U n i v e r z i t a
P a l a c k é h o
v
O l o m o u c i
Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie
Porovnání různých typů elektrod pro elektrochemické studium a analýzu biologicky aktivních látek
Diplomová práce
Autor:
Šimon Lindovský
Školitel:
RNDr. Jana Skopalová, Ph.D.
Studijní program:
N1407 Chemie
Studijní obor:
Analytická chemie
Forma studia:
prezenční
Olomouc 2015
Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracoval samostatně. Veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci použil, jsou v seznamu použité literatury. Souhlasím s tím, že práce je prezenčně zpřístupněna v knihovně Katedry analytické chemie, Přírodovědecké fakulty, Univerzity Palackého v Olomouci.
V Olomouci dne …………….. ………….……………………………….
Vlastnoruční podpis
2
Poděkování Chtěl bych velice poděkovat své vedoucí RNDr. Janě Skopalové Ph.D. za nabídnutí tématu a odborné vedení mé práce. Rád bych vyzdvihl především její optimismus, trpělivost a cenné rady při mém zpracování experimentální a teoretické části.
3
Obsah 1.
Úvod ....................................................................................................................... 6
2.
Teoretická část........................................................................................................ 7
2.1.
Studované látky a jejich elektrochemické chování ............................................ 7
2.1.1.
Dopamin ..................................................................................................... 7
2.1.2.
3-methoxytyramin ...................................................................................... 8
2.1.3.
Katechol ..................................................................................................... 9
2.1.4.
Guajakol ..................................................................................................... 9
2.2.
Chování analytů na povrchu voltametrických elektrod.................................... 11
2.2.1.
Adsorpce katecholů .................................................................................. 11
2.2.2.
Elektrochemická polymerace katecholů................................................... 13
2.3.
Metody analýzy, použité techniky.................................................................... 14
2.3.1.
Cyklická voltametrie ................................................................................ 14
2.3.2.
Rotující disková elektroda........................................................................ 14
2.3.3.
Elektrochemická impedanční spektroskopie ............................................ 16
2.3.4.
Spojení elektrochemie s hmotnostní detekcí ............................................ 18
3.
Experimentální část .............................................................................................. 21
3.1.
Přístrojové vybavení......................................................................................... 21
3.2.
Chemikálie ....................................................................................................... 22
3.3.
Voltametrická měření ....................................................................................... 23
3.4.
Elektrochemická impedanční spektroskopie .................................................... 24
3.5.
Měření EC/MS ................................................................................................. 25
4. 4.1.
Výsledky a diskuse............................................................................................... 26 Cyklická voltametrie ........................................................................................ 26
4.1.1.
Dopamin ................................................................................................... 26
4.1.2.
3-methoxytyramin .................................................................................... 29
4.1.3.
Katechol ................................................................................................... 31
4.1.4.
Guajakol ................................................................................................... 32
4.2.
Studium adsorpce dopaminu na povrchu voltametrických elektrod ................ 33
4.2.1.
Skelný uhlík.............................................................................................. 34
4.2.2.
Platina....................................................................................................... 36
4.3.
Elektrochemická impedanční spektroskopie .................................................... 37
4.4.
EC/MS.............................................................................................................. 40
4
4.4.1.
Vliv napětí na kapiláře ............................................................................. 40
4.4.2.
Vliv teploty sušícího plynu ...................................................................... 42
4.4.3.
Vliv rychlosti průtoku .............................................................................. 43
4.4.4.
Dopamin ................................................................................................... 44
4.4.5.
3-methoxytyramin .................................................................................... 45
4.4.6.
Katechol ................................................................................................... 47
4.4.7.
Guajakol ................................................................................................... 49
4.5.
EC/MS spojení průtokové cely s tištěnou elektrodou ...................................... 49
5.
Závěr..................................................................................................................... 53
6.
Summary .............................................................................................................. 54
7.
Použitá literatura .................................................................................................. 55
8.
Přílohy .................................................................................................................. 59
8.1.
MS spektra........................................................................................................ 59
8.1.1.
Dopamin ................................................................................................... 59
8.1.2.
3-methoxytyramin .................................................................................... 61
8.1.3.
Katechol ................................................................................................... 62
5
1.
Úvod
Látky studované v této práci (dopamin, 3-methoxytyramin, katechol, guajakol) jsou oxidovány přes redoxní systémy chinon/hydrochinon. Ty byly intensivně studovány pro jejich důležitost v biologických systémech. Katecholaminy (neurotransmitery) a další chinonoidní struktury pro své vhodné vlastnosti pro přenos elektronů podnítily rozsáhlé výzkumy redoxního chování chinonů a to jak ve vodném, tak nevodném prostředí. Zvláštní postavení zde mají studie heterogenního přenosu elektronu mezi pevnými elektrodami a těmito látkami. To vše má zásadní význam jak pro elektrochemickou detekci katecholaminů, tak i pro širší pochopení redoxního chování chinonů. Spojením elektrochemie s hmotnostní spektrometrií (od r. 1971) a vývojem této techniky dochází k zdokonalení tohoto výzkumu (lze získat informace o molekulové hmotnosti a při použití tandemové MS i strukturní informace o analyzovaných látkách). Cílem této práce bylo popsat elektrochemické chování vybraných modelových látek na elektrodách ze skelného uhlíku a platiny, studovat jejich oxidaci v různých prostředích a adsorpci výchozích látek i produktů elektrochemických reakcí. K tomu byly použity metody cyklické voltametrie, cyklické voltametrie na rotační diskové elektrodě a elektrochemické impedanční spektroskopie. Dále pak na základě identifikace produktů elektrochemické oxidace vybraných látek metodou hmotnostní spektrometrie se pokusit navrhnout cestu jejich elektrochemické přeměny, popřípadě posoudit vliv materiálu elektrody na oxidační produkty a průběh elektrochemických dějů.
6
2.
Teoretická část
2.1.
Studované látky a jejich elektrochemické chování
2.1.1. Dopamin Dopamin (4-(2-aminoethyl)benzen-1,2,-diol, DA) je významný neurotransmiter z řady katecholaminů. Má významnou funkci v centrálním nervovém, ledvinovém, hormonálním a kardiovaskulárním systému organismů [1], [2]. Fyzikálně-chemické charakteristiky jsou uvedeny v Tabulce 1. Nedostatek či přemíra dopaminu může vést k vzniku neurologických nemocí jako např. Parkinsonova choroba, schizofrenie, autismus či hyperaktivita. Sledování hladiny DA in vitro i in vivo je potřebné a to především z důvodů lepšího porozumění neuronálním funkcím a vývoje diagnostických nástrojů [3]. DA byl prvně nasyntetizován v roce 1910 G. Barnerem a J. Ewensem v laboratoři v Londýně (Wellcome Laboratories) [4]. V r. 1958 A. Carlsson a N. Hillarp objevili, že hlavní funkcí DA je přenos vzruchu (neurotransmiter) [5]. Carlsson obdržel roku 2000 Nobelovu cenu za fyziologii či lékařství. Ukázal, že dopamin není jen prekurzorem norepinefrinu a epinefrinu, ale že je také neurotransmiter [4]. Neurotransmitery jsou většinou snadno oxidovatelné látky. Jejich koncentrace v organismu jsou velmi nízké a změny jejich redoxních forem probíhají velmi rychle. Z toho důvodu k jejich zkoumání je zapotřebí metody velmi rychlé, citlivé a selektivní. Tyto podmínky výborně splňují elektrochemické techniky založené na anodické oxidaci. Jsou vhodné jak k detekci, tak k poskytnutí kvalitativních i kvantitativních informací o hladinách těchto látek [2]. Většina neurotransmiterů podstoupí po prvním přenesení elektronů (e mechanismus) chemickou reakci (c mechanismus). Toto je možno velmi dobře sledovat cyklickou voltametrií. Ta nám poskytuje informace o mechanismu a rychlosti chemické reakce. Počáteční oxidace dopaminu (závislá na pH, vznik DA-o-chinonu) může být následována 1,4−adicí (1,4-Michaelova adice, kdy se aminoskupina bočního řetězce spojuje s uhlíkem C(6) o−chinonu). To vede k vzniku cyklického produktu – dopaminochromu (2,3-dihydro1H-indol-5,6-dion, Obr. 1). Ten se může v blízkosti elektrody projevit redukční vlnou při negativnějších potenciálech než je potenciál redukce necyklického chinonu [6]. Cyklizace probíhá především při vyšších hodnotách pH (pH > 5). Následně může dojít k vzniku látek se strukturou
podobnou
melaninu,
které
7
mohou
inhibovat
přenos
elektronů
a tak minimalizovat odezvu na elektrodě [2]. Při nižších hodnotách pH cyklizace téměř neprobíhá, dochází k protonizaci aminoskupiny dopaminu-o-chinonu [6], [7], [8]. HO
NH2
O
NH2
2e-, 2H+ O
HO
O
HO
2e-, 2H+ N H
HO
N H
O
Obr. 1: Oxidační schéma dopaminu [6]. Jelikož je oxidace dopaminu závislá na pH roztoku, je tato skutečnost často zkoumaná a to jak na elektrodách nativních, tak modifikovaných [2]. V základním elektrolytu o kyselém pH (vodný pufr, pH < 6) je pozorován jen jeden redoxní pár s anodickým píkem +0,7 V (vs. Ag/AgCl,) spojený s přenosem dvou elektronů za vzniku chinonu a katodický pík při potenciálu kolem +0,2 V. Na cyklických voltamogramech z vodných pufrů o vysokém pH (mezi 10 a 13) byly viditelné 2 redoxní páry: irreversibilní oxidační pík mezi +0,2 a 0 V (vs. Ag/AgCl), který je v souladu s přenosem elektronů za vzniku cyklizovaného chinonu, a reversibilní redoxní píky mezi potenciály -0,2 a -0,6 V (vs. Ag/AgCl), které jsou přiřazovány redoxnímu páru leukochrom/cyklizovaný chinon [9].
2.1.2. 3-methoxytyramin 3-methoxytyramin (4-(2-aminoethyl)-2-methoxyphenol, 3-MT) je hlavním metabolitem dopaminu v organismu [10]. Carlsonn a Lindqvist objevili, že 3-MT vzniká methylací DA enzymem katechol-O-methyl transferasou (COMT, EC 2.1.1.6) [11]. Charakteristiky 3-MT jsou obsaženy v Tabulce 1. 3-MT je většinou v biologických materiálech analyzován separačními metodami s použitím vhodného detektoru. Jelikož se jedná o elektrochemicky aktivní látku, je velmi vhodnou
technikou
vysokoúčinná
kapalinová
chromatografie
s
elektrochemickým
detektorem. Pro správné nastavení potenciálu na elektrodě detektoru je vhodné si potenciál oxidace zjistit. Shoup a Kissinger [10] použili metodu CV 0,5 mM 3-MT na uhlíkové pastové elektrodě. Látka se oxidovala při +0,75 V (vs. Ag/AgCl). Navrhli průběh oxidace následujícím způsobem: O H3C
NH2 -
+
-2e , -H HO
O
+
NH2
H3C
+H2O
O
+
O
O
NH2
+ H + CH 3OH
Obr. 2: Oxidační schéma 3-MT dle Shoupa a Kissingera [10].
8
2.1.3. Katechol Katechol (benzen-1,2-diol, KAT) byl prvně izolován r. 1839 H. Reinscherem destilací katechinu (flavonoid) [12]. Katechol je znám v biologických systémech jako centrum pro přenos elektronů ve strukturách přírodních složek a biologicky aktivních molekul schopných redoxního chování [13]. Fyzikálně chemické charakteristiky jsou uvedeny v Tabulce 1. Při neutrálním pH v prostředí fosfátového pufru jsou při oxidaci katecholu na cyklickém voltamogramu viditelné dva píky – anodický (0,29 V) a s ním korespondující katodický pík při 0,12 V (vs. Ag/AgCl). Tyto píky jsou přisuzovány kvazireversibilní dvouelektronové oxidaci katecholu na o-benzochinon a zpět (obr. 3) [13]. Za těchto podmínek je poměr proudů píků I Cp / I pA téměř jednotkový. Obzvlášť při opakovaném cyklování může být tento poměr považován za kritérium stability o-chinonu produkovaného za stálých experimentálních podmínek na povrchu elektrody. Jinak řečeno, hydroxylace či dimerizace jsou příliš pomalé děje na to, aby se zde objevily. V zásaditém prostředí není poměr proudů píku jednotkový, klesá se vzrůstajícím pH a s klesající rychlostí polarizace elektrody. Tyto změny v elektrochemickém chování mohou být způsobeny dimerizací oxidovaných forem aniontů katecholu [14]. Rovnovážný potenciál pro přenos elektronu mezi katecholem a radikálem semichinonem je 100 mV při pH 7 [15]. Pro přenos druhého elektronu mezi radikálem semichinonem a chinonem jsou uvedeny rovnovážné potenciály 530 mV, 139 mV a 43 mV odpovídající pH 7, pH 11 a pH 13,5 [16]. V důsledku toho není katechol schopen při fyziologickém pH autooxidace [17]. HO
O
HO
HO
O
+ H+ +
e
+ 2H+ +
-
2e
-
O
Obr. 3: Předpokládaný průběh oxidace katecholu [17].
