Penentuan N-Terminal Enzim α-amilase dari Bakteri Lokal Bacillus sp. B. 148

J. Sains Tek., Desember 2004, Vol. 10, No. 3

Penentuan N-Terminal Enzim α-Amilase dari Bakteri Lokal Bacillus sp. B. 148 Yandri A.S. Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Lampung Jl. S. Brojonegoro No. 1 Bandar Lampung 35145 Abstract The objective of the research is to determine N-terminal amino acids sequence of αamylase from a local bacteria isolate, Bacillus sp B.148. The dansyl-chloride and Edman degradation methods were utilized. The activity of α-amylase was determined by Fuwa1 and Mandels2 methods, the protein content was measured by Lowry method3. The result showed that the molecular weight of α-amylase obtained from this local bacteria isolate, Bacillus sp B.148, was 67 kDa. The N-terminal amino acid residues sequence of purified enzyme are alanine-histidine-proline (Ala-His-Pro-). Keywords: α-amylase, Bacillus sp B.148. Pendahuluan Enzim α-amilase (α-1,4-glukan-4glukanohidrolase, EC 3.2.1.1) adalah enzim yang mengkatalisis penguraian pati, glikogen, dan macam-macam oligosakarida. Enzim ini sudah dikaji secara luas dari berbagai aspek, seperti struktur dan fungsi, serta penggunaan dalam industri. Umumnya enzim α-amilase mempunyai bobot molekul sekitar 50 kDa4. Sedangkan menurut Janecek & Balaz5, bobot molekul enzim α-amilase berkisar antara 45 – 60 kDa. Srivastava6 telah melakukan pemurnian pada enzim α-amilase dari B. stearothermophilus dengan menggunakan beberapa tahap pemurnian yaitu: pengendapan dengan etanol; pengendapan dengan amonium sulfat (45 – 70%); dialisis; dan kromatografi penukar ion DEAE-selulosa. Hasil penelitian menunjukkan enzim α-amilase hasil pemurnian mempunyai bobot molekul 48 kDa, suhu optimum 80°C dan pH optimum 6,9. Ivanova7, juga telah melakukan pemurnian enzim α-amilase dari B. licheniformis 44 MB 82-A dengan

 2004 FMIPA Universitas Lampung

menggunakan fase partisi PEG-dekstran, kromatografi penyaringan molekul Sephadex G-100, kromatografi penukar ion CM-Sepharosa CL-6B. Enzim αamilase hasil pemurnian memberikan satu pita pada SDS-PAGE dengan bobot molekul 58 kDa. Struktur tiga dimensi Taka amilase A dari A. oryzae8, α-amilase dari pankreas babi9, dan α-amilase asam dari Aspergillus niger10 telah diketahui. Struktur tiga dimensi dari α-amilase yang telah diketahui merupakan multi domain dengan satu rantai-polipeptida. Hingga akhir tahun 1992, hampir 50 urutan asam amino dari α-amilase telah ditentukan, tetapi hanya urutan-urutan asam amino dari Aspergillus oryzae dan enzim pankreas babi yang ditentukan secara langsung, yang lainnya ditentukan melalui urutan nukleotida. Enzim α-amilase yang dihasilkan dari bakteri lokal Bacillus sp B.148 hingga saat ini belum pernah ditentukan urutan asam aminonya. Untuk mempelajari struktur α-amilase yang dihasilkan dari

143

Yandri, A.S., Penentuan N-Terminal Enzim

bakteri lokal Bacillus sp B.148 perlu dilakukan penentuan struktur lengkap dari enzim ini. Untuk mencapai tujuan tersebut perlu dilakukan pemurnian enzim, sehingga diperoleh enzim dengan tingkat kemurnian yang tinggi. Kemurnian enzim ditunjukkan dengan data elektroforegram dan dengan penentuan urutan asam amino N terminalnya. Metode Penelitian Bahan dan Alat Enzim α-amilase yang akan digunakan untuk penentuan N terminal diperoleh dengan mengisolasi dan memurnikan dari bakteri lokal Bacillus sp B.14811. Bahan kimia yang digunakan mempunyai derajat pro analisis. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Spektrofotometer UVVisible Shimadzu; Mikropipet Socorex; Oven Memmert-Germany; Neraca analitis Sartorius-Germany; pH meter FisherCanada; Magnetic stirrer NUOVA IIUSA. Prosedur Kerja Tahapan penelitian yang akan dilakukan adalah sebagai berikut: Pemurnian enzim dan karakterisasi enzim hasil pemurnian dengan menggunakan elektoforesis SDS gel poliakrilamida, serta penentuan urutan asam amino N terminal dengan metode gabungan dansil klorida dan degradasi Edman.

