Patobiokémia Szarka András, Bánhegyi Gábor

Patobiokémia Szarka András, Bánhegyi Gábor

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Patobiokémia Szarka András, Bánhegyi Gábor Szerzői jog © 2014 Szarka András, Bánhegyi Gábor, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Tartalom Patobiokémia ..................................................................................................................................... vi ......................................................................................................................................................... vii 1. Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok .......................................................................... 1 1. 1.1. Oxidatív stressz .............................................................................................................. 1 2. 1.2. Reaktív oxigénvegyületek .............................................................................................. 1 3. 1.3. Az oxigén tartalmú gyökök termelődésének legfontosabb helyszíne, a mitokondrium . 2 4. 1.4. A lánc mely pontjain keletkezik a ROS? ........................................................................ 3 5. 1.5. Más ROS termelő folyamatok a mitokondriumban ........................................................ 6 6. 1.6. A ROS alapszintű termelődése és eliminációja .............................................................. 6 2. Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája .................................................................... 8 1. 2.1. Fontos funkcióinak felismerése, hiánybetegsége a skorbut ........................................... 8 2. 2.2. Mi áll a skorbut tüneteinek hátterében? A C-vitamin funkciói ...................................... 8 3. 2.3. A C-vitamin felszívódása, sejtmembránon keresztüli transzportja .............................. 11 4. 2.4. C-vitamin az endoplazmatikus retikulumban ............................................................... 13 5. 2.5. C-vitamin a mitokondriumban ..................................................................................... 14 6. 2.6. Vajon milyen szerepet tölthet be a C-vitamin a mitokondriumban? ............................ 15 7. 2.7. Mennyi is az annyi? ..................................................................................................... 15 3. A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek ................................................................ 17 1. 3.1. A mtDNS eredete ......................................................................................................... 17 2. 3.2. Bevezetés a mitokondriális betegségekbe .................................................................... 17 3. 3.3. Mitokondriális genetika: alapok ................................................................................... 17 4. 3.4. Az emlős mtDNS replikációja és transzkripciója ......................................................... 18 5. 3.5. Homoplazmia és heteroplazmia ................................................................................... 19 6. 3.6. A mutáns mtDNS szegregációja szomatikus szövetekben ........................................... 19 7. 3.7. A mtDNS anyai öröklésmenetének princípiumai ......................................................... 20 8. 3.8. A mtDNS betegségek klinikai sajátságai ..................................................................... 20 9. 3.9. Klasszikus mtDNS szindrómák .................................................................................... 21 10. 3.10. Klinikai szindrómák, amelyek hátterében nagy valószínűséggel mtDNS eltérés áll 21 11. 3.11. A mtDNS rendellenességek szerepe gyakori betegségekben ................................... 21 4. Mitokondrium, oxidatív stressz és öregedés ................................................................................. 23 1. 4.1. Oxidatív stressz és mitokondriális DNS ....................................................................... 23 2. 4.2. ROS-mtDNS mutáció-ROS ördögi kör? ...................................................................... 23 3. 4.3. Az mtDNS mutátor egér ............................................................................................... 24 4. 4.4. Egy váratlan fordulat: az mtDNS mutátor egér és a ROS kapcsolata .......................... 25 5. 4.5. Záró gondolatok, konklúzió ......................................................................................... 26 5. A fehérjék nem enzimes glikációja, késői glikációs végtermékek ................................................ 27 1. 5.1. AGE képződés és szerkezet .......................................................................................... 27 2. 5.2. Külsődleges AGE források ........................................................................................... 31 3. 5.3. AGE keresztkötések kialakulása .................................................................................. 31 4. 5.4. AGE és AGE receptor kapcsolat .................................................................................. 32 5. 5.5. AGE metabolizmus ...................................................................................................... 32 6. 5.6. Az AGE képződés következményei diabéteszben ........................................................ 32 7. 5.7. Az AGE képződés, mint terápiás célpont ..................................................................... 33 6. A fehérjetekeredés (folding) patobiokémiája ................................................................................ 34 1. 6.1. A fehérjeszerkezeti betegségek legnagyobb csoportja – az amiloidózisok .................. 35 1.1. 6.1.1. Az amiloidózisok formái .............................................................................. 35 1.2. 6.1.2. Szisztémás amiloidózisok ............................................................................. 35 2. 6.2. Szövetspecifikus amiloidózisok ................................................................................... 36 2.1. 6.2.1. Alzheimer betegség ..................................................................................... 36 2.2. 6.2.2. Parkinson kór ................................................................................................ 37 2.3. 6.2.3. Poliglutamin betegségek ............................................................................... 37 3. 6.3. Prion betegségek ......................................................................................................... 37 4. 6.4. Egyéb konformációs betegségek .................................................................................. 39 7. A szekréciós pálya patobiokémiája és az UPR ............................................................................. 40 1. 7.1. Fehérjeszintézis az endoplazmás retikulumon ............................................................. 40 1.1. 7.1.1. A szekréciós fehérjék minőségi ellenőrzése ................................................. 41