2.1.4. Guajakol Guajakol (2-methoxyphenol, GUA) je významný polutant průmyslových odpadních vod. Pro svou strukturu a elektrochemické vlastnosti je často brán jako modelový vzorek fenolických látek obsažených v odpadních vodách [18]. Některé z charakteristik (vzorec, molekulová hmotnost atd.) uvádí Tabulka 1.
9
Elektrochemická oxidace byla zkoumána jak z hlediska použitého materiálu elektrody, tak z hlediska použitého rozpouštědla [19], [20]. Z těchto výzkumů vyplývají následující závěry: guajakol prvně nevratně odštěpuje jeden nebo dva elektrony, což vede k vytvoření fenoxyradikálu nebo fenoxoniového kationtu. Tyto meziprodukty vytvářejí struktury jako o−benzochinon, methoxybenzochinon či polymery. Proud počátečního uvolnění elektronů je řízen rychlostí difuse látky k elektrodě. V kyselém prostředí guajakol odštěpuje dva elektrony ece mechanismem (elektrochemická reakce následována chemickou a poté opět elektrochemickou
reakcí),
v zásaditém
prostředí
probíhá
jednoelektronová
reakce
ec mechanismem [18].
Obr. 4.: Pravděpodobné schéma prvního kroku oxidace katecholu (A) a možný produkt oxidace ve vodném prostředí - methoxybenzochinon (B) [18].
Tabulka 1.: Charakteristiky zkoumaných látek [2], [8], [12], [17], [18]. Název
Strukturní vzorec HO
Dopamin
Mr NH 2
pK
Rozpustnost
pK1 = 8,1
v methanolu,
153,18 pK2 = 10,4 60 g/100 ml vody
HO
pK3 = 13,1 O H 3C
3-methoxytyramin
NH 2
v methanolu,
167,21 pK2 = 10,8 50 g/100 ml vody
HO HO
Katechol
pK1 = 9,5
pK1 = 9,25 110,11 pK2 = 13,0 ve vodě
HO O H 3C
Guajakol
124,14 pK = 9,9
HO
10
ve vodě
2.2.
Chování analytů na povrchu voltametrických elektrod
2.2.1. Adsorpce katecholů Jedním z hlavních problémů použití voltametrie a amperometrie pro detekci katecholů je stabilita a citlivost elektrodové odezvy. Je tak především z důvodu naadsorbování oxidačních produktů, které blokují povrch elektrody, což vede k celkovému snížení signálu s přibývajícím časem [2]. Elektrodová aktivita je ovlivněna několika faktory ovlivňujícími fyzikální sorpci a chemisorpci, jako jsou mikroskopická struktura povrchu, kvalita čištění či aktivní místa povrchu (funkční skupiny obsahující kyslík, uspořádání jednotlivých vrstev uhlíku atd.). Změny těchto proměnných spolu s různým použitým předčištěním povrchu způsobují, že je těžké definovat povrch elektrody pro daný experiment. To je však velmi důležité pro pochopení vztahu struktury povrchu a jeho elektrochemické aktivity [21]. Nastává řada specifických jevů spojených s adsorpcí - od výskytu vysokého či nereprodukovatelného proudu pozadí k celkové pasivaci a inaktivaci povrchu elektrody. Adsorpce je problémem zvlášť pro analýzy s použitím platinové elektrody z důvodů vysoké citlivosti povrchu k hysterezi a z nedostatku vhodných postupů k obnovení povrchu [22]. Elektrochemická oxidace katecholů zvyšuje adsorpci a rychlost přenosu elektronu, účinek často přisuzovaný elektrostatickým vlivům nebo katalýze přenosu protonu. Povrchové vlivy na přenos elektronů u chinoidních struktur bývají využívány v bioanalytických aplikacích, včetně omezení aniontových interferencí vytvořením záporně nabitého povrchu elektrody či prekoncentrace katecholaminů adsorpcí předcházející voltametrickým měřením při vysokých rychlostech scanu [23]. Adsorpce katecholaminů na záporný film či vlastní povrch uhlíku je rozhodující pro úspěšné elektrochemické analýzy in vivo. Adsorpce na skelném uhlíku je slabší, ale předpokládá se, že zde má vliv i fyzikální adsorpce [21]. Chemisorpce hydrochinonů na čistý povrch platinové elektrody byl zkoumán také [22]. Základní kroky přenosu elektronu v systému chinon/hydrochinon byly popsány pro platinovou a uhlíkovou pastovou elektrodu a bylo dosaženo dostatečné opakovatelnosti. Tento postup lze aplikovat na oxidaci hydrochinonu a katecholu se střídáním přenosu protonu a elektronu v závislosti na pH. Např. při zkoumání oxidace dopaminu na uhlíkové pastové elektrodě se dospělo k závěru, že pořadí přenosu protonů a elektronů pro vytvoření o-chinonu při pH 7 je H+, e-, H+, e-.
Z důvodů změn stavu povrchu elektrody (i při předčištění)
je obtížné tyto závěry zobecnit na širokou škálu redoxních reakcí katecholů. Například použitím vakuové tepelné předúpravy povrchu elektrody dochází k zmenšení poměru O/C
11
(poměr počtu atomů kyslíku ku počtu uhlíků) na povrchu skelného uhlíku, zatímco anodizace povrchu vede k vytvoří mnohovrstvého filmu oxidačního produktu s vysokým poměrem O/C. Nicméně na povrchu elektrody po obou těchto úpravách je kinetika oxidace DA rychlá. Vyvstává otázka, zda mají povrchové oxidy elektrody vliv na elektrodovou kinetiku. Avšak v případě, že je redoxní mechanismus dán určitou úpravou povrchu uhlíku, není vhodné předpokládat, že to bude platit i pro jinou úpravu či jiný druh uhlíkové elektrody [23]. Jedním z největších problémů je příprava a charakterizace reprodukovatelných pracovních povrchů elektrod. Použitím přesně definovaného postupu čištění a modifikace mohou být připraveny a spektroskopicky charakterizovány povrchy skelného uhlíku se shodným chováním kinetiky elektrodových reakcí. Takovýmto způsobem bylo dokázáno, že některé redoxní systémy (např. Ru(NH3)6+3/+2, methylviologen) jsou citlivé na povrchové úpravy a k přenosu elektronů může dojít prostřednictvím elektronového tunelování přes chemicky nasorbovanou vrstvu na GCE [24]. Zatímco redoxní systémy jako např. Fe3+/2+, systém při redukci kyslíku či oxidaci NADH velmi závisí na specifických interakcích s povrchem elektrody [25]. Pokrytí povrchu elektrody monovrstvou (chemisorpcí) vede k částečné či úplné inhibici přenosu elektronu u katecholů. Adsorpci katecholů však doprovází rychlý přenos elektronu na vyčištěném povrchu. Výsledkem toho je, že adsorpce katecholů na povrchu elektrody je nezbytná pro rychlý přenos elektronů, a že inhibice přenosu elektronu přes naadsorbovanou vrstvu je způsobena preventivně adsorpcí katecholů. Elektron tunneling přes inertní adsorbovanou vrstvu u katecholů nenastává [23]. Bylo vyzkoušeno mnoho dalších povrchových úprav jak u platinové elektrody, tak u elektrod uhlíkových, které měly zásadní vliv na voltametrii katecholů. Malými změnami povrchu docházelo k velkým změnám v elektrodové kinetice [1]. Například anodizací skleného uhlíku se snižuje Ep dopaminu a zvyšuje se jeho adsorpce [26]. Laserovou aktivací klesá Ep také, však bez povrchové oxidace [27]. Byly navrženy mnohé hypotézy vztahující se ke kinetice oxidace dopaminu na povrchu elektrody – iontový vliv povrchových oxidů, přenos protonů doprovázený přenosem elektronů [26], elektrokatalýza adsorpcí na povrchu elektrody atd. Na čisté platinové elektrodě probíhá ireversibilní adsorpce katecholů a hydrochinonů. Přes tuto vrstvu neprobíhá reversibilní přenos dvou elektronů odpovídající vytvoření chinonu. Na uhlíkových elektrodách zahrnuje oxidace katecholů na chinony přenos dvou elektronů a obvykle dvou protonů. Adsorbovaná vrstva může ovlivnit kterýkoli z těchto čtyř kroků přenosu [1].
12
2.2.2. Elektrochemická polymerace katecholů Pham a Lazac zkoušeli anodickou oxidaci fenolu a jeho derivátů na elektrodách z různých kovů (Fe, Cu, Pt, Ni) [28]. Našli vrstvu vytvořenou během oxidace, která pasivovala povrch elektrody. Byla to polymerní vrstva (tloušťka od 5 nm do 15 µm) dle nich bez elektrochemické aktivity, která významně chránila kov proti korozi. Většina polymerizací fenolů byla prováděna cyklizací potenciálu od -0,2 V do 2,0 V ve slabě bazických prostředích. Bylo zjištěno, že polymerace derivátů fenolu neprobíhá v případě, kdy je para pozice a jedna z ortho pozic vůči hydroxylové skupině obsazena. Znamená to, že polymerizace fenolů je převážně prováděna spojením hlava-ocas (jak je uvedeno na Obr. 5) [29].
Obr 5.: Způsob spojení katecholů při polymerizaci [29].
Polymery katecholu na uhlíkových materiálech jsou však elektroaktivní (použito jako materiál pro biosenzor a jako mediátor redoxní přeměny NAD+/NADH [30]). Na Obr. 4. jsou ukázány elektropolymerizační křivky katecholu. V prvním cyklu se objevující oxidační pík (Ep = −0,035 V) monomeru se s přibývajícími cykly zmenšuje. Oxidace je nevratná (chybí redukční pík během zpětného scanu). Však pasivace elektrody není úplná, neboť i při sedmém cyklu lze zaznamenat proudovou odezvu. To bylo potvrzeno i redoxní křivkou pro Fe(CN)36− /Fe(CN) 64 −
před
a
po
elektropolymerizaci.
Výrazné
snížení
odezvy
signalizovalo výskyt polymerního filmu, ale úplné zablokování povrchu elektrody bylo vyvráceno přítomností redoxní vlny [31].
Obr. 4.: Elektropolymerizace katecholu na GCE (c = 12,0 mmol/l v 0,1M NaOH), 7 cyklů, rychlost scanu 20 mV/s [31]. 13
Elektropolymerizací dopaminu lze vytvořit souvislou, hladkou vrstvu polydopaminu (PDA) na použitém podkladu. Tato metoda vykazuje vyšší rychlost depozice a je mnohem účinnější v porovnání se spontánní autopolymerizací dopaminu. Ta probíhá převážně v alkalickém prostředí (nejčastěji pH 8,5), rychlost depozice je velmi pomalá (v roztoku 2 mg/ml dopaminu je potřeba více jak 10 hodin k vytvoření vrstvy PDA o tloušťce 20 nm) a vede k vytvoření množství nano-/mikročásticových shluků v roztoku [32]. S tím je spojena změna zbarvení roztoku dopaminu. Při pH 8,5 při styku se vzduchem mění roztok velmi rychle zbarvení ze světle růžové na hnědou. Pravděpodobně je to způsobeno autopolymerizací DA za vytvoření PDA a dalších částic v roztoku a to nejen na rozhraní roztok-povrch elektrody. Tyto částice pak navazují další volné molekuly dopaminu a přispívají tak k menšímu pokrytí povrchu [33]. Zatímco při pH 7,4 pod atmosférou dusíku zůstává při elektropolymerizaci roztok bezbarvý. PDA je tvořen na rozhraní elektroda-roztok a žádné částice se nevyskytují v roztoku (vyšší účinnost pokrytí). To přispívá k efektivnějšímu využití dopaminu při modifikacích povrchu [32].
2.3.
Metody analýzy, použité techniky
2.3.1. Cyklická voltametrie Cyklická voltametrie (CV) je elektrochemická metoda umožňující lineárně měnit potenciál pracovní elektrody v daném rozmezí potenciálů konstantní rychlostí polarizace (mV/s). Potenciál je zvyšován od počátečního (initial) k tzv. přepínacímu potenciálu (vertex) a od této hodnoty je snižován ke konečnému potenciálu (final). Cyklické změny napětí vyvolají
změny
proudu,
které
jsou
zaznamenávány.
Následně
jsou
vynášeny
do tzv. voltamogramu (graf závislosti napětí na proudu). V případě jednoho cyklu se skládá ze dvou částí – dopředný a zpětný scan [34].
