Separační metody a jejich kombinace ve výuce analytické chemie

Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav chemie

Separační metody a jejich kombinace ve výuce analytické chemie Diplomová práce

Bc. Michal Machalíček

Vedoucí práce: RNDr. Marta Farková, CSc. 1

Brno 2012

Bibliografický záznam Autor:

Bc. Michal Machalíček Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Ústav chemie

Název práce:

Separační metody a jejich kombinace ve výuce analytické chemie

Studijní program:

PřF N-CH Chemie

Studijní obor:

PřF ANAL Analytická chemie

Vedoucí práce:

RNDr. Marta Farková, CSc.

Konzultant práce:

doc. RNDr. Přemysl Lubal, Ph.D.

Akademický rok:

2011/2012

Počet stran:

65

Klíčová slova:

Měď; Hliník; Separační metody; Chemometrie; Validace metod

Bibliographic Entry Author:

Bc. Michal Machalíček Faculty of Science, Masaryk University, Department of Chemistry

Title of Thesis:

Separation methods and their combinations in teaching analytical chemistry

Degree Programme:

FSci N-CH Chemistry

Field of Study:

FSci ANAL Analytical Chemistry

Supervisor:

RNDr. Marta Farková, CSc.

Consultant:

doc. RNDr. Přemysl Lubal, Ph.D.

Academic Year:

2011/2012

Number of Pages:

65

Keywords:

Copper; Aluminum; Separation methods; Chemometrics; Validation of methods

Abstrakt Ve své diplomové práci se věnuji analytickým metodám a postupům, které by mohly být zajímavé a hlavně přínosné pro studenty bakalářského a magisterského studia Chemie na PřF Masarykovy univerzity v rámci jejich laboratorních kurzů. Soustředil jsem se na separační metody (plynová chromatografie, vysokoúčinná kapalinová chromatografie), které umožňují pomocí komplexotvorných činidel oddělit a následně analyzovat kovové ionty (měď, hliník, apod.). Dále jsem se v rámci své diplomové práce věnoval analytickým postupům na stanovení mědi pomocí spektrofotometrie a průtokové chronopotenciometrie. Jako součást diplomové práce jsem vytvořil návody k jednotlivým analytickým metodám pro laboratorní cvičení z analytické chemie.

Abstract In this thesis I study analytical methods and procedures that might be interesting and especially useful for students of Bachelor and Master Chemistry programs at the Faculty of Science of Masaryk University in their laboratory courses. I was focused on separation methods (gas chromatography, high-performance liquid chromatography), which allow metal ions (copper, aluminum, etc.) to be separated and analyzed by complex agents. Further in my thesis I focused on analytical processes of a copper determination by spectrophotometry and also flow chronopotentiometry. I was developed as part of this thesis manuals for analytical methods for laboratory courses of analytical chemistry.

Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat paní RNDr. Martě Farkové, CSc. za odborné a věcné rady při vedení diplomové práce, paní Ing. Heleně Zavadilové za pomoc při shánění chemikálií a za umožnění využívat prostory výukové laboratoře. Panu doc. RNDr. Přemyslu Lubalovi, Ph.D. a paní Ing. Blance Vrbkové za konzultace a rady spojené s vývojem chromatografických metod. Panu Bc. Petru Švédovi za spolupráci. Dále bych chtěl poděkovat všem spolužákům, se kterými jsem strávil pět let svého života na této vysoké škole a na které mi zůstane spousta krásných vzpomínek. V neposlední řadě děkuji své rodině za pevné nervy a podporu během mého studia na vysoké škole.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 31. října 2012

……….................................... Bc. Michal Machalíček

Obsah 1.

Úvod .................................................................................................................................... 4

2.

Cíle ....................................................................................................................................... 5

3.

Teoretická část .................................................................................................................... 6 3.1. Stanovení mědi a hliníku pomocí plynové chromatografie ......................................................... 6 3.1.1. Plynová chromatografie ........................................................................................................ 6 3.1.2. Komplexotvorná činidla......................................................................................................... 7 3.2. Stanovení mědi pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie ............................................ 8 3.2.1. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie ............................................................................ 8 3.2.2. Komplexotvorné činidlo ........................................................................................................ 9 3.3. Stanovení mědi pomocí průtokové chronopotenciometrie....................................................... 10 3.3.1. Průtoková chronopotenciometrie ....................................................................................... 10 3.3.2. Průtoková chronopotenciometrie za konst. proudu ........................................................... 11 3.4. Stanovení mědi pomocí spektrofotometrie ............................................................................... 11 3.4.1. Spektrofotometrie............................................................................................................... 11 3.4.2. Porovnání s plynovou chromatografií ................................................................................. 11 3.5. Validace metod, chemometrie - techniky použité pro zpracování analytických dat ................. 12 3.5.1. Validace ............................................................................................................................... 12 3.5.2. Chemometrie - zpracování analytických dat ....................................................................... 14

4.

Praktická část..................................................................................................................... 17 4.1. Stanovení mědi a hliníku pomocí plynové chromatografie ....................................................... 17 4.1.1. Parametry a specifikace přístroje ........................................................................................ 17 4.1.2. Výsledky a diskuze ............................................................................................................... 19 4.2. Stanovení mědi pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie .......................................... 27 4.2.1. Parametry a specifikace přístroje ........................................................................................ 27 1

4.2.2. Výsledky a diskuze ............................................................................................................... 28 4.3. Stanovení mědi pomocí průtokové chronopotenciometrie....................................................... 37 4.3.1. Parametry a specifikace přístroje ........................................................................................ 37 4.3.2. Výsledky a diskuze ............................................................................................................... 38 4.4. Stanovení mědi pomocí spektrofotometrie ............................................................................... 45 4.4.1. Parametry a specifikace přístroje ........................................................................................ 45 4.4.2. Výsledky a diskuze ............................................................................................................... 46

5.

Závěr .................................................................................................................................. 51

6.

Seznam obrázků a tabulek uvedených v této práci .......................................................... 52 6.1. Seznam obrázků ......................................................................................................................... 52 6.2. Seznam tabulek .......................................................................................................................... 54

7.

Literatura ........................................................................................................................... 55

8.

Přílohy................................................................................................................................ 57

9.

Dodatek ............................................................................................................................. 60

2

Citát:1 Tři cesty vedou k poznání: - cesta zamyšlení - ta je nejušlechtilejší, - cesta napodobení - ta je nejlehčí, - cesta pokusu - ta je nejtrpčí.

Konfucius

3

1. Úvod V bakalářské práci se mi na Ústavu chemie naskytla příležitost pracovat s plynovým chromatografem YL 6100GC, nově zakoupeným od firmy LABICOM s.r.o., Olomouc, a podílet se tak na vzniku a optimalizaci některých metod pro cvičení z analytické chemie. V rámci své diplomové práce jsem se rozhodl rozšířit si své znalosti v oblasti analytických separačních metod a také nadále pokračovat ve směru vývoje a optimalizace metod v oblasti výuky analytické chemie. Specializoval jsem se na stanovení kovových iontů pomocí různých analytických metod. Od teď mají studenti bakalářského a magisterského studia Chemie na PřF Masarykovy univerzity možnost si v laboratorních kurzech vyzkoušet stanovení mědi jak pomocí metod, které jsou převážně

určeny

k analýzám

anorganických

látek

a

tudíž

i

kovů

(průtoková

chronopotenciometrie, spektrofotometrie), tak pomocí metody, která je v první řadě určena k analýze organických sloučenin (vysokoúčinná kapalinová chromatografie). Dále mají studenti možnost si vyzkoušet stanovení hliníku pomocí plynové chromatografie, která je stejně jako vysokoúčinná kapalinová chromatografie určena převážně k analýze organických sloučenin.

4

2. Cíle - Literární rešerše - Testování a vývoj chromatografických metod (plynová chromatografie, vysokoúčinná kapalinová chromatografie) pro simultánní stanovení analytů ve směsi - Testování a vývoj dalších analytických metod (průtoková chronopotenciometrie, spektrofotometrie) pro simultánní stanovení analytů ve směsi - Ověřování možností propojení jednotlivých technik pro analýzu vzorků s komplikovanou matricí - Analýza experimentálních dat pomocí pokročilých chemometrických technik - Sepsání návodů pro laboratorní cvičení z analytické chemie

5

3. Teoretická část 3.1. Stanovení mědi a hliníku pomocí plynové chromatografie 3.1.1. Plynová chromatografie Plynová chromatografie (GC) je vysoce účinná analytická separační metoda, která se používá převážně při analýze těkavých látek. Látky se od sebe separují na základě intenzity své interakce se stacionární fází. Hnací silou (mobilní fází) je proud inertního plynu. Metoda se dělí na rozdělovací plynovou chromatografii (GLC), kdy je separace založena na rozdílné rozpustnosti látek v systému plyn-kapalina, a na adsorpční plynovou chromatografii (GSC), kdy je separace založena na rozdílné adsorpci látek v systému plyn-pevná látka.2

Obr. č. 1 - Schéma zapojení plynové chromatografie

Základním parametrem, který charakterizuje dělenou látku v plynové chromatografii je retenční čas (tR), popř. redukovaný retenční čas (t’R). Tento parametr je závislý na experimentálních podmínkách a proto jeho hodnotu nelze srovnávat v rámci různých experimentálních podmínek. Aby byla retenční hodnota obecně srovnatelná, užívá se retenčního objemu (VR), popř. redukovaného retenčního objemu (V’R). Jednou z nejdůležitějších fyzikálních veličin, která ovlivňuje retenční hodnoty dané soustavy, je teplota kolony. Obecně lze říci, že lepšího rozdělení dvou píků je možné dosáhnout za nižší teploty, avšak při snižování teploty zároveň dochází k rozšiřování píků.3

