Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
Review: Pemisahan Preparatif dan Determinasi Matrin dari Tumbuhan Obat China Sophora flavescens dengan Menggunakan Sistem Moleculary Imprinted Solid-Phase Extraction Jia-Ping Lai, Xin-Wen He, Yue Jiang, Feng Chen Anal Bioanal Chem (2003) 375:264–269 DOI 10.1007/s00216-002-1675-2 Springer-Verlag 2002
Pendahuluan Sophora flavescens (famili fabaceae) adalah pohon yang tersebar di wilayah asia dan dapat tumbuh pada semua kondisi suhu. Pohon ini mengandung
alkaloid
oxide/oksimatrin.
quinolizidine,
Matrin
(MT)
dan
yaitu
matrine
oksimatrin
dan
(OMT)
matrine
merupakan
komponen utama dari tumbuhan obat china Sophora flavescens yang aktif secara biologis sebagai obat antifebril, nyeri, diuretik, batuk, antidotum, tumor, antiaritmia, abiritatif, meningkatkan leukosit, dan menjaga fungsi hati. Untuk memisahkan MT dan OMT agar lebih efektif dan efisien, peneliti melakukan pengembangan metode ekstraksi dan determinasinya. Metode pemisahan kedua senyawa tersebut masih sedikit dilaporkan termasuk
metode
Performance
Liquid
counter-current
chromatography
Chromatography
(HPLC)
(CCC), dan
High-
Thin-Layer
Chromatography (TLC). Ketiga metode tersebut belum maksimal dalam memisahkan senyawa MT dan OMT. Sedangkan untuk determinasi terutama digunakan HPLC dan Capillary Zone Electrophoresis (CZE)
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 1
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
Molecularly imprinted polymers (MIPs) adalah polimer crosslinker dengan daerah binding site membentuk jalinan kopolimerisasi dengan monomer fungsional pada molekul templat. MISPE adalah pengembangan dari metode solid-phase extraction (SPE) klasik dengan menggunakan fase diam Molecularly imprinted polymers (MIPs) yang sudah bersih dari pengotor. Pada penelitian ini menggunakan Molecularly imprinted microsphere (MIMs) yang disintesis dari cairan polimer micro-suspension untuk memisahkan matrin dari tumbuhan tersebut dengan matrin (MT) murni sebagai molekul templat. MIMs adalah suatu jenis membran yang mengandung MIPs dengan selektifitas dan afinitas yang tinggi. Metode Penelitian Pembuatan MIMs MIMs dibuat dengan terlebih dahulu melarutkan Poly (vinil alkohol) (PVA) 500 (3,4 g) dalam 120 mL air dengan kemurnian tinggi pada suhu 9095oC, hal ini dilakukan untuk memudahkan dalam pembentukan polimer. PVA adalah suatu polimer sintetis yang larut dalam air, dapat membentuk
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 2
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
lapisan, bahan pengemulsi dan mempunyai sifat adhesif. Larutan tersebut dimasukkan dalam labu berleher tiga. Molekul penuntun MT murni (1 mmol) dan monomer fungsional methacrylic acid (MAA) (6 mmol) dicampur dalam botol gelas kemudian ditambah kloroform sebagai progen. MAA adalah komponen organik yang dapat larut dalam air panas dan pelarut organik yang lain. MAA banyak digunakan untuk membentuk polimer.
Campuran
organik
disimpan
dalam
freezer
dengan
mempertahankan pada suhu 0oC selama 30 menit. Sejumlah 50 mmol ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) sebagai copolymer crosslinker dalam reaksi radikal bebas dan 150 mg AIBN sebagai inisiator ditambahkan
kedalam campuran
dan
larutan
tersonikasi.
Semua
campuran dimasukkan dalam fase air pada labu berleher tiga sambil diputar pada 410 rpm dengan penurunan secara perlahan (0,8 L/min) sambil dialiri nitrogen (99.99%). Temperatur diturunkan ke 60oC untuk mendorong terjadinya polimerisasi. Proses ini dijaga selama 24 jam. Butiran dicuci dengan air terpurifikasi, metanol, dan campuran metanolasam asetat glasial (9:1 v/v), selanjutnya mikrosphere non-imprinted dibuat dengan cara yang sama tanpa penambahan molekul penuntun MT. MIMs digunakan sebagai fase diam untuk memisahkan senyawa MT dan OMT. Ekstraksi Matrin kasar dari Sophora flavescens Ait. Ekstraksi matrin dilakukan dengan terlebih dahulu merendam Akar Sophora flavescens 5,0 g dalam 10,0 mL amonium hidroksida 2,0 %
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 3
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
selama 4 jam. Amonium hidroksida adalah pelarut yang dapat digunakan untuk membasakan, mengendapkan atau memurnikan senyawa golongan alkaloid. Untuk mengendapkan alkaloid Harborne 1987, menganjurkan meneteskan NH4OH pekat dan untuk mencuci endapan menggunakan NH4OH
1%.
