PENUNTUN PRAKTIKUM
BIOKIMIA
Dosen Pengampu : Ummi Mardhiah Batubara, S.Si, M.Si Risa Aryantri, S. Si, M.Si
LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS JAMBI JAMBI 2014
1
KATA PENGANTAR Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kehadiran Allah SWT, karena berkat rahmat dan karunia-NYA penulis dapat menyelesaikan penuntun praktikum Biokimia ini. Untuk memberi gambaran yang lebih jelas tentang jalannya reaksi-reaksi kimia dalam proses kehidupan, begitu pula mengenai prinsip-prinsip biokimia serta cara kerja atau metode dalam biokimia, hendaknya para mahasiswa dengan penuntun praktikum biokimia ini dapat mengambil manfaat yang sebesar-besarnya. Sehingga kebiasaan keterampilan maupun memahami proses serta peristiwa kehidupan tidak merupakan hal yang asing lagi baginya. Penuntun praktikum biokimia ini terutama ditunjukkan bagi mahasiswa yang sedang mengikuti kuliah biokimia. Tiap percobaan diawali dengan keterangan singkat, sehingga dapat mengingat kembali pengetahuan-pengetahuan yang mungkin telah terlupakan, atau dapat merangsang keinginan untuk lebih banyak mengetahui rahasia-rahasia hidup. Segala gerak-gerik makhluk hidup berlandaskan proses kimia. Konversi energi fisika menjadi energi kimia yang mengakibatkan perubahan cahaya matahari menjadi elektron-elektron dalam sel hidup yang dikenal sebagai hasil fotosintesis berupa karbohidrat adalah pangkal dari segala perikehidupan di dunia ini. Penyusun menyadari bahwa petunjuk ini masih sederhana sekali, masih banyak kekurangan. Oleh karena itu saran dan kritik sangat diharapkan.
Akhirnya penulis mengharapkan semoga penuntun praktikum ini dapat bermanfaat untuk perkembangan dan kemajuan ilmu pengetahuan dan kepada semua yang telah banyak membantu penulis ucapkan terima kasih.
Penulis
2
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ....................................................................................
2
DAFTAR ISI ...................................................................................................
3
I.
4
PROTEIN DAN ASAM AMINO ............................................................
II. DENATURASI PROTEIN .......................................................................
14
III. KARBOHIDRAT ....................................................................................
23
IV. KARBOHIDRAT ......................................................................................
29
V. LIPIDA ....................................................................................................
40
VI. ENZIM .....................................................................................................
45
3
I. PROTEIN DAN ASAM AMINO Di alam, kita dapat menjumpai ribuan jenis protein yang melangsungkan fungsi hayati yang bermacam-macam. Sifat fisik dan kimia protein sangat beragam, misalnya ukuran berat molekul, kelarutan, konformasi tiga dimensi, susunan dan deret asam amino penyusun, dan lain-lain. Namun demikian semua protein alami pasti tersusun atas 20 jenis asam amino. Sifat-sifat protein sangat dipengaruhi oleh komposisi dan deret asam amino penyusunnya. Asam amino dibebaskan dari ikatan peptida pada protein oleh hidrolisis enzim (protease) atau asam, dalam hal ini kondisi hidrolisis adalah pada 6N HCl 110oC selama 8 – 72 jam. Biasanya hidorlisis dilakukan dalam tabung reaksi pada keadaan vakum. Asam Amino dapat juga dipisahkan satu dengan lainnya dengan cara khromatografi (kertas, lapisan tipis atau kolom) dan elektrofenesis. Secara kualitatif asam amino dapat diteliti dengan pereaksi ninhidrin yang bereaksi dengan asam amino menghasil produk berwarna biru. Semua asam amino mengandung gugus fungsional yang dapat bekerja sebagai asam atau basa bergantung pada pH lingkungan. pKa = pH apabila konsentrasi dalam bentuk berproton dan bentuk tidak berprotonnya sama, pKa juga sama dengan pH pada saat gugus yang bersangkutan berada pada kapasitas atau buffernya. Proses denaturasi berkaitan dengan terganggunya ikatan atau interaksi kimiawi didalam molekul protein, sehingga mengubah keseluruhan struktur tiga dimensi protein. Prosedur ekstraksi dan pemurnian protein sangat beragam, tergantung pada jenis proteinnya. Selama proses ini perlu diperhatikan perlakuan yang dapat merusak protein. Ekstraksi protein awal biasanya menggunakan prinsip-prinsip kelarutan protein.
4
1.1
Pengaruh Beberapa Parameter terhadap Kelarutan Protein 1. Kekuatan Ion Kelarutan protein dipengaruhi oleh kekuatan ion. Pada umumnya dengan
meningkatnya kekuatan ion, kelarutan protein semakin besar. Peristiwa ini disebut “salting in” tetapi setelah mencapai suatu titik tertentu, kelarutannya justru menurun, peristiwa ini disebut “salting out”. Pada kekuatan ion rendah, gugus protein yang terionisasi dikelilingi oleh ion lawan sehingga interaksi antar protein dan kelarutannya meningkat. Apabila kekuatan ion meningkat akan lebih banyak air yang diikat oleh ion, sehingga tidak cukup untuk hidrasi protein. Akibatnya Interaksi antar protein lebih kuat dan kelarutannya menurun. 2. pH, Suhu dan Konstanta Dielektrik Disamping kekuatan ion, kelarutan protein bisa dipengaruhi oleh pH, suhu dan konstanta dielektrik. Perubahan pH akan mengubah ionisasi gugus fungsional protein yang berarti pula mengubah muatan protein. Protein mengendap pada titik isoelektriknya (pi) yaitu menunjukkan muatan protein nol, sehingga interaksi antar protein menjadi maksimum. Peningkatan suhu menyebabkan denaturasi protein, akibatnya struktur protein terbuka, dan gugus nonpolar yang berada di dalam molekul menjadi terbuka diluar. Oleh karena itu kelarutan protein dalam air (polar) menjadi turun. Pengaruh konstanta dielektrik diterangkan dengan penambahan etanol, methanol, serta aseton. Penurunan konstanta dielektrik medium menyebabkan peningkatan gaya tarik-menarik antar gugus bermuatan pada protein. Oleh karena itu, interaksi antar protein meningkat, sehingga kelarutan protein menurun. 1.2
Asam Amino 1. Sifat Asam-Basa Sesuai dengan namanya, asam amino adalah senyawa organik yang mengandung
gugus amino dan gugus karboksil. Dengan demikian, mempunyai sifat asam maupun basa. Terdapat sejumlah besar amino secara kimia, akan tetapi hanya beberapa diantaranya yang terdapat di alam. Dalam hal ini, kurang dari 22 macam asam amino terdapat didalam protein, yang hampir semuanya merupakanm asam amino, dimana gugus terdapat pada atom karbon alfa. 5
Asam amino umunya sudah larut dalam air, dan hanya sedikit atau bahkan tidak larut dalam pelarut organik, titik leburnyasangat tinggi. Asam-asam amino dalam larutan netral berada dalam bentuk ion-ion bermuatan rangkap dua yang dikenal sebagai “zwitterion”, dan sebagai molekul yang terionisasi. 2. Titik Isoelektris Asam amino bergerak dalam medan listrik, sifat ini merupakan dasar pemisahan asam-asam amino. pH pada saat muatan netto = nol dan tidak terjadi pergerakan dalam medan listrik, dikenal sebagai titik isoelektris untuk asam-asam amino. 3. Aktivitas Optik Atom karbon alfa bersifat asimetris untuk semua asam amino kecuali glisin. Oleh karena itu, semua asam amino menunjukkan aktivitas optik kecuali glisin. 1.3
Komposisi Asam Amino 1. Formula Asam Amino Seperti halnya monosakarida yang merupakan unit dasar polosakarida, maka
asam amino dapat dibayangkan sebagai batu bata yang digunakan untuk membangun “rumah” yang disebut dengan protein. 2. Ikatan Peptida Asam-asam amino saling berhubungan satu sama lain dalam molekul protein dengan ikatan peptida (-CO-NH) sebagai hasil kondensasi –COOH dari asam amino yang satu dengan gugus alfa –NH dari asam amino yang lain. Polimer asam amino dengan BM rendah dikenal sebagai polipeptida. Sedangkan istilah protein diberikan kepada polimer-polimer yang lebih besar dengan BM beberapa ribu atau lebih. Protein punya struktur khas/struktur lebih tingi. 3. Isolasi Protein Seperti halnya kebanyakan bahan-bahan biologis yang lain, kondisi ekstrim tahun dihindarkan dalam percobaan isolasi protein. Untuk keperluan ini, lebih banyak menggunakan metoda fisika daripada kimia. Sebenarnya, suatu konsentrasi protein tinggi, suhu yang rendah dan pH sekitar netral merupakan kondisi terbaik, dan apabila tidak demikian, dapat terjadi denaturasi.