merupakan pereaksi spesifik yang hanya bereaksi dengan residu asam amino terminal N suatu rantai polipeptida. Selanjutnnya dilakukan hidrolisis polipeptida menggunakan HCl 6 N untuk menghidrolisis semua residu asam amino yang menyusun protein tersebut. Residu asam amino terminal N membentuk derivat dansil asam amino yang bersifat fluoresensi sehingga dapat diidentifikasi di bawah sinar UV pada pelat kromatografi lapis tipis (KLT) poliamida dengan menggunakan pelarut sebagai berikut: pelarut pertama asam format 1,5%; pelarut kedua asam asetat : toluen (1 : 9); pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2). Penentuan residu asam amino terminal N kedua dan ketiga12 Penentuan residu asam amino terminal N kedua dan ketiga dilakukan dengan metode gabungan dansil-Edman. Dansilasi Sebanyak 1 - 5 nmol protein dilarutkan dalam NaHCO3 0,2 M. Kemudian ditambahkan 10 µL DNS-Cl (2,5 mg/mL aseton) dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. Tambahkan 50 µL HCl 6 N, tabung ditutup, selanjutnya dilakukan hidrolisis pada suhu 105°C selama 18 jam. Tutup tabung dibuka, dan sisa pereaksi dikeringkan dalam vakum yang dilengkapi zat pengering P2O5. Kemudian hasil reaksi dilarutkan dalam 5 µL etanol.

Identifikasi residu asam amino terminal N suatu polipeptida12

Kromatografi lapis tipis

Penentuan residu asam amino terminal N suatu polipeptida dilakukan dengan metode dansil. Pereaksi dansil klorida (1dimetilamino naftalen-5-sulfonil klorida),

Sebanyak 2 µL sampel (hasil dansilasi) ditotolkan pada pelat poliamida kira-kira 1 cm dari tiap sisi, dan dielusi dengan pelarut pertama. Eluen dibiarkan bergerak sampai lebih kurang 1 cm dari sisi

144



atas, kemudian dikeringkan dengan udara panas (hair dryer). Selanjutnya pelat dengan posisi tegak lurus terhadap posisi pertama dielusi dengan pelarut kedua, eluen dibiarkan bergerak sampai lebih kurang 1 cm dari sisi atas, dan dikeringkan dengan udara panas. Pelat dielusi kembali dengan pelarut ketiga, arah elusi sama dengan arah elusi kedua, dan dikeringkan dengan udara panas. Kemudian bercak dilihat di bawah sinar UV, dan dibandingkan dengan bercak standar. Degradasi Edman Sampel polipeptida dalam jumlah lebih besar (sekitar 100 nmol) didegradasi menurut cara Edman untuk menghilangkan residu asam amino ujung yang telah diidentifikasi melalui metode dansil. Urutan pengerjaan selanjutnya adalah sebagai berikut: Pada sampel polipeptida kering ditambahkan 20 µL piridin (50%), kemudian ditambahkan 100 µL 5% PITC dalam piridin, tutup tabung disemprot dengan gas N2. Campuran dicampur dengan seksama dan diinkubasi pada suhu 45°C selama 60 menit. Kemudian ditambahkan 200 µL TFA anhidrat, tutup tabung disemprot dengan N2, dan diinkubasi pada 45°C selama 30 menit. Campuran dikeringkan dengan alat vakum. Selanjutnya ditambahkan 100 µL aquadest dan dilakukan 3 kali ekstraksi dengan 1,5 mL n-butil asetat, lalu dikocok dengan seksama dan dipisahkan masing-masing dengan sentrifugasi selama 1 - 2 menit. Lapisan atas (butil asetat) dibuang dengan pipet Pasteur. Sampel dikeringkan dengan vakum. Selanjutnya sebagian dari sampel didansilasi untuk menentukan urutan residu asam amino terminal N kedua. Sampel yang lainnya digunakan untuk mengulangi prosedur degradasi Edman.pada penentuan urutan residu asam amino berikutnya.  2004 FMIPA Universitas Lampung