2.3.2. Rotující disková elektroda Rotující disková elektroda (RDE) v současnosti jedna z nejpoužívanějších tuhých pracovních elektrod. Je důležitá při studiu procesů, kde je závislost na transportu látek z roztoku. Základy teorie položil V.G. Levič roku 1942 [35]. RDE je stabilní geometrie a mechanicky robustní. Elektrochemicky aktivní disk je zabudován v izolačním obalu, který je upraven tak, aby bylo
14
možno elektrodu připojit k hřídeli motoru, který řídí rotaci. Pracovní elektroda tak rotuje a tento pohyb zajistí definovaný tok roztoku k disku elektrody. Tok je podobný víru, který unáší roztok s analyzovanou látkou k elektrodě [34]. Použitím této metody dostáváme voltametrické výsledky a z nich i charakterizaci elektrochemických dějů. Výsledný voltamogram má podobu sigmoidní vlny. Pro celkové pochopení dějů na RDE je velmi důležitá vrstva roztoku těsně u pracovního povrchu elektrody, pohybující se zároveň s elektrodou. Zde probíhá transport zkoumané látky difusí. Na tuto vrstvu dál navazuje hydrodynamická vrstva Prandtlova, kde se každá následující vrstva pohybuje pomaleji než vrstva předchozí až do určité vzdálenosti, kde je roztok již v klidu. Zvyšováním otáček elektrody lze snižovat tloušťku difusní vrstvy. Analyt je k elektrodě přiváděn dvěma druhy transportu: 1. molekuly analytu jsou vírem kolmým k elektrodě unášeny k vnějšímu okraji difusní vrstvy a 2. difundují k vlastnímu povrchu elektrody (Obr. 5). Z toho vyplývá, že čím větší je difusní vrstva, tím pomaleji analyt dosáhne povrchu elektrody, proto čím nižší otáčky RDE tím nižší hodnoty proudu jsou zaznamenávány. Lze zde dosáhnout od určitého potenciálu limitního proudu (proud určený pouze rychlostí transportu analytu k elektrodě) [36], [37].
Obr. 5: Schéma pohybu roztoku (laminární tok) a rozdělení vrstev u RDE (δ – tloušťka vrstvy) [37].
Historicky byla RDE používána k studiu kinetiky rychlých reakcí, zjišťování rychlostí přenosu elektronů k povrchu elektrody či ke studiu konvekce v mikrolitrových objemech [38]. Při těchto měřeních lze z charakteru závislosti proudu na RDE na odmocnině z rychlosti rotace určit mechanismus, který řídí velikost proudu. Na Obr. 6 jsou těmito ději konvektivní difuse (A), kinetika elektrodové reakce (B), smíšená kinetika (C) a kinetika chemické reakce v roztoku (D) [34].
15
Obr. 6.: Charaktery závislostí proudu na odmocnině z rychlosti rotace RDE při různých mechanismech řídících velikost proudu [34].
V současnosti je RDE používána v biologických aplikacích (enzymologie, neurochemie, neurofarmakologie neurotransmiterů atd.). Jedním z příkladů použití je v inkubačních komorách (obsahují pufr a nervová zakončení či další buňky). Rotace způsobuje rychlou konvekci obsahu komory a tak mohou být měřeny změny koncentrací analytů v těchto komorách v rámci desítek milisekund. Takto to může být použito i pro studium transportu biogenních katecholaminů (epinefrin, norepinefrin, dopamin atd.) [37], [38]. RDE jsou například používány ke studiu chemických interakcí mezi dopaminem a nízkomolekulárními látkami (např. neurotensin – antagonista neurobiologických funkcí dopaminu, syntetické drogy atd.) či k provedení rychlých časově rozličných měření uvolňování endogenního dopaminu z mozkové tkáně nucenou konvekcí u RDE, kdy je difuse využívána jako rychlost limitující krok detekce [39].
2.3.3. Elektrochemická impedanční spektroskopie Elektrochemická impedanční spektroskopie (EIS) je metoda vhodná pro studium objemových a mezifázových elektrických vlastností pevných nebo kapalných materiálů na elektrodovém podkladu,
především
ke
kvalitativnímu
popisu.
Poskytuje
komplexní
informace
o elektrochemických vlastnostech systému (faradaické i nefaradaické děje, mechanismus a kinetika elektrodového děje atd.) [40]. EIS má velké využití v technologii tenkých filmů, při kontrole koroze a ochraně před ní pomocí různých ošetření povrchů apod. [41]. Při
měření
EIS
je
na
pracovní
elektrodu
vkládán
konstantní
potenciál
se superponovaným střídavým napětím o určité stálé amplitudě a měnící se frekvenci, kdy se měří střídavá složka proudové odezvy v systému tříelektrodového zapojení. Jelikož je použito střídavé napětí, je odpor závislý na frekvenci a je označován jako impedance. Ta se vyjadřuje pomocí komplexních čísel (má dvě složky závislé na frekvenci – reálnou
16
a imaginární; výstupem je tzv. Nyquistův graf, kde je vynášena imaginární složka impedance proti reálné složce, Obr. 7) [42]. Frekvence jsou obvykle vkládány postupně (single-sine technika). To má výhody ty, že naměřená data jsou vysoké kvality a lze měřit při vyšších frekvencích, avšak je zde nevýhoda - velmi nízká rychlost měření při nízkých frekvencích [40]. Nyquistův graf 12 10 -Z´´/kΩ
8 6 4 2 0 -2 0
5
10
15
20
25
Z´/kΩ
Obr. 7.: Příklad Nyquistova grafu pro ekvivalentní obvod, záznam impedance (reálná složka impedance (Z´) vynesena proti imaginární složce (Z´´)).
Při interpretaci spektra se začíná hledáním tzv. ekvivalentního obvodu popisujícího chování systému, kdy jsou následně proměřená data proložena křivkou popsanou rovnicí, která odpovídá uvedenému obvodu. Ten se skládá ze sériových a paralelních kombinací prvků, kdy s některými z nich lze ztotožnit reálné prvky elektrochemické praxe. Jedná-li se o prvky reálné, pak to jsou rezistor (fyzikální interpretace je odpor roztoku, Rs nebo odpor k přenosu náboje, Rp), kondenzátor (kapacita elektrické dvojvrstvy, C) a cívka a pro elektrochemii specifický prvek je nejčastěji Warburgova impedance (W) [40]. Nejjednodušším modelem rozhraní elektroda-roztok je Randlesova cela, kde je využito paralelního zapojení kondenzátoru a odporu. Pokrytí povrchu elektrody vrstvou organického filmu může blokovat iontový a elektrický přenos mezi roztokem a elektrodou. Poruchy v tomto naneseném filmu mohou fungovat jako aktivní díry obklopené neaktivním okolím. V závislosti na velikosti těchto děr a vzdálenostech mezi nimi může každá díra fungovat jako samostatná ultramikroelektroda s vlastní difusí, která může obsahovat radiální příspěvky [41]. Pro použití v kvantitativní analýze se lze proto nejčastěji setkat se dvěma typy úpravy elektrod. První je provedena nanesením vodivého polymeru na podklad. Polymer může být použit jako nosič [43]
17
či jako citlivá vrstva [44]. V průběhu tohoto měření lze sledovat difusi analyzované látky do nebo z polymerní vrstvy na základě tvaru naměřených spekter. Druhou možností je pokrýt povrch elektrody nevodivou vrstvou a zabránit tak přístupu sondy (obvykle redoxně aktivní látka, nejčastěji směs Fe(CN)64 − /Fe(CN)36− ) k povrchu elektrody. Stanovení analytu je pak prováděno nepřímo na základě omezeného přístupu redoxní složky k povrchu elektrody [40]. Při studiu katecholu a jeho derivátů je EIS nejčastěji používána z hlediska zkoumání vlastností
povrchu
elektrod
jak
po
adsorpci
katecholů,
tak
především
po jejich elektrochemické polymerizaci, kdy dochází k modifikaci elektrod a změně jejich elektrochemických vlastností, čehož je využíváno v dalších analýzách [32].
2.3.4. Spojení elektrochemie s hmotnostní detekcí Přestože je spojení elektrochemie s hmotnostní spektrometrií (EC/MS) považováno za relativně nedávnou spojenou techniku, byla prvně popsána v literatuře před více jak 40 lety. Bruckenstein a Gadde v roce 1971 představili toto spojení při in situ detekci produktů elektrochemické oxidace. Použili porézní platinovou elektrodu v kontaktu s elektrolyzovaným roztokem a s vakuovým vstupem do hmotnostního spektrometru [45]. Takto zkoumali plynné produkty (např. kyslík) elektrochemické oxidace kyseliny chloristé (0,1 mol/l). S vývojem ionizace termosprejem (TSP) bylo možné detekovat netěkavé a polární látky v roztoku. Hambitzer a Heitbaum v r.1986 jako první studovali oxidační procesy (v jejich případě N,N−dimethylanilin) metodou online EC/TSP-MS. Pozorovali zde vznik dimerů a trimerů v závislosti na použitém oxidačním potenciálu [46]. Však vysoké rychlosti průtoku používané v TSP−MS (1-2 ml/min) měly nepříznivý vliv na účinnost konverze látek při elektrochemické oxidaci. To byl důvod mírného útlumu zájmu o tuto spojenou techniku. S vývojem elektrospreje jako ionizačního zdroje (ESI) došlo k oživení a to především z důvodu možnosti analýzy tepelně labilních, netěkavých a polárních látek. ESI je ionizační zdroj pracující za atmosférického tlaku, který pomocí elektrostatického rozprašovače převádí analyty přítomné v roztoku na plynou složku. První spojení EC/ESI-MS uvedl Van Berkel a kolektiv a to s ohledem na konstrukci cely a spojovacího zařízení vzhledem k vysokému napětí elektrospreje [47]. Ukázali, že přímé spojení EC a MS dovoluje elektrochemickou ionizaci neutrálních sloučenin, studium elektrodových reakcí a zakoncentrování stříbrných iontů a s tím související posílení signálu v ESI-MS s použitím anodické stripping voltametrie.
18
Následoval vzrůst počtu aplikací této spojené techniky a to především při studiu metabolismů a průběhů redoxních reakcí [48]. Je potřeba přímého spojení EC/MS a použití vhodné geometrie elektrochemické cely. Většina komerčních či v laboratořích vyrobených cel má jednu společnou nevýhodu – pracovní elektroda je těžko přístupná jak k očištění, tak k modifikaci jejího povrchu. Dobrá cela by měla dovolovat vyjmutí pracovní elektrody [49]. Nejčastějšími typy používaných cel jsou: A) tenkovrstevná průtoková cela (obvykle tříelektrodové zapojení s pracovní velkoplošnou elektrodou), B) tubulární průtoková cela a C) cela s porézní pracovní elektrodou (viz schéma Obr. 8) [50].
Obr. 8.: Schémata elektrochemických cel použitých v EC/MS (A - tenkovrstevná průtoková cela, B - tubulární průtoková cela, C - cela s porézní pracovní elektrodou) [50].
Použitím hmotnostní spektrometrie lze určit rychleji a přesněji molekulovou hmotnost reaktantů a produktů redoxních reakcí. Mohou být zjištěny izotopické informace, lze provést kvantifikaci a v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií lze získat strukturní informace o analytech a produktech [47]. Důležitým využitím je výzkum katalýzy a biologických redoxních dějů, studium průběhu reakcí, které jsou potřebné pro lepší pochopení ec procesů, které mohou být analyzovány online MS [51].
19
Průtoková cela s tištěnou elektrodou BVT Technologies, a.s.
Průtoková cela typ FC4, použitá v této práci, je vyrobena z materiálu PEEK (polyether ether keton) se zakončeními ze stejného materiálu, které poskytuje kompatibilní připojení jak k izokratické pumpě, tak k hmotnostnímu spektrometru. Cela umožňuje použití tištěných elektrod v flow-through uspořádání. Elektroda je vložena do cely, která je dotáhnuta šroubem. Je zde využito wall-jet proudění kolem pracovní elektrody, které je optimalizováno, aby nedocházelo ke vzniku bublinek. Cela má rozměry 4,2 x 2,4 x 1,6 cm, obsahuje výstupní kabel a kontakt [52]. Elektrodový poklad je keramicko-korundového základu. Na něj jsou natištěny pracovní, referentní a pomocná elektroda. Na konci elektrody je kontakt, který je spojen s aktivní částí stříbrnými vodivými obvody, které jsou kryty ochrannou vrstvou izolantu. Nejčastěji je zde používána jako referentní elektroda Ag/AgCl. Materiál pracovní elektrody může být různý (zlato, platina, stříbro, uhlík či slitina zlata a platiny). I povrch této elektrody je možné modifikovat biochemicky aktivní látkou a vytvořit tak biosenzor [53].
20
3.
Experimentální část
3.1.
Přístrojové vybavení
Všechna měření cyklických voltamogramů a elektrochemické impedanční spektroskopie byla prováděna na modulárním potenciostatu/galvanostatu Autolab PGSTAT128N (firma Metrohm Autolab B.V., Nizozemsko) v tříelektrodovém zapojení. Byly používány dva druhy pracovních elektrod: skelný uhlík (GCE) a platina (obě s průměrem disku 2 mm, Metrohm, Švýcarsko), a to jak v rotačním, tak statickém pracovním módu. Jako referentní byla použita nasycená kalomelová elektroda (SCE) a pomocnou elektrodou byl platinový plíšek. Přístroj byl ovládán elektrochemickým softwarem Autolab NOVA 1.10 (Metrohm Autolab B.V.). EC/MS systém byl sestaven z elektrochemické cely připojené na potenciostat a hmotnostního spektrometru. Byly použity tři typy cel: ESA 5021A Conditioning Cell (ESA Biosciences, Inc., Chelmsford, MA, USA) s pracovní elektrodou z porézního uhlíku a ESA 5040 Analytical Cell (od stejné firmy) s pracovní platinovou elektrodou. V obou celách byla referentní α-hydrogenpalladiová elektroda (Pd/H2). Třetím typem byla průtoková cela s tištěnou elektrodou (typ cely FC4.S), elektroda AC1.W4.RS – tištěná uhlíková pracovní elektroda s referentní Ag/AgCl, průměr 2mm, BVT Technologies, a.s. Brno, viz Obr. 9). Potenciostat Detector ADLC 1 (Laboratorní přístroje Praha) sloužil k udržování konstantního potenciálu mezi pracovní a referentní elektrodou v průtokových celách značky ESA. Pro práci s celou s tištěnou elektrodou k tomuto byla používána elektrochemická pracovní stanice (L−Chem, Olomouc, viz Obr. 10), která byla řízena multifunkční kartou National Instruments PCI-6251E se softwarovým vybavením v programovacím jazyce LabViewTM.. Hmotnostní spektrometr Agilent 1100 Series LC/MSD Trap (Agilent Technologies, Inc., USA) s elektrosprejem (ESI) jako iontovým zdrojem byl ovládán programem MSD Trap Control. Hmotnostní spektra byla zobrazena a zpracována v programu Data Analysis 3.3 (Bruker Daltonik, Brémy, Německo). Struktury a schémata oxidací byly vytvořeny v programu ADC/ChemSketch 12 (Advanced Chemistry Development, Inc., (ACD/Labs), Toronto, Kanada). Vzorky byly do systému dávkovány skleněnou mikrostříkačkou Hamilton (250 µl) pumpou NE-1002X (New Era Pump Systems, Inc., USA).. Všechny použité kapiláry, ferule, spojky a těsnění byly vyrobeny z polymerního materiálu PEEK.