6

Pro vysvětlení chromatografického procesu bylo navrženo několik teorií, z nichž nejpoužívanější je tzv. rychlostní teorie formulovaná van Deemterem. Vyjadřuje závislost výšky teoretického patra na rychlosti nosného plynu. Tuto teorii upravil pro plynovou chromatografii M. Golay a její rovnice má tvar

kde: H je výška teoretického patra, u je rychlost nosného plynu, d je vnitřní průměr kolony a D je difuzní koeficient. 3.1.2. Komplexotvorná činidla Dithiokarbamáty jsou skupina derivátů kyseliny dithiouhličité. Bylo dokázáno, že vykazují dobré vlastnosti jako komplexotvorná činidla pro velké množství kovových iontů, se kterými tvoří nasycené neutrální kovové cheláty, které se snadno extrahují do organických rozpouštědel. Plynová chromatografie je schopná separovat tyto cheláty s vysokým rozlišením, s nízkými náklady a na rozdíl od atomové absorpční spektrometrie i rozlišit více kovů najednou. Proto jsem se zaměřil na stanovení mědi a ostatních kovů (Al, Cr, Mn, Fe, Co a Ni) právě pomocí plynové chromatografie. V publikacích Laghari, A. J. a spol. a Arain, M. A. a spol. bylo prokázáno, že separace kovových komplexů probíhá nejlépe ve slabě kyselém prostředí, které bylo upraveno acetátovým pufrem o pH = 5. Teplota nástřiku byla nastavena na hodnotu 280 °C4, popř. na hodnotu 270 °C5. Teplota detektoru se pohybovala u obou postupů kolem 300 °C. Jako metoda nástřiku byla opět u obou postupů použita metoda děliče toku při nízkém splitu 10:14, popř. 18:15. Pro separaci byly použity převážně nepolární kolony (DB-1701 = 14% kyanopropylphenyl-methylpolysiloxan4, popř. DB-1 = 100% dimethylpolysiloxan5). Teplotní program kolony byl nastaven na rozmezí 180 °C - 260 °C, při teplotním růstu 8 °C/min4, popř. 5 °C/min5. Pro lepší separaci byly kovové komplexy ještě extrahovány do methylisobutylketonu (MIBK). Poněvadž se ani po usilovném vývoji a optimalizaci výše uvedeného postupu nepodařilo kvalitativně ani kvantitativně separovat stanovované látky, přistoupil jsem ke změně postupu u plynové chromatografie a jako komplexotvorné činidlo jsem použil acetylaceton.

Obr. č. 2 - Vzorec acetylacetonu 7

R-acetonáty (neboli β-R-diketonáty) kovů byly již dostatečně prostudovány a díky své vyšší těkavosti vůči dithiokarbamátům jsou vhodnější komplexotvorná činidla právě pro plynovou chromatografii. Al(III+) a Cr(III+) komplexy s acetylacetonem lze připravit reakcí nadbytečného množství acetonu se solemi kovů za přítomností močoviny. Extrakci komplexů z reakčních směsí lze provést chloroformem7, popř. benzenem8. Jiný postup pro přípravu Al(III+), Cr(III+) a Fe(III+) komplexů s acetylacetonem je reakce vzorku obsahující příslušný iont kovu s octanem sodným9,10. Obecně slouží tato reakce k odlišení skupiny trojmocných kovů, tvořících acetylacetonátové komplexy.7-12

3.2. Stanovení mědi pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie 3.2.1. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je analytická separační metoda umožňující analyzovat látky o relativních molekulových hmotnostech od několika desítek do několika stovek tisíc. Na rozdíl od GC je vhodná i pro separaci tepelně nestálých a netěkavých sloučenin. Stejně jako při plynové chromatografii se látky od sebe separují na základě míry své interakce se stacionární fází. Avšak na rozdíl od plynové chromatografie se na separaci látek výrazně podílí také typ mobilní fáze.

Obr. č. 3 - Schéma zapojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie13

8

Základním parametrem, který charakterizuje dělenou látku v HPLC je retenční čas (tR), popř. redukovaný retenční čas (t’R). Tento parametr je závislý na experimentálních podmínkách a proto jeho hodnota nelze srovnávat v rámci různých experimentálních podmínek. Aby byla retenční hodnota obecně srovnatelná, užívá se retenčního objemu (VR), popř. redukovaného retenčního objemu (V’R).

kde: FM je objem mobilní fáze, který proteče kolonou za jednotku času.

kde: tM je mrtvý čas retence inertní látky. Základním parametrem pro posouzení účinnosti kolony je počet teoretických pater kolony n

kde: Ws 0,5 je šířka píku v polovině výšky vyjádřená v časových jednotkách [s]. Pro vysvětlení chromatografického procesu se u vysokoúčinné kapalinové chromatografie využívá tzv. rychlostní teorie formulovaná van Deemterem, jejíž rovnice má tvar

kde: H je výška teoretického patra, A, B a C jsou konstanty, u je rychlost nosného plynu, d je průměr částic sorbentu a D je difuzní koeficient. 3.2.2. Komplexotvorné činidlo Stanovení mědi pomocí HPLC bylo popsáno v publikaci Ichinoki, S., a spol. Jako komplexotvorné činidlo byl použit 2-merkaptobenzothiazol (MBT).

Obr. č. 4 - Vzorec 2-merkaptobenzothiazolu

Pro zakoncentrování a zvýšení citlivosti metody byl výsledný Cu(II+) komplex s 2merkaptobenzothiazolem extrahován do benzenu. Samotná separace probíhala na koloně C18 a jako mobilní fáze byla použita fáze methanol:voda v poměru 88:12 (v/v).14,28,29

9

Před samotným vývojem metody a validací chemometrických parametrů musela být kolona podrobena testu, zda není kontaminována kovovými ionty. Test byl popsán v publikaci Cruze, E., a spol. a má název DERT (2,3- and 2,7-Dihydroxynaphthalene Efficiency Ratio Test). Analýza směsí 2,3- a 2,7- dihydroxynaftalenů probíhá v izokratickém módu za použití 0,025M octanu sodného v mobilní fázi acetonitril:voda v poměru 25:75 (v/v). V případě přítomnosti kovů ve stacionární fázi kolony má signál 2,3-dihydroxynaftalenu, který je schopný komplexovat kovové ionty, větší asymetrii než signál 2,7-dihydroxynaftalenu, který nemá schopnost tvořit komplexy s kovovými ionty.

V případě

kontaminace

kolony

kovovými

ionty

roste

asymetrie

signálu

2,3-

dihydroxynaftalenu a tudíž klesá hodnota testu DERT.15,31

3.3. Stanovení mědi pomocí průtokové chronopotenciometrie 3.3.1. Průtoková chronopotenciometrie Průtoková chronopotenciometrie je elektrochemická metoda založená na měření náboje, který je potřebný k úplné chemické přeměně analyzované látky na jinou formu v rozdílném oxidačním stupni. Z velikosti prošlého náboje lze následně vypočítat pomocí Faradayových zákonů množství analyzované látky

kde: m je hmotnost analyzované látky, M je molární hmotnost analyzované látky, Q je prošlý náboj, z je počet elektronů účastnících se elektrodové reakce, F je Faradayova konstanta, c je molární

koncentrace

analyzované

látky,

I

je

elektrolytický

proud,

τ

je

chronopotenciometrický přechodový čas a V je objem vzorku. Podmínkou je, že na pracovní elektrodě probíhá jediná reakce se 100% účinkem. Podle pracovního postupu rozlišujeme průtokovou chronopotenciometrii za konstantního potenciálu a za konstantního proudu. V diplomové práci jsem pracoval s průtokovou chronopotenciometrií za konst. proudu, kdy se sleduje a měří potenciál porézní elektrody.16,17

10

3.3.2. Průtoková chronopotenciometrie za konst. proudu Existují dvě hlavní skupiny analytických metod pro stanovení těžkých kovů ve vzorcích. Elektrochemická skupina metod (chronopotenciometrie, elektrogravimetrie, apod.) a spektrometrická

skupina

metod

(AAS,

ICP,

spektrofotometrie,

apod.).

Při

chronopotenciometrickém stanovení se využívá tzv. jevu nahromadění, kdy dochází k elektrochemickému nahromadění analytu na měrné elektrodě. Poté během působení konstantního proudu dochází k rozpouštění analytu, které může být elektrochemické, nebo chemické a měří se časově závislý potenciál. Ze změny potenciálu na pracovní elektrodě se získá signál, který má tvar píku a jehož plocha odpovídá chronopotenciometrickému přechodovému času úměrnému koncentraci analytu. Analýza probíhá na třech elektrodách: indikační (platinová), referenční (argentochloridová) a pracovní (typ záleží na analytu).18,19

3.4. Stanovení mědi pomocí spektrofotometrie 3.4.1. Spektrofotometrie Spektrofotometrie

je

optická

metoda

založená

na

pohlcování

(absorpci)

elektromagnetického záření převážně ve viditelné nebo ultrafialové části spektra zředěnými roztoky molekul. Při absorpci dochází k excitaci valenčních elektronů, které jsou součástí molekulových orbitalů. Výsledkem bývá absorpční spektrum, což je závislost propustnosti či absorbance na vlnové délce. Kvantitativní analýza je založena na Bouger-Lambert-Beerově zákoně

kde: A je absorbance, T je transmitance, Ø0 je vstupující zářivý tok, Ø je vystupující zářivý tok, ε je molární absorpční koeficient, c je molární koncentrace analyzované látky a l je tloušťka vrstvy analyzované látky. Tento zákon předpokládá, že rozhodující část úbytku záření připadá na jeho absorpci. Odraz a rozptyl záření se zanedbává.6,20,30 3.4.2. Porovnání s plynovou chromatografií Spektrofotometrické stanovení mědi je velmi citlivá, jednoduchá, selektivní a rychlá metoda. Je založena, podobně jako metoda stanovení mědi pomocí GC, na reakci komplexotvorných činidel s mědí a následné analýze vzniklých komplexů. V daném případě je bezpodmínečně

11

nutné, aby vzniklé komplexy byly barevné a stálé. Na rozdíl od plynové chromatografie lze současně stanovit jen jeden kov. Za posledních 20 let se vyskytly stovky publikací, které uvádí několik postupů pro spektrofotometrické stanovení mědi. Jako komplexotvorné činidlo se převážně používá kupral (diethyldithiokarbamát sodný). Pro zvýšení citlivosti se roztok extrahuje do organického rozpouštědla (amylalkohol, ethylacetát, MIBK, apod.). Úprava pH se provádí převážně amoniakem.6,21 Zvolené podmínky byly vybrány s ohledem na plynovou chromatografii, kdy obě metody vykazovaly podobný průběh přípravy vzorků ke stanovení mědi, a tudíž mohlo ve výsledku dojít k zajímavému porovnání daných metod v rámci laboratorních cvičení4-6.

