacylglycerolů. [on-line]. Ústav lékařské biochemie 1. LF UK [cit. 2010-02-12]. Dostupné z: http://che1.lf1.cuni.cz/html/Syntesa_MK_3sm.pdf MURRAY, R. K, et al. Happer´s Illustrated biochemistry. 26. ed. USA: The McGraw-Hill Companies, Inc., 2003. 695 s. ISBN 0-07-138901-6. DAVÍDEK, J., a kol. Laboratorní příručka analýzy potravin. 2. vyd. Praha: SNTL – Nakladatelství technické literatury, 1981. 720 s. CHURÁČEK, J., a kol. Analytická separace látek. 1. vyd. Praha: SNTL – Nakladatelství technické literatury, 1990. 384 s. ISBN 80-03-00569-8. KOLEKTIV AUTORŮ Analýza organických látek: Sborník přednášek. Churáček, J. 1. vyd. Český Těšín: 2-THETA, 1999. 349 s. ISBN 80-902432-9-0. Prof. Dr. Franz Ritter von Soxhlet. [on-line]. Gymnasium & SOŠPg Liberec Jeronýmova. Dostupné z: http://www.jergym.hiedu.cz/~canovm/nadobi/extrakto/soxhlet.htm LUTHRIA, D. L. Oil extraction and analysis: critical issues and comparative studies. 1 ed. USA: AOCS Publishing, 2004. 282 s. ISBN 1-893997-78-2. Obrázek Soxhletova extraktoru. Dostupné z: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=cs&N4=64824|SUPELC O&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC# POIRIER, Y., ANTONENKOV, V. D., GLUMOFF, T., HILTUNEN, J. K. Peroxisomal β-oxidation - a metabolic pathway with multiple functions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 2006. Vol. 1763, Issue 12, pp. 1413-1426. MAREK, M. V. Fyziologie rostlin pro biofyziky. [on-line]. Přírodovědecká fakulta Palackého univerzity Olomouc. [cit. 2010-03-05] Dostupné z: http://www.usbe.cas.cz/upload/UserFiles/File/USBE/USBEdownload/Fyziologie_rostlin_skripta.pdf SALWAY, J. G. Metabolism at a glance. 3.ed. Blackwell publishing Ltd, 2004. 125 s. ISBN 1-4051-0716-2.

[19] [20] [21]

[22] [23] [24]

[25] [26]

[27]

[28] [29] [30] [31]

[32] [33] [34] [35] [36] [37] [38]

