Základní principy transgenoze rostlin a její využití pro produkci nových odrůd Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc. BC AV ČR, v.v.i. a PřF JU České Budějovice
Šlechtění rostlin v neolitu umělý výběr – na výsev používána semena z nejlepších rostlin na konci 17. st. (po poznání pohlavnosti rostlin) přibyla druhá metoda – křížení ve 20. st. pak mutační šlechtění, využití tkáňových kultur a nakonec genové inženýrství nástroje gen. inženýrství - molekulární mapování (umožňuje přesně sledovat přenos mol. znaku v zastoupení nepřesně sledovatelného znaku – např. odolnosti vůči houb. onemocnění) - transgenoze (vnášení klonovaných genů do rostlinného genomu)
Šlechtění rostlin na základě charakteru použité DNA lze rozčlenit genetické modifikace na několik typů: i) xenogenní modifikace – do rostl. genomu včleněna syntetická DNA ii) transgenní modifikace – do genomu včleněna DNA pocházející z různých často fylogeneticky velmi vzdálených druhů iii) intragenní modifikace – do genomu vložen gen pocházející ze stejného rostlinného druhu, ale ostatní sekvence (promotor, terminátor) pocházejí z druhů jiných, ale navzájem křižitelných iv) cisgenní modifikace – do genomu integrován gen (kódující sekvence včetně jejich nativních regul. sekvencí) ze stejného druhu nebo druhu křižitelného
Agrobacterium tumefaciens nepřímá metoda prostřednictvím bakterií rodu Agrobacterium přímá metoda prostřednictvím DNA 1) Bakterie Agrobacterium tumefaciens - několik druhů půdních bakterií indukuje morfogenetické změny rostlin (rody Agrobacterium, Rhizobium, Bradyrhizobium a Azorhizobium) - bakterie rodu Rhizobium, Bradyrhizobium a Azorhizobium přeměněné v bakteroidy se stávají trvalou součástí pletiv kořenových hlízek leguminózních rostlin - u rodu Agrobacterium však bylo prokázáno, že bakterie vnášejí své specifické geny až do rostlinného genomu
Agrobacterium tumefaciens - vnášené geny jsou lokalizovány na bakt. plazmidu nazývaném Ti (tumor inducing), přenášená část plazmidu se označuje jako T-DNA (transferred DNA)
Agrobacterium tumefaciens - T-DNA plazmidu Ti přináší do rostl. buněk: i) geny pro nové cesty biosyntézy auxinů a cytokininů (dochází tím k dediferenciaci rostl. buněk, takže transformovaná pletiva rostou jako nediferencované nádory - crown galls)
Agrobacterium tumefaciens ii) geny pro syntézu nádorově specifických látek – opinů případně agrocinopinů (ty slouží pro příslušný typ bakterií jako zdroj C, N případně P a energie; jsou vylučovány do okolních netransformovaných pletin a do půdy) - zákl. typy Ti plazmidů jsou oktopinový a nopalinový, dalšími pak leucinamopinový, sukcinamopinový a kukumopinový
Agrobacterium tumefaciens rod Agrobacterium má tyto druhy: i) A. tumefaciens (infikuje několik stovek převážně dvouděložných druhů rostlin) ii) A. rhizogenes iii) A. rubi (způsobuje cane galls na maliníku) iv) A. vitis (infikuje vinnou révu) v) A. radiobacter (nevirulentní, někdy za druh nepovažován) Prvním krokem zachycení buněk A. tumefaciens na rostl. buňkách je navázání bakterií prostřednictvím specifických bakteriálních receptorů typu vitronektinů. Ty jsou kódovány geny chvA, chvB, pscA, exoC a att umístěnými na bakt. chromosomu.
Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid má dva úseky nezbytné pro indukci nádorů: i) T-DNA (vstupuje do rostl. buněk, geny pro vlastní integraci do hostitelské DNA nemá) ii) úsek virulence (vir oblast; obsahuje geny vedoucí k přenosu T-DNA do rostl. buněk a její integraci do genomu rostliny) Vir oblast má délku 35 kb a je tvořena minimálně 8 operony – virA, virB, virC, virG, virD, virE, virF a virH, jež kódují zhruba 35 polypeptidů Přenos T-DNA do rostl. buněk indukují fenolické látky typu acetosyringonu (mj. acetovanilon, kys. sinapová, kys. lysergová, katechol, kys. ferulová). Tyto látky jsou produkovány poraněnými buňkami většiny dvouděložných rostlin, ne však buňkami většiny rostlin jednoděložných.