3.5. Validace metod, chemometrie - techniky použité pro zpracování analytických dat 3.5.1. Validace = „potvrzení měřením/zkoušením a opatřením objektivního důkazu, že byly splněny jednotlivé požadavky pro určený účel“ (ČSN EN ISO/IEC 17025:2005) - nebo také: = „potvrzení získané prostřednictvím poskytnutí objektivních důkazů, že požadavky na specifické zamyšlené použití nebo specifickou aplikaci byly splněny“ (ISO 9000:2000, Eurachem Guide)22 - validace metody zahrnuje následující parametry:23,24 1. Opakovatelnost = míra těsnosti shody mezi výsledky posloupnosti nezávislých měření stejného vzorku analytu provedených stejnou metodou, stejným experimentátorem, na stejném přístroji, na stejném místě, za stejných podmínek v krátkém časovém intervalu (stanovuje se směrodatná odchylka v sérii 20 měření) 2. Reprodukovatelnost = těsnost shody mezi výsledky měření stejného analytu ve vzorku stejného materiálu, kdy jsou jednotlivá měření prováděna za různých podmínek (experimentátor, přístroj, místo, čas, podmínky), avšak stejnou metodou - body 1 a 2 se souhrnně označují jako přesnost

12

3. Správnost = porovnání shody mezi průměrnou hodnotou získanou z nekonečného počtu měření a referenční hodnotou (pod pojmem nekonečný počet měření se zde rozumí 10 a více měření) 4. Výtěžnost = podíl z množství analytu, přítomného v analyzovaném vzorku zkoušeného materiálu nebo přidaného k němu, který je extrahován a podrobován měření; neboli je to poměr výsledku měření k certifikované (referenční) hodnotě - výtěžnost se stanovuje na několika koncentračních hladinách tak, aby byl pokryt předpokládaný pracovní rozsah měření 5. Linearita = oblast hodnot obsahu, množství či koncentrací, ve kterém je analytický signál lineární funkcí hodnot obsahu, množství či koncentrace - linearita je zjišťována v celém deklarovaném rozsahu metody tak, že se analyzuje 3 až 5 vzorků v koncentrační hladině zvolené v daném deklarovaném rozsahu 6. Limit detekce = nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být detekováno, ale které nemusí být stanovitelné jako exaktní hodnota - množství analytu pro stanovení limitu detekce se měří minimálně desetkrát 7. Limit stanovitelnosti = nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být stanoveno jako exaktní hodnota s požadovanou hodnotou nejistoty - množství analytu pro stanovení limitu stanovitelnosti se měří minimálně desetkrát 8. Pracovní rozsah/interval měření = uzavřený interval hodnot množství/obsahu měřené veličiny ve vzorku, pro který bylo validací potvrzeno, že metoda/postup je v něm aplikovatelná 9. Interference = systematická chyba měření způsobená analytickým interferentem, což je složka vzorku, která je současně složkou ovlivňující veličiny, není sama zdrojem signálu měřícího systému, ale způsobuje přírůstek či pokles stanovované hodnoty - interference se zjišťuje porovnáním vzorku s předpokládaným analytickým interferentem a referenčním vzorkem bez analytického interferentu

13

10. Robustnost = schopnost metody poskytovat přijatelné výsledky měření i v případě, že dojde k malým odchylkám od měřícího postupu či složení vzorku - při stanovení robustnosti se pomocí faktorového pokusu zjišťuje, jak je analytický signál závislý na malých změnách parametrů metody 11. Porovnání s jinou metodou = postup, který vyhodnotí a porovná vychýlení, typ systematické chyby a korelaci s jinou již validovanou metodou 3.5.2. Chemometrie - zpracování analytických dat Chemometrie25,26 = chemická disciplína, která využívá matematické metody s cílem navrhnout nebo vybrat optimální experimentální postup a poskytnout ze získaných výsledků maximální chemickou informaci - veškeré výsledky byly analyzovány v programech Statistica, Microsoft Office Excel a ChemSketch - pokud není uvedeno jinak, pak: a) rovnice přímky má tvar: b) u všech naměřených souborů dat bylo předpokládáno normální rozložení jednotlivých výsledků c) naměřená data byla statisticky vyhodnocena na hladině významnosti α = 0,05 d) symbol n značí počet měření, symbol xi značí jednotlivá měření, symbol xp značí průměr z daného počtu měření (v programu Microsoft Office Excel funkce PRŮMĚR), symbol μ značí referentní hodnotu, symbol s značí směrodatnou odchylku (v programu Microsoft Office Excel funkce SMODCH.VÝBĚR), symbol R značí rozpětí, symbol sr značí relativní směrodatnou odchylku a symbol s(xp) značí směrodatnou odchylku průměru - směrodatná odchylka pro malý soubor (n < 10) se spočítá podle vztahu

- kn je Dean-Dixonův koeficient uvedený v příloze I - pro zjištění a následné vyloučení odlehlých výsledků v důsledku výskytu hrubých chyb byl použit Grubbsův test (n ≥ 10), popř. Dean-Dixonův test (n < 10): 14

Grubbsův test: - vypočtené veličiny T1 a Tn se porovnávají s kritickou hodnotou Tα;2;n uvedenou v příloze I Dean-Dixonův test: - vypočtené veličiny Q1 a Qn se porovnávají s kritickou hodnotou Qα;2;n uvedenou v příloze I - pro výpočet intervalu spolehlivosti (L1,2) byl použit způsob výpočtu, který využívá Studentovo rozdělení (n ≥ 10)

popř. výpočet intervalu spolehlivosti (L1,2) podle Dean-Dixona (n < 10)

- tα;2;n je kritická hodnota Studentova rozdělení uvedena v příloze II - Kα;2;n je kritická hodnota Lordova rozdělení uvedena v příloze II - pro porovnání výsledků získaných různými metodami byl nejprve použit test shody rozptylů (tzv. Snedecorův F-test) a poté se shodnost výsledků testovala podle Studentova t-testu (n ≥ 10), popř. podle Lordova u-testu (n < 10): Snedecorův F-test:

í

- vypočtená hodnota FA se porovnává s kritickou hodnotou Fα;2;n1;n2 uvedenou v příloze III Studentův t-test:

í

- vypočtená hodnota t se porovnává s kritickou hodnotou Studentova rozdělení tα;2;n uvedenou v příloze II

15

Lordův u-test: - vypočtená hodnota u se porovnává s kritickou hodnotou Lordova rozdělení uα;2;n uvedenou v příloze III - regresní analýza lineární závislosti má za úkol určit odhady koeficientů a (posunutí) a b (směrnice), které charakterizují regresní přímku, vyjádřenou rovnicí

- směrodatná odchylka sy,x charakterizuje rozptyl hodnot závisle proměnných kolem regresní přímky, kdy:

- výpočet směrodatné odchylky koeficientu a:

- výpočet směrodatné odchylky koeficientu b:

U přímkových kalibračních závislostí je regresní koeficient a (posunutí) významnou veličinou, jejíž nenulová hodnota svědčí o konstantní soustavné chybě, proto se t-testem zjišťuje, zda je její rozdíl od nuly statisticky významný, či nikoliv:

- t hodnota se porovnává s kritickou hodnotou Studentova rozdělení uvedenou v příloze II, kde n je počet kalibračních hodnot v kalibrační křivce - pokud se regresní koeficient významně neliší od nuly, lze regresní přímku zjednodušit vztahem

16

4. Praktická část 4.1. Stanovení mědi a hliníku pomocí plynové chromatografie

Obr. č. 5 - Přístroj YL 6100GC

4.1.1. Parametry a specifikace přístroje - Přístroj YL 6100GC, výrobce: YL Instrument Co., Ltd., Anyang, Korea - software YL-Clarity, výrobce: YL Instrument Co., Ltd., Anyang, Korea - tlakové nádoby: - nosný plyn:

dusík (čistota 5.0)

- CAS: 7727-37-9 - výrobce: SIAD Czech spol. s r.o., Praha

- pomocné plyny:

vodík (čistota 4.5)

- CAS: 1333-74-0 - výrobce: SIAD Czech spol. s r.o., Praha

vzduch (čistota 5.0) - CAS: 132259-10-0 - výrobce: SIAD Czech spol. s r.o., Praha

17

- nástřikový prostor: - BTO septum, výrobce: Sigma-Aldrich, Praha - liner: typ Agilent 5062-3587, výrobce: Sigma-Aldrich, Praha

- kolonový prostor: - kolona: typ SLB-5ms (5% phenyl - 95% methylsiloxan), délka 30 m, vnitřní průměr 0,25 mm, tloušťka sorbentu 0,25 μm - výrobce: Sigma-Aldrich, Praha

- detektor: - typ: FID (plamenově ionizační detektor) Tab. č. 1: Seznam chemikálií potřebných pro plynovou chromatografii Název chemikálie CAS Výrobce Poznámky diethyldithiokarbamát Lach-Ner s.r.o., komplexotvorné činidlo, 1% 20624-25-3 sodný Neratovice roztok (w/w) standardní roztok síran měďnatý 7758-98-7 LACHEMA, Brno připravovaný čerstvý každý pentahydrát měsíc o cm(CuII+) = 1 g/l Lach-Ner s.r.o., acetylaceton 123-54-6 komplexotvorné činidlo Neratovice Mach Chemikálie octan sodný p.a. 127-09-3 0,5M roztok s.r.o., Ostrava methylisobutylketon Lach-Ner s.r.o., 108-10-1 extrakční činidlo (MIBK) Neratovice benzen, p.a. 71-43-2 LACHEMA, Brno extrakční činidlo standardní roztok Lach-Ner s.r.o., chlorid hlinitý hexahydrát 7784-13-6 připravovaný čerstvý každý Neratovice měsíc o cm(AlIII+) = 1 g/l Lach-Ner s.r.o., aceton p.a. 67-64-1 Neratovice močovina 57-13-6 LACHEMA, Brno 0,05M roztok Mach Chemikálie octan sodný p.a. 127-09-3 2M acetátový pufr s.r.o., Ostrava Lach-Ner s.r.o., kyselina octová 99% p.a. 64-19-7 2M acetátový pufr Neratovice

18

4.1.2. Výsledky a diskuze Komplexotvorné činidlo diethyldithiokarbamát sodný (DDTC) byl připraven jako 1% roztok (w/w). Standardní roztoky kovových iontů (AlIII+, CrIII+, MnII+, FeIII+, CuII+, CoII+ a NiII+) o koncentraci 1 g/l byly zředěny na roztoky o koncentraci 1 mg/l. Vždy 1 ml vzorku kovového iontu reagoval s 1 ml 1% roztoku DDTC a 1 ml 2M acetátového pufru. Vznikl komplex příslušného kovového iontu s DDTC. Pro lepší rozlišení a zvýšení citlivosti se daný komplex extrahoval do 1 ml methylisobutylketonu (MIBK).