Hasil dan Pembahasan Uji homogenitas dan penentuan bobot molekul enzim hasil pemurnian dengan elektroforesis SDS-gel poliakrilamida Uji homogenitas dan penentuan bobot molekul enzim hasil pemurnian dilakukan dengan metode SDS gel poliakrilamida menurut Bollag et al.13, sebagai berikut: protein enzim direduksi dengan βmerkaptoetanol kemudian direaksikan dengan sodium dodesil sulfat (SDS), sehingga terbentuk kompleks proteinSDS yang bermuatan total negatif. Dengan adanya pengaruh medan listrik, protein yang bermuatan dalam gel poliakrilamida akan bergerak menuju anoda. Diperoleh elektroforegram pada Gambar 1. Gambar ini menunjukkan bahwa enzim telah homogen yang ditunjukkan dengan satu pita tunggal (lajur nomor 7 dan nomor 8). Untuk menentukan bobot molekul enzim α-amilase hasil pemurnian, dibuat grafik antara log BM terhadap mobilitas relatif protein. Mobilitas relatif (Rf) dihitung dengan rumus berikut: Rf =

La x Dp Lb x Dw

dengan: La: Panjang gel sebelum pewarnaan Lb: Panjang gel setelah penghilangan warna Dp: Jarak migrasi protein Dw: Jarak migrasi zat warna Karena panjang gel setelah pewarnaan dan setelah penghilangan warna sama maka mobilitas relatif protein (Rf) dihitung sebagai jarak migrasi protein dibagi jarak migrasi zat warna. Dengan mengalurkan logaritma bobot molekul protein standar sebagai sumbu Y terhadap mobilitas relatif sebagai sumbu X diperoleh grafik seperti pada Gambar 2.

145


α-amilase 200,0 116,3 94,4 67,0 55,4 36,5 31,0 21,5 14,4 6,0 3,5

1

2

3

4

5

6

7

8

Gambar 1. Elektroforegram SDS-gel poliakrilamida α-amilase hasil pemurnian Keterangan: Bobot molekul protein standar: miosin (200,0 kDa.), β-galaktosidase (116,3 kDa.), fosforilase b (94,4 kDa.), albumin sapi (67,0 kDa.), glutamat dehidrogenase (55,4 kDa.), laktat dehidrogenase (36,5 kDa.), karbonat anhidrase (31,0 kDa.), tripsin inhibitor (21,5 kDa.), lisozim (14,4 kDa.), aprotinin (6 kDa.), insulin B.(3,5 kDa.). Lajur nomor 1 protein standar; lajur nomor 2 ekstrak kasar enzim; lajur nomor 3 enzim hasil fraksinasi dengan amonium sulfat; lajur nomor 4 enzim hasil pemurnian dengan DEAE- selulosa; lajur nomor 5 enzim hasil pemurnian dengan CM-selulosa; lajur nomor 6, 7, dan 8 berturut-turut enzim hasil pemurnian dengan Sephadex G-100 fraksi nomor 17, 18, dan 19 2.5

α-amilase

2

Serum albumin sapi

Log BM

1,824

1.5

y = -0.0106x + 2.1093 R2 = 0.9893

Fosforilase b

Laktat dehidrogenase

Glutamat dehidrogenase

Karbonat anhidrase Tripsin inhibitor

Lisozim

1

0.5 26,88

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Mobilitas relatif (%)

Gambar 2. Grafik semi-log α-amilase hasil pemurnian dari bakteri lokal Bacillus sp. B.148

Dari grafik semi-log di atas didapatkan logaritma bobot molekul enzim tersebut sebesar 1,826, atau bobot molekul αamilase hasil pemurnian adalah 67 kDa.