6
4. Denaturasi Denaturasi adalah setiap proses yang mengubah susunan ruang konfigurasi tiga dimensi molekul protein dari struktur molekul asli/awal yang teratur menjadi tidak teratur lagi. Selama denaturasi, ikatan-ikatan hidrogen dan hidrofobik terputus, dan akan terjadi peningkatan entropi atau derajat ketidak teraturan molekul. Denaturasi dapat bersifat reversibel. Denaturasi dapat terjadi oleh beberapa faktor antara lain : Fisika
: panas, tekanan, pembekuan, gaya permukaan, Sinar X, iradiasi ultra violet
Kimia
: pH ekstrim, pelarut organik, amida dan turunannya.
Biologis
: Enzim-enzim proteolitik (denaturasi terjadi sebelum hidrolisis).
Pemeriksaan protein umunya berdasarkan reaksi warna. Percobaan dilakukan untuk larutan-larutan albumin, kasein dan gelatin.
7
Percobaan 1.1. Kelarutan Asam Amino : Tujuan
: Untuk melihat daya larut berbagai asam amino dalam pelarut-pelarut yang berbeda.
Prinsip
: Asam amino umunya larut dalam air dan hanya sebahagian kecil yang larut dalam pelarut organik. Asam amino dalam larutan netral berada dalam bentuk “zwitterion” dan tidak sebagai molekul yang tidak terorganisasi.
Bahan dan Alat : HCl 0.1N, NaOH 0.1 N, Etanol, Kloroform ( masing-masing 1 liter) Asam-asam amino (glisin, lisin, glutamat, alanin) masing-masing 30 g. Tabung reaksi, beker glass, batang pengaduk. Cara Kerja
:
Siapkan 5 buah tabung reaksi yang diisi dengan pelarut : HCl, NaOH, etanol, kloroform dan air (masing-masing 1 mL) Larutkan kira-kira 0.5 g asam amino kedalam masing-masing pelarut tersebut, gunakan pengaduk bila perlu. Catat bagaimana hasilnya dan bagaimana kesimpulan saudara.
8
Percobaan 1.2. Titrasi Asam Amino : Tujuan
: Untuk mengidentifikasi jenis asam amino dan menduga bobot molekulnya.
Prinsip
: Asam amino mempunyai rumus struktur umum sebagai berikut: R H2N – CH – COOH R adalah gugus organik yang membedakan tiap asam amino satu sama lain. Asam amino dapat bersifat asam, basa atau netral. Hal ini ditentukan oleh kedudukan dan banyaknya gugus NH2 dan COOH dalam struktur molekulnya. Bila gugus NH2 dan gugus COOH terletak pada atom C yang sama dan tidak terdapat pada R maka asam amino tersebut bersifat netral, contohnya glisin. Jika gugus COOH merupakan bagian dari R maka ia akan bersifat sama. Sebaliknya jika NH2 yang merupakan bagian dari R, ia bersifat basa. Asam amino jelas bukan merupakan asam kuat. Karena itu di dalam air hanya sebagian saja terprotonisasi (melepaskan H+), ini ditentukan oleh nilai pKa-nya. Disamping itu asam amino ada yang dapat membebaskan lebih dari satu proton, sehingga bila dititrasi akan ditemukan lebih dari satu titik ekivalen. Asam amino yang melepaskan hanya satu proton tiap molekulnya disebut monoprotik, selanjutnya disebut diprotik jika melepaskan dua proton dan triprotik untuk tiga proton.
Bahan dan Alat
:
KCl 0.5N 250 mL, NaOH 0.5N 250 mL,1 L larutan asam amino sampel dengan konsentrasi 10 g/l. pH meter, buret, statip buret, pengaduk magnetic, erlemenyer dan beker glass.
9
Cara Kerja a.
: Pasangkan dua buah buret pada standarnya dan isi masing-masing dengan NaOH 0.5N dan HCl 0.1N sampai batas tertentu.
b.
Siapkan 20 mL asam amino yang akan diidentifikasi kedalam beker glass dan ukur pH dengan pH meter.
c.
Jika pH nya dibawah 7.0 lakukan titrasi dengan NaOH, dan jika pH nya diatas 7.0 titrasi dengan HCl.
d.
Letakkan erlemenyer berisi asam amino diatas pengaduk magnetik dan celupkan elektroda pH meter.
e.
Lakukan titrasi sebagaimana butir (C). Titrasi dengan HCl dilakukan sampai pH 1.0 sedangkan titrasi dengan NaOH dilakukan sampai pH 12.0.
f.
Catat perubahan pH selama 1 mL volume titran. Bila perubahan terlalu drastic, pencatatan dilakukan selang 0.5 mL volume titran.
g.
Lakukan titrasi seperti diatas terhadap 20 mL akuades sebagai blangko.
h.
Buatlah grafik pH terhadap volume titran untuk masing-masing titrasi.
i.
Berdasarkan grafik yang saudara buat : Perkirakan nilai-nilai pKa, dan pH isoelektrik dari asam amino tersebut ( pH iso elektrik adalah nilai pH pada saat jumlah muatanmuatan dalam larutan = 0 ) Hitung bobot molekulnya dengan persamaan berikut : 2 X pOH + log [asam amino] = pKw - pKa Dari bentuk kurva yang didapat simpulkan apakah asam amino yang saudara titrasi termasuk monoprotik, diprotik atau triprotik.
10
Percobaan 1.3. Uji Ninhidrin : Tujuan
: Untuk mengidentifikasi asam amino.