Pracovní podmínky: Teplota nástřikového prostoru: 250 °C, teplotní program kolony: 150 °C - 250 °C (10 °C/min), split 15:1, průtok nosného plynu: 2 ml/min, teplota detektoru: 300 °C, průtoky plynů - H2: 30 ml/min, vzduch: 300 ml/min, MakeUp: 20 ml/min. Na kolonu byly dávkovány 2 μl vzorku komplexu a byla sledována separace.

Obr. č. 6 - Chromatogram analýzy kovů pomocí GC, dosažené v rešerši

19

DDTC

Obr. č. 7 - Chromatogram analýzy kovů na přístroji YL 6100GC

Jak již bylo uvedeno výše, optimalizace metody pro stanovení mědi a ostatních kovů (AlIII+, CrIII+, MnII+, FeIII+, CoII+ a NiII+) pomocí komplexotvorného činidla DDTC nevedla k reprezentativním výsledkům. Vzorky komplexů byly proměřeny také na GC-MS. Nejprve byly vzorky nastříknuty přímo na detektor, kde se výskyt daných komplexů potvrdil, avšak následný nástřik vzorků na kolonu opět nevedl k žádným výsledkům. Na základě tohoto experimentu bylo zjištěno, že problém je někde na rozhraní nástřikového prostoru a kolony. Problémem může být i to, že komplexy kovů s dithiokarbamáty jsou charakterizovány vysokými konstantami stability, a tudíž nízkou těkavostí27. Výše uvedené problémy mě přiměly přejít na jiný postup analýzy kovových iontů. Jako komplexotvorné činidlo byl použit acetylaceton, jehož kovové komplexy mají vyšší těkavost, a tudíž jsou vhodnější pro plynový chromatograf. Do současné chvíle se podařilo analyzovat pouze Al(III+) komplex s acetylacetonem. Protože si myslím, že daná metoda má uplatnění nejen v rámci laboratorních cvičení, stále pracuji na odstranění některých problémů a následném vývoji a optimalizaci metody. 4 ml acetonu reagovaly s 1 ml roztoku obsahující ionty Al(III+) za přítomnosti 1 ml 0,05M roztoku močoviny. Výsledný Al(III+) komplex s acetylacetonem se extrahoval do 1 ml benzenu.

20

Pracovní podmínky: Teplota nástřikového prostoru: 200 °C, teplotní program kolony: 150 °C - 230 °C (10 °C/min), split 20:1, průtok nosného plynu: 2 ml/min, teplota detektoru: 300 °C, průtoky plynů - H2: 30 ml/min, vzduch: 300 ml/min, MakeUp: 20 ml/min. Na kolonu byly dávkovány 2 μl vzorku komplexu, byla sledována separace a validovány parametry.

Linearita: Bylo připraveno 7 kalibračních roztoků obsahující Al(III+) komplex s acetylacetonem v rozmezí koncentrací hliníku 0,15 - 3,00 mg/l. Každý kalibrační roztok byl proměřen 5x a z průměru byla vytvořena kalibrační křivka.

Tab. č. 2: Ukázka statistické analýzy pro kalibrační roztok č. 2 Číslo měření Plocha píku [mV.s] 1 215,140 2 191,522 3 188,395 4 205,427 5 207,742 xp 201,645 Dean-Dixonův test R 26,745 Q1 0,117 Q5 0,277 Q0,05;2;5 0,642 Dean-Dixonovým testem pro odlehlost výsledků bylo prokázáno, že žádný z výsledků není odlehlý na hladině významnosti α = 0,05.

21

Tab. č. 3: Naměřené plochy píků pro jednotlivé kalibrační roztoky Kalibrační Koncentrace (AlIII+) Plocha píku* roztok č. [mg/l] [mV.s] 1 0,15 95,718 2 0,30 201,645 3 0,60 346,309 4 0,90 562,331 5 1,50 899,452 6 2,10 1254,120 7 3,00 1853,872 * průměrná hodnota signálu z 5 měření

Obr. č. 8 - Kalibrační křivka pro Al(III+) komplex s acetylacetonem vytvořena v programu Statistica

- rovnice regrese: y = 610,1174 · x - 0,4367 - regresní koeficient: R = 0,9990 - statistická analýza regresního koeficientu a (posunutí) kalibrační křivky - analýza: sa = 13,5479 |a| = 0,4367 výpočet parametru t: t0,05;2;7 = 2,447

22

- ze statistické analýzy regresního koeficientu a (posunutí) vyplývá, že úsek a je statisticky nevýznamný na hladině významnosti α = 0,05 - výsledná rovnice regrese: y = 609,8970 · x

Reprodukovatelnost: Reprodukovatelnost byla posuzována na kalibračním roztoku č. 4. Parametr byl srovnáván v závislosti na práci dvou různých pracovníků, kdy první skladba vzorků byla měřena mnou samotným a druhá skladba vzorků byla měřena s časovým odstupem jednoho týdne a byla měřena jiným, zkušeným operatérem (panem Bc. Petrem Švédou).

Tab. č. 4: Naměřené plochy píků a statistická analýza reprodukovatelnosti

Měření číslo

Grubbsův test na odlehlost výsledků Snedecorův F-test na shodu rozptylů Studentův t-test na shodnost výsledků

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 xp s S T1 T15

Plocha píku prvních nástřiků [mV.s] 511,396 526,023 527,036 530,654 534,816 558,819 561,883 568,592 570,237 572,580 599,631 601,306 605,152 622,912 645,953 569,133 39,507 38,167 1,513 2,013

T0,05;2;15 F F0,05;14;15 t t0,05;2;15

Plocha píku druhých nástřiků [mV.s] 527,863 541,926 547,788 559,832 562,103 562,452 572,189 578,042 583,091 589,125 596,601 606,341 618,981 628,072 641,027 581,029 32,630 31,524 1,687 1,903 2,493 1,466 2,484 0,869 2,145

23

Při testování na odlehlost výsledků Grubbsovým testem nebyla žádná z hodnot odlehlá na hladině významnosti α = 0,05. Poté se soubory testovaly Snedecorovým F-testem na shodu rozptylů. Rozptyly obou souborů se neliší na hladině významnosti α = 0,05. Studentovým ttestem na shodnost výsledků jsme následně prokázali reprodukovatelnost dané metody, kdy oba soubory se neliší na hladině významnosti α = 0,05.

Limit detekce: Pro tento parametr byla použita početní metoda z nejnižší měřitelné koncentrace, kdy kalibrační roztok č. 1 byl 10x zředěn a následně byl limit detekce vyhodnocen, jak z rovnice lineární regrese

kde s je směrodatná odchylka z naměřených hodnot signálu roztoku a k je směrnice kalibrační přímky (a = 0), tak pomocí vzorce z nízké měřitelné koncentrace roztoku

kde c je nízká koncentrace roztoku, s je směrodatná odchylka z průměru naměřených hodnot signálu daného roztoku a H plocha píku roztoku.

Tab. č. 5: Naměřené plochy píků pro Al(III+) komplex s acetylacetonem Komplex o koncentraci Plocha píku [mV.s] cM(AlIII+) = 0,015 mg/l 1 9,182 2 10,862 3 7,045 4 11,163 5 9,302 xp (=H) 9,511 Dean-Dixonův test R 4,118 Q1 0,519 Q5 0,073 Q0,05;2;5 0,642 Výpočet limitu detekce k5 0,430 s 1,771 LODR [mg/l] 0,0087 LODV [mg/l] 0,0084 24

Dean-Dixonovým testem pro odlehlost výsledků bylo prokázáno, že žádný z výsledků není odlehlý na hladině významnosti α = 0,05. Následně byly vypočteny limity detekce jak z rovnice lineární regrese, tak pomocí vzorce z nízké měřitelné koncentrace roztoku. Oba limity se řádově shodovaly.

Limit stanovitelnosti: Limit stanovitelnosti byl vypočítán jako trojnásobek LOD. LOQ = 3 · 0,008 = 0,024 [mg/l]

Interference: Jako interferentní prvky pro Al(III+) komplex s acetylacetonem byly vybrány ionty prvků CrIII+, MnII+, FeIII+, CuII+, CoII+ a NiII+. Koncentrace jednotlivých interferentních iontů byla asi 0,1 mol/l. Analýza probíhala takovým způsobem, že byl připraven Al(III+) komplex s acetylacetonem bez interferentů, s jednotlivými interferenty a na závěr byl připraven komplex se všemi interferenty dohromady.

Obr. č. 9 - Chromatogram Al(III+) komplexu s acetylacetonem bez přítomnosti interferenčních prvků

25

Obr. č. 10 - Chromatogram Al(III+) komplexu s acetylacetonem s přítomností všech interferenčních prvků

Výše jsou uvedeny dva chromatogramy, které znázorňují stanovení hliníku pomocí komplexotvorného činidla acetylacetonu bez přítomnosti interferentů (obr. č. 9) a s přítomností interferentů (obr. č. 10). Z chromatogramů je patrné, že interferenty výrazně ovlivňují analýzu a dochází k tzv. chvostování píku.

Závěr: Na plynovém chromatografu YL 6100GC jsem stanovil Al(III+) komplex s acetylacetonem. Validoval jsem následující parametry: linearitu, reprodukovatelnost, limit detekce, limit stanovitelnosti a interferenci. Při validaci interference byl prokázán vliv ostatních kovů na stanovení hliníku. Komplexy acetylacetonu s ostatními ionty kovů (CrIII+, MnII+, FeIII+, CuII+, CoII+ a NiII+) nebyly analyzovány. Důvodem může být vyšší molekulová hmotnost daných komplexů a z toho plynoucí nižší těkavost. Vytvořil jsem návod pro stanovení hliníku pomocí komplexotvorného činidla acetylacetonu metodou GC pro studenty do laboratorních kurzů. Návod byl uložen na CD a přiložen k diplomové práci.