iii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Patobiokémia

2. 7.2. Az endoplazmás retikulum stressz ............................................................................... 3. 7.3. Jelátvitel az endoplazmás retikulum és a sejtmag között ............................................. 4. 7.4. Selejtfehérje válasz (unfolded protein response, UPR) ................................................ 5. 7.5. A szekréciós pályával összefüggő betegségek ............................................................. 8. Fehérjelebontás – a lizoszóma ...................................................................................................... 1. 8.1. A lizoszomális proteóma kialakulása ........................................................................... 2. 8.2. A lebontandó szubsztrátok felvétele ............................................................................. 2.1. 8.2.1. Extracelluláris szubsztrátok .......................................................................... 2.2. 8.2.2. Intracelluláris szubsztrátok .......................................................................... 2.3. 8.2.3. A végtermékek exportja ................................................................................ 3. 8.3. Lizoszomális betegségek .............................................................................................. 3.1. 8.3.1. A lizoszóma biogenezis zavarai .................................................................... 3.2. 8.3.2. Lizoszomális tárolási betegségek .................................................................. 4. 8.4. A lizoszomális ion- és pH homeosztázis zavarai ......................................................... 9. Proteosztázis – az ubikvitináció/proteaszóma rendszer ................................................................ 10. Felhasznált és ajánlott irodalom .................................................................................................

iv Created by XMLmind XSL-FO Converter.

41 42 42 43 45 45 46 46 46 46 47 47 47 49 50 54

Az ábrák listája 1.1. A molekuláris oxigén lépésenkénti redukciója során kialakuló reaktív oxigénvegyületek .......... 1 1.2. A Q ciklus .................................................................................................................................... 4 2.1. A kollagén hidroxilációja ............................................................................................................ 9 2.2. Az aszkorbát szerepe a prolin hidroxilációjában ....................................................................... 10 2.3. A C-vitamin (aszkorbát, DHA) plazmamembrán és intracelluláris transzport rendszerei, transzportja 11 2.4. A plazma C-vitamin koncentrációjának alakulása a C-vitamin bevitel függvényében .............. 13 3.1. A mitokondriális DNS ............................................................................................................... 18 5.1. A fehérjék nem enzimes glikációja ............................................................................................ 27 5.2. A késői glikációs termékek képződése ...................................................................................... 28 5.3. Néhány AGE vegyület szerkezete ............................................................................................. 29

v Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Patobiokémia Szarka András, Bánhegyi Gábor

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem, 2014 © Szarka András, Bánhegyi Gábor Typotex Kiadó, www.typotex.hu ISBN: 978-963-279-178-4 Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerzők nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/1-2011-0079 számú, „Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért” című projekt keretében.