Prinsip
: Ninhidrin (triketohidrinden hidrat), suatu senyawa oksidator kuat bereaksi dengan semua asam amino pada pH 4 – 8 dan dihasilkan senyawa berwana biru (purple). Asam-asam amino, prolin dan hidroksi prolin juga bereaksi dengan ninhidrin akan tetapi menghasilkan warna kuning.
Bahan dan Alat : Asam-asam amino : glisin, tirosin, histidin, arginin dan triptofan 1 g/l masing-masing sebanyak 1 L. Ninhidrin ( 2 g/l ) dipersiapkan sebelum digunakan. Tabung reaksi, pipet, gelas ukur, erlemenyer, penangas air dan penjepit tabung reaksi. Cara kerja
: a.
Masukkan 2 mL asam amino yang akan di identifikasi ke dalam tabung reaksi dengan pH netral.
b.
Tambahkan pereaksi Ninhidrin.
c.
Didihkan selama 2 menit dalam penangas air.
d.
Amati warna hasil reaksi, dan simpulkan hasil pengamatan anda.
Percobaan 1.4. Uji Pauly : Tujuan
: Untuk mengidentifikasi asam amino (histidin) melalui reaksi pembentukan senyawa azo.
Prinsip
: Diazitozaed sulphanilic dapat bereaksi denganfenol dan imidazol, membentuk senyawa azo yang berwarna tajam. Senyawa diazonium hanya terbentuk pada keadaan dingin, karena itu semua larutan harus didinginkan dengan es sebelum diazitasi. Senyawa ini dibuat dengan mereaksikan asam sulfanitat dengan NaNO3 pada suasana
11
asam dan hanya memberikan hasil positif dengan asam amino histidin. Bahan dan Alat : Asam-asam amino : glisin, tirosin, histidin, arginin dan triptofan 1 g/l masing-masing sebanyak 1 L. Asam sulfanilat ( 10 g/l HCl 1N ), NaNO3 ( 50 g/l ) dan NaCO3 (10 g/l) masing-masing 1 L. Es Batu, Tabung reaksi, pipet, gelas ukur dan erlemenyer. Cara Kerja a.
: Siapkan larutan asam amino yang akan di identifikasi kedalam tabung reaksi masing-masing 2 mL dan dinginkan dengan es batu.
b.
Pada tabung yang lain, siapkan 1 mL larutan asam sulfanilat, campurkan dengan 1 mL HNO3. Biarkan pada keadaan dingin selama 3 menit.
c.
Ambil 5 tetes campuran asam sulfanilat dan HNO3 ( point B ) dan tambahkan kedalam masing-masing asam amino. Biarkan dalam keadaan dingin selama 3 menit. Amati.
d.
Buat keadaan menjadi alkalis dengan menambahkan 2 mL NaOH 10 M.
e.
Amati warna hasil reaksi, dan seimpulkan pengamatan anda.
Percobaan 1.5. Uji Millon : Tujuan
: Untuk mengidentifikasi asam amino yang mengandung gugus fenolik (tirosin).
Prinsip
: Bahan utama pereaksi Millon adalah larutan mencuri sulfat dalam asam sulfat 15% v/v. Pereaksi ini akan membentuk komplek berwarna bila bereaksi dengan senyawa yang mengandung radikalhidroksi-benzen. Karena itu asam-asam amino fenolik seperti tirosin dan turunnya akan memberikan reaksi positif dengan pereaksi Millon. 12
Bahan dan Alat : Asam – asam amino : Glisin, tirosin, hisditin,arginin dan triptofan 1 g/l masing-masing sebanyak 1 L. Fenol ( 1 g/l ) . . . . . . 250 mL. NaNo3 ( 50 g/l ) . . . . . . 250 mL. Pereksi Millon. Tabung reaksi, pipet, gelas ukur, erlemenyer, penjepit tabung reaksi dan penangas air. Cara Kerja
: a. Siapkan larutan asam amino yang akan diidentifikasi kedalam tabung reaksi masing-masing 3 ml dan tambahkan 1 ml NaOH 1 M. b. Tambahkan 2 tetes alfa naftol dan 4-5 tetes air brom c. Amati segera warna hasil reaksi (sebelum 2 menit) dan simpulkan hasil pengamatan anda.
13
II.
KARBOHIDRAT
Karbohidrat merupakan senyawa organik yang paling berlimpah dibumi kita, yang tersusun terutama oleh monosakarida. Unit – unit monosakarida yang merupakan polihidroksi aldehida atau polihidroksi keton bergabung membentuk polimer oligasakarida dan polisakarida dengan melepaskan air. Sebagian besar zat-zat alam merupakan golongan karbohidrat, fungsinya sebagai bahan baku ( bahan sumber energi ) baik untuk mikroorganisme, tumbuhan maupun hewan. Karbohidrat dibentuk pada tanaman tingkat tinggi dan beberapa ganggang selama fotosintesis dengan memanfaatkan cahaya matahari, bahan bakunya CO2 dan air. Karbohidrat
yang dikonsumsi
oleh
jasad
non-fotosintetik
diuraikan
menjadi
monosakarida, unit penyusun utamanya glukosa, lalu dioksidasi menjadi CO2 dan H2O, diubah menjadi monosakarida, atau disakarida lain atau disimpan sebagai cadangan makanan didalam otot atau hati dengan glikogen. Karbohidrat merupakan komponen terpenting dalam beberapa senyawa struktural seperti dinding sel tanaman, bakteri, mukopolisakarida kulit dan jaringan pengikat pada hewan. Beberapa terikat dengan molekul lain seperti protein sebagai glikoprotein atau dengan lipida sebagai glikolipida. Pada glikoprotein rantai oligo atau polisakarida terikat oleh rantai polipeptida melalui ikatan N-glikosida. Pada nitrogen amida asam amino, asparagin, atau glutamin atau melalui ikatan o-glikosida apda rantai samping atau (gugus hidroksil) OH asam amino serin dan freonin. Analisis bagian karbohidrat, molekul glikoprotein memerlukan penguraian polisakarida dari protein secara hati-hati. Biasanya dengan enzim proteolitik atau degradasi oleh alkali encer ikatan glukosida. Karbohidrat dibagi atas monosakarida (fruktosa, glukosa, manosa, galaktosa dan sebagainya). Komponen gula yang terdiri 6 atom C, disakarida (2 komponen monosakarida) olisakarida (3-6 komponen monosakarida), polisakarida ( lebih dari 6 komponen monosakarida ), ditentukan juga oleh gugus yang karakteristik sebagai aldoheksosa atau ketoheksosa. Monomer monosakarida merupakan senyawa aldosa atau ketosa yang dinamakan sesuai dengan jumlah karbon pada rantainya.
14
Polimer yang disusun oleh monosakarida sangat bervariasi, dalam ukuran (BM). Pada sakarida dapat mengandung hanya 1 jenis unit monosakarida (homopolisakarida), seperti
pati,
glikogen,
selulosa,
kitin
atau
beberapa
jenis
monosakarida
(heteropolisakarida). Mengenai struktur senyawa karbohidrat dikenal sistem terbuka dari E. Fischer, tertutup dari tollens, dan berbidang yang diproyeksikan Harworth. Pembagian selengkapnya dari karbohidrat adalah sebagai berikut : 1.