21
Obr. 9: Systém EC/MS (průtoková cela s tištěnou elektrodou): 1 – izokratická pumpa, 2 – cela (detail Obr. 10), 3 – elektrochemická pracovní stanice, 4 – hmotnostní spektrometr.
Obr. 10: Průtoková cela (2) s tištěnou velkoplošnou elektrodou (5) od firmy BVT Technologies, a.s. Brno.
3.2.
Chemikálie
Standardy dopaminu hydrochloridu (DA), 3-methoxytyraminu hydrochloridu (3-MT), 1,2−dihydroxybenzenu a guajakolu byly pořízeny od firmy Sigma-Aldrich. Všechny (vyjma 1,2−dihydroxybenzenu) byly skladovány v temnu při teplotě 4 ˚C; dopamin a 3−methoxytyramin v atmosféře dusíku. Další použité chemikálie: N-acetyl-L-cystein (Sigma-Aldrich); octan amonný (p.a., Lachema, a.s.); amoniak (vodný roztok 25-29% p.a., Penta); kyselina sírová (96% p.a., Penta), kyselina octová (99% p.a., Lach-Ner, s.r.o.), methanol (HiPerSolv, VWR Chemicals
22
Prolabo), 2-propanol (CHROMASOLV, Merck), voda (CHROMASOLV® Plus, pro HPLC, Merck), hexakyanoželezitan draselný (p.a., Lachema Brno), hexakyanoželeznatan draselný trihydrát (p.a., Lachema Brno), chlorid draselný (p.a., Lachema Brno).
3.3.
Voltametrická měření
V programu NOVA 1.10 byla zvolena jako pracovní metoda cyklická voltametrie a byly nastaveny parametry měření: polarizační potenciál v rozsahu - 0,1 až 1,0 V, skenovací rychlost 5 mV/s, „step potential“ 1 mV. Pracovalo se v tříelektrodovém zapojení, pracovní elektrody byly dvou typů: skelný uhlík a platinová elektroda; referentní byla elektroda nasycená kalomelová (SCE) a pomocná platinový plíšek. Základním elektrolytem byl octanový pufr připravený z roztoku octanu amonného (20 mmol/l), jehož pH bylo upraveno vodným roztokem amoniaku na dvě rozdílná pH: pH = 7,0; pH = 10,0. Před měřením byla potřeba pracovní elektrodu očistit. V případě skelného uhlíku se postupovalo následovně: elektroda byla opláchnuta destilovanou vodou a vyleštěna pomocí aluminy (suspenze Al2O3, 50 nm, Sigma-Aldrich) na lešticí textilii (Buehler, USA). Následně byla elektroda 1 minutu sonifikována v destilované vodě a poté opláchnuta destilovanou vodou. Po mechanickém čištění byla elektroda zapojena do systému a čištěna elektrochemicky cyklickou polarizací v používaném čistém pufru, aby se docílilo reprodukovatelného voltamogramu základního elektrolytu. K tomu obvykle stačilo 10 cyklů v potenciálovém rozsahu -0,2 až 1,2 V. V případě platiny jsem jako nejvhodnější postup očištění zvolil opláchnutí destilovanou vodou a následnou elektrochemickou aktivaci v 0,5M H2SO4 (20 cyklů v rozsahu -0,2 až 1,2 V) a následný oplach destilovanou vodou. Byla prováděna měření cyklických voltamogramů i na rotačních diskových elektrodách (skelný uhlík a platina). Zde byla zaznamenávána závislost hodnoty limitního proudu (Ilim) na odmocnině rychlosti rotace elektrody. Byly voleny rychlosti v rozsahu 52,2 rad/s až 314,2 rad/s. Všechny ostatní parametry byly shodné s parametry pro měření na statické pracovní elektrodě. Pro voltametrická měření byly vzorky studovaných látek připraveny zředěním zásobního roztoku standardu (c = 1 · 10-2 mol/l) roztokem pufru a rozpouštědlem (voda nebo methanol) na výslednou koncentraci 1 · 10-4 mol/l v celkovém objemu 10 ml. Koncentrace základního elektrolytu v roztocích vzorků byla 20 mmol/l. Před prvním měřením byl připravený roztok probublán inertním plynem (dusík) po dobu 5 minut k odstranění vzdušného kyslíku z roztoku. Všechna měření byla prováděna a zaznamenávána dvakrát.
23
3.4.
Elektrochemická impedanční spektroskopie
Elektrochemická impedanční spektra byla měřena v roztoku
[Fe(CN ) 6 ]−2 /[Fe(CN ) 6 ]−3
ekvimolární směsi
(c = 5 mmol/l) v 0,1M KCl. Adsorpce zkoumaných látek
na elektrodový povrch byla prováděna z roztoků o c = 1 · 10-4 mol/l v octanovém pufru (20 mmol/l). Měření bylo prováděno v tříelektrodovém zapojení (pracovní elektroda skelný uhlík či platina; refentní SCE a pomocná Pt elektroda). Po načtení metody FRA impedance potentiostatic v programu NOVA 1.10 jsem navolil tyto parametry: stejnosměrný konstantní potenciál 0,2 V, frekvence 5000 až 0,1 Hz, počet frekvencí 50, amplituda 0,01 V, integrační čas 0,125 s, technika single sine. Při měření impedance naadsorbované látky na povrchu elektrody se postupovalo následovně: dobře očištěná elektroda (viz čištění elektrody pro voltametrická měření) se na 1 minutu umístila do roztoku zkoumané látky. Poté byla vyjmuta, opláchnuta destilovanou vodou a osušena. Následně probíhalo měření impedance v roztoku ferrikyanidu/ferrokyanidu. Při měření impedance po elektrochemické reakci dopaminu (impedance oxidačního produktu) bylo postupováno takto: očištěná pracovní elektroda byla umístěna do roztoku dopaminu v octanovém pufru, kde byl proveden daný počet měření cyklických voltamogramů (1, 5 nebo 10 cyklů). Poté byla elektroda vyjmuta, opláchnuta a osušena. Umístěna do roztoku ferrikyanidu/ferrokyanidu, kde proběhlo měření impedanční spektroskopie. Naměřená data byla v softwaru NOVA zpracována tak, že experimentální data byla proložena křivkou odpovídající zvolenému modelu pro Randlesovu celu. Ekvivalentní obvod pro tento model je na Obr. 11. Následně program iterační metodou vypočetl hodnoty jednotlivých prvků v obvodu. Data byla poté zaznamenávána a vyhodnocována z tzv. Nyquistova grafu (Obr. 7).
Obr. 11: Schéma ekvivalentního obvodu (Randlesova cela) pro vyhodnocení experimentálních měření elektrochemické impedanční spektroskopie (C – kapacita elektrické dvojvrstvy, Rp – odpor proti přenosu náboje, Rs – odpor roztoku, W – Warburgova impedance (odpor způsobený difuzí v roztoku)).
24
3.5.
Měření EC/MS
Při měřeních bylo na elektrochemických celách nastavováno napětí potenciostatem v rozsahu od -0,2 V do 0,7 V. Pomocí softwaru MSD Trap Control byly voleny vhodné podmínky pro ionizaci v elektrospreji (napětí na sprejovací kapiláře, teplota). Jako sušicí a zmlžovací plyn byl použit dusík. Kolizním plynem v hmotnostním analyzátoru bylo hélium.. Vzorek byl připravován v celkovém objemu 4 ml (50 % methanolu; 50 % vodné fáze) do šroubovací vialky. Koncentrace látky v nástřiku byla 2·10-5 mol/l; koncentrace pufru (octan amonný) 20 mmol/l. Byla používána voda CHROMASOLV® Plus, pro HPLC. Všechna měření byla prováděna a zaznamenávána 2x.
25
4.
Výsledky a diskuse
4.1.
Cyklická voltametrie
4.1.1. Dopamin
Obr. 12: CV dopaminu v roztoku octanu amonného (cDA = 1·10−4 mol/l, pH = 7; -0,1 V až 1,0 V; 5mV/s) na skelném uhlíku (A) a na platině (B). Cyklické voltamogramy dopaminu změřené na elektrodách ze skelného uhlíku a platiny ukazují obr. Na GCE byl patrný první oxidační pík při 0,3 V a nepatrný náznak druhého píku oxidace při 0,9 V. Tento pík je malý z důvodu nízké rychlosti scanu (5 mV/s). Tyto píky potvrzují dvoustupňovou oxidaci dopaminu v neutrálním prostředí. Byl zaznamenán i katodický pík oxidačního produktu při 0,1 V. Na platinové elektrodě je potenciál oxidačního píku dopaminu posunut o 400 mV pozitivněji (Ep = 0,7 V) oproti píku na GCE. Tvar píku také prozrazuje větší ireversibilitu elektrodové reakce na Pt proti GCE. Je zde dále i náznak katodického píku při 0,15 V.
26
Obr. 13: Cyklické voltamogramy dopaminu v roztoku octanu amonného (pH = 7) na rotační diskové elektrodě ze skelného uhlíku (A) a na RDE z platiny (B) při rychlostech v rozmezí 52,2 rad/s až 314,2 rad/s. Mezi jednotlivými měřeními bez čištění elektrody. Na voltamogramech RDE ze skelného uhlíku je s klesající rychlostí rotace elektrody viditelný posun půlvlnových potenciálů (E1/2) k vyšším hodnotám (od 0,2 V k 0,4 V). Předpokládám, že je tak z důvodu ztíženého přenosu náboje k povrchu pracovní elektrody, který je deaktivován adsorpcí oxidačních produktů (pasivací). O pasivaci elektrody vypovídá hystereze křivky cyklického voltamogramu, patrná zejména v prvním cyklu (rychlost rotace 314 rad/s). Na záznamu CV z rotační diskové elektrody z platiny není viditelná hystereze voltamogramů, křivky mají sigmoidní tvar typický pro rotační elektrodu. Oxidační produkty reakce tu zjevně nepasivují povrch elektrody (nejsou na RDE adsorbovány). 50 45 40 35 30 I lim/µA 25 20 15 10 5 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
√v
Obr. 14: Závislost hodnoty limitního proudu na odmocnině z rychlosti rotace rotační diskové elektrody ze skelného uhlíku při měření dopaminu.
27
20
60 50 40 I lim/µA 30 20 10 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
√v
Obr. 15: Závislost hodnoty limitního proudu na odmocnině z rychlosti rotace rotační diskové elektrody z platiny při měření dopaminu. Z jednotlivých záznamů závislostí hodnoty limitního proudu na odmocnině z rychlosti rotace elektrody (Obr. 14 a 15) jsou vidět mírná zakřivení spojnice bodů. Toto zakřivení způsobuje měnící se kinetika chemické reakce v roztoku. Při pomalých rychlostech rotace děj není řízen difusí (lineární závislost), ale rychlostí homogenní chemické reakce, která následuj přenos prvního elektronu. Obdobný tvar mají tyto závislosti i pro ostatní analyzované látky, proto u těchto látek nejsou uváděny.
28
20
4.1.2. 3-methoxytyramin
Obr. 16: CV 3-methoxytyraminu v roztoku octanu amonného (c3-MT = 1·10-4 mol/l; pH = 7) na GCE (A) a Pt (B). Parametry: -0,1 až 1,0 V, 5mV/s.
Voltamogramy (Obr. 16) prokazují oxidaci 3-methoxytyraminu na elektrodě ze skelného uhlíku i platiny. Je zde viditelný posun oxidačního píku analytu z 0,45 V (GCE) k 0,65 V (Pt). U GCE je možno vidět katodický pík produktu oxidace 0,1 V, u Pt je tento pík posunut k hodnotě 0,2 V. 1400 1200 1000 800 600 I/nA 400 200 0 -200 -400 -600 -0,2
3-methoxytyramin
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
E/V vs SCE
Obr. 17: Opakovaná CV 3-methoxytyraminu v octanovém pufru (10 cyklů, c3-MT = 1·10-4 mol/l) na skelném uhlíku. CV: -0,1 až 1,0 V, 100 mV/s. Při opakování cyklických voltamogramů (10 cyklů) je viditelný mírný posun potenciálu píku oxidace k vyšším hodnotám, jeho výrazný pokles v důsledku pasivace povrchu GCE. Současně je vidět nárůst redukčního píku oxidačního produktu při 0,1 V a
29
jemu příslušejícího oxidačního píku při 0,35 V. Odtud plyne, že oxidací 3-MT vzniká elektrochemicky aktivní produkt, který se snadněji oxiduje než samotný 3-MT a zároveň pasivuje elektrodový povrch.