ROBERTS, K. Handbook of Plant Science, 2 Volume Set. John Willey & Sons Ltd, 2007.1648 s. ISBN 978-0-470-05723-0. BENDA, V. Biologie II. Nauka o potravinářských surovinách. 3. vyd. Vysoká škola chemicko.technologická. Praha, 2000. 196 s. ISBN 80-7080-402-5. PŘÍHODA, J., SKŘIVAN, P., HRUŠKOVÁ, M. Cereální chemie a technologie I: cereální chemie, mlýnská technologie, technologie výroby těstovin. 1. vyd. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Praha 2004.184 s. ISBN 80-7080-530-7. PUČ, V. Stanovení beta-karotenu v ječmeni metodou HPLC. Brno:Vysoké učení technické, Fakulta chemická, 2008. Vedoucí diplomové práce RNDr. Jaroslav Prýma BELITZ, H. D., GROSCH, W., SCHIEBERLE, P. Food Chemistry. 4. ed. Berlin Heidelberg: Springer, 2009. 1070 s. e-ISBN 978-3-540-69934-7. CARRASCO-PANCORBO, A., NAVAS-IGLESIAS, N., CUADROS-RODRÍGUEZ, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. Trends in Analytical Chemistry. 2009. Vol. 28, No. 3. AKOH, C. C., MIN, D. B. Food lipids: chemistry, nutrition, and biotechnology. 3. ed. USA: Taylor & Francis Group, 2008. 914 s. ISBN-10: 1-4200-4663-2. ANGELO ST., A. J., ORY, L. R. Lipid Degradation During Seed Deterioration Symposium: Deterioration Mechanisms in Seeds [on-line]. Southern Regional Research Center, ARS, US Department of Agriculture. 1983. [cit. 2010-03-26]. Dostupné z: http://apsnet.org/phyto/PDFS/1983/Phyto73n02_315.PDF SVOBODA, Z., MIKULÍKOVÁ, R., BĚLÁKOVÁ, S., BENEŠOVÁ, K., NESVADBA, Z. Stanovení obsahu lipidů a zastoupení mastných kyselin v obilkách ječmene a sladu. Kvasný průmysl. 2009. roč. 55, číslo 11 – 12, s. 315-320. LUTHRIA, D. L. Oil extraction and analysis: critical issues and comparative studies. USA: AOCS Press, 2004. 282 s. ISBN 1-893997-78-2 ASHURST, P. R. Food Flavorings. 3. ed. Springer – Verlag, 1999. 487 s. ISBN 978-0-8342-1621-1. KLOUDA, P. Moderní analytické metody. Ostrava: nakladatelství Pavel Klouda, 2003. 132 s. ISBN 80-86369-07-2. MODEY, W. K., MULHOLLAND, D. A., RAYNORANALYT, M. W. Analytical Supercritical Fluid Extraction of Natural Products. Phytochemical Analysis. 1996, Vol. 7, pp. 1-15. LANG, Q., WAI, CH. M. Supercritical fluid extraction in herbal and natural product studies – a practical review. Talanta. 2001, Vol. 53, pp. 771-782. TAYLOR, A., HORT, J. Modifying Flavour in Food. Woodhead Publishing, 2007. 302 s. ISBN 978-1-4200-4389-1. MITRA, S. Sample preparation techniques in analytical chemistry. John Willey & Sons, 2003. 458 s. ISBN 0-471-32845-6. Extraktory fexIKA. [on - line]. [cit. 2010-03-28]. Dostupné z: http://www.labicom.cz/default.aspx?section=16 IKA®Extracting. [on - line]. [cit. 2010-03-28]. Dostupné z: http://www.yjcorp.co.kr/admin/dataroom/IKA_Solid_liquid_extractors.pdf ANKOM XT10 Extraktor – návod k obsluze. 19 s. PLATTENBERG, R. H. Environmental pollution: new research. New York: Nova Science publishers, Inc, 2007. 308 s. ISBN 10 1-60021-285-9.

49

[39] [40] [41] [42] [43] [44]

[45]

[46] [47] [48] [49] [50]

[51] [52] [53]

[54]

[55] [56]