Monosakarida
: Disebut juga gula sederhana, diosa, triosa, tetrosa, pentosa
(arabinosa, xylosa, ribosa), heksosa, (glukosa, fruktosa, galaktosa, manosa). 2.
Oligosakarida
: di, tri, tetra, penta dan heksasakarida (disakarida terdiri atas :
sukrosa, maltosa, laktosa). 3.
Polisakarida
: Amilum, glikogen, dekstrin, selulosa.
Percobaan 2.1. Uji Iod : Tujuan
: Untuk menguji adanya karbohidrat dari beberapa bahan yang diuji (secara umum).
Prinsip
: Untuk membentuk kompleks adsorbsi berwarna dengan polisakarida. Pati memberi warna biru pada reaksi dengan Iod. Sedangkan glikogen dan pati terhidrolisis sebagian membentuk warna merahcoklat.
Bahan dan Alat : 1. Bahan
: Larutan Iod (5 mmol/L dalam KI 30 g/l) ........
100mL
Selulosa, glikogen, pati dan inulin (10 g/l)......... 200 mL. 2. Alat Cara Kerja
: Tabung reaksi
: 1. Masukkan larutan yang diuji (pati atau ...... ) kedalam tabung reaksi. 2. Tambahkan HCL encer, selanjutnya tambahkan lagi 2 tetes Iod.
15
3. Sebagai blangko lakukan prosedur (1) dan (2) tanpa menggunakan larutan yang di uji (diganti dengan akuades). 4. Bandingkan warna yang terjadi antara yang menggunakan larutan uji (pati atau ....... ) dengan blangko (akuades).
16
Percobaan 2.2. Uji Molissch : Tujuan
: Digunakan sebagai uji umum karbohidrat (dapat digunakan untuk menentukan semua macam karbohidrat)
Prinsip
: Asam sulfat pekat akan menghidrolisis ikatan glikosida (dari polisakarida), sehingga dihasilkan monosakarida, yang selanjutnya terjadi dehidrasi menjadi furfural dan turunannya. Prodek ini selanjutnya direaksikan dengan alfanaftol tersulfonasi yang akan menghasilkan kompleks berwarna ungu. Reaksi ini merupakan uji umum terhadap adanya karbohidrat dari senyawa organik lain yang menghasilkan fulfural bila direaksikan dengan asam sulfat. pekat.
Bahan dan Alat : 1.
Bahan
: Asam sulfat pekat, alfanol (50 g/L etanol) dibuat saat akan digunakan.
2. Cara Kerja
Alat
: Tabung reaksi, pipet tetes dan penangas air.
: 1. Siapkan 6 buah tabung reaksi, yang masing-masing diisi 2mL sari jeruk, sari nenas, sari tebu, sari ubi kayu, air cucian beras dan air (sebagai blangko). 2. Pada masing-masing tabung reaksi tersebut ditambahkan 2 tetes alfanaftol. 3. Kemudian dengan hati-hati ditambahkan pada masing-masing tabung reaksi tersebut dengan 1 mL melewati dinding dalam sehingga terbentuk dua lapisan. 4. Amati dengan seksama setiap perubahan warna pada batas kedua cairan tersebut (pada masing-masing larutan yang diuji).
17
Percobaan 2.3. Uji Seliwanof : Tujuan
: Digunakan untuk pemeriksaan adanya gugus keton pada gula (fruktosa) juga dapat digunakan untuk aldoheksosa (glukosa), tetapi reaksinya agak lambat.
Bahan dan Alat : Ketosa dapat dihidrasi lebih cepat daripada aldosa, sehingga diperoleh turunan furfural, yang selanjutnya berkondensasi dengan resorsinol membentuk kompleks berwarna merah. HCl pekat + gula + sedikit Resorsinol
4-hidroksi
metil
furfuran .......... (warna merah). Prinsip
: 1. Bahan
: Pereaksi Seliwabof 3L (0.5 g/L Resorsinol dalam 3m/L HCl), Fruktosa, Glukosa.
2. Alat Cara Kerja
: Tabung reaksi, pipet tetes dan penangas air.
: 1. Siapkan 2 buah tabung reaksi yang masing-masing diisi 2 mL pereaksi Seliwanof. 2. Pada tabung reaksi I ditambahkan 2 tetes fruktosa dan pada tabung reaksi ke II ditambahkan 2 tetes glukosa. 3. Masing-masing tabung reaksi I dan II panaskan pada penangas air mendidih selama 1 meenit. 4. Catat terbentuknya warnah merah gelap (bandingkan kecepatannya)
18
III. KARBOHIDRAT Sebagian besar zat-zat organik alam adalah golongan karbohidrat. Bila ditinjau dari strukturnya, karbohidrat merupakan derivate aldehid atau keton dari alkohol polihidris atau senyawa turunannya sebagai hidrolisanya, contoh pati dan gula yang terdapat pada tumbuh- tumbuhan. Fungsi dari karbohidrat adalah sebagai bahan baku atau bahan-bahan sumber energi, baik itu untuk tumbuh-tumbuhan maupun hewan. Pektin, selulosa, dan hemiselulosa merupakan bahan baku pembentuk organ tumbuh- tumbuhan. Disamping itu amilum (pati), sukrosa, dan fruktosa juga berasal dari tumbuh- tumbuhan, yang mana diperoleh dari hasil fotosintesis; sedangkan hasil fotosintesissendiri berasal dari bahan dasar CO2 dan H2O dengan pertolongan sinar matahari. Glikogen sendiri yang bahan penyusunnya D-glukosa merupakan bahan dan sumber energi yang terdapat pada hati dan otot hewan. Ada zat penetral racun dalam tubuh suatu organisme yang disintesis dari glukosa, zat ini disebut asam glukuronat. Asam glukuronat ini berkonjugasi dengan racun kemudian dibuang keluar melalui urine; disamping masih ada yang lain yaitu asam amino glisin.
Klasifikasi Karbohidrat 1.
Monosakarida (gula sederhana): karbohidrat yang tidak dapat dihidrolisis tanpa kehilangan sifat gulanya.
2.
Disakarida: sakar yang bila dihidrolisis menghasilkan dua monosakarida yang sama atau berbeda.
3.
Oligosakarida: sakar yang bila dihidrolisis menghasilkan 3-10 monosakarida.
4.
Polisakarida: sakar yang bila dihidrolisis menghasilkan lebih dari 10 monosakarida.
1. Monosakarida Monosakarida
merupakan
karbohidrat
yang
paling
sederhana
dan
mempunyai rasa manis. Golongan yang termasuk monosakarida ini adalah: triosa, tetrosa, pentosa, heksosa, dan heptosa. Gula ini dapat sebagai gula aldehid (aldosa) atau gula keton (ketosa).