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens Přenos T-DNA začíná od pravé hraniční 25 bp sekvence, kde mezi 3. a 4. bází vznikne zlom v dolním řetězci T-DNA, a to činností VirD1-VirD2 endonukleázového komplexu. Do rostl. buňky přechází T-DNA v jednořetězcové formě (Tstrand) s navázanou molekulou VirD2 na 5` konci a asociovanými molekulami VirE2 po celé své délce (Tkomplex).
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens Současné znalosti o integraci T-DNA jsou spojeny do tohoto modelu: i) T-DNA je zbavena asociovaných proteinů a je konvertována do dvouřetězcové molekuly replikačními nástroji hostitelské buňky ii) proteiny reparace DSB (Ku70, Ku80 aj.) interagují s dvouřetězcovou DNA a asistují při jejím směrování k dvouřetězcovým zlomům hostitelského genomu iii) v tomto stádiu může zřejmě také docházet ke spojování několika molekul T-DNA vedoucí nakonec k mnohačetné inserci T-DNA iv) T-DNA nacházející se v místě DSB hostitelské buňky je spojena s rostl. genomem ligázovým reparačním komplexem
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens T-DNA plasmidu Ti - nopalinová z jediného úseku - oktopinová z levé a pravé části s meziúsekem, jenž neobsahuje žádné geny a vstupuje do rostl. genomu fakultativně
Agrobacterium tumefaciens - společné geny T-DNA nopalinových a oktopinových plazmidů Ti tvoří tzv. jádro (core) T-DNA - u oktopinových plazmidů je jádro tvořeno levým úsekem TDNA (TL-DNA) - geny očíslovány podle velikosti jimi kódované mRNA Gen 1 (iaaM) kóduje tryptofanmonooxygenázu pro první stupeň nové biosyntetické dráhy auxinů Gen 2 (iaaH) kóduje indolylacetamidhydrolázu pro druhý stupeň nové syntézy auxinů Gen 3 (ocs) kóduje oktopinsyntázu pro syntézu oktopinu z argininu a pyruvátu Gen 4 (ipt) kóduje izopentenyltransferázu pro první stupeň syntézy cytokininů Gen 5 kóduje produkt účastnící se nové syntézy auxinů
Agrobacterium tumefaciens Gen 6a kóduje transportní protein pro sekreci opinů Gen 6b kóduje protein účastnící se nové syntézy cytokininů Gen 7 jeho funkce zatím neznámá Nopalinová T-DNA má vlevo od core genů 6 genů (a, b, c, d, e, acs), kde jenom o posledním je známo, že kóduje syntézu agrocinopinů, funkce ostatních je neznámá. Pravá část oktopinových plasmidů (TR-DNA) obsahuje 5 genů (0` až 4`). Geny 1` a 2` se podílejí na syntéze manopinu, 0` na syntéze agropinu, funkce ostatních je zatím neznámá. T-DNA je vymezena vysoce konzervativními přímými repeticemi o délce 25-28 bp, jež se nazývají pravá (BR) a levá hranice (BL).
Agrobacterium rhizogenes 2) Bakterie Agribacterium rhizogenes - vnášené geny jsou lokalizovány na bakt. plazmidu nazývaném Ri (root inducing) - transformovaná pletiva rostou jako kořeny (hairy roots) - základními typy Ri plazmidů jsou manopinový a agropinový
Agrobacterium rhizogenes
- hairy roots jsou schopny proliferace in vitro na médiu bez růstových látek - z obou typů transformovaných pletiv (crown galls, hairy roots) mohou diferencovat transformované nebo i netransformované výhony
Agrobacterium rhizogenes - k diferenciaci dochází u hairy roots nikoliv z kořenových špiček, ale ze starší části kořene - téměř všechny kmeny A. rhizogenes mají 3 komponenty Ri plazmidu: i) malý (Mr~90 MD) s geny pro utilizaci opinů ii) velký (Mr~150 MD) s dalšími geny pro využití opinů a pro využití agrocinopinů iii) kointegrovaný vzniklý spojením předcházejících - T-DNA manopinových plazmidů je tvořena jedním úsekem, agropinových dvěma (TL a TR) úseky oddělených segmentem, který do rostlinných buněk nevstupuje - geny na TL-DNA: celkem asi 18, z nichž 4 (rolA, rolB, rolC, rolD) podrobně prostudovány – působí zvýšení senzitivity k auxinům
Agrobacterium rhizogenes
- geny na TR-DNA: nejdůležitější jsou geny pro syntézu auxinů, homologní s geny 1 (iaaM) a 2 (iaaH) v T-DNA A. tumefaciens, a geny pro syntézu agropinu a nedávno objeven analog genu rolB z TL-DNA
