POTENCIÁLISAN BIOLÓGIAILAG AKTÍV MAKROCIKLUSOK SZINTÉZISE, ANALITIKAI ALKALMAZÁSUK ÉS KOORDINÁCIÓS KÉMIAI TULAJDONSÁGUK VIZSGÁLATA
Doktori (PhD) értekezés Iványi Tímea
Debreceni Egyetem Természettudományi Kar Debrecen, 2005
Ezen értekezést a Debreceni Egyetem TTK kémiai Doktori Iskola koordinációs kémiai programja keretében készítettem a Debreceni Egyetem TTK doktori (PhD) fokozatának elnyerése céljából. Debrecen, 2005. ……………
Iványi Tímea
Tanúsítom, hogy Iványi Tímea doktorjelölt 1999-2003 között a fent megnevezett Doktori Iskola koordinációs kémia programja keretében irányításommal végezte munkáját. Az értekezésben foglalt eredményekhez a jelölt önálló alkotó tevékenységével meghatározóan hozzájárult. Az értekezés elfogadását javasolom. Debrecen, 2005. ….................
Dr. Lázár István egyetemi docens
KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS szinte köszönetemet szeretném kifejezni témavezet mnek, Dr. Lázár István egyetemi docensnek a munkám során nyújtott hasznos tanácsaiért, sokoldalú segítségéért, türelméért és a zavartalan munkavégzést biztosító baráti légkör megteremtéséért. Hálával tartozom Dr. Emri József egyetemi docensnek az évek során nyújtott szakmai segítségeiért és nem csak szakmai jelleg , de sokkal inkább baráti jó tanácsaiért. Köszönöm Dr. Király Róbert egyetemi docensnek, Rózsa Béla vegyésztechnikusnak a potenciometriás mérések, Dr. Török János tanársegédnek a Maldi-TOF mérések elkészítését, és a kiértékelésben nyújtott szakmai segítségét, Dr. Bényei Attila krisztallográfusnak a röntgendiffrakciós szerkezet meghatározásban, Agárdiné Antek Évának az IR spektrumok felvételében és Gálné Remenyik Juditnak a fajlagos forgatóképesség mérések elkészítésében nyújtott segítségét. Köszönöm a VRIJE UNIVERSITEIT BRUSSEL-FABI minden tagjának, hogy a kapilláris elektroforetikus mérések kivitelezését lehet vé tették, nélkülözhetetlen szakmai tanácsokkal láttak el. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm a D505-ös “Makrociklusos-labor” minden egykori és jelenlegi tagjának, a laborban dolgozóknak, hogy munkám elvégzésében mindvégig támogattak, lelkesítettek. Hálával tartozom családomnak.
A DOLGOZATBAN HASZNÁLT RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE Acetát Bu Bn CE CEC CD Ciklén DMF DMPS DMSA DOTA DOTAGly DOTATOC DOTP DTPA EDTA EEDQ Et HEDTA HP-DO3A HPLC i-Pr2NEt Kryptofix-22 K22-R-AlaGly K22-R,R-di(AlaGly) K22-di(AlaGly) Me MeCN MeOH NODASA NOTA NOTAGly NOTMP NOTPME ODDA ODDAGly ODDM PIDA THF TMS Tritil Ts TSP 18C6 18C6H4
:karboximetil:butil:benzil:kapilláris elektroforézis :kapilláris elektrokromatográfia :ciklodextrin :1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán :dimetil-formamid :dimerkaptopropán-szulfonsav :dimerkapto-borostyánk sav :1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraacetát :1,4,7,10-tetraaza-1,4,7,10-tetrakisz(acetil-amino-ecetsav) :DOTA-D-Phe-Tyr-Octreotide :1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetrafoszfonát :dietilén-triamin-pentaecetsav :etilén-diamin-tetraecetsav :N-etoxikarbonil-2-etoxi-1,2-dihidrokinolin :etil:N’-(2-hidroxi-etil)-etilén-diamin-N,N,N’-triecetsav :10-(2-hidroxi-propil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7-triacetát :nagynyomású folyadékkromatográfia :N,N-diizopropil-etil-amin :1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán :[2R-2-(1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadec-7-il)-propionilamino]- ecetsav :1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(2R-2propionil-amino-ecetsav) :1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(2propionil-amino-ecetsav) :metil:acetonitril :metanol :1,4,7-triazaciklononán-1-szukcinát-4,7-diacetát :1,4,7-triaza-ciklononán-1,4,7-triacetát :1,4,7-triaza-ciklononán-1,4,7-trisz(acetil-amino-ecetsav) :1,4,7-trisz(metilén-foszfinát-monometil)-1,4,7-triaza-ciklononán :1,4,7-trisz(metilén-foszfonát-monoetil)- 1,4,7-triaza-ciklononán :1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-diacetát :1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(acetilamino-ecetsav) :1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(malonát) :piperazin-N,N’-diacetát :tetrahidrofurán :tetrametil-szilán :trifenil-metil:p-toluol-szulfonil:trimetilszilil-propánszulfonsav :18-korona-6 :18-korona-6-tetrakarboxilát
TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Orvosdiagnosztikai és terápiás alkalmazások 2.1.1. NMR tomográfia 2.1.2. Radioaktív izotópokkal jelzett diagnosztikai szerek 2.1.3. Intracelluláris fémionkoncentráció meghatározása 2.1.4. Fémmérgezések terápiás kezelése 2.1.5. Fiziológiás körülmények között hidrolizáló észterek alkalmazása 2.2. Enantiomer szeparáció – analitikai eljárások 2.2.1. Királis szelektorok 2.2.2. Makrociklus komplexképz kkel módosított szilikagél állófázisok 3. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 3.1. Hidrolizáló oldalláncot tartalmazó észterszármazékok el állítása 3.2. Az el állított makrociklusos-észterszármazékok hidrolízisének vizsgálata 3.3. Oldalláncban peptidkötést tartalmazó makrociklusos molekulák el állítása 3.3.1. Peptidkötést tartalmazó oldalláncok el állítása 3.3.2. N-(2-bróm-acetil-amino)-ecetsav oldalláncot tartalmazó származékok el állítása 3.3.3. N-(2-propionil-amino)-ecetsav oldalláncot tartalmazó diaza-koronaéter származék el állítása 3.4. Oldalláncban peptidkötést tartalmazó makrociklusos molekulák komplexképz tulajdonságainak vizsgálata 3.5. Oldalláncban peptidkötést tartalmazó származékok analitikai alkalmazhatóságának vizsgálata 3.5.1. Királis diaza-koronaéter származékok alkalmazhatósága a kapilláris elektroforézis technikában 3.5.2. Akirális diaza-koronaéter származék, mint módosítószer a mikroemulziós elektrokinetikus kromatográfiában (MEEKC) 3.5.3. Királis diaza-koronaéter származék felhasználása szilikagél állófázisok módosítására, a módosított állófázis vizsgálata 4. KÍSÉRLETI RÉSZ 5. ÖSSZEFOGLALÁS 6. SUMMARY 7. IRODALMI HIVATKOZÁSOK 8. Függelékek
1 3 3 3 5 6 9 13 15 16 20 25 25 35 44 44 46 47 56 66 66 76 77 79 98 101 104 111
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
1. BEVEZETÉS A makrociklusos vegyületek, ezen belül a poliaza-, poliaza-polioxacikloalkánok az elmúlt néhány évtizedben jelent s vegyületcsaláddá fejl dtek a laboratóriumi alapkutatások, az alkalmazott kutatások és a gyakorlati alkalmazások tekintetében egyaránt. A makrociklusos effektusnak köszönhet en kimagasló komplexképz tulajdonsággal rendelkez vegyületek1-5 felhasználása önmagukban is igen széleskör , a nitrogén és foszfor donoratomot tartalmazó makrociklusok esetében pedig komplexképzésre alkalmas oldalláncok segítségével a vegyületek koordinációs tulajdonsága tovább növelhet 6. Sok esetben a megnövekedett stabilitás az egyes fémionokkal szemben mutatott szelektivitás mértékének csökkenését eredményezi, ami a kutatások irányvonalát újabb és újabb származékok el állítása felé irányítja. Sokrét felhasználási területük között szerepel az él szervezetben történ szelektív fémionmegkötés és transzportálás7-9, a létfontosságú fémionok meghatározására alkalmas fluoreszcens markerek el állítása10-15, az intracelluláris fémionkoncentráció meghatározása16-21, a szövetek állapotának ellen rzésére szolgáló MRI kontrasztanyagok22-31, valamint radioaktív izotópokkal jelzett diagnosztikai szerek szintézise32-37, és egyes fémmérgezések kezelése38,39. A fémionok mellett kisebb molekulákkal host-guest komplex kialakítására is alkalmasak, ezen alapulnak azok a fémionok, valamint gyógyszerhatóanyagok min ségi és mennyiségi meghatározására szolgáló kromatográfiás analitikai módszerek, amelyek makrociklusos molekulákat használnak szelektorként.40-48 A Debreceni Egyetem Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszékén közel 15 éve folynak kutatások új, kimagaslóan nagy fémion-szelektivitással bíró, a gyakorlatban több területen is alkalmazható makrociklusos vegyületek el állítására. Ennek a munkának a folytatásaként olyan új makrociklusos származékok el állítását, koordinációs kémiai és kromatográfiás vizsgálatát t ztük ki célul, amelyek specifikus komplexképz tulajdonságuk révén magukban hordozzák a gyakorlati alkalmazás lehet ségét akár biokémiai, orvosdiagnosztikai és analitikai téren. Munkánkat részben az motiválta, hogy a megnövekedett ipari tevékenységek és az egyre gyakrabban bekövetkez ipari katasztrófák eredményeként a toxikus fémionok él szervezetben történ felhalmozódása egyre nagyobb veszélyt jelent. Szükség van tehát olyan terápiás szerekre, amelyek az él sejtekbe bejutva a toxikus fémionok szervezetb l történ kiürülését el segítik, meggyorsítják. A kiváló és specifikus komplexképz tulajdonsággal rendelkez makrociklusos vegyületek ilyen jelleg felhasználása korlátozott, ezért szükségszer nek láttuk olyan származékaik kifejlesztését és vizsgálatát, amelyek alkalmasak lehetnek a mérgez fémionok szervezetb l történ , szelektív eltávolítására. Munkánk további fázisában célunk volt olyan, amid oldalláncot tartalmazó, makrociklusos származékok el állítása, amelyek az orvosdiagnosztikai és terápiás területek mellett akár analitikai téren is 1
1. Bevezetés
alkalmazásba kerülhetnek. Céljaink között szerepelt, hogy az el állítani kívánt amidok közül, a koronaéterek és azok származékainak gyógyszerhatóanyagok, vegyipari alapanyagok tisztaság- és szerkezetvizsgálatára, különböz izomerjeinek elválasztására alkalmas analitikai felhasználhatósága alapján a Kryptofix-22 származékok analitikai területen (CE, HPLC) történ alkalmazhatóságát is tanulmányozzuk. Kutatási munkánk eredményei két egyetemen való közös munkaként jöttek létre. A vegyületek el állítását, tisztaságés szerkezetvizsgálatát (vékonyrétegkromatográfia, oszlopkromatográfia, NMR, IR, röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálat, Maldi-TOF, forgatóképesség mérés, elemanalízis), komplexkémiai vizsgálatát (pH-potenciometria, NMR-titrálás), az el állított észterek hidrolitikus tulajdonságának meghatározását, valamint a vegyületek konformációs tulajdonságainak molekulamechanikai és szemiempirikus kvantumkémiai számításokkal és modellezéssel történ tanulmányozását egyetemünkön, a Debreceni Egyetemen végeztük. A munkánk második fázisában el állított vegyületek kromatográfiás alkalmazhatóságát a kapilláris elektroforetikus méréseket Brüsszelben, a Vrije Universiteit Brussel-FABI tanszékén hajtottuk végre.
2
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Orvosdiagnosztikai és terápiás alkalmazások A poliaza- és poliaza-polioxa-makrociklusos komplexképz k - amelyek dolgozatban el forduló legfontosabb szubsztituálatlan képvisel it az 1. ábrán tüntettük fel (3-6) - felhasználása kiváló komplexképz tulajdonságából ered en igen széleskör . Az orvosdiagnosztika számos területén el fordulnak, pl. gammavagy béta-sugárzó radioaktív izotópok szövetspecifikus molekulákhoz kötött komplexeiben, lumineszcens komplexekben, paramágneses kontrasztanyagokban, de intracelluláris fémionkoncentráció meghatározására és toxikus fémionok szervezetb l történ eltávolítására is megfelel nek bizonyultak. A poliazamakrociklusok kémiai reakcióinak és NMR spektrumának modellezésére, valamint újabban komplexképz ként is alkalmazott piperazin és homopiperazin származékok (1, 2) pedig a gyógyszergyártásban kerültek eddig felhasználásra.49,50
HN
NH
HN
NH
n
N H
n=0 1
3
n=1 2
H
N
N
N H
H
N H
O
O
HN
NH O
O n
4
n=0 5 n=1 6
1. ábra Gy r s diaminok, valamint poliaza- és poliaza-polioxa-cikloalkánok szerkezete
2.1.1. NMR tomográfia Az MRI (magnetic resonance imaging = mágneses rezonancia tomográfia) a szervezetben lév H-atommagok által visszasugárzott, összetett rádiófrekvenciás jelet jeleníti meg képi formában, ezáltal alkalmazható az emberi test tanulmányozására, a rákos elváltozások kimutatására. Az eljárás kontrasztanyag nélkül is jó felbontású képet ad a különféle lágy szövetekr l, azonban a paramágneses makrociklusos kontrasztanyagok a lokális mágneses tér megváltoztatásával a közvetlen molekuláris környezetükben lév vízmolekulák protonjainak relaxációs sebességét megnövelik, ezáltal azok zavaró hatását az MRI képalkotásban lecsökkentik, és jobb felbontású felvételt eredményeznek. A gyakorlatban jelenleg a legnagyobb mágneses momentummal rendelkez Gd(III)ionokat tartalmazó kontrasztanyagokat használják, amelyekben a gadolíniumion valamilyen nyíltláncú (DTPA = Magnevist®) vagy gy r s komplexképz vel 3
2. Irodalmi áttekintés
(DOTA = Dotarem ®, HP-DO3A = ProHance®) alkotott megfelel termodinamikai és kinetikai stabilitással rendelkez és szigorú toxicitási feltételeknek eleget tev komplexe formájában található meg51-53 (2. ábra). 2O
O N
O
OH2
O
Gd N
O
O
O
N O
N N Gd N N
O O
O
-
O OH 2
O
O O
O O
O
[Gd(DOTA)]- (8)
[Gd(DTPA)]2- (7)
O
O OH 2 N N Gd N N
O O
O
[Gd(HP-DO3A)] (9)
2. ábra MRI kontrasztanyagként alkalmazott nyíltláncú DTPA és ciklénszármazékok gadolíniumkomplexeinek szerkezete
Az MRI kontrasztanyagok tökéletesítése jelenleg is a kutatások figyelmének középpontjában áll. A fejlesztések során el állítottak már olyan, foszfonát és karboxilát funkciós csoportokat tartalmazó, ciklén-alapú gadolínium-komplexeket, amelyek negatív töltés csoportjaikon keresztül alkalmasak poliaminosavakkal (pl. polilizin, poliornitin, poliarginin) történ kölcsönhatás kialakítására azok pozitív töltés aminocsoportjain keresztül (3. ábra).28 O
O O P O O OH
2
O O
N N Gd N N O (10)
N R O
R = -CH2-PO3H2 -CH2-COOH -H
O
3. ábra MRI kontrasztanyagként kifejlesztett vegyes funkciós csoportokat tartalmazó makrociklusos gadolínium-komplex szerkezete
A pozitívan töltött poliaminosavak szelektíven köt dnek az egészséges sejtekhez képest nagyobb negatív töltéssel rendelkez tumoros sejtek felületéhez (pl. agytumor, melanoma, rákos tüd sejtek). In vitro vérszérumban végzett kísérletek alapján, a szervezetbe juttatott poliaminosavak felhalmozódásának nyomon követésére, ezáltal a tumoros sejtek kimutatására a 10 származékot alkalmas ágensnek találták.
4
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
Egyre nagyobb érdekl dés övezi az MRI kontrasztanyagok új fajtáját, a CEST (chemical exchange saturation transfer = mágneses telítettség kémiai csere útján történ átvitele) anyagokat, amelyek OH vagy/és NH protonjának rezonancia frekvenciáján szelektív rádiófrekvenciás gerjesztést alkalmazva, a környez vízmolekulákkal protoncserére képesek, lecsökkentve azok jelintenzitását, és ezáltal zavaró hatását a képalkotásban. A kémiai csere sebességét a környezeti tulajdonságok, mint pH, h mérséklet és ion-koncentráció egyaránt befolyásolják. Minél nagyobb a cserélhet protont tartalmazó csoportok és a környez vízmolekulák protonjainak kémiai eltolódása közötti különbség, annál nagyobb CEST hatás érhet el. Mivel bizonyos lantanoida-ionok (pl. Dy3+, Eu3+, Yb3+) a környezetükben lév protonok nagymérték hiperfinom eltolódását eredményezik, Aime és társai Ln3+-ionok megkötésére alkalmas, amid oldallánccal rendelkez komplexképz vegyületet állítottak el , amely ígéretes CEST-kontrasztanyagként kerülhet alkalmazásba.54,55 A vegyület etil-észterének Eu(III)-komplexét Zhang és társai vizsgálták (11, 4. ábra).56,57 OR O N
O N
O
N
Ln
O OH2 N N
OR
N O
R = H, Et
N
RO O
O
N O
(11)
OR
4. ábra CEST kontrasztanyagként alkalmas DOTA-amid származék szerkezete
2.1.2. Radioaktív izotópokkal jelzett diagnosztikai szerek Radioaktív izotópokat tartalmazó komplexeket alkalmaznak tumoros sejtek, szövetek kimutatására. Az eljárás lényege, hogy a tumor-antigén ellen termelt ellenanyag klónozása után el állított monoklonális antitestet kinetikailag inert, β vagy γ-sugárzó radioaktív izotópot tartalmazó vegyülettel jelölik meg. Az így jelzett, biológiailag aktív, szövetspecifikus molekulák a szervezetben az adott fajta antigént tartalmazó tumorhoz lokalizálódnak. A radioaktív 113I izotóppal jelzett szomatosztatin (=bizonyos szervek normál szabályozását gátló peptid, melynek receptora specifikusan a rákos sejteknél jelenik meg) analóg bioaktív peptidek32, illetve a nyíltláncú DTPA peptidszármazékainak sikeres gyakorlati alkalmazását 5
2. Irodalmi áttekintés
követ en, hasonló peptidekkel módosított DOTA származékokat állítottak el (DOTATOC (12), 5. ábra), és alkalmaztak már klinikai szinten is33. A makrociklusos vegyületek el nye a tumoros sejtek jelzésére használt radioaktív izotópok (111In, 90Y) stabilabb komplexben tartása. Az 1,4,7-triazaciklononán-1szukcinát-4,7-diacetát származék (NODASA (13)) három karboxilát csoportján keresztül foglalja komplexbe a radioaktív 67Ga-ot, β-karboxilát csoportjánál fogva pedig alkalmas peptidkötés kialakítására, akár gyakorlatban alkalmazott szomatosztatin analógok kapcsolására.34 O
HO O
O
OH
N
N
N
N
HO
O N
D-Phen
Cys
Tyr
D-Trp
Thr(ol)
Cys
Thr
Lys
O
O OH N
* OH O
N N
OH
HO O NODASA (13)
DOTATOC (12) szomatosztatin analóg
5. ábra Tumoros sejtek jelzésére el állított DOTATOC és NODASA makrociklusok szerkezete, *: biológiailag aktív peptidek kapcsolódási helye
2.1.3. Intracelluláris fémionkoncentráció meghatározása Az emberi test diagnosztikai célú vizsgálatának egyik fontos lépése a szervezet számára nélkülözhetetlen kationok szabad mennyiségének gyors és lehet ség szerint roncsolásmentes eljárásokkal történ in vivo meghatározása, amely eljárás információt adhat a szervezet egészségi állapotáról, a fémionok hiánya okozta betegségek meglétér l. 31
P NMR-es detektálás A stabilitási állandók és a detektálhatóság szempontjából az 1,4,7-triaza-ciklononán metilén-foszfonát (NOTPME (14))16,17 illetve metilénfoszfinát (NOTMP (15))21 oldalláncokat tartalmazó származékai, a Mg2+- és Zn2+ionok intracelluláris koncentrációjának meghatározására alkalmas vegyületeknek bizonyultak (6. ábra). Az intracelluláris koncentráció meghatározása 31P NMR nyomkövetés alapján történhet, ugyanis a szervezetbe jutott ligandum, valamint a részvételével létrejöv fém-ligandum komplex az él sejtekben el forduló természetes foszfortartalmú vegyületek (inorganikus foszfát, ATP, AMP, cAMP) jellemz kémiai eltolódási tartományán kívül, egymástól jól elkülönül jelet ad. A 6
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
jel alatti területek arányából, a stabilitási állandó és a pH ismeretében a sejten belüli “szabad” fémionkoncentráció kiszámítható. Az NOTPME-b l (14), amely csak Mg2+-ion jelenlétében képes bejutni az emberi vörösvérsejtbe, el állítottak több olyan származékot (els sorban észtereket) is, amelyek fiziológiás körülmények között könnyen hidrolizáló oldalláncot tartalmaznak, és feltehet leg a szervezetben közvetlenül NOTPME-vé hidrolizálnak.58 Ez azért fontos, mert ezek a vegyületek már önmagukban, más fémion bevitele nélkül is képesek bejutni a vértestekbe, azaz közvetlenül alkalmasak a vértestekben lév magnézium-koncentráció pontosabb meghatározására.
EtO
OEt O P ONa
ONa P
N
O
N
Me
P
N
O
N
O P OEt
NaO
N N
NaO
O P Me
NOTMP (15)
NOTPME 1( 4) O
Me O P ONa
ONa
OH N
N N
HO
O OH
HOOC
N N Et
O NOTA (16)
COOH
N
P
O
OH
NO2A-EP (17)
6. ábra Intracelluláris fémionkoncentráció meghatározására el állított triaza-ciklononán-származékok és a NOTA szerkezete
Az NOTPME élettani hatásáról állatkísérletekkel bebizonyították, hogy a szervezetb l a vesén keresztül gyorsan kiürül, ezért nem képes a fémionkoncentrációk megállapításához szükséges mennyiségben felhalmozódni. Az NOTMP (15) az NOTPME-nél mind komplexképzés, mind a szervezetben történ felhalmozódás szempontjából sokkal el nyösebbnek bizonyult. Az acetát oldalláncot tartalmazó makrociklusos ligandumok magnéziumkomplexeinek stabilitása a foszfortartalmú ligandumokhoz képest nagyobb (logK NOTPME18: 6,20; NOTMP59: 6,66; NOTA60 (16): 9,69). Ezen okok miatt foglalkoztak olyan, vegyes oldalláncot tartalmazó ligandumok el állításával is, amelyekben a detektálhatóságot megkönnyít foszfortartalmú oldalláncok mellett a komplex stabilitását növel acetát oldalláncokat is kialakították.19 Az el állított ligandumok Mg2+-ionnal alkotott komplexeinek stabilitása, valamint Mg2+/Ca2+ 7
2. Irodalmi áttekintés
szelektivitása alapján a NO2A-EP (17) (Mg2+: logK 7,26; Ca2+: logK 6,43) bizonyult a legmegfelel bbnek (6. ábra). Fénykibocsátáson alapuló fémion-meghatározás Ciklén-alapú, kinetikailag inert, lumineszcens lantanoida komplexek (18) abszorbciós és emissziós spektruma Zn2+ion hatására a fémion koncentrációjának függvényében megváltozik, ezáltal alkalmasak a fémion koncentrációjának nyomonkövetésére és ellen rzésére szimulált extracelluláris térben (pH = 7,4, Mg2+, Ca2+, Na+, Cl- jelenlétében) (7. ábra).13 Ln = Eu, Tb O
O N
O
N
COOH
OH2
Ln
N N
R COOH
O
COOH O (18)
N
N
N
O
.
R
MeO
O
O
R N
MeO
O
4 HCl
R: H; CH2COOEt
O (19)
7. ábra Zn2+-ionok meghatározására alkalmas lumineszcens ciklén-alapú komplexképz k szerkezete
Hasonlóan, ciklén-alapú Zn2+-specifikus kemoszenzorokat (19) vizsgáltak, amelyek izolált él sejt Zn2+-ion tartalmának meghatározására bizonyultak alkalmasnak. Ezek önmagukban meglehet sen gyenge fluoreszcenciája a Zn2+-ionok hatására többszörösére n (7. ábra).15 Paramágneses NMR shift-reagens A lantanoida-ionokkal stabilis komplexet képez DOTP túlium-komplexe, a TmDOTP5- (20), mint paramágneses shiftreagens, 23Na NMR segítségével alkalmas az intra- és extracelluláris nátrium rezonanciák elválasztására, ezáltal az intracelluláris Na+-koncentráció meghatározására (8. ábra). A szervezetbe juttatott TMDOTP5- csak az extracelluláris térbe jut be, az ott lév Na+-iont megkötve annak rezonancia jelét eltolja, mialatt az intracelluláris Na+-ion rezonancia jelének kémiai eltolódása és intenzitása változatlan marad.27 Az eljárás alkalmas pl. intracelluláris oxigénhiányos állapotok kimutatására. 2-
2-
O3P
O3P
2-
N N Tm3+ N N
PO3
5-
PO32-
Tm(DOTP)5- (20) 5-
8. ábra TmDOTP , mint paramágneses NMR shift-reagens szerkezete
8
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
2.1.4. Fémmérgezések terápiás kezelése A megnövekedett ipari tevékenységek, a biológiai rendszerekre toxikus hatást gyakorló fémek (Cd, Hg, Pb, Cu), fémtartalmú vegyületek környezetünkben történ felhalmozódásához vezettek. A toxikus fémionokat tartalmazó vegyületekkel akaratunktól függetlenül, mindennapjainkban kapcsolatba kerülünk. Gondoljunk csak a szennyezett leveg re, talajra, természetes vizeinkre, ivóvízre, a növényekben és állatokban akkumulálódott toxikus fémek táplálékláncba történ bekerülésére61,62, nem beszélve bizonyos szintetikus fémvegyületeket tartalmazó anyagokról, pl. ólomtartalmú festékek63,64, vagy az els sorban a kelet-európai országokra jellemz ólomcsövekb l készült ivóvízrendszerek korróziója következtében el idézett ivóvizek ólomszennyez désér l. A fémionok szervezetben való felhalmozódása folyamatos, természetesen a szennyezett környezetnek tartósan kitett egyedek esetében az ártalom mértéke megsokszorozódik. Magyarországot az utóbbi id ben, több esetben is sújtotta akut vagy krónikus ólom- illetve kadmiummérgezés kialakulását kiváltó katasztrófa. Ilyen volt például a kilencvenes években a f szerpaprikába kevert mínium65, illetve a Tisza vizét és él világát veszélyeztet többszöri bányaszerencsétlenségek, amelyek többfajta toxikus fémiont juttattak egyszerre a környezetbe66-69. Ezáltal egészségi és környezeti katasztrófához vezettek, hiszen a toxikus fémionok a létfontosságú féminokhoz való nagyfokú kémiai hasonlóságukból ered en azokat biológiai folyamataikban utánozzák, azokból kiszorítják, és ezáltal a sejtm ködési folyamatokat nagymértékben megzavarják. A toxikus fémek enzimekhez, transzportfolyamatokban résztvev fehérjékhez köt dve gátolják a sejtm ködést, végs stádiumban akár sejthalált okoznak, illetve fiziológiailag fontos fémionok kiszorításával és szervezetbe történ beépülésével potenciális biológiai zavart kelthetnek. A fémek szervezetb l történ kiürülésének meggyorsítására olyan komplexképz szereket, többnyire kelátképz ket használnak, amelyek donorcsoportjaikon keresztül a fémionnal nagy stabilitású komplexet, fémkelátot képezve meggyorsítják azok szervezetb l történ kiürülését.63 Az ideális kelátképz nagyobb affinitást mutat a toxikus fémionok felé, mint a szervezeten belüli ligandumok, és az eltávolítani kívánt toxikus fémionnal stabilabb komplexet képez, mint a létfontosságú, fiziológiailag fontos fémionokkal. El nyös farmakokinetikai sajátsággal rendelkezik, kell en felszívódik a szervezetben, a szöveti megoszlása során a toxikus fémionnal stabilis, vízoldékony komplexet képez, amely komplex vízoldékonysága nagyobb, mint a toxikus fémioné önmagában, ezáltal megnöveli a fémkelát vesén keresztül történ kiürülését. Mindezek mellett nagyon fontos, hogy mind a kelátképz , mind a létrejött fémkelát viszonylag atoxikus legyen.63,70,71 Az 1. táblázatban és a 9. ábrán láthatók azok a terápiás szerek, amelyeket az emberi vagy állati szervezetben keletkezett, nehézfémek vagy metalloidok okozta mérgezések kezelésére használtak.70 A leginkább ismert és elfogadott kelátképz kre 9
2. Irodalmi áttekintés
általánosságban elmondható, hogy hidrofil tulajdonságuk révén a szervezetb l gyorsan kiürülnek, ezáltal a sejtekbe történ bejutásuk, ahol a toxikus fémionok legf bb része lerakódik, meglehet sen korlátozott. Így pl. az ólommérgezés kezelésére használt EDTA jelent s mértékben csak a vérben található ólomszennyez dést képes csökkenteni, de nem elegend en hatékony a sejtekben lerakódott ólomion eltávolítására.63 1. táblázat Toxikus fémionok vagy metalloidok állati és emberi szervezetb l történ eltávolítására hatékonyan alkalmazott terápiás szerek Terápiás szer
CaNa2EDTA[a] BAL (Dimerkaprol) [a] Meso-DMSA (Chemet) [a] DMPS (Dimaval) [a] D-penicillamin[a] Desferroxamin[a] Ditokarbamátok[a] ODDM[b]
Fémion
Pb2+, Cd2+ Pb2+, As3+, Hg2+, Cd2+, Bi3+ Pb2+, Hg2+, As3+, Cd2+ Hg2+, Cu2+, As3+ Cu2+, Pb2+, Hg2+ Fe3+, Al3+ Feltehet leg Pt4+, Cd2+ 90 2+ Sr
([a] Ref.70, [b] Ref.38)
Dimerkaprolt (BAL, 21) használtak ólom, higany és arzén eltávolításra, amelyet a második világháború idején, eredetileg egy arzén tartalmú vegyifegyver (a Lewisite) ellenszereként fejlesztettek ki.70-72. Lipofil tulajdonsága révén mind az extra-, mind az intracelluláris tér nehézfémion tartalmát képes megkötni, az epén és a vesén keresztül gyorsan ürül ki. Több hátrányos tulajdonsága van, többek között, hogy jó membrán-permeabilitása miatt egyes nehézfémionok (Cd2+, MeHg+) felhalmozódását fokozza az agyban, a kezelés rendkívül fájdalmas és kellemetlen mellékhatásokkal jár, ezért ma már csak kivételes esetekben használják ólom és bizmut okozta agykárosodás kezelésére.70 A dimerkaprol káros tulajdonsága miatt szerepét egyre inkább átvették a ditiol-kelátor szerves savak, mint a dimerkaptopropán-szulfonsav (DMPS, 22), dimerkapto-borostyánk sav (succimer vagy DMSA, 23). Intracelluláris térben való megoszlásuk kisebb, ezért szöveti felhalmozódásuk kevésbé jelent s. Mindkett eredményesen használható arzén, kadmium, ólom és higany kiürülésének fokozására.71,72
10
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
SHSH
CH2OH SHSH
dimerkaprol (BAL) (21)
H3C
CH2SO3H
HOOC
COOH SHSH
DMPS (22)
succimer (meso-DMSA)(23) NaOOCCH2
CH3 H O
N
SHSH OH
N
Ca C O O
O D-penicillamin (24)
CH2COONa
C O
CaNa2EDTA (25)
9. ábra A legtöbbet el forduló, toxikus fémionok eltávolítására használt terápiás szerek szerkezete
A D-penicillamin (24) els sorban a Wilson-kór (kóros rézfelhalmozódás) vagy esetleges rézmérgezés kezelésére használt kelátor, amely tiol-csoportjai révén ólom- és higanymérgezések kezelésére is alkalmas lehet.71 A legelterjedtebben használt kelátképz az EDTA (etilén-diamintetraecetsav). Felhasználása ólom- és kadmiumion szervezetb l történ kiürülésének meggyorsítására történik.70,72 Különböz létfontosságú és toxikus fémionokkal alkotott stabilitási állandóit a 2. táblázatban tüntettük fel. A kálciumionnal mutatott nagyfokú stabilitása miatt kálcium-só (CaNa2EDTA, 25) formájában juttatják a szervezetbe, ezzel elkerülve a terápia során a létfontosságú kálcium szervezetb l való kivonását. Az extracelluláris térbe jutva, az ott megkötött nehézfémionokat a vesén keresztül üríti ki, hátránya azonban, hogy a terápia kezdeti szakaszában el segíti a nehézfémionok felhalmozódását az agyban, amely mellékhatása ugyanakkor a terápia el rehaladásával megsz nik. A CaNa2EDTA-terápia másik hátránya annak magas ára és a kezelés meglehet sen hosszú ideje.63,70 Az EDTA toxikus fémion/létfontosságú fémion szelektivitása meglehet sen alacsony, ezért a kutatók figyelme olyan kelátorok szintézise felé irányult, amelyek nagyobb fémion-szelektivitással rendelkeznek, így a gy r méretéb l adódóan szelektív komplexképzésre hajlamos aza-koronaéterek és származékaik kerültek a figyelem középontjába (10.ábra).38,39 O R N
N R O
O
Kryptofix-22
(6)
-CH2COO-
ODDA 2-
(26)
-CH(COO- )2
ODDM4-
(27)
R:
O
H
10. ábra Kryptofix-22 és származékai szerkezete
11
2. Irodalmi áttekintés
A Kryptofix-22 (6) származékok esetében a szelektivitás már az alap makrociklusnál fennáll, ahogyan azt a 2. táblázat is mutatja, azonban a stabilitási állandók meglehet sen alacsonyak. A nitrogénatomokon ionizálódó acetát oldalláncok kialakítása (ODDA2- (26)) újabb koordinációs helyek létrehozása miatt a stabilitási állandók növekedéséhez, ugyanakkor a szelektivitás csökkenéséhez vezetett. Habár az ODDA elegend en nagy stabilitású komplexet képez az ólom- és a kadmiumionokkal73, és létfontosságú ionok jelenlétében (Ca2+, Mg2+ és Zn2+) az él szervezetben hatékony komplexképz ként alkalmazható lenne, terápiás alkalmazása eddig nem valósult meg. Ennek oka, feltehet en a megfelel adagolási eljárás hiánya, amely nélkül a diszubsztituált Kryptofix-22 származék meglehet sen toxikusnak bizonyult.74 2. tábláza EDTA, Kryptofix-22, ODDA, ODDM, NOTA ÉS DOTA ligandumok különböz fémionokkal alkotott komplexeinek stabilitási állandói Fémion
Ca2+ Ba2+ Sr2+ Zn2+ Cd2+ Pb2+
EDTA[a] Kryptofix-22[a]
10,6 7,8 8,6 16,1 16,4 18,2
3,87 2,97 3,1 2,65 5,28 6,8
ODDA[b]
ODDM[b]
NOTA[c]
DOTA[d]
8,39 7,63 8,29 8,42 11,07 13,55
7,54 9,76 9,79 6,28 10,27 13,03
8,93 8,81 18,3 19,8 16,0 16,6
11,03 15,85 18,90 19,06 24,3
([a] Ref.75, [b] Ref.38, [c] Ref.60, [d] Ref.76)
A Brücher és társai által el állított bisz(malonát)-oldalláncot tartalmazó ODDM-et (27)), amely már a gyakorlati alkalmazhatóság tekintetében elegend en nagy Pb2+/Zn2+ és Sr2+/Ca2+ szelektivitással rendelkezett, állatkísérletekkel az ólomés radioaktív stronciumionnal mérgezett szervezetek kezelésére ezidáig a legalkalmasabb komplexképz nek találták.38,39,77 A ligandum tetranátrium-só formájában kálciumot von el a szervezetb l, az LD50 érték ennek megfelel en túl alacsony. Dinátrium-kálcium komplexe formájában azonban a toxicitás a nyolcadrészére csökkent, és jelent sen megn tt a 90Sr2+-ion kiürülése a szervezetbeli kálciumion megkötése nélkül. A szervezetb l történ toxikus fémek kiürítésének meggyorsítása mellett, a környezetben felhalmozódó toxikus fémionok eltávolítására is egyre több módszer kifejlesztésével foglalkoznak. Ezek lényege az, hogy a szennyezett környezetben lév toxikus fémionokat még a szervezetbe kerülés el tt, megfelel komplexképz alkalmazásával eltávolítják. Alkalmazható módszer ez, pl. ivóvizek ólomtartalmának csökkentésére, amelyre szintén egy makrociklusos vegyület komplexképz tulajdonságát használták fel. A ciklám-származékkal módosított szilikagél állófázis 12
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
szilárd fázisú extrakciós alkalmazásban az ivóvizek ólomtartalmának csökkentésére használható (11. ábra).78 -O szilikagél -O -OH
OH Si H2NOC
N
N
N
N
CONH2 CONH2
(SZ1)
11. ábra Ciklám-származékkal módosított szilikagél állófázis szerkezete
2.1.5. Fiziológiás körülmények között hidrolizáló észterek alkalmazása Régóta alkalmazzák azt az eljárást, amely során az egyébként rosszul felszívódó ionos vegyületeket, gyógyszerhatóanyagot vagy kontrasztanyagot, labilis hidrolizáló észteresített karboxilátcsoportokat tartalmazó vegyület formájában juttatják az él szervezetbe. A könnyen távozó észtercsoportokat tartalmazó molekulák, az észtercsoportok jó lipofilitása következtében könnyebben áthatolnak a sejtmembránon, ezáltal könnyebben eljutnak a célszervekhez/szövetekhez, és fiziológiás körülmények között, általában enzimatikus hatásra (pl. észteráz enzim) a hidrofil formájú hatóanyaggá alakulnak át.79-81 Meghatározott körülmények között a hidrolízis folyamata kedvez en tanulmányozható homogenizált szövet- vagy sejtszuszpenzión 1H vagy 31P NMR technikával.82-85 Ez az eljárás kiemelked en fontos a b rön keresztül felszívódó gyógyszerkészítmények esetében, amikor az észteresítéssel a hatóanyag b rön keresztül történ átjutását segítik el . Ilyen készítmények például a 3. táblázatban látható különböz nikotinsav-, és szalicilsav-észterek (28, 29).86
13
2. Irodalmi áttekintés
3. táblázat B rön át felszívódó gyógyszerkészítmények hatóanyagának szerkezeti képlete és márka neve86 O
O
O R
O R N
O
(28)
R
Név
R
Név
Trafuril O
(29)
Tranvasin O
Rubriment
Nicotherm
Rheumacyl
O
Salenal
O O
Radioaktív jódizotóppal jelzett észteresített vegyületeket alkalmaznak a tüd , az idegsejtek valamint a ciszták szerkezetének tanulmányozására. Ezekben a módosulatokban, a karboxilcsoport észteresítésére általában valamilyen alifás alkoholt, pl. n-butanolt használnak, ami lipofil jellegéb l adódóan megnöveli a kontrasztanyag tartózkodási idejét. Az észteresítést sikeresen alkalmazták az N’-(2-hidroxi-etil)-etilén-diaminN,N,N’-tri-ecetsav (HEDTA, (30)) esetében, amelynek a lakton formája (HEDTAészter, (31)) hatékonyabb a 144Ce és a 91Y radioaktív izotópok májból történ kiürülésének meggyorsításához. O
O
HO HO
O N
N O
OH O HEDTA (30)
OH
HO
N
N O
OH O
HEDTA észter (31)
12. ábra A máj toxikus fémiontartalmának csökkentésére használt HEDTA és HEDTA-észter szerkezeti képlete
Habár makrociklusos ligandumok észterszármazékainak klinikai alkalmazására még nincs példa, ilyen fajta származékok el állításával már foglalkoztak, hogy csak a már tárgyalt 14 vegyületet16,17 vagy egyéb hidrolitikus és 14
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
sejtkísérletekre kifejlesztett makrociklus-alapú foszfonát-acetoximetil(AM)-észter származékokat88 említsük. Lázár és társai el állítottak hidrolízisre érzékeny, tetrahidro-2-oxofuran-3-il(butirolakton) oldalláncot tartalmazó piperazin, homopiperazin, 1,4,7-triaza-ciklononán és Kryptofix-22 vegyületeket.89 A γbutirolakton hidrolízisét számos, a szervezetben el forduló enzim el segíti. Hidrolízistermékei az emberi szervezet számára el nyös biológiai aktivitást mutatnak, meglehet sen alacsony toxicitással rendelkez altató és fájdalomcsillapító hatásúak.90 Nyíltláncú analógjaiknak tekinthet kelátképz ket már felhasználtak intracelluláris közegben történ fémionmegkötésre, ami azt jelenti, hogy a közismerten fémionszelektív komplexképz tulajdonsággal rendelkez makrociklusos poliaminopolikarboxilátok (ODDA, NOTA, DOTA) észterszármazékai a jöv ben, potenciálisan alkalmazható terápiás szerek lehetnek.
2.2. Enantiomer szeparáció – analitikai eljárások Az optikai izomerek elválasztása az analitikai kémiai kutatások egy kiemelked en fontos témájává vált, legf képpen a gyógyszerészet területén. Nagyon gyakran ugyanis a gyógyszerek hatóanyagának enantiomerjei gyógyászatilag különböz tulajdonsággal rendelkeznek. Egy optikailag aktív hatóanyag két enantiomerje különbözhet egymástól aktivitásában, mint például az (±)-epinefrin91, illetve egészségre gyakorolt hatásában, mint például az 1950-es években a terhes n k körében alkalmazott, és a forgalomból azóta már kivont Contergan® nev nyugtatószer hatóanyaga, a (±)-talitomid92. A hatóanyagok enantiomerjeinek tulajdonságbeli különbsége megkövetelte olyan analitikai eljárások kifejlesztését, amelyek alkalmasak királis tisztaságvizsgálatra, és a hatóanyagok farmakokinetikai tanulmányozására. Az optikailag aktív izomerek elválasztása kiemelked en fontossá vált a biológiailag jelent s gyógyszerhatóanyagok épít köveinek tekinthet aminovegyületek pl. aminosavak, β-blokkoló ágensek körében is. Napjainkban a legelterjedtebben használt kromatográfiás királis elválasztástechnikák a nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) és a kapilláris elektroforézis (CE). Az elválasztás minden esetben olyan szelektort igényel, amely a vizsgált enantiomerekkel eltér er sség kölcsönhatás kialakítására képes. A két eljárás alapjában abban tér el egymástól, hogy amíg a HPLC-ben a királis szelektor az állófázisba van építve, a CE a háttérelektrolitban tartalmazza azt. A CE elektroforézis anyagköltségét tekintve egyre inkább el nyben részesített eljárás a folyadékkromatográfiával szemben. Az elektroforézis során a töltéssel rendelkez részecskék elektromos er tér hatására elmozdulnak. Az elmozdulás mértéke az elektroforetikus mozgékonysággal jellemezhet , amely az 15
2. Irodalmi áttekintés
alábbi egyenlet szerint függ a következ tényez kt l: zi: az i komponens töltésszáma, e: az elemi töltés, E: elektromos er tér, η: az oldat viszkozitása, ri: a szolvatált ion sugara (1. egyenlet).93
µ i0 =
z i .e z .e = i E 6πηri
1. egyenlet
A vizsgált minta és az alkalmazott szelektor között kialakuló kölcsönhatás a mintakomponensek mozgékonyságát egymáshoz képest megváltoztatja, és így elválasztást indukál.