19
a. Diosa Satu-satunya diosa yang dikenal adalah etilen glikol atau dikenal pula sebagai glikol aldehid. Diosa ini penting dalam metabolisme pentosa. b. Triosa Dikenal dua macam: • •
sebagai aldotriosa adalah D-gliseraldehida.
sebagai ketotriosa adalah dihidroksi aseton. c. Tetrosa yang terpenting di antaranya yaitu: •
•
sebagai aldotetrosa adalah eritrosa.
sebagai ketotetrosa adalah eritrulosa. d. Pentosa Yang terpenting dari pentosa adalah ribosa dan deoksiribosa. D-ribosa
terdapat pada RNA, koenzim, ATP, NAD+, NADP+, dan lain sebagainya. Sedangkan D-deoksiribosa terdapat pada DNA di dalam inti sel dan mitokondria. Pentosa yang berbentuk sebagai aldopentosa. Pentosa adalah D-arabinosa, D-silosa, dan D-liksosa. Yang berbentuk sebagai ketopentosa adalah ribulosa. e. Heksosa yang terpenting dari heksosa adalah D-glukosa, D-fruktosa, D-galaktosa, dan D- manosa. D-glukosa banyak terdapat dalam buah yang rasanya manis, juga merupakan hasil hidrolisis amilum, sukrosa, maltosa, dan laktosa. Glukosa juga terdapat dalam darah sebagai sumber energi dan bila kandungannya naik terus dapat menimbulkan kencing manis, dan bila terdapat dalam urine disebut glukonuria. Glukosa dengan rotasi yang spesifik +111º disebut α-glukosa dan sebaliknya bila mengalami pergeseran menjadi +19º disebut β-glukosa. D-fruktosa banyak terdapat pada buah-buahan, madu, atau hasil hidrolisis dari sukroa atau inulin. Dalam usus atau hepar fruktosa diubah menjadi glukosa. Demikian pula galaktosa, merupakan hasil hidrolisis laktosa. Di dalam hati diubah menjadi glukosa. Galaktosa
merupakan
bagian
penting
20
dari
glikolipid
dan
glikoprotein.
f. Heptosa Yang perlu diketahui adalah sedoheptulosa, zat ini terdapat sebagai zat antara dalam metabolisme karbohidrat.
Sifat-Sifat Monosakarida a. Sifat mereduksi dalam alkali Gugus karbonil bebas (gugus aldehid atau gugus keton) dalam larutan alkalis menjadi bentuk enol yang reaktif dan mudah dioksidasi. b. Reduksi dari gula •
Glukosa direduksi menjadi sorbital.
•
Mannosa direduksi menjadi mannital.
•
Fruktosa direduksi menjadi campuran sorbital dan mannital.
•
Galaktosa direduksi dulsital.
c. Pengaruh asam Pentosa dengan asam pekat dan pemanasan menjadi furfural, sedangkan heksosa dengan asam pekat dan pemanasan menjadi hidroksimetilfurfural. d. Pengaruh alkali Dalam larutan alkali aldosa dan tetrosa menjadi bentuk enol yang reaktif. Bentuk enol glukosa, fruktosa, dan mannosa adalah sama. Bila larutan alkalis salah satu gula didiamkan maka akan diperoleh campuran glukosa, fruktosa, dan mannosa. e. Pembentukan osazon Fenilhidrazin dengan monosakarida dan beberapa sakarida lain akan membentuk osazon, yaitu kristal kuning yang tidak larut dalam air dan bentuknya khas untuk setiap macam gula. Dengan demikian uji ini dapat dipergunakan unuk identifikasi. Osazon dari glukosa dan fruktosa adalah sama, sedangkan sukrosa tidak membentuk osazon. f. Persenyawaan dengan iodium aldosa bila dipanaskan dengan asam iodida pekat oksigennya akan dilepas, dan membentuk senyawa iodida. Sebagai contoh glukosa dengan asam iodida pekat akan membentuk iodoheksana.
21
g. Asetilasi Kemampuan gula untuk membentuk ester, misalnya asetilasi dengan asetilklorida menunjukkan adanya gugus alkohol. Jumlah gugus asil yang dapat diikat dapat digunakanuntuk menghitung banyaknya gugus alkohol. Gula dengan 5 gugus hidroksil (misalnya glukosa) akan menghasilkan penta asetat.
22
h. Oksidasi Oksidasi aldosa akan menghasilkan asam aldonat. Bila gugus aldehid tidak mengalami perubahan maka disebut asam uronat.
2. Disakarida Disakarida yang terpenting adalah sukrosa, matosa, laktosa, dan trehalosa.
Sukrosa Hidrolisis dengan asam akan menghasilkan glukosa dan fruktosa dengan jumlah seimbang yang biasa disebut gula invert. Sifat lain dari sukrosa yaitu tidak mereduksi, tidak dapat membentuk osazon, tetapi dapat difermentasikan/diragikan.
Laktosa Adanya laktosa yang terdapat pada urine wanita yang sedang menyusui disebut laktosuria. Hidrolisis dengan asam atau laktase akan menghasilkan glukosa dan galaktosa. Sifat-sifatnya dapat mereduksi, dapat membentuk osazon, tetapi tidak dapat difermentasikan. Trehalosa Terdapat pada fungi dan yeast. Trehalosa merupakan ikatan antara glukosa dengan glukosa pada ikatan 1 – 1, sehingga tidak ada lagi gugus yang mereduksi atau tidak dapat membentuk osazon. Hidrolisis trehalosa akan menghasilkan glukosa.
3. Oligosakarida kurang
begitu
penting.
Contohnya
raffinose,
bila
dihidrolisis
akan
menghasilkan glukosa, fruktosa, dan galaktosa.
4. Polisakarida polisakarida merupakan polimer monosakarida yang mempunyai bobot molekul tinggi. Sifat tidak larut dalam air, berbentuk koloid pada larutan biasa, dan tidak terasa manis. Dalam sistem digestivus ada yang dapat dicerna dan ada pula yang
23
tidak dapat dicerna, perbedaan ini sangat tergantung spesiesnya. Pemberian nama tergantung pada monosakarida penyusunnya; misalnya pentosa, nama polisakaridanya menjadi pentosan dan sebagainya.
Amilum Banyak terdapat sumber nabati yang kaya akan karbohidrat, sebagai contoh: beras, ubi kayu, jagung, dan sebagainya. Bentuk dan besar amilum tergantung spesiesnya. Amilum terdiri dari dua macam yaitu amilose dan amilopektin. Perbedaan keduanya terletak pada rantainya, yang satu lurus, lainnya bercabang; serta pada amilopektin rantainya lebih pendek. Hidrolisis amilum menggunakan asam menghasilkan glukosa, sedangkan bila menggunakan enzim menghasilkan maltosa. Dengan iod amilose memberikan warna biru, sedangkan amilopektin memberikan warna ungu. Pada saat dipanaskan warna hilang. Setelah dingin warna timbul kembali. Dengan alkali warna hilang sebab alkali mengikat iodium. Amilum tidak mereduksi dan tidak membentuk osazon. Pada saat dihidrolisis dengan enzim atau dengan asam akan terbentuk hasil antara, yaitu amilodekstrin, eritrodekstrin, akhrodekstrin, dan akhirnyamenjadi maltosa yang akhirnya menjadi glukosa setelah terpengaruh enzim maltase.
Dekstrin Dekstrin memiliki beberapa sifat, yaitu amilodekstrin dengan iodium , warna menjadi ungu, eritrodekstrin dengan iodium warna menjadi merah, sedang akhrodekstrin dengan iodium menjadi tak berubah warnanya.
Dekstran Polisakarida dengan bobot molekul 50.000 yang berhubungan erat dengan amilum dan glikogen, disintesis oleh bakteri tertentu, dan merupakan polimer dari unit D-gluko- piranosa.