vi Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Kedves Olvasó! A Patobiokémia tankönyv megírásakor két dologra törekedtünk, arra, hogy az olvasó érdeklődve lapozzon és várja a következő oldalt, élvezettel utazzon a gondolatok fonala mentén a sejtek világába. Emellett fontosnak tartottuk, hogy a tárgyalt probléma időszerű legyen és a legújabb ismereteket közvetítsük. Tekintve, hogy tankönyvünket elsősorban biomérnök M.Sc. hallgatóknak szánjuk feltételezzük, hogy az olvasó alapvető biokémiai, élettani, kórélettani és klinikai kémiai ismeretek birtokában van. Mindezen szempontokat figyelembe véve építettük fel a tankönyvet, amely így nem arra törekszik, hogy átfogó patobiokémiai ismereteket nyújtson, hanem arra, hogy néhány a szerkesztő és a szerzők által érdekesnek ítélt patobiokémiai problémával ismertesse meg az olvasót. Ennek megfelelően mondandónkat három fő, egymással összefüggésben levő problémakör köré szőttük. A tankönyv e három tartópillére az oxidatív stressz, amely területről szinte észrevétlenül váltunk a mitokondriális patobiokémiára, illetve a fehérjék megfelelő térszerkezetének kialakulása, ennek defektusai, illetve ezek megoldására irányuló (pato)biokémiai folyamatok. Ahogy említettük, a tankönyv elkészítésekor rendelkezésre álló legfrissebb irodalmi ismeretekre alapoztunk, ennek velejárója az átlagos tankönyvekhez képest jóval töményebb, szakkifejezésekkel sűrűbben átszőtt nyelvezet. Így reményeink szerint a tankönyv érdekessége mellett, segít be-, illetve átvezetni az olvasót a tudományos szakirodalom világába is, amely egy M.Sc. hallgató esetében kifejezetten kívánatos lehet. A szerzők izgalmakkal teli, élvezetes utazásra invitálják az olvasót a patobiokémia világába. Szarka András Budapest, 2013. december 19.

vii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

1. fejezet - Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok 1. 1.1. Oxidatív stressz Mit is takar az oxidatív stressz kifejezés? Egy gyűjtőfogalom: az összes olyan biológiai folyamatot így nevezzük, amely során megbomlik az oxidáns és az antioxidáns rendszer közötti egyensúly. Az oxidatív stressz leggyakoribb kiváltói a nem kellő helyen és/vagy megnövekedett mennyiségben keletkezett szabad gyökök. A szabad gyökök olyan molekulák vagy molekularészletek, amelyek párosítatlan elektront tartalmaznak a legkülső elektronhéjukon. Tekintettel arra, hogy az elektronok párképzésre hajlamosak, a magányos elektront tartalmazó molekulák nagy intenzitással keresnek más molekulákat, amelyektől elektronokat vonhatnak el. Így a szabad gyököknek nagy a reakciókészségük, könnyen és gyorsan kémiai reakcióba lépnek egymással vagy más vegyületekkel. A biológiai szempontból legfontosabb szabad gyökök az oxigén-, nitrogén- és kéncentrumú reaktív anyagok.

2. 1.2. Reaktív oxigénvegyületek Az élet paradoxona, hogy az aerob léthez nélkülözhetetlen oxigénből a sejtek a biokémiai folyamatok melléktermékeként (a víz mellett) igen káros, redukált oxigénszármazékokat hoznak létre, amelyek nagy része szabadgyök. A molekuláris oxigén alapállapotban (ez a triplet oxigén) egyáltalán nem reaktív, azonban egyik elektron spinjének átfordításával (szinglet oxigén) vagy egy elektron felvételével aktiválódhat (szuperoxid anion, O2.-). Ezt követően további egyértékű redukciókon is keresztülmehet (a sor utolsó tagja természetesen a víz) (1.1. ábra). Ezen aktiválódott oxigénszármazékokat összefoglaló néven reaktív oxigénvegyületeknek hívjuk (reactive oxygen species, ROS).