Vektory Pro využití bakterií Agrobacterium jako vektorů transgenů je třeba odstranit původní geny a místo nich (tj. mezi hraniční sekvence T-DNA) vložit geny, které chceme do rostl. genomu integrovat. A) Intermediární (kointegrativní) vektory - intermediární vektor je malý plazmid s krátkými úseky s levou a pravou hraniční sekvencí, mezi nimiž jen vložen zájmový gen a gen selekční - je schopen replikace v E. coli, nikoliv však v agrobakteriu - po vnesení do agrobakteria (transformací nebo konjugací) se trvale udrží jen v buňkách, ve kterých došlo k rekombinaci mezi homologními sekvencemi Ti plazmidu a intermediárního vektoru
Vektory
Vektory
Vektory B) Binární vektory - jejich konstrukce založena na skutečnosti, že schopnost indukovat nádor má i Ti plazmid, který je rozdělen na dva menší: i) jeden obsahuje úsek virulence, ale nikoliv T-DNA, a počátek replikace pro agrobakterium (Ti plazmid zbavený T-DNA) ii) druhý obsahuje T-DNA a počátek replikace pro agrobakterium (vektorový plazmid); má vhodná restrikční místa pro inzerci cizorodé DNA - příkladem kmene A. tumefaciens nesoucí Ti plazmid bez TDNA je kmen LBA4404, jenž obsahuje plazmid zvaný pAL4404, odvozený od Ti plazmidu pTiAch5 delecí TDNA úseku
Vektory
Vektory - jedním z prvních binárních vektorů byl v r. 1984 pBin19, který byl v r. 1987 vylepšen doplněním o reportérový gen za vzniku pBI121 - tyto dva vektory a jejich deriváty jsou stále nejpopulárnější (v letech 2000-2007 byly použity v pracech zabývajících se transformací vyšších rostlin ve 40 % případů)
Vektory
Vektory - za posledních 20 let byla vyvinuta řada systémů binárních vektorů, ovšem díky omezení velikosti vkládané DNA nesou vedle selekčního genu jen 1-2 geny zájmové - toto omezení je dáno monocistronickou expresí eukaryotních ORF, což vede ke značné velikosti vkládané DNA a komplikuje klonovací postupy - v r. 2005 byl publikován modulární vektorový systém pSAT, který umožňuje vložení až 7 ORF do jedné T-DNA a jež je založen na tzv. homing (naváděcích) endonukleázách; ty rozpoznávají velmi raritní sekvence (např. I-SceI 18 bázovou sekvenci, která se teor. vyskytuje každých 7 x 1010 bp) - binární vektor obsahuje 6 různých raritních sekvencí a přes různé expresní kazety pSAT jsou do nich bez komplikací vkládány jednotlivé zájmové geny
Vektory
Vektory C) Superbinární vektory - vektory, které vedle T-DNA obsahují ještě některé z genů vir oblasti - využívá se poznatku, že některé z produktů vir genů vykazují dávkový efekt, tj. čím více je těchto produktů v buňce přítomno, tím větší je účinnost transformace - tyto vektory hrály v pol. 90. let stěžejní úlohu při rozšiřování spektra druhů transformovatelných agrobakteriem o obiloviny
Nepřímá transformace používá se agrobakterium s vhodným binárním (superbinárním) vektorem z akceptorové rostliny se používají různé orgány resp. pletiva: listové disky, děložní listy, stonky explantát se kultivuje s bakteriemi agrobakteria v řádech minut až dní a pak se přenese na médium obsahující selekční agens, antibiotikum pro eliminaci agrobakteria a růstové látky (RL) v poměru vedoucím k organogenezi (vzniku prýtů) na selekčním médiu bez RL pak prýty zakoření a obvykle ponesou stabilně integrovaný transgen (ověření PCR a Southernovou hybridizací)
Nepřímá transformace
Nepřímá transformace při transientní (dočasné) in planta expresi dojde k případné expresi v rostl. buňce během několika hodin až dní a záhy odezní – ověřování funkčnosti konstruktů, rychlá jednorázová produkce velkého množství produktu jedna z metod pro indukci transientní exprese využívá agrobakterium – agroinfiltrace - tekutá kultura agrobakteria s binárním vektorem se vakuově nebo pomocí inj. stříkačky infiltruje do listu
Nepřímá transformace další metody pro transientní expresi: - mikroprojektily zlata nebo wolframu o velikosti zhruba 1 μm s navázanou plazmidovou DNA; vnášejí se buď ručním přístrojem Helios Gene Gun přímo na živé rostlině nebo do oddělených explantátů ve vakuové komoře (PDS-1000 He); limitující je především vysoká vstupní investice