24
Glikogen Glikogen merupakan polisakarida yang terdapat pada otot dan hati, serta merupakan glukosan yang rantainya bercabang dengan cabang yang lebih pendek, namun jumlah cabangnya lebih banyak. Dengan iodium berwarna merah, tidak membentuk osazon, dan dapat diendapkan dengan menjenuhkan dengan (NH4)2SO4.
Selulosa Selulosa merupakan glukosan dengan polimer rantai panjang yang terdapat pada dinding sel tumbuh-tumbuhan. Sulit larut dalam air maupun lemak dan tidak dapat dicerna, kecuali pada hewan tertentu, kelompok ruminansia, karena ada bakteri yang menghasilkan enzim untuk membongkar selulosa. Dengan iodium tidak terjadi perubahan warna.
25
Praktikum Karbohidrat 3.1. Percobaan Benedict Isi reagen Benedict 2 ml dalam tabung reaksi (setinggi 1-2 cm) ditambahkan 8 tetes larutan yang diperiksa. Panaskan dalam api langsung selama 2-3 menit. Adanya perubahan warna hijau, kuning, jingga, atau merah menunjukkan reaksi yang positif. Prinsipnya larutan- larutan tembaga yang alkalis bila direduksi oleh karbohidrat yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas akan membentuk Cupro Oksida (Cu2O) yang berwarna kuning sampai merah. Tugas Periksalah larutan yang mengandung sukrosa 1%, glukosa 1%, maltosa 1%, laktosa 1%, fruktosa 1%, dan galaktosa 1%.
4.1.
Percobaan Barfoed Isi reagen Barfoed 2 ml ke dalam tabung reaksi, tambahkan 1 ml larutan
yang diperiksa. Panaskan selama 5 menit, kemudian diamkan sebentar setelah itu ditambahkan 2-3 reagen fosfo-molibdat. Bila terjadi larutan yang berwarna biru menunjukkan reaksi positif.
Tugas: Periksalah larutan yang mengandung sukrosa 1%, glukosa 1%, maltosa 1%, laktosa 1%, fruktosa 1%, dan arabinosa 1%.
4.2.
Percobaan Tauber Larutan 4% benzidin dalam asetat glasial sebanyak 0,5 ml ditambah 1
tetes larutan pentosa. Panaskan sampai mendidih sebentar kemudian 37
didinginkan di bawah air ledeng. Kalau perlu ditambah 1 ml aquades akan terjadi warna merah anggur. Prinsipnya pentosa dengan benzidin di dalam asetat glasial akan membentuk senyawa berwarna merah anggur.
Tugas: Periksalah larutan yang mengandung glukosa 1%, fruktosa 1%, arabinosa 1%, gum arab 1%, bahan nabati 1%, dan bahan hewani 1%.
4.3.
Percobaan Bial Reagens Bial 5 ml ditambahkan 2-3 ml larutan yang akan diperiksa.
Panaskan sampai timbul gelembung gas yang akan sampai ke permukaan. Adanya warna hijau dan adanya endapan menunjukkan reaksi yang positif. Furfural yang terbentuk dari gula atau dari pentosa akan bereaksi dengan orsinol (3,5-dihidroksi toluena) membentuk senyawa berwarna kebiru- biruan karena adanya ion ferri.
Tugas: Periksalah larutan yang mengandung sukrosa 1%, laktosa 1%, glukosa 1%, arabinosa 1%, furfural 1%, gum arab 1%, bahan nabati 1%, dan bahan hewani 1%.
4.4.
Hidrolisis Selulosa Potongan-potongan kertas saring dibasahi dengan air dan secara
perlahan-lahan ditambahkan asam sulfat pekat, diaduk, dan dipanaskan setelah ditambah air secukupnya. Setelah satu jam ambilah beberapa tetes larutan tersebut dan tes dengan Benedict. Bila masih negatif panaskan kembali larutan tersebut setengah jam lagi, kemudian tes kembeli dengan Benedict. 38
4.5.
Hidrolisis Amilum Suspensi amilum 10 ml ditambah 2,5 ml 1N HCl, kemudian panaskan
pada api langsung. Setiap tiga menit tes larutan tersebut dengan tes iodium. Di samping itu larutan tetap dipanaskan. Bila tes iodium telah negatif, maka lakukanlah tes Benedict tiap 3 menit berikutnya.
4.6.
Uji Osazon Tabung reaksi diisi 0,5 ml larutan fenilhidrazin, Na-asetat kering,
kemudian tambahkan 2 ml larutan bahan percobaan dan dikocok sampai homogen. Larutan yang telah omogen tersebut terus dipanaskan pada penangas air mendidih selama 30 menit. Apabila sudah dingin maka akan kelihatan endapan berwarna kuning dan periksalah di bawah mikroskop, maka setiap bahan percobaan punya karakteristik sendiri. Prinsipnya aldosa atau ketosa dapat bereaksi dengan hidrazin akan membentuk osazon.
Tugas: Periksalah larutan yang mengandung glukosa 1%, fruktosa 1%, galaktosa 1%, laktosa 1%, maltosa 1%, sukrosa 1%, arabinosa 1%, larutan bahan nabati, dan larutan bahan hewani 1%.
39
V. L I P I D A Lemak terdiri dari ester asam lemak dan gliserin. Lemak tidak larut dalam air tetapi larut dalam eter, kloroform, bensin, tetra (CCl4) karena sebagian besar tergolong gugus lipofil. Di alam terdapat sebagai lemak yang netral dan disamping zat-zat yang menyerupai lemak (lipoid). Lipida terutama disusun atas rantai hidrokarbon panjang berantai lurus, bercabang atau membuat struktur siklis. Lipida sederhana mencakup lemak netral dan lilin. Lipida kompleks mengandung komponen non-lipida seperti posfat pada posfo lipida, protein pada proteolipida atau gula pada glukolipida. Beberapa golongan senyawa menunjukkan sifat-sifat kimiawi seperti lipida dan biasanya dijumpai terlarut atau berikatan dengan lipida. Contohnya adalah senyawasenyawa steroid dan vitamin yang larut dalam lemak, seperti karoten dan klorofil. Lipida sederhana merupakan ester gliserol dan asam lemak, juga sebagai gliserida. Triglise atau triasil gliserol merupakan molekul tidak bermuatan dan dikenal juga sebagai lipida netral, lemak atau minyak sederhana. Jenis asam lemak yang menyusunnya bervariasi. Yang umumnya dijumpai di alam berantai lurus dan memiliki jumlah atom karbon genap. Banyak mengandung ikatan rangkap atau tidak jenuh terutama asam lemak yang terdapat pada tumbuh-tumbuhan seperti asam oleat, linoleat, linolenat (asam lemak dengan 18 atom karrbon C dan 1, 2 serta 3 ikatan rangkap berturut-turut) dan arachindonat. Jenis asam lemak tersebut memiliki titik cair yang lebih rendah dibandingkan asam lemak jenuh, seperti stearat, palmitat atau laurat yang banyak dijumpai pada lemak yang berasal dari hewan. Trigliserida merupakan bagian utama lipida yang dikonsumsi. Trigliserida terurai menjadi komponen penyusunnya oleh lipase. Di dalam hati dan biji-bijian, trigliserida menjadi cadangan makanan dan sumber energi jika diperlukan.