50

HAMMOND, E. W. Chromatography for the analysis of the lipids. CRC Press, Inc., 1993. 188 s. ISBN 0-8493-4255-4. PERKINS, E. G. Analyses of Fats, Oils and Derivatives. AOCS Press, 1993. 438 s. ISBN 0-935315-48-9. SHIBAMOTO, T. Lipid chromatographic analysis. USA: Marcel Dekker, Inc., 1994. 412 s. ISBN 0-8247-8941-5. EL-GEWELY, M. R. Biotechnology Annual Review. 1. ed. Netherlands: Elsevier B. V., 2006. 422 s. ISBN 0-444-52724-9. TEALE, M. C. Omega 3 fatty acid research. New York: Nova Science Publishers, Inc., 2006. 301 s. ISBN 1-59454-620-7. THIMMINS, A. MACPHERSON, E. J. & ACKMAN, R. G. Direct use of methyl tricosanoate as an internal standard and overcoming a potential error in the quantification of the omega-3 long chain polyunsaturated fatty acid of marine oils as ethyl esters. Food chem. 2000, Vol.70, pp. 426 – 426. CHRISTIE, W. The lipid library- The preparation of Derivates of Fatty Acid. [on – line; poslední revize: 2009 – 10 -07]. [cit. 2010-04-10]. Dostupné z: http://lipidlibrary.aocs.org/GC_lipid/04_deriv/index.htm BAREK, J., ET AL. Nomenklatura a terminologie. Metrologická terminologie v chemii. Chemické listy, 2000, roč. 94, č. 7, s. 439-444. ISSN 1213-7103. Validační program pro statistické zpracování analytických dat. [on-line]. [cit. 2010-04-13]. Dostupné z: http://hplc.sweb.cz SUCHÁNEK, M., PLZÁK, Z., ŠUBRT, P., KORUNA, I. Kvalimetrie. 7. Validace analytických metod. Vyd. Praha: EURACHEM-ČR, 1997. 137 s. ISBN 80-901868-2-3 HENDL, J. Přehled statistických metod zpracování dat. Praha: Portál, 2004. 584 s. ISBN 80-7178-820-1. Validace. [cit. 2010-04-13]. Dostupné z: http://www.labmet.cz/cs/c/validace-meridelpristroju-validace-sterilizatoru-termostatu-chladnic-mraznic-peci-validace-susarencentrifug/validace.htm Mez detekce a mez stanovitelnosti [on-line]. [cit. 2010-04-15]. Dostupné z: http://www.hplc.cz/Tip/lod_loq.htm EDER, K. Gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. Journal of Chromatography B, 671 (1995) 113-131 RIDDELLOVÁ, K. Plynová chromatografie (Nástřiky) [on-line]. [cit. 2010-04-16]. VŠCHT Praha.Dostupné z: http://web.vscht.cz/poustkaj/ISM_GC_NASTRIKY_1107.pdf RUPRICHOVÁ, L. Zavedení metody stanovení konjugované linolové kyseliny (CLA). Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2009. 67 s. Vedoucí diplomové práce Ing. Eva Vítová, Ph.D. McNAIR, H. M., MILLER, J. M. Basic gas chromatogrphy. 2.ed. John Willey & Sons, 2009. 239 s. ISBN 978-0-470-43954-8. Aplikační list, speciální plyny – plamenoionizační detektor [on-line]. Linde. [cit. 2010-04-16]. Dostupné z: http://www.lindegas.cz/international/web/lg/cz/like35lgcz.nsf/repositorybyalias/pdf_plamenoionizacni_ detektor/$file/Plamenoionizacni_detektor.pdf

7

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

MK

mastné kyseliny

EPA

eikosapentaenová kyselina

CoA

koenzym A

ACP

acyl carrier protein

LOX

lipoxygenasa

DES

divinylether syntasa

POX

peroxygenása

HPL

hydroperoxid lyasa

EAS

epoxy alkohol syntasa

AOS

allen oxid syntasa

IL

isocitrát lyasa

MS

malát syntasa

CS

citrát syntasa

AC

akonitasa

MD

malát dehydrogenasa

CAT

katalasa

AP

askorbát peroxidasa

AR

askorbát reuktasa

LLE

liquid-liquid extrakce

SPE

extrakce na pevné fázi

SFE

superkritická fluidní extrakce

MAE

extrakce pomocí mikrovln

PFE

přetlaková fluidní extrakce

EI

elektronová ionizace

NMR

nukleární magnetická rezonance

FT-IR

Fourier transform infrared (spectroscopy)

GC-MS plynová chromatografie s hmotnostní detekcí LC-MS kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí CE-MS kapilární elektroforéza s hmotnostní detekcí TLC

chromatografie na tenké vrstvě

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

NP-LC

kapalinová chromatografie s normální fází

RP-LC

kapalinová chromatografie s reverzní fází

FAME

Fatty acid methyl ester (methylestery mastných kyselin)

CLA

konjugovaná kyselina linolová

RID

refractive index detector (detektor indexu lomu)

