Základy analýzy potravin
Přednáška 8
STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ BÍLKOVIN Důvody pro stanovení AK složení • určení nutriční hodnoty potraviny, suroviny (esenciální vs. neesenciální AK) • charakterizace určité bílkovinné frakce nebo konkrétní bílkoviny (první krok před určováním struktury bílkoviny) Postup stanovení aminokyselinového složení 1. izolace bílkovin (přítomnost sacharidů, lipidů komplikuje další kroky) 2. hydrolýza vzorku 3. vlastní stanovení aminokyselin v hydrolyzátu Hydrolýza bílkovin má zajistit rozštěpení bílkovinných makromolekul na stavební jednotky – aminokyseliny Možnosti provedení: • kyselá hydrolýza • alkalická hydrolýza • enzymová hydrolýza Kyselá hydrolýza bílkovin • nejčastěji hydrolýza 6M HCl při 110°C 16-72 hod (rychlá hydrolýza: mikrovlnný ohřev 145-155°C, 4 hod) • nevýhody kyselé hydrolýzy: • destrukce Trp (zčásti Ser, Thr) • hydrolýza amidových vazeb Gln a Asn → Glu resp. Asp • částečná oxidace Cys 11
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
• při předběžné oxidaci vzorku permravenčí kyselinou dochází ke konverzi sirných aminokyselin: Cys → cysteová kyselina (–SH → –SO3H) Met → methioninsulfon Alkalická hydrolýza bílkovin • 4,2M NaOH nebo 2M Ba(OH)2 nebo 4M LiOH, 110°C, 22 hod (nebo mikrovlnný ohřev 50-60 min) • zpravidla se používá jen pro stanovení Trp (chybu minimalizuje použití 5-methyl-tryptofanu jako interního standardu) • dochází k destrukci Arg a cystinu
12
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
STANOVENÍ A DŮKAZY AMINOKYSELIN Stanovení AK
• volných • vázaných v bílkovinách a peptidech
Důvody pro analýzu aminokyselin • • • • • •
nutriční hodnota, AK složení bílkoviny kontrola receptury výrobku Phe vs. potraviny pro fenylketonuriky potraviny fortifikované esenciálními AK Glu jako ochucující přísada určování druhu suroviny
Planární chromatografie aminokyselin • zejména TLC, HPTLC (PC se používá málo) • slouží ke kvalitativní, příp. semikvantitativní analýze • porovnání polohy skvrn vzorku na chromatogramu se skvrnami standardních látek, RF hodnoty • denzitometrické měření skvrn • spektrofotometrické měření po eluci látky ze skvrny Příklady podmínek pro TLC aminokyselin: • silikagel, mobilní fáze: butanol – kyselina octová – voda (4:1:1) nebo • dvourozměrná chromatografie na silikagelu (1.směr: CHCl3 – MeOH – 17% NH3 2:2:1 objemově, 2.směr: fenol – voda 3:1 hmotnostně)
13
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Detekce aminokyselin v planární chomatografii Reakce s ninhydrinem (postříkání chromatogramu acetonovým roztokem, odpaření, záhřev): většina AK poskytuje červenofialové až modrofialové produkty
R
CH
COOH
+
OH 2
OH
NH2
O
O
O
O
+
R CH
O
+ +
+ 3 H2O
CO2
N OH
O
prolin a hydroxyprolin poskytují žlutý produkt R O
O
N O
OH
Detekce ninhydrinem je neselektivní, reagují i bílkoviny, peptidy, aminy, amoniak… Jiná možnost detekce: ninhydrin + Cu(NO3)2 →různě barevné skvrny jednotlivých AK Další detekční (resp. derivatizační) činidla: • • • •
kyselina trinitrobenzensulfonová (→ žluté produkty) 2,4-dinitrofluorbenzen (→ žlutě zbarvené deriváty, dělení TLC) 4-toluensulfonová kyselina (→ tosylderiváty) dansylchlorid (→ fluoreskující dansylderiváty)
14
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Stanovení celkového množství aminokyselin Formolová titrace aminokyselin po reakci AK s formaldehydem (aduje se na aminoskupinu) se uplatní kyselý charakter karboxylu a kyseliny lze titrovat odměrným roztokem hydroxidu na fenolftalein R
CH
COOH
+
CH2
R
O
CH
COOH
+
H2O
N=CH2
NH2
Spektrofotometrická stanovení • ninhydrinem absorbance produktů se měří při 570 nm (u prolinu a hydroxyprolinu při 430 nm) • kys. trinitrobenzensulfonovou: v alkalickém prostředí vznikají žluté produkty, měří absorbance při 340 nm NO2 R
CH NH2
COOH
+
O2N
NO2
SO3H
-H2O
O2N
SO2 NO2
NO2
NH
CH
COOH
R
prolin a hydroxyprolin nereagují Manometrické stanovení aminokyselin (VAN SLYKE) kys. dusitá konvertuje α-aminokyseliny na α-hydroxykyseliny, uvolňuje se ekvimolární množství dusíku, kyselé produkty rozkladu HNO2 se absorbují v roztoku hydroxidu, množství dusíku se určí z nárůstu tlaku 15