Obr. 18: Cyklické voltamogramy 3-methoxytyraminu v roztoku octanu amonného (pH = 7) na rotační elektrodě ze skelného uhlíku (A) a vpravo na RDE z platiny (B) při rychlostech v rozmezí 52,2 rad/s až 314,2 rad/s. Mezi jednotlivými voltamogramy neprobíhalo čištění.
Také ze záznamu RDE ze skelného uhlíku je vidět, že jeho povrch je více pasivován. Při všech rychlostech rotace byla viditelná hystereze křivek. Na záznamu z platinové elektrody je pozorovatelná
větší
adsorpce
(zřejmá
z hystereze
křivek)
produktu
oxidace
3-
methoxytyraminu, který se projevuje katodickou vlnou při 0,1 V. Při vyšších rychlostech je zde též viditelná oxidační vlna 3-MT při 0,7 V.
Jelikož je na grafech závislostí hodnoty limitního proudu na odmocnině z rychlosti rotace elektrody vidět obdobné zakřivení jako na grafech pro dopamin (děj je ovlivněn kinetikou chemické reakce), grafy jsem zde neuvedl.
30
4.1.3. Katechol
Obr. 19: CV katecholu v roztoku octanu amonného (cCAT = 1·10-4 mol/l; pH = 7, rychlost scanu 5mV/s) na GCE pracovní elektrodě (A) a Pt pracovní elektrodě (B).
Cyklické voltamogramy (Obr. 19) prokazují oxidaci katecholu na pracovní elektrodě ze skelného uhlíku i platiny. Na záznamu z GCE je viditelná kvazireversibilita děje. Nachází se zde oxidační pík při 0,3 V a katodický pík 0,1 V. Při použití platinové elektrody je potenciál oxidačního píku posunut k 0,65 V. Je pozorovatelný i katodický pík při 0,1V. Děj se však chová méně reverzibilně než na skelném uhlíku (tvar píku je mnohem plošší a rozdíl v potenciálech anodického píku a jeho katodického protějšku je mnohem větší v porovnání s GCE).
Obr. 20: Cyklické voltamogramy katecholu v roztoku octanu amonného (pH 7) na rotační elektrodě ze skelného uhlíku (A) a platiny (B) při rychlostech v rozmezí 52,2 rad/s až 314,2 rad/s. Mezi jednotlivými voltamogramy bez čištění. 31
Na záznamech CV katecholu na RDE ze skleného uhlíku i platiny je možno na strmé části vlny pozorovat 2 různé směrnice odpovídající různým rychlostem přenosu elektronů (dvouelektronová oxidace látky). Na rozdíl od GCE, kde je směrnice první části vlny strmější, a tedy přenos prvního elektronu rychlejší, na Pt jsou sklony obou částí vlny obrácené, z čehož lze soudit, že v tomto případě je rychlejší přenos druhého elektronu. Na všech křivkách je též viditelná hystereze v důsledku pasivace oxidačním produktem. Graf závislosti limitního proudu (I lim) na odmocnině z rychlosti rotace elektrody (√v) je velmi podobný grafu této závislosti u dopaminu. I zde je děj ovlivněn kinetikou chemické reakce.
4.1.4. Guajakol
Obr. 21: CV guajakolu v roztoku octanu amonného (cGUA = 1·10-4 mol/l; pH = 7, rychlost scanu 5 mV/s) na skelném uhlíku (A) a na platině (B).
Na cyklických voltamogramech měřených s GCE (Obr. 21) lze pozorovat kvazireversibilní oxidaci guajakolu. Je zde oxidační pík s potenciálem 0,55 V a redukční pík oxidačního produktu při 0,1 V. Na Pt elektrodě je má oxidační pík vyšší potenciál (0,65 V) a katodický pík je při 0,15 V.
32
Obr. 22: Cyklické voltamogramy guajakolu v roztoku octanu amonného (pH = 7) na rotační elektrodě ze skelného uhlíku (A) a z platiny (B) při rychlostech rotace v rozmezí 52,2 rad/s až 314,2 rad/s. Mezi jednotlivými voltamogramy bez čištění.
Ze záznamu cyklické voltametrie na rotační diskové elektrodě ze skelného uhlíku je viditelná pasivace povrchu elektrody. Jsou zde opět znatelné dvě směrnice odpovídající různým rychlostem přenosu elektronů. Větší směrnice ukazuje rychlejší přenos prvního e- je než přenos druhého. Na GCE i platinové RDE je znatelná hystereze způsobená změnou kvality povrchu v důsledku adsorpce produktů elektrochemické reakce. Zejména je tento jev výrazný u Pt elektrody, kde pozorované překřížení anodické větve katodickou vypovídá o kvalitativně jiné vrstvě na elektrodě, na níž dochází k přenosu náboje [54]. Na grafech závislostí hodnoty limitního proudu na odmocnině z rychlosti rotace elektrody bylo opět viditelné zakřivení jako na grafech závislosti pro dopamin (děj je řízen kinetikou chemické reakce).
4.2.
Studium adsorpce dopaminu na povrchu voltametrických elektrod
Voltametrická měření byla provedena za stejných podmínek a parametrů, jak je popsáno v kapitole 3.3. Koncentrace dopaminu v měřeném roztoku byla 1·10-4 mol/l. Rozdíly oproti měření na rotační diskové elektrodě byly následující: lišil se způsob aktivace platinové elektrody; složení roztoku látky, kde probíhala adsorpce či složení roztoku, kde probíhalo měření (vodné či ethanolické prostředí). Čištění elektrody ze skleného uhlíku probíhalo vždy stejným způsobem: očištění na alumině, opláchnutí destilovanou vodou, sonifikace jednu minutu v destilované vodě, osušení, CV v roztoku základního elektrolytu (octanový pufr).
33
4.2.1. Skelný uhlík 3,5 3,0 2,5
dopamin, 1. cyklus dopamin, 2. cyklus
2,0 I/µA 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
E/V vs SCE
Obr. 23: Dva opakované cyklické voltamogramy dopaminu v roztoku octanu amnoného (pH 7) na rotační elektrodě ze skelného uhlíku při rychlosti rotace 314,2 rad/s, rychlost scanu 5 mV/s. Elektroda byla před prvním měřením řádně očištěna obvyklým postupem a následně vložena do roztoku dopaminu, kde probíhalo měření (CV: -0,1 – 1,0 V; 0,005 V/s). Na voltamogramu je vidět, že odezva byla při druhém měření oproti předešlému minimální. Usuzuji, že je tak z důvodu pasivace elektrody způsobené naadsorbováním oxidačního produktu na její povrch. Jako modelový voltamogram jsem zde uvedl měření dopaminu na elektrodě ze skelného uhlíku při rychlosti rotace rotační diskové elektrody 314,2 rad/s. Obdobně se chovaly všechny měřené látky, a to i při ostatních rychlostech v rozsahu do 52,2 rad/s. 0,10 0,05 0,00 I/µA -0,05 dopamin -0,10 -0,15 -0,2
kyselina sírová
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
E/V vs SCE
Obr. 24: Cyklický voltamogram dopaminu naadsorbovaného na GCE v měřícím roztoku obsahujícím pouze kyselinu sírovou (0,5 mol/l), (-0,1 Važ 1,0 V; 5 mV/s). 34
Byla testována adsorpce samotného dopaminu na GCE z jeho roztoku v octanu amonném (pH = 7) po dobu 5 minut. Následovalo opláchnutí ethanolem, osušení a měření cyklického voltamogramu v kyselině sírové (Obr. 24). Jelikož měření probíhalo v roztoku, kde nebyla aktivní látka, předpokládám, že se samotný dopamin naadsorboval na povrch pracovní elektrody a tak elektrodu modifikoval. Při CV se naadsorbovaná vrstva dopaminu oxiduje (0,55 V) a objevuje se i katodický pík 0,5 V (Obr. 24). Oproti měření ve vodném roztoku octanu amonného došlo k posunu potenciálů píků k vyšším hodnotám. 0,10 0,05 0,00
I/µA -0,05 dopamin -0,10 -0,15 -0,2
kyselina sírová
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
E/V vs SCE
Obr. 25: Cyklický voltamogram dopaminu naadsorbovaného na GCE v měřícím roztoku
obsahujícím pouze kyselinu sírovou (c = 0,5 mol/l) po sonifikaci v ethanolu, (-0,1 Važ 1,0 V; 5 mV/s). Po adsorpci samotného dopaminu (5 minut) na GCE z jeho roztoku v octanu amonném (pH = 7) následovalo opláchnutí ethanolem, sonifikace v ethanolu po dobu tří minut, osušení a měření cyklického voltamogramu v kyselině sírové (Obr. 25). Na CV je náznak oxidace naadsorbované vrstvy dopaminu (0,55 V) a to i po sonifikaci v ethanolu (Obr. 25).
Adsorpce dopaminu na GCE je tak silná, že je možné zaznamenat odezvu oxidace naadsorbované vrstvy po sonifikaci ve vodě, v ethanolu, dokonce i po vyleštění na alumině. Potenciály „píků“ této vrstvy dopaminu se nemění, jsou stejné jako při měření v kyselině sírové (0,55 V).
35
4.2.2. Platina 2,5 2,0 1,5
dopamin ethanol
1,0 0,5
I/µA 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 -2,0 -2,5 -0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
E/V v s SCE
Obr. 26: Cyklický voltamogram dopaminu (c = 10-4 mol/l…) v ethanolu (-0,1 V až 1,0 V; 0,005V/s), po aktivaci povrchu Pt elektrody v 0,1M-H2SO4 byla použita desorpce vodíku při 0,4 V po dobu 3 minuty.
2,0 1,5 1,0
dopamin ethanol
0,5 0,0 I/µA -0,5 -1,0 -1,5 -2,0 -2,5 -0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
E/V vs SCE
Obr. 27: Cyklický voltamogram dopaminu v ethanolu (c = 1·10-4 mol/l) (-0,1 V– 1,0 V; 0,005V/s) bez desorpce vodíku. Oxidace dopaminu na Pt elektrodě byla provedena následujícím způsobem: po aktivaci pracovní elektrody z platiny (20 potenciálových cyklů v kyselině sírové, vložení konstantního potenciálu 0,4 V na dobu 3 minut pro desorpci vodíku), Obr.), byla elektroda opláchnuta ethanolem, byl zaznamenán cyklický voltamogram v ethanolu a po opláchnutí ethanolem byl následně změřen roztok dopaminu v ethanolu. Na voltamogramu (Obr. 26) je viditelný oxidační pík 0,7 V. Oxidační produkt se však na povrchu elektrody neadsorbuje, tudíž není zaznamenán žádný katodický pík. Oproti tomu
36
při měření bez desorpce vodíku (Obr. 27) je odezva oxidačního píku menší a posunuta k potenciálu 0,75 V a je zde i redukční pík oxidačního produktu při 0,3 V.
2,0 1,0 0,0
dopamin
I/µA -1,0 -2,0 -3,0 -4,0 -0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
E/V vs SCE
Obr. 28: Cyklický voltamogram dopaminu v měřícím roztoku – ethanol (-0,1 V až 1,0V; 0,005V/s). Po aktivaci Pt elektrody (20 potenciálových cyklů v kyselině sírové, vložení konstantního potenciálu 0,4 V na dobu 3 minut) byla následně provedena adsorpce dopaminu v roztoku octanu amonného po dobu 5minut. Poté opláchnutí ethanolem, sonifikace v ethanolu 3 minuty, opláchnutí ethanolem a měření cyklického voltamogramu v ethanolu. Na cyklickém voltamogramu (Obr. 28) nebyla zaznamenána žádná odezva naadsorbovaného dopaminu. Z uvedených výsledků je patrné, že se dopamin adsorbuje mnohem silněji na elektrodu ze skelného uhlíku (Obr. 24, 25) než na elektrodu platinovou (Obr. 28).
4.3.
Elektrochemická impedanční spektroskopie
Pro záznam elektrochemických impedančních spekter (EIS) byla použita potenciostatická metoda měření s elektroaktivní sondou, kterou byl redoxní systém Fe(CN)6]-2/[Fe(CN)6]-3. Nejprve jsem zaznamenal cyklický voltamogram v připraveném měřícím roztoku 5mM Fe(CN)6]-2/[Fe(CN)6]-3 v 0,1M KCl k zjištění hodnoty potenciálu, který byl poté nastaven pro měření EI spekter. Z voltamogramu byla odečtena jako vhodná pro další měření hodnota potenciálu 0,2 V (potenciál v polovině strmé části křivky, kdy se systém chová lineárně, Obr. 29).
37
I/µA
4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -0,2
ferrikyanid/ferrokyanid
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
E/V vs SCE
Obr. 29: CV v roztoku 5mM Fe(CN)6]-2/[Fe(CN)6]-3 obsahujícím 0,1M KCl. Podmínky: GCE, -0,1 až 1,0 V; 0,1 V/s; step potential 0,001 V).