51

ELSD

evaporatin light-scattering detection

ECD

elektrochemický detektor

SCD

suppressed conduktivity detection

CAD

Charged aerosol detection

ELLSD Evaporative laser light scattering detection FID

plamenově-ionizačním detektor

MS

hmotnostní spektrometrie

ESI

ionizace elektrosprejem

FAB

fast atom bombardment (ionizace rychlými atomy a ionty)

MALDI matrix-assisted laser desorption/ionization (desorpce laserem za přítomnosti matrice) FD

field desorption

APCI

Atmospheric pressure chemical ionization

APPI

Atmospheric Pressure Photoionization

CI

chemická ionizace

Q

kvadrupol

IT

iontová past

QIT

kvadrupólová-iontová past

QQQ

tripl-kvadrupol

TOF

Time-of-flight

Q-TOF

quadrupole-Time-of-flight

FT-ICR Fourier-transform ion cyclotron resonance OT

Orbitrap

IT-OT

iontová past-Orbitrap

CAS

Chemical Abstracts Servise Registry Number; CAS registrační číslo

52

8

PŘÍLOHY

Příloha 1 Seznam mastných kyselin ze standardu FAME mix 37 Příloha 2 Porovnání mastných kyselin v odrůdách ječmene – ročník 2008, 2009 Příloha 3 Grafické porovnání mastných kyselin v odrůdách ječmene – ročník 2008/2009

53

Příloha 1 Seznam mastných kyselin, jejichž methylestery jsou obsaženy ve standardu FAME mix 37 Číslo MK 1

Máselná kyselina (C4:0)

Číslo MK 20

linolelaidová kyselina (C18:2n6t)

mastná kyselina

2

kapronová kyselina (C6:0)

21

γ-linolenová kyselina (C18:3n6)

3

kaprylová kyselina (C8:0)

22

α-linolenová kyselina (C18:3n3)

4

kaprinová kyselina (C10:0)

23

arachová kyselina (C20:0)

5

undekanová kyselina (C11:0)

24

cis-11-eikosenová kyselina (20:1)

6

laurová kyselina (C12:0)

25

7

tridekanová kyselina (C13:0)

26

8

myristová kyselina (C14:0)

27

9

28

12

myristolejová kyselina (C14:1) pentadekanová kyselina (C15:0) cis-10-pentadecenová kyselina (C15:1) palmitová kyselina (C16:0)

cis-11,14-eikosadienová kyselina (C20:2) cis-8,11,14-eikosatrienová kyselina (C20:3n6) cis-11,14,17-eikosatrienová kyselina (C20:3n3) arachidonová kyselina (C20:4n6) cis-5,8,11,14,17-eikosapentaenová kyselina (C20:5n3)

13 14

10

29 30

heneikosanová kyselina (C21:0)

31

behenová kyselina (C22:0)

palmitolejová kyselina (C16:1)

32

eruková kyselina (C22:1n9)

33

16

heptadekanoá kyselina (17:0) cis-10-heptadecenová kyselina (C17:1) stearová kyselina (C18:0)

35

cis-13,16-dokosadienová kyselina (C22:2) cis-4,7,10,13,16,19-dokosahexaenová kyselina (C22:6n3) trikosanová kyselina (C23:0)

17

olejová kyselina (C18:1n9c)

36

lignocerová kyselina (C24:0)

18

elaidová kyselina/(C18:1n9t)

37

nervonová kyselina (C24:1n9)

19

linolová kyselina (C18:2n6c)

–

11

15

54

mastná kyselina

34

–

55

Wikingett Troon Cruiser Bellevue Biatlon Mauritia Ebson NFC Tipple Westminster Publican Marthe Maltasia Lissane Musikant Xanadu Jersey Malvaz Binder Tepelský 421 Ratbořský

Odrůda

2009

0,33 0,41 0,33 0,32 0,10 0,34 0,26 0,34 0,29 0,37 0,29 0,20 0,27 0,23 0,26 0,19 0,22 0,27 0,20 0,23

2008

0,29 0,25 0,21 0,38 0,23 0,33 0,22 0,36 0,32 0,37 0,24 0,30 0,33 0,29 0,25 0,26 0,23 0,36 0,39 0,27