2.2.1. Királis szelektorok A királis elválasztáshoz olyan optikailag tiszta makromolekulákat használnak, amelyek üreg vagy gy r méretükb l adódóan az elválasztás során in situ kölcsönhatásba lépnek az enantiomer szubsztrátokkal, például diasztereomer molekulakomplexeket képezve. A legszélesebb körben alkalmazott szelektorok a különböz ciklodextrinek és azok származékai41-46,94, valamint korlátozott számban koronaétereket44,47,48,91 és kalixaréneket95-97 is alkalmaznak. A ciklodextrinek D-glükópiranóz egységekb l felépül 91,98 oligoszacharidok. A vödörhöz vagy csonka kúphoz hasonlítható makromolekulák üregméretét a kapcsolódó D-glükopiranóz egységek száma határozza meg, így attól függ en, hogy 6, 7 vagy 8 egységb l épülnek fel megkülönböztetünk α-, β- és γ-ciklodextrineket (13. ábra). HO A
β-CD
*
B C OH
host-guest komplex
13. ábra β-ciklodextrin, mint királis szelektor, és a kromatográfiás elválasztás során kialakuló hostguest komplexek szerkezete
Küls felületük a glükóz egységek hidroxilcsoportjainak orientáltsága miatt hidrofil, míg a belsejük a poliéterhidakkal összekötött metiléncsoportok miatt hidrofób tulajdonságú.99 Az elválasztás a ciklodextrin és a királis részecske közötti intermolekuláris kölcsönhatásokon keresztül (hidrogénkötés, hidrofób-, dipol-dipol és van der Waals) valósul meg. A vizsgált minta hidrofób része a ciklodextrin 16
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
üregébe ágyazódik, a hidrofil molekularész pedig a ciklodextrin gy r jének pereménél elhelyezked hidroxil- vagy módosított hidroxilcsoportokkal lép er sebb kölcsönhatásba (13. ábra). Mivel a hidroxilcsoportok a CD-ben optikailag aktív szénatomokhoz kapcsolódnak, a kialakuló molekulakomplexek energiája és térszerkezete különböz , aminek következtében, szelektor jelenlétében a diasztereomerek kromatográfiás vándorlási tulajdonsága is eltér .98 A ciklodextrinek mellett Pederson és társai100,101 által felfedezett koronaéterszármazékok is képesek molekulakomplex kialakítására91. Közöttük a “18-korona6”-típusú molekulák (18C6, 32) alkalmazása a legelterjedtebb. A kiralitáscentrumot vagy a gy r n alakítják ki, vagy királis szubsztituenst kapcsolnak a molekulához. A Lehn és társai által el állított (-)-18-korona-6-tetrakarboxilát (18C6H4, (33)) 4 gy r szénatomon hordozza az optikai centrumot.100 Ezt a vegyületet Kuhn és társai használták el ször a CE-ben, amely a mai napig az egyetlen, szélesebb körben használt, kereskedelmi forgalomban is kapható királis szelektorként alkalmazott koronaéter (14. ábra).47 O O O
O
O
O
HOOC
O
O
HOOC
O
O
O
COOH
O
COOH
O
O
-O
O-
O
O
O O HH O O OH -O N+ O-
O
R
18C6 (32)
18C6H4 (33)
host-guest komplex
14. ábra 18C6, 18C6H4 és a kromatográfiás elválasztás során a 18C6H4-el kialakuló host-guest komplex szerkezete
Míg ciklodextrinek esetében az aminok rend sége nem befolyásolja az elválasztást, a koronaéterek csak primer aminocsoporttal rendelkez racém elegyek enantiomerjeinek elválasztására használhatók. Az enantiomer, protonált aminocsoportján keresztül a koronaéter gy r jébe ágyazódik, miközben az oxigének nemköt elektronpárjaival három +NH…O hidrogénkötést alakít ki (14. ábra).47,91,98 A szeparáció mértékét a koronaéter és az aminovegyület enantiomerjeinek kiralitást hordozó szubsztituensei között lév sztérikus gátlás mértéke határozza meg, amely különböz stabilitású diasztereomerek képz déséhez vezet.47,103 Magasabbrend aminok esetében a nagyobb sztérikus gátlás, valamint a háromnál kisebb számú hidrogénkötés következtében nem alakul ki megfelel stabilitású komplex. Kuhn és társai megállapították, hogy abban az esetben, amikor önmagában sem a ciklodextrin, sem pedig a 18C6H4 (34) nem elég hatékony szelektor, együttesen alkalmazva szinergista hatást fejtenek ki, pozitívan befolyásolva az elválasztás mértékét.47 Ugyanezt a szinergista hatást fedezték fel akirális 18C6 (33) esetében, amely kiralitáscentrum hiányában, önmagában nem, azonban 17
2. Irodalmi áttekintés
ciklodextrinekkel együttesen alkalmazva jelent sen javította a primer aminok királis szeparációját.104-107 Megállapították, hogy ezekben a “kett s szelektor”-t tartalmazó rendszerekben a koronaéter támogatja az amin és a ciklodextrin közötti kölcsönhatást. Az aminovegyület hidrofób része a ciklodextrin üregébe ül, amelyet a koronaéter a protonált aminocsoporton keresztül kialakított host-guest kölcsönhatással stabilizál. Az így kialakult “trimolekulás-komplex” stabilitását, azaz a lehetséges kölcsönhatások er sségét és irányultságát, a szelektorok és a vizsgált aminok kémiai szerkezete befolyásolja. A komplex kialakulása több egyensúlyi folyamattal értelmezhet (15. ábra).107 +
OO O OO O
R * NH3 2 R1
K1
K2
R * 2
O O O H O H H O O R * 2
+
NH3
R1
N
R1
K4
K3 O O O H O H H O O R * 2
OO O OO O
N
R1
15. ábra Trimolekulás-komplex kialakulásának egyensúlyi folyamata
CE és NMR vizsgálatokkal megállapított egyensúlyi állandók a pimer amin és 18C6 host-guest komplex kialakulását valószín sítik el ször, amely ezt követ en képez asszociátumot a ciklodextrinnel. A 33 származék mellett több, hasonló szerkezet királis koronaétert, aza/diaza-koronaétert állítottak el , amelyek kromatográfiás felhasználására még nem került sor103,108. Ezek közül néhány származék látható a 16. ábrán. O
H3C
O
H3C
O
O (34)
N
O
H3C
O
O
H3C
O
O (35)
O
CH3
O
CH3
H3C
N O
O O
H N
O
(36)
16. ábra Királis koronaéter, aza- illetve diaza-koronaéterek szerkezete
18
CH3
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
A kiralitáscentrum kialakítását a koronaétergy r szintézise közben valósítják meg, leggyakrabban a gy r t alkotó szénatomon (17. ábra (a)108, vagy ritkán az oldalláncon (17. ábra (b)109). Y N Y
1, K 2CO3 (DMF, melegítés, Ar) 2,
N OH
R
R
OH
Y = CH vagy N
TsO
O
R = CH 3
H3C
O
O
O
O
(37)
Ts = p-CH3C6H5SO2
H CH3
CH3
O
OTs 10 (R)-(+)-1-fenil-etil-amin, xilén OTs Ts = p-CH C H SO 3 6 5 2
O O
N H
H N
(a)
O
3 OTs
H
O
CH3
N Pr3N, xilén
O
O
O
O
(b)
N H3C
H3C H
H (38)
17. ábra Kiralitásközpont kialakítása (a) aza-koronaéter gy r szénatomján, és (b) diaza-koronaéter oldalláncán
Az aminokkal alkotott komplexeik asszociációs állandóját, valamint a potenciálisan királis szelektorként használható koronaéterek enantiomer-felismer képességét UV-VIS és NMR spetroszkópiai mérésekkel határozták meg103,110-115 Az enantiomerek megkülönböztetése során, a királis koronaéter a két enantiomerrel eltér asszociációs állandóval rendelkez molekulakomplexet alkot. Minél nagyobb a különbség a komplexek asszociációs állandói között, annál jelent sebb a királis koronaéter enantiomer-megkülönböztet hatása. Az NMR mérések során a királis Az koronaéter-származékok ún. NMR shift-reagensként m ködnek. aminovegyületek egyes enantiomerjei kiralitásközpontjának környezetében lév csoportok rezonancia jeleit egymástól elválasztják, ezáltal különbséget tesznek az egyes enantiomerek között. A koronaéterek kromatográfiás felhasználásában a királis szeparáció mellett alkálifémek, alkáliföldfémek és átmenetifémek megkülönböztetésére116-119, különböz rend szerves aminok120, valamint aromás aminok pozíciós 48,120,121 izomerjeinek elválasztására is van példa. Ezeknek a meghatározásoknak nem feltétele a koronaéter molekula kiralitása, így egyszer szubsztituálatlan 18C6 (32) 19
2. Irodalmi áttekintés
is hatékonyan alkalmazható. A szeparáció minden esetben a molekulakomplexek eltér stabilitásából és különböz elektroforetikus mozgékonyságából adódik. A semleges koronaéter származékok csak pozitív töltés részecskék megkülönböztetésére használhatók, de anionok elválasztására is sok esetben igény lehet. Mori és társai negatív töltés pozíciós izomereket (pl. naftalén-1,5diszulfonát, naftalén-2,6-diszulfonát, naftalén-2,7-diszulfonát vagy ftalát, izoftalát, tereftalát) különítettek el egymástól, amihez kétszeresen pozitív töltés diazakoronaéter származékot (39) szintetizáltak (18. ábra).122 O
O + N Me2
Me2 N + O
O
2Cl-
(39)
18. ábra Anionos pozíciós izomerek elválasztására alkalmas kationos diaza-koronaéter szerkezete
2.2.2. Makrociklus komplexképz kkel módosított szilikagél állófázisok A makrociklusos vegyületekkel módosított szilikagél állófázisok, a makrociklus szelektív komplexképz tulajdonságát kihasználva alkalmasak a makrociklussal különböz stabilitású komplexet képz fémionok123, valamint optikailag aktív makrociklusok esetén királis aminok124-137 folyadékkromatográfiás elválasztására. A szilikagél módosítása költségkímél eljárás, hiszen a gélhez kötött makrociklus mennyisége sokkal kisebb, mintha a makrociklust tartalmazó eluálószert alkalmaznának, ráadásul a szilikagél állófázisok a megfelel regenerálás után többször felhasználhatók. A módosított szilikagél el állítása háromféleképpen valósítható meg. Az els eljárás szerint a kapcsolódó oldallánccal ellátott makrociklust kötik a szilikagélhez, ahogyan Bradshaw és társai is többféle poliaza- valamint poliazapolioxa-cikloalkán származékkal módosított szilikagélt állítottak el , többek között nehézfémionokkal szennyezett vizek tisztítására.137-141 Megállapították, hogy a szilikagélhez kötött makrociklusok fémkomplexeinek stabilitása közel azonos a módosítatlan makrociklusok komplexeinek stabilitásával. A szilikagél módosítása az el z leg el állított makrociklusos vegyület szilikagélhez történ kapcsolásával történt (19. ábra).
20
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
szilikagél
O O CH2OCH2CH=CH2 O
CH2O(CH2)3-Si(OC2H5)2
O
R N
O N R
O
O
Pt kat. HSi(OC2H5)2
R N
N R O
CH3
CH3
O
szilikagél melegítés
CH2O(CH2)3-Si O
R N
O
CH3
O N R
O
R = benzil; hexil; etil
O
(SZ2)
19. ábra Szilikagél módosítása makrociklusos vegyület szilikagélhez történ kapcsolásával
A második eljárás szerint, az el z ekben említett szintézist l eltér en, el ször klórpropil csoportot alakítanak ki a szilikagélen, majd az aza-koronaétert a már módosított szilikagélhez kapcsolják (20. ábra).142 kat., toluol
szilika + (C2H5O)3SiCH2CH2CH2Cl O
szilika
O
Si
CH2CH2CH2Cl
O
NH O
reflux
O
O
O
szilika bázis, DMF melegítés
O
Si
CH2CH2CH2
O
N
O O
O
ACPS (SZ3)
20. ábra Aza-makrociklussal módosított szilikagél el állítása a makrociklusnak, klór-propil csoporttal módosított szilikagélhez történ kapcsolásával
A harmadik módszer szerint a gy r zárást a kapcsolódó oldallánccal módosított gélen viszik végbe, ahogyan azt a 21. ábra mutatja.143
21
2. Irodalmi áttekintés
O
-(OH) szilikagél -(OH) + (CH3O)3Si(CH2) 3OCH2CH
kat., toluol CH2
reflux
- (OH) O
-O szilikagél -O -O
Si(CH2) 3OCH2CH
NH2CH2CH2OH, kat. CH2
DMF, reflux
-O szilikagél -O -O
Si(CH2) 3OCH2CHCH2NHCH2CH2OH
O O n O - Ts NaH, DMF, THF
Ts - O
Ts = p-CH3C6H5SO2
OH
-O szilikagél -O -O
Si(CH2) 3OCH2
N
O
O
O O
(SZ4)
n
n = 1 vagy 2
21. ábra Aza-makrociklussal módosított szilikagél kialakítása szilikagélen történ gy r zárással
El állították a már CE-b l ismert és alkalmazott 18C6H4-tal (33) kapcsolt szilikagél állófázist (CSP-18C6I, SZ5), amelynek 3-aminopropil csoporttal módosított szilikagélhez történ kapcsolása, reaktív csoport hiányában, egy a peptidszintézisben használt kapcsolóágens, az N-etoxikarbonil-2-etoxi-1,2dihidrokinolin (EEDQ) segítségével történik (22. ábra).129 A koronaéterrel nem reagált aminocsoportokat ecetsavanhidriddel acetilezve lezárták. Különböz primer aminosavak, aminosav származékok, aminoalkoholok, s t a kapilláris elektroforézisben tapasztaltakkal ellentétben szekunder aminocsoportot tartalmazó β-blokkoló ágensek elválasztására is használható.
22
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
-O -O -O -O -O -O -O -O
(+)-18-korona-6tetrakarboxilát, NH2 EEDQ
OMe Si OMe Si
NH2
ecetsavanhidrid
-O -O -O -O
OMe Si
O N H
OMe Si
-O
N H
OMe Si
-O
O
O O
HOOC
OMe Si
O O
N H
O
O
COOH
O
COOH
O
COOH
O
COOH
CH3 CH3
O N H
OMe Si
-O
O
N H
OMe Si
-O
CH3
O
O
N H
O
O
O
CSP-18C6I (SZ5)
22. ábra 18C6H4-el módosított királis szilikagél állófázis kialakítása
Makrociklusos vegyületek (koronaéter- és ciklám-származékok) és ciklodextrinek királis elválasztásra gyakorolt együttes szinergista hatását a makrociklussal szubsztituált β-ciklodextrinnel módosított szilikagél állófázisok UHPLC-s és CEC felhasználásával igazolták (23. ábra).131,135,144
O-
(C(O)CH2Br) y
O
(C(O)CH2Br) z
O-
(C(O)CH2Br) y
Si O -
OCH2CHCH2(CH2)3
O
OCH2CHCH2(CH2)3
O
O-
O
(C(O)CH2Br) z O -
(x+y+z ~ 3,2) O
(x+y+z ~ 2,4)
(CH2OC(O)CH2Br) x O O
NH N
O O
N
N O
O
AQ2D18C6-CD-HPS (SZ6)
Si O -
N
NH2
O
(CH2OC(O)CH2Br) x
N
N
N
N
N
N H
OH
OH (SZ7)
23. ábra Makrociklussal szubsztituált β-CD-nel módosított királis szilikagél állófázis szerkezete
Az enantiomer elválasztás során a puffer-oldatban lév fémiont a szilikagélen kötött makrociklus-egység komplexbe foglalja, ezáltal pozitív töltést alakít ki a módosított 23
2. Irodalmi áttekintés
szilikagélen. A pozitív töltés makrociklussal szubszitutált β-CD extra elektrosztatikus és dipoláris kölcsönhatások kialakítására képes a mintakomponenssel, amely er sebb host-guest kölcsönhatást eredményez, ezáltal javítja a királis elválasztás és a szelektivitás mértékét. Az irodalmi adatokból látható, hogy nagyon sok fejlesztés történik a kromatográfiás királis állófázisok el állításának és alkalmazásának irányába. Analitikai alkalmazhatóságukat és jelent ségüket a legjobban az mutatja, hogy egyik származékuk, a (3,3’-difenil-1,1’-binaftil)-20-korona-6-tal (40, 24. ábra) szubsztituált CROWNPACK CR (+) szilikagél állófázis már kereskedelmi forgalomban is kapható (Daicel Chemical Industries), és elterjedten használt primer aminocsoportot tartalmazó, racém származékok ennatiomerjeinek elválasztásához.48,132,145-147
O O
O
O
O O
(40)
24. ábra A CROWNPACK-CR (+) királis állófázis kialakításához használt (3,3’-difenil-1,1’-binaftil)20-korona-6 szerkezete
24
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
3. Kísérleti eredmények és értékelésük 3.1. Hidrolizáló el állítása
oldalláncot
tartalmazó
észterszármazékok
Munkánk els részében széleskör szintetikus kutatást végeztünk labilis, hidrolizáló oldalláncot tartalmazó gy r s diaminok, polioxa-diaza-koronaéterek és poliaza-makrociklusos származékok el állítására, amely során a kereskedelemben megtalálható valamennyi potenciálisnak számító kiindulási anyag alkalmazhatóságát megvizsgáltuk. Az oldalláncok kapcsolására használt α-bróm-karbonsav-észterszármazékát, bróm-acetil-bromid és a megfelel hidroxilcsoportot tartalmazó vegyületek nukleofil szubsztitúciós reakciójában állítottuk el (1-3. egyenlet). Els sorban olyan észtereket szintetizáltunk, amelyek önmagukban vagy valamely rokonvegyületként gyógyszerhatóanyagok módosítására az irodalomban már el fordultak. Ilyenek voltak például a gyakorlatban elterjedten alkalmazott, b rön keresztül felszívódó észterszármazékok közül az etoxi-karbonil-metil-acetát, a benzil-acetát illetve a 2-hidroxi-etil-acetát oldalláncok.86 A hidroxil-csoportot tartalmazó vegyületek egy részét, amelyek kereskedelmi forgalomban nem voltak elérhet k, vagy magas áruk indokolttá tette, magunk szintetizáltuk. Az etil-glikolátot (41) és a benzil-glikolátot (42) Fisher módszere alapján148 állítottuk el glikolsavból és a megfelel alkoholból kiindulva (1. egyenlet) sósav katalízissel. A 2-benziloxi-etanolt (43) Butler eljárása szerint készítettük149 etilén-glikolból, benzil-bromidból és kálium-hidroxidból. (2. egyenlet). Ezt követ en bróm-acetil-bromidot és a kiválasztott hidroxilcsoportot tartalmazó vegyületet ((etil-glikolát (41), butil-glikolát, benzil-glikolát (42), 3-hidroxi-dihidrofurán-2-on, 2,2,2-trifluoro-etanol, 2-benziloxi-etanolt (43)) vízmentes diklórmetános közegben, a forrás h mérsékletén reagáltatva jutottunk el a megfelel αbróm-karbonsav-észterekhez (41-49).
25
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
HOCH2COOH
OH
HO
O Br
Br
O
R OH kat. HCl reflux, -H2O
HO R = Et Bn
Bn-Br
(1)
41 42 (2)
O
HO
KOH reflux, -KBr
OR
43
O
száraz CH 2Cl2 HO R'
Br
reflux, R' = -CH2C(O)OEt -CH2C(O)OBu -CH2C(O)OBn
41 42
(3)
R' 44 45 46
O O -CH2CF3 -CH2CH2OBn
47
43
48 49
25. ábra Az oldalláncként használt csoportok α-bróm származékának el állítása
Az oldószer eltávolítása után a 44-46, 48-49 észtereket atmoszférikus desztillációval tisztítottunk meg az elreagálatlan kiindulási anyagok maradékától és a keletkezett melléktermékekt l. A 47-származék tisztításához, a rendkívül kis mennyiségre való tekintettel száraz oszlopos vákuum kromatográfiás eljárást alkalmaztunk. Az így el állított α-bróm-észtereket (44-49) lassan adagoltuk sztöchiometriai mennyiség gy r s diamin (1, 2, 5, 6) vízmentes acetonitriles oldatához. (26-27. ábra). A lassú adagolásra a diaminok különböz bázicitású nitrogénatomjai miatt volt szükség, hogy elkerüljük a kvaternerizálódott és monoszubsztituált melléktermékek keletkezését. A reakció során keletkez hidrogénbromid megkötésére i-Pr2NEt nemnukleofil bázist alkalmaztunk. Ezekben a reakciókban a piperazinnak (1) valamennyi észterszármazékát (50-56), a homopiperazin (11) esetében az 57-59, 6062 származékokat, míg Kryptofix-21 (5) és Kryptofix-22 (6) esetén a 63-67, valamint a 68-72 származékokat állítottuk el .
26
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
HN
NH + 2 n
R'
Br
O
száraz MeCN, i-Pr2NEt, reflux
O
-i-Pr2NEt.HBr
'RO
OR'
N
(4)
n
O
n=0 1 n=1 2 R' = -CH2C(O)OEt
N
n=0
n=1
44
50
57
-CH2C(O)OBu
45
51
58
-CH2C(O)OBn
46
52
59
47
53
48 49
54
60
55 56
61 62
O O
-CH2CF3 -CH2CH2OBn -Bn
26. ábra Piperazin és homopiperazin hidrolizáló észtercsoportot tartalmazó származékainak el állítása
O
O
HN
NH O
O
O
+
2
Br
R'
száraz MeCN, i-Pr2NEt, reflux -i-Pr2NEt.HBr
n
O
O
O
N
N 'RO
O
O
OR' (5)
O n
n=0 5 n=1 6 R' = -CH2C(O)OEt -CH2C(O)OBu -CH2C(O)OBn -CH2CH2OBn -Bn
44 45 46 49
n=0
n =1
63 64 65 66 67
68 69 70 71 72
27. ábra Kryptofix-21 és Kryptofix-22 hidrolizáló észtercsoportot tartalmazó származékainak el állítása
Az el állított észterszármazékok közül a 2-benziloxi-etil-acetát-származékok (55, 61, 66, 71) esetében kromatográfiás tisztítási eljárást kellett alkalmazni. Az oszlopkromatográfiás elválasztás során az 55 piperazin-észter esetében egy nagyobb mennyiségben keletkezett mellékterméket (73) sikerült izolálnunk, és a szerkezetét meghatároznunk (28. ábra). 27
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
O
O N
O
O
N
O
O
O
O N
N
O O
73
28. ábra Az 55 el állítása közben képz dött, és oszlopkromatográfiásan izolált melléktermék szerkezete
Bróm-ecetsav-hidroxietil-észterb l és gy r s diaminból kiindulva az N-2-hidroxietil-acetát oldalláncot tartalmazó diamin-származékok el állítását, az eddig még azonosítatlan mellékreakciók lejátszódása miatt, nem tudtuk megvalósítani. Etilénglikol és bróm-acetil-bromid reakciójában az ’a’ kívánt észter mellett az NMR spektrum alapján a ’b’ és ’c’ melléktermékek keletkezése volt valószín síthet (29. ábra). O Br
HO
OH +
+ HBr
O OH
'a'
O Br
O Br
O 'b'
+ H2O (a) Br (6)
O
Br Br
O
+ 2 HBr
O 'c'
O
(b)
Br
29. ábra Etilén-glikol és bróm-acetil-bromid között lejátszódó lehetséges folyamatok (reakciókörülmények: vízmentes CH2Cl2, reflux)
A kis mennyiségben jelenlev melléktermékek a diaminokkal reagálva további melléktermékek képz dését eredményezték. A 74-77 célvegyületekhez a benziloxietil-acetát oldalláncot tartalmazó származékok (55, 61, 66, 71) katalitikus hidrogénezése útján jutottunk, a 30. ábrán megadott körülmények között.
28
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
55 vagy 61
MeOH, kat. Pd/C, H2
O
HO
szobahõm.
O
N
N
66 vagy 71
szobahõm.
OH
74 75
O
O
N
N O
O
O
O
HO
(7)
n
O n=0 n=1
MeOH, kat. Pd/C, H2
O
O
(8) OH
O n
n=0 n=1
76 77
30. ábra 2-hidroxi-etil-acetát oldalláncot tartalmazó gy r s diamin-származékok el állítása
Nagy gyakorlati jelent ségükre tekintettel kísérletet tettünk az 1,4,7-triazaciklononán és az 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán hidrolizáló észterszármazékainak az el állítására, a 26-27. ábrán megadott reakciókörülmények között. Az el kísérletekben megállapítottuk, hogy az egyszer metil- és etilésztereken túl, egyéb α-bróm-észterekkel a legtöbb esetben számtalan melléktermék keletkezik, ami els sorban a kiindulási poliaza-makrociklusok szekunder aminocsoportjainak bázicitása közötti meglehet sen nagy különbségnek tulajdonítható (7. táblázat). A nagyon bázikus poliaza-cikloalkánok esetében két olyan mellékreakció jelentkezett, ami a gy r s diaminoknál nem volt megfigyelhet . Részlegesen szubsztituált származékok képz dtek; valamint a gy r nitrogének részvételével kvaternerizációs reakciók játszódtak le. A különböz módon szubsztituált termékeket tartalmazó keverékek oszlopkromatográfiás tisztítását nem tudtuk megvalósítani, ugyanis a szilikagél hatására a labilis észtercsoportok az elválasztás során elhidrolizáltak. 4. táblázat Az 1,4,7-triaza-cikoononán (3) és 1,4,7,10-tetraza-ciklododekán (4) protonálódási állandói
logK1 logK2 logK3 logK4
1,4,7-triazacikoononán[a] 10,42 6,82 <1 -
1,4,7,10-tetrazaciklododekán[b] 10,82 9,72 1,15 <1
[a] Ref.150, [b] Ref.75
29
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
Az 1,4,7-triaza-ciklononán-1,4,7-trisz(etil-acetát) származékot (78) tisztán állítottuk el a piperazin-észterszármazékoknál alkalmazott nukleofil szubsztitúciós körülmények között, azonban a bróm-ecetsav-etil-észter kis feleslege is a legnagyobb protonálódási állandóval rendelkez szekunder aminocsoport kvaternerizációjához, ezáltal a 79 származék képz déséhez vezetett (31. ábra). EtOOC
COOEt
N
N
BrCH2C(O)OEt
EtOOC
COOEt
N
N + N
N
(9)
-
Br COOEt COOEt
COOEt
79
78
31. ábra Tercier aminocsoport kvaternerizációja 1,4,7-triaza-ciklononán észterszármazékának esetében
A negatív eredmények rámutattak arra, hogy a gy r s diaminoknál és polioxa-dazakoronaétereknél alkalmazott eljárások nem, vagy csak nagyon korlátozottan terjeszthet k ki a kett nél több aminocsoportot tartalmazó poliaza-makrociklusos vegyületekre. Azért, hogy minél általánosabban használható eljárást találjunk a hidrolizáló oldalláncokat tartalmazó makrociklusos vegyületek el állítására, a továbbiakban részletesen vizsgáltuk a kereskedelmi forgalomban hozzáférhet , illetve egyszer en el állítható acetát- és észterszármazékok alkalmazhatóságát. Az új típusú reakciókhoz modellvegyületként a PIDA-t (80) és annak metil-észterét (81) használtuk (32. ábra). Piperazinból (1) bróm-ecetsavval lúgos közegben a PIDAnátrium sóját állítottuk el , amelyb l sósavas savanyítással a PIDA hidrokloridjához jutottunk (32. ábra, 10a egyenlet). Hasonlóan PIDA-hoz jutottunk a PIDA-Me-észter savas hidrolízisével is. PIDA-Me-észtert legegyszer bben piperazin és klór-ecetsavmetil-észter reakciójában állítottunk el (32. ábra, 10b egyenlet).
NH + 2
HN
OH
Br
O
1, 80 0C, NaOH-oldat/pH 9, -HBr
O
N 80
O NH + 2
HN 1
Cl
száraz MeCN, -i-Pr2NEt, reflux
OMe -i-Pr2NEt.HBr
cc. HCl reflux -MeOH, OMe -HCl
O N 81
2
32. ábra PIDA és PIDA-Me-észter el állítása
30
.
2, szobahõm., HCl-oldat/pH 2, -NaCl
1
OH 2 HCl
(a)
2 (10)
(b)
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
A PIDA az észteresítési folyamatokhoz szükséges szerves oldószerekben egyáltalán nem oldódik, bróm-ecetsav-etil-észterrel történ közvetlen alkilezése i-Pr2NEt jelenlétében, különböz oldószerekben (acetonitril, aceton vagy DMF), még forrás h mérsékletén, több nap alatt sem ment végbe. A PIDA oldékonysága és a karboxilát-anion nukleofilitásának növelése érdekében több eljárást is kidolgoztunk a PIDA tetrametilammónium- (82) és tetraetilammónium sójának (83) az el állítására, amelyeket a további, alkilezési reakciókban mint lehetséges kiindulási anyagokat használtunk fel. Piperazinhoz (1) bróm-ecetsavat kapcsoltunk tetraalkilammónium-hidroxid bázis jelenlétében, PIDAt (80) semlegesítettünk, illetve PIDA-Me-észtert (81) hidrolizáltunk tetraalkilammónium-hidroxid oldattal (33. ábra, 11a, b, c egyenletek). A 82 és 83sóknak a reakciókban keletkez tetraalkilammónium-halogenidekt l történ elválasztását nem végeztük el, ugyanis tapasztalataink alapján a tetraalkilammónium-halogenidek a további reakciókat nem befolyásolják. O NH + 2
HN
OH
Br
+ 2 NR''4OH
1
(a)
pH 9-10, 80 0C
- NR"4Br
O
O
OH
N
2 NR''4OH
2
80 O
+
2 HCl
.
pH 9-10, 90 0C -NR"4Cl
O(NR''4)
(b)
(11)
2 pH 9-10 90 0C
OMe
N
N
+
R" = Me 82 R" = Et 83
2 NR''4OH
(c)
2 81
33. ábra PIDA-tetraalkilammónium sóinak el állítása
A 82- és 83-sókat tartalmazó sókeverékeket a kapcsolni kívánt α-bróm- illetve αklór-karbonsav-észterszármazékokkal reagáltattuk, a 34. ábrán szerepl körülmények között. A 82-sóból kiindulva el állítottuk a 50, 56, 74, 84 vegyületeket. Az 52 és 53 származékok esetében, a 82-só kis oldékonysága miatt tapasztalt alacsony kitermelés következtében, a nagyobb oldékonysággal rendelkez 83-sóból indultunk ki, és jelent sen magasabb konverziót értünk el.
31
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
O N
száraz MeCN reflux
O(NR''4) +
-NR''4Br/Cl
X' = Br; R' = -CH2C(O)OEt -Bn
(12) 2
50 56
X' = Cl; R' = -CH2CH2OH -CH2CN R'' = Et 83
OR'
N
2 X' R'
2 R'' = Me 82
O
X' = Br; R' = -CH2C(O)OBn
74 84 52
O O
53
34. ábra Néhány piperazin-észterszármazék el állítása PIDA tetraalkilammónium sójából kiindulva
Az 50, 56 észterek esetében a termék észtert a reakció során képz dött tetraalkilammónium-halogenidt l dietil-éteres vagy kloroformos kioldással sikerült megtisztítanunk, míg az 52, 53, 74, 84 származékok csak a reakcióban képz d tetraalkilammónium-halogeniddel együtt voltak kinyerhet k, ami azonban tapasztalataink alapján nem befolyásolja az észterszármazékokkal folytatott további vizsgálatokat. A 74 észter esetében, 1H NMR mérések alapján kimutattuk, hogy a 74 észter és a 82-só egymással rögzített mólarányú asszociátumot képez. Molekulamechanikai és szemiempirikus kvantumkémiai számítások szerint két 74 molekula között a 35a. ábrán látható szerkezet jön létre, amelyben a piperazingy r csavart kád konformációt vesz fel, és az oldalláncok hidroxil- és karboxilcsoportjai között kialakuló hidrogénkötések stabilizálják a szerkezetet. A NMe4+-ion hatására az oldalláncok közötti hidrogénkötések felbomlanak, az oldalláncok távolabb kerülnek egymástól, és ezáltal a NMe4+-ion képes beépülni a két molekula által kialakított üregbe.
(a)
(b)
35. ábra (a) Két 74-molekula között kialakuló asszociátum, és (b) két 74-molekula és NMe4+-ion között kialakuló molekulakomplex feltételezett szerkezete
32
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
A 74 és a 84 észterszármazékok esetében, a 2-klór-etanol és a klór-acetonitril mérsékelt reaktivitása miatt, csak nagyon kis átalakulást tudtunk elérni. Reaktivitásuk, és ezzel együtt a kitermelés ugrásszer megemelkedését tapasztaltuk a reakcióelegyhez adott katalitikus mennyiség NaI hatására, miután a reaktívabb jód-etanol illetve jód-acetonirtil keletkezett in situ a reakció során. Az eljárás az 5, 6 diaza-koronaéterek esetében alkalmatlan tiszta észterszármazékok el állítására, ugyanis a koronaéter gy r méretéb l adódóan a tetraalkilammóniumionokkal er s molekulakomplexet képez, amely lehetetlenné teszi azok elválasztását. NOTA-(NEt4)3-sóból (85) kiindulva, amelyet a 83-sóhoz hasonló körülmények között szintetizáltunk (33. ábra), a 86 és a 87 észterszármazékokat sikerült el állítani, amelyeket mindkét esetben a reakcióban keletkez NEt4Br-al együtt tudtuk izolálni. Et4O O
OEt4
N
N
O
N
száraz MeCN + 3 Br R'''
-NR'''4Br
RO O
O
N
OEt4
(13)
OR
O 85
OR
N
N
O R''' = -CH2C(O)OEt
86
O O
87
36. ábra Az 1,4,7-triaza-ciklononán 86 és 87 származékának el állítása 85-sóból kiindulva
A poliaza-makrociklusos észterszármazékok el állításánál eddig tapasztalt eredmények további módszerek kidolgozására késztettek bennünket. Korábbi megfigyeléseink alapján olyan funkcionalizált szilikagél el állítását t ztük ki célul, amely új makrociklusok (esetleg regioszelektíven szubsztituált származékok) szintézisét teszi lehet vé. Ezekben a reakciókban a szilikagélt vagy a i-Pr2NEt-t, helyettesít , heterogén fázisú bázisként, vagy reaktánsként kívántuk felhasználni. A kereskedelmi forgalomban elérhet különféle aminovegyületekkel módosított szilikagélek példája alapján, amelyeket az egyes reakciókban képz d reaktánsok illetve melléktermékek megkötésére használnak, a 37. ábrán megadott körülmények között, klór-propil-csoporttal módosított, trimetil-klór-szilánnal lezárt és dietanolaminnal funkcionalizált szilikagélt (SZ8) állítottunk el .
33
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
- (OH)
1, (CH3O)3Si(CH2) 3Cl
szilikagél - (OH) - (OH)
toluol, reflux, -MeOH
2, (CH3) 3SiCl toluol, reflux, -HCl
-O szilikagél - O
NH2(CH2CH2OH)2
Si(CH2) 3O(CH2) 3Cl
(14)
MeCN, reflux, -HCl
-O -O szilikagél -O
Si(CH2) 3O(CH2) 3NH(CH2CH2OH)2
-O SZ8
37. ábra Klór-propil csoporttal funkcionalizált, trimetil-szilánnal lezárt, majd dietanol-aminnal módosított szilikagél el állítása
Az el bbiekben el állított SZ8 szilikagél-bázist ciklén (4) és sztöchiometriai mennyiség (négy ekvivalens) 44 α-bróm-karbonsav-észter reakciójában alkalmaztuk (38. ábra, 15. egyenlet). A reakcióelegyb l száraz oszlopos vákuum kromatográfiás eljárással tisztán nyertük ki a reakció során nagyobb mennyiségben képz d 88 triszubsztituált ciklénszármazék hidrobromidját. O H
H
N
N
N
N
H
H
+ n Br
O O
4
44
O
reflux, -SZ8 szilikagél.HBr O
O O
MeCN, SZ8 szilikagél
O
n = 3 vagy 4
O O
O
N
N
O
N
N
O
O .HBr
(15)
H
O O 88
38. ábra Részlegesen szubsztituált, hidrolizáló észtercsoportot tartalmazó ciklén
A részlegesen szubsztituált termék keletkezésére való tekintettel a reakciót megismételtük három ekvivalens 44 α-bróm-karbonsav-észtert alkalmazva, és a várakozásnak megfelel en, a reakcióelegyben a f termék szintén a 88 triszubsztituált ciklénszármazék volt, azonban sokkal kisebb hozammal, mint az el z esetben. A hidrogénbromid tartalmat Volhard módszerével határoztuk meg. Az el z ekhez hasonló reakciókörülmények között 1,4,7-triaza-ciklononánt (3) sztöchiometriai mennyiség (három ekvivalens) 44 α-bróm-karbonsav-észterrel reagáltatva, majd a reakcióelegyet száraz oszlopos vákuum kromatográfiával 34
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
tisztítva az 1H NMR spektrumban a jel alatti területek egymáshoz viszonyított arányából számolva a 86 tri- és a 89 diszubsztituált 1,4,7-triaza-ciklononánszármazékok 3:2 arányú keverékét együttesen sikerült kinyerni (39. ábra). Ezt az eredményt a Maldi-TOF mérések is alátámasztották. A kétkomponens keverékben az egyes komponensek hidrogénbromid tartalmát, a komponensek arányának pontos ismerete hiányában, nem tudtuk meghatározni. H
N
N N H
H
+ 3 Br
MeCN, O SZ8 szilikagél
R'O x
O R' reflux, -SZ8 szilikagél.HBr
O
N
R' = CH2C(O)OEt 44
R'O + y
OR' O
3
OR'
N
N
86
O
OR'
N
N N
O
(16)
H .z
x:y = 3:2
HBr
89
39. ábra Részlegesen szubsztituált, hidrolizáló észtercsoportot tartalmazó 1,4,7-triaza-ciklononán származék el állítása
Az SZ8 szilikagél felhasználásával olyan új módszert találtunk, amellyel véd csoport használata nélkül, regioszelektíven szubsztituált poliaza-makrociklusos vegyületeket lehet el állítani. Ezzel az új módszerrel a regioszelektíven módosított származékok el állításához szükséges reakciólépések száma a véd csoportot alkalmazó szintézisekhez képest jelent sen lecsökken, az elreagált szilikagél könnyen eltávolítható a reakcióelegyb l, és semlegesítést követ en újra felhasználható.
3.2. Az el állított makrociklusos-észterszármazékok hidrolízisének vizsgálata Kémiai és enzimatikus hidrolízis Ahhoz, hogy a különböz hidrolizáló oldalláncok különböz körülmények között hidrolízissel szemben mutatott viselkedését megállapítsuk, és a lehetséges hidrolízistermékeket meghatározzuk, a hidrolízis vizsgálatokat nagyon savas (pH<1), közepesen savas (pH~3, megfelel a gyomorsavnak), fiziológiás (pH = 7,4) és nagyon bázikus (pH>12) körülmények között végeztük el. A hidrolízis folyamatát 1H NMR spektroszkópiai mérésekkel követtük nyomon, az egyes hidrolízis lépésekhez tartozó felezési id ket az 1H NMR spektrumban a kiindulási észterszármazék és hidrolízisterméke jel alatti területeinek egymáshoz viszonyított arányából számítottuk ki, a nagyon gyors lépések esetében megbecsültük. A hidrolízis vizsgálatokat néhány piperazin-származékon (50, 51, 54, 74, 84) hajtottuk végre, ugyanis a piperazin-származékok rendelkeznek a legegyszer bb 1 H NMR spektrummal, és kémiai szerkezetükb l adódóan a legegyszer bb kémiai viselkedéssel. A kísérleteket az 58 homopiperazin-, majd a 69 Kryptofix-22 35
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
származékokkal is elvégeztük, és a kapott eredményekkel megállapítottuk, hogy az oldalláncok hidrolízisének mechanizmusát és a hidrolízis sebességét a gy r mérete nem befolyásolja. A hidrolízis az elméletileg lehetséges útvonalat követve, de az alkalmazott körülményekt l és az oldallánc min ségét l függ en mehet végbe (40. ábra). b O R"" O N
O
O
N
R"" O c
a R"" = -Et -Bu
O
2 50 51
2
54 R"" = -CH2CF3 -CH2CH2OH 74 84 -CH2CN
40. ábra Néhány piperazin-észterszármazék hidrolízisének lehetséges lépései
Abban az esetben, ha a hidrolízis teljes mértékben lejátszódik, valamennyi származék esetében képz dik PIDA (80), továbbá a 50 és 51 származékok esetében a megfelel alkohol (etanol/butanol) és glikolsav, a 54 származék esetében a trifluor-etanol, a 74 észter esetében etilén-glikol és a 84 észterszármazék esetében hidroxi-acetonitril. Er sen savas körülmények között az 50 és 51 észterek meglehet sen gyorsan hidrolizálnak. A hidrolízis mindkét lehetséges úton („a” és „b”) végbemegy, azonban a „b” lépés, azaz a megfelel alkohol lehasadásának sebessége nagyon nagy, NMR techikával gyakorlatilag mérhetetlen. A hidrolíziselegy a megfelel alkohol (etanol/butanol), a 41. ábrán látható új típusú komplexképz (90) és a PIDA (80) különböz arányú keveréke. Az 54, 74 és 84 észterszármazékok pH<1 körülmények között a hidrolízissel szemben gyakorlatilag stabilisnak mondhatók. A 54 észterb l több napos, szobah mérsékleten történ kevertetés után is a trifluoretanol csak elhanyagolhatóan kis mennyiségben képz dik. A 84 esetében feltehet leg –CN→COOH átalakulás játszódik le, de rendkívül kis sebességgel. A legstabilisabbnak a 74 hidroxi-etil-származékot találtuk, amely a savas körülményeknek teljesen ellenállt.
36
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
C
A
C B glikolsav
B
butanol
A O
N
butanol
O
PIDA
OH
O
2
90 PIDA
5.0
4.5
4.0
3.5
PPM
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
1
41. ábra Az 51 butil-észter savas hidrolízise során kapott hidrolíziselegy H NMR spektruma (pH<1, 20°C, 10 perc)
Enyhén savas körülmények között (pH~3) valamennyi észterszármazék (50, 51, 54, 74, 84) stabilisnak mutatkozott, az 50 és 51 esetében is csak néhány órás hidrolízis után tudtuk kimutatni el ször a megfelel alkohol képz dését. Lúgos körülmények között egyik észter sem mondható stabilisnak, a hidrolízis mindegyik észterszármazék (50, 51, 54, 74, 84) esetében teljes mértékben végbement. A hidrolíziselegyben az 50 és 51 esetében a PIDA-dinátrium sója, nátrium-glikolát és a megfelel alkohol (etil/butil) (42. ábra), míg a többi származék esetében nátrium-glikolát kivételével a PIDA-dinátrium sója mellett trifluor-etanol (54 esetében), etilén-glikol (74 esetében) és hidroxi-acetonitril (84 esetében) keletkezett. O O HO
NaO N
A
ONa
N ONa
A
butanol
O B
butanol
B
4.0
3.5
3.0
PPM
2.5
2.0
1.5
1.0
1
42. ábra Az 51 butil-észter lúgos hidrolízise során kapott reakcióelegy H NMR spektruma; (pH ~12, 20°C, 5 perc)
Fiziológiás körülmények között (pH=7,4, 36 °C-os) az 50, 51, 54, 74 származékok nagy stabilitást mutattak, az 1H NMR spektrumok alapján a hidrolízis felezési ideje nagyobb volt, mint 1 hét. A 84 ciano-metil észter esetében a hidrolízis 37
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
sokkal gyorsabban ment végbe, a hidrolízis felezési ideje 2-3 óra volt. A reakcióelegyben diészter, részlegesen csak az egyik oldalláncban hidrolizált monoészter, valamint hidroxi-acetonitril képz dött. Enzimatikus hidrolízis Fiziológiás körülmények között, sertésmáj észteráz enzim jelenlétében valamennyi észter hidrolízisének sebessége javult az észteráz enzim jelenléte nélkül történ hidrolízis vizsgálathoz képest. Ez azt igazolta, hogy az alkalmazott D2O-tartalmú oldatban az enzim meg rizte az aktivitását. Az 50 és 51 észterek esetében a hidrolízis sebessége a 40. ábrán jelzett „b” úton sokkal jelent sebb volt, mint az „a” mentén. Az NMR spektrumok a már korábban említett 90 komplexképz jelenlétére utaltak (43. ábra). Az 50, 51 észterek enzimatikus hidrolízisének felezési ideje 3-4 óra volt, amit az el állított valamennyi észterszármazék közül, a szervezetbe történ adminisztráció szempontjából a legel nyösebbnek tekintettünk.
C C B
A O
A
N O O
51 észter PIDA
4.0
2
90
B
4.5
OH
51 észter
3.5
3.0
PPM
2.5
2.0
1.5
1.0
43. ábra Az 51 butil-észter enzimatikus hidrolízise során kapott bepárlási maradék 1H NMR spektruma
A 74 hidroxi-etil-észter hidrolízisét az észteráz enzim sokkal kisebb mértékben katalizálja, a felezési id nagyobb, mint 16 óra. A 84 ciano-metilészter hidrolízisének a felezési ideje a legrövidebb, kb. 45 perc. A különböz körülmények között meghatározott hidrolízis felezési idejét az 5. táblázatban tüntettük fel.