26

4.2. Stanovení mědi pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie

Obr. č. 11 - Isokratický HPLC systém Watrex

4.2.1. Parametry a specifikace přístroje - pumpa DeltaChromTM P102, výrobce: Watrex, Praha - fotometrický detektor DeltaChromTM UV250, výrobce: Watrex, Praha - software EZStart, výrobce: Watrex, Praha - kolonový prostor: - kolona: Reprosil 100 C18, 250x4 mm, 5 µm - výrobce: Watrex, Praha - průtok mobilní fáze: FM = 0,5 ml/min

27

Tab. č. 6: Seznam chemikálií potřebných pro analýzu: Název chemikálie CAS Výrobce Merck spol. s r.o., 2-merkaptobenzothiazol 149-30-4 Praha benzen, p.a.

71-43-2

kyselina dusičná 65% p.a.

7697-37-2

methanol

67-56-1

aceton p.a.

67-64-1

toluen p.a.

108-88-3

octan sodný p.a.

127-09-3

kyselina octová 99% p.a.

64-19-7

octan amonný p.a.

631-61-8

2,3-dihydroxynaftalen

92-44-4

2,7-dihydoxynaftalen

582-17-2

acetonitril

75-05-8

síran měďnatý pentahydrát

7758-98-7

LACHEMA, Brno Lach-Ner s.r.o., Neratovice Lach-Ner s.r.o., Neratovice Lach-Ner s.r.o., Neratovice Lach-Ner s.r.o., Neratovice Mach Chemikálie s.r.o., Ostrava Lach-Ner s.r.o., Neratovice Lach-Ner s.r.o., Neratovice Sigma-Aldrich, Praha Sigma-Aldrich, Praha Lach-Ner s.r.o., Neratovice LACHEMA, Brno

Poznámky 0,01M roztok připravovaný čerstvý každý měsíc extrakční činidlo, testovací směs 0,1M HNO3 MF testovací směs testovací směs 2M acetátový pufr 2M acetátový pufr MF standard pro DERT standard pro DERT MF standardní roztok připravovaný čerstvý každý měsíc o cm(CuII+) = 1 g/l

4.2.2. Výsledky a diskuze Test DERT: Před analýzou i během analýzy byla vždy kolona podrobena testu, zda není kontaminována kovovými ionty. Pokud by došlo ke kontaminaci kolony, mohlo by to vést až ke znatelné modifikaci kolony a k ovlivnění samotné analýzy, popř. ke znehodnocení naměřených výsledků. Mohlo by docházet ke změnám retenčních časů, ke chvostování píků, ke zvýšení kyselosti silanolových skupin, popř. ke zvýšení polarity samotné stacionární fáze. K analýze se použila směs 2,3-dihydroxynaftalenu o koncentraci cM = 3,0 mg/l a 2,7-dihydroxynaftalenu o koncentraci cM = 1,5 mg/l.31

28

- podmínky: - mobilní fáze: 0,025M octan sodný v acetonitril:voda v poměru 25:75 (v/v), objem nástřiku 2,5 µl, detektor UV (230 nm)

2,3-dihydroxynaftalen 2,7-dihydroxynaftalen

Obr. č. 12 - Chromatogram standardů 2,3- a 2,7-dihydroxynaftalenů pro test DERT

Hodnota testu: Z výše uvedené hodnoty testu DERT vyplývá, že kolona nebyla kontaminována kovovými ionty a tudíž jsem mohl přejít k vlastní analýze a k validaci parametrů metody.

Testovací směs: Do odměrné baňky na 50 ml byly přidány 4 ml acetonu, 1 ml benzenu, 1 ml toluenu a výsledná směs byla doplněna destilovanou vodou po rysku. Testovací směs byla proměřena 5x a byly vyhodnoceny parametry. Jako mrtvý čas byl použit čas acetonu, který se téměř nezadržoval na koloně. Testovací směs byla analyzována na začátku analýzy a následně vždy po skončení denního experimentu, aby se na základě statistického vyhodnocení ověřilo, že kolona nevykazuje žádné změny ve složení během validace metody.

29

- podmínky: - MF: 70% methanol, objem nástřiku 2,5 µl, detektor UV (254 nm)

benzen

toluen

aceton

Obr. č. 13 - Chromatogram testovací směsi pro HPLC

Tab. č. 7: Určení retenčních časů a výpočet počtu teoretických pater pro testovací směs Retenční čas Aceton Benzen Toluen [min] 1 4,670 12,422 19,130 2 4,671 12,172 19,143 3 4,665 12,670 19,700 4 4,665 12,692 19,680 5 4,667 12,394 19,381 xp(tR) 4,668 12,470 19,407 Dean-Dixonův test R 0,006 0,520 0,570 Q1 0,000 0,427 0,023 Q5 0,167 0,042 0,035 Q0,05;2;5 0,642 0,642 0,642 Výpočet chromatografických parametrů tM 4,668 4,668 4,668 t’R 7,802 14,739 V’R [ml] 3,901 7,370 Ws 0,5 [min] 0,48 0,59 0,53 n (počet teor. pater) 524 3069 5999

30

Jednotlivé retenční časy se testovaly Dean-Dixonovým testem na odlehlost výsledků. Bylo prokázáno, že žádný z výsledků není odlehlý na hladině významnosti α = 0,05. Následně se pro každou látku určil redukovaný retenční čas, redukovaný retenční objem a počet teoretických pater.

Cu(II+) komplex s 2-merkaptobenzothiazolem: Vždy 4 ml roztoku mědi s předem vypočítanou koncentrací Cu(II+) bylo smícháno s 1 ml 0,1M kyseliny dusičné a 2 ml 2M acetátového pufru pro zajištění vhodného prostředí pro vznik komplexu. K roztoku bylo přidáno 300 μl 0,01M 2-merkaptobenzothiazolu. Výsledný Cu(II+) komplex s 2-merkaptobenzothiazolem byl extrahován 500 μl benzenu. Pro tuto metodu se nejprve optimalizovala mobilní fáze. Byly vybrány tři potenciálně vhodné mobilní fáze (MF), které se lišily poměrem methanolu a vody. První MF methanol:voda v poměru 95:5 (v/v), druhá MF v poměru 88:12 (v/v) a třetí MF v poměru 80:20 (v/v). Jako nejvhodnější MF byla potvrzena mobilní fáze z rešerše, a to methanol:voda v poměru 88:12 (v/v) (Obr. č. 14). Při použití první MF se píky benzenu i Cu(II+) komplexu s 2merkaptobenzothiazolem rozmývaly v důsledku vysokého procenta methanolu v mobilní fázi. Při použití třetí MF se Cu(II+) komplex s 2-merkaptobenzothiazolem eluoval při vyšší hodnotě retenčního času a opět docházelo k rozmývání píku.

komplex Cu benzen

Obr. č. 14 - Chromatogram Cu(II+) komplexu s 2-merkaptobenzothiazolem při použití druhé MF (methanol:voda v poměru 88:12 (v/v))

31

komplex Cu

benzen komplex Cu

benzen

Obr. č. 15 - Chromatogram Cu(II+) komplexu

Obr. č. 16 - Chromatogram Cu(II+) komplexu

s merkaptobenzothiazolem při použití první

s merkaptobenzothiazolem při použití třetí

MF (methanol:voda v poměru 95:5 (v/v))

MF (methanol:voda v poměru 80:20 (v/v))

Linearita: Bylo připraveno 7 kalibračních roztoků Cu(II+) komplexu s 2-merkaptobenzothiazolem v rozmezí koncentrací mědi 0,03 - 2,00 mg/l. Každý kalibrační roztok byl proměřen 5x a z průměru byla vytvořena kalibrační křivka. - podmínky: - MF: methanol:voda 88:12 (v/v), objem nástřiku 2,5 µl, detektor UV (275 nm)

Tab. č. 8: Ukázka statistické analýzy pro kalibrační roztok č. 4 Číslo měření Plocha píku [AU.s] 1 764,175 2 771,352 3 795,478 4 802,621 5 782,016 xp 783,128 Dean-Dixonův test R 38,446 Q1 0,187 Q5 0,186 Q0,05;2;5 0,642 Dean-Dixonovým testem pro odlehlost výsledků bylo prokázáno, že žádný z výsledků není odlehlý na hladině významnosti α = 0,05. 32

Tab. č. 9: Naměřené plochy píků pro jednotlivé kalibrační roztoky Cu(II+) komplexu s 2merkaptobenzothiazolem Kalibrační Koncentrace mědi Plocha píku* roztok č. [mg/l] [AU.s] 1 0,03 45,163 2 0,10 165,072 3 0,30 462,926 4 0,50 783,128 5 1,00 1392,551 6 1,50 2004,932 7 2,00 2618,311 * průměrná hodnota signálu z 5 měření

Obr. č. 17 - Kalibrační křivka pro Cu(II+) komplex s 2-merkaptobenzothiazolem vytvořena v programu Statistica - rovnice regrese: y = 1 295,0633 · x + 62,8414 - regresní koeficient: R = 0,9979 - statistická analýza regresního koeficientu a (posunutí) kalibrační křivky - analýza: sa = 27,4623 |a| = 62,8414 výpočet parametru t: t0,05;2;7 = 2,447 33

- ze statistické analýzy regresního koeficientu a (posunutí) vyplývá, že úsek a je statisticky nevýznamný na hladině významnosti α = 0,05 - výsledná rovnice regrese: y = 1 339,9560 · x

Limit detekce: Limit detekce byl vypočítán jak z rovnice lineární regrese

kde: s je směrodatná odchylka z naměřených hodnot signálu kalibračního roztoku č. 1 a k je směrnice kalibrační přímky (a = 0), tak pomocí vzorce z nízké měřitelné koncentrace roztoku

kde c je koncentrace kalibračního roztoku č. 1, s je směrodatná odchylka z průměru naměřených hodnot signálu daného roztoku a H plocha píku roztoku.

Tab. č. 10: Naměřené plochy píků pro Cu(II+) komplex s 2-merkaptobenzothiazolem o koncentraci mědi 0,03 mg/l Číslo měření Plocha píku [mV.s] 1 35,084 2 39,228 3 40,185 4 43,542 5 43,957 6 45,718 7 47,108 8 50,067 9 52,748 10 58,933 xp (=H) 45,657 Grubbsův test s 6,980 S 6,622 T1 1,597 T10 2,005 T0,05;2;10 2,294 Výpočet limitu detekce LODR [mg/l] 0,016 LODV [mg/l] 0,014

34

Grubbsovým testem pro odlehlost výsledků bylo prokázáno, že žádný z výsledků není odlehlý na hladině významnosti α = 0,05. Poté byly vypočteny limity detekce jak z rovnice lineární regrese, tak pomocí vzorce z nízké měřitelné koncentrace roztoku. Oba limity se řádově nelišily.