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Stanovení aminokyselin vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií Nejčastější typy: • iontoměničová chromatografie (IEC): dělení ve formě aminokyselin, pokolonová derivatizace • chromatografie na obrácené fázi (RP-HPLC): zpravidla dělení derivátů aminokyselin – předkolonová derivatizace Možnosti detekce aminokyselin v HPLC Vlastní absorpce AK v UV se analyticky většinou nevyužívá (absorbují jen aromat. AK, detekce je neselektivní a málo citlivá). Tryptofan lze detekovat fluorimetricky. K detekci většiny AK slouží derivatizace, tj. konverze analytu na derivát vhodných spektrálních nebo elektrochemických vlastností. Derivatizace může být • pokolonová (separované AK vystupující z kolony reagují s tokem činidla a vznikají deriváty – např. reakce s ninhydrinem) • předkolonová (deriváty se vytvoří reakcí složek vzorku s činidlem před nástřikem do chromatografu) Příklady detekce AK s použitím derivatizace Detekce UV/VIS
Činidlo ninhydrin dabsyl chlorid PITC fluorimetrická OPA dansyl chlorid elektrochemická OPA
Pozn. pokolonová deriv., 570 a 440 nm 425 a 436 nm 254-280 nm ex. 330 nm, em. 455 nm předkolonová d.,ex. 340 nm, em. 510 nm 0,4-0,7 V
16
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Chemické reakce probíhající při derivatizaci AK – příklady: N= N
(CH3)2N
SO2Cl
+
CH
R
COOH
NH2
dabsylchlorid - HCl
N= N
(CH3)2N
SO2
CH
NH
COOH
R
dabsylderivát Pozn.: dabsylchlorid reaguje i se sek. aminokyselinami (Pro) a aminy
PITC (fenylisothiokyanát)
fenylthiokarbamoyl (PTC) aminokyselina
Pozn.: PITC se používá také při Edmanově odbourání peptidů; v tom případě vznikají fenylthiohydantoiny O
R H H
+
H2N
CH
COOH
+
HS
CH2
CH2
OH
merkaptoethanol
O OPA (ortho-ftalaldehyd)
S
CH2 N
CH
CH2OH COOH
R
Pozn.: OPA lze použít i k detekci sek. aminokyselin (Pro) po jejich oxidaci chlornanem 17
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
(konverze na primární amin) SO2Cl
SO2
+ N(CH3)2
H2N
CH
COOH
NH
CH R
- HCl
R
N(CH3)2
dansylchlorid
dansylderivát
18
COOH
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Stanovení aminokyselin iontoměničovou chromatografií Klasický přístup (automatické analyzátory aminokyselin): • dělení AK na silně kyselém katexu • eluce řadou pufrů o rostoucí hodnotě pH (3,3-10,5) v několika krocích • pokolonová derivatizace ninhydrinem (reakční cívka 130-135°C) • detekce monitorováním absorbance při 570 a 440 nm HPLC směsi aminokyselin pokolonová derivatizace ninhydrinem horní křivka: A570 spodní křivka: A440 nástřik jednotlivých AK: 10 nmol
Alternativy: • gradientová eluce • použití jiných činidel pro pokolonovou derivatizaci (OPA, fluorimetrická detekce → velmi vysoká citlivost) Chromatogram hydrolyzátu sójové mouky připraveného po předchozí oxidaci sirných AK; derivatizace ninhydrinem; 1 – cysteová kys. 2 – Asp, 3 – Met sulfon, 4 – Thr, 5 – Ser, 6 – Glu, … 18 – Lys, 19 – His, 20 – NH3, 21 – Arg
19
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Rychlá IEC analýza 16 aminokyselin; pokolonová derivatizace o-ftalaldehydem a merkaptoethanolem; fluorescenční detekce: excitace 360 nm, emise 418-700 nm; nátřik jednotlivých AK: 2,5 nmol
Stanovení aminokyselin chromatografií na obrácené fázi • zpravidla předkolonová derivatizace (dabsyl-, dansyl-chlorid, OPA) • gradientová eluce derivátů AK • detekce (UV/VIS, fluorimetrie…)
RP-HPLC směsi derivátů aminokyselin s OPA a ME kolona C18, 5µm, 250×4,6 mm, předkolona C18, 40µm, 80×4,6 mm mobilní fáze A: THF+ MeOH+ 0,05M NaOAc (pH 5,9) 1+19+80 mobilní fáze B: MeOH + 0,05M NaOAc (pH 5,9) 80+20 průtok 1,7 ml/min fluorescenční detekce nástřik 5 pmol (aminokyseliny), NH3 (20 pmol)
20
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Stanovení aminokyselin plynovou chromatografií pro dosažení potřebné těkavosti je nutná derivatizace Obvyklý způsob – dvoustupňová derivatizace: 1) esterifikace aminokyseliny alkoholem (MeOH, PrOH, iPrOH, BuOH, iBuOH, iAmOH) v prostředí 3M HCl: R
CH
COOH
+
R1 OH
NH2
- H2O
R
CH
COO R1
NH2
2) acylace aminoskupiny esteru anhydridem kyseliny (octové, trifluoroctové, pentafluorpropionové, heptafluorbutanové): R2
R
CH NH2
COO R1
+
CO O
R2
R
CO
CH NH
+
COO R1
C
R2
COOH
R2
O
Příklad: GC analýza N-heptafluorbutyryl isobutyl derivátů aminokyselin kapilární kolona WCOT 50 m × 0,22 mm stacionární fáze SE 30 teplota kolony 100-250°C detekce FID
21
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Alternativní postupy derivatizace aminokyselin a) silylace bis(trimethylsilyl) trifluoracetamidem (BSTFA) O CF3 R
CH
C
N (Si(CH3)3)2
COOH
R
- CF CONH 3 2
NH2
COOSi(CH3)3
CH
NHSi(CH3)3
b) reakce s alkyl-chloroformiátem O R
CH NH2
COOH
+
2 Cl
C
OR1
- 2 HCl
R
O
CH
C
NH
C
O C
O
OR1
OR1
O - CO2 O R
CH
C
NH
C
O R1 OR1
O
N-alkoxykarbonyl derivát esteru aminokyseliny (R1 = Me, Et)
22