1.1. ábra - A molekuláris oxigén lépésenkénti redukciója során kialakuló reaktív oxigénvegyületek

Fontos megemlíteni, hogy ide tartozik a hidrogén-peroxid is, ami nem szabad gyök, de fémionok hatására hidroxil gyököt képez (Fenton-reakció), amely a jelenleg ismert legerősebb oxidálószer. A hidrogén-peroxid azért is különösen fontos, mert töltéssel nem rendelkezik, így a membránokon könnyedén áthatolhat, ezáltal a sejt nem képes elkülöníteni, karanténba zárni. A reaktív oxigénvegyületek képesek a legtöbb szerves vegyületet oxidálni, vagy gyököt képezni belőlük. Mindkét esetre nézzünk egy példát. Az alábbi egyenletekben (1-4) egy szerves vegyületet hidroxil gyök oxidál, majd ezen alkil gyök redukálódik fémionok, triplet oxigén vagy éppen egy másik alkil gyök által. (1) (2)

1 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok (3) (4) Az alábbi egyenletekben (5-7) pedig szintén hidroxil gyök indít el egy láncreakciót, melynek során alkilperoxidok és gyökök képződnek mindaddig, míg jelen van oxigén és oxidálható vegyület. (5) (6) (7) A fenti egyenletekből látszik a hidroxil gyök hihetetlen reaktivitása, így nem csoda, hogy a sejt számos védelmi mechanizmust fejlesztett ki, hogy elkerülje képződését. A legveszélyeztetettebb molekulák a telítetlen lipidek (ezáltal a sejtmembránok), a fehérjék és a DNS. A lipidek esetében a hidroxil gyök indítja el a reakciót, mely a telítetlen kötésnél támadva (pl.: linolénsavnál a 11-es szénatomon), egy hidrogén elvonásával vízzé alakul és egy karbon gyököt hagy hátra, melynek párosítatlan elektronja megoszlik a 9-es és 13-as szénatomok között. Ez a gyök már könnyen reagál triplet oxigénnel, amely a sejtben bőségesen megtalálható. Ennek során peroxil gyök képződik, mely további zsírsavakat oxidálhat el. Látható, hogy a hidroxil gyöknek itt szikra-szerű szerepe van, a további reakciók során már csak az alapállapotú oxigén vesz részt. Fehérjék esetén az oxidatív hatás specifikus aminosav módosulásokat, peptid fragmentációkat, keresztkötéseket, megváltozott töltéseloszlást, ezek által megváltozott funkciót eredményezhet. A legérzékenyebbek a kéntartalmú aminosavak: a hidroxil gyök a cisztein tiol csoportjáról egy hidrogén atomot elvonva tiil gyököt képez, amely ezt követően további tiil gyökökkel reagálva keresztkötéseket hozhat létre. Az oxigén a metioninra is addicionálódhat, metionin-szulfoxid származékokat eredményezve. Mindkét származék redukálható a tioredoxin és a tioredoxin oxidáz segítségével. Más oxidatív reakciók nem reverzibilisek, számos aminosav irreverzibilisen módosulhat a fehérje oxidációjakor pl. a fehérjék Fe-S centrumját a szuperoxid végérvényesen működésképtelenné teszi. Az aktivált oxigén számos sérülést okozhat a DNS-ben, pl. deléciót, pont mutációt és más letális genetikai hatásokat válthat ki. Ismert, hogy a DNS cukor és bázis része is érzékeny az oxidációra, a bázis lebomlik, az adott szál elszakadhat, valamint fehérje keresztkötések képződhetnek. A lánc szakadásának oka a cukor hidroxil gyök kiváltotta oxidációja. In vitro sem a hidrogén-peroxid, sem a szuperoxid nem okoz láncszakadást fiziológiás körülmények között, így az in vivo toxicitásuk valószínűleg a fémionok által katalizált reakciók eredménye. A hidroxil gyök támadásának másik eredménye lehet a keresztkötések kialakulása a DNS és a fehérjék közt, melynek során a timin kovalens kötést alakít ki a ciszteinnel. Az ilyen nukleoproteineket nem lehet károsodás nélkül szétválasztani. Bár a keresztkötések kialakulásának esélye egy nagyságrenddel kisebb, mint a láncszakadásé, nehezen javítható, ezáltal az ilyen módosulás könnyen letálissá válhat. A DNS egyértelműen a sejt leggyengébb pontja a reaktív oxigénvegyületekkel szemben, mivel könnyen köti a fémionokat, lehetőséget ad a Fenton-reakció lejátszódására, valamint más makromolekulákhoz képest sokkal kevesebb károsodást visel el. Ez lehet az egyik oka annak, hogy az eukarióta sejtek a DNS tartalmukat, messze a légzési redox folyamatoktól, a sejtmagba helyezték.