Naměřená data byla vyhodnocena z Randlesova ekvivalentního obvodu (Obr. 11) a proložena regresní křivkou, z níž byly získány odhady parametrů jednotlivých prvků v náhradním obvodu. Ty jsou uvedeny v tabulce 2 . Pro interpretaci výsledků elektrochemické impedanční spektroskopie jsem vytvořil dále uvedené hypotézy. Je však nutné pro jejich ověření v budoucnu provést další měření.
Tabulka 2: Hodnoty parametrů v Randlesově ekvivalentním obvodu z měření elektrochemické impedanční spektroskopie po adsorpci analytů na povrch pracovní elektrody.
Dopamin
3-methoxytyramin
t/min GCE 0 1 Pt 0 1 GCE 0 1 Pt 0 1
Rs/Ω
Rp/kΩ
C/nF
W/µMho
201 208
3,57 5,23
298 290
243 214
190 191
3,5 2,36
940 856
138 162
221 226
8,1 13,1
321 292
131 103
195 195
7,84 7,66
1202 1050
69,9 82,2
38
Katechol
Guajakol
t/min GCE 0 1 Pt 0 1 GCE 0 1 Pt 0 1
Rs/Ω
Rp/kΩ
C/nF
W/µMho
199 202
15,2 18,8
204 145
248 251
193 197
40,3 25,8
661 606
54,3 65,1
233 228
5,28 7,19
223 216
231 211
197 198
11,4 8,99
840 691
107 113
Po adsorpci jednotlivých látek na pracovní elektrodu (Pt, GCE) lze sledovat trendy jednotlivých prvků obvodu. Pro všechna měření se hodnota odporu roztoku (Rs) pohybuje kolem konstantní hodnoty (Rs (GCE) = 215 Ω, Rs (Pt) = 195 Ω, měření v roztoku o stále stejném složení a koncentraci). Odpor proti přenosu náboje (Rp) se při měřeních na GCE zvyšuje. Přisuzuji to tomu, že adsorbovaná látka pasivuje povrch skleného uhlíku a snižuje tak jeho vodivost. Při měřeních na platinové elektrodě Rp klesá. Předpokládám, že naadsorbovaná látka vytváří na platinové elektrodě vrstvu, která je oproti čistému povrchu vodivější. Kapacita (C) klesá po adsorpci látky jak na GCE, tak na Pt. Myslím si, že tak je z důvodu změny tloušťky vrstvy mezifází (difusní vrstvy) naadsorbováním aktivní látky na povrch elektrody.
EIS po elektrochemické oxidaci dopaminu:
Tabulka 3: Iterační metodou vypočtené hodnoty prvků v ekvivalentním obvodu po elektrochemické oxidaci dopaminu. počet CV GCE 0 1 5 10 Pt 0 1 5 10
Rs/Ω
Rp/kΩ
CPE/nF
W/µMho
222,71 224,04 211,41 213,66
8,58 20,83 14,2 10,4
230 272 379 392
155 58,4 74,6 96,8
190,43 197,79 193,23 190,38
3,5 10,53 6,87 4,1
940 981 1050 1060
138 124 147 179
39
Při měření impedanční spektroskopie po elektrochemické oxidaci dopaminu lze u prvků obvodu sledovat následující chování. Odpor roztoku (Rs) považuji při jednotlivých měřeních za konstantní (jeho hodnoty se pro daný typ elektrody téměř nemění). Rp (odpor proti přenosu náboje) u GCE i Pt klesá. Myslím si, že vrstva oxidačního produktu mění vlastnosti povrchu elektrody (zvyšuje vodivost). Čím více potenciálových cyklů je na elektrodu v roztoku dopaminu vloženo, tím menší je odpor povrchu a tím je elektroda vodivější. Kapacita elektrické dvojvrstvy (C) má u obou druhů elektrod vzrůstající charakter. Vysvětluji si to tím, že se vzrůstajícím počtem cyklických voltamogramů dochází k uspořádání vrstvy oxidačního produktu na povrchu elektrody. Povrchová vrstva se zřejmě stává tenčí, kompaktnější a tím roste kapacita povrchu. Je nutné opětně připomenout, že pro ověření těchto hypotéz je zapotřebí dalšího výzkumu a měření.
4.4.
EC/MS
Pro navolení vhodných podmínek MS analýzy (parametrů ESI a rychlosti zavádění vzorku) byl jako modelový vzorek používán roztok dopaminu. Po změně příslušného parametru bylo vyčkáno ustálení odezvy hmotnostního analyzátoru (doba čekání přibližně 3 minuty) a byla zaznamenána hodnota intenzity izolovaného molekulárního iontu dopaminu m/z = 154 a iontu jeho oxidačního produktu m/z = 150. Jako nejvhodnější byla zvolena ta hodnota parametru, při které byla intenzita těchto iontů největší. Hledání vhodných podmínek bylo učiněno pro oba typy průtokových cel (s uhlíkovou i platinovou pracovní elektrodou), kdy však výsledky vycházely podobně, tudíž jsou zde uvedeny jen pro celu s porézním uhlíkem jako pracovní elektrodou. Celkově tyto podmínky vyhovovaly i pro MS analýzu 3-MT a jeho oxidačního produktu. Všechna měření byla provedena v roztocích o pH 7 a pH 10. Mezi výsledky z těchto měření nebyly rozdíly, proto jsou zde uvedeny vždy pouze jedny z nich.
4.4.1. Vliv napětí na kapiláře Bylo postupně voleno ionizační napětí na kapiláře v elektrospreji v kladném módu (ESI+) v rozsahu od -1,2 kV do -2,7 kV. Po ustálení napětí byly izolovány molekulární ionty [M+H+] dopaminu s m/z = 154 a jeho oxidačního produktu s m/z = 150 a zaznamenána jejich odezva. Intenzita těchto iontů (I/counts) byla vynášena proti napětí na kapiláře (Obr. 30 a 31).
40
Největší intenzitu měl ion m/z = 154 při napětí -2,5 kV. Ion m/z = 150 dával největší odezvu při potenciálu -2,7 kV, ale s přihlédnutím k výsledkům pro ion m/z = 154 jsme jako dostačující zvolili pro další měření hodnotu -2,5 kV. 40 35 30 25 I·10^5 20 15 10 5 0 0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
- U/kV
Obr. 30: Závislost intenzity iontu m/z = 154 na napětí na kapiláře v iontovém. 30 25 20 I·10^5 15 10 5 0 0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
- U/kV
Obr. 31: Závislost intenzity iontu m/z = 150 na napětí na kapiláře v iontovém zdroji.
Bylo zjištěno, že přímo v iontovém zdroji při vysokých hodnotách napětí na kapiláře dochází k oxidaci dopaminu (Tab. 4). Maximální použitelné napětí je 2,5 kV, při vyšším napětí dochází k oxidaci a vzniku iontu m/z 150, který se stává dominantním. Tabulka 4: Intenzita iontů m/z = 154 a m/z = 150 při různých hodnotách napětí na kapiláře iontového zdroje. (-2,0)kV (-4,5)kV
I(154)/cnt I(150)/cnt 1941618 1040448 1155944 2873566
41
4.4.2. Vliv teploty sušícího plynu Dále byla postupně měněna teplota sušícího plynu (dusíku) a to v rozsahu 60 – 270 ˚C. Byla opětně zaznamenávána intenzita iontů m/z = 154 a m/z = 150, která byla dále vyhodnocena (Obr. 32 a 33).
4,0 3,0 I·10^6 2,0 1,0 0,0 0
50
100
150
200
250
300
250
300
t˚C
Obr. 32: Graf závislosti intenzity iontu m/z = 154 na teplotě sušícího plynu.
4,0 3,0 I·10^6 2,0 1,0 0,0 0
50
100
150
200
t/˚C
Obr. 33: Závislost intenzity iontu m/z = 150 na teplotě sušícího plynu.
Z grafů je viditelné, že nejvhodnější teplota plynu byla 240 ˚C, neboť intenzity obou iontů při této teplotě dosahovaly nejvyšší hodnoty. Dále byla proto používána tato teplota jako výchozí.
42
4.4.3. Vliv rychlosti průtoku Dalším parametrem, který byl optimalizován, byla rychlost přímé infúze vzorku, která byla měněna v rozsahu 4 až 12 µl/min. Po ustálení toku byly zaznamenány intenzity hmot m/z = 154 a m/z = 150, se kterými se dále pracovalo.
Obr. 34: Závislost intenzity m/z 154 na změně průtokové rychlosti (v).
Obr. 35: Závislost intenzity (m/z = 150) na změně průtokové rychlosti v.
Z grafů (Obr. 34 a 35) je možno vidět vzrůstající intenzitu MS píku s rostoucí rychlostí infúze vzorku. Z tohoto důvodu byla jako nejvhodnější zvolena rychlost 12 µl/min.
Po sumarizaci předchozích výsledků byly všechny experimenty EC/MS prováděny za těchto podmínek: napětí na kapiláře -2,5 kV; nebulizer 10 psi; průtok sušícího plynu (N2) 5 l/min; teplota 240 ˚C; scan 50 – 600 m/z; rychlost infúze 12 µl/min.
43
4.4.4. Dopamin Dopamin ([M+H]+ s m/z 154) je elektrochemicky oxidován na produkt [M+H]+ s m/z 150 (dopaminochrom, Obr. 36): HO
NH2
O
-4e-, -4H+
HO
N H
O
[M+H]+ = 154.086255
[M+H]+ = 150.054955
Obr. 36: Souhrnné schéma oxidace dopaminu na dopaminochrom. Hlavním fragmentem dopaminu je ion [M-NH3+H]+ s m/z 137 (Obr. 37). Fragmentační spektrum je v Příloze 3. HO
NH2
-NH3+
HO CH2 HO
HO
[M+H]+ = 154.086255
[M+H]+ = 137.059706
Obr. 37: Schéma hlavní fragmentační cesty protonizované molekuly dopaminu.
30 25
m/z = 154
20
m/z = 150
I·10^6 15 10 5 0 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
E/V
Obr. 38: Graf závislosti intenzity molekulárního iontu dopaminu (m/z = 154) a jeho oxidačního produktu (m/z = 150) na měnícím se potenciálu na pracovní elektrodě z porézního uhlíku; pH = 7,0; měřeno v +ESI.
44
14 12 10 8
I·10^6
m/z = 154
6
m/z =150
4 2 0 -0,3
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
E/V
Obr. 39: Závislost intenzity iontů m/z = 154 (dopamin) a m/z = 150 (dopaminochrom) na změně napětí na pracovní elektrodě platinové; pH = 10,0; měřeno v +ESI. Dopamin ([M+H]+ s m/z 154) byl v cele s porézním uhlíkem oxidován při nízkém potenciálu (kolem 0 V vs. (Pd/H2)), což se projevilo poklesem signálu tohoto iontu (Obr. 38). Současně byl pozorován vzrůst intenzity odezvy oxidačního produktu s m/z
150. Při potenciálu
0,4 V dochází i k poklesu intenzity iontu m/z = 150. Tento pokles přisuzuji zmenšení povrchu pracovní elektrody z důvodů adsorpce oxidačního produktu (což bylo potvrzeno CV). Potenciál oxidace (0,1 V) je nižší než potenciál zjištěný z voltametrických experimentů, což je způsobeno jinou referentní elektrodou v průtokové cele (α-hydrogenpalladiová (Pd/H2)). Na platinové pracovní elektrodě se dopamin
oxidoval již při potenciálu -0,1 V
(Obr. 39). S rostoucím potenciálem docházelo k poklesu intenzity molekulárního iontu a nárůstu oxidačního produktu dopaminu (m/z 150). Na rozdíl od uhlíkové porézní elektrody, v případě platinové nebyl pozorován pokles signálu oxidačního produktu při vyšších potenciálech, což napovídá, že nedochází k deaktivaci pracovní elektrody adsorpcí oxidačního produktu. Toto pozorování je v souladu s výsledky voltametrických měření s platinovou RDE. Nebyl pozorován znatelný rozdíl ve výsledcích experimentů při různých hodnotách pH.
4.4.5. 3-methoxytyramin 3-methoxytyramin ([M+H]+ s m/z 168) je ionizován v +ESI. Jeho hlavní fragmentační ion je [M-NH3+H]+ s m/z 151 (Příloha 10, Obr. 40 A). Oxidační produkt ([M+H]+ s m/z 166) s chinoidní strukturou (Obr. 40 B) poskytl viditelný signál pouze na elektrodě z porézního
45
uhlíku. Předpokládám, že ta na svém povrchu obsahuje struktury, které katalyzují oxidaci 3−methoxytyraminu (lze sledovat signál), zatímco na povrchu platinové elektrody tato katalýza neprobíhá. Všechna hmotnostní spektra jsou v Přílohách 7 až 12. H 3CO
NH2
H 3CO
-2e-. -2H+ HO
NH2
O
[M+H]+ = 166,086255
[M+H]+ = 168.101905
A H 3CO
NH2
-NH3 +
HO
H 3CO
CH2
HO [M+H]+ = 151.075356
[M+H]+ = 168.101905
B Obr. 40: Oxidační schéma protonizovaného 3-methoxytyraminu (A) a jeho hlavní fragmentační cesta (B).