Kemudian
akar
dihancurkan
dengan
high-speed
desintegrator. Penghancuran akar dapat memudahkan penetrasi pelarut untuk menembus lapisan batas sehingga mempercepat proses ekstraksi. Bahan diekstraksi tiga kali dengan 10,0 mL campuran kloroform:metanol (5:5, v/v) secara berturut-turut. Harborne 1987, juga menganjurkan penarikan alkaloid dengan kloroform-etanol, kepolaran pelarut ini tidak jauh berbeda dengan cara
yang digunakan oleh peneliti. Ekstraksi
sebanyak tiga kali biasanya akan lebih efektif dibandingkan dengan satukali menggunakan volume pelarut yang sama. Campuran ekstrak diuapkan dengan rotavapor R-114. Residu dari hasil penguapan dilarutkan dalam 10,0 mL metanol kemudian disaring dengan membran Polymer Thick Film (PTF). PTF biasanya juga digunakan untuk memisahkan protein. Filtrat digunakan untuk SPE atau analisis dengan MIMs-HPLC. Solid-Phase Extraction MIMs kering yang disuspensikan dalam campuran metanol dan 2-propanol (5:5,v/v) disonikasi dalam waterbath selama 10 menit dan ditempatkan dalam cartridge SPE yang terbuat dari polypropylene dengan poros yang besar dan mempunyai kran untuk mendukung MIMs. Bagian atas dibatasi dengan gelas wool. Cartridge SPE dihubungkan dengan pompa vacuum.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 4
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
Pengisian cartridge SPE dengan menggunakan MGAA (9:1, v/v) sebanyak 30 mL, kemudian dijenuhkan dengan 20 mL metanol. Aliran dikontrol setiap 0,2 mL/menit. Cartridge yang telah dicuci dikeringkan dalam vaccum. Cartridge kosong juga dilakukan sesuai prosedur. Selanjutnya, 5,0 mL larutan standar atau ekstrak dimasukkan melalui cartridge (berisi MIMs dan polimer kosong)
dengan kecepatan 0,2 mL/menit. Untuk
mengevaluasi perbedaan pengaruh eluen dalam mengelusi pengisian cartridge dicuci dengan 5,0 mL MW 3:7, v/v, metanol–air (5:5, v/v), metanol, metanol–dichloromethane (8:2, v/v) dan metanol–asam asetat glasial (9:1, v/v), secara berturut-turut. Effluent dari setiap eluasi dikumpulkan untuk dianalisis dengan MIMs-HPLC. Metode MIMs-HPLC Microsphere dikemas dalam kolom dengan metode basah menggunakan campuran metanol:2-propanol (5:5, mL). Sistem HPLC terdiri dari 2 pompa air 510, modul air temperature-control dan detektor air 996 photodioda array. Temperatur kolom oven dikontrol pada suhu 50oC. Panjang gelombang dideteksi pada 215 nm. Kolom dibilas dengan campuran MGAA 9:1, v/v sampai stabil. Aliran disetting pada 1,0 mL/menit. Volume injeksi 20 uL. Faktor kapasitas dihitung berdasarkan prosedur standar kromatografi k’=(t-t0)/t0, t dan t0 adalah waktu retensi dan waktu awal. Waktu awal (t0) telah dideterminasi dengan waktu elusi dari peak pelarut. Faktor imprinted (α) dihitung dengan cara, α=k’ impr/k’ non-impr.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 5
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
Hasil dan Pembahasan Pemilihan pelarut pembilas dan eluen untuk MISPE Dalam sistem MISPE pelarut pembilas dengan eluen harus dibedakan. Pelarut pembilas digunakan untuk membersihkan pengotor, sedangkan eluen digunakan untuk mengelusi molekul target. Pemilihan eluen adalah hal kritis yang harus diperhatikan dalam menentukan kolom MIMs dalam proses kromatografi. Beberapa pelarut pembilas yang dipilih dalam prose MISPE seperti metanol:air (3:7,v/v, MW37) metanol–air (5:5, v/v, MW55), methanol (M), metanol–diklorometane (8:2, v/v, MDCM), diklorometan
(DCM) dan metanol–asam asetat glasial (9:1, v/v, MGAA). Larutan bilasan langsung dipisahkan dengan menggunakan metode MIPs-HPLC. Kromatogram a adalah peak OMT dan b adalah MT yang digunakan sebagai standar.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 6
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
Pada kromatogram c dibilas dengan menggunakan pelarut MW37, berdasarkan kromatogram tersebut tidak menunjukkan adanya senyawa MT ataupun OMT. Sedangkan pada kromatogram d menggunakan MW55 menunjukkan adanya sedikit peak MT maupun OMT. Hal ini menandakan bahwa MW37 merupakan campuran pelarut bersifat yang polar tidak dapat membawa MT atau OMT yang merupakan alkaloid dimana alkaloid larut dalam pelarut kurang polar, sedangkan MW55 sedikit bisa walaupun peak sangat kecil dibanding kontrol karena konsentrasi metanol ditingkatkan.