Limit stanovitelnosti: Limit stanovitelnosti byl vypočítán jako trojnásobek limitu detekce. LOQ = 3 · 0,01 mg/l = 0,03 mg/l

Interference: Jako interferentní prvky pro měď byly vybrány ionty kovů AlIII+, CrIII+, MnII+, FeIII+, CoII+ a NiII+. Koncentrace jednotlivých interferentních iontů byla asi 0,1 mol/l. Analýza probíhala takovým způsobem, že byl připraven Cu(II+) komplex s 2-merkaptobenzothiazolem bez interferentů, s jednotlivými interferenty a na závěr byl připraven komplex se všemi interferenty dohromady. Ani u jednoho prvku se nepotvrdila interference, tudíž lze usuzovat, že daná metoda je pro měď specifická.

Test DERT: Vždy po skončení experimentu byla kolona podrobena testu DERT na kontaminaci kovy.

2,3-dihydroxynaftalen

Obr. č. 18 - Ukázka asymetrie píku 2,3-dihydroxynaftalenu po detekci průchodu kontaminovanou kolonou 35

Hodnota testu: Z výše uvedené hodnoty testu DERT vyplývá, že kolona byla kontaminována kovovými ionty a byla potřeba vždy před další analýzou provést dekontaminaci. K tomuto účelu se doporučuje použít jako mobilní fázi 0,05M roztok amonné soli EDTA a následně 0,1% roztok kyseliny tereftalové (TFA). Dekontaminace kolony probíhala takovým způsobem, že nejprve se kolona promývala 0,05M roztok amonné soli EDTA po dobu 40 minut, poté se nechala kolona promývat 0,1% roztokem TFA po dobu alespoň 30 minut. Poté se opět provedl test kontaminace kolony, kdy se hodnota testu DERT zvýšila na 0,88.

Závěr: Metodou HPLC, která je převážně určena na analýzu organických látek, jsem se pokusil stanovit měď, a to pomocí reakce s komplexotvorným činidlem 2-merkaptobenzothiazolem. Pro zakoncentrování a zvýšení citlivosti metody jsem výsledný komplex extrahoval do benzenu. Optimalizoval jsem mobilní fázi, provedl jsem validaci parametrů: linearita, limit detekce, limit stanovitelnosti a interference. Kolona byla také podrobena testu DERT na kontaminaci kolony. Problémem při stanovení mědi pomocí HPLC shledáván v tom, že každý den po analýze jsem musel provést dekontaminaci kolony 0,05M roztokem amonné soli EDTA a následně 0,1% roztokem TFA. Byl vytvořen návod stanovení mědi jako Cu(II+) komplex s 2-merkaptobenzothiazolem pomocí HPLC, který byl uložen na CD a přiložen k diplomové práci.

36

4.3. Stanovení mědi pomocí průtokové chronopotenciometrie

Obr. č. 19 - Přístroj EcaFlow 150 GLP

4.3.1. Parametry a specifikace přístroje - elektrochemický analyzátor EcaFlow 150 GLP, výrobce: Istran s.r.o., Bratislava - kompaktní průtoková cela s pracovní elektrodou E53 Au, výrobce: Istran s.r.o., Bratislava - software EcaFlow na vyhodnocení výsledků, výrobce: Istran s.r.o., Bratislava Tab. č. 10: Seznam chemikálií potřebných pro analýzu Název chemikálie CAS Výrobce Lach-Ner s.r.o., kys. chlorovodíková 35% p.a. 7647-01-0 Neratovice síran měďnatý pentahydrát

LACHEMA, Brno

7758-98-7

37

Poznámky základní elektrolyt R-013 (0,1 M HCl) standardní roztok připravovaný čerstvý každý měsíc o cm(CuII+) = 1 g/l

4.3.2. Výsledky a diskuze Stanovením mědi pomocí průtokové chronopotenciometrie se již zabývala paní Mgr. Jana Benešová, která pomocí průtokové chronopoteciometrie stanovovala obsah mědi ve vzorcích vína. Já jsem v rámci své diplomové práce rozšířil metodu stanovení mědi na kapalné vzorky s jednoduchou matricí obecně, provedl jsem validaci parametrů a následně jsem vytvořil návod pro studenty do laboratorních kurzů analytické chemie. Ze standardního roztoku byly připraveny kalibrační roztoky mědi o koncentraci 0,5, 1,0 a 2,0 mg/l. Následně byla vytvořena kalibrační křivka.

Obr. č. 20 - Chronopotenciogram standardu mědi o koncentraci 0,5 mg/l

Podle návodů z firmy Istran s.r.o., Bratislava by se měď měla vylučovat v rozmezí elektrodového potenciálu 400 - 600 mV. Červené kurzory v grafu značí, v jakém rozmezí elektrodového potenciálu se měď skutečně vylučovala a v jakém rozmezí byla také softwarem EcaFlow převedena na kalibrační křivku.

38

Obr. č. 21 - Kalibrační křivka vytvořená softwarem EcaFlow od firmy Istran s.r.o., Bratislava - rovnice regrese: y = 0,0258 · x + 0,0401 - regresní koeficient: R = 0,9997

Limit detekce: Pro vyhodnocení tohoto parametru byla použita metoda postupného ředění. Kalibrační roztoky mědi byly 20x zředěny na koncentrace 25,0, 50,0 a 100,0 μg/l. Každý kalibrační roztok byl vždy několikrát proměřen.

Obr. č. 22 - Graf standardu mědi

Obr. č. 23 - Graf standardu mědi

o koncentraci 25,0 μg/l

o koncentraci 50,0 μg/l

39

Protože při následném ředění se již neobjevoval pík mědi, byla jako limit detekce označena koncentrace 25,0 μg/l.

Limit stanovitelnosti: Limit stanovitelnosti byl určen jako trojnásobek limitu detekce. LOQ = 3 · 25,0 μg/l = 75,0 μg/l

Interference: Jako interferentní prvky pro měď byly vybrány ionty kovů AlIII+, CrIII+, MnII+, FeIII+, CoII+ a NiII+. Koncentrace jednotlivých interferentních iontů byla asi 0,1 mol/l. Analýza probíhala takovým způsobem, že byl připraven roztok mědi bez interferentů, s jednotlivými interferenty a na závěr byl připraven roztok mědi se všemi interferenty dohromady. Ani u jednoho prvku se nepotvrdila interference, tudíž lze usuzovat, že daná metoda je pro měď specifická.

Robustnost: Protože je metoda součástí laboratorních kurzů určených pro studenty bakalářského a magisterského studia Chemie a studenti si sami připravují základní elektrolyt R-013, byla metoda validována na robustnost vůči změně koncentrace základního elektrolytu R-013 v rozmezí 0,08 - 0,12 M HCl. Vždy byla připravena sada roztoků o přesně dané koncentraci, která byla zředěna základním elektrolytem o různé koncentraci HCl. Naměřené výsledky byly vyhodnoceny Dean-Dixonovým testem na odlehlost a Lordovým testem na správnost.

40

Tab. č. 11: Naměřená data pro posouzení správnosti a robustnosti dané metody Koncentrace HCl v základním elektrolytu R-013 0,08M HCl 0,10M HCl 0,12M HCl Sada roztoků o koncentraci mědi [μg/l] 50

100

200

Měření č. 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Naměřená koncentrace mědi [μg/l] 47,32 49,43 51,96 99,17 103,35 103,74 195,07 197,66 198,23

46,81 49,05 50,78 97,45 99,53 100,29 196,14 196,75 201,54

48,33 49,18 52,63 97,64 102,34 103,13 195,64 201,51 203,03

Obr. č. 24 - Krabicový graf vytvořený programem Statistica pro posouzení robustnosti a správnosti metody pro sadu roztoků mědi o koncentraci 50 μg/l (modře je znázorněna referentní hodnota, oranžově naměřené hodnoty)

41

Tab. č. 12: Dean-Dixonův test a určení intervalu spolehlivosti pro sadu roztoků mědi o koncentraci 50 μg/l

xp R Q1 Q3 Q0,05;2;3 K0,05;2;3 L1,2

Naměřené hodnoty pro roztok mědi o koncentraci 50 μg/l 0,08M HCl 0,10M HCl 0,12M HCl 49,57 48,88 50,05 4,64 3,97 4,30 0,455 0,564 0,198 0,545 0,436 0,802 0,941 0,941 0,941 1,304 1,304 1,304 49,57 ± 6,05 48,88 ± 5,18 50,05 ± 5,61


42


xp R Q1 Q3 Q0,05;2;3 K0,05;2;3 L1,2



43


xp R Q1 Q3 Q0,05;2;3 K0,05;2;3 L1,2


Z výše uvedených grafů a tabulek je patrné, že změna koncentrace kyseliny chlorovodíkové v základním elektrolytu v rozmezí 0,08 - 0,12 M HCl nemá významný vliv na výsledek stanovení na hladině významnosti α = 0,05.

Závěr: Metodou stanovení mědi pomocí průtokové chronopotenciometrie se již zabývala Mgr. Jana Benešová, která stanovovala obsah mědi ve vzorcích vína. Já jsem danou metodu rozšířil na kapalné vzorky s jednoduchou matricí obecně, provedl jsem validaci parametrů: linearita, limit detekce, limit stanovitelnosti, interference a robustnost. Poté jsem vytvořil návod do laboratorních kurzů, který jsem uložil na CD a přiložil k diplomové práci.

44

4.4. Stanovení mědi pomocí spektrofotometrie

Obr. č. 27 - Spektrofotometr Lightwave II 4.4.1. Parametry a specifikace přístroje - spektrofotometr Lightwave II od firmy Biochrom Ltd., Cambridge

Tab. č. 15: Seznam chemikálií potřebných pro analýzu Název chemikálie CAS Výrobce diethyldithiokarbamát Lach-Ner s.r.o., 20624-25-3 sodný Neratovice amylalkohol 71-41-0 LACHEMA, Brno hydrogencitronan amonný Lach-Ner s.r.o., 3012-65-5 p.a. Neratovice

Poznámky chelatační činidlo (1% roztok) extrakční činidlo 40% roztok

síran měďnatý pentahydrát

7758-98-7

LACHEMA, Brno

standardní roztok připravovaný čerstvý každý měsíc o cm(CuII+) = 1 g/l

amoniak 25% p.a.