3. 1.3. Az oxigén tartalmú gyökök termelődésének legfontosabb helyszíne, a mitokondrium Reaktív oxigénvegyületek a sejt több pontján, organellumában és enzime által képződhetnek. Képződésükhöz jelentősebb mértékben hozzájárulnak a plazmamembrán egyes fehérjéi, mint például a NADPH oxidázok, a peroxiszóma lipid anyagcseréje, illetve változatos citoplazmatikus enzimek, mint például a ciklooxigenázok. Habár mindezek a folyamatok hozzájárulnak a teljes oxidatív terheléshez, a celluláris ROS legjelentősebb része (hozzávetőlegesen 90%-a) a mitokondriumból származik. A mitokondriális ROS termelés az oxidatív foszforiláció következménye. A folyamaté, amely a NADH, illetve a FADH2 kontrollált oxidációja során a mitokondriális membrán két oldala között proton gradienst, 2 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok potenciálkülönbséget (ΔΨ) hoz létre, majd ez a potenciálkülönbség hajtja meg az F1-F0 ATP-ázt, hogy az ADPt ATP-vé foszforilálja. A NADH-ról, illetve FADH2-ről származó elektronok a citokróm lánc (vagy más néven a respirációs elektron transzfer lánc) során számos helyen direkt módon reagálhatnak az oxigénnel, vagy más elektron akceptorral szabad gyökök képződését eredményezve. Korábban a ROS és más szabad gyökök keletkezését egyszerűen csak az elektron transzfer lánc „megcsúszásának”, vagy egyféle nem produktív mellékreakciónak tekintették. A legújabb kísérleti eredmények azonban azt valószínűsítik, hogy a mitokondriális ROS termelés fontos redox jelátviteli szerepet tölt be, illetve felvetették szerepét az öregedéssel kapcsolatos folyamatokban is. Ez utóbbival külön fejezetben foglalkozunk. Az elsősorban a TCA ciklusból érkező NADH a komplex I-nél oxidálódik. Miközben az elektronok a NADHról az első mobilis elektronszállítóra az ubikinonra kerülnek a felszabaduló energia a mitokondriális mátrixból történő protonpumpálásra fordítódik. Az ubikinon, az I-es komplex megkerülésével, a II-es komplex közvetítésével a FADH2-ről szintén kaphat elektronokat. Az ubikinol ezt követően a citokróm b-nek adja át az elektronokat a III-as komplexnél. Az elektronok a III-as komplexnél a citokróm c1-re kerülnek, miközben újfent protonok kerülnek a mátrixból a két membrán közti térbe. A citokróm c1-ről a második mobil elektronszállítóra a citokróm c-re kerülnek az elektronok. Az ily módon redukálódott citokróm c ezt követően redukálja a citokróm c oxidázban található citokróm a-t, a3-at a komplex IV-nél, amely aztán végső soron az oxigént vízzé redukálja. Ez utóbbi redox energia disszipáció szintén protonok mátrixból történő kipumpálásával jár együtt. Ily módon a respirációs elektron transzfer lánc a viszonylag stabil NADH és FADH2 redox energiáját a belső membrán két oldala között mérhető membránpotenciál különbséggé alakítja. Az elektrontranszferben történő „kisiklás” okozza a mitokondriális ROS termelést, amellyel kapcsolatban számos kérdés jogosan merülhet fel bennünk: A lánc mely pontjain keletkezik a ROS? Mi az alap ROS képződési ráta? Mi szabályozza a mitokondriális ROS termelést? Hogyan szabadul meg a mitokondrium a káros ROS-től?