Pada kromatogram e dan f menggunakan pembilas M dan MDCM menunjukkan adanya peak MT dan OMT dengan jelas. Hal ini dapat terjadi
karena
metanol
merupakan
pelarut
yang
mempunyai
segmentasi/rentang luas dalam melarutkan senyawa dari berbagai tingkat kepolaran.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 7
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
Pada kromatogram g tidak menunjukkan adanya MT atau OMT dengan menggunakan DCM. Sedangkan kromatogram h menunjukkan sedikit peak MT dengan menggunakan MGAA tetapi peak OMT tidak muncul. Sehingga pada penelitian ini digunakan MW37 sebagai pelarut pembilas dan MGAA91 sebagai eluen untuk memisahkan MT. Pengaruh konsentrasi dan volume MISPE Ekstrak kloroform mengandung banyak pengotor sehingga perlu dibilas dengan menggunakan MW37. Untuk membilas MT dan OMT harus menggunakan
metanol
dengan
konsentrasi
tinggi
karena
pada
konsentrasi rendah metanol tidak dapat membersihkan pengotor. Hal ini didukung oleh penelitian dengan menggunakan variasi konsentrasi.
30 %
Konsentrasi
<30
%
dengan
analisis
kromatografik
tidak
dapat
mengeluarkan MT sedangkan konsentrasi > 30 dapat meningkatkan pengeluaran pengotor. Pengotor juga tidak dapat dihilangkan sempurna jika penggunaan eluen dalam jumlah sedikit.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 8
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
Pengeluaran MT dari cartridge-imprinted muncul jika menggunakan eluen yang banyak sampai 25 mL.sehingga dalam penelitian ini menggunakan metanol 30% dengan volume 25 mL yang digunakan untuk membilas pengotor dalam cartridge yang berisi MIMs. (Lihat Fig. 4) Pemilihan cartridge-MIMs dan kolom Pada pengguanaan cartridge tidak ada perbedaan nyata antara imprinted cartridge (IC) dengan non-imprinted cartridge (NIC) pada pembilasan awal hal ini menunjukkkan bahwa tidak ada IC dan NIC tidak mempunyai ikatan yang spesifik.
Peningkatan pembilasan tampak jelas setelah volume eluen sebesar 10 mL.
Pengeluaran
IC
tampak
jelas
pada
volume
25
mL.