Nepřímá transformace další metody pro transientní expresi: - virové vektory, v nichž je zájmový gen vložen do virového genomu; obzvláště účinný je sytém magnifection, ve kterém virové replikony nesoucí zájmový gen jsou naklonovány do T-DNA a do rostliny jsou vnášeny již zmíněnou agroinfiltrací; během množení viru je zájmový gen exprimován spolu s virovými geny, což vede k masivní produkci požadovaného produktu
Přímá transformace různé metody začaly být vyvíjeny jako alternativa k agrobakteriové transgenozi pro druhy, u níž Agrobacterium nefungovalo jako první vznikla metoda transformace protoplastů (PP) - omezeno na druhy se zvládnutou regenerací PP - DNA přijímána endocytózou, k její stimulaci lze použít buď PEG nebo elektroporaci - DNA lze do jader PP vložit mikroinjekcemi biolistika (biologická balistika) - jde o bombardování buněk nebo pletiv mikropartikulemi (~1 μm) zlata nebo wolframu, na nichž je navázaná plazmidová DNA
Přímá transformace - jen 7-10 % mikroprojektilů pronikne alespoň do epidermis, ale je třeba proniknout až do buněk mezofylu; pokud se tak stane, jen u 5 % z těchto buněk se projektil dostane až do jádra, ale většina (95-98 %) těchto buněk po zásahu stejně odumírá - pokud se mikroprojektil s DNA dostane až do jádra a buňka zásah přežije, je frekvence integrece vnesené DNA do jaderné DNA (alespoň) u tabáku značně vysoká (u tabáku 10-100 integrací na jeden výstřel - 0,5 mg Au s 0,8 μg DNA) vsakování roztoku DNA dehydratovanými rostl. pletivy - metoda stále studována a optimalizována (není pro rutinní transgenozi)
Přímá transformace přenos zprostředkovaný liposomy (lipofekce) - uvnitř liposomů roztok DNA, aplikováno na zralá pylová zrna, lze použít na PP - úspěšných prací poskrovnu přenos zprostředkovaný alginátovými mikrokapičkami - umožňuje přenos velmi velkých fragmentů DNA do PP, a to navíc s řádově větší transformační účinností než PEG
Přímá transformace technologie transformace pylu i) biolistika jednobuněčného pylu - jednobuněčné mikrospory jsou bombardovány v G1 fázi, po dozrání mikrospor je pyl použit k opylení in vivo a semena testována na selekčním médiu
Přímá transformace ii) biolistika mikrospor nebo nezralých pylových zrn reprogramovaných stresem k tvorbě sporofytu - embryogenní mikrospory či nezralá pylová zrna jsou transformována a vzniklé embryogenní buňky dávají vznik haploidnímu embryu a rostlinám (diploidizace spontánně či chem. indukována)
Cisgenoze Cisgenoze je definována jako přenos genů s jejich nativními regulačními sekvencemi metodami genového inženýrství z druhu přirozeně křižitelného nebo z druhu téhož. Jde též o vytvoření nových transformačních protokolů bez použití (bakteriálních) selekčních markerů – u generativně množených druhů kotransformací, u vegetativně množených druhů odstranitelnými selekčními geny nebo použitím vektorů bez markerových genů (marker-gene-free vectors). Díky tomu by na takto geneticky upravené rostliny nemuselo být nahlíženo jako na GMO, ale jako na klasickými metodami vyšlechtěné odrůdy se všemi legislativními dopady a s příznivým míněním veřejnosti.
Cisgenoze V praxi bude cisgenoze vhodná zvláště pro rezistentní šlechtění vegetativně množených vysoce heterozygotních plodin (brambory, jabloně), kde zdrojem genů rezistence jsou příbuzné plané druhy.
Využití GM plodin „GM crops are not the problem, but part of the solution to sustainably feeding 9 billion people.“ (Professor Giles Oldroyd, Senior Plant Scientist, John Innes Centre, UK) Do roku 2030 je třeba celosvětově zvýšit výrobu potravin nejméně o 50 %, což se nedá zvládnout pouze klasickými šlechtitelskými postupy. Genetické modifikace budou tedy muset být jednou z technologií, jak se s tímto požadavkem úspěšně vyrovnat.