8 0,08 0,10 0,08 0,10 0,09 0,10 0,07 0,11 0,09 0,08 0,08 0,11 0,08 0,09 0,08 0,08 0,07 0,10 0,10 0,10

2008

10 0,14 0,16 0,14 0,10 0,17 0,11 0,11 0,15 0,08 0,13 0,07 0,09 0,10 0,09 0,10 0,11 0,10

2009 21,88 21,44 21,42 23,91 22,26 23,56 22,42 23,39 24,29 22,57 21,70 24,78 24,72 23,55 21,51 22,70 18,78 23,33 25,15 21,11

2008

12 23,00 23,83 24,21 19,97 24,61 23,86 22,92 24,56 24,10 23,07 22,27 22,98 24,13 24,05 24,13 23,51 21,06 23,00 21,21 21,49

2009

MK

Příloha 2 Porovnání mastných kyselin v odrůdách ječmene – ročník 2008 a 2009

1,69 1,46 1,38 1,49 1,44 1,40 1,29 1,25 1,45 1,34 1,51 1,91 1,70 1,69 1,48 1,41 1,06 1,34 1,89 1,18

2008

16 1,90 1,68 1,68 1,03 1,37 1,39 1,22 1,14 1,20 1,22 1,48 1,40 1,23 1,09 1,20 1,12 1,24 1,62 1,15 1,09

2009 13,85 12,63 14,43 12,97 13,63 12,89 13,83 14,03 13,52 13,00 13,42 13,24 12,65 12,44 14,33 14,03 18,77 13,17 12,15 16,58

2008

17 11,64 12,73 12,52 8,98 12,48 10,92 12,68 10,84 12,53 11,92 12,41 12,70 12,23 11,51 13,14 12,92 16,98 12,88 15,52 13,68

2009 55,61 57,63 55,64 54,74 55,26 54,87 55,20 55,82 53,62 55,61 56,17 53,25 54,37 55,55 55,22 54,27 54,24 54,98 54,39 54,12

2008

19 55,44 53,16 52,65 42,33 53,10 55,26 54,53 55,17 53,85 55,52 55,61 54,74 54,89 55,84 53,62 54,07 53,53 55,20 54,03 55,68

2009

56

Wikingett Troon Cruiser Bellevue Biatlon Mauritia Ebson NFC Tipple Westminster Publican Marthe Maltasia Lissane Musikant Xanadu Jersey Malvaz Binder Tepelský 421 Ratbořský

Odrůda 2009 6,09 6,56 6,94 4,91 6,75 6,86 6,57 6,39 6,59 6,31 6,41 6,65 6,04 5,74 6,37 6,72 5,71 5,54 6,40 6,30

2008

5,43 5,31 5,48 5,13 5,69 5,66 5,62 4,95 5,46 5,65 5,43 5,39 5,08 5,13 5,59 5,86 4,94 5,32 4,87 5,26

22 0,62 0,63 0,74 0,70 0,78 0,68 0,77 0,68 0,69 0,76 0,77 0,59 0,62 0,69 0,87 0,78 0,88 0,76 0,58 0,80

2008

25 0,08 0,08 0,10 0,07 0,10 0,11 0,18 0,11 0,12 0,08 0,11 0,09 0,09 0,06 0,08 0,08 0,06 0,08 0,08 0,10

2009 0,09 0,08 0,09 0,08 0,08 0,07 0,07 0,08 0,08 0,10 0,10 0,06 0,06 0,08 0,09 0,07 0,80 0,10 0,06 0,09

2008

31 0,07 0,08 0,09 0,07 0,10 0,13 0,10 0,10 0,10 0,09 0,11 0,08 0,11 0,03 -

2009

MK

0,09 0,10 0,11 0,11 0,12 0,08 0,11 0,14 0,11 0,11 0,13 0,08 0,08 0,11 0,13 0,12 0,16 0,12 0,10 0,12