146

Identifikasi residu asam amino terminal N

Hasil penentuan residu asam amino terminal N pertama dari α-amilase hasil pemurnian dapat dilihat pada Gambar 3.  2004 FMIPA Universitas Lampung


DNS-NH2

DNS-NH2

Pelarut 2

•

DNS-OH

• Pelarut 1

Pelarut 3

A A

DNS-OH

•

Pelarut 1 Gambar 3. KLT poliamida dari residu asam amino terminal N menggunakan dansil klorida. Pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat : toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2) Keterangan: A = alanin

Gambar 3 di atas menunjukkan bahwa bercak yang terbentuk setelah elusi dengan ketiga pelarut: pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat: toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2), berwarna kuning kehijauan. Berdasarkan warna dan posisi bercak pada KLT dapat diperkirakan bahwa residu asam amino terminal N pertama αH

amilase hasil pemurnian adalah alanin (sesuai dengan posisi bercak standar). Identifikasi residu asam amino terminal N kedua dan ketiga Hasil penentuan residu asam amino terminal N kedua dapat dilihat pada Gambar 4.

DNS-NH2

H DNS-NH2

DNS-OH

Pelarut 1 •

Pelarut 3

Pelarut 2

•

DNS-OH

•

Pelarut 1 Gambar 4 KLT poliamida dari residu asam amino terminal N menggunakan metode degradasi Edman dan dansil klorida. Pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat : toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2) Keterangan: H = histidin

Gambar 4. menunjukkan bahwa bercak yang terbentuk setelah elusi dengan ketiga pelarut: pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat : toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2), berwarna kuning jingga. Dari warna dan posisi bercak pada KLT dapat


diperkirakan bahwa residu asam amino terminal N kedua α-amilase hasil pemurnian adalah histidin (sesuai dengan posisi bercak standar). Penentuan residu asam amino terminal N ketiga dapat dilihat pada Gambar 5.

147


DNS-NH2

•

DNS-OH

Pelarut 1

Pelarut 3

Pelarut 2

•

P

DNS-NH2

P

DNS-OH

•

Gambar 5. KLT poliamida dari residu asam amino terminal N menggunakan metode degradasi Edman dan dansil klorida. Pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat : toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2) Keterangan: P = prolin

Gambar 5. menunjukkan bahwa bahwa bercak yang terbentuk setelah elusi dengan ketiga pelarut: pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat : toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2), berwarna kuning muda. Dari warna dan posisi bercak pada KLT dapat diperkirakan bahwa residu asam amino terminal N ketiga α-amilase hasil pemurnian adalah prolin (sesuai dengan posisi bercak standar). Dari penentuan residu asam amino terminal N menggunakan metode gabungan degradasi Edman dan dansil klorida dapat ditentukan tiga residu asam amino terminal N α-amilase hasil pemurnian yaitu: Ala-His-Pro-. Hasil ini menunjukkan enzim yang diperoleh sudah murni14. Urutan ini hampir sama dengan urutan residu asam amino terminal N α-amilase beberapa Bacillus sp. yang mempunyai urutan alanin diikuti alanin dan prolin (AAP) 15-17. Sedangkan urutan residu asam amino terminal N α-amilase beberapa Bacillus subtilis adalah leusin, treonin, dan alanin (LTA)18-20.

148

Kesimpulan Penelitian ini telah berhasil mendapatkan enzim α-amilase dari bakteri lokal Bacillus sp B.148 dengan tingkat kemurnian yang tinggi dengan bobot molekul 67 kDa. Pada penentuan urutan asam amino N terminal enzim α-amilase hasil pemurnian menunjukkan tiga residu asam amino yaitu: Ala-His-Pro-. Daftar Pustaka 1. Fuwa, H. 1954. A new method for microdetermination of amylase activity by the use of amylose as the substrate, J. Biochem. (Tokyo), 41, 583-603. 2. Mandels, M., Raymond, A., Charles, R. 1976. Measurement of saccharifying cellulase, Biotech. & Bioeng. Symp., No. 6, John Wiley & Sons Inc. 3. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. 1951. Protein measurment with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193-265. 4. Fogarty, W.M. and Kelly, C.T. 1979. Enzyme and Fermentation Biotech-



nology, Ellis Horwood Limited, West Sussex, England, pp.45-52. 5. Janecek, S. and Balaz, S. 1992. αAmylase and approaches leading to their enhanced stability, Febs Lett., 304 (1), 1-3.