4. 1.4. A lánc mely pontjain keletkezik a ROS? A jelenleg elfogadott általános nézet szerint két helyen, az I-es és a III-as komplexnél keletkezik ROS nagyobb mennyiségben, azokon a pontokon, ahol az oxigén redukciójához képest nagy elektron potenciális energiaváltozás következik be. Azok a kísérletes manipulációk, amelyek az I-es, vagy III-as komplex redox potenciálját növelik, megnövelik a ROS termelődés mértékét is. Ez alátámasztani látszik azt a vélekedést, hogy ezen komplexek redox potenciálja fontos szerepet játszik a ROS termelődésben. A mitokondriális elektron transzfer lánc kevésbé ismert elemei közé tartozik az I-es komplex. Ez a több alegységből álló komplex mintegy 46 fehérjéből áll össze és molekulatömege meghaladja az 1000 kDa-t, legalább 1 flavin mononukleotidot és 8 vas-kén csoportot tartalmaz. Mind a vas-kén csoportok, mind a flavin mononukleotid részletek potenciális ROS termelő helynek számítanak. Harmadik potenciális szuperoxid produkciós helyként az ubikinon komplex I kötőhelyét (Qi) szokták emlegetni. A komplex III esetében a Q ciklus jóval komplikáltabb történet. Ha a mitokondriális ROS termelés számszerű adatait tekintjük, akkor izolált mitokondriumokon nyert adatok alapján elmondhatjuk, hogy oxigénfogyasztásunk, mintegy 2-5%-a szuperoxid anion képződésre fordítódik és ennek a szuperoxid termelésnek mintegy 70-80%-áért a III-as komplex Q ciklusa felelős. Ezen becslések esetében azonban figyelembe kell vennünk néhány további tényt: a szuperoxid termelés sejttípus, illetve légzési állapot függő. Mindezen tényeket figyelembe véve egy jóval reálisabb jóslást kaphatunk, amely szerint fiziológiás körülmények között a szuperoxid termelés a respirációs ráta 0.1%-ának adódik. Ezek után vizsgáljuk meg alaposabban a Q-ciklust! A redukált ubikinol (miután az I-es és II-es komplexek felöl begyűjtötte az elektronokat) a Qo kötési helyére diffundál. Kötési helye a mitokondriális belső membrán citoszólhoz közeli felén található a vas-kén fehérje (Rieske fehérje) közelében. Elsőként egy elektron adódik át az ubikinolról (UQH2) a Rieske fehérjére két protont a citoplazmatikus oldalra átadva és UQ .- szemikinon gyök marad vissza a Qo helyhez kötve. A Rieske fehérje által átvett elektron továbbadódik a citokróm c1-re, majd a citokróm c-re, végül a citokróm c oxidázra. A második elektron a citoszólikus oldalhoz közel található bL hemre kerül, majd ezt követően ugyanazon fehérje bH hem csoportjára. Jelenleg azt gondoljuk, hogy az UQH 2 és az UQ a hidrofób mag egyik helyéről a másikra szabadon vándorolhat, a proton motoros erőtől függetlenül, mivel ezek a hidrofób szállító molekulák nem rendelkeznek töltéssel. Egy másik a bH közelében található kinon kötőhely, a Q i lehetővé teszi a redukált bH-ról történő egy elektronos elektron transzfert, így a UQ.- képződését. A folyamat eredménye egy Qi kötőhelyhez erősen kötött szemikinon. A Q ciklus, következő szakaszában, egy második UQH2 molekula oxidálódik a már ismertetett módon a Q o helyen. Újfent egy elektron a citokróm c1-re kerül és egy másik pedig a bL-es keresztül a bH-ra. Ezen elektron révén bekövetkezik a UQ.- UQH2-vé történő redukciója, amelyhez a két proton a mátrix oldalról származik. Az UQH 2 visszatér a fő ubikinon poolba és a Q ciklus bezárul. A Qo és a Qi ezen modell szerint nem ekvivalensek: kizárólag a Qi köti a szemikinont erősen. A


Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok Qo esetében termodinamikai és/vagy kinetikai kényszer hiányában a szemikinon mindössze csak átmenetileg létezik.