2008

32 0,08 0,08 0,13 0,08 0,14 0,10 0,13 0,16 0,11 0,11 0,16 0,11 0,10 0,12 0,06 0,19 0,06 0,14 0,13 0,15

2009

Příloha 2 Porovnání mastných kyselin v odrůdách ječmene – ročník 2008 a 2009 (pokračování)

0,03 0,04 0,05 0,05 0,05 0,04 0,06 0,05 0,05 0,05 0,07 0,02 0,03 0,05 0,05 0,06 0,08 0,06 0,02 0,05

2008

36 0,02 0,04 0,04 0,02 0,04 0,05 0,07 0,03 0,04 0,07 0,05 0,05 0,03 0,04 0,03 0,07 0,04 0,05

2009 0,03 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,03 0,04 0,05 0,05 0,02 0,03 0,04 0,05 0,05 0,05 0,04 0,02 0,04

2008

37 0,04 0,04 0,04 0,03 0,03 0,04 0,04 0,03 0,02 0,03 0,05 0,04 0,03 0,05 0,04 0,05 0,04 0,04

2009

57

ik W

0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00

i W

ge in

tt

tt

e ng ki

0,05 0,00

0,25 0,20 0,15 0,10

0,35 0,30

0,45 0,40

o Tr

on

on

o Tr

C

is ru

C

er

er is ru

Be

e vu

e vu ll e

lle Be

lo at Bi

n

n

lo at Bi 2008

a s Eb N

on FC

p Ti tm es W

e pl in

er st ic bl Pu

an M

e th ar M

a si ta l a e M

2009

an ss i L

n ika us

t X

ad an

u r Je

y se

M 2008

ia ri t au s Eb N

on FC

p Ti tm es W

e pl i

r te ns

an l ic b Pu

M

ar

e th M

a si ta al

e

2009

an ss i L

M

n ika s u

t X

ad an

u

rs Je

ey M

Porovnání obsahu kyseliny pentadekanové (č.10) ve všech vzorcích ječmene

M

i ri t au

Porovnání obsahu kyseliny myristové (č. 8) ve všech vzorcích ječmene

Příloha 3 Grafické porovnání mastných kyselin v odrůdách ječmene – ročník 2008/2009