1336-21-6

Lach-Ner s.r.o., Neratovice

vodný roztok 1:1

45

4.4.2. Výsledky a diskuze Do dělící nálevky bylo vždy přidáno 50 ml roztoku o přesně dané koncentraci mědi, 5 ml 40% roztoku hydrogencitronanu amonného, 10 ml amoniaku (1:1) pro úpravu pH, 5 ml 1% komplexotvorného roztoku DDTC a 10 ml amylalkoholu. Po protřepání a dokonalém oddělení obou fází byla organická fáze obsahující Cu(II+) komplex s DDTC analyzována na spektrofotometr Lightwave II od firmy Biochrom Ltd., Cambridge. Komplex byl proměřen v rozsahu vlnových délek 400 - 650 nm: 0,1 0,09

Absorbance

0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,0 400,0

450,0

500,0

550,0

600,0

650,0

Vlnová délka [nm]

Obr. č. 28 - Spektrum Cu(II+) komplexu s DDTC o koncentraci cM(CuII+) = 0,50 mg/l

Po vyhodnocení spektra Cu(II+) komplexu s DDTC byla jako nejvhodnější vlnová délka pro další analýzy vybrána hodnota 430 nm, při které dosahovala hodnota absorbance nejvyšší hodnoty.

Linearita: Bylo připraveno 7 kalibračních roztoků Cu(II+) komplexu s DDTC v rozmezí koncentrací mědi 0,15 - 5,00 mg/l. Každý kalibrační roztok byl proměřen 5x a z průměru byla vytvořena kalibrační křivka. Přístroj byl nulován na roztok 100% dichlormethanu. Blank byl proměřen 5x a jeho průměrná hodnota absorbance byla A0 = 0,005

46

Tab. č. 16: Ukázka statistické analýzy pro kalibrační roztok č. 2 Číslo měření Hodnota absorbance 1 0,088 2 0,086 3 0,089 4 0,089 5 0,087 xp 0,088 Dean-Dixonův test R 0,003 Q1 0,333 Q5 0,333 Q0,05;2;5 0,642 Dean-Dixonovým testem pro odlehlost výsledků bylo prokázáno, že žádný z výsledků není odlehlý na hladině významnosti α = 0,05.

Tab. č. 17: Naměřené hodnoty absorbance pro jednotlivé kalibrační roztoky Kalibrační Koncentrace roztoku Cu Absorbance roztoku a Absorbance roztoku po roztok č. [mg/l] blanku* odečtení blanku* 1 0,15 0,021 0,016 2 0,50 0,088 0,083 3 1,00 0,176 0,171 4 1,50 0,259 0,254 5 2,00 0,327 0,322 6 3,00 0,506 0,501 7 5,00 0,820 0,815 * průměrná hodnota absorbance z 5 měření

47

Obr. č. 29 - Kalibrační křivka Cu(II+) komplexu s DDTC

- rovnice regrese: y = 0,1639 · x + 0,0010 - regresní koeficient: R = 0,9993 - statistická analýza regresního koeficientu a (posunutí) kalibrační křivky - analýza: sa = 0,0048 |a| = 0,0010 výpočet parametru t: t0,05;2;7 = 2,447 - ze statistické analýzy regresního koeficientu a (posunutí) vyplývá, že úsek a je statisticky nevýznamný na hladině významnosti α = 0,05 - výsledná rovnice regrese: y = 0,1642 · x

Limit detekce: Pro vyhodnocení tohoto parametru byla použita metoda postupného ředění a metoda výpočtu z rovnice lineární regrese. Metodou postupného zředění bylo prokázáno, že koncentrace limitu detekce je cm(Cu) = 0,05 mg/l. Vzorek byl proměřen 10x a byl proveden Grubbsův test na odlehlost výsledků.

48

Tab. č. 18: Hodnoty pro vyhodnocení limitu detekce Hodnota absorbance roztoku Číslo měření o cm(Cu) = 0,05 mg/l 1 0,005 2 0,007 3 0,007 4 0,007 5 0,008 6 0,008 7 0,009 8 0,010 9 0,010 10 0,011 xp 0,008 Grubbsův test s 0,002 S 0,002 T1 1,860 T10 1,627 T0,05;2;10 2,294 Grubbsovým testem na odlehlost výsledků se prokázalo, že žádný výsledek není odlehlý na hladině významnosti α = 0,05. Metodou výpočtu z rovnice lineární regrese bylo určeno, že koncentrace limitu detekce je LODR = 3 · 0,0048 / 0,1642 = 0,088 mg/l Oba limity se řádově nelišily.

Limit stanovitelnosti: Limit stanovitelnosti byl určen jako trojnásobek LOD, tudíž LOQ = 3 · 0,05 mg/l = 0,15 mg/l

49

Interference: Jako interferentní prvky pro měď byly vybrány ionty prvků AlIII+, CrIII+, MnII+, FeIII+, CoII+ a NiII+. Koncentrace jednotlivých interferentních iontů byla asi 0,1 mol/l. Analýza probíhala takovým způsobem, že byl připraven Cu(II+) komplex s diethyldithiokarbamátem bez interferentů, s jednotlivými interferenty a na závěr byl připraven Cu(II+) komplex s DDTC se všemi interferenty dohromady. Ani u jednoho prvku se nepotvrdila interference, tudíž lze usuzovat, že daná metoda je pro měď specifická.

Závěr: V rámci své diplomové práce jsem optimalizoval metodu stanovení mědi pomocí komplexotvorného činidla diethyldithiokarbamátu pro spektrofotometrie na přístroji Lightwave II od firmy Biochrom Ltd., Cambridge. Validoval jsem parametry: linearita, limit detekce, limit stanovitelnosti a interference. Následně jsem pro danou metodu vytvořil návod pro laboratorní cvičení z analytické chemie. Návod byl uložen na CD a přiložen k diplomové práci.

50

5. Závěr Byly splněny všechny cíle diplomové práce. Validoval jsem několik metod pro simultánní stanovení analytů ve směsi (převážně mědi a hliníku). Veškerá naměřená data jsem analyzoval pomocí chemometrických technik k tomu potřebných a pomocí softwaru Statistica, Microsoft Office Excel a ChemSketch. V neposlední řadě jsem vytvořil návody k jednotlivým metodám pro laboratorní cvičení z analytické chemie, kde si studenti nyní mohou propojit tři principiálně různé techniky pro stanovení analytu kovu. Podrobněji jsem validoval parametry: linearitu, limit detekce, limit stanovitelnosti a interferenci. U vybraných metod také robustnost a Reprodukovatelnost. Vytvořil jsem návod pro stanovení hliníku plynovým chromatografem pomocí reakce s komplexotvorným činidlem acetylacetonem. Vytvořil jsem návod pro metodu stanovení mědi reakcí s komplexotvorným činidlem 2merkaptobenzothiazolem pomocí HPLC. Dále jsem rozšířil metodu paní Mgr. Jany Benešové, která se věnovala stanovení mědi pomocí průtokové chronopotenciometrie ve víně, na stanovení mědi obecně v kapalných vzorcích s jednoduchou matricí. Pro metodu jsem vytvořil návod do laboratorních cvičení z analytické chemie. V neposlední řadě jsem validoval parametry

pro

metodu

stanovení

mědi

reakcí

s

komplexotvorným

činidlem

diethyldithiokarbamátem sodným pomocí spektrofotometrie na přístroji Lightwave II od firmy Biochrom Ltd., Cambridge. Opět byl vytvořen návod do laboratorních cvičení z analytické chemie. Protože nastaly problémy s optimalizací metody pro stanovení mědi pomocí komplexotvorného činidla DDTC na plynovém chromatografu, nemohly být porovnány metody spektrofotometrie a plynové chromatografie, které vykazovaly podobný průběh přípravy vzorků. Všechny vytvořené návody do laboratorních cvičení z analytické chemie jsou přiloženy k diplomové práci na CD.

51

6. Seznam obrázků a tabulek uvedených v této práci 6.1. Seznam obrázků Obr. č. 1

Schéma zapojení plynové chromatografie

Obr. č. 2

Vzorec acetylacetonu

Obr. č. 3

Schéma zapojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie13

Obr. č. 4

Vzorec 2-merkaptobenzothiazolu

Obr. č. 5

Přístroj YL 6100GC

Obr. č. 6

Chromatogram analýzy kovů pomocí GC, dosažené v rešerši

Obr. č. 7

Chromatogram analýzy kovů na přístroji YL 6100GC

Obr. č. 8

Kalibrační křivka pro Al(III+) komplex s acetylacetonem vytvořena v programu Statistica

Obr. č. 9

Chromatogram

Al(III+) komplexu

s acetylacetonem

bez

přítomnosti

interferenčních prvků Obr. č. 10

Chromatogram Al(III+) komplexu s acetylacetonem s přítomností všech interferenčních prvků

Obr. č. 11

Isokratický HPLC systém Watrex

Obr. č. 12

Chromatogram standardů 2,3- a 2,7-dihydroxynaftalenů pro test DERT

Obr. č. 13

Chromatogram testovací směsi pro HPLC

Obr. č. 14

Chromatogram Cu(II+) komplexu s 2-merkaptobenzothiazolem při použití druhé MF (methanol:voda v poměru 88:12 (v/v))

Obr. č. 15

Chromatogram Cu(II+) komplexu s merkaptobenzothiazolem při použití první MF (methanol:voda v poměru 95:5 (v/v))

Obr. č. 16

Chromatogram Cu(II+) komplexu s merkaptobenzothiazolem při použití třetí MF (methanol:voda v poměru 80:20 (v/v))

Obr. č. 17

Kalibrační křivka pro Cu(II+) komplex s 2-merkaptobenzothiazolem vytvořena v programu Statistica

Obr. č. 18

Ukázka asymetrie píku 2,3-dihydroxynaftalenu po detekci průchodu kontaminovanou kolonou