6. Srivastava, R.A.K. 1987. Purification and chemical characterization of thermostable amylases produced by Bacillus stearothermophilus, Enzyme Microb. Technol., 9, 749-754. 7. Ivanova,V.N., Dobreva, E.P., Emanuilova, E.I. 1993. Purifications and characterization of a thermostable αamylase from Bacillus licheniformis, J. Biotechnol ., 28, 277-289.

sp B. 148, Prosiding Kimia Bersama ITB-UKM Keempat, Bandung, 294302. 12. Findlay, J.B.C. and Geisow, M.J. 1989. Protein Sequencing, Oxford Univ., New York, 134-144. 13. Bollag, D. M., Rozycki, M. D., Edelstein, S. J. 1996. Protein Methods 2 nd ed., John Wiley & Sons, Inc., Publication, New York, 91-93; 232274. 14. Scopes, R. K. (1994), Protein Purification 3 rd ed., Springer–Verlag, New York., 308-309.

8. Matsuura, Y., Kusunoki, M., Harada, W. and Kakudo, M.1984. Structure and possible catalytic residues of Taka-amylase A., J. Biochem., 95, 697-702.

15. Itkor P., N. Tsukagoshi, S. Udaka (1990), Nucleotide sequence of the raw-starch-digesting amylase gene from Bacillus sp. B1018 and its strong homology to the cyclodextrin glucanotransferase genes, Biochem. Biophys. Res. Commun., 166, 630636.

9. Buisson, G., Duee, E., Haser, R. and Payan, F.1987. Three dimensional structure of porcina pancreatic αamylase at 2.9 Å resolution. role of calcium in structure and activity, EMBO J., 6, 3909-3916.

16. Sidhu, G.S., Chakarbarti, T. 1996. Molecular cloning and expression of the gene encoding for thermostable alphamylase of a thermophilic bacterial isolate, EMBL/GenBank/DDBJ databases.

10. Boel, E., Brady, L., Brozozowski, A.M., Derewenda, Z., Dodson, G.G., Jensen, V.J., Petersen, S.B., Swift, H., Thim, L. and Woldike, H.F. 1990. Biochemistry, 29, 6244-6249.

11. Yandri, A.S. 2000. Isolasi, pemurnian dan karakterisasi enzim α-amilase termostabil dari bakteri lokal Bacillus


17. Sumitani, J., Tottori, T., Kawaguchi, T., Arai, M. 2002. New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. no. 195 Alpha-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading, Biochem. J., 350, 477-484. 18. Fujimoto, Z., Takase, K., Doui, N., Momma, M., Matsumoto, T. and 149


Mizuno, H. 1998. Crystal structure of a catalityc-site mutant α-amylase from Bacillus subtilis complexed with maltopentaose, J. Mol. Biol., 277, 393-407. 19. Kunst F., Ogasawara, N., Moszer, I., Albertini, A.M., G. Alloni, V. Azevedo, M. G. Bertero, Bessieres, P. et al. 1997. The complete genome sequence of the Gram-positive

150

Bacterium Bacillus subtilis, Nature, 390/6657, 249-256. 20. Ohmura, K., Yamazaki, H., Takeichi, Y., Nakayama, A., Otozai, K., Yamane, K., Yamasaki, M., Tamura, G. 1983. Nucleotide sequence of the promoter and NH2-terminal signal peptide region of Bacillus subtilis alpha-amylase gene cloned in puB110, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 678-683.


Penentuan N-Terminal Enzim α-amilase dari Bakteri Lokal Bacillus sp. B. 148

Recommend Documents