38
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
5. táblázat Néhány, hidrolizáló oldalláncot tartalmazó piperazin-származék 1H NMR spektrum alapján megbecsült, különböz körülmények között mért hidrolízisének felezési ideje (τ1/2)
Közeg
50
51
54
74
84
pH = 7,4; 36°C, enzimmel pH = 7,4; 36°C, enzim nélkül pH ~ 3; 25 °C pH < 1; 25 °C
b, a τ1/2≈3-4 h b τ1/2> 1 hét stabilis
(nincs eredmény)
τ1/2≈45 min
τ1/2≥ 16 h
τ1/2> 1 hét
nagyon lassú
τ1/2≈2-3 h
stabilis
stabilis
stabilis
stabilis
stabilis
stabilis
pH > 12; 25 °C
a+b τ1/2<10 sec
b, a τ1/2≈3-4 h b τ1/2> 1 hét stabilis b, a τ1/2≈20 min a+b τ1/2<10 sec
τ1/2<1 min
τ1/2<10 sec
τ1/2<10 sec
b, a
A kémiai hidrolízisvizsgálatok eredményei alapján - figyelembe véve az egyes hidrolízistermékek toxicitását, valamint a fiziológiás körülmények között végbemen hidrolízisek sebességét (5. táblázat) - az etoxi-/ és butoxi-karbonil-metilacetát oldalláncok elegend en nagy stabilitást mutattak a spontán hidrolízissel szemben. Az él szervezetben is el forduló izolált sertésmáj észteráz enzimmel végzett enzimatikus hidrolízis vizsgálatok alapján, pedig a célfelhasználás szempontjából elfogadható id n belül a gy r s diaminok jól ismert komplexképz származékává hidrolizáltak. Az oldalláncok valódi, az észteráz enzimben gazdag májszövetekkel szemben mutatott viselkedésének megállapítására újabb kísérleteket végeztünk. Ezekhez a vizsgálatokhoz a Kryptofix-22 etoxi-/ és butoxi-karbonil-metil-acetát oldalláncot tartalmazó észtereit (68, 69) használtuk, amelyekr l az el zetes vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy a különböz létfontosságú és toxikus fémionokra nézve szelektív komplexképz tulajdonsággal rendelkez ODDA-vá (26) hidrolizálnak.
Májszuszpenziós és májszeleteken történ vizsgálatok Az in vitro körülmények között történ hidrolízis folyamatokat, valamint a hidrolizáló észterszármazék sejtekbe történ bejutását májhomogenizátumon és májszeleteken tanulmányoztuk. A májszeleteken történ vizsgálatokat az irodalomban is elterjedten használják egyes gyógyszerek májban történ metabolizmusának vizsgálatára.151 A vizsgálatokhoz már a toxikus fémionok megkötésére kiválóan alkalmas 68 és a 69 Kryptofix-22 származékokat használtuk. A kémiai hidrolízisvizsgálatok alapján a 68 és 69 vegyületek teljes hidrolízisének lehetséges termékei az ODDA (26), a glikolsav és a megfelel alkohol: 68 esetében etanol, 69 esetében n-butanol. Májszuszpenzió A májszuszpenziós vizsgálatok során tanulmányoztuk a májban lév , roncsolás útján felszabadult enzimeknek az észterszármazékok hidrolízisére gyakorolt hatását. A májszuszpenzió egy részét üresen (észtermentesen), egy részét pedig a vizsgált észterszármazékkal fiziológiás h mérsékleten (36 °C) kezeltük. A tiszta májszuszpenzió 1H NMR spektrumának meghatározására azért volt szükség, hogy a májszuszpenzióban vizsgált észterek és 39
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
hidrolízistermékeik rezonancia jelei megkülönböztethet k legyenek a májban el forduló szerves összetev kt l, pl. zsírsavaktól. A 44. ábra jól mutatja a sertésmájban lév enzimeknek a 69 észter hidrolízisére gyakorolt katalitikus hatását, igazolva az izolált sertésmáj észteráz enzimmel végzett kísérleti eredményeket.
d c
b
#
#
*
*
*
a 4.00 ppm (t1)
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
44. ábra Májszupenzió hatása a 69 butil-észter hidrolízisére (pH = 7,4 és 36 °C). 1H NMR spektrum: a, üres májszuszpenzió; b, májszuszpenzióhoz adott 69 - # a még elhidrolizálatlan 69 jelenléte, * a nbutanol jelenléte; c, szabad n-butanol; d, szabad 69
Az észtert tartalmazó májszuszpenzióban néhány óra elteltével szinte teljessé vált az n-butanol lehasadása, kevés elhidrolizálatlan 69 észter jelenlétére a butilcsoportjának kis intenzitású jelei utaltak. A két nitrogénatomhoz kapcsolódó oldallánc hidrolízise eltér sebességgel ment végbe, amelyet a 2,9 ppm kémiai eltolódásnál jelentkez diaza-koronaéter gy r jelének felhasadása jelzett. A kémiai hidrolízis vizsgálatok során kapott eredményeket igazolták a 68 etilészterrel végzett vizsgálatok is, néhány óra elteltével szinte teljessé vált az etanol felszabadulása, a diaza-koronaéter gy r jének szimmetrikus jele azonban nem hasadt fel, ami azt bizonyítja, hogy a hidrolízis mindkét oldalláncban hasonló sebességgel ment végbe (45. ábra).
40
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
d c b
*
#
a 4.00 ppm (t1)
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
45. ábra Májszuszpenzió hatása a 68 etil-észter hidrolízisére (pH = 7,4 és 36 °C). 1H NMR spektrum: a, üres májszuszpenzió; b, májszuszpenzióhoz adott 68 - # a még elhidrolizálatlan 68 jelenléte, * etanol hidrolízistermék jelenléte; c, szabad etanol; d, szabad 68.
A kísérleteket az 50 és 51 piperazin-származékokkal is elvégeztük. A máj roncsolása útján feltárt enzimek hatására a Kryptofix-22 származékhoz hasonlóan, a megfelel alkohol lehasadása következett be, valamivel rövidebb, de az el z vel összevethet id alatt. Ezek a kísérletek igazolták azt az el zetesen tett megállapításunkat, miszerint a gy r mérete nem befolyásolja számottev en az oldallánc hidrolízisének mechanizmusát. Májszeletek A kísérlet célja a 69 észterszármazék illetve hidrolízisterméke, az ODDA (26) él szövetekbe történ bejutásának vizsgálata volt. A májszeletek egy részét üresen (észtermentesen), másik részét a vizsgált észterszármazékkal a sejtek életbentartásához fontos ionokat tartalmazó Hank-pufferben, karbogén (95% O2, 5% CO2) gázzal telített atmoszférában vizsgáltuk. Ilyen körülmények között a májszövetek elhalása kb. 30 perc elteltével indult meg. A nekrózist az 1H NMR spektrumban 1,30 ppm-nél megjelen dublett intenzitásának növekedéséb l lehetett megállapítani. A 46. ábrán látható, hogy a 69 butil-észter jelei megjelentek az elroncsolt májszeletek 1H NMR spektrumában, ami azt igazolja, hogy a 69 butilészter elhidrolizálatlan formában bejutott az él májszövetekbe. Ugyanakkor az 1,65 ppm-nél megjelen n-butanolra utaló rezonancia jelek azt mutatják, hogy a májban lév enzimek hatására megindult a szövetekbe jutott észter hidrolízise (46. ábra, b, spektrum).
41
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
e
d c
# b
# *
#
a 4.00 ppm (t1)
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
46. ábra A 69 butil-észter viselkedése májszeletekkel (pH = 7,4 és 36 °C). 1H NMR spektrum: a, üres májszelet; b, májszelethez adott 69 - # a még elhidrolizálatlan 69, * a n-butanol hidrolízistermék; c, szabad n-butanol; d, szabad 69; e, 69 kálcium-komplexe
Annak bizonyítására, hogy a lipofil észtercsoport el segíti a makrociklus él szövetekbe történ felvételét, a 69 teljes hidrolízise során kapott ODDA (26) májszövetekbe való bejutásának képességét is megvizsgáltuk. Az eredmények azt igazolták, hogy a 69 butil-észterhez hasonlóan az ODDA is bejutott a szövetekbe, azonban attól sokkal kisebb hatékonysággal. Mindemellett a 47. ábra b, spektrumán látható, hogy a 26 származék kálcium-komplexként van jelen, amely feltehet leg már a Hank-pufferben képz dött, és ilyen formában szívódott fel. A 26-tal ellentétben a 69-butil-észter szabad formában jutott a szövetekbe. Ez a tény a kutatás kés bbi fázisában az állatkísérletek során megkövetelheti, hogy a 69 szervezetbe történ beadásával együtt cink- illetve kálciumionokat kell bejuttatni, hogy a hidrolízis során felszabaduló 26 ODDA ne csökkentse az említett létfontosságú ionok szervezetben szükséges mennyiségét.
42
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
d c
b
* *
a
ppm (t1)
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
47. ábra ODDA (26) viselkedése májszeletekkel (pH = 7,4 , 36 °C). 1H NMR spektrum: a, üres májszelet; b, májszelethez adott 26 , * 26 kálcium-komplex jelenléte; c, szabad 26; d, 26 kálciumkomplex;
A májszeletekkel történ vizsgálatot a 69 etil-észter esetében nem végeztük el, mivel az azt megel z valamennyi egyéb hidrolízis vizsgálat az etil-észternek a butil-észterrel megegyez viselkedését igazolta. Összefoglalóan megállapíthatjuk, hogy munkánk els részében sikerült olyan hidrolizáló észtercsoportokat tartalmazó makrociklusos vegyületeket el állítanunk, amelyek hidrolízis felezési ideje, valamint in vitro májszövetekkel végzett hidrolízis és permeációs vizsgálatai alapján, lipofil észtercsoportjaiknak köszönhet en képesek bejutni az él szövetekbe. A szöveteken belül enzimek hatására bekövetkez hidrolízis útján, a fémionok szelektív megkötésére alkalmas komplexképz vé, az ODDA-vá (26) alakulnak át, és ezáltal potenciális jelöltnek tekinthet k bizonyos toxikus fémionok él szervezetb l történ kiürítésének meggyorsítására. Az in vitro hidrolízis vizsgálatok természetesen nem elegend ek ahhoz, hogy a szervezetbe juttatott észterszármazékok szervezetre gyakorolt hatását megállapítsuk. Ehhez további állatkísérletekre van szükség.
43
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
3.3. Oldalláncban peptidkötést molekulák el állítása
tartalmazó
makrociklusos
Az irodalmi bevezet ben láthattuk, hogy az orvosdiagnosztika számos területén alkalmaznak oldalláncban peptidkötést tartalmazó makrociklusos vegyületeket Ezekben a vegyületekben az oldalláncban el forduló funkciós csoportok - peptid, karboxilát - hozzájárulnak az alap makrociklus gy r komplexképz tulajdonságának javításához, el segítik a különböz ionokkal, guest molekulákkal kialakuló stabilis komplexek képz dését. Munkánk során kétféle, peptidkötést tartalmazó oldallánccal, az N-acetilamino-ecetsav és az N-propionil-amino-ecetsav oldalláncokkal foglalkoztunk, amelyeket a megfelel bróm-származék-benzil-észter makrociklusos vegyülethez történ kapcsolásával, majd a benzilcsoport eltávolításával állítottunk el . Az orvosdiagnosztikában történ alkalmazhatóság megvizsgálása mellett, els sorban a kiralitásközponttal rendelkez N-propionil-amino-ecetsav oldalláncot tartalmazó racém és enantiomertiszta származékokkal a célunk az volt, hogy megvizsgáljuk a kiralitásközpont komplexképzésre gyakorolt hatását, valamint, hogy ezeket a vegyületeket akár a CE, akár a HPLC területén optikai izomerek elválasztására felhasználhassuk.
3.3.1. Peptidkötést tartalmazó oldalláncok el állítása A szintézis több lépéses reakciósorozat eredményeként valósítható meg. Els lépésben az amino-ecetsav-benzil-észter p-toluolszulfonsav sót (91) állítottuk el Zervas és társai152 leírása alapján, kisebb módosításokat alkalmazva glicinb l, benzil-alkoholból és p-toluolszulfonsavból kiindulva, majd a 91 lúgos közegben történ hidrolízisével felszabadítottuk az amino-ecetsav-benzil-észtert (92) (48. ábra). A 92-t a transzamidáción keresztül lejátszódó polimerizáció elkerülése miatt, további felhasználáshoz azonnal oldottuk vízmentes diklór-metánban, alacsony h mérsékleten tartottuk, és a lehet legrövidebb id n belül felhasználtuk.
44
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
H2N
COOH +
OH
+ p-CH3C6H4SO3H . H2O
O
toluol -H2O
H2N
. p-CH3C6H4SO3H
O
91 Na2CO3-oldat extrakció, 0 0C
(17)
O H2N
O
92
48. ábra Glicin-benzil-észter (92) el állítása
A következ lépésben a glicin-benzil-észtert (92) a megfelel savbromiddal illetve savkloriddal reagáltattuk, amely reakcióban a kilép hidrogénklorid megkötésére magát a 92-t használtuk. (49. ábra) O O Br
Br
Br Br H3C
2 NH2CH2COOBn
rac-93
92 Br
H O
Br H3C
N H
rac- 95 O
H O
H3C Cl S-93
OBn O
94
H O Cl
+ NH2CH2COOBn . HCl
N H
Br H3C
OBn
+ NH2CH2COOBn . HCl
(18)
H O N H
OBn
+ NH2CH2COOBn . HCl
S-95 O
49. ábra α-bróm-acetil-glicin-benzil-észter (S-93) és a (2-bróm-propionil-amino)-ecetsav benzil-észter (rac-95, S-95) el állítása vízmentes diklór-metánban, -80 °C-on
A racém rac-93, illetve az enantiomertiszta S-93 savklorid el állításához a megfelel bróm-propionsavat katalitikus mennyiség PCl3 jelenlétében tionilkloriddal reagáltattuk az 50. ábrán közölt reakciókörülmények között, majd a tiszta terméket vákuumdesztillációval tisztítottuk. 45
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
Br
H
O
H3C
OH
+ SOCl2
kat. PCl3
H
O
H3C *
Cl
Br
-SO2; - HCl
(19)
S-93
50 ábra (S)-(-)-bróm-propionil-klorid el állítása
3.3.2. N-(2-bróm-acetil-amino)-ecetsav származékok el állítása
oldalláncot
tartalmazó
A 94 benzil-észtert sztöchiometriai mennyiség gy r s poliaminnal reagáltattuk az 51. ábrán szerepl körülmények között. A terméket szilárd (96, 97, 100) vagy olajos (98, 99) formában nyertük ki. Az 96, 97, 100 származékokat sikerült tisztán izolálni, azonban a 98 és 99 vegyületek a reakcióban keletkez i-Pr2NEt.HBr egy részét komplexbe kötötték, amelyet egyszer módszerekkel nem, oszlopkromatográfiás tisztítást alkalmazva részben el tudtunk távolítani. O HN
NH + 2 Br
száraz MeCN, i-Pr2NEt, reflux
N H
n
-i-Pr2NEt.HBr
OBn O
n=0 1 n=1 2
O
O BnO
N
N H
H N
N
O
n
O
n = 0 96 n = 1 97 OBn
94
OBn
(a)
O HN H
H
N
N
N
O
H
N H
+ X Br n
n=0 3 n=1 4
HN + 2 Br
NH O
O
-i-Pr2NEt.HBr BnO
száraz MeCN, i-Pr2NEt, reflux
N H O 94
O
O
n=0 X=3 n=1 X=4
94
O 6
OBn
O
O
O
száraz MeCN, i-Pr2NEt, reflux
N H
H N
N
N
N
N
N H
N H
O
O OBn O N
O
(b)
NH
O
N
(20)
n
O
O
OBn
O
n = 0 98 n = 1 99
O
OBn -i-Pr2NEt.HBr BnO
O
O
H N
O 100
51. ábra N-(2-bróm-acetil-amino)-ecetsav-benzil-észter kapcsolása különböz méret gy r s poliaminokhoz
46
OBn (c) O
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
A benzil véd csoportot valamennyi származék (96-100) esetében katalitikus hidrogénezéssel távolítottuk el (52. ábra), amely eljárás sokkal egyszer bb és kíméletesebb az irodalomban a 99 ciklén-származék el állítására alkalmazott lúgos hidrolízisnél.54,55.
96 97
MeOH, kat. Pd/C, H2 szobahõm.
O
O HO
N
N H
O
H N
N
OH
(a)
O
n n = 0 101 n = 1 102
OH O HN
98 99
MeOH, kat. Pd/C, H2
O
szobahõm. HO O
100
MeOH, kat. Pd/C, H2 szobahõm.
N
N
N
N H
O
NH O OH O
O N
O
(21) (b)
n
n = 0 103 n = 1 104
N
OH
O
O
O
O
H N
N N H
O HO
O
H N
O
OH
(c)
O
105
52. ábra N-(2-bróm-acetil-amino)-ecetsav oldalláncot tartalmazó származékok el állítása katalitikus hidrogénezéssel
3.3.3. N-(2-propionil-amino)-ecetsav koronaéter származékok el állítása
oldalláncot
tartalmazó
diaza-
Ezzel az oldallánccal kizárólag a Krypofix-22 származékokat állítottuk el , mert gy r méreténél fogva ez a diaza-koronaéter származék lehet alkalmas a különböz optikai izomerek kromatográfiás elválasztására. El állítottuk a diaza-koronaéternek mind a mono-, mind a diszubsztituált származékát.
47
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
N-(2-propionil-amino)ecetsav-benzil-észter oldalláncokat tartalmazó monoszubsztituált Kryptofix-22 származékok el állítása A rac-95 és S-95 benzil-észtereket acetonitriles közegben reagáltattuk Kryptofix-22 szabad bázissal (6), ahogyan azt az 53. ábra is mutatja. Az oldallánc kapcsolása során a nukleofil szubsztitúció a királis szénatom részvételével ment végbe, egy inverziót követ en az S-enantiomer oldallánc kapcsolásával a kiralitáscentrumon R-konfiguráció alakult ki. A királis szénatomon található metil csoport jelenléte az oldallánc kapcsolódását sztérikusan gátolttá teszi, amelyet a meglehet sen hosszú reakcióid , illetve a diszubsztituált termék mellett, jelent sebb mennyiség monoszubsztituált származék keletkezése is igazol. A tiszta diszubsztituált terméket a melléktermékként keletkezett monoszubsztituált származék, valamint az elreagálatlan Kryptofix-22 kiindulási szabad bázis mell l oszlopkromatográfiás tisztítási eljárással választottuk el. O
O HN + 2
NH O
O
Br
H
H3C
O HN
NH O
O 6
N H O rac-95
6 O
száraz MeCN, i-Pr2NEt, reflux
O
+2
Br H3C
H
OBn
száraz MeCN, i-Pr2NEt, reflux
N H O
O
N H H
O N
N CH3 O
CH3 H H N
O OBn (22)
O
O
rac- 106
O
S-95
-i-Pr2NEt.HBr
O
O BnO
OBn
-i-Pr2NEt.HBr
O
O BnO O
N H H
O N
N CH3 O
O
CH3 H H N
O OBn
(23)
O
R,R-106
53. ábra N-(2-bróm-propionil-amino)-ecetsav-benzil-észter oldalláncot tartalmazó származék racém elegyének (22. egyenlet) és R,R-enantiomerjének (23. egyenlet) el állítása
Mind a rac-106 és az R,R-106 benzil-észterek esetében az 1H-NMR spektrumok két különböz szerkezet molekula jelenlétére utaltak (54. ábra), amelyek a peptidkötésben résztvev -NH csoportok kémiai eltolódásában, valamint az azokhoz kapcsolódó -CH2 csoportok jeleinek felhasadásában térnek el egymástól. Többnyire együttesen fordulnak el , oldékonyságbeli különbségük alapján azonban sikerült azokat tisztán is izolálnunk. Az R,R-enantiomer esetében a kisebb oldékonyságú I. szerkezeti izomer egy része már a reakcióelegyb l kivált. Ugyancsak a két szerkezeti izomer elválasztását eredményezte az acetonitrilben oldott, lassan párlódó mintából történ kristálykiválás, amely ebben az esetben is az I. szerkezettel rendelkezett, míg a II. izomert a visszamaradt oldatból lehetett kinyerni, közel 95 %os tisztasággal.
48
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
II. izomer
I. izomer
I. + II. izomer
ppm (t1)
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
54. ábra N-(2-bróm-propionil-amino)-ecetsav-benzil-észter oldalláncot tartalmazó Kryptofix-22 származék különböz szerkezeti izomerjeinek 1H NMR spektruma
Az 1H-1H COSY spektrumokon jól látható az I. és II. izomerekben el forduló -NHCH2- protonok közötti csatolás, illetve a -CH2 protonok jelfelhasadásában mutatkozó különbség (55. ábra).
2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (f1) 8.0 ppm (f2)
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
55a. ábra Az I. szerkezeti izomer 1H-1H COSY NMR spektruma
49
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1) 8.0 ppm (t2)
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
55b. ábra A II. szerkezeti izomer 1H-1H COSY NMR spektruma
A tiszta I. izomer tömény oldatából sikerült röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálatra alkalmas egykristályt is növeszteni. A molekula kristályszerkezete (56. ábra) alapján ebben a formában a C=O és N-H kötések egymáshoz képest transz-térállásban helyezkednek el. A két oldallánc a makrociklus gy r síkja felett és alatt található úgy, hogy a peptidkötés amid-hidrogénje mindkét esetben a gy r síkja felé orientálódik, hidrogénkötés kialakítására törekedve, a gy r -oxigén és az amid-hidrogén közötti kötéstávolság 2,4 Å. Az II., azaz a ciszizomerb l nem sikerült egykristályt növeszteni.
56. ábra A transz-szerkezeti izomer röntgendiffrakciós szerkezete
50
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
A két szerkezet a peptidkötés gátolt rotációja miatt alakul ki, azt a –C=O és –N-H kötések egymáshoz viszonyított térállása határozza meg (57. ábra). O
O N
H
N H transz-
cisz-
57. ábra A C=O és N-H kötések relatív helyzete alapján kialakuló cisz- és transz-izomerek szerkezete
A két izomer szerkezete közötti különbség az infravörös spektrumaikban is megfigyelhet . Az -NH vegyértékrezgési sáv a transz-izomer esetében 3335 nm-nél jelentkezik, a cisz-izomer esetében pedig 3340 és 3290 nm-es tartományban, amely feltehet leg hidrogénkötések által kialakult asszociáció következtében felhasadást is mutat. Az amidokra jellemz két amid csoportrezgési sáv eltér intenzitással jelentkezik a cisz- illetve a transz-izomer esetében, 1660-1760 nm tartományban (58. ábra). 100.0
80
60 %T 40
Amid csoportrezgések 20
NH vegyértékrezgés
3.2 4000.0
3000
2000
cm-1
1500
1000
400.0
1500
1000
400.0
(a) 100.0
80
60 %T 40
Amid csoportrezgések 20
NH vegyértékrezgés
3.2 4000.0
3000
2000
cm-1
(b) 58. ábra A (a) transz- és a (b) cisz-izomerek IR spektrumai
Akár a rac-106, akár az R,R-106 származékok cisz-, transz- vagy vegyes cisz- és transz- izomerjeit katalitikusan hidrogénezzük, NMR spektroszkópiai tulajdonságaikban teljesen megegyez származékokhoz (rac-107, 51
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
R,R-107) jutunk (59. ábra). Az NMR spektrumok jellegét, az egyes csoportokhoz tatozó jelek felhasadását és kémiai eltolódását, az oldat pH-ja határozza meg.
rac- 106
MeOH, kat. Pd/C, H2
O
O HO
szobahõm.
O
N H H
O N
N CH3 O
CH3 H H N
O OH
(24)
O
O
rac- 107
R,R- 106
MeOH, kat. Pd/C, H2 szobahõm.
O
O HO O
N H H
O N
N CH3 O
O
CH3 H H N
O OH
(25)
O
R,R- 107
59. ábra A racém és az enantiomertiszta, N-(2-propionil-amino)-ecetsav oldalláncot tartalmazó származékok el állítása
N-(2-propionil-amino)ecetsav-benzil-észter oldalláncokat tartalmazó monoszubsztituált Kryptofix-22 származékok el állítása Részlegesen szubsztituált származékok el állításával többszörös célunk volt. Részben a vegyület szubsztituálatlan nitrogénatomján keresztül alkalmas szilárd állófázishoz, pl. szilikagélhez történ kapcsoláshoz, ezáltal kromatográfiás elválasztástechnikai vizsgálatokhoz, másrészt egyéb funkciós csoportokkal szubsztituálható, ezáltal komplexkémiai tulajdonsága a kapcsolt oldallánc tulajdonságának megfelel en változtatható. A részlegesen szubsztituált származék el állítását kétféle módon valósítottuk meg, az egyik nitrogénatomján tritil véd csoporttal védett Kryptofix-22-b l kiindulva, illetve a kiindulási diaza-koronaéter nagy feleslegben történ alkalmazásával. Kryptofix-22 és tritil-klorid 2:1 mólarányú keverékéb l kiindulva a monotritil-Kryptofix-22 származékot állítottuk el (60. ábra). A monoszubsztituált termék keletkezését a tritil-klorid lassú adagolásával, illetve a Kryptofix-22 feleslegben történ alkalmazásával segítettük el . A reakcióban kilép hidrogénklorid megkötésére a Kryptofix-22 szabad bázist használtuk. Ilyen körülmények között túlnyomó részben monoszubsztituált származék keletkezett, amit a reagensek maradékától illetve a melléktermékként keletkez diszubsztituált ditritil-Kryptofix-22-t l oszlopkromatográfiás módszerrel választottunk el. A savra érzékeny tritil véd csoport lehasadásának elkerülésére az elválasztáshoz nem hagyományos, Ca2+-ionokkal kezelt, hanem Na2CO3-oldattal impregnált szilikagélt alkalmaztunk. 52
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
O
O 2
HN
NH O
+ ClPh3
CH2Cl2 - [22] .HCl
O 6
O
O N CPh3
NH O
(26)
O 108
60. ábra Kryptofix-22-monotritil származék el állítása
A 108 monotritil-származékot a 61. ábrán megadott körülmények között reagáltattuk az S-95 benzil-észterrel, majd a tritil és a benzil-véd csoportot katalitikus hidrogénezéssel távolítottuk el. O
O HN
Ph3C N O
O 108
+
Br H3C
száraz MeCN, i -Pr2NEt, reflux
H O N H
OBn - i -Pr2NEt.HBr O
O
O
N
Ph3C N O
S-95
CH3 H H N
O OBn
O
O 109
MeOH, kat. Pd/C, H2 szobahõm. O
O N
NH O
O
CH3 H H N
(27)
O OH
O
R- 110
61. ábra S-(-)-(2-bróm-propionil-amino)-ecetsav-benzil-észter kapcsolása monotritil- Kryptofix-22höz, majd a véd csoportok eltávolítása
Monoszubsztituált termék keletkezésének irányába segítjük a reakciót abban az esetben, ha a Kryptofix-22 kiindulási szabad bázist a kapcsolni kívánt oldallánc bróm-származékához képest feleslegben, esetünkben 2:1 mólarányban alkalmazzuk, az oldalláncot lassan adagoljuk, és kerüljük a reakcióelegy melegítését. A reakcióban keletkez hidrogénbromid megkötésére a kiindulási Kryptofix-22 szabad bázis feleslegét használtuk (62. ábra).
53
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
O
O N
NH O
S-95
HN
2 NH O
O 6
O
O OBn
O
O rac- 95
N O
O
N O
CH3 H H N
O OH
O
O
MeOH, R-110 kat. Pd/C, H2 szobahõm.
O
NH
O
NH
O
R-111 száraz MeCN, szobahõm. -[22] .HBr
O
O
CH3 H H N
CH3 H H N
O
O OBn
(28)
O N
NH
O
O
rac- 111
CH3 H H N
O OH
O
O
rac- 110
62. ábra Racém illetve S-(-)-(2-bróm-propionil-amino)-ecetsav-benzil-észter kapcsolása Kryptofix-22 szabad bázishoz, majd a benzil véd csoport eltávolítása
A monoszubsztituált termék mellet kis mennyiségben diszubsztituált termék is képz dött, amelyt l a monoszubsztituált terméket száraz oszlopos vákuum kromatográfiával választottuk el. Az elválasztást legjobb hatásfokkal metanol tartalmú eluenset használva értük el, a termék benzil-észter azonban metanol hatására részlegesen metil-észterré alakult. Az átalakulás 1 nap alatt szobah mérsékleten 40 %-os hatásfokkal ment végbe (63. ábra). O
O N
NH O
CH3 H H N
O OBn
MeOH
O
O
N O
O
rac- 111
N
CH3 H H N
O OMe
O
O
R- 112
O
NH
O
NH O
R- 111 O
O
CH3 H H N O
O OBn
MeOH
O
(29)
O N
NH O
O
CH3 H H N
O OMe
O
rac- 112
63. ábra Benzil-észter – metil-észter átalakulási folyamat
A folyamat megakadályozható, ha a metanolos frakciókat alacsony h mérsékleten tartjuk, illetve az oldószert a lehet leggyorsabban alacsony h fokon kidesztilláljuk. Az alkalmazott körülmények között, az R-112 és rac-112 metil-észterek az R-111 és 54
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
rac-111 benzil-észterekt l vékonyrétegkromatográfiás eljárással nem különböztethet k meg, oszlopkromatográfiásan nem választhatók el. A katalitikus hidrogénezés során szintén bekövetkezhet a benzil-észter átészteresedése, ezért a metanolt próbáltuk más poláris oldószerre lecserélni, pl. víz, de ezáltal a hidrogénezés hatásfoka jelent sen lecsökkent. A metil-észterek (R-112, rac-112) a katalitikus hidrogénezés során keletkez R-110 és rac-110 karbonsavszármazékoktól már vékonyrétegkromatográfiásan megkülönböztethet k, és oszlopkromatográfiás eljárással elválaszthatók. A rac-106 és R,R-106 diszubsztituált Kryptofix-22-származékokkal ellentétben, az R-111, rac-111, R-112 és rac-112 monoszubszitutált származékok esetében csak a cisz-izomer keletkezett, ami jól látható, pl. az R-111 származék 1H-1H COSY spektrumán, a peptidkötés amidcsoportjához kapcsolódó metiléncsoport protonjainak felhasadásán (64. ábra).
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0(f1) ppm 8.0 ppm (f2)
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
64. ábra A R-111 monoszubsztituált Kryptofix-22-származék 1H-1H COSY NMR spektruma
55
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
3.4. Oldalláncban peptidkötést tartalmazó makrociklusos molekulák komplexképz tulajdonságainak vizsgálata Ahhoz, hogy a molekulák biológiai vagy analitikai felhasználhatóságát vizsgáljuk, elengedhetetlen a komplexképz sajátságaiknak, így a protonálódási állandók és biológiai szempontból érdekes fémkomplexeik stabilitási állandóinak tanulmányozása. A vegyületek protonálódási állandóit két módszerrel határoztuk meg, NMR titrálással, illetve pH-potenciometriás mérésekkel. Az NMR titrálással kapott adatok és a pH-potenciometriás mérések eredményei egymást teljes mértékben alátámasztották. A protonálódási állandókat a 2., a fémkomplexek stabilitási és protonálódási állandóit a 3-4. egyenlet szerint definiáljuk:
[ H i L]
Ki H =
[ H i −1 L][ H + ]
K MH i L =
K ML =
[ MH i L] [ MH i −1 L][ H + ]
[ ML] [ M ][ L]
2. egyenlet
3. egyenlet
4. egyenlet
Az NMR titrálás során a vegyületek protonálódási folyamatainak helyét és a protonálódási állandóit állapítottuk meg. Az oldatok pH-ját 1-13 között változtatva vizsgáltuk az egyes rezonancia jelekhez tartozó kémiai eltolódások értékét. A protonálódási állandó meghatározásához az 5. egyenletet használtuk. Az egyenletet egy protonálódási lépcs höz tartozó rezonanciajelek valamennyi adatpontjához illesztettük. i
δA + δ=
n i =1
δ H i A ⋅ 10 i
1+
n
10
log K j −i ⋅ pH
j =1
5. egyenlet log K j − i ⋅ pH
j =1
i =1
Az 5. egyenlet egyidej leg csak egy protonálódási egyensúlyhoz tartozó kémiai eltolódások tulajdonságának a leírására alkalmas. Egynél több protonálódási lépcs csak abban az esetben vizsgálható, ha azok egymástól jól elkülönülnek. Ha a protonálódási lépcs k egymáshoz túl közel helyezkednek el, akkor az egyes 56
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
atomcsoportokhoz tartozó kémiai eltolódások valamennyi protonálódási egyensúlyra érzékenyek, ezáltal a számítás téves eredményekhez vezethet.
1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(acetil-aminoecetsav)(105, ODDAGly) 1H NMR titrálással két protonálódási folyamat volt meghatározható (65. ábra). Az els a makrociklusgy r nitrogénatomjának protonálódásához tartozik. A gy r -nitrogénatomok protonálódása leginkább a hozzá kapcsolódó -CH2-csoportok kémiai eltolódásának változásával észlelhet 3,48,5 pH tartományban. A gy r valamennyi protonja érzékeli a gy r nitrogének protonálódását, de minél távolabb helyezkednek el a protonálódás helyét l, kémiai eltolódásuk annál kevésbé érzékeny a folyamatra. Legkevésbé érzékelik a protonálódás folyamatát a gy r (OCH2)2 protonok. A második folyamat a karboxilátcsoportok protonálódására utal, amelyet a karboxilátcsoporthoz kapcsolódó metiléncsoportok kémiai eltolódásának változása jelez 1,4 - 4,3 pH tartományon belül. 4,6 4,4
kémiai eltolódás /ppm
4,2 4
3,6
a b c
3,4
d
3,8
3,2
O
O HO
O
O N
N N H
O
H N
O
OH O
O
105
e
d
a
c
3 e
2,8
b
2,6 0
5
pH
10
65. ábra A 105 ODDAGly NMR titrálási görbéje (gy r -NCH2: ; glicin -CH2: ; gy r (OCH2)2: ; gy r OCH2: ; acetil CH2: )
A pH potenciometriás mérésekkel állandó ioner sség mellet négy protonálódási állandót lehetett meghatározni. A kapott két fels protonálódási állandó a gy r nitrogének protonálódását jellemzi, míg a két alsó protonálódási állandó a két karboxilátcsoport protonálódásának felel meg. A molekula szimmetriájából adódóan, az NMR titrálás során csak két protonálódási állandó megkülönböztetésére volt lehet ség. Ha figyelembe vesszük azt a tényt, hogy az ioner sség az NMR titrálás során meglehet sen alacsony volt és nem állandó, a kapott eredmények kiváló összhangban vannak a potenciometriás mérések eredményeivel. 57
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
6. táblázat Az ODDAGly (105), ODDA (26) és Kryptofix-22 (6) protonálódási állandói. (ODDAGly esetében 25°C, I = 1,0 M KNO3)
ODDAGly logK1 logK2 logK3 logK4
6,15 ± 0,013 (-) 5,49 ± 0,011 (5,47) 3,64 ± 0,015 (3,44) 3,11± 0,014 (-)
ODDA[a] 8,45 7,80 2,90 -
Kryptofix-22[b] 9,08 7,94 -
[a]
Ref.73, [b] Ref.153 Az NMR-titrálással meghatározott állandók zárójelben szerepelnek.
A 6. táblázatban látható, hogy a Kryptofix-22-höz (6) illetve az ODDA-hoz (26) képest is az acetil-amino-ecetsav oldalláncot tartalmazó származék gy r nitrogénjeinek protonálódási állandói kisebbek, karboxilátcsoportjainak protonálódási állandói kismértékben nagyobbak, ami a karboxilátcsoportok és a gy r nitrogének közötti nagyobb távolsággal magyarázható. Megvizsgáltuk a 105 vegyület különböz biológiai szempontból érdekes fémionnal mutatott komplexképz tulajdonságát. A fémkomplexek stabilitási állandóit a 7. táblázatban tüntettük fel. 7. táblázat Az ODDAGly (105), ODDA (26) és Kryptofix-22 (6) különböz fémionokkal képzett komplexeinek stabilitási állandói (ODDAGly esetében 25 ºC, I = 1,0 M KNO3)
Ca2+ Sr2+ Zn2+ Cd2+ Pb2+ [a]
ODDAGly logKML 5,39 5,18 2,64 7,98 9,76
ODDA[a] logKML 8,39 8,29 8,42 11,07 13,55
Kryptofix-22[b] logKML 3,87 3,1 2,65 5,28 6,8
Ref.38, [b] Ref.75
Az N-acetil-amino-ecetsav oldallánc jelenlétében a 105 ODDAGly fémkomplexeinek stabilitási állandói a szubsztituálatlan Kryptofix-22-höz képest nagyobbak, ami igazolja az oldallánc koordinációban való részvételét. A 26 bisz(karboxi-metil)-származékhoz képest mutatott kisebb stabilitási állandók a karboxilátcsoportok, és ezáltal azok negatív töltéseinek a gy r nitrogénekhez viszonyított nagyobb távolságával magyarázhatók. A kisebb stabilitási állandók ellenére a 105 ODDAGly ligandum kiemelked en nagy Pb2+/Zn2+ illetve Cd2+/Zn2+ szelektivitást mutat, sokkal nagyobbat, mint az ODDA. Ezek alapján az ODDAGly származék potenciálisan alkalmas lehet a szervezetbe jutott Pb2+- illetve Cd2+-ionok eltávolítására anélkül, hogy a létfontosságú Zn2+-ionok intracelluláris koncentrációját számottev en csökkentené. 58
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
1,4,7-triaza-ciklononán-1,4,7-trisz(acetil-amino-ecetsav)(103, NOTAGly) Az NMR titrálás során három, a protonálódásra érzékeny csoport jele különböztethet meg egymástól. (66. ábra). pH 8-13 tartományban a gy r -nitrogénatomok protonálódásának következtében a gy r metilén- és az acetil-protonok rezonancia jeleinek a kémiai eltolódása változik meg szignifikánsan, míg a glicinát-metilén rezonancia jelének kémiai eltolódását ez a folyamat nem befolyásolja. pH < 5 tartományban két protonálódási folyamat jelenlétére tudunk következtetni. A glicinát-metilén kémiai eltolódása megváltozik, ami a karboxilátcsoport protonálódására utal, illetve valamivel alacsonyabb pH értéken a gy r metilén- és az acetil-protonok kémiai eltolódása is jelent sen megváltozik, amely a gy r nitrogének további protonálódásával magyarázható. Látható, hogy pH 1-nél a folyamat még nem fejez dött be, így az utolsó protonálódási állandó csak jó közelítéssel határozható meg a titrálási görbéb l. 4,2
kémiai eltolódás / ppm
4 a
3,8
b
3,6
O HO
3,4
b
H N
N
N O
N
3
c
2,8 0
5
pH
10
a
O
103 c
OH
O
3,2 O
O
H N
OH
15
66. ábra A 103 NOTAGly NMR titrálási görbéje (gy r -NCH2:
; acetil CH2: ; glicin -CH2: )
A pH potenciometriás mérésekkel állandó ioner sség mellett négy protonálódási állandót lehetett meghatározni. Az els kett , valamint az utolsó érték a gy r nitrogének protonálódási állandóit, a harmadik pedig a karboxilátcsoport protonálódási állandóját adja meg. A gy r nitrogének második protonálódási állandóját NMR titrálással nem sikerült meghatároznunk, mivel látható, hogy igen közel es értéket mutat a karboxilátcsoport protonálódási állandójával.
59
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
8. táblázat A NOTAGly (103), NOTA (16) és 1,4,7-triaza-ciklononán (3) protonálódási állandói (NOTAGly esetében 25 ºC, 0,1 M KCl)
log K1 logK2 logK3 logK4
NOTAGly
NOTA[a]
1,4,7-triazaciklononán[b]
10,17 ± 0,05 (10,52) 4,08 ± 0,09(-) 3,58 ± 0,08 (3,42) 2,58 ± 0,06(1,06)
11,41 5,74 3,16 1,71
10,42 6,82 <1 -
[a]
Ref.154, [b] Ref.150 Az NMR-titrálással meghatározott állandók zárójelben szerepelnek.
Összehasonlítva a NOTAGly (103), NOTA (16) és 1,4,7-triaza-ciklononán (3) protonálódási állandóit láthatjuk, hogy az els állandó valamennyi származék esetében meglehet sen magas, közel azonos érték, míg a további nitrogének protonálódási állandói sokkal alacsonyabbak (8. táblázat). A NOTAGly második és harmadik nitrogénjének protonálódási állandója a NOTA-hoz képest kisebb, ugyanis az egyes gy r nitrogének amid-oldalláncai karboxilátcsoportjaikon keresztül hidrogénkötést alakítanak ki a szomszédos gy r nitrogénekhez kapcsolódó oldalláncok amidcsoportjaival. A NOTA a NOTAGly-hez képest szabad karboxilátcsoportjain keresztül extra negatív töltéssel rendelkezik. A 103 NOTAGly különböz fémionokkal alkotott komplexeinek stabilitási állandóit a 9. táblázatban foglaltuk össze, összehasonlításban a 3 1,4,7-triaza-ciklononán, valamint 16 NOTA megfelel értékeivel. Azokban az esetekben, ahol valamennyi komplexképz fémkomplexének stabilitási állandó értéke rendelkezésünkre állt elmondhatjuk, hogy a 103 NOTAGly esetében az N-acetil-amino-ecetsav beépülésével a 3 szubsztituálatlan makrociklushoz képest nagyobb stabilitású komplexek keletkeztek, míg a 16 NOTA-hoz képest a komplexek stabilitása lényegesen kisebb. A 105 Kryptofix-22-származékkal ellentétben a 103 vegyület egyik vizsgált toxikus fémionra nézve sem rendelkezik megfelel szelektivitással a biológiailag fontos fémionokkal szemben. 9. táblázat A NOTAGly (103), NOTA (16) és 1,4,7-triaza-ciklononán (3) különböz fémionokkal képzett komplexeinek stabilitási állandói (NOTAGly esetében 25 ºC, I=0,1 M KCl/KNO3)
Mg2+ Ca2+ Sr2+ Zn2+ Cd2+ Pb2+ [a]
60
NOTAGly
NOTA[a]
logKML 2,25 ± 0,06 5,50 ± 0,04 12,61 ± 0,03 11,65 ± 0,03 11,77 ± 0,02
logKML 9,69 8,92 6,83 18,3 16,0 -
Ref.60, [b] Ref.75
1,4,7-triazaciklononán[b] logKML 11,6 9,4 11,0
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
1,4,7,10-tetraaza-1,4,7,10-tetrakisz(acetil-amino-ecetsav)(104, DOTAGly) A három, N-acetil-amino-ecetsav oldalláncot tartalmazó származék közül a ciklénalapú vegyület NMR titrálása mutatkozott a legbonyolultabbnak. 4,2 4 kémiai eltolódás/ppm
3,8
OH
a
3,6
d, e (g, h Na-komplex)
O
b, c (f Na-komplex) HN
b, c,
O
3,4 f
3,2 d, e,
3 2,8
HO
g
2,6
h
2,4
O
O
N
N
N
N
N H
104
O
H N
O
OH
O
a
NH O OH
2,2 0
5
pH
10
67. ábra A 104 DOTAGly NMR titrálás görbéje (gy r -NCH2: és a szabad ligandumban, és a ligandum nátrium-komplexében; acetil-CH2: és a szabad ligandumban, a ligandum nátriumkomplexében; glicin - CH2: - mindkét részecskében)
A ligandum 1H NMR titrálása során a protonok kémiai eltolódásában jelentkez változásokat a 67. ábrán láthatjuk, a protonálódási állandókat a 10. táblázatban foglaltuk össze. Az NMR titrálás során jelekben b velked spektrum tárul elénk, legf képpen a pH 5-9 tartományban, amikor is a részlegesen protonált szabad ligandum, valamint annak nátrium-komplexe is jelen van, míg pH > 9 tartományban a ligandum nátrium-komplexe a domináns részecske. A pH 5-9 tartományban a makrociklusgy r nitrogénatomjainak protonálódása következik be, amit az acetil- és a gy r metilén-protonok jeleinek eltolódása jelez. A karboxilátcsoportok protonálódása csak pH < 5 tartományban jelentkezik, amelyet egyedül a glicinmetilén csoportok kémiai eltolódásában bekövetkez változások jeleznek. A titrálás során pH < 5 tartományban valamennyi proton széles és felhasadt jellel rendelkezik, kivéve a glicinmetilén csoportokat, ami miatt a kémiai eltolódások beazonosítása meglehet sen bonyolulttá tette a spektrumok elemzését. A protonálódási állandók teljes meghatározása ezért csak a potenciometriás mérésekkel volt lehetséges, az 1H NMR titrálást csak három állandó meghatározására, illetve a potenciometriásan meghatározott állandók egyes csoportokhoz történ hozzárendelésére tudtuk felhasználni.
61
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
10. táblázat A DOTAGly (104), DOTA és 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán (4) protonálódási állandói (DOTAGly esetében 25 ºC, I=1 M KCl)
logK1 logK2 logK3 logK4 logK5 logK6
DOTAGly
DOTA[a]
9,19 ± 0,02(-) 6,25 ± 0,03 (6,44) 4,08 ± 0,04(4,90) 3,45 ± 0,04(3,58) 3,20 ± 0,03(-) 1,40 ± 0,05(-)
12,6 9,7 4,5 4,14 2,32 -
1,4,7,10-tetraazaciklododekán[b] 10,82 9,72 1,15 -
[a]
Ref.155, [b] Ref.58, Az NMR-titrálással meghatározott állandók zárójelben szerepelnek.