40
Fosfolipida merupakan turunan triasil gliserol yang salah satu komponen asam lemaknya diganti oleh senyawa fosfat. Fosfolipida yang sering dijumpai dalam alam adalah lesitin, sefalin, fosfogliserida serin, fosfogliserida inositol. Golongan sterol merupakan turunan hidrosil senyawasiklo-pentanoperhidro-fenantren (steroid). Semua senyawa sterol dapat membentuk ester dengan asam lemak. Contoh sterol yang biasa dijumpai adalah kolesterol pada hewan, β-sitosterol pada tanaman tingkat tinggi dan egosterol pada golongan jamur.
Percobaan 5.1. Daya Kelarutan Lipida : Tujuan
: Untuk melihat daya kelarutan lipida dan asam-asam lemak dalam berbagai pelarut.
Prinsip
: Kelarutan, gugus-gugus utama lipida mempunyai sifat-sifat kelarutan yang berbeda dan sifat ini digunakan dalam ekstraksi dan isolasinya dari bahan biologis. Emulsi sebagian besar lipida dalam etanol 95% v/v akan tetapi
membentuk suatu emulsi butir-butir halus pada penambahan air. Hal ini mengakibatkan larutan mempunyai penampakan karakteristik seperti susu dan merupakan uji yang sangat sensitif untuk lemak. Ke dalam 3 mL air diteteskan 1-2 tetes minyak kelapa. Pada waktu dikocok terjadilah emulsi, tetapi setelah didiamkan berubah kembali pada keadaan semula sebagai campuran emulsi adalah suatu peristiwa yang mana tetesan cairan minyak terdispersi pada cairan lainnya. Garis tengah tetsan cairan tersebut terdapat antara 0.1 -1.0 mikron, jadi lebih besar daripada dalam sol. Emulsi umunya tidak stabil.
41
Masukkan 3 mL alkohol kedalam tabung reaksi, tetesan 1 atau 2 tetes minyak kelapa, dikocok dan terjadi suatu larutan tetapi jika ditambah air nya mengendap. Masukkan 3 tetes eter ke dalam tabung reaksi, tetskan 1 atau 2 tetes minyak kelapa, dikocok dan terjadi suatu larutan. Masukkan kedalam 3 mL kloroform ke dalam tabung reaksi, diteteskan 1 atau 2 tetes minyak kelapa dan terjadinya larutan. Bahan dan Alat : 1.
Bahan
:
Asam-asam lemak (butiran, stearat dan asam oleat) Lemak dan minyak (lard, butter, margarin, olive) Fosfolipida. Kolesterol. Pelarut (Aseton, alkohol, dan eter). 2.
Alat
: Tabung reaksi Kertas saring Pipet tetes Erlemenyer
Cara Kerja
: 1. Periksalah larutan lipida dan asam-asam lemak dalam air dan pelarut-pelarut diatas, catat perbedaan diantara gugus-gugus utama lipida. 2. Teteskan 1 tetes larutan lipida diatas pada kertas saring dan biarkan kering. Amati pembentukan suatu noda lemakjernih. 42
3. Masukkan 1 mL air. Tambahkan lipida yang terkenal dilarutkan dalam etanol kedalam tabung reaksi. 4. Masukkan air 3 mL ke dalam 2 tabung reaksi, tambahan 2 tetes minyak zaitun (olive) kedalam 2 tabung reaksi tersebut. Tambahkan lagi larutan lesitin ke dalam salah satu tabung reaksi, dan minyak zaitun kedalam tabung reaksi yang lain. Kocok campuran dengan baik dan bandingkan stabilitas emulsi yang terbentuk. Apa pengaruh lesitin dan mengapa.
Percobaan 5.2. Emulsi dari Lemak : Tujuan
: Untuk mengamati keadaan emulsi dari lemak dan zat yang bertindak sebagai emulgator.
Prinsip
: Jika air dan lemak dikocok akan terjadi emulsi dan ternyata tidak stabil. Sehingga akan kembali kepada keadaan semua (campuran) setelah didiamkan sejenak. Penambahan suatu zat yang ketiga yang mempunyai daya aktif permukaan (misalnya sabun). Sabun sebagai emulgator (pencegah emulsi).
Bahan dan Alat : 1. Bahan : Minyak parafin Minyak kelapa HCl encer Kolesterol Soda
43
2. Alat : Tabung reaksi dan raknya Kertas saring Pipet tetes Cara Kerja
: Digunakan empat tabung reaksi yang masing-masing berisi kurang lebih 5 mL air.
TABUNG REAKSI 1
2
3
4
(Masing-masing berisi 5 mL air) + 1 tetes Minyak Parafin +1 tetes HCl yang encer
+1 tetes Minyak kelapa + 1 tetes HCl yang encer
+ 1 tetes minyak parafin + 1 tetes soda
+ 1 tetes minyak kelapa + 1 tetes soda
Amati emulsi yang terjadi dan jelaskan keadaan masing-masing tabung reaksi.
44
VI. E N Z I M Enzim dapat diproduksi dengan cara mengekstraksi dari jaringan tanaman atau hewan dan mikroorganisme. Cara ini memiliki beberapa kelamahan, sehingga yang sering dan umum dilakukan adalah cara membiakkan mikroba penghasil enzim yang dikehendaki pada media tertentu kemudian diekstraksi. Keuntungan memproduksi enzim dari mikroba antara lain biaya produksi lebih rendah, dapat diproduksi dalam waktu singkat serta mudah dikontrol. Kecepatan produksi enzim dapat lebih ditingkatkan dengan menggunakan strain mikroba, induksi mutan dan perbaikan kondisi kultur pertumbuhan. Dalam memproduksi enzim dari mikroba perlu dipelajari beberapa hal antara lain : jenis enzim, jenis mikroba, komposisi media dsan kondisi pertumbuha mikroba terhadap aktivitas enzim yang bersangkutan. Enzim
merupakan
proteinyang
disintetis
oleh
sel
hidup
untuk
mengkatalisis reaksi yang berlangsung didalamnya. Oleh karena reaksi enzimatis sangat bervariasi, maka biokatalisator dengan spesifisitas dan efisiensi tinggi. Sebagai protein, enzim memiliki sifat-sifat umum protein, misalnya enzim akan terdenaturasi pada suhu tinggidan kondisi ekstrim lainnya, seperti terlalu tinggi atau rendahnya pH atau tekanan. Beberapa oksidator, keadaan polaritas larutan, dan tekanan osmotik yang abnormal juga dapat menghambat kerja enzim. Reaksi enzim dengan suatu subtrat yang mengikuti hukum Michaelis Menten dapat digambarkan sebagai berikut : k1 E + S
k2 ES
k2 S P E
: Subtrat : Produk : Enzim 45
E + P
Kecepatan reaksi (v) dipengaruhi oleh konsentrasi substrat (S). Km = konsentrasi subtrat pada saat V0 mencapai Vmaks. Vmaks adalah kecepatan maksimum enzim yang tercapai bila semua enzim telah diikat oleh substrat. Vmaks = k2 (E) = k2 (Eo) Km merupakan konstanta Michaelis Menten yang harganya tertentu bagi reaksi enzim dengan subtrat tertentu, dan hanya dipengaruhi oleh suhu, pH dan lingkungan fisik atau kimiawi reaksi enzimatis. Km dan Vmaks adalah parameter reaksi enzimatis yang diketahui dalam penelitian-penelitian enzim. Aktifitas spesifik enzim merupakan parameter reaksi enzim yang dapat menggambarkan daya kerja enzim yang bersangkutan. Nilainya biasanya dinyatakan sebagai kecepatan reaksi enzim per mg protein enzim. Semakin murni suatu enzim, semakin tinggi pula spesifik aktivitasnya. Spesifik aktifitas dapat juga dinyatakan dalam satuan kecepatan reaksi enzim per unit volume filtrat (cairan enzim). Prinsip-prinsip isolasi dan pemurnian enzim sama dengan prinsip isolasi dan pemurnian protein, karena enzim merupakan protein biokatalisator. Yang perlu diperhatikan secara khusus adalah adanya golongan enzim yang memiliki daya tahan pada pH, suhu atau lingkungan lain dengan kisaran yang tidak terlalu besar, sehingga pemakaian buffer dan pemilihan faktor lingkungan yang tepat penting diperhatikan.