%

%

va al

M

z

va al

z

el

42

ý sk

ký ls pe

r

Te

e nd Bi

r p Te

e nd Bi

1

42

1

%

%

58

i W

e ng ki

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

tt

ge in k i W

0,00

5,00

15,00 10,00

20,00

25,00

30,00

tt

o Tr

on

oo Tr

n

C

er is u r

C

ue

e vu lle

v lle

Be

Be

er is u r

lo at Bi

n M

s Eb N

on FC

p Ti es W

e pl tm

s in

r te P

lic ub

an M

e th ar M

si ta al

a L

ne M

2009

a iss

ika us

nt X

ad an

u r Je

y se

N

n so Eb

2008

ia ri t u a FC

p Ti tm es W

e pl

er st n i ic bl u P

an M

e th ar M

a si ta al

e

2009

an ss Li

M

ika us

nt

d na a X

u r Je

y se

Porovnání obsahu kyseliny stearové (č. 16) ve všech vzorcích ječmene

2008

n ia lo ri t u at i a B M

Porovnání obsahu kyseliny palmitové (č. 12) ve všech vzorcích ječmene

M

M

va al

z va al

z

ký ls pe

r

Te

e nd Bi

42

1 er 42 nd i ý B k ls pe e T

1

59

%

%

ge in ik W

50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00

70,00 60,00

ge in ik W

20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00

tt

tt

n

on

oo Tr

o Tr

er

B

le el

e vu

e er vu is le ru l C Be

C

is ru

B

n

t lo ia

lo at Bi

n

N

n so b E FC

e pl

es W

p Ti tm

in

er st P

lic ub

an M

ar

e th M

si ta al

a e

2009

an ss i L M

ik us

an

t d na a X

u r Je

y se

a

e n er an pl so st lic ip b n b i T E tm Pu FC es N W

2008

i rit au M

ar

e th M

a si ta l a

e

2009

an ss i L

M

u

an sik

t

d na Xa

u J

M

y se er

Porovnání obsahu kyseliny linolové (č. 19) ve všech vzorcích ječmene

2008

M

M

ia ri t u a

Porovnání obsahu kyseliny olejové (č. 17) ve všech vzorcích ječmene

z

1 er 42 nd i ý B sk el p Te

1 er 42 nd i ý B sk el p Te

va al

z

M

va al

%

%

60

i W

e ng ki

1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

tt

tt

ge in ik W

8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00

oo Tr

o Tr

n

on

C

is ru

C

er

is ru

B

er

le el

e vu

Be

v lle

ue

n

2008

M

ia ri t au s Eb

on N

FC

p Ti es W

e pl tm

i

r te ns P

lic ub

an M

e th ar M

si ta al

a

2009

L

an iss

e M

u

an sik

t d na Xa

u J

y se er

lo at Bi

n

2008

M

i ri t au

a N

n so b E FC

p Ti es W

e pl tm

s in

r te P

an ic l ub M

e th ar M

a si ta l a

2009

an ss i L

e M

u

an sik

t

d na a X

u

ey rs e J

M

z va al

Porovnání obsahu kyseliny cis-11,14- eikosadienové (č. 25) ve všech vzorcích ječmene

B

t lo ia

Porovnání obsahu kyselin α -linolenové (č. 22) ve všech vzorcích ječmene

Te

e nd Bi

z

ký ls e p

r

M

va al

42

1

r p Te

e nd i B

el

ý sk

42

1

61

%

%

ik W

0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00

tt

tt

ge in

ge in

ik W

0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00

o Tr

on

on

o Tr

C

is ru

C

er

er

is ru

Be

v lle

Be

ue

ue

v lle

lo at Bi

B M

M

N

n so b E FC

p Ti tm es W

e pl i

r te ns an l ic b Pu M

ar

e th M

a si ta al 2009

L

an iss

e M

u

a sik

nt d na Xa

u J

y se er

2008

ia ri t au E N

on bs FC

e pl

tm es W

p Ti i

r te ns P

an li c b u

M

ar

e th M

a si ta l a

e

2009

an ss i L

M

u

a sik

nt

d na Xa

u J

y se er

Porovnání obsahukyseliny erukové (č. 32) ve všech vzorcích ječmene

ia ri t au

2008

n

n

t lo ia

M

z va al

M

z va al

Porovnání obsahu MK kyseliny behenové (č. 31) ve všech vzorcích ječmene

1 er 42 nd i ý B sk el p Te

1 er 42 nd i ý B k ls pe e T

%

%

62

W

i

ge in

tt

tt

e ng ki

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

ik W

0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00

on

on

o Tr

o Tr

C

C

er

er

is ru

is ru

B

le el

Be

ue

e vu

v lle

n

n

lo at Bi

B

t lo ia

ia ri t au

2008

M

s Eb N

on FC

p Ti W

es

e pl tm

i

r te ns P

lic ub

an M

ar

e th M

si ta al

a s Li

e M

2009

n sa u

a sik

nt X

ad an

u J

s er

ey

s Eb N

on FC

p Ti es W

e pl tm

in

er st P

lic ub

an M

ar

e th M

si ta l a

a

ne

2009

a ss Li

M

ik us

an

t

d na a X

u

ey rs e J

Porovnání obsahu kyseliny nervonové (č. 37) ve všech vzorcích ječmene

2008

M

ia ri t au

Porovnání obsahu kyseliny lignocerové (č. 36) ve všech vzorcích ječmene

M

M

z

z

va al

va al

r

r ký

ký

s el

s el

p Te

e nd Bi

p Te

e nd Bi

1

1

42

42