A 104 DOTAGly származék, valamint etil-észterének gyakorlati fontosságát a CEST-kontrasztanyagként történ alkalmazás tekintetében már többen vizsgálták5457 . Baranyai Zsolt munkájában az DOTAGly Eu(III)-ionnal alkotott komplexének kinetikai tulajdonságát tanulmányozta, és megállapította, hogy fiziológiás körülmények között az [Eu(DOTAGly)- komplex formájában létezik, és kinetikailag megfelel en inert ahhoz, hogy alkalmas legyen orvosdiagnosztikai felhasználásra156.
[2R-2-(1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadec-7-il)-propionil-amino]-ecetsav (R-110, K22-R-AlaGly) és 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16bisz(2R-2-propionil-amino-ecetsav) (R,R-107, K22-R,R-di(AlaGly)) A vegyületek 1 H NMR spektrumai, és ebb l ered en 68. és 69. ábrán látható 1H NMR titrálási görbéi b velkednek jelekben. Az egyes rezonancia jelekhez tartozó kémiai eltolódás értékek meghatározása els sorban a savasabb tartományban, pH < 6 alatt jelentett problémát, ezért ezeknél az értékeknél 2D NMR spektrumok felvételével állapítottuk meg az egymás takarásában lév jelekhez tartozó kémiai eltolódás értékeket.
62
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
5
a
4,5
b
kémiai eltolódás / ppm
4
g
c
3,5
b
e
3
f
2,5
e O
d
O
1 NH
2 h
1,5
c
2N
O
O
A(d) h
B (f )
a
H CH 3 H HO N H HO
g O
R-110
1 0,5 0 0
5
pH
10
68. ábra Az R-110 (K22-R-AlaGly) NMR titrálás görbéje (-CH: ; glicin -CH2: ; gy r (OCH2)2: ; gy r N(2)OCH2: ; gy r N(2)CH2(BH): ; gy r N(2)CH2(AH): ; gy r N(1)CH2: x; -CH3: )
Az R-110 monoszubszitutált ligandum esetében pH 3,5-7,5 tartományban a szubsztituált gy r -nitrogénatom (N(2)) protonálódása következik be, amelyet a gy r ben ehhez a nitrogénatomhoz közel es csoportok – gy r N(2)OCH2, gy r N(2)CH2(AH), gy r N(2)CH2(BH) –, valamint az oldalláncban közvetlenül hozzá kapcsolódó -CH csoport és annak -CH3 szubsztituense kémiai eltolódásának változásával határozottan észlelhetünk. A szubsztituálatlan gy r -nitrogénatom (N(1)) protonálódását pH > 8 értéknél, a gy r ben ehhez a nitrogénatomhoz kapcsolódó metiléncsoportok kémiai eltolódásának változásával érzékelhetjük. Az oldallánc karboxilátcsoportjának protonálódását a 68. ábrán látható jelek kémiai eltolódásának változása nem jelzi. Azonban az oldallánc glicin NH protonjának kémiai eltolódása két pH tartományban változik, pH < 4,5 tartományban a glicin karboxilátcsoportjának protonálódása, pH 4,5-7,5 értékek között a szubsztituált gy r -nitrogénatom (N(2)) protonálódásának hatására. Bár a változás nem jelent s, mégis a potenciometriás eredményekhez képest jó közelítéssel használható a protonálódási állandók kiszámításához. A R,R-107 diszubsztituált ligandum esetében pH < 4 tartományban a glicinmetiléncsoport kémiai eltolódásának változása jelzi az oldallánc karboxilátcsoportjának protonálódását (69. ábra), amelyre az amidproton rezonancia jele szintén érzékeny. A gy r nitrogének protonálódási folyamatát a nitrogénatomokhoz közvetlenül kapcsolódó metilén-protonok, valamint az oldalláncban közvetlenül hozzá kapcsolódó CH-csoport és CH3-csoport kémiai eltolódásának változásával észlelhetünk. 63
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
5 kémiai eltolódás /ppm
4,5
a
4
A(e)
b
3,5
c
e
3
c
2,5
d
2
HO
1,5
O
1
f
0,5 0
5
pH
O
O N H H
O N
N CH3 O
H H
O
B(d) CH 3
f a O
H H N
OH
O
b
R,R-107
10
69. ábra A R,R-107 K22-R,R-di(AlaGly) NMR titrálás görbéje. Jelölések: -CH: ; glicin -CH2: ; gy r (OCH2)2: ; gy r NCH2(BH): ; gy r NCH2(AH): ; -CH3: .
A potenciometriásan és 1H NMR titrálással meghatározott protonálódási állandókat a 11. táblázatban tüntettük fel. A szubsztituált gy r -nitrogénatom protonálódási állandója az ODDA gy r nitrogénjének protonálódási állandójához képest kisebb, ami a peptidoldallánc esetében a gy r nitrogének és a karboxilátcsoportok közötti nagy távolságnak tulajdonítható. A R-110 monoszubsztiutált ligandum esetében a két mérési módszerrel meghatározott eredmények jó közelítéssel egyeznek. A R,R-107 diszubsztituált ligandumnál azonban pH-potenciometriásan mindkét gy r -nitrogénatom és mindkét karboxilcsoport protonálódási állandóját sikerült külön-külön megállapítani, míg 1H NMR titrálással a molekula szimmetriája miatt csak egy-egy protonálódási állandót tudtunk meghatározni (11. táblázat). Annak megállapítására, hogy az oldallánc kiralitásközpontjának van-e számottev szerepe a R,R-107 diszubsztituált származék komplexképz tulajdonságában, a pH-potenciometriás vizsgálatokat az enantiomertiszta R,R-107 (K22-R,R-di(AlaGly)) és a racém rac-107 (K22-di(AlaGly)) vegyületek esetében is elvégeztük. A protonálódási állandók a rac-107 származék esetében kis mértékben alacsonyabbak voltak, mint a R,R-107 származéknál. 11. táblázat A K22-R-AlaGly (R-110), K22-R,R-di(AlaGly) (R,R-107), K22-di(AlaGly) (rac-107) az ODDA (26) és a Kryptofix-22 (6) protonálódási állandói (jelen munka esetében 25 ºC, I = 1 M KCl)
logK1 logK2 logK3 logK4
[a]
K22-R-AlaGly
K22-R,Rdi(AlaGly)
9,51±0,05 (9,63) 5,52±0,06 (5,41) 2,74±0,06 (2,86) -
6,78 (6,27) 5,81 3,51 (3,21) 2,92
K22di(AlaGly) 6,66 5,67 3,52 2,11
ODDA[a]
Kryptofix-22[b]
8,45 7,80 2,90
9,08 7,94 -
Ref.73, [b] Ref.153. Az NMR-titrálással meghatározott állandók zárójelben szerepelnek.
64
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
A ligandumok néhány, biológiai szempontból érdekes fémionnal alkotott komplexeinek stabilitási állandóit meghatároztuk, azokat a 12. táblázatban tüntettük fel. Ahogyan az el z leg vizsgált diaza-koronaéter származékok esetében tapasztaltuk, az N-propionil-amino-ecetsav oldallánc beépülése a Kryptofix-22-höz (6) képest növelte a komplexek stabilitását, azonban az ODDA (26) származékhoz képest jelent s stabilitásbeli csökkenést eredményezett. 12. táblázat A K22-R-AlaGly (R-110), K22-R,R-di(AlaGly) (R,R-107), K22-di(AlaGly) (rac-107) ODDA (26), ODDM (27) és a Kryptofix-22 (6) különböz fémionokkal képzett komplexeinek stabilitási állandói (jelen munka esetében 25 ºC, I = 1,0 M KNO3) K22-RAlaGly
logKML 3,06±0,03 3,66±0,03 3,70±0,18 6,25±0,02 8,24±0,01 [a], [b] Ref.38, [c] Ref.75
Ca2+ Sr2+ Zn2+ Cd2+ Pb2+
K22-R,Rdi(AlaGly)
K22di(AlaGly)
ODDA[a]
ODDM[b]
Kryptofix-22[c]
logKML 4,85 4,21 2,60 8,53 8,96
logKML 4,08 3,98 2,54 7,82 8,53
logKML 8,39 8,29 8,42 11,07 13,55
logKML 7,54 9,79 6,28 10,27 13,03
logKML 3,87 3,1 2,65 5,28 6,8
A diszubsztituált ligandum R,R enantiomerjét (R,R-107) és a racém származékát (rac-107) összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy a stabilitási állandóik értékei is a protonálódási állandókhoz hasonló tendenciát mutatnak, a racém származék esetében kisebbek, mint az enantiomertiszta származéknál. A racém származékban el forduló R,S illetve S,R konfigurációjú származékok stabilitási állandói a tiszta R,R illetve S,S-enantiomerekhez képest sokkal kisebbek, ami az oldalláncok egyidej koordinációjának sztérikus gátlása miatt következik be. Megállapíthatjuk tehát, hogy a kiralitásközpontnak, valamint a molekula konfigurációjának számottev szerepe van a komplexképzésben. A R-110 mono- és a R,R-107 diszubszituált származékot összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy a R,R-107 származék esetében a komplexek stabilitási állandója a két oldallánc jelenléte miatt nagyobb, mint a monoszubsztituált származék esetében, kivéve a kis méret Zn2+-iont. A R-110 származéknál figyelemreméltó a Ca2+- és Sr2+-ionok stabilitási állandóinak aránya. Míg a Kryptofix-22 ligandum esetében a kálcium-komplex stabilitása a nagyobb, az ODDA pedig mindkét fémionnal közel azonos stabilitású komplexet képez, az Npropionil-amino-ecetsav oldallánccal rendelkez R-110 ligandum stronciumkomplexe rendelkezik a nagyobb stabilitási állandóval. Ez nagyon figyelemreméltó eredmény, ugyanis eddig, az összes el állított Kryptofix-22 származék között csak az ODDM mutatott hasonló szelektivitási sorrendváltozást. A toxikus fémionok eltávolítása szempontjából a R,R-107 és az R-110 vegyület esetében jelent s eredménynek mondható az Pb2+/Zn2+, Cd2+/Zn2+ stabilitási állandók arányának magas értéke, amely a 26 ODDA-hoz, valamint a 27 65
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
ODDM-hez képest is jelent s növekedést mutat. Természetesen ez az arány a R,R-107 diszubsztituált származék esetében jelent sebb, hiszen két oldalláncának részvételével nagyobb stabilitású komplexek kialakítására képes. Ebben az esetben az Pb2+ és a Zn2+ valamint a Cd2+ és a Zn2+ komplexek stabilitása közötti különbség meghaladja a 3 nagyságrendet, míg ez az érték a R-110 monoszubszitutált származék esetében csak közel 2 nagyságrendbeli, és gyakorlatilag megegyezik az ODDM-nél számolt különbséggel. Az eredmény mindkét ligandumra (R,R-107, R110), de különösen a R,R-107 diszubsztituált származékra nézve biztató, amely ezáltal ígéretes vegyületnek mondható a toxikus fémionok szervezetb l történ eltávolítására. Ilyen irányú felhasználás azonban még mindenképpen további kutatásokat és vizsgálatokat követel meg.
3.5. Oldalláncban peptidkötést tartalmazó származékok analitikai alkalmazhatóságának vizsgálata Az irodalmi bevezet ben láthattuk a különféle élettani hatással bíró optikai izomerek elválasztásának gyakorlati jelent ségét, els sorban a gyógyszerhatóanyagok épít köveinek számító vegyületek, pl. aminosavak területén. Láthattuk, hogy a kutatócsoportunk érdekl désének középpontjában álló makrociklusos vegyületek közül a koronaéter típusú vegyületek és származékaik önmagukba illetve ciklodextrinekkel együtt alkalmazva képesek királis vegyületek enantiomerjeinek elválasztására. Ezen el zmények alapján vizsgálatainkat a diazakoronaéter származékok kapilláris elektroforézisben történ vizsgálatára terjesztettük ki. Az el állított diaza-koronaéter származékaink közül is a monoszubszitutált származékokat emeltük ki, amelyek a kapilláris elektroforézisben történ felhasználás mellett alkalmasak lehetnek még királis kromatográfiás állófázisként történ felhasználásra a HPLC vagy a kapilláris elektrokromatográfia területén is.
3.5.1. Királis diaza-koronaéter származékok alkalmazhatósága a kapilláris elektroforézis technikában Korábbi munkáink ilyen jelleg kutatások felé nem irányultak, így vizsgálataink alapjának és kiinduló pontjának a Kuhn és társai47, valamint az Armstrong és társai106 által közölt körülményeket tekintettük, akik egyszer és összetett elektrolit rendszerekben vizsgálták 18C6 koronaéter és királis származékának, valamint ciklodextrineknek különféle primer aminosavszármazékok enantiomerjeinek elválasztására gyakorolt hatását. Vizsgálatainkhoz primer aminocsoporttal rendelkez aminosavszármazékokat használtunk, mivel a koronaéter típusú szelektorok els sorban csak 66
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
primer aminocsoporttal rendelkez racém elegyek enantiomerjeinek elválasztására alkalmasak. A rendelkezésünkre álló aminosav-származékok a triptofán (Try), triptofán-metil (TryMe), -etil (TryEt) és butilészterek (TryBu), valamint tirozinmetilészterek (TyrMe) voltak (70. ábra). O
O OR N H R=H Me Et Bu
NH2 Try
NH2
HO
OMe
TyrMe
TryMe TryEt TryBu
70. ábra A CE vizsgálatok során használt triptofán- és tirozin-észterek szerkezete
Az aminosavak elválasztására különböz szelektor rendszereket alkalmaztunk. Megvizsgáltuk az R-110 Kryptofix-22 származék, valamint a ciklodextrinek elválasztó hatását önmagában, ún. egyszer , majd együttesen ún. kett s szelektor rendszerekben. A kett s szelektor rendszerekben a rac-110 hatását is tanulmányoztuk. Ezen kívül ahhoz, hogy az általunk el állított származékok enantiomerek elválasztására gyakorolt hatását megállapítsuk, megvizsgáltuk az irodalomban is használt 18C6 koronaéter (32), valamint a szubsztituálatlan Kryptofix-22 (6) hatását ciklodextrinekkel közös, kett s szelektor rendszerekben. A vizsgálatokat savas körülmények között hajtottuk végre, ezáltal az elválasztandó aminosav származékok primer aminocsoportjai protonált állapotban kölcsönhatás kialakítására képesek az elválasztáshoz alkalmazott szelektorok megfelel csoportjaival. Valamennyi szeletorra nézve azonos koncentrációjú elektrolit oldatot használtunk. Az elválasztás eredményeit az 1. Függelékben foglaltuk össze. Két csúcs közötti felbontás értékét a komponensek migrációs ideje (t1 és t2), valamint az alapvonalon mért csúcsszélességük (w1, w2) alapján, a következ 6. egyenlet szerint számoltuk. Rs = 2(t2-t1)/(w2-w1)
6. egyenlet
Nagymértékben átfedett csúcsok esetében az egyes csúcsokhoz tartozó migrációs id illetve csúcsszélesség kiszámításához a Parabolikus-Lorentz-ellentétesen módosított Gauss (PLMG) dekonvolúciós modellt alkalmaztuk157. A PLMG modellel történ számítások kivitelezéséhez Nikitas és társai által158 használt matematikai és komputeres kromatográfiás csúcs-illeszt eljárást használtuk a Microsoft Excel program segítségével. Ezt követ en az Rs felbontás értékeket a dekonvolúciós modellel kapott csúcsparaméterek felhasználásával számítottuk ki. 67
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
Egyszer szelektor rendszerek Ahhoz, hogy megállapítsuk az alkalmazott szelektorok önmagukban mutatott enantiomer-elválasztó hatását, vizsgálatainkat az egyszer szelektor rendszerek tanulmányozásával kezdtük.
[2R-2-(1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadec-7-il)-propionil-amino]-ecetsav (R-110, Kry-R-AlaGly) A monoszubsztituált Kryptofix-22 származékok közül a racém rac-110 származék enantiomerfelesleg hiányában, önmagában nem alkalmas királis szeparációra, ezért egyszer szelektor rendszerben, önmagában csak a R-110 enantiomert vizsgáltuk. A kísérleti körülményeket Kuhn és társai által közölt irodalomból47 vettük át azzal a különbséggel, hogy az általuk használt királis szelektort - 18C6H4 (33) - helyettesítettük a R-110 vegyülettel. Az elválasztást különböz puffer-összetételek (trisz-tartalmú citrát puffer, valamint foszfát puffer), különböz pH (2,5-6,0 tartomány) és különböz szelektor koncentrációk (5-100 mM) mellett tanulmányoztuk. Azt tapasztaltuk, hogy a szelektor koncentrációjának növelésével az aminosavak migrációs ideje is n tt, amely egyaránt magyarázható az elektrolitoldat növekv viszkozitásával, vagy az aminosav és a szelektor között képz dött asszociátum, aminosavhoz képest jelent sen megnövekedett méretével. Továbbá, a pH növekedésével a deprotonálódási folyamat következtében a királis szelektor töltése, és ezzel együtt a migrációs id k értéke is csökken. Az alkalmazott körülmények között elválasztást nem értünk el, ami azzal magyarázható, hogy az R-110 származék és az aminosav molekulák között létrejött szerkezet túlságosan flexibilis, az asszociációs állandó pedig túl kicsi ahhoz, hogy a királis elválasztáshoz szükséges különböz fizikai tulajdonságokkal rendelkez stabilis diasztereomerek képz djenek. Ciklodextrinek Nyolc különböz ciklodextrint vizsgáltunk egyszer szelektor rendszerekben (α-CD, β-CD, γ-CD, DM-β-CD1, TM-β-CD, HP-β-CD, Me-β-CD és DM-β-CD2). A DM-β-CD1 és DM-β-CD2). Az általunk alkalmazott körülmények között meglehet sen alacsony migrációs id kkel jellemezhet eredményeket kaptunk. Az esetek többségében felbontást nem tapasztaltunk, csak néhányszor értünk el alapvonalon történ elválasztást. AM1 szemiempirikus kvantumkémiai számításokkal modelleztük a ciklodextrint és triptofán-származékot magába foglaló bimolekulás komplex szerkezetét. A triptofán hidrofób heterociklusos része a ciklodextrin hidrofób üregébe ékel dik, hidrofil tulajdonságokkal rendelkez része pedig a ciklodextrin pereménél elhelyezked hidroxilcsoportokkal alkot hidrogénkötéseket, és stabilizálja a komplexet (71. ábra).
68
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
71. ábra Ciklodextrin+triptofán bimolekulás komplexének számított modellje
Valamennyi vizsgált királis aminosav-származék esetében megállapítható, hogy az elválasztás szempontjából egyik ciklodextrin sem tekinthet tökéletes szelektornak.
Kett s szelektor rendszerek Mivel sem a R-110 Kryptofix-22-származék, sem a ciklodextrinekb l álló egyszer elektrolit rendszerekben történ elektroforézissel nem sikerült megfelel királis szeparációt elérnünk, olyan kett s szelektor rendszereket vizsgáltunk, amelyek egyaránt tartalmazzák mindkét szelektort. Ezáltal vizsgáltuk a két királis szelektor enantiomerek elválasztására gyakorolt együttes hatását. A kiindulási körülményeket Armstrong és társai106 által leírt irodalomból merítettük, akik az akirális 18-korona-6 (32) hatását tanulmányozták hat különféle ciklodextrinre nézve, közel ötven racém elegy enantiomerjeinek elválasztása során. Munkánk során kett s elektrolit rendszerekben vizsgáltuk a 32 koronaéter, a 6 diaza-koronaéter, valamint az általunk el állított monoszubsztituált enantiomertiszta R-110 és a racém rac-110 származék nyolc különféle ciklodextrin enantiomer elválasztó tulajdonságára gyakorolt hatását. Ezekben a rendszerekben akirális makrociklusos származékok egyaránt rendelkezhetnek a CD-re nézve szinergista hatással, hiszen a kiralitáscentrumot a ciklodextrin magában hordozza, az akirális molekulák, pedig a CD és aminosav-származék között kialakuló kölcsönhatás mértékét megnövelve a királis elválasztást befolyásolhatják. Ilyen körülmények között a ciklodextrin gy r mérete, a ciklodextrin szubsztituensének természete és száma, a makrociklusgy r donoratomjainak természete, valamint a makrociklusgy r höz kapcsolt királis oldallánc jelenlétének enantiomerelválasztásra gyakorolt hatása egyaránt vizsgálható. Vizsgálataink csak a makrociklus vegyületek elválasztásra gyakorolt hatására terjedtek ki, minden más tényez t figyelmen kívül hagytunk. Ciklodextrin és 18-korona-6 együttes hatása A ciklodextrint tartalmazó elektrolit rendszerekhez akirális 18C6-ot (32) adva megállapítható, hogy a 18C6-nak triptofán-származékok elválasztására a csak ciklodextrint tartalmazó egyszer elektrolit rendszerhez képest nincs vagy többnyire negatív hatása van. Pozitív hatás csak néhány esetben érhet el. (1. Függelék). 69
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
Általánosságban megállapítható, hogy 18C6+CD-b l álló kett s elektrolit rendszereket alkalmazva az aminosavak migrációs ideje csekély mértékben növekedett az egyszer ciklodextrineket tartalmazó elektrolit rendszerekhez képest. Ez magyarázható azzal a ténnyel, hogy a kett s elektrolit rendszer esetében a 18C6+aminosav+CD trimolekulás asszociációs komplex mérete sokkal nagyobb, mint a CD+aminosav bimolekulás komplexé.
Ciklodextrin és Kryptofix-22 együttes hatása A Kryptofix-22-t (6) ciklodextrinekkel együttesen alkalmazva általánosságban megállapíthatjuk, hogy a 18C6 molekulához képest sok esetben indukált, vagy a meglév höz képest jelent sebb felbontást idézett el . Az elválasztás során az Kryptofix22+aminosav+CD trimolekulás komplexben relatívan nagyobb intermolekuláris kölcsönhatások alakulnak ki, mint azt a 18C6 részvételével tapasztalhattuk. Az alkalmazott savas körülmények között a Kryptofix-22 nitrogén donoratomjai protonált állapotba kerülnek (logK1 = 9,08; logK2 = 7,94)153, ami további hidrogénkötések kialakulását teszi lehet vé a trimolekulás komplexen belül. Ez látható a kvantumkémiai számításokkal kapott 72. ábrán. A Kryptofix-22 alkalmazásával a migrációs id értékek jelent sen megnövekedtek, amit a Kryptofix-22 mellett az aminosavak, valamint a ciklodextrinek molekulaszerkezete egyaránt befolyásol. Triptofán-észterek esetében a Kryptofix-22-nek többnyire pozitív hatása van az enantiomerek elválasztására, míg triptofán esetében a Kryptofx-22+ciklodextrin kett s elektrolit rendszer a migrációs id olyan mérték növekedéséhez vezetett, amely az elektroforézis területén az elfogadható mérési határokon kívül esik (>100 min). A jelenség magyarázatát a kés bbiekben tárgyaljuk.
72. ábra Kryptofix-22+triptofán+ciklodextrin trimolekulás komplex számított szerkezete
A Kryptofix-22, a β-ciklodextrin kivételével, valamennyi ciklodextrinnel alkotott kett s elektrolit rendszerben negatív hatást gyakorol a TyrMe enantiomerjeinek elválasztására.
70
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
Ciklodextrin és K22-R-AlaGly (R-110), valamint ciklodextrin és racém K22AlaGly (rac-110) együttes hatása Ezekben a kett s elektrolit rendszerekben vizsgáltuk meg a kiralitásközponttal rendelkez AlaGly oldallánc szerepét a szubsztituálatlan Kryptofix-22-höz képest. Az oldalláncok jelenlétével számottev en megn tt az enantiomerek felbontásának mértéke, nem egyszer alapvonalon történ elválasztást eredményezve. A R-110 és rac-110 diazakoronaéter származékok oldalláncának karboxilátcsoportja, valamint a ciklodextrin hidrofil része pl. hidroxil- vagy hidroxipropil-csoport között hidrogénkötés alakul ki, ami jelent s mértékben megnöveli a diaza-koronaéter-származék+aminosav+CD trimolekulás komplexben kialakuló host-guest kölcsönhatás er sségét, ezáltal az enantiomer elválasztás hatásfokát. Az 1. Függelék adatai alapján látható, hogy TryMe észternél két kivétellel, míg TryEt észternél valamennyi esetben, a királis diaza-koronaétereket (R-110, rac110) tartalmazó kett s elektrolit rendszer, az el z ekben vizsgált kett s elektrolit rendszerekhez képest, elválasztást indukált, vagy javított az elválasztás mértékén. Az is megfigyelhet , hogy a Try Et észternél kapott felbontás értékek számottev en nagyobbak, mint a TryMe észter esetében. A HP-β-CD-nel alkotott kett s elektrolit rendszerben például a TryMe észter Rs értékei az R-110-el 1,55, a rac-110-el 1,50, míg a TryEt észter esetében az R-110-el 3,55 és a rac-110-el 3,66 (73. ábra). Az egyetlen kivétel, a komplexképzéshez valószín leg kis üregmérettel rendelkez α-CD, amelyet tartalmazó kett s elektrolit rendszerben ezekre az aminosavészterekre semmiféle elválasztás nem mutatkozott. 0.04
0.06
A
absorbance
0.03
0.04
0.02 0.02
0.01
0
0 13
15
15
17
17
0.04
0.03
0.03
0.04
0.02
0.02
0.02
0.01
0.01
0
0
25
23
27
0.02
0.02
29
31
33
35
0.01
0
0.04
0.025
0.03
0.02
17 time (min)
(a)
19
19
21
23
25
60 65 time (min)
70
time (min)
(d)
(e)
50
35
55
40
45 time (min)
0.03 0.02
0.01
0.01
0.005
0 17
55
45
0.015
0.01
0 15
50
40
time (min)
0.02
0.01
0 35
time (min)
0.03
0.03 absorbance
21
0.04
time (min)
time (min)
B
19
0.08 0.06
0
0 33
38
43
time (min)
time (min)
(b)
(c)
48
53
45
50
55
60
65
50
55
73. ábra (A) TryME és (B) TryEt elektroferogramjai (a) HP-β-CD, (b) HP-β-CD+18C6, (c) HP-βCD+R-110 Kryptofix-22-származék, (e) HP-β-CD+rac-110 Kryptofix-22-származék.
TryBu és Try enantiomerjeinek elválasztásához ezek a kett s elektrolit rendszerek nem nyújtanak optimális körülményeket, sok esetben ugyanis a kapilláris elektroforézis elválasztástechnikában elfogadható id határon kívül jelentkezett az 71
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
enantiomerek elválasztása. Ennek ellenére, valamennyi vizsgált aminosav-észtert figyelembe véve, a felbontás mértéke sok esetben a legjobbnak bizonyult. Try esetében a hosszú migrációs id az alkalmazott vizsgálati körülmények között, savas pH-n (pH=2,27) a Try és a diaza-koronaéter származék esetében fennálló protonáltsági fokokkal magyarázható. A 74. ábrán látható részecske eloszlási görbék azt mutatják, hogy vizes, pH 2,27 foszfát-pufferes oldatban a Try aminocsoportja 100%-os, (pK2 = 9,32), karboxilátcsoportja (pK1=2,35) pedig közel 50%-os mértékben protonált állapotban van, ami 50%-ban egyszeresen pozitív, 50%-ban zéró töltést eredményez a molekulában. Az R-110 diaza-koronaéter származék mindkét gy r -nitrogénje teljesen (pK2=5,52, pK3=9,32), a propionil-amino-ecetsav oldallánc karboxilátcsoportja pedig 70%-ban protonált állapotban van (pK1 = 2,74). Ez 70%-ban kétszeres, 30%-ban egyszeres pozitív töltést eredményez a makrociklus-származékban. A protonáltsági fokoknak megfelel en a trimolekulás komplex töltése összességében +2 és +3 között változik. [H2A]
+
HA
-
A
[H3A]
2+
HA [H2A]
(a)
-
A
+
(b)
74. ábra A triptofán (a) és az R-110 K22-R-AlaGly (b) részecske eloszlási görbéje a pH függvényében
Try-észterek esetében a deprotonálódásra képes karboxilcsoportok hiánya miatt a trimolekulás komplex töltése a Try-t tartalmazó trimolekulás komplexhez képest eggyel nagyobb. Mivel az elektroforézis során tapasztalt mozgékonyság az elektrolitban migráló minta töltésével egyenesen arányos, a Try nagyobb migrációs id vel rendelkezik, mint a TryMe és TryEt észterek. TryBu észter esetében pedig a trimolekulás komplex méretének megnövekedése okozza a kisebb alkilcsoportokkal rendelkez TryMe és TryEt észterekhez képest tapasztalt nagyobb migrációs id értékeket. Elméletileg ezt a magas migrációs id t a pH csökkentésével lehetne csökkenteni, ugyanis az alacsonyabb pH-n kialakuló trimolekulás komplex töltése a karboxilcsoportok teljes protonáltsága miatt növekedne. A molekulakomplexek szerkezetének tanulmányozására a HyperChem programmal szemiempirikus kvantumkémiai számításokat végeztünk, amelyek során azonban azt is kimutattuk, hogy a legkedvez bb szerkezetben a trimolekulás komplex egy pozitív töltéssel kevesebbel rendelkezik, mint azt a komponensek protonáltsági fokától várnánk. Az R-110 Kryptofix-22-származék Try+ciklodextrin bimolekulás 72
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
komplexhez történ koordinációját tanulmányozva látható, hogy a R-110 diprotonált makrociklus gy r je egy csavart planáris konformációt vesz fel, és az N-propionilamino-ecetsav oldallánc kissé a makrociklus gy r síkja fölé hajolva helyezkedik el. Az oldallánc helyzetét hidrogénkötések és elektrosztatikus kölcsönhatások stabilizálják, amelyek az amido NH-, a részecskék protonált amino-csoportjai, valamint az oldatban jelenlév dihidrogénfoszfát-ionok negatív töltés oxigén atomjai között jönnek létre. A makrociklus síkjára hajolt oldallánc relatív helyzetét l függ en a makrociklus gy r kétféleképpen képes koordinálódni a ciklodextrin és a ciklodextrin üregébe zárt triptofán adduktumához. A komplex I. és II. számított szerkezetében az oldallánc meghatározó stabilizáló szerepet tölt be. Az N-propionil-amino-ecetsav oldallánc amidcsoportja által koordinálódik a triptofán egyik protonált aminocsoportjához, valamint a ciklodextrin gy r hidroxilcsoportjához, míg a makrociklus gy r protonált aminocsoportjai a triptofán aminocsoportok irányába helyezkednek el (75. ábra). A komplex I. és II. szerkezete a triptofán karboxilátcsoportjának protonáltságában tér el egymástól, hiszen a vizsgált pH-n az 50 %-ban protonált állapotban található. Ezáltal az I. szerkezet komplexben karboxilcsoportként, a II. szerkezet komplexben karboxilát-anionként fordul el .
(a)
(b)
75. ábra Az R-110 +triptofán+ciklodextrin trimolekulás komplex I. és II. szerkezete a propionil-aminoecetsav oldallánc koordinációjának részvételével.
A I. és II. szerkezetben látható, hogy az adott pH ellenére a triptofán aminocsoportja deprotonált állapotban van. Abban az esetben ugyanis, ha feltételezzük ennek az aminocsoportnak a protonált állapotát a trimolekulás komplexben egy nagyon nagy pozitív elektromos töltéss r ség alakul ki. Ebben az elrendezésben, a trimolekulás komplex stabilizálásában a dihidrogénfoszfát-ionok töltenek be nagyon fontos szerepet, hiszen azok a ciklodextrinnel és az R-110 diaza-koronaéter származékkal egyaránt hidrogénkötések kialakítására képesek. A dihidrogénfoszfát-ionoknak a trimolekullás komplex stabilizálásában mutatott jelent ségét 2D elektrosztatikus potenciál számításokkal igazoltuk (76. ábra). Az I. és II. szerkezet esetén a nagy pozitív töltéss r ség következtében az aminocsoportján protonált triptofán molekula extra pozitív töltése a trimolekulás komplexb l képes leválni, amely a 73
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
dihidrogénfoszfát-ion felé migrál. Ennek következtében a triptofán aminocsoportja neutrális lesz, és a trimolekulás komplex stabilizálódik (76a. ábra).
(a)
(b)
76. ábra Az R-110+triptofán+ciklodextrin által alkotott trimolekulás komplex (a) I/II. és (b) III. szerkezetének 2D elektrosztatikus potenciálja
A számítások szerint legkevésbé stabil, III. szerkezetben a triptofán protonált aminocsoportja a koronaétergy r oxigénatomjaihoz koordinálódik, és az Npropionil-amino-ecetsav oldallánc nem vesz részt a koordinációban (77. ábra). Ebben a szerkezetben a trimolekulás komplex elektromosan töltött részei távolabb helyezkednek el egymástól. A 2D elektrosztatikus potenciál számítások igazolták, hogy ebben az elrendezésben a puffer-oldat dihidrogénfoszfát-ionjai és a protonált aminocsoportok között nincs protonátadási folyamat, ezáltal a triptofán aminocsoportja meg rzi eredeti protonált állapotát (76b. ábra).
77. ábra A R-110+triptofán+ciklodextrin által alkotott trimolekulás komplex III. struktúrája a propionil-amino-ecetsav oldallánc koordinációja nélkül
A számítások alapján megállapíthatjuk, hogy a Try-t tartalmazó trimolekulás komplex két leginkább valószín síthet szerkezetében (I. és II.) a triptofán protonált aminocsoportjának protonátadásával a komplex fajlagos töltése a várthoz képest eggyel csökken. A számításokat Try-észterekre elvégezve hasonló eredményekhez 74
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
jutottunk, azzal a különbséggel, hogy a karboxilcsoportok hiánya miatt a trimolekulás komplexnek csak egy stabilis szerkezetét valószín sítettük. A legrosszabb elválasztást a TyrMe észter esetében értük el. A rac-110 és R110 diaza-koronaéter származékoknak a nyolc különböz ciklodextrin közül mindössze néggyel alkotott kett s elektrolit rendszere eredményezett jobb enantiomer elválasztást, mint egyéb rendszerekben. A kapilláris elektroforetikus vizsgálatok alapján általánosságban megállapíthatjuk, hogy a racém rac-110 lassabb migrációt eredményez, mint az enantiomertiszta R-110 származék. Feltételezhet en a racém elegy S-enantiomerje az Renantiomerhez képest valamivel er sebb kölcsönhatást alakít ki a vizsgált aminosavval, ezáltal a racém származékot alkalmazva er sebb átlagos kölcsönhatás jön létre. A kölcsönhatások er sségének pontosabb meghatározásához további vizsgálatok, molekulamodellezési számítások szükségesek. Ezeknél a tanulmányoknál a host-guest kölcsönhatás kialakításában számtalan molekuláris tulajdonság, mint pl. a ciklodextrin üregének mérete, a ciklodextrin-származék szubsztituensének természete és tulajdonságai, a vizsgált minta és a diaza-koronaéter származék szerkezete, az oldatban jelenlév anionok/kationok hatása, valamint a vízmolekulákkal kialakuló kritikus kölcsönhatások játszanak fontos szerepet. Eredményeink alapján elmondható, hogy az általunk el állított királis N-propionilamino-ecetsav oldalláncot tartalmazó R-110 és rac-110 diaza-koronaéter származékok figyelemreméltó hatást mutatnak néhány, általunk vizsgált aminosav-származék enantiomerjeinek kapilláris elektroforetikus eljárással történ elválasztására, ciklodextrinekkel alkalmazott kett s elektrolit rendszerekben. Összességében megállapítható, hogy az elektroforézis során kialakuló trimolekulás komplexek protonáltsági állapotából ered en, az elválasztás során meglehet sen magas migrációs id ket értünk el. Vizsgálataink els dleges célja az volt, hogy ezeknek a királis makrociklusos vegyületeknek királis szelektorként történ alkalmasságát megvizsgáljuk. Az egyes szelektorok illetve a puffer koncetrációjának az elválasztásra gyakorolt hatásának meghatározásával, kísérleti tervezéssel Dr. Elek János foglalkozott.159
Kísérleti tervezés A vizsgált aminosav-származékok közül a TryMe és a TyrMe észterek esetében vizsgálták az elválasztásban résztvev egyes komponensek elválasztásra gyakorolt hatását.159 Egy háromfaktoros központi összetett tervezést alkalmaztak. Mivel egy ilyen kísérleti tervezés rendkívül id - és anyagigényes, a vizsgált ciklodextrinek közül mindössze kett (Me-β-CD és DMe-β-CD2), a királis diaza-koronaéter származékok közül pedig a racém K22-AlaGly (rac-110) esetét vizsgálták meg. A ciklodextrin, a királis diaza-koronaéter származék és a puffer koncentrációk függvényében a felbontást (Rs) és a migrációs id ket (tm) tanulmányozták. A kísérleti tervezés 15 kísérletet írt el , amelyek kiértékeléséhez a Nemrod szoftvert használták. A
kísérletek
kiindulási
pontjának
az
el z ekben 75
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
alkalmazott konstans koncentráció értékeket (30 mM rac-110, 30 mM ciklodextrin, 50 mM puffer) tekintették. Megállapították, hogy állandó pufferkoncentráció mellett a ciklodextrin és a rac110 koncentrációjának növekedése pozitívan befolyásolja a felbontás értékét, negatívan hat azonban a migrációs id változására. A két szelektor közül azonban az rac-110 koncentrációja sokkal jelent sebben befolyásolta a migrációs id értékét. A legalacsonyabb migrációs id alacsony rac-110 koncentrációnál tapasztalható, de ebben az esetben a felbontás nem érte el az optimumot. Állandó ciklodextrin koncentráció mellett vizsgálva a rac-110 és a puffer koncentrációjának felbontásra gyakorolt hatását megállapítható, hogy a rac-110 koncentrációjának növekedésével csak kis mértékben javul a felbontás mértéke. Hasonlóan a puffer koncentráció sincs jelent s hatással a felbontásra, bár növekv pufferkoncentráció megnövekedett elektroozmotikus áramláshoz, ezáltal kisebb migrációs id höz, ugyanakkor gyengébb felbontáshoz vezet. Állandó puffer illetve rac-110 koncentráció mellett a ciklodextrin koncentrációjának változtatásával lehet a legoptimálisabb felbontást elérni. Ez a felbontás az 1. Függelékben közölt körülmények között elért eredményekkel közel azonos.
3.5.2. Akirális diaza-koronaéter származék, mint módosítószer a mikroemulziós elektrokinetikus kromatográfiában (MEEKC) Az MEEKC a micelláris elektrokinetikus kormatográfiához hasonló eljárás, amely során vizes pufferes közegben egy felületaktív anyag segítségével lipofil szerves oldószert oszlatnak szét apró cseppekben. A mintakomponensek vagy a mikroemulzión kívüli hidrofil felülethez köt dnek, vagy a mikroemulzió hidrofób belsejében ragadnak le. A mikroemulzió belsejében lév részecskék a mikroemulzió részecskéjével, a mikroemulzión kívül lév részecskék saját vándorlási sebességükkel jutnak el a detektor irányába. A két részecske mozgékonysága töltésbeli különbségek miatt különbözik, ezáltal az eltér en hidrofób részecskék egymástól elválaszthatók. A Leuven-i egyetem kutatócsoportja egy TMC114 HIV-proteáz inhibitor nyolc diasztereomer párjának elválasztására alkalmazta módosítószerként az általunk el állított akirális 105 származékot olyan rendszerekben, amelyek f szelektorként szulfobutiléter-β-CD-t (SBE-β-CD), módosítószerként pedig acetonitrillel kombinált 105 származékot tartalmaztak.160 Bár a rendszer enantiomerek elválasztására nem volt alkalmas, a nyolc diasztereomer elválasztásához kiválóan megfelelt. A HIV proteáz mint proteolitikus enzim jelent sége, hogy a vírusos propeptideket a HIV vírus kifejl déséhez és fert z vírusrészecskék termeléséhez szükséges különféle funkciós proteinekké hasítja. Ez azt jelenti, hogy a HIV proteáz enzim alapvet szerepet játszik a HIV fert zés kialakulásában. Ennek az enzimnek az inaktiválása akár mutációval, akár kémiai 76
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
inhibícióval megakadályozhatja a fert zést. Ilyen okok miatt vált a HIV-1 proteáz fontos célponttá a gyógyszertervezésben.
3.5.3. Királis diaza-koronaéter származék felhasználása szilikagél állófázisok módosítására, a módosított állófázis vizsgálata A monoszubsztituált diaza-koronaéter származékok szabad gy r nitrogénatomjaikon keresztül alkalmasak szilikagél állófázis módosítására. Királis diaza-koronaéter származékokkal módosított szilikagél, királis állófázis szerepét töltheti be akár a elektrokromatográfia, akár a HPLC elválasztástechnikai vizsgálatok során, és ezáltal alkalmas lehet királis vegyületek enantiomerjeinek elválasztására. Az általunk el állított állófázisok elválasztásban betöltött szerepét nem vizsgáltuk, azonban a szilikagélen történ megköt dés hatékonyságát ellen riztük. A 37. ábrán már bemutatott körülmények között el állított klór-propil csoporttal funkcionalizált szilikagélt reagáltattuk a kapcsolni kívánt R-110 Kryptofix-22 származékkal, majd a szabadon maradt szilanolcsoportokat trimetilklór-szilánnal kezelve lezártuk (78. ábra). A szilikagél R-110 származékra nézett borítottságát a szilikagél klórtartalmából vezettük vissza, amelyet a szilikagél KOHos lúgos feltárását követ en Volhard-módszerével határoztunk meg. A lúgos feltárás során a szilikagélen kötött klór-propil-csoportokból származó kloridionokat tartalmazó oldatot visszasavanyítottuk, majd a kloridionokkal csapadékot képez , ismert mennyiség ezüst-nitrát oldattal reagáltattuk, amelynek feleslegét ammónium-tiocianát oldattal visszatitráltuk. Kidolgoztunk egy eljárást, amellyel bizonyítottuk, hogy a módosított szilikagél komplexképz tulajdonsága a szilikagélen kötött diaza-koronaéter származéknak köszönhet , és a módosítatlan szilikagél esetében nem létezik.