Obr. č. 19

Přístroj EcaFlow 150 GLP

Obr. č. 20

Chronopotenciogram standardu mědi o koncentraci 0,5 mg/l

52

Obr. č. 21

Kalibrační křivka vytvořená softwarem EcaFlow od firmy Istran s.r.o., Bratislava

Obr. č. 22

Graf standardu mědi o koncentraci 25 μg/l

Obr. č. 23

Graf standardu mědi o koncentraci 50 μg/l

Obr. č. 24

Krabicový graf vytvořený programem Statistica pro posouzení robustnosti a správnosti metody pro sadu roztoků mědi o koncentraci 50 μg/l (modře je znázorněna referentní hodnota, oranžově naměřené hodnoty)

Obr. č. 25


Obr. č. 26


Obr. č. 27

Spektrofotometr Lightwave II

Obr. č. 28

Spektrum Cu(II+) komplexu s DDTC o koncentraci cM(CuII+) = 0,50 mg/l

Obr. č. 29

Kalibrační křivka Cu(II+) komplexu s DDTC

53

6.2. Seznam tabulek Tab. č. 1

Seznam chemikálií potřebných pro plynovou chromatografii

Tab. č. 2

Ukázka statistické analýzy pro kalibrační roztok č. 2

Tab. č. 3

Naměřené plochy píků pro jednotlivé kalibrační roztoky

Tab. č. 4

Naměřené plochy píků a statistická analýza reprodukovatelnosti

Tab. č. 5

Naměřené plochy píků pro Al(III+) komplex s acetylacetonem

Tab. č. 6

Seznam chemikálií potřebných pro analýzu

Tab. č. 7

Určení retenčních časů a výpočet počtu teoretických pater pro testovací směs

Tab. č. 8


Tab. č. 9

Naměřené plochy píků pro jednotlivé kalibrační roztoky Cu(II+) komplexu s 2merkaptobenzothiazolem

Tab. č. 10


Tab. č. 11

Naměřená data pro posouzení správnosti a robustnosti dané metody

Tab. č. 12

Dean-Dixonův test a určení intervalu spolehlivosti pro sadu roztoků mědi o koncentraci 50 μg/l

Tab. č. 13


Tab. č. 14


Tab. č. 15


Tab. č. 16


Tab. č. 17

Naměřené hodnoty absorbance pro jednotlivé kalibrační roztoky

Tab. č. 18

Hodnoty pro vyhodnocení limitu detekce

54

7. Literatura 1

http://meloun.upce.cz/index.php?option=com_content&view=article&id=91&Itemid =38 (14. 2. 2011)

2

www.chemi.muni.cz/~literak/uvod.pdf (1. 5. 2009)

3

Popl, M., Kubát, J., Základy chromatografie. Praha : SNTL - Nakladatelství technické literatury, 1981

4

Laghari, A. J. a spol., Pyrrolidinedithiocarbamate as a Reagent for GC Analysis of Metal Ions 2010, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 4(12), 6046-6051

5

Arain, M. A. a spol., Capillary Gas Chromatography of Metal Chelates of Diethyl Dithiocarbamates 2002, Chromatographia, 55, 349-352

6

Malát, M., Absorpční anorganická fotometrie. Praha : Academia, 1973

7

Vogel, A. I., A text-book of quantitative inorganic analysis. London : Longmans, 1961

8

Hill, R. D., Gesser, H., An Investigation into the Quantitative Gas Chromatographic Analysis of Metal Chelates Using a Hydrogen-Flame Ionization Detector 1963, Journal of Gas Chromatography, 10, 11-14

9

Maslowska, J., Starzynski, S., Studies on the Separation of Metal Acetylacetonates by Gas Chromatography 1983, Chromatographia, 17, 418-420

10

Maslowska, J., Starzynski, S., Gas Chromatographic Behaviour of Some Metal Acetylacetonates 1984, Mikrochimica Acta, 1, 487-492

11

Sokolov, D. N., Analytical Gas Chromatography of Volatile Metal Complexes 1988, Russian Chemical Reviews, 57, 956-966

12

Arancibia, V. a spol., Determination of chromium in urine samples by complexationsupercritical fluid extraction and liquid or gas chromatography 2003, Journal of Chromatography B, 785, 303-309

13

http://users.prf.jcu.cz/sima/analyticka_chemie/separa.htm (20. 5. 2012)

14

Ichinoki, S. a spol., Determination of Copper Ion in River Water by Solvent Extraction with 2-Mercaptobenzothiazole Followed by Reserved Phase HPLC 2009, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 32, 3066-3076

15

Cruz, E. a spol., Chromatographic Classification of Commercially Available ReversePhase HPLC Columns 1997, Chromatographia, 44, 151-161

16

Zýka, J. a kol., Analytická příručka. Praha : SNTL, 1988 55

17

Bartušek, M., Úvod do elektroanalytických metod. Praha : Státní pedagogické nakladatelství, 1984

18

Aplikační list EcaFlow, Istran s.r.o., Bratislava, 2009

19

Benešová, J., Stanovení mědi a dusičnanů coulometricky - Bakalářská práce, 2010

20

Farková, M., Instrumentální analytická chemie - praktikum. Brno : Masarykova univerzita, 2011

21

Ghazy, M. E. a spol., Spectrophotometric Determination of Copper(II) in Natural Waters, Vitamins and Certified Steel Scrap Samples Using Acetophenone-pchlorophenylthiosemicarbazone 2006, Journal of the Iranian Chemical Society, 3, 140150

22

http://www.eurachem.org/ (13. 3. 2012)

23

http://www.cskb.cz/cskb.php?pg=doporuceni--validace-a-verifikace-metod (27. 2. 2012)

24

http://www.effichem.cz/reseni/laboratorni-specialiste/validace-metod/ (13. 3. 2012)

25

Eckschlager, K., Horsák, I., Kodejš, Z., Vyhodnocování analytických výsledků a metod. Praha : SNTL, 1980

26

Skoog, D. A. a spol., Analytical Chemistry : an introduction. Philadelphia : Saunders College Publishing, 1994

27

Wai, C. M., Preconcentration Techniques for Trace Elements. Boča Raton : CRC Press, 1991

28

Timerbaev, A. R. a spol., Analytical Application of Liquid Chromatography of Metal Chelates 1987, Analytical Chemistry, 327, 87-101

29

Wang, P., Lee, H. K., Recent Application of High-Performance Liquid Chromatography to the Analysis of Metal Complexes 1997, Journal of Chromatography A, 789, 437-451

30

Atkins, P. W., Physical Chemistry. Oxford : Oxford University Press, 1998

31

Procházková, M., Analýza metaloproteinů metodou HPLC-ICP-MS - Diplomová práce, 2010

56

8. Přílohy

Příloha I

- tabulka pro Dean-Dixonův koeficient kn Počet stanovení n 2 3 4 5 6 7 8 9 10

kα;2;n α = 0,05 0,8862 0,5908 0,4857 0,4299 0,3946 0,3698 0,3512 0,3367 0,3249

- tabulka kritických hodnot Tα;2;n a Qα;2;n pro vylučování odlehlých výsledků Počet stanovení n 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tα;2;n α = 0,05 1,412 1,689 1,869 1,996 2,093 2,172 2,237 2,294 2,343 2,387 2,426 2,461 2,493

57

Qα;2;n α = 0,05 0,941 0,765 0,642 0,560 0,507 0,468 0,437 0,412

Příloha II

- tabulka kritických hodnot Studentova rozdělení tα;2;n pro testování shody výsledků Počet stanovení n 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

tα;2,n α = 0,05 12,706 4,303 3,182 2,776 2,571 2,447 2,365 2,306 2,262 2,228 2,201 2,179 2,160 2,145

- tabulka kritických hodnot Lordova rozdělení Kα;2;n Počet stanovení n 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Kα;2;n α = 0,05 6,353 1,304 0,717 0,507 0,399 0,333 0,288 0,255 0,230

58

Příloha III

- tabulka kritických hodnot Snedecorova rozdělení Fα;2;n1;n2 (α = 0,05) pro testování shody rozptylů n2 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2 161,5 18,5 10,1 7,7 6,6 6,0 5,6 5,3 5,1

3 199,5 19,0 9,6 6,9 5,8 5,1 4,7 4,5 4,3

4 215,7 19,2 9,3 6,6 5,4 4,8 4,3 4,1 3,9

5 224,6 19,2 9,1 6,4 5,2 4,5 4,1 3,8 3,6

n1 6 230,2 19,3 9,0 6,3 5,1 4,4 4,0 3,7 3,5

- tabulka kritických hodnot Lordova rozdělení uα;2;n Počet stanovení n 2 3 4 5 6 7 8 9 10

uα;2;n α = 0,05 1,714 0,636 0,406 0,306 0,250 0,213 0,186 0,167 0,152

59

7 234,0 19,3 8,9 6,2 5,0 4,3 3,9 3,6 3,4

8 9 10 11 236,8 238,9 240,5 241,9 19,4 19,4 19,4 19,4 8,9 8,8 8,8 8,8 6,1 6,0 6,0 6,0 4,9 4,8 4,8 4,7 4,2 4,1 4,1 4,1 3,8 3,7 3,7 3,6 3,5 3,4 3,4 3,3 3,3 3,2 3,2 3,1

9. Dodatek Závěrem mé diplomové práce bych Vám chtěl ukázat pár zákonů, se kterými musí každý vědecký pracovník při své práci počítat. Murphyho zákony v chemometrii1 1. Základní zákon o měření: Neopakuj měření, dožiješ se zklamání. 2. Zákon spolehlivé matematiky: Nejlepší výpočet je kvalifikovaný odhad. 3. Zákon o jistotě nejistot: Měření je jisté, jen nejistoty jsou nejisté. 4. Zákon o zdrojích nejistot: Důležitý zdroj nejistot zůstává obvykle nepoznán. 5. Zákon přímé úměrnosti: Malým znalostem odpovídají malé nejistoty. 6. Zákon nepřímé úměry: Čím více měříš, tím méně si věříš. 7. Zákon inverze: Čím vyspělejší je metrologické pracoviště, tím menší udává rozsah měření a větší nejistoty. 8. Zákon didaktického rozporu: Vše souvisí se vším. Jak to ale zapsat do kalibračního grafu? 9. Zákon laboratorní praxe: Uprostřed důležitého měření vždy přijde zákazník nebo alespoň zazvoní telefon. 10. Zákon systému jakosti: Systém jakosti je nejlepší způsob, jak udělat samozřejmé zásady složitými a neřešitelnými.

60

Separační metody a jejich kombinace ve výuce analytické chemie

Recommend Documents