Využití GM plodin Přes legislativní problémy v určitých částech světa plocha GM plodin stále roste, protože přinášejí vyšší zisk pěstitelům a vyšší užitnou hodnotu spotřebitelům.
Využití GM plodin Drtivá většina v současnosti v praxi využívaných GM plodin nese geny tolerance k herbicidům (HT) nebo geny pro tvorbu δ-endotoxinu z B. thuringiensis (BT).
Využití GM plodin Z hlediska plodin vede sója následovaná kukuřicí a bavlníkem.
Využití GM plodin Podíl nejrozšířenějších GM plodin na jejich celkové světové produkci:
Využití GM plodin Přehled zemí s povoleným polním pěstováním viz obr.:
Využití GM plodin Přicházející GM plodiny: i) kukuřice s genem pro fytázu (Čína) – podstatná část fosforu ve zralých obilovinách a olejninách je obsažena ve formě fytátu; vzhledem k tomu, že monogastrická zvířata mají málo střevní fytázy, je jejich využití fosforu z obilovin a olejnin omezené a fytát, který není zvířaty využit, je vylučován v hnoji a způsobuje problémy se znečištěním prostředí; kyselina fytová dále může snížit biologickou dostupnost dalších prvků – Ca a Zn ii) kukuřice se sníženým obsahem fytátu v semeni (USA, Pioneer Hi-Bred International) iii) Bt rýže se zvýšenou rezistencí vůči zavíječům (Čína) iv) „SmartStax“ kukuřice (Monsanto, 2010) – nese 8 různých transgenů (2 pro rezistenci k glyfosátu resp. glufosinátu) a 6 genů BT směrovaných proti různým živočišným škůdcům
Využití GM plodin v) kukuřice se zvýšenou odolností vůči suchu (Monsanto); očekávané tržní zavedení 2012 vi) geny zlepšující nutriční vlastnosti plodin – sója se zvýšeným obsahem 3-ω mastné kyseliny - kyseliny stearidonové (Monsanto), která je stabilnější než rybí tuk a v lidském či zvířecím těle je konvertována na polynenasycené 3-ω mastné kyseliny s příznivým účinkem na vaskulární systém vii) „zlatá rýže 2“ s velmi vysokým obsahem β-karoténu bude zavedena 2012
Využití GM plodin Příklad vývoje GM plodin firmou Monsanto
Využití GM plodin
Využití GM plodin
Využití GM plodin
Využití GM plodin
Využití GM plodin Perspektivní GM plodiny: i) rajčata s genem Bs2 z papriky pro rezistenci vůči Xanthomonas sp. v polních podmínkách ii) rajčata rezistentní vůči Phytophtora infestans s geny rezistence z planých druhů rajčat iii) rajčata se zvýšenou odolností k bakteriálním chorobám (vč. Ralstonia solanacearum) s genem efr z arabidopsis iv) banánovník je nyní devastován chorobou sigatoga způsobovanou houbou Mycosphaerella fijiensis – téměř veškerá světová produkce banánů je tvořena extrémně citlivou odrůdou Cavendish; žádný GM rezistentní banánovník ještě není hotov, ale několik nadějných postupů je testováno
Využití GM plodin Perspektivní GM plodiny: v) rajčata s výrazně vyšším (3x) obsahem antioxidantů (antokyanů a flavonolů) díky expresi dvou genů pro transkripční faktory z hledíku – (purple tomato)
Využití GM plodin Perspektivní GM plodiny: vi) zvýšení účinnosti příjmu N rostlinami k omezení hnojení a znečišťování povrchových i spodních vod – alaninaminotransferasa je slibným kandidátem; v delším horizontu je žádoucí vytvořit GM plodin se schopností vytvořit symbiotický vztah s dusík fixujícími bakteriemi leguminóz vii) zavedení rezistence vůči rzi trávní (Puccinia graminis) do pšenice; geny rezistence jsou dostupné v planých druzích, ze kterých budou klonovány a vneseny do kultivarů pšenice
Důvody využití GM plodin umožní nutné zvýšení světové produkce potravin přes pokles rozlohy obdělávatelné půdy umožní produkci potravin na půdách dosud pro zemědělskou produkci nevhodných (sucho, zasolení) redukují environmentální dopady rostlinné zemědělské výroby snižováním počtu pesticidních ošetření a tím snižováním potřeby fosilních paliv na jednotku produkce redukují spotřebu paliv díky aplikaci úspornějších metod obdělávání půdy zlepšují nutriční hodnotu potravin a krmiv zlepšují vlastnosti surovin pro průmyslové využití umožní zvýšit produkci rostl. hmoty jakožto obnovitelného zdroje energie