77
3. Kísérleti eredmények és értékeléásük
-(OH) szilikagél -(OH) - (OH)
1, (CH3O)3Si(CH2) 3Cl
2, (CH3) 3SiCl toluol, reflux, -HCl
toluol, reflux, -MeOH O
O
-O szilikagél - O
O
-O
O
O
114
OH
i-Pr2NEt, DMF, reflux i-Pr2NEt.HCl O
-O Si(CH2) 3O(CH2) 3
O
H H N
(31)
Si(CH2) 3O(CH2) 3Cl
-O
szilikagél -O
H3C N
NH
O N
N O
O
CH3 H H N
O OH
O
SZ9
78. ábra Klór-propil-csoporttal funkcionalizált, trimetilszilánnal véglezárt és R-110 K22-R-AlaGly származékkal módosított szilikagél el állítása
Az eljárás során színes komplexképz déssel járó folyamatot idéztünk
el egy, a vékonyrétegkromatográfiában el hívószerként alkalmazott, Bi(III)tartalmú Dragendorff-reagens segítségével, amely jellegzetes és szelektív színreakciót mutat nitrogéntartalmú komplexképz kkel. A módosított szilikagél adott mennyiségéhez egyre növekv mennyiségben Dragendorff-reagenst adtunk. Meghatározott id elteltével a szilikagélt lesz rtük, és a feleslegben maradt Dragendorff-reagenst metanolos mosással eltávolítottuk. A sz rlethez azonos mennyiség H2S-es vizet adtunk, és vizsgáltuk a sz rletben lév , a makrociklus által meg nem kötött Bi(III)-ionok mennyiségét l függ Bi2S3 csapadék leválását. Minél nagyobb feleslegben alkalmaztuk a Dragendorff-reagenst, és ezáltal a Bi(III)ionokat a szilikagél makrociklus tartalmához képest, annál nagyobb volt a sz rletben levált Bi2S3-csapadék mennyisége. A Dragendorff-reagenssel kezelt R110 származékkal módosított szilikagél a komplexképz désre jellemz narancssárga színreakciót mutatott, míg a módosítatlan szilikagél esetében a színreakció elmaradt, a szilikagélr l lesz rt oldatból pedig jelent s mennyiség Bi2S3 csapadék vált le. Ez elegend bizonyíték arra nézve, hogy a makrociklus kovalens kötéssel kapcsolódik a szilikagél felületéhez. Megállapíthatjuk, hogy a módosított szilikagél tulajdonságainak meghatározásában a lúgos feltárást követ klorid-meghatározás és a Dragendorff-reagenssel végzett próba egymást jól kiegészít szemikvantitatív módszerek. Abban az esetben, ha a gélmódosítást CE vagy HPLC tisztaságú gélen végezzük, a módosított gélek királis elválasztásra gyakorolt hatása a kapilláris elektrokromatográfia, vagy a HPLC területén is vizsgálható. 78
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
4. KÍSÉRLETI RÉSZ A kísérletek ellen riztük során használt oldószerek analitikai min ség ek voltak (Spektrum-3D Kft), amelyeket további tisztítás nélkül használtunk, kivéve az acetonitrilt, amelyet CaH2-del szárítottunk, majd desztilláltunk, valamint a diklór-metánt, amelyet P2O5-dal szárítottunk, majd desztilláltunk, és néhány csepp amilénnel stabilizáltuk. A i-Pr2NEt-t (Aldrich) KOH pasztillákkal szárítottuk, majd cink porról desztilláltuk. A szintézisekhez használt, leginkább 95% tisztaságú reagenseket az Aldrich, Fluka és a Merck cégekt l szereztük be, és további tisztítás nélkül használtuk. A kapilláris elektroforézishez használt vegyületek közül a D,L-triptofán hidroklorid, a D-triptofán és a D-triptofán-metil-észter az Aldrich-, a D,L-triptofán-metil-észter hidroklorid, a D,L-triptofán-etil-észter hidroklorid, a D,L-triptofán-butil-észter hidroklorid, az α-ciklodextrin (α-CD), β-ciklodextrin (β-CD), a metil-β-ciklodextrin (Me-β-CD), heptakis(2,3-di-O-metil)- β-ciklodextrin (DM-B-CD1) és a heptakis(2,3,6tri-O-metil)- β-ciklodextrin (TM-β-CD) a Sigma-, a γ-ciklodextrin (γ-CD), hidroxipropil-β-ciklodextrin (HP-β-CD) és a dimetil-β-ciklodextrin (DMe-β-CD2) a Beckman, a 18-korona-6 és az elektroozmotikus áramlás meghatározásához használt mezitil-oxid a Fluka Chemie, az 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán (Kryptofix-22) a Merck cég terméke volt. A vizsgálatokhoz szükséges tisztaságú vizet Milli-Q rendszerrel állítottuk el . A tömegspektrometriás vizsgálatok egy TOF analizátorral összekötött Bruker BIFLEX IIITM MALDI-TOF tömeg spektrométerrel készültek. Minden esetben 19 kV gyorsító feszültséget alkalmaztak pulzáló ion kibocsátással (PIETM). A pozitív ionokat reflektron módban detektálták. A párologtatáshoz és ionizációhoz 4 Hz-en m köd nitrogén lézert (337 nm, 3 ns pulzus szélesség, 106-107 W/cm2) használtak, és felvételenként 100-150 impulzust alkalmaztak. Az analízishez THF-ben feloldott dihidroxi-benzoesav mátrixból (20 mg/ml) és a mintákból törzsoldatot készítettek (5 mg/ml). Ezt követ en a két oldatot összekeverték 10:1 v/v (mátrix: minta) arányban. Ennek a mátrix-minta tartalmú oldatnak a 0,5-1 µl mennyiségét helyezték el a rozsdamentes acél mintatartóra, és hagyták megszárazni leveg n. Az el állított vegyületek szerkezetének felderítésére, tisztaságának vizsgálatára és esetenként a reakciók lejátszódásának nyomon követésére 1H és 13C NMR spektroszkópiát használtunk. Az NMR spektrumokat Bruker AM 360 spektrométeren vettük fel, és a MestRe-C 2.3 és 3.99 programokkal értékeltük ki. Az 1H NMR spektrumokban bels standardként CDCl3-ban a TMS-t, míg D2O-ban TSP-t, a 13C NMR spektrumokban a CDCl3 triplett jelének közepe, mint a 77,0 ppm szolgált bels viszonyítási alapként, míg D2O-ban CH3CN metil-csoportjának jelére állítottuk be a 1,24 ppm kémiai eltolódást. Az egyes vegyületekb l az NMR titrálás során 1:1 D2O:H2O oldószerelegyben közel 0,05 mol/dm3 koncentrációjú oldatokat készítettünk. Az oldatok pH-ját NaOD- és DCloldattal megközelít leg 0,5 egységenként 1-13 között változtattuk, felvettük a különböz
79
4. Kísérleti rész
pH-jú oldatok 1H NMR spektrumát, és vizsgáltuk az egyes rezonancia jelekhez tartozó kémiai eltolódásokat. A potenciometriás mérésekhez egy Radiometer pHM93 típusú pH mér t, ABU 80 automata bürettát és Metrohm 6.0234.100 kombinált üvegelektródot használtunk. A titrálások, a mintát 25 °C-on termosztálva, állandó kevertetés és nitrogén átáramoltatás mellett történtek. A pH-mér kalibrálása KH-ftalát (pH=4,005) és bórax (pH=9,180) pufferekkel, az ioner sség beállítása Merck gyártmányú kálium-klorid, illetve káliumnitrát felhasználásával történt. A komplexek stabilitási állandójának meghatározása általában 1:1=fém:ligandum arány mellett történt. Mind a protonálódási és mind a stabilitási állandók számítása PSEQUAD programmal155 történt. Az IR spektrumok egy Perkin Elmer, FT-IR Spectrometer Paragon 1000 PC készüléken (mérési tartomány: 4000-400 cm-1), KBr pasztillákban készültek. A fajlagos forgatóképesség mérések egy Perkin Elmer 241 polariméteren, 10 cm-es küvettában, 1 ml mintatérfogattal, az elemanalízis vizsgálatok egy Carlo Erba Elemanalizátor 1106 készülékkel történtek. A röntgendiffraktumok felvételéhez egy Enraf Nonius MACH3 négykörös egykristály diffraktométert használtak, amely a 0,71073 Å hullámhosszúságú Mo Kα röntgensugár segítségével végezte az adatgy jtést. A reflexióból nyert adatok alapján az egykristály szerkezetét a SIR-92 szofverrel oldották meg, és az F2 értékek felhasználásával a SHELX-97 programmal finomították. A kapilláris elektroforetikus mérések kivitelezése egy gyors szkennel UV-VIS detektorral ellátott SpectraPhoresis Ultra kapilláris elektroforézis készüléken történt. Az elválasztásokat egy nemborított, 56,5 cm teljes hosszal (detektorig számított hossza 50,3 cm) és 75 µm bels átmér vel rendelkez szilika kapillárisban végeztük. A mintákat hidrosztatikusan 5,5 kPa pozitív nyomás alkalmazásával 2 s alatt injektáltuk (az injektált mintatérfogat 6,7 nl). Az elválasztás 25 °C-on, 15 kV feszültség mellett történt, a mintákat 218, 236 és 254 nm hullámhosszon detektáltuk. Abban az esetben, ha elektrolitot váltottunk, a kapillárist 0,1 mM NaOH és Milli-Q vízzel külön-külön 2-2 percig, majd a használandó elektrolittal 5 percen keresztül öblítettük. Minden injektálást megel z en a kapillárist a használandó elektrolit oldattal 2 percen át kondicionáltuk. A mérések többségéhez használt elektrolitokhoz 2,27 pH-jú 50 mM foszfát-puffert illetve 10 mM trisz-citrát puffert használtunk, amelyet 0,45 µm-os nylon fecskend sz r n (Chromafil) átsz rtünk, és ultrahanggal gázmentesítettünk. A királis szelektorokat tartalmazó elektrolit rendszerek az alkalmazott pufferben egyenként 30 mM α-CD, Meβ-CD, DM-β-CD1, DMe-β-CD2, TM-β-CD és HP-β-CD-t, valamint oldhatósági problémák miatt csak 15 mM β-CD és γ-CD-t tartalmaztak. A kett s elektrolit rendszerekben a ciklodextrinek mellett 30 mM koncentrációban alkalmaztuk a megfelel koronaéter-származékot. Az elválasztandó aminosav-származékok racém elegyéb l 1 mg/ml koncentrációjú vizes törzsoldatot, majd ötszörös hígítás után ~200 µg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk. A hígított oldatokat fecskend sz r n átsz rtük, ultrahangos kezeléssel gázmentesítettük. Valamennyi oldatot 0-4 °C-on tároltuk, amely körülmények között 2 hétig használhattuk. Egy injektáláshoz használt elektrolit oldat illetve mintaoldat térfogata 1,3 ml volt. 80
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
A molekulamechanikai és szemiempirikus kvantumkémiai számításokat a HyperChem 7.1 számítógépes programmal végeztük. A szemiempirikus számításokat AM1 bázison végeztük. A molekulamechanikai számítások MM+ er térrel, vákuumban történtek. A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokhoz állófázisként Silica 60 F254 kromatográfiás lapokat (Merck), eluensként pedig az észercsoportokat tartalmazó piperazin- és homopiperazin származékok esetében 95:5 v/v arányú CHCl3:MeOH elegyet, az észtercsoportokat tartalmazó Kryptofix-21, Kryptofix-22, 1,4,7-triazaciklononán, valamint ciklén származékok esetében 5 ml MeOH + 5 csepp jégecet, a glicin-benzil észter és a propionil-glicin-benzil észter oldalláncot tartalmazó származékok esetében 5 ml MeOH és 2 csepp 10 % HNO3 oldószerelegyet használtunk. A glicil-acetát és propanoil-glicil-acetát származékok elválasztásához szilikagél állófázis helyett cellulóz réteget (Merck) és THF:jégecet:víz=6:1:3 összetétel oldószerelegyet használtunk. A kromatogramokat el ször 254 nm UV fény alatt vizsgáltuk, majd az aminokra szelektív Dragendorff-reagenssel, valamint ezt követ en egyes esetekben 20% H2SO4-oldattal való bepermetezéssel hívtuk el . A Dragendorff-reagens elkészítéséhez 60-70 mg BiONO3-ot forrón feloldottunk 20 ml jégecetben, majd leh tés után intenzív keverés közben hozzáadtunk 2,33 mg KI 80 ml vízben elkészített oldatát. Az így nyert sárga szín reagens oldat szobah mérsékleten tárolva legalább egy hónapig felhasználható volt. A száraz oszlopos vákuum kromatográfiás elválasztásokat Pedersen és társai156 által leírt közleményt alapul véve a következ módosításokkal végeztük. Egy hengeres kialakítású 20 cm magas, 7 mm bels átmér j G-3 finomságú zsugorított üvegsz r t 5,5-6 cm magasságig megtöltöttünk száraz Silica gel 60-nal (0,015-0,040 mm, Merck Cat. No. 115111), felületét egy lapos vég üvegbottal tömörítettük, majd 5 ml n-hexánt vákuummal átszívattunk rajta. Az így elkészített oszlopon egy átlagos elválasztásnál 300-700 mg minta komponensei választhatók el, míg 2-3-szor nagyobb tömeg minta elválasztásához egy 2,8 cm bels átmér vel rendelkez üvegsz r t alkalmaztunk. A szilárd mintákat az oszlop megtöltéséhez használt, lehet leg minél kisebb mennyiség szilikagéllel homogenizáltuk, az olajos anyagokat pedig oldatból a szilikagél felületére pároltuk. Az így elkészített mintát tartalmazó szilikagélt egyenletesen eloszlatva az oszlop tetejére rétegeztük, és egy lapos vég üvegbot segítségével er sen megnyomkodtuk, majd kevés kvarchomokot szórtunk rá. Ezt követ en egyre növekv metanol tartalommal rendelkez kloroform:metanol elegy 10-20 ml részleteivel végeztük az elválasztást. A gyakorlatban 0%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30% stb. növekv metanol tartalmú oldószerlegyet használtunk. Az egyes összetételeknél az eluálószert vákuum alkalmazásával átszívattuk az oszlopon mindaddig, amíg ismételten egy teljesen száraz oszlopot nem kaptunk. Ezt követ en az oszlopra rétegeztük a következ összetétel eluenst, és az eljárást megismételtük. Minden eluálószer alkalmazásával nyert frakciót külön-külön gy jtöttük, és minden egyes frakció tisztaságát vékonyrétegkromatográfiával ellen riztük. A tiszta komponenseket tartalmazó frakciókat egyesítettük, és bepároltuk. Azokat a frakciókat, amelyek esetleg két komponenst tartalmaztak, ismételten elválasztottuk. 81
4. Kísérleti rész
Az aktív észtercsoportok hidrolízissebességének és mechanizmusának meghatározása során a hidrolízis kinetikai vizsgálatokat NMR cs ben, deutérium-oxidos közegben a megfelel piperazin és homopiperazin származékokkal végeztük. 50 mg aktív észtert feloldottunk 700 µl D2O-ban, és mivel egyes észterek oldékonysága vízben korlátozott volt, ezért 2-3 mg Triton X-100-at adtunk az oldathoz. Az így kapott oldat pD-jét kombinált üvegelektróddal felszerelt Radiometer típusú pH mér segítségével DCl-dal vagy NaOD-dal olyan értékre állítottuk be úgy, hogy a kívánt pH-t a pD=pH+0,4 egyenlet szerint160 kapjuk. Az oldat savasságát pH<1 és pH=3 értékekre 15% és 3% DCl-dal, míg a pH>12 értéket 5M NaOD-dal értük el. Az enzimatikus hidrolízis vizsgálatok során az észterszármazékot feloldottuk pH=7,4 Na2HPO4/KH2PO4 puffer oldatban, hozzáadtunk 1,1 mg sertésmáj észteráz enzimet (Sigma), és az elegyet 36 °C-os vízfürd ben néhány órán át termosztáltuk. Szobah mérsékleten történ bepárlást követ en a visszamaradt anyagot D2O-ban feloldottuk, amelyb l az id függvényében 1H NMR spektrumokat vettünk fel. Az aktív észtercsoportok májszuszpenziós vizsgálata során homogenizált friss sertésmájban található enzimek, els sorban a sertésmáj észteráz enzim, aktív észter csoportokra gyakorolt hatását vizsgáltuk. A sertésmájból 10 db kb. 8 mm élhosszúságú kockát vágtunk, karbogénnel (95% O2 / 5% CO2) átbuborékoltatott 15 ml 55 mM KH2PO4/Na2HPO4 puffert tartalmazó dörzsmozsárban, acél szitaszöveten péppé homogenizáltuk, és az így keletkezett szuszpenzióból 1,4 ml-t 15 percig 6000 rpm/2000 g fordulattal centrifugáltuk. A leülepedett májzagyról a felülúszó folyadékot leöntöttük, és friss 700 µl puffert hozzáöntve, összerázva ismételten lecentrifugáltuk. Ez utóbbi m veletet háromszor ismételtük meg. A harmadik mosás/centrifugálás folyamat után, a centrifugacs ben maradt májzagyhoz 700 µl puffert, valamint 10 mg vizsgálandó aktív észtert vagy egyéb származékot adtunk. A szuszpenziót kis üvegedénybe öntöttük, és 36 °C-os vízfürd ben rázógépre téve, 60 percen keresztül rázattuk. 60 perc elteltével az aktív észtert tartalmazó májszuszpenziót 15 percig centrifugáltuk, majd a felülúszó folyadékot a májzagyról leöntöttük, és friss 700 µl pufferrel összerázva ismételten lecentrifugáltuk. Ez utóbbi m veletet háromszor ismételtük meg, ezáltal a sejtekbe be nem jutott aktív észtert a májzagyról eltávolítottuk. Az így mosott és centrifugált májzagyot friss 700 µl pufferrel felöntve 15 percig ultrahanggal roncsoltuk, majd ismételten lecentrifugáltuk. A felülúszó folyadékból 300 µl-t 350 µl D2O-val NMR cs ben összekeverve, NMR méréseket végeztünk. Az aktív észtercsoportok inkubált vékony májszeletekkel történ vizsgálata során az aktív észtercsoportokat tartalmazó vegyületek sejtekbe történ bejutását vizsgáltuk. A vizsgálatokhoz 0,5-1 mm vastag friss csirkemájszeleteket használtunk. A sejtek életben tartására glükóztartalmú Hank-puffert, míg a májszeletekb l készült szuszpenzió 1H NMR spektrumának felvételéhez, a glükóz NMR spektrumban el forduló jeleinek zavaró hatása miatt, glükózmentes Hank-puffert használtunk. A Hank-puffert analitikai tisztaságú vegyszerek kétszer ionizált vízben történ feloldásával állítottuk el , amelyet használat el tt 0,45 µm membránsz r n sz rtünk át. A Hankpuffer kémiai összetétele a következ (mg/l): NaCl 8000, KCl 400, Na2HPO4.2H2O 47,9, KH2PO4 60, CaCl2 144, MgSO4.7H2O 246, NaHCO3 350, glükóz 1000. Az 82
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
elkészített Hank-puffert pH=7,4 eléréséig karbogéngázzal buborékoltattuk át. A vizsgálatokhoz 1-1,5 kg-os élelmiszermin ség csirkéb l származó csirkemájat használtunk, amelyet közvetlenül a testb l való kiemelést követ en 0-5°C-os el z leg karbogén gázzal telített, glükóztartalmú Hank-pufferrel a testnedvekt l leöblítettünk, majd glükóztartalmú Hank-pufferbe helyeztünk, és jeget tartalmazó termoszban tartottunk kevesebb, mint 1 órán keresztül, a kísérlet kezdetéig. Az így tartott máj kisebb darabjait glükózos Hank-puffert tartalmazó petricsészébe helyeztük, éles szikével 0,5-1 mm vastagságúra szeleteltük, majd glükózos Hank-pufferrel leöblítettük. 2-3 g-nyi májszeletet karbogéngázzal folyamatosan átbuborékoltatott, 36 ºC-on termosztált, 10 ml glükózos Hank-pufferben oldottunk, amelyet rázógépen 15-30 percen keresztül rázattunk. Az oldathoz adtunk 50 mg vizsgálandó aktív észtert vagy egyéb származékot tartalmazó 20 ml glükózos Hank-puffert, és további 30 percen keresztül rázattuk. Az oldatokból kivettük a májszeleteket, és háromszor lemostuk glükózmentes Hankpufferrel, -80°C-ra lefagyasztottuk, fagyott állapotban dörzsmozsárban elporítottuk, majd kb. 10 ml szobah mérséklet glükózmentes Hank-pufferban szuszpendáltuk. Néhány perces ultrahangos roncsolást követ en a szuszpenzióból 1,4 ml-t 15-20 percen keresztül 2500 g fordulattal centrifugáltuk, majd a felülúszó folyadék 400 µl-ét NMR cs ben 300 µl D2O-dal összekevertük, és 1H NMR spektroszkópiás módszerrel vizsgáltuk. A májszeletekb l az aktív észter hozzáadása nélkül készített vakminták feldolgozását is elvégeztük, a fent leírt pontok szerint.
(41) Etil-glikolát Fisher eljárása alapján148 glikolsav (20,04 g, 0,264 mol) 70 ml absz. etanolos oldatához 0,5 ml 37%-os sósavat adtunk, az elegyet 4 órán keresztül a forrás h mérsékletén tartottuk, majd az oldószert kidesztilláltuk, a visszamaradó anyagot pedig desztillációval tisztítottuk (760 Hgmm, 157 °C). Az így kapott tiszta termék színtelen folyadék (11,47 g, 0,110 mmol, 42% kitermelés). (42) Benzil-glikolát Ez a vegyület szintén a Fisher eljárás alapján148 készült, 30 ml benzil-alkoholban oldott glikolsavhoz (10,0345 g, 0,13 mol) hozzáadtunk 0,4 ml 37% sósavat. A reakcióelegyb l 6 órás forralás után az oldószert kidesztilláltuk, és a visszamaradó anyagot desztillációval tisztítottuk (5 Hgmm, 132 °C). A tiszta termék színtelen folyadék (5,996 g, 36,08 mmol, 27% kitermelés). (43) 2-benziloxi-etanol Az eljárást Butler leírása alapján149 valósítottuk meg, a következ módosításokkal. Az el z leg elporított, és 100 °C-on kiizzított káliumhidroxidot (3,60 g, 64,2 mmol) etán–1,2-diolban (10,01 g, 0,161 mol) oldottuk, majd 2 óra alatt sztöchiometriai mennyiség benzil-bromidot (11,03 g, 64,4 mmol) adagoltunk hozzá, miközben a reakcióelegyet mágneses kever n er teljesen kevertettük. A benzilbromid hatására képz dött kálium-bromid a reakcióelegyet meglehet sen s r vé tette. A reakcióelegy h mérsékletét 127 °C-ra növeltük, és a kálium-bromid teljes feloldódásáig 2 órán keresztül így tartottuk. Ezt követ en hagytuk leh lni szobah mérséklet re, 30 ml vizet adtunk hozzá, és az inhomogén oldatot több részletben dietil-éterrel extraháltuk. A szerves fázisokat egyesítettük, néhány órán keresztül vízmentes Na2SO4-on, majd annak 83
4. Kísérleti rész
kisz rése után egy éjszakán át vízmentes MgSO4-on szárítottuk. A szárítószer kisz rése után a sz rletet rotációs bepárlón bepároltuk, és a visszamaradó sötétbarna oldatot vákuumdesztillációval tisztítottuk (4 Hgmm, 101-107 °C). A termék színtelen folyadék (5,19 g, 34,1 mmol, 53% kitermelés).
(44) 1-bróm-(etoxi-karbonil-metil-acetát) Száraz diklór-metánban (30 ml) oldott etilglikoláthoz (4,33 g, 41,5 mmol) 1 óra alatt sztöchiometriai mennyiség bróm-acetilbromidot (8,39 g, 41,5 mmol) adtunk, majd a reakcióelegyet 4 órán keresztül forraltuk. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítottuk, és a visszamaradó anyagot vákuumdesztillációval tisztítottuk (10 Hgmm, 122-128 °C). A termék színtelen folyadék (3,32 g, 14,8 mmol, 36% kitermelés). (45) 1-bróm-(butoxi-karbonil-metil-acetát) Ez a vegyület 44-származékkal azonos módon készült, butil-glikolátból (4,60 g, 34,8 mmol) és bróm-acetil-bromidból (7,03 g, 34,8 mmol) kiindulva. A tiszta terméket, mint színtelen folyadékot (4,929 g, 19,5 mmol, 56,5% kitermelés) vákuumdesztillációs tisztítási eljárást követ en kaptuk (8 Hgmm, 129 °C). (46) 1-bróm-(benziloxi-karbonil-metil-acetát) A vegyület el állítása a 44-származék el állításának folyamatával egyezik meg, benzil-glikolátból (4,13 g, 24,8 mmol) és bróm-acetil-bromidból (5,01 g, 24,8 mmol) kiindulva. Vákuumdesztillációt (5 Hgmm, f.p. 168 °C) követ en kissé viszkózus, halványsárga folyadékot kaptunk (2,165 g, 7,54 mmol, 30% kitermelés). (47) 1-bróm-(2-oxo-tetrahidro-furán-3-il-acetát) Ez a termék a 44-származékhoz hasonló módon készült, 3-hidroxi-dihidro-furán-2-on (2,46 g, 24,1 mmol) és brómacetil-bromid (4,87 g, 24,1 mmol) felhasználásával. A reakcióelegy 4 Hgmm-en és 158 °C-on történ vákuumdesztillációjával kapott viszkózus folyadékot száraz oszlopos vákuum kromatográfiával tovább tisztítottuk. A termék halványsárga folyadék (430 mg, 1,93 mmol, 8% kitermelés). (48) 1-bróm-(2,2,2,-trifluoro-etil-acetát) Az eljárás a 44-származék el állításával egyezik meg, 2,2,2-trifluoro-etanolból (7,21 g, 72 mmol) és bróm-acetil-bromidból (7,18 g, 35,5 mmol) kiindulva. A tiszta terméket, mint színtelen folyadékot (3,74 g, 16,9 mmol, 47% kitermelés) atmoszférikus nyomáson történ desztillációval nyertük (f.p. 139 °C). (49) 1-bróm-(2-benziloxi-etil-acetát) A vegyület a 44-származékkal azonos módon készült, 2-benziloxi-etanolból (5,19 g, 34,1 mmol) és bróm-acetil-bromidból (6,89 g, 34,1 mmol). A tiszta, színtelen folyadékot vákuumdesztillációval (5 Hgmm-en, 154-158 °C) történ tisztítás után kaptuk (3,01 g, 11,0 mmol, 32% kitermelés).
84
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
(50) Piperazin-N,N’-bisz(etoxi-karbonil-metil-acetát) (általános eljárás (57) homopiperazin, (63) Kryptofix-21 és (68) Kryptofix-22 származékok el állítására) Piperazint (80,6 mg, 0,935 mmol) oldottunk vízmentes acetonitrilben (20 ml) i-Pr2NEt nem-nukleofil bázis feleslegének jelenlétében, majd 1 óra alatt hozzáadagoltuk a sztöchiometriai mennyiség 44-vegyület (425 mg, 1,89 mmol) vízmentes acetonitriles oldatát (20 ml). Az adagolás befejezése után a reakcióelegyet 4 órán keresztül forraltuk, majd rotációs bepárlón az oldószert és a i-Pr2NEt felesleget eltávolítottuk. A visszamaradó sárgás szín olajos szilárd anyagot dietil-éterben egy üvegbottal eldörzsöltük. A dietil-éterben oldhatatlan i-Pr2NEt.HBr-ot Schlenk-sz r n kisz rtük, az éteres sz rletet csökkentett nyomáson 5 ml-es térfogatig bepároltuk. Az így keletkez zavaros oldatot vattán keresztül nitrogén túlnyomással átsz rtük, és a sz rletet ezután szárazra pároltuk. A termék fehér, szilárd anyag (211 mg, 0,564 mmol, 60% kitermelés). Ugyanezzel az eljárással a többi ciklikus diaminok esetében a termék halványsárga olaj, kitermelések egyenként 57: 76%, 63: 70% és 68: 89%. (51) Piperazin-N,N’-bisz(butoxi-karbonil-metil-acetát) (általános eljárás (58) homopiperazin, (64) Kryptofix-21 és (69) Kryptofix-22 származékok el állítására) Az 50 piperazin-származékkal megegyez módon állítottuk el , piperazinból (126 mg, 1,46 mmol) és 45-vegyületb l (742 mg, 2,93 mmol) kiindulva. A termék halványsárga olaj (508 mg, 1,18 mmol, 81% kitermelés). Ugyanezzel az eljárással a többi ciklikus diamin esetében a termék szintén halványsárga olaj, kitermelések egyenként 58: 79%, 64: 83% és 69: 83%. (52) Piperazin-N,N’-bisz(benziloxi-karbonil-metil-acetát) (általános eljárás (59) homopiperazin, (65) Kryptofix-21 és (70) Kryptofix-22 származékok el állítására) A eljárás Az 50 piperazin-származéknál leírt módon állítottuk el , piperazinból (53,8 mg, 0,624 mmol) és 46-vegyületb l (359 mg, 1,25 mmol) kiindulva. A termék halványsárga szilárd anyag (211 mg, 0,423 mmol, 68% kitermelés). Ugyanezzel az eljárással a többi ciklikus diamin esetében a termék halványsárga olaj, kitermelés egyenkénti 59: 69%, 65: 81% és 70: 83%. B eljárás A 82 PIDA(NEt4)2-t (288 mg, 0,62 mmol) és tetraetilammónium-bromidot (263 g) tartalmazó reakciókeveréket feloldottuk 20 ml vízmentes acetonitrilben, hozzáadtuk a 46-vegyületet (287 mg, 1,25 mmol), majd 8 órán keresztül forraltuk. A reakcióelegyet rotációs bepárlón bepároltuk, a visszamaradt sárgásfehér szilárd anyagot dietil-éterben eldörzsöltük, és az éterben oldhatatlan részt Schlenk-sz r n kisz rtük, tiszta dietil-éterrel mostuk, majd nitrogén atmoszférában szárítottuk. Az NMR spektrumban a jel alatti területek egymáshoz viszonyított arányából megítélve, a termék szilárd anyag 26 (m/m)%-ban az 52 piperazin-származékot (216 mg, 0,434 mmol, 69% kitermelés), valamint 74 (m/m)%-ban tetraetilammónium-bromidot tartalmazott. (53) Piperazin-N,N’-bisz(tetrhidro-furán-2-on-3-il-acetát) A 83 PIDA-(NEt4)2-t és tetraetil-ammónium-bromidot tartalmazó reakciókeverék (503 mg keverék, amely 289,9 mg 0,629 mmol PIDA-(NEt4)2-t tartalmaz) vízmentes acetonitriles oldatához (20 ml), 85
4. Kísérleti rész
hozzáadtuk a 2-bróm-γ-butirolaktont (210 mg, 1,26 mmol), és a reakcióelegyet 3 órán keresztül forraltuk. A reakcióelegyben keletkez tetraetilammónium-bromidot Schlenksz r n kisz rtük, az éteres sz rletet csökkentett nyomáson bepároltuk, és a visszamaradó sötétbarna olajos szilárd anyagot dietil-éterben üvegbottal jól átdolgoztuk. A diettil-éterben oldhatatlan szilárd anyagot kisz rtük, mostuk tiszta dietil-éterrel, majd nitrogénáramban szárítottuk. A termék sötétbarna, szilárd anyag (90 mg, 0,24 mmol, 39% kitermelés).
(54) Piperazin-N,N’-bisz(trifluor-etil-acetát) el állítása (általános eljárás (60) homopiperazin származék el állítására) Az 50 piperazin-származéknak megfelel pontban leírt eljárás szerint állítottuk el piperazinból (185 mg, 2,15 mmol) és 48vegyületb l (963 mg, 4,35 mmol) kiindulva. A termék halványsárga, szilárd anyag (354 mg, 0,97 mmol, 45% kitermelés). A (60) homopiperazin származék halványsárga, szilárd anyag (kitermelés 40%). (55) Piperazin-N,N’-bisz(benziloxi-etil-acetát) (általános eljárás (61) homopiperazin, (66) Kryptofix-21 és (71) Kryptofix-22 származékok el állítására) Az 50 piperazin-származéknak megfelel pontban leírt eljárás szerint állítottuk el , piperazinból (104 mg, 1,21 mmol) és 49-vegyületb l (656 mg, 2,40 mmol) kiindulva. A terméket száraz oszlopos vákuum kromatográfiás technikával tisztítottuk, ami halványsárga olaj (299 mg, 0,635 mmol, 53% kitermelés). Ugyanezzel az eljárással a többi ciklikus diamin esetében a termék szintén halványsárga olaj, kitermelések egyenként 61: 42%, 66: 46% és 71: 47%. (56) Piperazin-N,N’-bisz(benzil-acetát) (általános eljárás (62) homopiperazin, (67) Kryptofix-21 és (72) Kryptofix-22 származékok el állítására) Az 50 piperazinszármazéknak megfelel módon állítottuk el , piperazinból (183 mg, 2,12 mmol) és benzil-bromidból (976 mg, 4,26 mmol) kiindulva. A termék sárgásfehér szín , szilárd anyag (460 mg, 1,20 mmol, 57% kitermelés). Ugyanezzel az eljárással a többi ciklikus diamin esetében a termék halványsárga olaj, kitermelések egyenként 62: 71%, 67: 72 % és 72: 68 %. (74) Piperazin-N,N’-bisz(2-hidroxi-etil-acetát) (általános eljárás (75) homopiperazin, (76) Kryptofix-21 és (77) Kryptofix-22 származékok el állítására) Az 55 piperazin-származékot (28 mg, 0,060 mmol) egy nyomásálló kétnyakú lombikban, nitrogén atmoszféra alatt, metanolban (30 ml) feloldottuk, majd a kiindulási észter tömegének 10%-ában Pd/C katalizátort (3 mg, amelynek Pd tartalma 10%) adtunk hozzá. A lombikot egy háromállású gázbevezet csappal, Hg-manométer/túlnyomásvéd rendszerrel és egy Kipp-készülékkel kötöttük össze, amelyb l kb. 1 bar túlnyomás eléréséig száraz, oxigénmentes hidrogéngázt vezettünk a reakcióelegyhez. A katalitikus reakció el rehaladását a folyamatos nyomásesés jelezte. A hidrogéngázt a szükséges túlnyomás eléréséig szakaszosan adagoltuk a rendszerbe. Amikor a túlnyomás értéke az 86
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
id el rehaladtával nem változott, a nyomást megszüntettük, és a lombikot száraz nitrogéngázzal történ átöblítés közben kinyitottuk. A katalizátort nitrogén atmoszférában Schlenk-sz r n kisz rtük, a sz rletet rotációs bepárlón bepároltuk. A visszamaradt termék barna olaj (6 mg, 0,021 mmol, 35% kitermelés). Ugyanezzel az eljárással el állított 75 homopiperazin- és a 76 Kriptofix-21 származék halványsárga olaj, kitermelések egyenként 75: 78% és 76: 36%, míg a 77 Kriptofix-22 származék fehér, szilárd anyag, amelyet száraz oszlopos vákuum kromatográfiás technikával történ tisztítás után kaptunk, kitermelés: 6 %. Fontos Amikor a hidrogéngázzal telített katalizátor érintkezésbe kerül a leveg vel nagyon könnyen t z vagy robbanás keletkezhet, ezért Pd/C katalizátorral történ valamennyi m veletet csak és kizárólag inert atmoszférában lehet végezni.
(78) 1,4,7-trisz(etoxi-karbonil-metil)-1,4,7-triaza-ciklononán 1,4,7-triaza-ciklononánt (513 mg, 3,9 mmol) 10 ml acetonitriles oldatához i-Pr2NEt feleslegének jelenlétében 1 óra alatt hozzáadtuk a bróm-ecetsav-etilészter (2,00 gm 11,9 mmol) 15 ml acetonitriles oldatát. A reakcióelegyet 3 napon keresztül a forrás h mérsékletén tartottuk, majd az oldószert rotációs bepárlón eltávolítottuk. A visszamaradt sárga, olajos szilárdanyagot dietil-éterben egy üvegbottal eldolgoztuk, majd a dietil-éteres részt a visszamardt ragacsos állagú anyagról leöntöttük, és csökkentett nyomáson bepároltuk. A termék sárga, olajos anyag (319 mg, 0,82 mmol, 21% kitermelés) (80) N,N’-bisz(karboxi-metil)-piperazin hidroklorid (PIDA.2HCl) A eljárás Piperazint (1,15 g, 13,4 mmol) és bróm-ecetsavat (3,74 g, 26,9 mmol) 5 ml vízben feloldottunk, majd hozzáadtunk 10,3 ml NaOH-oldatot (5,224 mol/dm3, 53,6 mmol). A reakcióelegyet 80 °C-ra felmelegítettük, ezen a h mérsékleten az oldat pH-ját fenolftalein indikátor jelenlétében további, folyamatos NaOH-oldat adagolással konstans pH=9-10 közé állítottuk be. Ezt követ en a NaOH-oldat adagolását megállítottuk, a reakcióelegy pH-ját HCl-oldattal pH=2-re csökkentettük, és az oldószert rotációs bepárlón csökkentett nyomáson fehér kristálykiválás megindulásának kezdetéig kidesztilláltuk. Tíz óra szobah mérsékleten történ állás után a reakcióelegyb l kivált kristályokat üvegsz r n kisz rtük, néhány csepp desztillált vízzel mostuk, majd csökkentett nyomáson súlyállandóságig szárítottuk. A termék fehér mikrokristályos anyag (2,35 g, 8,54 mmol, 64% kitermelés). B eljárás A 82 PIDA-metilésztert (9,99 g, 43,4 mmol) feloldottuk 150 ml HCl-oldatban (6 mol/dm3), majd forrásig melegítettük. A reakcióelegyb l forrás közben metanol és hidrogénklorid desztillált ki mindaddig, amíg 1 H NMR mérések segítségével a hidrolízis elegyben metanolt vagy metil-észtert detektáltunk. A hidrolízis teljes lejátszódása után a reakcióelegyet csökkentett nyomáson szárazra pároltuk. A termék fehér, szilárd anyag (11,65 g, 42,3 mmol, 97% kitermelés). (81) N,N’-bisz(metoxi-karbonil-metil)-piperazin (PIDA-Me-észter) Az 50 piperazinszármazéknak megfelel pontban leírt eljárás szerint állítottuk el , piperazinból 1,07 g, 12,4 mmol) és klór-ecetsav-metilészterb l (2,70 g, 24,8 mmol). A termék fehér, szilárd anyag (2,51 g, 10,9 mmol, 88% kitermelés). 87
4. Kísérleti rész
(82) N,N’-bisz(karboxi-metil)-piperazin tetrametilammónium só A eljárás Piperazint (334 mg, 3,8 mmol) és bróm-ecetsavat (1,14 g, 8,4 mmol) 5 ml desztillált vízben feloldottunk, és 5,90 ml NMe4OH-oldatot (2,66 mol/dm3, 15,7 mmol) adtunk hozzá. A reakcióelegyet 80 °C-ra felmelegítettük, és ezen a h mérsékleten az oldat pH-ját fenolftalein indikátor jelenlétében további folyamatos NMe4OH-oldat adagolásával konstans pH 9-10 közé állítottuk. Ezt követ en a NMe4OH-oldat adagolását megállítottuk, és a reakcióelegyet rotációs bepárlón csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradt kissé vizes szilárd anyagot absz. etanolban szuszpendáltuk, újra bepároltuk, ezáltal teljesen vízmentesítettük. Az így kapott barnás szín , szilárd anyagot dietil-éterben egy üvegbottal eldörzsöltük, majd Schlenk-sz r n kisz rtük, és nitrogénáramban szárítottuk. A halványbarna, szilárd anyag a 82 piperazin-só mellett NMe4Br-ot tartalmazott (teljes tömeg, 2,25 g, amelyb l a 82 piperazin-só: 1,14 g, 3,27 mmol, 86% kitermelés). A kitermelést az 1H NMR spektrum alapján számítottuk ki. A különböz reakciókban ezt a keveréket a komponensek további elválasztása nélkül használtuk fel. B eljárás A 80 PIDA.2HCl-ot (978 mg, 3,55 mmol) desztillált vízben oldottuk, majd 5,35 ml NMe4OH-oldattal (2,66 mol/dm3, 14,3 mmol) semlegesítettük. A reakcióelegy feldolgozása ett l a ponttól kezdve megegyezik az A eljárásban leírtakkal. A reakció során képz dött halványsárga, szilárd anyag 82 piperazin-sót és NMe4Br-ot tartalmazott (teljes tömeg: 1,89 g, amelyb l a 82 piperazin-só 1,01 g, 2,90 mmol, 82,5% kitermelés) C eljárás A 81 PIDA-Me- észtert (827 mg, 3,59 mmol) és NMe4OH-ot (1,42 g, 15,6 mmol) feloldottuk desztillált vízben, majd egy órán keresztül 90 °C-on kevertettük. A reakcióelegy feldolgozása ett l a ponttól kezdve megegyezik az A eljárásban leírtakkal. A temék fehér, szilárd anyag, amely csak a 82 piperazin-sót tartalmazta (1,02 g, 2,93 mmol, 82% kitermelés). (83) N,N’-bisz(karboxi-metil)-piperazin tetraetilammónium só A 82 piperazin-só el állításával megegyez módon készítettük, NEt4OH-oldat felhasználásával. A terméket, ami egy nagyon higroszkópos fehér, szilárd anyag, az eljárásnak megfelel en tiszta vagy NEt4Br/NEt4Cl-val ’szennyezett’ formában nyertük ki. Az elválasztással nyert vagy az 1H NMR spektrumból számított kitermelés 80-90%. (84) Piperazin-N,N’-bisz(ciano-metil-acetát) Vízmentes acetonitrilben oldott (20 ml) 83 PIDA-(NEt4)2-t és tetraetilammónium-bromidot tartalmazó reakciókeverékhez (összesen 433 mg keverék, amely 249 mg, 0,715 mmol PIDA-(NEt4)2-t tartalmaz) egy részletben, nagy feleslegben klór-acetonitrilt (233 mg, 3,09 mmol), valamint katalitikus mennyiség nátriumjodidot (10 mg, 0,06 mmol) adtunk. Ezt követ en a reakcióelegyet öt órán keresztül forraltuk, majd a tetraetilammónium-bromidot Schlenk-sz r n kisz rtük, a sz rletb l csökkentett nyomáson az oldószert eltávolítottuk, és a visszamaradt sötétbarna szín , olajos szilárdanyagot dietil-éterben egy üvegbottal eldolgoztuk. A dietil-éterben oldhatatlan sötétbarna szín , szilárd anyagot Schlenksz r n kisz rtük, tiszta dietil-éterrel mostuk, és nitrogénáramban szárítottuk. A temék sötétbarna, szilárd anyag (189 mg, 0,674 mmol, 94% kitermelés). Az 1H NMR 88
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
spektrumban az egyes csúcsok integrál értékeinek egymáshoz viszonyított arányából megállapítottuk, hogy a termék még megközelít leg 4 % tetrametilammóniumhalogenidet tartalmazott.
(85) 1,4,7-trisz(karboxi-metil)-1,4,7-triaza-ciklononán tetraetilammónium só A terméket a 82 piperazin-só el állításával megegyez módon készítettük, NOTA.3HCl (1,075 g, 4,5 mmol), bróm-ecetsav (2,05 g, 14,7 mmol) és 32,4 ml NEt4OH-oldat (1,365 mol/dm3, 44 mmol) felhasználásával. A termék barnássárga, nagyon higroszkópos, szilárd anyag (2,85 g, 4,1 mmol, 91,6% kitermelés). (86) 1,4,7-triaza-ciklononán-1,4,7-trisz(etoxi-karbonil-metil-acetát) A 85 tetraetilammónium sót (1,43 g, 2,7 mmol) szuszpendáltuk 30 ml acetonitrilben, majd 1 óra alatt hozzáadagoltuk a bróm-ecetsav-etilészter (1,65 g, 9,8 mmol) 30 ml acetonitriles oldatát. A reakcióelegyet 4 órán keresztül forraltuk, majd az oldószert kidesztilláltuk. A visszamaradt olajos szilárd anyagot dietil-éterben egy üvegbottal eldolgoztuk, majd a dietil-éteres oldatot a szilárd anyagról leöntve, rotációs bepárlón bepároltuk. A visszamaradt termék sárga olaj (373 mg, 0,66 mmol, 20% kitermelés). (87) 1,4,7-triaza-ciklononán-1,4,7-trisz(tetrahidro-furán-2-on-3-il-acetát) A termék el állítása megegyezik a 86 származék el állításával, 85 tetraetilammónium sóból (301,6 mg, 0,44 mmol) és 47 észterb l (239,5 mg, 1,45 mmol) kiindulva, azzal a különbséggel, hogy a terméket a dietil-éterben nem oldódó sárgásbarna, szilárd sókeverék (1,1 g) tartalmazta (133 mg, 0,24 mmol, 54,8% kitemelés). (88) 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7-trisz(etoxi-karbonil-metil-acetát) Ciklén (42,5 mg, 0,25 mmol) 20 ml acetonitriles oldatában SZ8 módosított szilikagélt (2,7 g, 4,25% dietanol-amin borítottsággal) szuszpendáltunk, és 2 óra alatt hozzáadagoltuk a 44 észter (221 mg, 0,98 mmol) 20 ml acetonitriles oldatát. A reakcióelegyet 2 napon keresztül, szobah mérsékleten lassan kevertettük, majd a szilikagélt Schlenk-sz r n kisz rtük, a sz rletet bepároltuk. A visszamaradt sárga, olajos anyagot száraz oszlopos vákuum kromatográfiával tisztítottuk. A termék sárga olaj (125,6 mg, 0,18 mmol, 74,3% kitermelés). (91) Glicin-benzil-észter p-toluolszulfonsav só A vegyületet Zervas és társai152 által leírtak alapján állítottuk el a következ módosításokkal. Glicint (30,03 g, 400 mmol), benzil-alkoholt (173,3 g, 165 cm3, 1,6 mol) és p-toluolszulfonsav monohidrátot (79,90 g, 420 mmol) 70 cm3 vízmentes toluolban szuszpendáltunk, és 8 órán keresztül forraltunk, miközben a reakcióban keletkez vizet azeotróp desztillációval távolítottuk el. A reakcióelegyet szobah mérsékletre leh töttük, 250 ml dietil-étert adtunk hozzá, és a kivált fehér szilárd anyagot üvegsz r n kisz rtük, dietil-éterrel (2 x 25 ml) mostuk, leveg átszivatással szárítottuk, majd ezt követ en diklór-metánból átkristályosítottuk. A termék fehér, lemezes kristályos anyag (124,1 g, 367,8 mmol, 92% kitermelés). 89
4. Kísérleti rész
(92) Glicin-benzil-észter el állítása A 91-sót (12,76 g, 37,8 mmol) jégben h tött Na2CO3-oldatban (37 ml, 1,0446 M) feloldottuk, és háromszor 150 ml kloroformmal extraháltuk. A kloroformos fázisokat egyesítettük, és néhány órán át vízmentes Na2SO4on, majd arról lesz rve egy éjszakán keresztül h t szekrényben MgSO4-on szárítottuk. A szárítószer kisz rését követ en az oldószert alacsony h mérsékleten (30-40 °C) és csökkentett nyomáson kidesztilláltuk. A termék viszkózus színtelen folyadék (6,21 g, 37,76 mmol, 99,4% kitermelés), amelyet a további felhasználáshoz azonnal oldottunk vízmentes diklór-metánban. Az alacsony h mérsékleten történ bepárlásra, valamint a termék azonnal történ feloldására a transzamidáció elkerülése miatt volt szükség. (rac-93) Bróm-propionil-klorid A racém bróm-propinsavat (20,90 g, 0,137 mol) egy kétnyakú lombikban, jeges-sós h t keverékben beh töttük, hozzáadtunk katalitikus mennyiség (10 csepp) PCl3-ot és kis feleslegben alkalmazott tionil-kloridot (17,55 g, 0,148 mol), majd 30 percen keresztül a jeges h t keverékben intenzíven kevertettük. A reaktánsok vízérzékenysége miatt a reakciót nitrogén atmoszféra alatt hajtottuk végre. A reakcióelegyet szobah mérsékletre történ felmelegedés után, további 3-4 napon keresztül 80 °C-on tartottuk. A reakcióelegyet vákuumdesztillációval tisztítottuk (f.p. 56-60 °C, 50-54 Hgmm). A termék színtelen folyadék (15,17 g, 88,49 mmol, 64,7%). (S-93) (S)-(-)-bróm-propionil-klorid A vegyület el állítása a rac-93 racém savklorid el állításával teljesen azonos, (S)-(-)-bróm-propionsavat (25,35 g, 0,165 mol), tionilkloridot (21,60 g, 0,182 mol), valamint PCl3-ot (10 csepp ) felhasználva. A termék színtelen folyadék (20,91 g, 0,122 mol, 73,6% kitermelés). (94) N-(2-bróm-acetil)-glicin-benzil-észter A 92 glicin-észter (4,21 g, 25,48 mmol) 20 ml vízmentes diklór-metános oldatához aceton-szénsavhó h t keverékben történ h tés közben bróm-acetil-bromidot (5,15 g, 25,51 mmol) adtunk. A reakcióelegyet a h t keverékben néhány órát hagytuk állni, majd hagytuk szobah mérsékletre felmelegedni. 18 óra elteltével a kivált fehér csapadékot Schlenk-sz r n kisz rtük, a sz rletb l csökkentett nyomáson az oldószert kidesztilláltuk. A visszamaradt barna szín olaj a szobah mérsékletet felvéve átszilárdult. Ezt a szilárd anyagot a maradék brómacetil-bromid eltávolítása miatt 20 ml pentánban szuszpendálva üvegsz r re vittük, lesz rtük, mostuk további 20 ml pentánnal és néhány ml dietil-éterrel, majd leveg átszívatással szárítottuk. A termék fehér, szilárd anyag (2,00 g, 6,99 mmol, 54,8% kitermelés). (rac-95) (2-bróm-propionil-amino)-ecetsav-benzil-észter A vegyület el állítása a 94 glicin-származék el állításának folyamatával egyezik meg, 92 glicin-észterb l (10,12 g, 61,25 mmol) és racém bróm-propionil-kloridból (5,25 g, 30,62 mmol) kiindulva. A termék halványsárga, szilárd anyag (6,32 g, 21,05 mmol, 68,7% kitermelés). (S-95) S-(-)-(2-bróm-propionil-amino)-ecetsav benzil-észter A vegyület el állítása a 94 észter el állításának folyamatával egyezik meg, 92 glicin-észtert (11,47 g, 69,42 90
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
mmol) és S-93 savkloridot (5,95 g, 34,71 mmol) felhasználva. A termék halványsárga szilárd anyag (7,90 g, 26,3 mmol, 75,8% kitermelés).