46
Percobaan
6.1. Penambahan Enzim Papain Pada Krim Santan Kelapa dalam Menghasilkan Minyak :
Tujuan
: Untuk mengetahui pengaruh enzim papain dalam krim santan kelapa
untuk
menghasilkan
minyak,
dan
juga
untuk
mengetahui volume yang mutu dari minyak yang dihasilkan. Prinsip
: Sebagai katalisator, enzim didefenisikan sebagai suatu zat yang dapat mempercepat reaksi kimia tanpa ikut atau muncul dalam hasil reaksi. Dewasa ini penggunaan enzim telah meluas pada industri pengolahan pangan, termasuk pengolahan minyak kelapa. Enzim yang berperan dalam ekstraksi minyak kelapa adalah enzim yang menghidrolisismakro molekul karbohidrat danprotein (proteolitik). Salah satu dari enzim yang tergolong proteolitik ini adalah enzim papain, yang dapat diperoleh dari getah papaya, terutama dari buah papaya yang masih muda.
Bahan dan Alat : 1.
Bahan
:
Krim santan kelapa Getah buah pepaya Akuades Alkohol (70% dan 90%) Fenolptalien NaOH (0.1N) standar KOH (0.1N) standar 2.
Alat
:
Pemarut kelapa Neraca analistik Beker glass (1000 mL, 500 mL, 250 mL dan 100 mL) 47
Gelas ukur (50 mL dan 100 mL) Selang plastik Erlemenyer Corong Thermometer Botol inkubasi Pipet tetes Pipet takar Sentrifugasi Water Bath Kantong plastik Karet gelang Cara Kerja
: 1.
Penyediaan santan kelapa Satu kilogram kelapa parut segar ditambah dengan 1 liter akuades, kemudian diperas dan akan didapatkan santan. Santan yang diperoleh didiamkan selama 1 jam, untuk memisahkan antara krim santan dan air santan/skim krimsantan akan terdapat pada bagian atas dan skim bagian bawah, pisahkan kedua bentuk ini dengan hati-hati.
2.
Penyediaan getah buah papaya Buah pepaya muda ditoreh dengan alat tahan karat, yang terlebih dahulu diolesi atau disterilkan dengan alkohol 70% dan dipijarkan pada nyala bunsen. Getah yang keluar ditampung sesuai kebutuhan.
3.
Penambahan Getah Buah Pepaya pada Krim Santan
48
Kedalam 100 mL krim santan kelapa ditambahkan 30 mL getah buah papaya kedalam botol inkubasi. Botol-botol ini lalu diinkubasi dalam incubator pada suhu kamar. Bersihkan semua peralatan yang digunakan dan meja kerja saudara dengan alkohol 70% saat akan melakukan percobaan, dan lakukan juga perlakuan tanpa penambahan getah pepaya (sebagai kontrol). Peralatan
:
Amatilah pada masing-masing perlakuan dan kontrol apakah dihasilkan minyak? Dan amati pula lamanya waktu inkubasi yang dibutuhkan untuk menghasilkan minyak tersebut. Lakukan perbandingan terhadap parameterparameter berikut. 1.
Volume Minyak yang Dihasilkan Minyak yang dihasilkan dari masing-masing perlakuan dan kontrol dipisahkan dengan alat sentrufugasi pada putaran 3000 rpm, selama 15 menit . Hasil sentrifugasi ini berupa tiga bagian yaitu bagian atas terdiri dari minyak, bagian bawah berupa cairan yang mengandung air. Minyak yang terdapat pada bagian atas tabung sentrifugasi diukur volumenya dan pisahkan pada beker glass.
2.
Uji Organoleptik Tentukan tiga orang panelis untuk menguji mutu masing-masing contoh minyak. Panelis diminta menguji dan menilai terhadap warna, bau dan rasa dari minyak, dengan standar nilai kesukaan sebagai berikut :
3.
A. Sangat Suka
C. Tidak
B. Suka
D.
Sangat Tidak Suka
Asam Lemak Bebas (Free Fatty Acid / %FFA)
49
Timbang 28.2 + 0.2 minyak, dimasukkan kedalam erlemenyer, ditambah dengan 50 mL alcohol 95% panas dan 2 mL indicator penolptalien 1%, selanjutnya titrasi dengan larutan NaOH 0.1 N yang telah distandarkan sampai warna merah jambu tercapai, dan tidak selama 30 detik. Persentase asam lemak bebas ditentukan dengan rumus : ( Mehlenpencer, 1960 dalam Sumardji, dkk. 1981) ml NaOH x N NaOH x 28.2 %FFA =
x 100% Berat Sampel
4.
Angka Asam Timbang 20 gram minyak, masukkan dalam erlemenyer dan tambahkan dengan 50 mL alcohol 95% netral. Setelah ditutup dinginkan dengan pendingin balik, kemudian dipanaskan sampai mendidih, dan kocok kuat-kuat untuk melarutkan asam lemak bebasnya. Setelah dingin, campuran dititrasi dengan 0.1 N larutan KOH standar. Sebagai indikator gunakan penolptalien 1%. Titrasi diakhiri pada saat timbulnya warna merah muda yang tidak hilang selama 30 detik. Angka asam ditentukan dengan rumus :
mL KOH x N KOH x 56.1 Angka Asam = Gram sampel Apabila untuk titrasi digunakan larutan NaOH, maka factor 56.1 diganti menjadi 39.9. (Kataren, 1986 : Woodman, 1941 ; dan Shell et al., 1972 dalam Sudarmadji, dkk. 1981). Setelah dilakukan pengamatan dan pengujian terhadap parameterparameter diatas, bandingkanlah hasil tersebut dengan karakteristik minyak kelapa menurut SII (Standar Industri Indonesia) berikut ini : 50
Sifat – Sifat
Standar
Warna
-
Bau dan Rasa
Tidak berbau, dan tidak berasa
Angka Asam
0.5
Asam Lemak Bebas
0.3
Sumber : Rumokoi, 1988.
51