Ini
mengindikasikan bahwa IC mengikat MT lebih kuat dibandingkan NIC. Untuk melihat efek imprinting terhadap OMT dilakukan penelitian lanjutan dengan hasil.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 9
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
Faktor kapasitas OMT pada IC (6,18) dan kolom blank (4,66) dengan nilai α adalah 1,33. Berbeda dengan faktor kapasitas MT templat pada IC dan kolom blank kelihatan berbeda, nilai k’ adalah 12,15 dan 7,04 dan nilai α adalah 1,73. Hal ini mengindikasikan bahwa afinitas spesifik pada IC adalah MT. Leakage Load, maximum load dan recovery cartridge Leakage load (LL) mempunyai rumus LL=cLVL/W MIP, dimana LL adalah leakage load (µgg–1), cL adalah konsentrasi substrat (µgmL–1), VL adalah leakage volume (mL) dari substrat, dan W MIP (g) adalah bobot MIPs kering yang dikemas dalam cartridge. Berdasarkan rumus tersebut diperoleh nilai LL MT pada NIC adalah 15,0 ug/g dan IC adalah 30,0 ug/g. Hal ini menginformasikan bahwa untuk memisahkan MT lebih bagus dengan menggunakan IC. Maximum load mempunyai rumus Lmax=csVs/W MIP, dimana cs adalah concentration dari tested substrate larutan eluasi, Vs adalah volume eluent. Berdasarkan rumus tersebut, maximum loads (Lmax) dari MT pada NIC adalah 22.4 µg/g
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
dan IC adalah 38.7 µg/g. Hal ini
Hal. 10
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
mengindikasikan bahwa nilai Lmax selalu lebih besar dari nilai LL, dengan kata lain leakage selalu terjadi sebelum adsorbsi kering tercapai. Selanjutnya dilakukan penelitian tentang recovery MT dan OMT pada IC dan NIC. Larutan metanol MT dan OMT (1.0 µgmL–1, 5mL) ditambahkan ke dalam ekstrak sampel (5 mL) dari S. Flavescens. Campuran di run dengan kecepatan 0,2 mL/menit. Pengisian MT dan OMT pada cartridge dielusi dengan 5,0 mL campuran MGAA91 dan dianalisis dengan MIMs-HPLC.
Recovery MT pada IC adalah 71,4% sedangkan OMT 57,3%. Hal ini menunjukkan recovery MT lebih mudah dilakukan dibandingkan OMT. Pengujian sampel extract S. Flavescens Sejumlah 5,0 mL extract
S. Flavescens di load ke dalam imprinted
cartridge dengan kecepatan 0,2 mL/menit dengan menggunakan larutan pembilas MW37 dan eluen MGAA91.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 11
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
Pada
kromatogram
a
menunjukkan
banyaknya
pengotor
yang
menandakan bahwa itu adalah ekstrak kasar dari extract S. Flavescens, sedangkan pembanding tidak banyak terlihat. Sehingga ketika ekstrak di load ke dalam cartridge dibilas dengan 25 mL MW37 tampak jelas perbedaannya antara ekstrak MT kasar dengan MT murni, karena banyak pengotor telah diremoved dari cartridge yang digunakan. Kesimpulan 1. MIMs dapat digunakan untuk solid-phase extraction (SPE) dan Hight Performance Liquid Chromatografi (HPLC) untuk memisahkan Matrin (MT). 2. Cartridge MISPE dan kolom MIMs-HPLC menunjukkan afinitas spesifik terhadap molekul templat Matrin (MT). 3. Pendekatan MISPE lebih stabil, keberulangan, teratur dan antikorosif dibanding kolom reverse-phase C18. 4. MISPE juga merupakan hal yang baru dalam pengembangan Obat Tradisional China. Saran dan komentar 1. Perlu optimasi penggunaan eluen metanol–asam asetat glasial (MGAA) untuk memisahkan Matrin (MT) dengan oksimatrin (OMT). 2. Perbandingan efektifitas dan efisiensi MISPE dengan kolom reversephase C18. perlu diteliti sehingga ada data ilmiah untuk memastikan kelebihan dan kekurangan kedua sistem.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 12
Abd. Malik 10/ 307253/ PFA/994
PUSTAKA Harborne, J.B., 1987. Metode Fitokimia. Terbitan kedua. Terjemahan Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Penerbit ITB; Bandung. Lai, J.P., et al. 2003. Preparative separation and determination of matrine from the Chinese medicinal plant Sophora flavescens Ait by molecularly imprinted solid-phase extraction. www. Technology-articles.org. 2010. Preparation of Molecularly Imprinted Membranes and Their Application Study of the Membrane Chromatography. Diakses Maret 2011. Lai,
J.P,. et al. 2007. Molecularly imprinted microspheres and nanospheres for di(2-ethylhexyl)phthalate prepared by precipitation polymerization. Jurnal Anal Bioanal Chem. 389(2):405-12.
www. Suite 101.com. Sophora Flavescens: An Asian Herb in the Spotlight for Fighting Cancer and Inflammation. Diakses Maret 2011.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Hal. 13