(96) Piperazin-N,N’-bisz(acetil-glicin-benzil-észter) (általános eljárás (97) homopiperazin, (98) 1,4,7-triaza-ciklononán, (99) ciklén és (100) Kryptofix-22, származékok el állítására) Piperazin (22,71 mg, 0,26 mmol) 10 ml acetonitriles oldatához i-Pr2NEt nem-nukleofil bázis felesleg jelenlétében (186 µl, 1,1 mmol), szobah mérsékleten, 1 óra alatt hozzáadtunk 5 ml acetonitrilben oldott 95 származékot (150,9 mg, 0,53 mmol). A reakcióelegyet, amelyben fehér anyagkiválást tapasztaltunk, 2 órán keresztül forraltuk, majd az oldószert rotációs bepárlón kidesztilláltuk. A visszamaradt halványbarna, szilárd anyagot 30 ml kloroformban oldottuk, és a keletkez i-Pr2NEt.HBr-ot a termék mell l jégben h tött Na2CO3-oldattal (300 µl, 1,04 M) kiextraháltuk. A kloroformos fázist vízmentes Na2SO4-on, majd annak kisz rése után egy éjszakán át vízmentes MgSO4-on szárítottuk. A szárítószer kisz rése után a sz rletet bepároltuk, és a visszamaradt kissé tapadó, szilárd anyagot dietil-éterben egy üvegbottal jól kezelhet porrá alakítottuk, majd Schlenk-sz r n kisz rtük. A termék halványsárga, szilárd anyag (82 mg, 0,165 mmol, 62,6% kitermelés). A (97) homopiperazin-származék esetében a reakciókörülmények a 96 piperazinszármazéknál leírtakkal teljesen megegyeztek, a termék halványsárga, szilárd anyag (93% kitermelés). A (98) 1,4,7-triaza-ciklononán származék esetében a reakcióid 3 nap, a termék lassan átszilárduló halványsárga, mézszer anyag, amely kb. 23% iPr2NEt.HBr-ot tartalmazott (82% számított kitermelés). A (99) 1,4,7,10-tetraazacikododekán származék el állításánál a reakcióid 4 nap, a termék halványsárga mézszer anyag, amely 10-12% i-Pr2NEt.HBr-ot kötött meg. A i-Pr2NEt.HBr mennyiségének csökkentése miatt a sárga, mézszer anyagot kis mennyiség kloroformban oldottuk, majd 100 mg szilikagélb l készített oszlopon 20 ml kloroformmal eluáltuk. A termék viszkózus, sárga olaj, amelynek i-Pr2NEt.HBr tartalma kb. 6%-ra csökkent (87% számított kitermelés). A (100) Kriptofix-22 származék esetében a reakcióid 2 nap, a termék halványsárga szilárd anyag (63,3% kitermelés). (101) N,N’-bisz(acetil-amino-ecetsav)-piperazin (általános eljárás (102) homopiperazin, (103) 1,4,7-triaza-ciklononán, (104) ciklén és (105) Kryptofix-22 származékok el állítására) A 96 piperazin-észtert (1,715 g, 3,45 mmol) nyomásálló kétnyakú lombikban, nitrogén atmoszféra alatt 20-30 ml metanolban szuszpendáltuk, és a kiindulási észter tömegének 10%-ában Pd/C katalizátort (171 mg, amelynek Pd tartalma 10%) adtunk hozzá. Az alkalmazott körülmények ett l a ponttól kezdve a túlnyomás megsz ntetéséig megegyeznek a 74 piperazin-származéknál leírtakkal. A nyomás megsz ntetése után a reakcióelegyet, néhány ml térfogatig bepároltuk, a kivált fehér csapadékot desztillált vízzel beoldottuk, majd a Pd/C katalizátort Schlenk-sz r n kisz rtük, és a sz rletet rotációs bepárlón bepároltuk. A termék fehér, szilárd anyag (695 mg, 2,2 mmol, 63,7% kitermelés). Ugyanezzel az eljárással a termék a (102) homopiperazin esetében halványsárga olaj (78% kitermelés), a (105) Kryptofix-22 származék esetében fehér, szilárd anyag (76% kitermelés). A (103) 1,4,7-triaza91
4. Kísérleti rész
ciklononán és (104) ciklén származékok esetében a termék kissé olajos, nehezen szilárduló anyag, amelyet kevés acetonitrilben dörzsölés hatására tudtunk átszilárdítani. A szilárd anyagot, amely néhány % i-Pr2NEt.HBr-ot is tartalmazott Schlenk-sz r n kisz rtük, majd az i-Pr2NEt.HBr mennyiségének jelent s részét meleg acetonitrillel történ extrakcióval eltávolítottuk. Számított kitermelés 103: 64,5%; 104: 44% (~2 % i-Pr2NEt.HBr tartalom). (rac-106) 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(2-propionilamino-ecetsav-benzil-észter) Kryptofix-22 (1,261 g, 4,8 mmol) 50 ml acetonitriles oldatához feleslegben alkalmazott i-Pr2NEt jelenlétében (3,4 ml, 19,3 mmol) szobah mérsékleten 2 óra alatt hozzáadtunk 25 ml acetonitrilben oldott 96 származékot (2,8826 g, 9,6 mmol). A reakcióelegyet 1 napig szobah mérsékleten, 7 napon keresztül a forrás h mérsékletén, majd 2 napon keresztül szobah mérsékleten kevertettük, miközben a reakció el rehaladtát vékonyrétegkromatográfiás eljárással vizsgáltuk. Amikor a reakcióban keletkez termékek aránya nem változott tovább, a reakcióelegyet csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradt s r n folyó, olajos anyagot, amelyb l állás közben fehér, hosszúkás kristályok váltak ki, feloldottuk 100 ml CHCl3-ban, majd jégben h tött Na2CO3-oldattal (10,0 ml, 0,9719 mol/dm3) extraháltuk. A szerves fázist el ször vízmentes Na2SO4-on, majd azt követ en MgSO4-on szárítottuk. A szárítószer kisz rése után a sz rletet bepároltuk, és a visszamaradt barnássárga szín , olajos párlatot 20 ml dietil-éterben egy üvegbottal eldolgoztuk. Az eljárást 3-4 alkalommal friss dietiléterrel megismételtük, amíg az olajos állagú anyag teljesen átszilárdult. Az így keletkezett halványbarna, szilárd anyagot Schlenk-sz r re vittük, és tiszta dietil-éterrel extraháltuk. Az extrakció eredményeként visszamaradt szilárd anyagot 10 ml kloroformban feloldottuk, és 2 g, el z leg kloroformban duzzasztott szilikagélb l készített kromatográfiás oszlopon átöntöttük, majd további 30 ml kloroformmal eluáltuk. A tiszta komponenst tartalmazó frakciót bepároltuk, a visszamaradt fehér, szilárd anyag a termék cisz-transz rotációs izomerjeinek 1:2 arányú keveréke (839,1 mg, 1,19 mmol). A dietil-éteres extrakció eredményeként keletkezett dietil-éteres extraktumot csökkentett nyomáson bepároltuk, a visszamaradt sárga, olajos anyagot száraz oszlopos vákuum kromatográfiás eljárással tisztítottuk. A tiszta komponenst tartalmazó frakciókat egyesítettük, az oldószert csökkentett nyomáson kidesztilláltuk. A visszamaradt olajos anyagot dietil-éterben egy üvegbottal eldolgoztuk, aminek hatására az olaj fehér, szilárd anyaggá alakult át. A fehér, szilárd anyagot Schlenk-sz r n kisz rtük, kevés dietiléterrel mostuk, majd leveg átszivatással szárítottuk, ami a termék cisz-transz izomerjeinek 4:1 arányú keveréke (218,9 mg, 0,31 mmol). Cisz-transz rotációs izomerek elválasztása: a rotációs izomerek keverékét meleg acetonitrilben oldottuk, majd hagytuk lassan leh lni. Az oldatból a tiszta transz-izomer fehér kristályok formájában vált ki, amelyet Schlenk-sz r n kisz rtünk. Az acetonitriles sz rletet szobah mérsékleten nitrogénáramban 5 ml térfogatig bepároltuk, a kivált sárga kristályokat Schlenk-sz r n kisz rtük, amely a termék 95%-os tisztaságú cisz-izomerje, 5%-ban transz-izomert tartalmazva. A reakcióban összesen keletkezett rac-106 származék 1,21 g, 1,72 mmol, 35,8% kitermelés. 92
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
(R,R-106) 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(2R-2-propionilamino-ecetsav-benzil-észter) Kryptofix-22 ( 642,7 mg, 2,45 mmol) 30 ml acetonitriles oldatához feleslegben alkalmazott i-Pr2NEt nem-nukleofil bázis jelenlétében (1,75 ml, 9,9 mmol) szobah mérsékleten 2 óra alatt hozzáadtunk 25 ml acetonitrilben feloldott S95 benzil-észtert (1,4723 g, 4,9 mmol). A reakcióelegyet 1 napig szobah mérsékleten, 7 napon keresztül a forrás h mérsékletén, majd 2 napon keresztül szobah mérsékleten kevertettük, miközben a reakció el rehaladtát vékonyréteg kromatográfiás eljárással vizsgáltuk. Amikor a reakcióban keletkez termékek aránya nem változott tovább, a reakcióelegyben kivált fehér, szilárd anyagot Schlenk-sz r n kisz rtük, és kevés acetonitrillel mostuk. Ez a termék tiszta transz-izomerje (339 mg, 0,48 mmol). Az acetonitriles sz rletet csökkentett nyomáson bepároltuk, a visszamaradt sárgásbarna olajos szilárd anyagot 100 ml kloroformban feloldottuk, és jégben h tött Na2CO3oldattal (5,5 ml 0,9719 mol/dm3) extraháltuk. A szerves fázist el ször vízmentes Na2SO4-on, majd MgSO4-on szárítottuk, és a szárítószer kisz rése után rotációs bepárlón bepároltuk. A visszamaradt barnássárga, olajos anyag dietil-éterben üvegbottal történ eldolgozást követ en fehér, szilárd anyaggá szilárdult át. Ezt üvegsz r n kisz rtük, kevés dietil-éterrel mostuk, és leveg átszivatással szárítottuk. A kisz rt fehér, szilárd anyag a termék cisz-transz izomerjeinek 2:3 arányú keveréke (485 mg, 0,69 mmol). Az el z dietil-éteres sz rletet csökkentett nyomáson bepároltuk, a visszamaradt sárga, olajos anyagot (415,7 mg) 10 ml kloroformban oldottuk, és 1 g kloroformban duzzasztott szilikagélb l készített kromatográfiás oszlopon átöntöttük, majd további 20 ml CHCl3-mal és 1 % MeOH tartalmú CHCl3-mal eluáltuk. A tiszta komponenst tartalmazó frakciókat egyesítettük, és csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradt olajos anyag lassan átszilárdult. Az így kapott fehér szilárd anyag a termék 95%-os tisztaságú cisz-izomerje 5%-ban transz-izomert tartalmazva (142,6 mg, 0,20 mmol). A reakcióban összesen keletkezett R,R-106 termék 966,6 mg, 1,38 mmol, 55% kitermelés. (rac-107) 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(2-propionilamino-ecetsav) A rac-106 Kryptofix-22-benzil-észtert (440 mg, 0,63 mmol) egy kétnyakú, nyomásálló lombikban, nirogén atmoszféra alatt feloldottuk 30 ml MeOHban, és a kiindulási észter tömegének 40%-ában Pd/C katalizátort (190 mg, amelynek Pd tartalma 10%) adtunk hozzá. Az alkalmazott körülmények ett l a ponttól kezdve a túlnyomás megsz ntetéséig megegyeznek a 74 piperazin-származéknál leírtakkal. A nyomás megsz ntetése után a reakcióelegyb l a katalizátort Schlenk-sz r n kisz rtük, és a sz rletet csökkentett nyomáson bepároltuk. A termék halványsárga, szilárd anyag (304,9 mg, 0,586 mmol, 93,2% kitermelés). (R,R-107) 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(2R-2-propionilamino-ecetsav) A termék el állításának körülménye teljesen megegyezik a rac-107 Kryptofix-22-származékéval, R,R-106 Kryptofix-22-benzil-észterb l (216,4 mg, 0,31 mmol) és 50 mg Pd/C katalizátorból kiindulva. A kezdetben kissé olajos termék bepárlás 93
4. Kísérleti rész
után, dietil-éterben eldolgozva átszilárdult fehér, szilárd anyaggá (144,7 mg, 90% kitermelés).
(108) 16-tritil-1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán Kryptofix-22-t (10,0037 g, 13,7 mmol) oldottunk 60 ml diklór-metánban, amihez a tritil-klorid (5,3150 g, 6,83 mmol) 60 ml diklór-metános oldatát 2-5 csepp/perc sebességgel adagoltuk. A reakcióelegyet 4 napig forraltuk, majd a reakció során kivált Kryptofix-22 hidrokloridot Schlenk-sz r n kisz rtük. A sz rletet rotációs bepárlón bepároltuk, és a visszamaradt sárga, viszkózus olajat (11,84 g) három részletben, egyenként 30 g Na2CO3-tal impregnált szilikagélb l készített kromatográfiás oszlopon tisztítottuk. Eluálószer: 100 ml CHCl3, 100 ml 3% MeOH tartalmú CHCl3, 100 ml 5% MeOH tartalmú CHCl3, 100 ml MeOH. Az elválasztás eredményességét Na2CO3-tal impregnált Kieselgel 60 szilikagél állófázison, vékonyrétegkromatográfiásan ellen riztük. A tiszta komponenseket tartalmazó frakciókat egyesítettük, és csökkentett nyomáson bepároltuk, majd 100 ml CHCl3-ban feloldottuk, és 100 ml Na2CO3-oldattal (1 mol/dm3) extraháltuk. A kloroformos fázist el ször vízmentes Na2SO4-on, majd MgSO4-on szárítottuk, és a szárítószer kisz rése után a sz rletet rotációs bepárlón bepároltuk. A termék halványsárga, olaj (5,6171 g, 1,12 mmol, 58,3% kitermelés). (109) [2R-2-(16-tritil-1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadec-7-il)-propionilamino]-ecetsav-benzil-észter A 108 Kryptofix-22-tritil-származékot (1,821 g, 3,61 mmol), S-95 benzil-észtert (1,224 g, 4,1 mmol), valamint feleslegben alkalmazott i-Pr2NEt-t (5 ml) feloldottuk 30 ml acetonitrilben, és 5 napon keresztül forraltuk. A reakcióelegyet bepároltuk, és 30 g Na2CO3-tal impregnált szilikagélb l készített kromatográfiás oszlopon tisztítottuk. Eluálószer: 100 ml CHCl3, 100 ml 3% MeOH tartalmú CHCl3, 100 ml 5% MeOH tartalmú CHCl3, 100 ml MeOH. Az elválasztás eredményességét Na2CO3-tal impregnált Kieselgel 60 szilikagél állófázison vékonyréteg kromatográfiás eljárással ellen riztük. A tiszta komponenseket tartalmazó frakciókat egyesítettük, és csökkentett nyomáson bepároltuk. A termék sárgásbarna, gyantás anyag (823 mg, 1,34 mmol, 32% kitermelés). (R-110) [2R-2-(1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadec-7-il)-propionil-amino]ecetsav A eljárás A 109 Kryptofix-22-származékot (108,8 mg, 0,15 mmol) nyomásálló, kétnyakú lombikban, nitrogén atmoszféra alatt oldottuk 20 ml MeOH-ban, és a kiindulási észter tömegének 50%-ában Pd/C katalizátort (50,8 mg, amelynek Pd tartalma 10%) adtunk hozzá. Az alkalmazott körülmények ett l a ponttól kezdve a túlnyomás megsz ntetéséig megegyeznek a 74 piperazin-származéknál leírtakkal. A nyomás megsz ntetése után a reakcióelegyb l a katalizátort Schlenk-sz r n kisz rtük, és a sz rletet csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradt anyagot vízben feloldottuk, majd CHCl3-os extrakciót követ en a vizes fázist vízmentes Na2SO4-on, majd MgSO4on szárítottuk, a szárítószer sz rletb l történ kisz rését követ en az oldószert kidesztilláltuk. A termék fehér, szilárd anyag (51,3 mg, 0,131 mmol, 87% kitermelés). B eljárás Az R-111 Kryptofix-22-származékot (4,5661 g, 9,4 mmol) nyomásálló 94
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
kétnyakú lombikban nitrogén atmoszféra alatt oldottuk 50 ml MeOH-ban, és a kiindulási észter tömegének 12%-ában Pd/C katalizátort (560 mg Pd/C, amelynek Pd tartalma 10 %) adtunk hozzá. Az alkalmazott körülmények ett l a ponttól kezdve a túlnyomás megsz ntetéséig megegyeznek a 74 piperazin-származéknál leírtakkal. A reakció el rehaladását vékonyrétegkromatográfiásan cellulóz állófázison ellen riztük. A nyomás megsz ntetése után a reakcióelegyb l a katalizátort Schlenk-sz r n kisz rtük, és a sz rletet csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradt sárga, olajos anyagot (3,86 g) száraz oszlopos vákuum kromatográfiás eljárással tisztítottuk. A tiszta komponenseket tartalmazó frakciókat egyesítettük, és az oldószert kidesztilláltuk. A tiszta termék sárga, olajos anyag, amely lassan állás közben kristályosodik (1,4624 g, 3,73 mmol, 39,4% kitermelés).
(rac-110) [2-(1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadec-7-il)-propionil-amino]ecetsav A vegyület el állítása megegyezik a R-110 Kryptofix-22-származéknál leírt B eljárással, rac-111 Kryptofix-22-észterb l (6,9900 g, 14,5 mmol) és 700 mg Pd/C katalizátorból kiindulva. A tiszta termék sárga, olajos anyag, amely állás közben lassan kristályosodik (2,7140 g, 6,93 mmol, 47,8% kitermelés). (R-111) [2R-2-(1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadec-7-il)-propionil-amino]ecetsav-benzil-észter Kryptofix-22-t (14,1098 g, 53,78 mmol) oldottunk 50 ml acetonitrilben, majd lassan csepegtetve (3-4 csepp/perc) hozzáadagoltuk a S-95 benzilészter (8,0690 g, 26,87 mmol) 20 ml acetonitriles oldatát. A reakcióelegyet 4 napig szobah mérsékleten kevertettük, majd 8 órán keresztül 80 ºC-on melegítettük. A reakció során kivált fehér csapadékot Schlenk-sz r n kisz rtük, a sz rletet csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradt sárga, olajos anyagot 30 ml dietil-éterben egy üvegbottal eldolgoztuk, majd a dietil-éterben kivált fehér szilárd anyagot Schlenk-sz r n kisz rtük, és asz rletb l az oldószert kidesztilláltuk. A visszamaradt sárga, olajos anyagot száraz oszlopos vákuum kromatográfiásan tisztítottuk. A termék halványsárga, olajos anyag (5,4544 g, 11,32 mmol, 42% kitermelés). (rac-111) [2-(1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadec-7-il)-propionil-amino]-ecet-sav-benzil-észter A vegyület el állítása a R-111 Kryptofix-22-származéknál leírtakkal azonos körülmények között történt, Kryptofix-22-b l (11,8856 g, 45,3 mmol) és rac-95 vegyületb l (6,8000 g, 22,65 mmol) kiindulva. A termék halványsárga, olajos anyag (4,7538 g, 9,87 mmol, 43,6% kitermelés). Klór-propil-csoporttal módosított és trimetil-szilánnal véglezárt szilikagél A lépés Az eljárást Da és társai által leírt módszer alapján végeztük kisebb módosításokkal139. A kísérletet abszolutizált oldószerekkel, nitrogén atmoszférában hajtottuk végre. 100 g szilikagélt (Kieselgel 60, 230-400 mesh) vákuum-szárítószekrényben (3-5 g szilikagél esetén vákuum-szárítópisztolyban P2O5 fölött) 2 Hgmm-en és 100 °C-on 4-5 nap alatt súlyállandóságig szárítottunk. Ezt követ en a vízmentes szilikagélt egy KPG-kever vel ellátott háromnyakú lombikban, 300 ml vízmentes toluolban (víztart. Max 0,0075 %) 95
4. Kísérleti rész
szuszpendáltuk, hozzáadtunk 16 ml (3-klórpropil)-trimetoxi-szilán-t, majd lassan kevertetve három napon keresztül nitrogén atmoszférában forraltuk. A szilikagélt ezt követ en a reakcióelegyb l Schlenk-sz r n kisz rtük, a maradék kiindulási (3-klórpropil)-trimetoxi-szilán eltávolítása miatt mostuk több adag tiszta meleg toluollal, THF-fel, metanollal és végül dietil-éterrel, majd nitrogénáramban melegítve súlyállandóságig szárítottuk. A kiindulási szilikagélhez képest 7,6 g súlynövekedést tapasztaltunk. B lépés A véglezárási reakciót a Sudo és társai által közölt módszer szerint végeztük kisebb módosításokkal157. Ehhez az A lépésben el állított módosított szilikagélt az A lépésben alkalmazott körülmények között szuszpendáltuk 250 ml száraz toluolban, hozzáadtuk a trimetil-klór-szilánt, és 1 órát szobah mérsékleten, majd 4 órát a forrás h mérsékletén kevertettük. Az így véglezárt szilikagélt az A lépésben leírt módon dolgoztuk fel, és súlyállandóságig való szárítást követ en felhasználtuk. Fontos! A szililez ágensek egészségre ártalmas anyagok, nagyon irritálóak, torokfájást, torokduzzanatot okoznak. A szililez ágenssel történ munkákat kizárólag vegyifülke alatt végezzük. Mivel a szililez ágensek nedvesség hatására könnyen hidrolizálnak, valamennyi velük folytatott reakciót inert atmoszférában kell kivitelezni. (SZ8) Klór-propil csoporttal módosított, trimetil-szilánnal véglezárt szilikagél további módosítása dietanol-aminnal A kísérletet abszolutizált oldószerekkel, nitrogén atmoszférában hajtottuk végre. Az el z reakcióban kapott klór-propil-csoporttal módosított szilikagélt (102,6 g) egy KPG-kever vel ellátott háromnyakú lombikban, 350 ml vízmentes acetonitrilben szuszpendáltuk, feleslegben számított dietanol-amint (52 ml, 0,54 mol) adtunk hozzá, majd a reakcióelegyet lassú kevertetés közben 3 napon keresztül forraltuk. Ezt követ en a szilikagélt Schlenk-sz r n kisz rtük, amit a feleslegben maradt dietanol-amin eltávolítása miatt mostunk több adag metanollal, pH=9-10 ammónia-oldattal, majd ismételten néhány adag metanollal, és végül vákuumszárítószekrényben súlyállandóságig szárítottuk. A szilikagélen megköt dött dietanol-amin tartalmat savval való titrálással illetve lúgos feltárással egyaránt meghatároztuk, a szilikagél dietanol-aminra nézve 4,2%-os borítottsággal rendelkezik.
(SZ9) Klór-propil-csoporttal módosított, trimetil-szilánnal véglezárt szilikagél további módosítása R-110 Kryptofix-22-származékkal A kísérletet abszolutizált oldószerekkel, nitrogén atmoszférában hajtottuk végre. Egy 4,5.10-4 mol Cl / 100 g szilikagél borítottsággal rendelkez klór-propil-csoporttal módosított és trimetilszilánnal véglezárt szilikagélt (603,2 mg), valamint a szilikagél klórtartalmára számított 1,5-szeres sztöchiometriai mennyiség R-110 Kryptofix-22-származékot (273,8 mg) és feleslegben alkalmazott i-Pr2NEt-ot egy KPG-kever vel ellátott háromnyakú lombikban, 50 ml vízmentes acetonitrilben szuszpendáltuk. A reakcióelegyet 4 napon keresztül 100 °C alatti h mérsékleten melegítettük, majd a szilikagélt Schlenk-sz r n kisz rtük, metanollal mostuk, és metanollal extraháltuk. Az extrahált gélt dietil-éterrel mostuk, és nitrogénáramban súlyállandóságig szárítottuk. Az így kapott gél 1,8.10-5 mol R-110származék / 100 mg gél borítottsággal rendelkezik.
96
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
Klór-propil-csoporttal és dietanol-aminnal módosított szilikagél dietanol-amin tartalmának meghatározása A eljárás Ammónia-oldattal mosott SZ8 szilikagélt (408,7 mg) kevés vízben szuszpendáltunk, 5,00 ml 0,10105 mol/dm3 sósav-oldatot adtunk hozzá, és néhány percen keresztül, lassan kevertettük. Metilnarancs indikátor jelenlétében NaOH-mér oldattal (0,1348 mol/dm3, 2,58 ml) a dietanol-aminnal nem reagált HCl-mér oldatot visszatitráltuk. A fogyások értelmében a szilikagél borítottsága dietanol-aminra nézve 4,23%-os (0,4 mmol dietanol-amino-csoport / 1 g szilikagél). B eljárás Az ammónia-oldatos mosással deprotonált SZ8 szilikagélt (393,4 mg) egy kémcs ben 3,4 mol/dm3-es NaOH-oldatban lánggal melegítettünk úgy, hogy a h hatására fejl d ammóniát elnyelettük egy ismert koncentrációjú és tréfogatú HClmér oldatban (5,00 ml, 0,10105 mol/dm3) a rendszeren átvezetett nitrogéngáz segítségével. A feltárás befejeztével a HCl-mér oldatot metilnarancs indikátor jelenlétében NaOH-mér oldattal (0,1348 mol/dm3, 3,75 ml) visszatitráltuk. A fogyások értelmében a szilikagél borítottsága dietanol-aminra nézve 4,25%-os (0,4 mmol dietanolamino-csoport / 1 g szilikagél).
97
5. Összefoglalás
5. ÖSSZEFOGLALÁS Doktori munkám során olyan gy r s diaminok (piperazin, homopiperazin), polioxa-diaza-koronaéterek (Kryptofix-21, Kryptofix-22) és poliaza-makrociklusos vegyületek (1,4,7-triaza-ciklononán, 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán) származékait állítottuk el , amelyek eredményeink szerint alkalmazást nyerhetnek az orvosdiagnosztika, a terápia és az analitika területén. Több eljárást dolgoztunk ki olyan hidrolizáló, új észterszármazékok el állítására, amelyek alkalmasak lehetnek a sejten belüli állapot diagnosztizálására, vagy egyes toxikus fémionok szervezetb l történ kiürülésének meggyorsítására. Az észterek szintézisére használt egyik általános eljárás során olyan α-bróm-karbonsavésztereket kapcsoltunk gy r s diaminokhoz, illetve polioxa-diaza-koronaéterekhez, amelyek önmagukban, vagy rokonvegyületeikben már alkalmazásra kerültek gyógyszerhatóanyagok felszívódásának javítására, például a gyakorlatban elterjedten alkalmazott, b rön keresztül felszívódó észterszármazékok, mint például az etoxi-karbonil-metil-acetát, a benzil-acetát illetve a 2-hidroxi-etil-acetát. Az eljárást a poliaza-makrociklusokra, azok szekunder aminocsoportjainak bázicitása közötti meglehet sen nagy különbségnek köszönhet en fellép mellékreakciók miatt nem vagy csak korlátozottan tudtuk kiterjeszteni. Több poliaza-makrocilusos észterszármazék el állítását oldottuk meg a makrociklusos vegyületek acetát- illetve észterszármazékaiból egyszer en el állítható tetraalkilammónium-sóin keresztül. Kidolgoztunk továbbá egy olyan új módszert, amelyben regioszelektíven szubsztituált makrociklusos észterszármazékok el állítását valósítottuk meg, véd csoport alkalmazása nélkül, dietanol-aminnal módosított szilikagél felhasználásával. A különböz hidrolizáló észterszármazékok hidrolízissebességének meghatározását, és a hidrolízis során keletkez termékek azonosítását 1H NMR spektroszkópiás módszerrel végeztük. A vizsgálatokat piperazin származékokkal, mint modellvegyületekkel hajtottuk végre, majd makrociklusos származékok felhasználásával bizonyítottuk, hogy a gy r méret nem befolyásolja az oldalláncok hidrolitikus tulajdonságát. A hidrolízistermékek toxicitását, valamint a fiziológiás körülmények között végbemen hidrolízisfolyamatok sebességét figyelembe véve megállapítottuk, hogy a vizsgált észterszármazékok közül az N-etoxi-/ és N-butoxikarbonil-metil-acetát származékok elegend en nagy stabilitást mutatnak a spontán hidrolízissel szemben. Az él szervezetben is el forduló izolált észteráz enzimmel végzett enzimatikus hidrolízisvizsgálatok alapján pedig a célfelhasználás szempontjából elfogadható id n belül, a vizsgált diamin/makrociklusos vegyület szabad karboxi-metil-csoportot tartalmazó komplexképz származékává hidrolizálnak. Az észteráz enzimben gazdag májhomogenizátumon és májszeleteken végzett kísérletek során megállapítottuk, hogy az N-etoxi-/ és N-butoxi-karbonilmetil-acetát oldalláncokat tartalmazó diaza-koronaéter származékok képesek bejutni az él májszövetekbe, és a szöveteken belül enzimek hatására a fémionok szelektív 98
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
megkötésére alkalmas karboxi-metil-származékká, az ODDA-vá alakulnak át. Kimutattuk, hogy az ODDA a vizsgált észterszármazékokhoz képest önmagában sokkal kisebb hatékonysággal jut be az él szövetekbe, ezáltal igazoltuk, hogy a makrociklusos vegyületek él szervezetbe történ bejuttatásához a lipofil észtercsoportok kialakításának nagyon fontos szerepe van. Kétféle, peptidkötést tartalmazó oldalláncokkal (N-acetil-amino-ecetsav és a N-propionil-amino-ecetsav) szubsztituált peptidszármazékokat állítottunk el , amelyek oldalláncában el forduló peptid- és karboxilátcsoportok hozzájárulnak az alap makrociklus gy r különböz ionokkal és guest molekulákkal kialakuló stabilis komplexeinek képz déséhez. Az N-acetil-amino-ecetsav oldallánccal valamennyi vizsgált gy r s diamin, Kryptofix-22 diaza-koronaéter és poliaza-makrociklus diszubsztituált származékát, az N-propionil-amino-ecetsav oldallánccal a Kryptofix22 diaza-koronaéter mono-, és diszubsztituált származékait állítottuk el . A diszubsztituált származékokat a megfelel bróm-származék-benzil-észter makrociklusos vegyülethez történ kapcsolásával, majd a benzilcsoport eltávolításával szintetizáltuk. A monoszubsztituált, N-propionil-amino-ecetsav oldalláncot tartalmazó Kryptofix-22 származékot kétféle eljárással állítottuk el , a bróm-propionil-amino-ecetsav-benzil-észtert a tritil-csoporttal regioszelektíven védett diaza-koronaéterrel, illetve a szubsztituálatlan kiindulási Kryptofix-22 feleslegével reagáltattuk, majd a tritil- és benzilcsoportokat eltávolítottuk. A diszubsztituált N-propionil-amino-ecetsav-benzil-észterek szintézise során azonosíottuk és izoláltuk a peptidkötés gátolt rotációja miatt kialakult cisz- és transz-izomereket. Az el állított peptidszármazékok protonálódási állandóinak meghatározásához pH-potenciometriás és 1H NMR spektroszkópiás, míg az egyes fémkomplexeinek stabilitási állandóinak meghatározásához pH-potenciometriás technikát alkalmaztunk. A kétféle módszerrel meghatározott protonálódási állandók jó egyezést mutattak. Megállapítottuk, hogy a peptidkötést tartalmazó oldalláncok beépülésével a karboxilátcsoportok gy r -nitrogénekt l mért megnövekedett távolságának következtében, a vegyületek fémkomplexei a karboxi-metil-származékhoz (ODDA) képest kisebb stabilitással rendelkeznek. Megállapítottuk, hogy a diszubsztituált, Kryptofix-22 N-propionil-amino-ecetsav származékának R,R enantiomerje sztérikus okok miatt stabilabb komplexeket képez, mint a racém származéka, azaz a molekula konfigurációjának számottev szerepe van a komplexképzésben. Kimutattuk, hogy valamennyi el állított Kryptofix-22 származék figyelemre méltóan nagy Pb2+/Zn2+ illetve Cd2+/Zn2+ szelektivitást mutat, nagyobbat, mint a karboxi-metil-származék, az ODDA. Az eredmények alapján a Kryptofix-22 peptidszármazékok potenciálisan alkalmasak lehetnek az él szervezetbe jutott Pb2+- illetve Cd2+-ionok eltávolítására anélkül, hogy a létfontosságú Zn2+-ionok intracelluláris koncentrációját számottev en csökkentenék. A DOTAGly Eu(III)-ionnal alkotott komplexének kinetikai tulajdonságát tanulmányozva megállapítottuk, hogy fiziológiás körülmények között az [Eu(DOTAGly)- komplex formájában létezik, és kinetikailag megfelel en inert 99
5. Összefoglalás
ahhoz, hogy alkalmas legyen az orvosdiagnosztikában nagy érdekl déssel bíró CEST-kontrasztanyagként történ felhasználásra. Kapilláris elektroforézis technikával megvizsgáltuk a monoszubszitutált, Npropionil-amino-ecetsav oldallánccal rendelkez Kryptofix-22 származékok primeraminovegyületek enantiomerjeinek elválasztására gyakorolt hatását. Megállapítottuk, hogy a vizsgált Kryptofix-22 származékok önmagukban nem alkalmasak elválasztásra, azonban kett s elektrolit rendszerekben a koronaéterhez és a diaza-koronaéterhez képest, sok esetben elválasztást indukálva, jelent sen megnövelik a ciklodextrinek elválasztásra gyakorolt hatását. Molekulamechanikai és szemiempirikus kvantumkémiai számításokkal modelleztük az aminosavszármazékok, a diaza-koronaéter származékok és a ciklodextrin között kialakuló trimolekulás komplex szerkezetét. Kimutattuk, hogy a számítások szerint leginkább szerkezetben a peptid oldallánc, valamint a puffer valószín síthet dihidrogénfoszfát-ionjai hidrogénkötések és elektrosztatikus kölcsönhatások kialakításával meghatározó stabilizáló szerepet töltenek be. Néhány aminosavszármazék esetében, kett s elektrolit rendszerekben, kísérleti tervezéssel megállapítottuk a legoptimálisabb elválasztási körülményeket. Az N-acetil-amino-ecetsav oldalláncot tartalmazó diaza-koronaéterszármazék (ODDAGly) kromatográfiás felhasználásának gyakorlati jelent ségét igazolták mikroemulziós elektrokinetikus kromatográfiás mérésekkel. Az eredmények szerint az ODDAGly kiválóan alkalmas, mint elválasztást módosító adalékanyag, az új TMC114 HIV-proteáz inhibitor diasztereomer párjainak megkülönböztetésére. Azon túl, hogy a monoszubsztituált származékokat kapilláris elektroforézissel vizsgáltuk, kutatásainkat kiterjesztettük még a monoszubsztituált diaza-koronaéter származékokkal módosított szilikagél állófázisok el állítására is. Kidolgoztunk egy eljárást, amellyel a származék szilikagélen történ megköt désének mértékét meghatároztuk, és bizonyítottuk, hogy a módosított szilikagél komplexképz tulajdonsága a szilikagélen kötött diaza-koronaéter származéknak köszönhet , és a módosítatlan szilikagél esetében nem létezik.
100
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
6. SUMMARY In this work ester and amide derivatives of cyclic diamines (piperazine, homopiperazine), polyoxa-diaza crown ethers (Kryptofix-21, Kryptofix-22) and polyaza-macrocyclic compounds have been synthesized and extensively studied for diagnostic, therapeutic and analytical applications. A variety of synthetic methods have been worked out for the synthesis of new ester derivatives attached with disposable pendant arms, which are able to enter living tissues. In one of the methods α-bromo-carboxylic acid esters have been reacted with cyclic diamines and polyoxa-diaza crown ethers. Some of the chosen α-bromo-carboxylic acid esters have already been applied in order to improve the uptake properties of active ingredients of drugs. This method could be applied for the synthesis of polyaza-macrocyclic derivatives only in a limited number of cases, because of numerous side reactions that occurred due to the rather large difference between the basicity of their secondary amino groups. Several polyaza-macrocyclic esters have been synthesized via the tetraalkylammonium salts of their carboxymethyl derivatives. The tetraalkylammonium salts were prepared in order to increase the solubility and the nucleophility of the carboxylate anion. Regioselectively substituted macrocyclic esters have been synthesized applying silica gel modified by diethanol-amine. The main advantages of this new method are that the use of protecting groups is eliminated, less reaction step is needed and the reacted silica gel can be easily removed from the reaction mixture and after neutralization it can be recycled. Determination of the hydrolysis rate of the different ester derivatives and the identification of the hydrolysis products were carried out by using 1H NMR spectroscopy. The hydrolytic processes were performed first on piperazine ester derivatives as model compounds, and then on macrocyclic ester derivatives. It has been established that the ring size has negligible effect on the hydrolytic properties (rate and mechanism) of the pendant arms. Toxicity of the hydrolysis products and the rate of the hydrolysis under physiological conditions were considered in order to establish that among the examined ester derivatives, those which contain N-ethoxy-/ N-butoxycarbonylmethyl pendant arms are stabile enough against the spontaneous hydrolysis. In the presence of isolated esterase enzyme, also present in the living cells, these derivatives hydrolyze into the free carboxylic pendant arm containing complexing agent within an acceptable time. In order to check the in vitro hydrolysis and uptake properties, N-ethoxy-/ Nbutoxycarbonylmethyl ester derivatives of diaza-crown ether were tested either on liver homogenate or on slices both rich in esterase enzyme. The experiments clearly showed that these esters are able to enter liver cells, hydrolyze inside the cell by enzymes liberating the free carboxylic pendant arm containing complexing agent (ODDA), which is capable for selective complex formation with different metal ions. It was pointed 101
6. Summary
out, that however ODDA was able to enter into liver cells, but with significantly lower efficiency than the N-ethoxy-/ N-butoxycarbonylmethyl derivatives. Based on the performed experiments it was confirmed, that the presence of lipohilic ester pendant arms is very important in order to introduce macrocyclic complexing agents into living tissues, so the objectives of our study has realized. We have synthesized peptide derivatives with two, peptide bond containing pendant arms (N-acetyl-amino-acetic acid and N-propionyl-amino acetic acid), in which the peptide- and carboxylic groups assist in the stabile complex formation of the macrocyclic ring with different ions and guest molecules. Disubstituted, Nacetyl-amino-acetic acid derivatives of all of the studied cyclic compounds, and mono-, and disubstituted N-propyonyl-amino-acetic acid pendant arm-containing Kryptofix-22 diaza-crown ether derivatives have been synthesized. The disubstituted derivatives were synthesized by reacting the suitable bromoderivative-benzyl ester with the appropriate cyclic compounds. Two methods were used for the synthesis of the monosubstituted, N-propionyl-amino-acetic acid pendant arm-containing Kryptofix-22 derivative. Bromo-propionyl-amino-acetic acid benzyl ester was reacted with Kryptofix-22 regioselectively protected by tritil group and with the unsubstituted Kryptofix-22 applied in excess, respectively. The tritil and benzyl protecting groups were then removed by catalytic hydrogenation. Due to the hindered rotation of the peptide bond the cis- and trans-isomers of disubstituted N-propionyl-amino-acetic acid benzyl esters were determined and isolated. The protonation constants of the synthesized peptide derivatives and the stability constants of their metal complexes were determined by pH-potentiometry and 1H NMR spectroscopy. The protonation constants determined by the two techniques were in good agreement. It was established, that the metal complexes of the peptide derivatives had significantly lower stability compare to the metal complexes of the carboxymethyl derivative (ODDA) due to the higher distance between the carboxylic group and the ring nitrogen atoms. It was determined, that the R,R enantiomer of the disubstituted, N-propyonil-amino-acetic acid pendant arm containing Kryptofix-22 formed more stabile complexes compare to its racemic derivative, which means that the absolute configuration of the chiral centre plays an important role in the complex formation. It was established that all of the synthesized diaza-crown ether derivatives showed noticeably high Pb2+/Zn2+ and Cd2+/Zn2+ selectivity, higher than the carboxymethyl derivative. These peptide derivatives can be considered as potential candidates for the removal of the toxic lead and cadmium ions from the living organism without the excretion of essential zinc ion. Studying the kinetic property of the Eu-complex of DOTAGly it was stated, that under physiological conditions the complex exists in its [Eu(DOTAGly)- form, and
102
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
its kinetic inertness is high enough for medical application as a CEST contrast agent. Capillary electrophoresis technique was used to investigate the effect of the monosubstituted Kryptofix-22 derivative having N-propionyl-amino-acetic acid pendant arm on the enantiomer separation of primary amino group-containing amino acid derivatives. However, it has been pointed out, that neither of the studied Kryptofix-22 derivatives produced enantiomer separation individually; they can improve the effect of cyclodextins and result in a high degree of separation when used in cyclodextrin-containing dual electrolyte systems. Moleculamechanical and semiempirical quantumchemical calculations were performed for the investigation of the structure of the trimolecular complex formed between the Kryptofix-22 derivative, amino acid derivative and cyclodextrin. It was established, that the peptide pendant arm and the dihydrogenphosphate ions of the buffer solution play determinative stabilizing role in the most possible trimolecular structure. They form hydrogen bonds and electrostatic attraction between the amido -NH, the protonated amino groups and the negatively charged oxygen atoms of the dihydrogenphosphate ions. Experimental design approach was used to find optimal separation conditions in dual electrolyte systems for amino-acid derivatives. Microemulsion electrokinetic chromatography measurements appeared to offer utilization of the N-acetyl-amino-acetic acid pendant arms containing Kryptofix-22 derivative (ODDAGly). Based on the results the non-chiral diazacrown ether compound was capable for the separation of the diastereomers of a new HIV-protease inhibitor TMC114. Over the capillary electrophoretic study, our work was extended for the synthesis of silica gel stationary phase modified by the monosubstituted diazacrown ether derivatives. Stationary phases modified with chiral crown ether derivatives have already been used for separation of chiral compounds either in HPLC or CEC. We have worked out a method in order to determine the amount of the diaza-crown ether derivative bounded on the silica gel surface, and confirmed, that the complexing property of the modified silica gel is due to the diaza-crown ether derivatives, and it does not exist in case of the unbounded silica gel.