8 7
m/z = 168
6
m/z = 166
5
I·10^6 4 3 2 1 0 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
E/V
Obr. 41: Závislost intenzity signálu iontu m/z = 168 (3-methoxytyramin) a m/z = 166 na potenciálu pracovní elektrody z porézního uhlíku; pH = 7,0; měřeno v +ESI; ostatní parametry jako u předchozích měření.
46
18 16 14 12 10 I·10^6 8 6 4 2 0 -0,3
m/z = 168
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
E/V
Obr. 42: Závislost intenzity odezvy iontu m/z = 168 (3-methoxytyramin) na potenciálu pracovní elektrody z platiny; pH = 7,0; měřeno v +ESI; ostatní parametry jako u předchozích měření. Na pracovní elektrodě z porézního uhlíku se 3-methoxytyramin oxidoval při potenciálu vyšším než 0,1 V (vs. (Pd/H2). Docházelo zde k poklesu intenzity molekulárního iontu [M+H]+ s m/z 168 a od 0,2 V k vzrůstu intenzity iontu [M+H]+ oxidačního produktu m/z 166. V
cele
s platinovou
pracovní
elektrodou
docházelo
k oxidaci
3-methoxytyraminu
při potenciálu 0,4 V (vs. (Pd/H2). Výsledný oxidační produkt však v MS spektru nalezen nebyl. Posun potenciálů oxidace 3-MT mezi porézní uhlíkovou a platinovou elektrodou o 200 mV souhlasí s údaji získanými z měření cyklických voltamogramů (viz kapitola 4.1.2.).
4.4.6. Katechol Katechol byl měřen v záporném modu elektrospreje, kdy (odštěpením protonu vznikal záporně nabitý molekulární ion [M-H]-. Při oxidaci katecholu ([M-H]- s m/z 109, spektrum v Příloze 13) byl očekáván vznik produktu – benzochinonu (Obr. 43 A). Látka takovéto struktury se však v MS neionizovala ani v záporném, ani v kladném módu ionizace, jak bylo prokázáno přímým nástřikem roztoku benzochinonu, tudíž nedávala žádnou odezvu. Hlavní fragmentační pík katecholu m/z 81 přísluší nejspíš struktuře [M-H-CO]- (Obr. 43 B, Příloha 15). Byl zaznamenám signál dimeru katecholu ([2M-H]- = 217, Příloha 16). Další hmotnostní spektra Příloha 13. až 16.
47
O
OH OH
O
-2e-, -2H+
[M-H]- = 107.013853
[M-H]- = 109.029503
A OH
OH OH -CO
[M-H]- = 81.034588
[M-H]- = 109.029503
B Obr. 43: Oxidační schéma katecholu (A) a schéma hlavní oxidační cesty deprotonizované molekuly katecholu (B).
4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 I·10^5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,4
m/z = 109
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
E/V
Obr. 44: Závislost intenzity iontu s m/z = 109 (katechol) na změně napětí na pracovní elektrodě z porézního uhlíku; pH = 7,0; měřeno v –ESI.
5,0 4,0 3,0 I·10^6 2,0
m/z = 109
1,0 0,0 -0,3
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
E/V
Obr. 45: Závislost intenzity iontu s m/z = 109 (katechol) na změně napětí na pracovní elektrodě z platiny; pH = 7,0; měřeno v –ESI. 48
Katechol byl oxidován v roztocích o pH 7 i pH 10 při stejném potenciálu na pracovní elektrodě, a to při 0 V (vs. (Pd/H2). Od tohoto potenciálu docházelo k poklesu intenzity molekulárního iontu (m/z 109) z důvodů oxidace této látky. V cele s pracovní porézní uhlíkovou elektrodou dochází k lepší oxidaci (viditelnější pokles signálu molekulárního iontu) jak je patrné z porovnání obrázků Obr. 44 a 45.
4.4.7. Guajakol EC/MS experimenty s guajakolem bohužel nebyly úspěšné. Guajakol sám se neionizoval v ESI, tudíž nebyla viditelná žádná odezva molekulárního iontu. Měření byla provedena v roztocích o rozdílném pH (pH 2, pH 7, pH 10) v záporném i kladném módu, za různých podmínek (změny teploty, napětí na kapiláře, průtoků). Výsledek však byl vždy stejný – žádný signál analyzované látky.
4.5.
EC/MS spojení průtokové cely s tištěnou elektrodou
Jak vyplynulo z výsledků voltametrických měření všech čtyř studovaných látek, oxidační produkty těchto látek snadno a účinně pasivují povrch elektrod. V průtokových celách, kde jsou omezeny možnosti aktivace elektrodového povrchu na elektrochemickou metodu vkládání kladných a záporných potenciálů a na chemické čištění vhodnými rozpouštědly, to může vést k postupnému nenávratnému zničení elektrody. Cena komerčních průtokových cel s pevně zabudovanými (nevyměnitelnými) elektrodami je vysoká, proto je z ekonomického hlediska žádoucí hledat levnější možnosti. Z tohoto důvodu byl proveden pokus spojit s hmotnostním spektrometrem průtokovou celou na tištěné elektrody (SPE – screen printed electrodes). Tyto elektrody jsou velmi levné (cena za kus se pohybuje kolem 2 eur) a snadno vyměnitelné. Na uhlíkové SPE elektrodě v průtokové mikrocele byla nejprve měřena odezva dopaminu jako modelové látky cyklickou voltametrií (polarizační potenciál v rozsahu −0,1 až 1,0 V, skenovací rychlost 5 mV/s). Jak ukazuje Obr. 46, na cyklickém voltamogramu se objevil oxidační pík dopaminu při potenciálu 0,4 V. Z obrázku je zřejmé, že kinetika redoxní reakce na SPE je mnohem pomalejší než na GCE. Katodický pík oxidačního produktu nebyl na této elektrodě za použitých potenciálů vůbec patrný. Dále byl dopamin oxidován při konstantním potenciálu v rozsahu -0,2 až 0,8 V se současným záznamem křivky závislosti proudu na čase oxidace (I/t) a hmotnostních
49
spekter elektrolyzovaného roztoku zaváděného přímo do vstupu ESI-MS. Vzhledem k velikosti pracovní elektrody bylo nutné snížit rychlost průtoku analyzované látky na 5 µl/min (nejnižší rychlost, při níž byl signál stabilní). Při snímání křivek I/t jsem nastavil zvolený potenciál na pracovní elektrodě, počkal na ustálení signálu a poté po dobu 30 minut zaznamenával závislost proudu na čase (Obr. 48 a Obr. 49 záznam proudu na čase při -0,3 V a 0,6 V). Ze záznamů je viditelné, že k ustálení signálu dochází po cca 900 s (tj. 15 minut). Po ustálení proudového signálu bylo zaznamenáno hmotnostní spektrum. Obr. 47 ukazuje závislost intenzity signálů iontů dopaminu (m/z 154) a jeho oxidačního produktu (m/z 150) na potenciálu pracovní uhlíkové SPE. Malý signál iontu 154 na začátku měření si vysvětluji tím, že při nízkých potenciálech dochází k adsorpci dopaminu na tištěnou uhlíkovou elektrodu a až po dosažení vyšších potenciálů (0,1 V) dochází ke vzrůstu intenzity. K oxidaci výchozí látky (dopaminu) dochází při potenciálu 0,2 V (vs Ag/AgCl). Od tohoto potenciálu dochází k vzrůstu signálu oxidačního produktu (m/z 150). 25 20 15
dopamin octanový pufr
10 I/µA
5 0 -5 -10 -15 -0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
E/V vs Ag/AgCl
Obr. 46: CV dopaminu (c = 1·10-4 mol/l) na uhlíkové tištěné elektrodě (SPE) v průtočné mikrocele (-0,3 V až 1,1 V, rychlost scanu 5 mV/s).
50
12 10
m/z = 154 m/z = 150
8 I·10^6 6 4 2 0 -0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
E/V
Obr. 47: Graf závislosti intenzity dopaminu (m/z = 154) a jeho oxidačního produktu (m/z = 150) na měnícím se potenciálu na pracovní tištěné elektrodě z uhlíku; pH = 7,0; měřeno v +ESI.
Dalším experimentem byla potvrzena silná adsorpce dopaminu na elektrodě. Při přímém nástřiku do hmotnostního spektrometru byla intenzita výchozí látky (m/z 154) přibližně 9 krát vyšší než při nástřiku přes vypnutou celu (Tabulka 5).
Tabulka 5: Porovnání intenzit signálů iontů m/z 154 a m/z 150 při nástřiku do hmotnostního spektrometru přímo a při nástřiku přes vypnutou celu
přímo MS vyp.cela
I(154)/cnt I(150)/cnt 1941618 1040448 214648 65915
Po provedení nástřiku dochází k adsorpci produktu (pík s m/z 150) v hmotnostním spektrometru a je velice obtížné a časově náročné stroj vyčistit. Promýval jsem rozpouštědly methanol:voda (1:1), acetonitril:voda (1:1), methanol:acetonitril (1:1) a propan-2-ol:voda (1:1). Při čištění je potřeba zvýšit napětí na kapiláře (-5,0 kV), zvýšit tlak a průtok sušícího plynu (10 psi, 10 l/min). Průměrný čas čištění při pravidelné výměně používaných rozpouštědel byl přibližně 3 hodiny.
51
0 -500
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
-1000 -1500 I/nA -2000 -2500 -3000 -3500 t/s
Obr. 48: Záznam proudu v závislosti na čase při potenciálu -0,3V měření dopaminu. 600 500 400 I/nA 300 200 100 0 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
t/s
Obr. 49: Záznam proudu v závislosti na čase při potenciálu 0,6V měření dopaminu.
52
5.
Závěr
Byly změřeny cyklické voltamogramy dopaminu, 3-methoxytyraminu, katecholu a guajakolu na statické a rotační diskové elektrodě (RDE). U všech látek byla závislost limitního proudu na odmocnině z rychlosti rotace RDE nelineární s průběhem typickým pro reakční mechanismus řízený kinetikou chemické reakce v roztoku. U dopaminu docházelo k posunu E1/2 k vyšším potenciálům a adsorpci oxidačního produktu na GCE, při měření na Pt se pasivace elektrodového povrchu neprojevila. 3−methoxytyramin se adsorboval na obou elektrodových materiálech. Při měření katecholu a guajakolu jsou na voltametrických křivkách dvě viditelně odlišné směrnice odpovídající různým rychlostem přenosu prvního a druhého elektronu. 3-MT, katechol i guajakol poskytovaly produkty elektrochemické reakce, které pasivovaly (deaktivovaly) povrch jak GCE tak Pt. Byla potvrzena adsorpce dopaminu v různých prostředích na povrch obou typů elektrod a důležitý vliv způsobu čištění jejich povrchů. Ve výsledcích z elektrochemické impedanční spektroskopie jsou vidět určité trendy. Po adsorpci (jedna minuta v roztoku aktivní látky) se výsledky na elektrodě ze skelného uhlíku (GCE) a platiny (Pt) liší. Na GCE jsem předpokládal pasivaci adsorpcí látky na povrch elektrody, zatímco na Pt vytvoření vodivější vrstvy na povrchu platiny. Kapacita u obou typů elektrod klesá z důvodu změny tloušťky vrstvy naadsorbováním studované látky. Po potenciálových cyklech u dopaminu se obě elektrody chovají obdobně. Oxidační produkt nejspíš mění vlastnosti povrchu a to pravděpodobně uspořádáním vrstvy, které vede k zlepšení kapacity. Všechny látky byly proměřeny metodou EC/MS/MS. Bylo potvrzeno oxidační schéma dopaminu (oxidace na dopaminochrom). Byla navržena oxidační cesta 3-methoxytyraminu (vznik chinoidní struktury, která byla potvrzena i z fragmentačního spektra). Oxidační produkt byl však zachycen jen na elektrodě z porézního uhlíku (předpokládáme katalýzu na povrchu této elektrody). Poklesem signálu molekulového píku katecholu byla potvrzena jeho oxidace. Oxidace látek probíhala lépe na elektrodě z uhlíku než z platiny. Bylo úspěšně vyzkoušeno spojení průtokové cely s tištěnou elektrodou připojenou k elektrochemické pracovní stanici (záznam I/t křivek) s hmotnostním spektrometrem.
53
6.