103
7. Irodalmi hivatkozások
7. IRODALMI HIVATKOZÁSOK (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26)
104
Hannongbua, S. V.; Rode, B. M. Inorganic Chemistry 1985, 24, 2577. Hancock, R. D. Pure and Applied Chemistry 1986, 58, 1445-1452. Hancock, R. D.; Martell, A. E. Chemical Reviews 1989, 89, 1875-1914. Hancock, R. D. Journal of Chemical Education 1992, 69, 615-621. Hannongbua, S. Inorganica Chimica Acta 1992, 202, 85. Chantson, T. E.; Hancock, R. D. Inorganica Chimica Acta 1995, 230, 165-167. Cho, M. H.; Shin, S. C. Bulletin of the Korean Chemical Society 1995, 16, 33-36. Kim, H. D.; Jung, H. J.; Jung, O. J. Bulletin of the Korean Chemical Society 1993, 14, 561-567. Bradshaw, J. S.; Izatt, R. M. Accounts of the Chemical Research 1997, 30, 338345. London, R. E. Annu. Rev. Physiol. 1991, 53, 241-258. Mayer, A.; Neuenhofer, S. Angewandte Chemie International Edition in English 1994, 33, 1044-1072. Czarnik, A. W. Accounts of the Chemical Research 1994, 27, 302-308. Reany, O.; Gunnlaugsson, T.; Parker, D. Chemical Communication 2000, 473474. Gunlaugsson, T. Tetrahedron Letters 2001, 42, 8901-8905. Lim, N. C.; Yao, L.; Freake, H. C.; Brückner, C. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 2003, 13, 2251-2254. Ramasamy, R.; Lázár, I.; Brücher, E.; Sherry, A. D.; Malloy, C. R. FEBS Letters 1991, 280, 121-124. Lázár, I.; Sherry, A. D. Journal of the Chemical Society Chemical Communications 1991, 1252-1253. Lázár, I.; Ramasamy, R.; Brücher, E.; Geraldes, C. F. G. C.; Sherry, A. D. Inorganica Chimica Acta 1992, 195, 89-93. van Haveren, J.; DeLeon, L.; Ramasamy, R.; van Westrenen, J.; Sherry, A. D. NMR in Biomedicine 1995, 8, 197-205. Huskens, J.; Sherry, A. D. Inorganic Chemistry 1996, 35, 5137-5143. Huskens, J.; Sherry, A. D. Journal of the American Chemical Society 1996, 118, 4396-4404. Lauffer, R. B. Chemical Reviews 1987, 87, 901-927. Sherry, A. D. Journal of the Less-Common Metals 1989, 149, 133-141. Schaefer, M.; Meyer, D.; Beaute, S.; Doucet, D. Magnetic Resonance in Medicine 1991, 22, 238-241. Bradshaw, J. S.; Alsop, D.; Meacham, T.; Josep, P.; Kressel, H.; Kung, H. F. In Proceedings of the Society of Magnetic Resonance in Medicine, XII Annual Scientific Meeting, New York, NY, USA,, 1993 Aug. 14-20, 750. Platzek, J.; Fruzel, T.; Muller-Farnow, A.; Raduchel, B.; Schuhman-Giampieri, G.; Weinmann, H. J. 1993. In Proceedings of the Society of Magnetic Resonance
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
(27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) (40) (41) (42) (43) (44) (45) (46)
in Medicine, XII Annual Scientific Meeting, New York, NY, USA,, 1993 Aug. 1420, 751. Sherry, A. D. Journal of Alloys and Compounds 1997, 249, 153-159. Aime, S.; Botta, M.; Garino, E.; Crich, S. G.; Giovenzana, G.; Pagliarin, R.; Palmisano, G.; Sisti, M. Chemistry, A European Journal 2000, 6, 2609-2617. Anelli, P. L.; Lattuada, L.; Lorusso, V.; Schneider, M.; Tournier, H.; Uggeri, F. Magnetic Resonance Materials in Physics, Biology and Medicine 2001, 12, 114120. Weinmann, H.-J.; Ebert, W.; Misselwitz, B.; Schmitt-Willich, H. European Journal of Radiology 2003, 46, 33-44. Lencioni, R.; Cioni, D.; Crocetti, L.; Della Pina, C.; Bartolozzi, C. Journal of Hepatology 2004, 40, 162-171. Lamberts, S. W. J.; Bakker, W. H.; Reubi, J.-C.; Krenning, E. P. J. Steroid in Biochemistry and. Molecular Biology 1990, 37, 1079-1082. Otte, A.; Jermann, E.; Behe, M.; M., G.; Bucher, H. C.; Roser, H. W.; Heppeler, A.; Mueller-Brand, J.; Maecke, H. R. European Journal of Nuclear Medicine 1997, 24, 792-795. Andre, J. P.; Maecke, H. R.; Zehnder, M.; Macko, L.; Akyel, K. G. Chemical Communications 1998, 1301-1302. Behr, T. Targeted radioniclide therapy, In COST D8/D18 European Workshop: Biomedical applications of lanthanide complexes, Prága, Cseh Köztársaság, 2000, Szept. 14-17, 5. Norman, T. J.; Smith, F. C.; Parker, D.; Harrison, A.; Royle, L.; Walker, C. A. Supramolecular Chemistry 1995, 4, 305-308. Peterson, J. J.; Pak, R. H.; Meares, C. F. Bioconjugate Chemistry 1999, 10, 316320. Brücher, E.; Gy ri, B.; Emri, J.; Sólymosi, P.; Sztanyik, L. B.; Varga, L. Journal of the Chemical Society Chemical Communications 1993, 574. Varga, L. P.; Sztanyik, L. B.; Rónai, E.; Bodó, K.; Brücher, E.; Gy ri, B.; Emri, J.; Kovács, Z. Internal Journal of Radiation Biology 1994, 66, 399-405. Smith, N. W. Journal of Chromatography A 1993, 652, 259-262. Lucy, C. A.; Brown, R.; Yeung, K. K.-C. Journal of Chromatography A 1996, 745, 9-15. Nguyen, N. T.; Siegler, R. W. Journal of Chromatography A 1996, 735, 123-150. Altria, K. D.; Kelly, M. A.; Clark, B. J. Trends in Analytical Chemistry 1998, 17, 214-226. Chankvetadze, B. Capillary electrophoresis in chiral analysis; Wiley: Chichester, 1997, 275 Perrin, C.; Vander Heyden, Y.; Maftouh, M.; Massart, D. L. Electrophoresis 2001, 22, 3203-3215. Matthijs, N.; Perrin, C.; Maftouh, M.; Massart, D. L.; Vander Heyden, Y. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2002, 27, 515-529. 105
7. Irodalmi hivatkozások
(47) Kuhn, R.; Steinmetz, C.; Bereuter, T.; Haas, P.; Erni, F. Journal of Chromatography A 1994, 666, 367-373. (48) Nishi, H.; Nakamura, K.; Nakai, H.; Sato, T. Journal of Chromatography A 1997, 757, 225-235. (49) European Pharmacopoeia; Third Edition; Council of Europe: Strasbourg, 2001; supplement. (50) The Merck Index; 10th Edition; Merck & Co., Inc.: Rahway, N.J., U.S.A., 1983. (51) Chang, C. A. European Journal of Solid State Inorganic Chemistry 1991, 28, 237244. (52) Zhang, X.; Chang, C. A.; Brittain, H. G.; Garrison, J. M.; Telser, J.; Tweedle, M. F. Inorganic Chemistry 1992, 31, 5597-5600. (53) Kumar, K.; Tweedle, M. F. Pure and Applied Chemistry 1993, 65, 515-520. (54) Aime, S.; Castelli, D. D.; Terreno, E. Angewandte Chemie, International Edition 2002, 41, 4334-4336. (55) Aime, S.; Barge, A.; Castelli, D. D.; Fedeli, F.; Mortillaro, A.; Nielsen, F. U.; Terreno, E. Magnetic Resoncnce in Medicine 2002, 47, 639. (56) Zhang, S.; Winter, P.; Wu, K.; Sherry, A. D. Journal of the American Chemical Society 2001, 123, 1517-1518. (57) Zhang, S.; Wu, K.; Biewe, M. C.; Sherry, A. D. Inorganic Chemistry 2001, 40, 4284-4290 (58) Lázár, I. Nitrogéneken foszfortartalmú oldallánccal szubsztituált új triaza- és tetraaza-makrociklusos ligandumok el állítása és komplexképz tulajdonságaik, kandidátusi értekezés, MTA TMB, Budapest, 1993. (59) Kovács, Z.; Sherry, A. D. Synthesis 1997, 759-763. (60) Bevilacqua, A.; Gelb, R. I.; Hebard, W. B.; Zompa, L. J. Inorganic Chemistry 1987, 26, 2699-2706. (61) http://www-iarc.fr/htdocs/monograph/vol58/mono58-2.htm 1993, 58, 119. (62) Csalári, J.; Szántai, K. Mainstream and sidestream smoke formation of tobacco-cut cased by Zn salt in model experiment, In Mengen- und Spurenelemente, Arbeitstagung, 20th,; Jéna, Németország, 2000, Dec. 1-2., 445-452. (63) Miller; Scott, C.; Bruenger; Friedrich, W. United States Patent No. 5,403,862, 1995. (64) Reith, D. J. Paediatrics and Child. Health 2003, 39 (8), 623-626. (65) http://www.zip.com.au/-djrat/lanv3n3/lanv3n3-6.html Lead Action News 1994, 3. (66) Black, M. C.; Williams, P. L. Journal of Soils and Sediments 2001, 1(4), 213-216. (67) Denut, I.; Bud, I.; Pop, I. In Water-Rock Interaction, Proceeding of the International Symposum on Water-Rock Interaction, 10th, Villasimius, Italy, 2001, Jún. 10-15., 1205-1208. (68) Berka, M.; Demeter, A.; Borbély, J.; Bányai, I. Magyar Kémiai Folyóirat 2002, 108(9), 413-420. (69) Lakatos, G.; Fleit, E.; Mészáros, I. Toxicology Letters 2003, 140-141, 333-342.
106
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
(70) Aposhian, H. V.; Maiorino, R. M.; Gonzalez-R., D.; Zuniga-C., M.; Xu, Z.; Hurlbut, K. M.; Junco-M., P.; Dart, R. C.; Aposhian, M. M. Toxicology 1995, 97, 23-38. (71) Fürst, Zs. Gyógyszertan; Medicina Könyvkiadó RT.: Budapest, 1998, 1044-1049 (72) Domingo, J. L. Reproductive Toxicology 1998, 12, 499-510. (73) Chang, C. A.; Rowland, M. E. Inorganic Chemistry 1983, 22, 3866. (74) Kulstad, S.; Malmsten, L. A. Acta Chemica Scandinavica 1979, B33, 469. (75) Martell, A. E.; Smith, R. M. Critical stability constants; Plenum Press: New York and London, 1977; 3. (76) Delgado, R.; Frausto Da Silva, J. J. R. Talanta 1982, 29, 815-822. (77) Varga, L.; Emri, J.; Gy ri, B.; Kovács, Z.; Brücher, E.; al., e. In Patent Hungary, No. 210 667, 1995. (78) Cuenot, F.; Meyer, M.; Bucaille, A.; Guilard, R. Journal of Molecular Liquids 2004, 118, 89-99. (79) Arien, E. J. In Drug design: Modulation of Pharmacokinetics by molecular manipulation, Academic Press: New York, USA, 1971, 1-117. (80) Rautio, J.; Nevalainen, T.; Taipale, H.; Vepsalainen, J.; Gynther, J.; Laine, K.; Jarvinen, T. European Journal of Pharmaceutical Sciences 2000, 11, 157-163. (81) Kozák, A. US Patent No. 6,077,837, 2000. (82) Mahfouz, N. M.; Aboul-F., T.; Diab, A. K. European Journal of Medicinal Chemistry, 1998, 33, 675-683. (83) Ferretti, A.; Knijn, A.; Iorio, E.; Pulciani, S.; Giambenedetti, M.; Molinari, A.; Meschini, S.; Stringaro, A.; Calcabrini, A.; Freitas, I.; Strom, R.; Arancia, G.; Podo, F. Biochimica et Biophisica Acta 1999, 1438, 329-348. (84) Changani, K. K.; Fuller, B. J.; Bryant, D. J.; Bell, J. D.; Ala-K., M.; Tayleor-R., S. D.; Moore, D. P.; Davidson, B. R. Journal of Hepatology 1997, 26, 336-342. (85) Grivet, J.-P.; Delort, A.-M.; Portais, J.-C. Biochimie 2003, 85, 823-840. (86) Ippen, H. Index Pharmacorum, Thieme Verlag, Stuttgart, 1968. (87) Catsch, A. Federation Proceeding, 20, 1961, supplement, 10, Part II.,206. (88) Chavez, M. R.; Kovács, Z.; Sherry, A. D. In Biomedical imaging: Reporters, Dyes and Instrumentation; Proc. SPIE. 1999; 3600, 99-106. (89) Lázár, I.; Egri, A.; Király, R.; Baranyai, Z.; T., I.; Brücher, E. European Journal of Organic Chemistry 2002, 351-360. (90) Miltenberger, K. In Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry; Elvers, B., Hawkins, S., Ravenscroft, M., Schulz, G., Eds.; VCH Verlaggesellschaft mbH.: Weinheim, Germany, 1989; A13, 507-517. (91) Fanali, S. Journal of Chromatography A 1997, 792, 227-267. (92) Mikló, K. http://www.hpo.hu/ipsz/200312/01-miklo.html . (93) Gáspár, A. Kapilláris Zónaelektroforézis, Kossuth Egyetemi Kiadó, 2000, 7-14. (94) Smith, B. E.; Burger, A. Journal of the American Chemical Society 1953, 75, 5891. (95) Zhao, T.; Hu, X.; Cheng, J.; Lu, X. Analytica Chimica Acta 1998, 358, 263-268. 107
7. Irodalmi hivatkozások
(96) Yang, W.-C.; Yu, W.-C.; Yu, A.-M.; Chen, H.-Y. Journal of Chromatography A 2000, 910, 311-318. (97) Blanco, M.; Valverde, I. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2003, 31, 431-438. (98) Blanco, M.; Valverde, I. Trends in Analytical Chemistry 2003, 22, 428-439. (99) Martin Bel Valle, E. M. Process Biochemistry 2004, 39, 1033-1046. (100) Pedersen, C. J. Journal of the American Chemical Society, 1967, 89, 2495-2496. (101) Pedersen, C. J. Journal of the American Chemical Society 1967, 89, 7017-7036. (102) Lehn, J. M. Accounts of the Chemical Research 1978, 11, 49-57. (103) Zhang, X. X.; Bradshaw, J. S.; Izatt, R. M. Chemical Reviews 1997, 97, 33133361. (104) Huang, W. X.; Fazio, S. D.; Vivilecchia, R. V. Journal of Chromatography A 1997, 781, 129-137. (105) Huang, W. X.; Xu, H.; Fazio, S. D.; Vivilecchia, R. V. Journal of Chromatography B 1997, 695, 157-162. (106) Armstrong, D. W.; Chang, L. W.; Chang, S. S. C. Journal of Chromatography A 1998, 793, 115-134. (107) Koide, T.; Ueno, K. Journal of Chromatography A 2001, 923, 229-239. (108) Huszthy, P.; Samu, E.; Vermes, B.; Mezey-Vándor, G.; Nógrádi, M.; Bradshaw, J. S.; Izatt, R. M. Tetrahedron 1999, 55, 1491-1504. (109) Demirel, N.; Bulut, Y. Tetrahedron: Asymmetry 2003, 14, 2633-2637. (110) Tsukube, H.; Wada, M.; Shinoda, S.; Tamiaki, H. Journal of Alloys and Compounds 2001, 323-324, 133-137. (111) Wenzel, T. J.; Thurston, J. E.; Sek, D. C.; Joly, J.-P. Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 1125-1130. (112) Turgut, Y.; Hosgören, H. Tetrahedron: Asymmetry 2003, article in press. (113) Bitter, I.; K szegi, É.; Grün, A.; Bakó, P.; Pál, K.; Grofcsik, A.; Kubinyi, M.; Balázs, B.; Tóth, G. Tetrahedron: Asymmetry 2003, 14, 1025-1035. (114) Hirose, K.; Fujiwara, A.; Matsunaga, K.; Aoki, N.; Tobe, Y. Tetrahedron: Asymmetry 2003, 14, 555-566. (115) Karakaplan, M.; Aral, T. Tetrahedron: Assymetry 2005, 16, 2119-2124. (116) Francois, C.; Morin, P.; Dreux, M. Journal of Chromatography A 1995, 717, 393408. (117) Francois, C.; Mori, P.; Dreux, M. Journal of Chromatography A 1995, 706, 535553. (118) Oehrle, S. A. Journal of Chromatography A 1996, 745, 87-92. (119) Muzikar, M.; Havel, J.; Macka, M. Electrophoresis 2002, 23, 1796-1802. (120) Chiou, C. S.; Shih, J. S. Analytica Chimica Acta 1998, 360, 69-76. (121) Chen, Z.; Uchiyama, K.; Hobo, T. Electrophoresis 2001, 22, 2136-2142. (122) Mori, M.; Tsue, H.; Tanaka, S. Journal of Chromatography A 2001, 922, 399403. (123) Lauth, M.; Gramain, P. Journal of Chromatography 1987, 395, 153-158. (124) Josic, D.; Reutter, W. Journal of Chromatography 1989, 476, 309-318. 108
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
(125) Ohwa, M.; Akiyoshi, M.; Mitamura, S. Journal of Chromatogrphy 1990, 521, 122-127. (126) Walbroehl, Y.; Wagner, J. Journal of Chromatography A 1994, 685, 321-329. (127) Walbroehl, Y.; Wagner, J. Journal of Chromatogrphy A 1994, 680, 253-261. (128) Hyun, M. H.; Jin, J. S.; Lee, W. Journal of Chromatography A 1998, 822, 155161. (129) Machida, Y.; Nishi, H.; Nakamura, K.; Nakai, H.; Sato, T. Journal of Chromatography A 1998, 805, 85-92. (130) Armstrong, D. W. Analytical Chemistry 2001, 557-561. (131) Gong, Y.; Xue, G.; Xiang, Y.; Bradshaw, J. S.; Lee, M. L.; Lee, H. K. Tetrahedron Letters 2002, 43, 2463-2466. (132) Steffeck, R. J.; Zelechonok, Y.; Gahm, K. H. Journal of Chromatography A 2002, 947, 301-305. (133) Hyun, M. H.; Han, S. C.; Lipshutz, B. H.; Shin, Y.-J.; Welch, C. J. Journal of Chromatography A 2002, 959, 75-83. (134) Hyun, M. H.; Cho, Y. J.; Kim, J. A.; Jin, J. S. Journal of Chromatography A 2003, 984, 163-171. (135) Gong, Y.; Xiang, Y.; Yue, B.; Xue, G.; Bradshaw, J. S.; Lee, H. K.; Lee, M. L. journal of Chromatography A 2003, 1002, 63-70. (136) Beesley, T. E.; Lee, J. T. Recent Developments in LC Column Technology 2003, 33-36. (137) Hirose, K.; Younzhu, J.; Nakamura, T.; Nishioka, R.; Ueshige, T.; Tobe, Y. Journal of Chromatography A 2005, 1078, 35-41. (138) Bradshaw, J. S.; Krakowiak, K. E.; Bruening, R. L.; Tarbet, B. J.; Savage, P. B.; Izatt, R. M. Journal of Organic Chemistry 1988, 53, 3190-3195. (139) Bradshaw, J. S.; Bruening, R. L.; Krakowiak, K. E.; Tarbet, B. J.; Bruening, M. L.; Izatt, R. M.; Christensen, J. J. Journal of the Chemical Society Chemical Communications 1988, 812-814. (140) Bradshaw, J. S.; Krakowiak, K. E.; Izatt, R. M. Tetrahedron Letters 1989, 30, 803-806. (141) Bradshaw, J. S.; Krakowiak, K. E.; Tarbet, B. J.; Bruening, R. L.; Biernat, J. F.; Bochenska, M.; Izatt, R. M.; Christensen, J. J. Pure and Applied Chemistry 1989, 61, 1619-1624. (142) Da, S.-L.; Feng, Y.-Q.; Gong, Y.-H.; Zhang, Y.-W. Journal of Chromatographic Science 1999, 37, 137-144. (143) Da, S. L.; Yue, W. G.; Wen, Y. F.; Da, H. L.; Wang, Z. H. Analytica Chimica Acta 1994, 299, 239-247. (144) Gong, Y.; Xue, G.; Bradshaw, J. S.; Lee, M. L.; Lee, H. K. Journal of Heterocyclic Chemistry 2001, 38, 1317-1321. (145) Hilton, M.; Armstrong, D. W. Journal of Liquid Chromatography 1991, 14, 9. (146) Machida, Y.; Nishi, H.; Nakamura, K. Journal of Chromatography A 1999, 830, 311. (147) Lee, W.; Hong, C. Y. Journal of Chromatography A 2000, 879, 113. 109
7. Irodalmi hivatkozások
(148) Fisher, E.; Speier, A. Berichte 1895, 3252 (149) Butler, C. L.; Renfrew, A. G.; Clapp, M. Journal of American Chemical Society,1938, 60, 1472. (150) Yang, R.; Zompa, L. J. Inorganic Chemistry 1976, 15, 1499-1502. (151) Lerche-Langrad, C.; Toutain, H. J. Toxicology 2000, 153, 221-253. (152) Zervas, L.; Winitz, M.; Greenstein, J. P. Journal of Organic Chemistry 1957, 1515. (153) Brücher, E.; Gy ri, B.; Emri, J.; Jakab, S.; Kovács, Z.; Solymosi, P.; Tóth, I. Journal of the Chemical Society - Dalton Transactions 1995, 3353-3357. (154) Van Der Merwe, M. J.; Boeyens, J. C. A.; Hancock, R. D. Inorganic Chemistry 1985, 24, 1208-1213. (155) Burai, L.; Fábián, I.; Király, R.; Szilágyi, E.; Brücher, E. Journal of the Chemical Society - Dalton Transactions 1998, 243-248. (156) Baranyai, Z.; Brücher, E.; Iványi, T.; Király, R.; Lázár, I.; Zékány, L. Helvetica Chimica Acta 2005, 88, 604-617. (157) Caballero, R. D.; Garcia-Alvarez-Coque, M. C.; Baeza-Baeza, J. J. Journal of Chromatography A 2002, 954, 59-76. (158) Nikitas, P.; Pappa-Louisi, A.; Papageorgiou, A. Journal of Chromatography A 2001, 912, 13-29. (159) Elek, J.; Mangelings, D.; Iványi, T.; Lázár, I.; Vander Heyden, Y. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2005, 38, 601-608. (160) Leonard, S.; van Schepdael, A.; Iványi, T.; Lázár, I.; Rosier, J.; Vanstockem, M.; Vermeersch, H.; Hoogmartens, J. Electrophoresis 2005, 26, 627-632. (161) Covington, A. K.; Paabo, M.; Robinson, R. A.; Bates, R. G. Analytical Chemistry 1968, 40, 700-706.
110
TryEt
TryMe
Amino -sav
18,55/18,83 18,47/18,76
0 0,35 0,5 0 0 0,57
0,48 1,19
12,75
17,31/17,42
11,45/11,94
17,95
14,96
15,33/15,47
13,19
13,67/13,92
13,71/13,79
19,86/20,27
Me-β-CD
DM-β-CD1
DM-β-CD2
TM-β-CD
HP-β-CD
α-CD
β-CD
γ-CD
Me-β-CD
20,75/20,86 22,58//22,97 20,96/21,29
0,68 0,60 1,31
19,52/19,73
16,28/16,39
17,00/17,38
DM-β-CD2
TM-β-CD
HP-β-CD
40,65/41,08 30,77
0
0,99
0,84
0,41
0,71
0,74
0,90
0,82
41,81/43,04
44,01
61,97/63,42
incs jel
55,15/55,76
19,31/19,52
23,23/23,55
45,35
0
53,10/54,02
0
0
0,61
nincs jel
0
1,81
0
1,21
-
0,57
0,95
1,14
0
0,86
-
1,04
59,23/60,23
0
0,44
0,63
17,91/17,99
25,91/26,19
0
0
0,36
40,91
CD + Kryptofix-22 t1/t2 Rs
52,87/56,86
29,79/30,29
44,90/46,15
79,05/51,94
50,80/53,86
29,96/30,45
42,34/44,26
39,78
43,29/44,59
37,13/37,34
35,19/35,50
37,99/39,13
37,26/37,94
25,41/25,69
32,17/32,77
3,55
1,10
1,47
2,78
2,91
1,04
2,31
0
1,55
0,17
0,45
1,11
1,03
0,60
1,07
0,52
CD + R-110 Rs
28,98/29,23
t1/t2
57,57/62,55
33,59/34,22
54,86/56,03
51,10/54,11
56,72/60,75
56,46/54,56
59,97/63,88
56,85
42,97/44,32
30,72/30,95
38,10/38,52
40,98/42,58
39,25/40,09
25,52/25,23
44,93/46,18
3,66
1,22
1,35
2,47
2,95
1,18
2,75
0
1,50
0,55
0,56
1,80
1,01
0,70
1,32
0,70
CD + rac-110 Rs
37,31/37,77
t1/t2
Körülmények: nemborított kapilláris 56,5 cm (50,3 cm a detektorig) x 75 µm, UV detektálás: 218, 236, 254 nm,, 25 °C, 15 kV, [minta] 200 µg/ml, [puffer] 30 mM, [CD] 30 mM, kivéve [β-CD] 15 mM és [γ-CD] 15 mM, [koronaéeter-származékok] 30 mM A táblázatban, ahol “nincs jel” megjegyzés található 80 perc vagy annál magasabb id alatt nem jelent meg csúcs a mérés során.
42,02/42,64
1,72
25,55/26,76
17,27/17,55
17,99
DM-β-CD1
0,98
0
18,69/18,89
20,02
17,47
46,71
16,37
17,02
15,57/15,71
γ-CD
0,43
12,85/12,94
0
CD + 18C6 Rs
17,62
t1/t2
β-CD
0
CD egyedül Rs
11,58
t1/t2
α-CD
CD
Királis aminosav-származékok racém elegyének kapilláris elektroforézissel kapott elválasztása során mért migrációs id (t) és felbontás (Rs) értékei Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
8. FÜGGELÉKEK 1. FÜGGELÉK
111
112
Try
TryBu
Amino -sav
25,09/25,68 22,98/23,41 60,36 26,34/27,01 30,51 29,05/30,03
0,42 1,17 0,70 1,35 1,02 1,39
0 0
17.36/17.48
27.30/28.04
33.28/33.89
26.23/27.03
19.85/20.29
23.16/23.91
16,36/16,70
18,43
18,13
25,65
Me-β-CD
DM-β-CD1
DM-β-CD2
TM-β-CD
HP-β-CD
α-CD
β-CD
γ-CD
Me-β-CD
0, 0,55 0
24,74
23,43/23,59
22,30
DM-β-CD2
TM-β-CD
HP-β-CD
27,55
nincs jel
25,80
42,19
23,14
20,09
23,30
24,01/24,69
0
-
0
0
0
0
0
1,56
1,46
0
1,08
0
0,82
0,98
0
nincs jel
nincs jel
nincs jel
nincs jel
nincs jel
nincs jel
nincs jel
nincs jel
57,93/60,64
68,81/70,82
58,33
nincs jel
75,,02
38,13/38,67
32,42/32,78
33,35/34,06
-
-
-
-
-
-
-
-
2,99
1,57
0
-
0
0,87
0,2
1,43
CD + Kryptofix-22 t1/t2 Rs
nincs jel
62,17
80,61
48,38/49,49
93,90
73,98
nincs jel
nincs jel
nincs jel
40,80/42,21
88,42/97,37
62,79/64,26
nincs jel
57,57/59,12
nincs jel
-
0
0
1,36
0
0
-
-
-
1,96
3,41
0,99
-
1,12
-
-
CD + R-110 Rs
nincs jel
t1/t2
nincs jel
nincs jel
nincs jel
155,55/159,4 1 65,31/67,65
nincs jel
nincs jel
nincs jel
nincs jel
47,61/49,49
92,95/102,48
126,88/140,6 4 63,15/64,58
nincs jel
nincs jel
-
-
-
2,01
1,03
-
-
-
-
2,14
3,62
0,86
3,19
-
-
-
CD + rac-110 Rs
nincs jel
t1/t2
Körülmények: nemborított kapilláris 56,5 cm (50,3 cm a detektorig) x 75 µm, UV detektálás: 218, 236, 254 nm,, 25 °C, 15 kV, [minta] 200 µg/ml, [puffer] 30 mM, [CD] 30 mM, kivéve [β-CD] 15 mM és [γ-CD] 15 mM, [koronaéeter-származékok] 30 mM A táblázatban, ahol “nincs jel” megjegyzés található 80 perc vagy annál magasabb id alatt nem jelent meg csúcs a mérés során.
0,56
22,73/22,90
DM-β-CD1
0
1,33
24,78
γ-CD
0
16,22
0
CD + 18C6 Rs
25,71
t1/t2
β-CD
0
CD egyedül Rs
16,91
t1/t2
α-CD
CD
Királis aminosav-származékok racém elegyének kapilláris elektroforézissel kapott elválasztása során mért migrációs id (t) és felbontás (Rs) értékei
8. Függelékek
1. FÜGGELÉK folytatás
TyrMe
Amino -sav
0 0,57
12,49
16,11/16,32
γ-CD
Me-β-CD
0,56 0 0
14,89/15,02
14,18
15,46
DM-β-CD2
TM-β-CD
HP-β-CD
19,88
18,70/18,86
19,64/20,19
37,26/38,02
19,28/19,75
18,81
17,32
0
0,54
1,22
0,59
1,08
0
0
0
CD + 18C6 Rs
14,75
t1/t2
53,08
44,82
73,34
nincs jel
73,51
19,19
29,29/29,70
22,37
0
0
0
-
0
0
1,00
0
CD + Kryptofix-22 Rs t1/t2
36,52
23,36
30,50/31,06
30,31/30,76
34,63/35,32
25,48
35,01/35,51
0
0
1,10
0,92
1,17
0
0,79
0
CD + R-110 Rs
27,70
t1/t2
39,79
27,09
31,54/32,10
31,60/32,11
36,09/36,90
45,92
46,85/47,63
0
0
1,06
0,81
1,17
0
0,72
0
CD + rac-110 Rs
36,73
t1/t2
Körülmények: nemborított kapilláris 56,5 cm (50,3 cm a detektorig) x 75 µm, UV detektálás: 218, 236, 254 nm,, 25 °C, 15 kV, [minta] 200 µg/ml, [puffer] 30 mM, [CD] 30 mM, kivéve [β-CD] 15 mM és [γ-CD] 15 mM, [koronaéeter-származékok] 30 mM A táblázatban, ahol “nincs jel” megjegyzés található 80 perc vagy annál magasabb id alatt nem jelent meg csúcs a mérés során.
0
16,97
DM-β-CD1
0
11,92
β-CD
0
CD egyedül Rs
11,41
t1/t2
α-CD
CD
Királis aminosav-származékok racém elegyének kapilláris elektroforézissel kapott elválasztása során mért migrációs id (t) és felbontás (Rs) értékei Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
1. FÜGGELÉK folytatás
113
8. Függelékek
2. FÜGGELÉK Az el állított vegyületek adatai
Vegyület
NMR, MALDI-TOF, elemanalízis és fajlagos forgatóképesség adatok
41
1 H NMR (CDCl3): δ = 1,3 [t, 3JH,H = 7.4 Hz, 3H, CH3], 2,83 (s, 1H, OH), 4,16 (s, 2H, CH2), 4,26 [q, 3JH,H = 7.4 Hz, 2H, OCH2]; 13C NMR (CDCl3): δ = 14,2 (CH3), 60,7 és 61,5 (OCH2), 173,4 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 4,21 (s, 2H, OCH2), 5,23 (s, 2H, OCH2), 7,35-7,41 (m, 5H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 60,6 és 67,2 (OCH2), 128,4, 128,6 és 128,62 (HCarom), 134,9 (Carom), 173,2 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 3,56-3,58 (m, 2H, OCH2), 3,71-3,74 (m, 2H, CH2), 4,54 (s, 2H, OCH2), 7,25-7,36 (m, 5H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 61,7 (CH2), 71,4 és 73,1 (OCH2), 127,74, 127,72 és 128,4 (HCarom), 137,9 (Carom) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,3 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 3H, CH3], 3,96 (s, 2H, BrCH2), 4,24 [q, 3JH,H = 7,4 Hz, 2H, OCH2], 4,69 (s, 2H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 13,9 (CH3), 24,9 (BrCH2), 61,7 és 61,6 (OCH2), 166,6 és 166,9 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 0,94 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 3H, CH3], 1,33-1,43 (m, 2H, CH2), 1,60-1,68 (m, 2H, CH2), 3,95 (s, 2H, BrCH2), 4,19 (t, 3JH,H = 6,8 Hz, 2H, OCH2), 4,69 (s, 2H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 13,5 (CH3), 18,8 (CH2), 24,8 (BrCH2), 30,3 (CH2), 61,7 és 65,4 (OCH2), 166,3 és 167,0 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 3,67-3,70 (m, 2H, CH2), 3,85 (s, 2H, BrCH2), 4,32-4,35 (m, 2H, OCH2), 4,56 (s, 2H, OCH2), 7,26-7,38 (m, 5H, CHarom), 13C NMR (CDCl3): δ = 25,6 (BrCH2), 65,2 (CH2), 67,4 és 73,05 (OCH2), 127,6, 127,7 és 128,3 (HCarom), 137,6 (Carom), 167,1 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,31-2,43 (m, 2H, CH2), 2,72-2,81 (m, 1H, CH2), 3,97 (s, 2H, BrCH2), 4,32-4,39 (m, 1H, OCH2), 4,42-4,56 (m, 1H, OCH2), 5,48-5,53 (m, 1H, OCH); 13C NMR (CDCl3): δ = 24,9 (BrCH2), 28,3 (CH2), 65,0 (OCH2), 68,9 (OCH), 166,2 és 171,9 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 3,95 (s, 2H, BrCH2), 4,55 [q, 3JH,H = 8,4 Hz, 2H, OCH2]; 13C NMR (CDCl3): δ = 24,4 (BrCH2), 60,8, 61,2, 61,6 és 62,1 (OCH2), 117,9, 120,9, 124,0 és 127,1 (CF3), 165,8 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 3,93 (s, 2H, BrCH2), 4,73 (s, 2H, OCH2), 5,21 (s, 2H, OCH2), 7,32-7,40 (m, 5H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 24,8 (BrCH2), 61,7 és 67,2 (OCH2), 128,33, 128,35 és 128,5 (HCarom), 134,7 (Carom), 166,6 és 166,8 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,28 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 6H, CH3], 2,72 (s, 8H, gy r NCH2), 3,36 (s, 4H, NCH2), 4,22 [q, 3JH,H = 7,4 Hz, 4H, OCH2], 4,66 (s, 4H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 13,9 (CH3), 52,5 (gy r NCH2), 58,9 (NCH2), 60,6 és 61,3 (OCH2), 167,4 és 169,5 (C=O); Elemanalízis C16H26N2O8 talált (számított): C 51,23 % (51,33 %), H 7,18 %, (7,00 %), N 7,44 % (7,48 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 375,24 (375,18) 1 H NMR (CDCl3): δ = 0,93 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 6H, CH3], 1,32-1,42 (m, 4H, CH2), 1,58-1,66 (m, 4H, CH2), 2,73 (s, 8H, gy r NCH2), 3,36 (s, 4H, NCH2), 4,16 [t, 3JH,H = 6,8 Hz, 4H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 13,5 δ (CH3), 18,9 és 30,4 (CH2), 52,4 (gy r NCH2), 58,7 (NCH2), 60,7 és 65,8 (OCH2), 167,5 és 169,4 (C=O); Elemanalízis C20H34N2O8 talált (számított): C 55,64 %, (55,80 %), H 7,88 % (7,96 %), N 6,67 % (6,51 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított):431,11 (431,24) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,64 (s, 8H, gy r NCH2), 3,31 (s, 4H, CH2), 4,71 (s, 4H, OCH2), 5,18 (s, 4H, OCH2), 7,26-7,38 (m, 10H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 52,5 (gy r nCH2), 58,9 (NCH2), 60,7 és 67,1 (OCH2), 128,4-128,5 és 128,6 (HCarom), 134,8 (C), 167,3 és 169,4 (C=O); Elemanalízis C26H30N2O8 talált (számított): C 62,74 % (62,64 %), H 6,15 % (6,07 %), N 5,32 % (5,62 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 499,43 (499,21) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,29-2,41 (m, 2H, CH2), 2,69-2,78 (m, 2H, CH2), 2,75 (s, 8H, gy r NCH2), 3,40 [d, 3JH,H = 5,8 Hz, 4H, NCH2], 4,29-4,37 (m, 2H, OCH2), 4,47-4,53 (m, 2H, OCH2), 5,46-5,52 (m, 2H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 28,3 (CH2), 51,9 (gy r NCH2), 58,1 (NCH2), 65,0 (OCH2), 67,6 (OCH), 168,4 és 172,3 (C=O); Elemanalízis C16H22N2O8 talált (számított): C 52,23 % (51,89 %), H 6,34 % (5,99 %), N 7,31 % (7,56 %)
42 43 44 45
46 47 48 49 50
51
52
53
114
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
2. FÜGGELÉK folytatás Vegyület
NMR, MALDI-TOF, elemanalízis és fajlagos forgatóképesség adatok
54
1
55
56
57
58
59
60
61
62
H NMR (CDCl3): δ = 2,68 (s, 8H, gy r NCH2), 3,35 (s, 4H, NCH2), 4,51 [q, 3JH,H = 8,4 Hz, 4H, OCH2]; 13C NMR (CDCl3): δ = 52,5 (gy r NCH2), 58,5 (NCH2), 59,5, 59,9, 60,35 és 60,75 (OCH2), 118,2, 121,2, 124,3 és 127,4 (CF3), 168,6 (C=O); Elemanalízis C12H16N2O4 talált (számított): 368,38 (367,11); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 367,38 (367,11) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,61 (s, 8H, gy r CH2), 3,21 (s, 4H, CH2), 3,62-3,65 (m, 4H, CH2), 4,254,28 (m, 4H, OCH2), 4,51 (s, 4H, OCH2), 7,26-7,37 (m, 10H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 52,6 (gy r NCH2), 59,1 (NCH2), 63,5 (CH2), 67,6 és 72,9 (OCH2), 127,5, 127,6 és 128,3 (HCarom), 137,6 (Carom), 170,0 (C=O); Elemanalízis C26H34N2O6 talált (számított): C 66,01 % (66,36 %), H 7,35 % (7,28 %), N 5,73 % (5,95 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 471,47 (471,25) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,65 (s, 8H, gy r NCH2), 3,26 (s, 4H, NCH2), 5,16 (s, 4H, OCH2), 7,35 (m, 10H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 52,7 (gy r NCH2), 59,2 (NCH2), 66,3 (OCH2), 128,3 és 128,5 (HCarom), 135,6 (Carom), 170,0 (C=O); Elemanalízis C22H26N2O4 talált (számított): C 68,8 % (69,09 %), H 7,03 % (6,85 %), N 7,15 % (7,32 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 383,17 (383,20) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,28 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 6H, CH3], 1,84-1,91 (p, 3JH,H = 5,8 Hz, 2H, gy r CH2), 2,91-2,95 (m, 8H, gy r NCH2), 3,56 (s, 4H NCH2), 4,22 [q, 3JH,H = 7,4 Hz, 4H, OCH2], 4,65 (s, 4H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 14,0 (CH3), 28,1 (gy r CH2), 53,7 és 54,4 (gy r NCH2), 58,7 (NCH2), 60,5 és 61,3 (OCH2), 167,5 és 170,5 (C=O); Elemanalízis C17H28N2O8 talált (számított): C 52,56 % (52,57 %), H 7,31 % (7,27 %), N 7,30 % (7,21 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 389,23, (389,19) 1 H NMR (CDCl3): δ = 0,93 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 6H, CH3], 1,32-1,42 (m, 4H, gy r CH2), 1,58-1,66 (m, 4H, CH2), 1,83-1,90 (m, 2H, gy r CH2), 2,90-2,94 (m, 8H, gy r NCH2), 3,56 (s, 4H, NCH2), 4,14-1,18 [t, 3JH,H = 6,8 Hz, 4H, CH2], 4,64 (s, 4H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 13,3 (CH3), 18,8 (CH2), 28,2 (gy r CH2), 30,3 (CH2), 53,7 (gy r NCH2), 60,4 (OCH2), 65,1 (CH2), 167,6 és 170,5 (C=O); Elemanalízis C21H36N2O8 talált (számított): C 56,44 % (56,74 %), H 7,87 % (8,16 %), N 6,49 % (6,30 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 445,29 (445,25) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,79 [p, 3JH,H = 5,8 Hz, 2H, gy r CH2], 2,83-2,87 (m, 8H, gy r NCH2), 3,52 (s, 4H, NCH2), 4,69 (s, 4H, OCH2), 5,18 (s, 4H, OCH2), 7,26-7,36 (m, 10H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 27,9 (gy r CH2), 53,6 és 54,2 (gy r NCH2), 58,6 (NCH2), 60,4 és 67,1 (OCH2), 128,3, 128,4 és 128,5 (HCarom), 167,4-170,4 (C=O); Elemanalízis C27H32N2O8 talált (számított): 63,09 % (63,27%), H 6,44 % (6,29 %), N, 5,59 % (5,47 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 513,48 (513,22) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,84 [p, 3JH,H = 5,8 Hz, 2H, gy r CH2], 2,86-2,89 (m, 8H, gy r NCH2), 3,54 (s, 4H, NCH2), 4,49 [q, 3JH,H = 8,4 Hz, 4H, OCH2]; 13C NMR (CDCl3): δ = 28,4 (gy r CH2), 53,6 és 54,5 (gy r NCH2), 58,5 (NCH2), 59,3, 59,7 és 60,1 (OCH2), 118,2, 121,3, 124,4 és 127,4 (CF3), 169,6 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,79 [p, 3JH,H = 5,8 Hz, 2H, gy r CH2], 2,81-2,85 (m, 8H, gy r NCH2), 3,42 (s, 4H, NCH2), 3,64-3,66 (m, 4H, CH2), 4,26-4,28 (m, 4H, OCH2), 4,53 (s, 4H, OCH2), 7,237,35 (m, 10H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 28,0 (gy r CH2), 53,6 és 54,4 (gy r NCH2), 58,8 (NCH2), 63,1 (CH2), 67,5 és 72,75 (OCH2), 127,4, 127,5 és 128,1 (HCarom), 137,5 (Carom), 170,9 (C=O); Elemanalízis C27H36N2O6 talált (számított): C 67,32 % (66,92 %), H 7,11 % (7,49 %), N 5,63 % (5,78 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 485,43 (485,27) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,81 [p, 3JH,H = 5,8 Hz, 2H, gy r CH2], 2,84-2,86 (m, 8H, gy r NCH2), 3,45 (s, 4H, NCH2), 5,14 (s, 4H, OCH2), 7,29-7,36 (m, 10H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 28,2 (gy r CH2), 53,8 és 54,6 (gy r NCH2), 59,1 (NCH2), 66,1 (OCH2), 128,2, 128,3 és 128,4 (HCarom), 135,7 (Carom), 171,0 (C=O); Elemanalízis C23H28N2O4 talált (számított): C 69,27 % (69,67 %), H 7,43 % (7,12 %), N 7,01 % (7,07 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 397,13 (397,21)
115
8. Függelékek
2. FÜGGELÉK folytatás Vegyület
NMR, MALDI-TOF, elemanalízis és fajlagos forgatóképesség adatok
63
1
64
65
66
67
68
69
70
116
H NMR (CDCl3): δ = 1,28 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 6H, CH3], 2,97-3,01 (m, 8H, gy r NCH2), 3,583,63 (m, 12H, OCH2), 3,65 (s, 4H, NCH2), 4,22 [q, 3JH,H = 7,4 Hz, 4H, CH2], 4,63 (s, 4H, OCH2); ); 13C NMR (CDCl3): δ = 14,0 (CH3), 54,3 és 55,9 (gy r CH2), 60,4 (NCH2), 61,4 (OCH2), 69,1, 69,9 és 70,4 (gy r OCH2), 167,6 és 170,9 (C=O); Elemanalízis C22H38N2O11 talált (számított): C 52,30 % (51,96 %), H 7,83 % (7,56 %), N 5,31 % (5,53 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 507,23 (507,26) 1 H NMR (CDCl3): δ = 0,93 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 6H, CH3], 1,32-1,42 (m, 4H, CH2), 1,58-1,66 (m, 4H, CH2), 2,99-3,03 (m, 8H, gy r NCH2), 3,59-3,63 (m, 12H, gy r OCH2), 3,67 (s, 4H, NCH2), 4,16 [t, 3JH,H = 6,8 Hz, 4H, CH2], 4,63 (s, 4H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 13,5 (CH3), 18,9 és 30,4 (CH2), 53,9 és 54,2 (gy r NCH2), 55,8 (NCH2), 60,4 (OCH2), 65,2 (CH2), 69,1, 69,8 és 70,4 (gy r OCH2), 167,6 és 170,7 (C=O); Elemanalízis C26H46N2O11 talált (számított): C 55,96 % (55,50 %), H 8,30 % (8,24 %), N 4,87 % (4,98 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 563,29 (563,32) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,92-2,97 (m, 8H, gy r CH2), 3,54-3,59 (m, 8H, gy r NCH2), 3,61 (s, 4H, gy r NCH2), 3,62 (s, 4H, NCH2), 4,67 (s, 4H, OCH2), 5,18 (s, 4H, OCH2), 7,31-7,40 (m, 10H, CH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 53,8 és 54,2 (gy r NCH2), 60,3 és 67,0 (OCH), 69,1, 69,8 és 70,4 (gy r OCH), 128,3, 128,4 és 128,5 (HC), 134,9 (Carom), 167,4 és 170,8 (C=O); Elemanalízis C32H42N2O11 talált (számított): C 60,69 % (60,94 %), H 6,41 % (6,71 %), N 4,33 % (4,44 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 631,45 (631,29) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,92-2,96 (m, 8H, gy r NCH2), 3,53 (s, 4H, OCH2), 3,55-3,59 (m, 8H, gy r OCH2), 3,61 (s, 4H, NCH2), 3,65-3,67 (m, 4H, CH2), 4,25-4,28 (m, 4H, OCH2), 4,55 (s, 4H, OCH2), 7,28-7,37 (m, 10H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 53,9 és 54,3 (gy r NCH2), 56,2 (NCH2), 63,3 (CH2), 67,7 (OCH2), 69,1, 69,8 és 70,4 (gy r OCH2), 73,0 (OCH2), 127,6, 127,7 és 128,4 (HCarom), 137,7 (Carom), 171,3 (C=O); Elemanalízis C32H46N2O9 talált (számított): C 64,12 % (63,77 %), H 7,45 % (7,69 %), N 4,36 % (4,65 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 603,55 (603,33) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,93-2,97 (m, 8H, gy r NCH2), 3,54-3,59 (m, 12H, gy r OCH2), 3,61 (s, 4H, NCH2), 5,13 (s, 4H, OCH2), 7,31-7,37 (m, 10H, CHarom); ); 13C NMR (CDCl3): δ = 54,0 és 54,4 (gy r NCH2), 56,55 (NCH2), 66,0 (OCH2), 69,4, 70,15 és 70,5 (gy r OCH2), 128,2, 128,25 és 128,5 (HCarom), 135,7 (Carom), 171,5 (C=O); Elemanalízis C28H38N2O7 talált (számított): C 65,72 % (65,35 %), H 7,30 % (7,44 %), N 5,56 % (5,44 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 515,07 (515,28) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,28 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 6H, CH3], 3,01 [t, 3JH,H = 5,3 Hz, 8H, gy r NCH2], 3,61 (s, 8H, gy r OCH2), 3,63-3,66 28 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 8H, gy r OCH2], 3,71 (s, 4H, CH2), 4,22 [q, 3JH,H = 7,4 Hz, 4H, CH2], 4,63 (s, 4H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 14,0 (CH3), 53,9 (gy r NCH2), 55,5 (OCH2), 60,4 (CH2), 61,3 (OCH2), 69,8 és 70,4 (gy r OCH2), 167,6 és 171,0 (C=O); Elemanalízis C24H42N2O12 talált (számított): C 52,45 % (52,35 %), H 7,53 % (7,69 %), N 5,18 % (5,09 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 551,34 (551,28) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,28 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 6H, CH3], 1,32-1,42 (m, 4H, CH2), 1,58-1,66 (m, 4H, CH2), 3,02 [t, 3JH,H = 5,3 Hz, 8H, gy r NCH2], 3,61 (s, 8H, gy r OCH2), 3,63-3,66 [t, 3JH,H = 5,3 Hz, 8H, gy r OCH2], 3,73 (s, 4H, CH2), 4,16 [t, 3JH,H = 6,8 Hz, 4H, CH2], 4,63 (s, 4H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 13,5 (CH3), 18,8 (CH2), 30,3 (CH2), 53,8 (gy r NCH2), 55,3 (CH2), 60,3 (OCH2), 65,1 (CH2), 69,7 és 704 (gy r OCH2), 167,6 és 170,9 (C=O); Elemanalízis C28H50N2O12 talált (számított): C 55,31 % (55,43 %), H 8,49 % (8,31 %), N 4,56 % (4,62 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 607,22 (607,34) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,96 [t, 3JH,H = 5,3 Hz, 8H, gy r NCH2], 3,58-3,61 (m, 16H, gy r OCH2), 3,67 (s, 4H, CH2), 4,67 (s, 4H, OCH2), 5,18 (s, 4H, OCH2), 7,31-7,38 (m, 10H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 53,9 (gy r NCH2), 55,5 (CH2), 60,3 (OCH2), 67,0 (CH2), 69,85 és 70,5 (gy r OCH2), 128,3, 128,45 és 128,5 (HCarom), 135,0 (Carom), 167,5 és 171,1 (C=O); Elemanalízis C34H46N2O12 talált (számított): C 60,21 % ( 60,52 %), H 6,56 % (6,87 %), N 4,22 % (4,15 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 675,51 (675,31)
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
2. FÜGGELÉK folytatás Vegyület
NMR, MALDI-TOF, elemanalízis és fajlagos forgatóképesség adatok
71
1
72
73
74
75
76
77
78 82 83 84 85
H NMR (CDCl3): δ = 2,95 [t, 3JH,H = 5,3 Hz, 8H, gy r NCH2], 3,56 (s, 4H, CH2), 3,58-3,61 (m, 8H, gy r OCH2), 3,59 (s, 8H, gy r OCH2), 3,65-3,68 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 4H, CH2], 4,28 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 4H, CH2], 4,55 (s, 4H, CH2), 7,28-7,37 (m, 10H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 54,0 (gy r NCH2), 56,1 (CH2), 63,2 (OCH2), 67,9 (CH2), 70,0 és 70,6 (gy r OCH2), 73,1 (OCH2), 127,6, 127,7 és 128,4 (HCarom), 137,8 (Carom), 171,6 (C=O); Elemanalízis C34H50N2O10 talált (számított): C 63,57 % ( 63,14 %), H 7,89 % (7,79 %), N 4,43 % (4,33 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 647,37 (647,35) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,96 [t, 3JH,H = 5,3 Hz, 8H, gy r NCH2], 3,57-3,61 (m, 16H, gy r OCH2), 5,13 (s, 4H, CH2), 7,28-7,42 (m, 10H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 54,0 (gy r NCH2), 56,1 (CH2), 65,9 (OCH2), 69,9 és 70,5 (OCH2), 128,2, 128,25 és 135,8 (HCarom), 135,8 és 171,5 (C=O); Elemanalízis C30H42N2O8 talált (számított): C 64,34 % ( 64,50 %), H 7,31 % (7,58 %), N 4,89 % (5,01 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 559,09 (559,30) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,65 (s, 16H, gy r NCH2), 3,24 (s, 4H, NCH2), 3,26 (s, 4H, NCH2), 3,673,69 (m, 4H, OCH2), 4,29-4,32 (m, 4H, OCH2), 4,33 (s, 4H, OCH2), 4,55 (s, 4H, OCH2), 7,29-7,37 (m, 10H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 52,6 (gy r CH2), 58,96 és 59,1 (NCH2), 61,9, 63,5, 67,6 és 72,9 (OCH2), 127,5, 127,6 és128,3 (HCarom), 137,6 (Carom), 169,8 és 170,0 (C=O) 1 H NMR (D2O): δ = 3,29 (s, 8H, gy r CH2), 3,81-3,84 (m, 4H, CH2), 3,90 (s, 4H, NCH2), 4,314,33 (m, 4H, OCH2); 13C NMR (D2O): δ = 52,4 (gy r CH2), 59,1 (NCH2), 60,2 (CH2OH), 66,1 (OCH2), 170,2 (C=O); Elemanalízis C12H22N2O6 talált (számított): C 49,88 % (49,65 %), H 7,35 % (7,64 %), N 9,43 % (9,65 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 291,43, (291,16) 1 H NMR (D2O): δ = 2,24 81 [p, 3JH,H = 5,8 Hz, 2H, gy r CH2], 3,46 [t, 3JH,H = 5,4 Hz, 4H, gy r NCH2], 3,63 (s, 4H, gy r NCH2), 3,83-3,86 (m, 4H, CH2), 4,12 (s, 4H, NCH2), 4,34-4,37 (m, 4H, OCH2); 13C NMR (D2O): δ = 22,6 (gy r CH2), 51,3 és 54,7 (gy r NCH2), 57,3 (CH2OH), 59,6 (NCH2), 67,7 (OCH2), 168,4 (C=O); Elemanalízis C13H24N2O6 talált (számított): C 51,23 % (51,30 %), H 8,28 % (7,95 %), N 9,31 % (9,20 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 305,47 (305,17) 1 H NMR (D2O): δ = 3,28 (s, 4H, gy r NCH2), 3,72-3,76 (m, 12H, gy r OCH2), 3,80-3,83 (m, 4H, CH2OH), 3,94 (s, 4H, NCH2), 4,29-4,32 (m, 4H, OCH2); 13C NMR (D2O): δ = 54,6 és 54,9 (gy r NCH2), 59,7 (NCH2), 55,7 (CH2OH), 59,7 (NCH2), 66,1, 67,3 és 69,8 (gy r OCH2), 169,4 (C=O); Elemanalízis C18H34N2O9 talált (számított): C 50,99 % (51,17 %), H 8,06 % (8,11 %), N 6,54 % (6,63 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 423,12 (423,23) 1 H NMR (D2O): δ = 3,59 (m, 8H, gy r OCH2), 3,74 (s, 8H, gy r OCH2), 3,3,86-3,89 (m, 4H, CH2OH), 3,89-3,91 (m, 8H, gy r NCH2), 4,28 (s, 4H, NCH2), 4,37-4,39 (m, 4H, OCH2); 13C NMR (D2O): δ = 54,5 (gy r NCH2), 55,5 (NCH2), 59,5 (CH2OH), 64,3 (OCH2), 68,3 és 69,9 (gy r OCH2), 167,2 (C=O); Elemanalízis C20H38N2O10 talált (számított): C 51,21 % ( 51,49 %), H 8,33 % (8,21 %), N 5,74 % (6,00 %); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 467,53 (467,26) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,26 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 9H, CH3], 2,90 (s, 12H, gy r CH2), 3,45 (s, 6H, NCH2), 4,15 (m, 6H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 13,9 (CH3), 54,8 (gy r CH2), 58,3 (NCH2), 59,8 (OCH2), 171,6 (C=O); 1 H NMR (D2O): δ = 2,98 (s, 8H, gy r CH2), 3,11 (s, 4H, NCH2), 3,18 (s, 24H, CH3); 13C NMR (D2O): δ = 52,4 (gy r CH2), 56,1 (CH3), 61,9 (CH2), 177,0 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): 1,22-1,27 (m, 24H, CH3), 2,6 (s, 8H, gy r CH2), 3,0 (s, 4H, NCH2), 3,21-3,27 (m, 16H, CH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 7,7 (CH3), 52,6 (gy r CH2), 53,3 (CH2), 64,4 (NCH2), 174,5 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,68 (s, 8H, gy r CH2), 3,35 (s, 4H, NCH2), 4,77 (s, 4H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 48,2 (gy r CH2), 52,5 (NCH2), 58,4 (OCH2), 168,6 (C=O); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 699,48 (699,36) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,36-1,40 (m, 36H, CH3), 3,02-3,25 (m, 12H, gy r NCH2), 3,35 (s, 6H, NCH2), 3,45-3,51 (m, 24H, CH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 7,5 (CH3), 52,3 (CH2), 54,7 (gy r CH2), 56,9 (NCH2)
117
8. Függelékek
2. FÜGGELÉK folytatás
Vegyület
NMR, MALDI-TOF, elemanalízis és fajlagos forgatóképesség adatok
86
1
87
88
89 91
92 rac-93 S-93 94 rac-95 S-95
96
97
98
118
H NMR (CDCl3): δ = 1,28 [t, 3JH,H = 7,4 Hz, 9H, CH3], 2,80 (s, 12H, gy r NCH2), 3,58 (s, 6H, NCH2), 4,22 [q, 3JH,H = 7,4 Hz, 6H, OCH2], 4,62 (s, 6H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 14,0 (CH3), 54,9 (gy r CH2), 58,0 (CH2), 60,4 (NCH2), 61,3 (OCH2), 167,5 és 171,3 (C=O); MALDITOF MS, M+H+ talált (számított): 562,25 (562,21) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,32-2,44 (m, 6H, CH2), 2,66-3,88 (m, 6H, CH2), 3,02 (s, 12H, gy r NCH2), 3,67-3,75 (m, 6H, NCH2), 4,33-4,42 (m, 6H, OCH2), 4,49-4,58 (m, 6H, OCH2), 5,51-5,56 (m, 3H, OCH); 13C NMR (CDCl3): δ = 28,0 (CH2), 59,1 (gy r CH2), 64,4 (NCH2), 65,0 (OCH2), 66,0 és 70,0 (OCH), 168 és 172,1 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,27-1,32 (m, 9H, CH3), 2,97-3,16 (m, 16H, gy r NCH2), 3,57 (s, 2H, NCH2), 3,65 (s, 4H, NCH2), 4,17-4,32 (m, 6H, OCH2), 4,66 (s, 4H, OCH2), 4,68 (2H, OCH2); 13C NMR (CDCl3): δ = 13,8 (CH3), 47,1 és 49,1 (NCH2), 51,22 és 56,7 (gy r NCH2), 60,5 és 61,3 (OCH2), 137,18, 167,2, 169,5 és 170,5 (C=O); MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 605,28 (605,26) MALDI-TOF MS, M+H+ talált (számított): 418,20 (418,18) 1
H NMR (D2O): δ = 2,38 (s, 3H, CH3), 3,95 (s, 2H, NCH2), 5,30 (s, 2H, OCH2), 7,36 [d, 3JH,H = 8,1 Hz, 2H, CHarom], 7,42-7,49 (m, 5H, CHarom),7,68 [d, 3JH,H = 8,1 Hz, 2H, CHarom); 13C NMR (D2O): δ = 20,9 (CH3), 40,5 (NCH2), 68,6 (OCH2), 119,5 (Carom), 125,8, 128,9, 129,2, 129,3, és 129,8 (HCarom), 135,0 (Carom), 142,5 (Carom), 168,2 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,48 (s, 2H, NH2), 3,46 (s, 2H, NCH2), 5,16 (s, 2H, OCH2), 7,29-7,37 (m, 5H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 43,9 (NCH2), 66,55 (OCH2), 128,25, 128,3 és 128,5 (HCarom), 135,5 (Carom), 174,0 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,93 [d, 3JH,H = 7,4, 3H, CH3], 4,65 [q, 3JH,H = 6,8 Hz, 1H, CH]; 13C NMR (CDCl3): δ = 21,7 (CH3), 48,4 (CH), 170,6 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,93 [d, 3JH,H = 6,6 Hz, 3H, CH3], 4,65 [q, 3JH,H = 7,2 Hz, 1H, CH] 1 H NMR (CDCl3): δ = 3,91 (BrCH2), 4,10 [d, 3JH,H = 5,2 Hz, 2H, NCH2], 5,20 (OCH2), 6,99 (s, 1H, NH), 7,33-7,40 (m, 5H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 28,6 (BrCH2), 42,0 (NCH2), 67,5 (OCH2), 128,5, 128, 7 és 128,72 (HCarom), 134,9 (Carom), 168,7 és 169,1 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,89 [d, 3JH,H = 7,3 Hz, 3H, CH3], 4,10 [d, 3JH,H = 5,2 Hz, 2H, NCH2,), 4,44 [q, 3JH,H = 7,3 Hz, 1H, CH), 5,20 (s, 2H, OCH2), 6,85 (s, 1H, NH), 7,33-7,40 (m, 5H, CHarom) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,88 [d, 3JH,H = 6,8 Hz, 3H, CH3], 4,10 [d, 3JH,H = 5,3 Hz, 2H, NCH2,), 4,44 [q, 3JH,H = 6,8 Hz, 1H, CH), 5,21 (s, 2H, OCH2), 6,86 (s, 1H, NH), 7,37-7,42 (m, 5H, CHarom); 13C NMR (CDCl3): δ = 23,0 (CH3), 41,9 (NCH2), 44,3 (CH), 67,4 (OCH2), 128,4, 128,6 (HCarom), 135,0 (Carom), 169,2 és169,5 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,57 (s, 8H, gy r CH2), 3,05 (s, 4H, NCH2), 4,14 [d, 3JH,H = 5,7 Hz, 4H, NCH2], 5,18 (s, 4H, OCH2), 7,32-7,40 (m, 10H, CHarom), 7,59 (s, 1H, NH); 13C NMR (CDCl3): δ = 40,7 és 53,4 (NCH2), 61,1 (gy r NCH2), 67,2 (OCH2), 128,4, 128,6 és 128,64 (HCarom), 135,1 (Carom), 169,6 és 170,3 (C=O); Elemanalízis C26H32N2O6 talált (számított): C 60,42 % ( 62,89 %), H 6,38 % (6,50 %), N 11,24 % (11,28 %); 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,81 [p, 3JH,H = 5,8 Hz, 2H, gy r CH2], 2,75 (s, 4H, gy r CH2), 2,782,83 (m, 8H, gy r NCH2), 3,23 (s, 4H, NCH2), 4,13 [d, 3JH,H = 5,7 Hz, 4H, NCH2], 5,16 (s, 4H, OCH2), 7,31-7,39 (m, 10H, CHarom), 7,76-7,79 (m, 2H, NH); 13C NMR (CDCl3): δ = 28,3 (gy r CH2), 40,7 és 55,0 (gy r NCH2), 56,3 és 61,8 (NCH2), 66,9 (OCH2), 128,2, 128,4 és 128,46 (HCarom), 134,95 (Carom), 169,6 és 171,0 (C=O); Elemanalízis C27H34N2O6 talált (számított): C 63,41 % (63,41 %), H 6,84 % (6,71 %), N 11,18 % (10,97 %) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,78 (s, 12H, gy r CH2,), 3,25 (s, 6H, NCH2), 40,07 [d, 3JH,H = 5,8 Hz, 6H, NCH2), 5,13 (s, 6H, OCH2), 7,30-7,38 (m, 15H, CHarom), 7,53-7,56 (m, 3H, NH); 13C NMR (CDCl3): δ = 40,9 és 55,4 (NCH2), 61,9 (gy r CH2), 67,0 (OCH2), 128,3, 128,4 és 128,5 (HCarom), 135,1 (Carom), 169,9, 172,8 (C=O); Elemanalízis C39H48N6O9 talált (számított): C 60,18 % ( 62,89 %), H 6,59 % (6,50 %), N 10,79 % (11,28 %)
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
2. FÜGGELÉK folytatás Vegyület
NMR, MALDI-TOF, elemanalízis és fajlagos forgatóképesség adatok
99
1
100
101 102
103 104 105
transz
rac-106 cisz rac-106 transz
R,R-106
cisz R,R-106
H NMR (CDCl3): δ = 2,67 (s, 16H, gy r CH2), 3,10 (s, 8H, NCH2), 3,98 [d, 3JH,H = 5,8 Hz, 8H, NCH2), 5,10 (s, 8H, OCH2), 7,30-7,34 (m, 20H, CHarom), 7,57-7,59 (m, 4H, NH); 13C NMR (CDCl3): δ = 40,9 és 53,2 (NCH2), 59,1 (gy r CH2), 67,1 (OCH2), 128,4, 128,5 és 128,6 (HCarom), 135,1 (Carom), 169,96 és171,6 (C=O); Elemanalízis C52H64N8O12 talált (számított): C 60,78 % (62,89 %), H 6,56 % (6,50 %), N 10,92 % (11,28 %) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,67 [t, 3JH,H = 4,7 Hz, 8H, gy r CH2], 3,11 (s, 4H, NCH2), 3,30 [t, 3JH,H = 4,7 Hz, 8H, gy r OCH2), 3,38 (s, 8H, gy r CH2), 4,10 [d, 3JH,H = 6,3 Hz, 4H, NCH2), 5,13 (s, 8H, OCH2), 7,32-7,38 (m, 10H, CHarom), 8,19-8,23 (m, 2H, NH); 13C NMR (CDCl3): δ = 41,2 (NCH2), 56,8 és 56,9 (gy r NCH2), 66,4 és 68,4 (gy r OCH2), 70,2 (OCH2), 128,2, 128,4 és 128,5 (HCarom), 135,7 (Carom), 169,8 és172,8 (C=O); Elemanalízis C34H48N4O10 talált (számított): C 61,03 % ( 60,7 %), H 7,45 % (7,19 %), N 8,70 % (8,33 %) 1 H NMR (D2O): δ = 3,22 (s, 8H, gy r CH2), 3,70 (s, 4H, NCH2), 3,91 (s, 4H, NCH2); 13C NMR (D2O): δ = 42,3 és 51,2 (NCH2), 58,2 gy r (CH2), 168,9 és 174,9 (C=O); Elemanalízis C12H20N4O6 talált (számított): C 45,74 % ( 45,57 %), H 6,56 % (6,37 %), N 17,99 % (17,71 %) 1 H NMR (D2O): δ = 2,21 [p, 3JH,H = 5,8 Hz, 2H, gy r CH2], 3,41-3,44 (m, 4H, gy r CH2), 3,58 (s, 4H, s, gy r CH2), 3,89 (s, 4H, NCH2), 3,95 (s, 4H, NCH2); 13C NMR (D2O): δ = 22,84 (gy r CH2), 42,81 és 51,78 (gy r NCH2), 54,80 és 58,76 (NCH2), 167,80 és 175,49 (C=O); Elemanalízis C13H22N4O6 talált (számított): C 44,16 % (47,27 %), H 7,10 % (6,71 %), N 15,98 % (16,96 %) 1 H NMR (D2O): δ = 3,08 (s, 12H, gy r CH2), 3,76 (s, 6H, NCH2), 3,94 (s, 6H, NCH2); 13C NMR (D2O): δ = 42,1 és 49,9 (NCH2), 57,9 (gy r CH2), 171,6 és 174,5 (C=O); Elemanalízis C18H30N6O9 talált (számított): C 45,08 % (45,57 %), H 6,58 % (6,37 %), N 17,28 % (17,71 %) 1 H NMR (D2O): δ = 3,35 (s, 16H, gy r NCH2), 3,87 (s, 16H, NCH2); 13C NMR (D2O): δ = 42,7 (NCH2), 55,4 (gy r CH2), 175,1 (C=O); Elemanalízis C24H40N8O12 talált (számított): C 42,79 % (45,57 %), H 6,77 % (6,37 %), N 16,22 % (17,71 %) 1 H NMR (D2O): δ = 3,60 [t, 3JH,H = 4,7 Hz, 8H, gy r NCH2], 3,72 (s, 8H, gy r OCH2), 3,84 (s, 4H, NCH2), 3,87-3,90 (m, 8H, gy r OCH2), 4,17 (s, 4H, NCH2); 13C NMR (D2O): δ = 43,6 (NCH2), 55,2 (gy r NCH2), 55,4 és 64,4 (gy r OCH2), 70,07 (OCH2), 166,0 és 175,9 (C=O); Elemanalízis C13H22N4O6 talált (számított): C 48,64 % (48,77 %), H 7,65 % (7,37 %), N 11,68 % (11,28 %) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,21 [d, 3JH,H = 6,9 Hz, 6H, CH3], 2,34-2,49 (m, 4H, gy r NCH2(Ha)), 2,67-2,74 (m, 4H, gy r NCH2(Hb), 3,41-3,55 (m, 18H, gy r OCH2 és NCH), 4,03 [d, 3JH,H = 6,1 Hz, 4H, NCH2], 5,14 (s, 4H, OCH2), 7,29-7,37 (m, 10H, CHarom), 8,47-8,50 (m, 2H, NH) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,23 [d, 3JH,H = 6,9 Hz, 6H, CH3], 2,54-2,60 (m, 4H, gy r NCH2(Ha)), 2,71-2,78 (m, 4H, gy r NCH2(Hb), 3,41-3,57 (m, 18H, gy r OCH2 és NCH), 3,88-4,16 (m, 4H, NCH2], 5,14 (s, 4H, OCH2), 7,29-7,37 (s, 10H, CHarom), 8,37-8,41 (m, 2H, NH) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,25 [d, 3JH,H = 7,0 Hz, 6H, CH3], 2,53-2,59 (m, 4H, gy r NCH2(Ha)), 2,71-2,78 (m, 4H, gy r NCH2(Hb), 3,44-3,58 (m, 18H, gy r OCH2 és NCH), 4,07 [d, 3JH,H = 6,1 Hz, 4H, NCH2], 5,14-5,21 (m, 4H, OCH2), 7,34-7,41 (m, 10H, CHarom), 8,51-8,54 (m, 2H, NH); 13 C NMR (CDCl3): δ = 8,6 (CH3), 41,1 (NCH2), 50,9 (gy r NCH2), 59,7 (NCH), 66,7, 69,4 és 70,5 (gy r OCH2 és CH2), 128,3 és 128,5 (HCarom), 135,55 (Carom), 169,9 és 174,9 (C=O); MALDI-TOF MS, C36H52N4O10 M+H+ talált (számított): 701,60 (701,32); [α]D = -4,62 (0,13 mol/dm3, CHCl3) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,23 [d, 3JH,H = 7,0 Hz, 6H, CH3], 2,54-2,60 (m, 4H, gy r NCH2(Ha)), 2,71-2,78 (m, 4H, gy r NCH2(Hb), 3,41-3,57 (m, 18H, gy r OCH2 és NCH), 3,87-4,17 (m, 4H, NCH2), 5,14 (s, 4H, OCH2), 7,328-7,41 (m, 10H, CHarom), 8,38-8,41 (m, 2H, NH); 13C NMR (CDCl3): δ = 8,9 (CH3), 41,1 (NCH2), 50,9 (gy r NCH2), 60,1 (NCH), 66,7, 69,6 és 70,6 (gy r OCH2 és CH2), 128,3 és 128,5 (HCarom), 135,55 (Carom), 169,9 és 174,9 (C=O); [α]D = -13,24 (0,0982 mol/dm3, CHCl3)
119
2 Irodalmi áttekintés
2. FÜGGELÉK folytatás Vegyület
NMR, MALDI-TOF, elemanalízis és fajlagos forgatóképesség adatok
rac-107
1
R,R-107
108 109
R-110
rac-110
R-111
rac-111 R-112
rac-112
120
H NMR (D2O, pD=4,0): 1,66 [d, 3JH,H = 6,9 Hz, 6H, CH3], 3,43-4,10 (m, 28H, gy r NCH2, gy r OCH2, NCH2); 4,42 [q, 3JH,H = 6,9 Hz, 2H, NCH] 1 H NMR (D2O, pD=9,5): δ = 1,25 [d, 3JH,H = 6,9 Hz, 6H, CH3], 2,73-2,86 (m, 8H, gy r NCH2, 3,56-3,88 (m, 22H, gy r OCH2, NCH, NCH2); 13C NMR (D2O, pD 9,5): δ = 10,49 (CH3), 43,5 (NCH2), 50,7 (gy r NCH2), 60,2 (NCH), 69,3 és 69,9 (gy r OCH2), 176,8 és 177,0 (C=O); MALDI-TOF MS, C22H40N4O10 M+H+ talált (számított): 521,18 (521,24); [α]D = -2,32 (0,1294 mol/dm3, MeOH) 1 H NMR (CDCl3): δ = 2,56 [t, 3JH,H = 6,2 Hz, 4H, gy r NCH2), 2,84 ([t, 3JH,H = 4,8 Hz, 4H, gy r NCH2), 3,63 (m, 16H, gy r OCH2), 7,12-7,53 (m, 15H, tritil) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,24 [d, 3JH,H = 6,9 Hz, 6H, CH3], 2,57-2,64 (m, 6H, gy r NCH2), 2,782,85 (m, 2H, gy r NCH2), 3,42-3,48 [q, 3JH,H = 6,8 Hz, 1H, CH], 3,5-3,69 (m, 20H, gy r OCH2), 3,80-3,99 (m, 2H, NCH2), 7,12-7,50 (m, 20H, CHarom), 8,37-8,40 (m, 2H, NH); 13C NMR (CDCl3): δ = 8,86 (CH3), 51,2 és 52,6 (NCH2), 60,0 (CH), 67,0, 69,7, 70,6, 71,0 és 71,5 (OCH2), 78,7 (tritil C), 126,0, 127,5 és 129,3 (tritil HCarom), 128,3 és 128,5 (HCarom), 135,5 (Carom), 143,8 (tritil C), 17,0 és 174,9 (C=O); MALDI-TOF MS, C43H53N3O7 M+H+ talált (számított): 724,28 (724,34) 1 H NMR (D2O, pD 9,45): δ = 1,15 [d, 3JH,H = 6,8 Hz, 3H, CH3], 2,62-2,68 (m, 2H, gy r NCH2 (Ha)), 2,82-2,89 (m, 2H, gy r NCH2(Hb)), 3,0-3,02 (m, 4H, gy r NCH2), 3,50-3,55 (m, 2H, gy r OCH2), 3,62-3,93 (m, 17H, gy r OCH2, NCH, NCH2), 8,32 (s, 1H, NH); 13C NMR (D2O, pD 9,45): δ = 8,6 (CH3), 43,5 (NCH2), 47,8 és 50,7 (gy r NCH2), 57,8 (NCH), 67,7, 68,4 és 70,1 (gy r OCH2), 176,6 és 177,0 (C=O); MALDI-TOF MS, C17H33N3O7 M+H+ talált (számított): 392,32 (392,24); [α]D = -15,53 (0,3478 mol/dm3, H2O) 1 H NMR (D2O, pD 9,45): δ = 1,16 [d, 3JH,H = 6,9 Hz, 3H, CH3], 2,47-2,51 (m, 2H, gy r NCH2 (Ha)), 2,87-2,94 (m, 2H, gy r NCH2(Hb)), 3,12-3,24 (m, 4H, gy r NCH2), 3,47-4,15 (m, 19H, gy r OCH2, NCH, NCH2), 8,32 (s, 1H, NH); 13C NMR (D2O, pD 9,45): δ = 7,75 (CH3), 43,4 (NCH2), 47,4 és 51,1 (gy r NCH2), 59,7 (NCH), 66,4 , 69,3, 70,0 és 71,0 (gy r OCH2), 173,3 és 174,8 (C=O) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,23 [d, 3JH,H = 6,8 Hz, 3H, CH3], 2,55-2,61 (m, 2H, gy r NCH2(Ha)), 2,74-2,81 (m, 6H, gy r NCH2(Hb) és gy r NCH2), 3,49-3,62 (m, 17H, gy r OCH2 és NCH)), 3,91-4,18 (m, 2H, NCH2), 5,15 (s, 2H, OCH2), 7,30-7,37 (m, 5H, CHarom), 8,48-8,51 (m, 1H, NH); 13 C NMR (CDCl3): δ = 8,6 (CH3), 41,4 (NCH2), 49,1 és 50,6 (gy r NCH2), 59,7 (NCH), 66,5 (OCH2), 69,8, 70,0, 70,3 és 70,9 (gy r OCH2), 128,2, 128,25 és 128,4 (HCarom), 135,6 (Carom), 169,9 és 175,1 (C=O); MALDI-TOF MS, C24H39N3O7 M+H+ talált (számított): 482,49 (482,28); [α]D = -15,78 (0,2665 mol/dm3, CHCl3) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,25 [d, 3JH,H = 7,1 Hz, 3H, CH3], 2,56-2,62 (m, 2H, gy r NCH2(Ha)), 2,79-2,88 (m, 6H, gy r NCH2(Hb) és gy r NCH2), 3,49-3,66 (m, 17H, gy r OCH2 és NCH)), 3,98-4,19 (m, 2H, NCH2), 5,19 (s, 2H, OCH2), 7,33-7,40 (m, 5H, CHarom), 8,47-8,50 (m, 1H, NH); 1 H NMR (D2O): δ = 1,8 [d, 3JH,H = 6,8 Hz, 3H, CH3], 2,67-2,74 (m, 2H, gy r NCH2(Ha)), 2,862,92 (m, 2H, gy r NCH2(Hb)), 3,25-3,28 (m, 4H, gy r NCH2), 3,52-3,58 (m, 2H, gy r OCH2), 3,65-3,79 (m, 17H, gy r OCH2, NCH), 3,76 (s, 3H, OCH3), 4,00-4,10 (m, 2H, NCH2), 8,55 (s, 1H, NH); 13C NMR (D2O): δ = 8,7 (CH3), 41,4 (NCH2), 47,7 és 50,8 (gy r NCH2), 53,1 (OCH3), 57,2 (NCH), 66,0, 68,1, 70,0 és 70,2 (gy r OCH2), 172,3 és 176,5 (C=O); MALDI-TOF MS, C18H35N3O7 M+H+ talált (számított): 406,33 (406,25); [α]D = -15,08 (0,1525 mol/dm3, CHCl3) 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,24 [d, 3JH,H = 6,8 Hz, 3H, CH3], 2,59-2,65 (m, 2H, gy r NCH2(Ha)), 2,77-2,85 (m, 6H, gy r NCH2(Hb) és gy r NCH2), 3,55-3,69 (m, 17H, gy r OCH2 és CH), 3,76 (s, 3H, OCH3), 3,92-4,12 (m, 2H, NCH2), 8,41 (s, 1H, NH); 13C NMR (CDCl3): δ = 8,51 (CH3), 40,8 (NCH2), 48,9 és 50,5 (gy r NCH2), 51,7 (OCH3), 59,6 (NCH), 69,8, 70,0, 70,21 és 70,8 (gy r OCH2), 170,43 és 175,0 (C=O);
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
3. FÜGGELÉK Az értekezés alapját képez közlemények: 1. Tímea Iványi, Kornélia Pál, István Lázár, D. L. Massart, Yvan Vander Heyden, Application of tetraoxadiaza-crown ether derivatives as chiral selectors in capillary electrophoresis J. Chromatog. A, 2004, 1028, 325-332 2. Stefanie Leonard, Ann Van Schepdael, Tímea Iványi, István Lázár, Jan Rosier, Marc Vanstockem, Hans Vermeersch, Jos Hoogmartens Development of a capillary electrophoretic method for the separation of diastereoisomers of a new human immunodeficiency virus protease inhibitor Electrophoresis, 2005, 26, 627-632 3. János Elek, Debby Mangelings, Tímea Iványi, István Lázár, Y. Vander Heyden Enantioselective capillary electrophoretic separation of tryptophane- and tyrosine-methyesters in a dual system with a tetra-oxadiaza-crown-ether derivative and a cyclodextrin Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 38, 601-608 4. Zsolt Baranyai, Ern Brücher, Tímea Iványi, Róbert Király, István Lázár and László Zékány Complexation properties of N,N’,N’’,N’’’-[1,4,7,10-tetraazacyclododecane1,4,7,10-tetraylkis(1-oxoethane-2,1-diyl)]tetrakis[glycine] (H4dotagl). Equilibrium, kinetic and relaxation behavior of the lanthanide(III) complexes Helvetica Chimica Acta, 2005, 88, 604-617 5. Tímea Iványi, István Lázár Synthesis and in vitro enzyme hydrolysis of trioxadiaza- and tetraoxadiazacrown ether based complexing agents with disposable ester pendant arms Synthesis, (megjelenés alatt)
Az értekezéshez nem kapcsolódó közlemények: 1. István Lázár, Adél Egri, Róbert Király, Zsolt Baranyai, Tímea Iványi and Ern Brücher, Synthesis, conformation and equilibrium study of new piperazine and azamacrocyclic ligands with N-(tetrahydrofuran-2-on-3-yl) and N[(carboxy)(2- hydroxyethyl)methyl] pendant arm Eur. J. Org. Chem., 2002, 351-360. 2. Tímea Iványi, Yvan Vander Heyden, Dóra Visky, Peggy Baten, Jacques De Beer, István Lázár, D. L. Massart, Eugene Roets, Jos Hoogmartens 121
2 Irodalmi áttekintés
Minimal number of chromatographic test parameters for the characterisation of reversed-phase liquid chromatographic stationary phases, J. Chrom. A, 2002, 954, 99-114. 3. D. Visky, Y. Vander Heyden, T. Iványi, P. Baten, J. De Beer, B. Noszál, E. Roets, D. L. Massart, J. Hoogmartens Characterisation of reversed phase liquid chromatographic columns by chromatographic tests, Preliminary experiments and development of the protocol, Pharmaeuropa, 2002, 14, 288-297. 4. Dóra Visky, Yvan Vander Heyden, Tímea Iványi, Peggy Baten, Jacques De Beer, Zsuzsanna Kovács, Béla Noszál, Eugène Roets, Désiré. L. Massart, Jos Hoogmartens Characterisation of reversed phase liquid chromatographic columns by chromatographic tests. Evaluation of 36 test parameters: repetability reproducibility and correlation, J. Chrom. A, 977, 2002, 39-58. 5. Dóra Visky, Yvan Vander Heyden, Tímea Iványi, Peggy Baten, Jacques De Beer, Zsuzsanna Kovács, Béla Noszál, Pieter Dehouck, Eugène Roets, Désiré. L. Massart, Jos Hoogmartens, Characterisation of reversed-phase licquid chromatographic columns by chromatographic tests. Rational column classification by a minimal number of columns test parameters, J. Chrom A, 2003, 1012, 11-29.
Az értekezés anyagához kapcsolódó el adások és poszterek: 1. Iványi Tímea (Témavezet : Dr Lázár István) Intracelluláris fémionkoncentráció meghatározására alkalmas poliazamakrociklusos komplexképz k modellvegyületeinek el állítása és hidrolízisuk vizsgálata, XXIV. Országos Tudományos Diákköri Konferencia Kémiai és Vegyipari Szekció, 1999. április 7-9, Veszprém 2. Iványi Tímea, Lázár István Poliaza-poliacetát típusú makrociklusok átalakítása fiziológiás körülmények között hidrolizáló származékokká, XXXIV. Komplexxémiai kollokvium, 1999. május 19-21, Tata 3. Iványi Tímea, Lázár István, Szilágyi Erika, Brücher Ern Dipeptid oldalláncot tartalmazó poliaza-makrociklusos komplexképz k szintézise és protonálódási mechanizmusának vizsgálata, XXXV. Komplexkémiai kollokvium, 2000. május 24-26, Kecskemét 122
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
4. Tímea Iványi, István Lázár (poszter) Hydrolysable pendant arms containing polyaza macrocycles for cell targeting, COST D8/D18 European Workshop, 2000. szeptember 14-17, Prága, Csehország 5. Iványi Tímea, Lázár István Preparation and study of new polyaza macrocycles for biomedical application, 2000. október 11, Vrije Universiteit Brussel, Department of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Brüsszel, Belgium 6. Tímea Iványi, István Lázár, (poszter) Polyaza macrocycles for intracellular applications, ChemoAC Meeting, 2000. november 7-8, Vrije Universiteit Brussel, Department of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Brüsszel, Belgium 7. Baranyai Zsolt, Bényei Attila, Bücher Ern , Iványi Tímea, Király Róbert és Lázár István, Az 1,4,7-triaza-ciklononán-1,4,7-trisz(acetil-glicin) el állítása és komplexképz sajátságai, XXXVI. Komplexkémiai kollokvium, 2001. május 2325, Pécs 8. Baranyai Zs., Brücher E., Király R., Iványi T., Lázár I. és Simon A., Acetilglicinát funkciós csoportokat tartalmazó tetraaza- és diaza-tetraoxa makrociklusos ligandumok komplexképz sajátosságai, XXXVII. Komplexkémiai kollokvium, 2002. május 29-31, Mátraháza 9. E. Brücher, Zs. Baranyai, A. Bényei, T. Iványi, R. Király, I. Lázár, A. Simon (poszter), Complexation properties of the triaza, tetraaza and diaza-tetraoxa macroczclic ligands containing acetylglycinate functional groups, Eurobic-6, 2002. július 29-augusztus 3, Lund, Svédország 10. Baranyai Zs., Brücher E., Király R., Iványi T., Lázár I. Az 1,4,7,10-tetraazaciklooktadekán-1,4,7,10-tetrakisz(acetilglicin) ligandum komplexképz sajátságai, XXXVIII. Komplexkémiai Kollokvium, 2003. május 21-23, Gyula 11. Iványi T., Lázár I., Y. Vander Heyden, D. L. Massart Makrociklus alapú királis szelektorok alkalmazása optikailag aktív aminosav származékok elválasztására, XXXVIII. Komplexkémiai Kollokvium, 2003. május 21-23, Gyula 12. T. Iványi, K. Pál, I. Lázár, Y. Vander Heyden, D.L. Massart (poszter) Application of macrocycle type molecules as chiral selector modifiers in capillary electrophoresis, 28th International Conference on Solution Chemistry (ICSC 28), 2003. augusztus 23-28, Debrecen 123
2 Irodalmi áttekintés
13. T. Iványi and I. Lázár (poszter) Macrocyclic chelators for intracellular applications, 28th International Conference on Solution Chemistry (ICSC 28), 2003. augusztus 23-28, Debrecen 14. T. Iványi, K. Pál, I. Lázár, D.L. Massart and Y. Vander Heyden (poszter) A potentially biologically active diaza-crown ether derivative as chiral selector in capillary electrophoresis, 5th CE users group meeting, 2003. október 16, Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgium 15. J. Elek, T. Iványi, D-L Massart and Y. Vander Heyden (poszter) The enantioselective CE separation of tryptophan- and tyrosine-methylester in a dual selector system with a tetraoxadiaza-crown ether derivative (RS-1) and cyclodextrins, A, 5th CE users group meeting, 2003. október 16, Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgium, B, Advances in Chromatography and Electrophoresis – Conferentia Chemometrica (ACE & CC 2003), 2003. október 2729, Budapest 16. T. Iványi, K. Pál, I. Lázár, D.L. Massart and Y. Vander Heyden Modification of the enantioselective effect of different cyclodextrins using tetraoxadiaza-crown ether derivatives as chiral selector modifiers in capillary electrophoresis (poszter), Advances in Chromatography and Electrophoresis – Conferentia Chemometrica (ACE & CC 2003), 2003. október 27-29, Budapest
Az értekezés anyagához nem kapcsolódó el adások és poszterek: 1. Tímea Iványi, Dóra Visky, Jacques De Beer, Yvan Vander Heyden, Béla Noszál, Eugene Roets, D.L. Massart, Jos Hoogmartens, Characterization of stationary phases in reversed phase liquid chromatography, ChemoAC Meeting, 2000. November 7-8, Vrije Universiteit Brussel, Department of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Brüsszel Belgium (poszter) 2. T. Iványi, D.L. Massart and Y. Vander Heyden, Data analysis, survey of possibilities for column clustering based on a minimal number of column tests, Mini-symposium: Characterization of HPLC columns, Vrije Universiteit Brussel, Department of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Brussels, February 15, 2001. Belgium 3. T. Iványi, D. Visky, E. Roest, J. Hoogmartens, J. De Beer, D.L. Massart et Y. Vander Heyden, Caractérisation de phases stationnaires. Analyse de données: possibilitand de regrouper des colonnes en fonction d´un nombre minimal de paramètres de test, SEP01, 2001. Június 12-14, Párizs, Franciaország 124
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai…
4. Tímea Iványi, Dóra Visky, Jacques De Beer, Eugene Roets, Jos Hoogmartens, D.L. Massart, Yvan Vander Heyden, Characterisation of stationary phases. Survey of data analysis, Possibilities for column clustering based on a minimal number of column tests, 25th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separation and Related Techniques, 2001. Június 17-22, Maastricht, Holland (poszter) 5. T. Iványi, D.L. Massart and Y. Vander Heyden, Data analysis, survey of possibilities for column clustering based on a minimal number of column tests, Workshop on Characterisation of Reversed Phase HPLC Columns, Catholic University of Leuven, Laboratory of Pharmaceutical Chemistry and Drug Analysis, 2001. január 11, Leuven, Belgium 6. Visky D., Iványi T., Vander Heyden Y., De Beer J., Kovács Zs., Noszál B.,Roets E., Massart D. L., Hoogmartens J., (poszter) Characterisation of 71 PRLC C18 Columns by Chromatographic Tests Interlaboratory Study, Balaton Symposium ' 01 on High Performance Separation Methods, 2001. szeptember 2-4, Siófok 7. D. Visky, Y. Vander Heyden, Zs. Kovács, T. Iványi, P. Baten, J. De Beer, B. Noszál, E. Roets, D.L. Massart, J. Hoogmartens, Characterisation of 71 RPHPLC columns – comparison of chromatographic tests and a real separation using principal component analysis, Drug Analysis 2002 Symposium organized by The Belgian Society of Pharmaceutical Sciences (BSPS), 2002. április 21-25, Brugge, Belgium
125