Summary
Comparison of different types of electrode material (carbon and platinum) for electrochemical studies and analysis biologically active substances (dopamine, 3-methoxytyramine, catechol and guaiacol) has been investigated by cyclic voltammetry on static and rotating disk electrodes,
by
electrochemical
impedance
spectroscopy
and
by
combination
of
electrochemistry with mass spectrometry detection. In experiments with rotating disc electrodes, dependence of limiting current on the square root of scan rate was nonlinear with similar shape for all analytes, typical for current influenced by kinetics of chemical reaction in solution. Half wave of dopamine increased at repeated measurements and oxidation product was absorbed on surface of GCE in contrast to Pt. 3-methoxytyramine was absorbed on both types of electrode materials. There were two slopes corresponding to different rates of electron transport in two-electron oxidation process of catechol and guaiacol. Oxidation products of 3−MT, catechol and guaiacol passivated both GCE and Pt surfaces. Adsorption of dopamine has been investigated in aqueous and mixed solutions. It was strongly dependent on surface treatments. Results of electrochemical impedance spectroscopy measurements were revealed some trends for all studied substances. After adsorption of the analyte, changes in the electrode surface characteristics (conductivity and capacity) of GCE and Pt electrode were different. I inferred that the passivation of GCE surface by adsorption of analyte occured. On the other hand, a layer with better conductivity was formed on the Pt electrode surface. There were changes in the thickness of the layer for both electrodes. After electrochemical oxidation of dopamine using potential cycling, observed trends were similar for both electrodes. I inferred that oxidation products changed properties of surface by better ordering of the layer of oxidation product on the electrode surface. All compounds were studied by EC/MS/MS. Oxidation pathway of dopamine reported in literature was confirmed (oxidation to dopaminochrome). I proposed oxidation scheme of 3−methoxytyramine (oxidation to quinone system, which was confirmed from MS/MS spectrum). Formation of the oxidation product was observed only on porous carbon electrode (I expect the surface catalysis of this electrode). A MS signal of catechol was decreased and the presence of dimer was demonstrated. I introduced coupling of flow cell containing electrochemical screen printed sensor (controlled by electrochemical workstation) with MS.
54
7.
Použitá literatura [1] DuVall, S.H., McCreery, R.L., Control of catechol and hydroquinone electron-transfer kinetics on native and modified glassy carbon electrodes. Anal. Chem. 71 (1999) 4594-4602.
[2] Patel, A. N., Tan, S. T., Miller. S. M., Macpherson, J.V., Unwin, P.R., Comparison and reappraisal of carbon electrodes for the voltammetric detection of dopamine. Anal. Chem. 85 (2013) 11755-11764.
[3] Venton, B. J., Wightman, R.M., Psychoanalytical electrochemistry: Dopamine and behavior. Anal. Chem. 75 (2003) 414A-421A.
[4] News Medical [online]. [staženo 2015-03-23].
.
[5] Carlssonn, A., Hillarp, N.A., On the state of the catechol amines of the adrenal modullary granules. Acta Physiol. Scand. 44 (1958) 163-169.
[6] Kuwana, T., Analytical Electrochemistry: A Laboratory Manual. 4. The cyclic voltammetry of dopamine: an ec mechanism. Analytical Sciences Digital Library (ASDL), [online, staženo 2014-02-06]. .
[7] Yeh, W.L., Kuo, Y.R., Cheng, S.H., Voltammetry and flow injection amperometry for indirect determination of dopamine. Electrochem. Commun. 10 (2008) 66-70.
[8] Zhang, F., Dryhurst, G., Oxidation chemistry of dopamine: possible insights into the age-dependent loss of dopaminergic nigrostriatal neurons. Bioorg. Chem. 21 (1993) 392-410.
[9] Chen, S.M., Peng, K.T. The electrochemical properties of dopamine, epinefrine, norepinefrine, and their electrocatalytic reactions on cobalt(II) hexakyanferrate films. J. Electroanal. Chem. 547 (2003) 179-189.
[10] Shoup, R. E., Kissinger, P.T., Determination of urinary normetanephrine, metanephrine, and 3methoxytyramine by liquid chromatography, with amperometric detection. Clin. Chem 23 (1977) 1268-1274.
[11] Carlsonn, A., Lindqvist, M., Effect of chlorpromazine or haloperidol on formation of 3methoxytyramine and norepinephrine in mouse brain. Acta Pharmacol. et Toxicol. 20 (1963) 140-144.
[12] Stern, G., Why catechol?. Movement disorders 26 (2011) 24-26. [13] Fotouhi, L., Khakpour, M., Nematollahi, D., Heravi, M. M., Investigation of the electrochemical behavior of some catechols in the presence of 4,6-dimethylpyrimidine-2-thiol. Arkivoc (2008) 43-52.
[14] Nematollahi, D., Rafiee, M., Electrochemical oxidation of catechols in presence of acetylaceton. J. Electroanal. Chem. 566 (2004) 31-37.
[15] Eberson, L., The Marcus theory of electron transfer, a sorting device for toxic compounds. Adv. Free Radic. Biol. Med. 1 (1985) 19-90.
[16] Steenken, S., Neta, P., Electron transfer rates and equilibria between substituted phenoxide ions and phenoxyl radicals. J. Phys. Chem. 83 (1979) 1134-1137.
55
[17] Schweigert, N., Zehnder, A.J.B., Eggen, R.I.L., Chemical properties of catechols and their molecular modes of toxic cation in cells, from microoganisms to mammals. Environ. Microbiol. 3 (2001) 81-91.
[18] Samet, Y., Abdelhedi, R., Savall, A., A study of the electrochemical oxidation of guaiacol. Phys. Chem. News 8 (2002) 89-99.
[19] Suatoni, J.C., Snyder, R.E., Clark, R.O., Voltammetric studies of phenol and aniline ring substitution. Anal Chem. 33 (1961) 1894-1897.
[20] Yanilkin, V.V., Medvedev, V.A., Babkin, V.A., Ivanova, S.Z., Medvedeva, S.A., The electrochemical oxidation of 2-methoxyphenols. Khim. Drev. 6 (1985) 132-135.
[21] Allred, Ch.D., McCreery, R.L., Adsorption of catechols on fractured glassy carbon electrode surfaces. Anal. Chem. 64 (1992) 444-448.
[22] Siria, J.W., Baldwin, R.P., Adsorption pre-concentration and analysis of dopamine at platinum electrode surfaces. Anal. Lett. 13 (1980) 577-588.
[23] DuVall, S.H., McCreery, R.L., Self-catalysis by catechols and quinones during heterogenous electron transfer at carbon electrodes. J. Am. Chem. Soc. 122 (2000) 6759-6764.
[24] Chen, P.H., McCreery, R.L., Control of electron transfer kinetics at glassy carbon electrodes by specific surface modification. Anal. Chem. 68 (1996) 3958-3965.
[25] McDermott, C.A., Kneten, K.R., McCreery, R.L., Electron transfer kinetics of Aquated Fe+3/+2, Eu+3/+2, and V+3/+2 at carbon electrodes. J. Electrochem. Soc. 140 (1993) 2593-2599.
[26] Cabaniss, G.E., Diamantis, A.A., Murphy, W.R., Linton, R.W., Meyer, T.J., Electrocatalysis of protoncoupled electron-transfer reactions at glassy-carbon electrodes. J. Am. Chem. Soc. 107 (1985) 1845-1854.
[27] Poon, M., McCreery, R.L., In situ laser activation of glassy-carbon electrodes. Anal. Chem. 58 (1986) 2745-2750.
[28] Pham, M.C., Lacaze, P.C., Dubois, J.E., Obtaining thin-films of reactive polymers on metal-surfaces by electrochemical polymerization. 1.Reactivity of functional-groups in carbonyl substitued polyphenyle oxide film. J. Electroanal. Chem. 86 (1978) 147-157.
[29] Kong, Y., Mu, S.F., Mao, B.W., Synthesis of polycatechol with electrochemical activity and its properties. Chin. J. Polym. Sci. 20 (2002) 517-524.
[30] Pariente, F., Lorenzo, E., Abruna, H.D., Electrocatalysis of NADH oxidation with electropolymerized films of 3,4-dihydroxybenzaldehyde. Anal. Chem. 66 (1994) 4337-4344.
[31] Khoo, S.B., Zhu, J., Poly(catechol) film modified glassy carbon electrode for ultratrace determination of cerium(III) by diferential pulse anodic stripping voltammetry. Electroanalysis 11 (1999) 546-552.
[32] Wang, J. et al, Electropolymerization of dopamine for surface modification of complex-shaped cardiovascular stents. Biomaterials 35 (2014) 7679-7689.
56
[33] Ball, V., Del Frari, D., Toniazzo, V., Ruch, D., Kinetics of polydopamine film deposition as a function of pH and dopamine concentration: Insights in th polydopamine deposition mechanism. J. Colloid Interface Sci. 386 (2012) 366-372.
[34] Barek, J., Opekar, F., Štulík, K. Elektroanalytická chemie. 1. vyd. Praha: Karolinum, 2005. 188 s. ISBN 80-246-1146-5.
[35] Levich, V.G., The theory of concentration polarization. I.. Acta Physicochim. URSS 17 (1942) 257-307. [36] Cyklická voltametrie s rotující diskovou elektrodou (RDE) [online, staženo 2015-04-11].
[37] Chiu, V.M., Lukus, P.A., Doyle, J.L., Schenk, J.O., Mass transport at rotating disk electrodes: Effects of synthetic particles and nerve endings. Anal. Biochem. 418 (2011) 58-65.
[38] Earles, C., Schenk, J.O., Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal. Biochem. 264 (1998) 191-198.
[39] Schenk, J.O., Patterson, T.A., McElvain, J.S., Rotating disk voltammetric measurements in neurobiology and neuropharmacology. Trends Anal. Chem. 9 (1990) 325-330.
[40] Tatarkovič, M., Broncová, G., Kronďák, M., Elektroimpedanční spektroskopie a její využití v chemické analýze. Chem. Listy 106 (2012) 1067-1074.
[41] Amirudin, A., Thierry, D., Application of electrochemical impedance spectroscopy to study the degradation of polymer-coated metals. Prog. Org. Coat. 26 (1995) 1-28.
[42] Rueda, M.R., Dapena, F.P., Application of electrochemical impedance spectroscopy to the study of surface processes. Collect. Czech. Chem. Commun. 76 (2011) 1825-1854.
[43] Cortina-Puig, M. et al., Characterization of an ion-selective polypyrrole coating and application to the joint determination of potassium, sodium, ammonium by electrochemical impedance spectroscopy and partial least squared method. Anal. Chim. Acta 597 (2007) 231-237.
[44] Benito, D., Gabrielli, C., Garcia-Jareno, J.J., Keddam, M., Perrot, H., Vincente, F., An electrochemical impedance and ac-electrogravimetry study of PNR films in aqueous salt media. Electrochem. Commun. 4 (2002) 613-619.
[45] Bruckenstein, S., Gadda, R.R., Use of porous electrode for in situ mass spectrometric determination of valatile electrode reaction products. J. Am. Chem. Soc. 93 (1971) 793-794.
[46] Hambitzer, G., Heitbaum, J., Electrochemical thermospray mass spectrometry. Anal. Chem. 58 (1986) 1067-1070.
[47] Deng, H., Van Berkel, G.J., A thin-layer electrochemical flow cell coupled online with electrospraymass spectrometry for the study of biological redox reactions. Electroanalysis 11 (1999) 857-865.
57
[48] Faber, H., Vogel, M., Karst, U., Electrochemistry/mass spectrometry as a tool in metabolism studies-A review. Anal. Chim. Acta 834 (2014) 9-21.
[49] Regino, M.C.S., BrajterToth, A., An electrochemical cell for on-line electrochemistry mass spectrometry. Anal. Chem. 69 (1997) 5067-5072.
[50] Zhou, F., Van Berkel, G.J., Electrochemistry combined on-line with electrospray mass spectrometry. Anal. Chem. 67 (1995) 3643-3649.
[51] Looi, D.W., Iftikhar, I., Brajter-Toth, A., Electrochemical attributes of electrochemistry in tandem with electrospray mass spectrometry. Electroanalysis 26 (2014) 319-327.
[52] BVT
Technologies,
a.s.
[online,
staženo
2015-04-11].
a.s.
[online,
staženo
2015-04-11].
%20new/FC4n.pdf>.
[53] BVT
Technologies,
%20new/AC1n.pdf >.
[54] Lee, J., Murugappan, K., Arrigan, D.W.M., Silvester, D.S., Oxygen reduction voltammetry on platinum macrodisk and screen-printed electrodes in ionic liquids: Reaction of the electrogenerated superoxide species with compounds used in the paste of Pt screen-printed electrodes. Electrochim. Acta 101 (2013) 158-168.
58
8.
Přílohy
8.1. MS spektra 8.1.1. Dopamin
Příloha 1.: Hmotnostní spektrum dopaminu (+ESI, přes celu při potenciále -0,2 V).
Příloha 2.: Hmotnostní spektrum dopaminu (+ESI, přes celu, E = 0,6 V).
Příloha 3.: Fragmentační spektrum dopaminu (m/z 154).
59
Příloha 4.: MS2 spektrum iontu 137.
Příloha 5.: Fragmentační spektrum m/z 152.
Příloha 6.: MS2 spektrum fragmentační iontu m/z 150.
60
8.1.2. 3-methoxytyramin
Příloha 8.: Hmotnostní spektrum 3-methoxytyraminu (m/z = 168) při E = -0,2 V (+ESI).
Příloha 9.: Hmotnostní spektrum 3-methoxytyraminu (m/z = 168) při E = 0,6 V (+ESI).
Příloha 10.:Fragmentační spektrum 3-methoxytyraminu (168).
61
Příloha 11.: Fragmentační spektrum m/z = 151.
Příloha 12.: Fragmentační spektrum m/z = 166.
8.1.3. Katechol
Příloha 13.: Hmotnostní spektrum katecholu (m/z 109; -ESI; E = -0,2 V).
62
Příloha 14.: Hmotnostní spektrum katecholu (m/z 109; -ESI; E = + 0,6 V).
Příloha 15.: Fragmentační spektrum m/z 109.
Příloha 16.: MS2 spektrum iontu 217 (dimer katecholu).
63