1.2. ábra - A Q ciklus


Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok


Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok Forrás: Rigoulet M, Yoboue ED, Devin A: Mitochondrial ROS Generation and Its Regulation: Mechanisms Involved in H2O2Signaling ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING 2011, 14, 459-468. A III-as komplexnél található szuperoxid generátort kicsit jobban szemügyre véve két komponens kerülhet gyanúba, hogy elektronokat ad át az oxigénnek: a szemiubikion, illetve a citokróm b. Annak érdekében, hogy megállapítsák melyikük ad át közvetlenül elektronokat a dioxigénnek, specifikus III-as komplex (elektrontranszfer) gátlókat alkalmaztak. Elektrondonorként szukcinátot használva Antimycin A jelenlétében intakt patkány mitokondriumokat myxothiazollal kezelve, amely meggátolja a Rieske vas-kén fehérje redukcióját, a szuperoxid anionok képződése elkerülhető volt. Ehhez hasonlatosan a mitokondriális citokróm c depléciója gátolta, míg az antimycin A önmagában elősegítette a szuperoxidok keletkezését. Ezen eredmények alapján, úgy tűnik, hogy minden olyan tényező, amely a szemiubikinon képződését gátolja, az gátolja a szuperoxid keletkezését is. Mindezen megfigyelések összhangban vannak azzal a vélekedéssel, amely szerint a komplex III esetében a szemiubikinon az egyetlen redukált elektronszállító, amely képes a dioxigén szuperoxiddá történő redukciójára. A Q ciklus tehát képes a mitokondriális belső membrán belső és külső felszínén is szuperoxidot generálni. A szuperoxid nem képes átjutni a membránon, így igen fontos lenne az intermembrán tér és a mátrix relatív fluxusainak ismerete. Jelenleg azonban erre a kérdésre nem tudunk választ adni.

5. 1.5. Más ROS termelő folyamatok a mitokondriumban Ahogy arról korábban említést tettünk, a respirációs elektrontranszfer lánc komplexeit tanulmányozták legrészletesebben a mitokondriális ROS termelés tekintetében. Mostanság azonban egyre gyakrabban keverednek gyanúba a mitokondriális dehidrogenázok is. Az α-ketoglutarát dehidrogenáz enzimkomplex, amely az α-ketoglutarát szukcinil-KoA-vá történő oxidációját katalizálja NADH képződése mellett a citrát körben három enzimből épül fel: α-ketoglutarát dehidrogenáz (E1), dihidrolipoamid szukcinil-transzferáz (E2) és a dihidrolipoil dehidrogenáz (Dld, LADH, E3). Emlős agy mitokondriumok esetében a komplex ROS termeléséről számoltak be. A szuperoxid képződését a Dld flavin kofaktorához kötik. Ez a megfigyelés más mitokondriális flavoenzimek esetében is felveti a ROS képzés gyanúját, mint például a piruvát dehidrogenáz, amely szintén tartalmaz Dld részegységet. A glikolízis során a citoszólban keletkezett NADH mitokondriumba juttatását szolgáló glicerol-3-foszfát inga egy citoszólikus és egy mitokondriális glicerol-3-foszfát dehidrogenázból áll. A mitokondriális forma a belső membrán külső felszínén helyezkedik el és a glicerol-3-foszfátot dihidroxi-aceton-foszfáttá oxidálja, miközben elektronokat juttat az ubikinonra. Tekintve, hogy az enzim nem rendelkezik ubikinon kötőhellyel, ami növelhetné a szemiubikinon védelmét, az enzimet egy potenciális ROS forrásként tartják számon. Jó néhány éve galamb és patkány mitokondrium esetében palmitoil-karnitint alkalmazva szubsztrátként H2O2 termelődést lehetett mérni. A hidrogén-peroxid termelődés a respirációs lánctól függetlennek bizonyult és egyértelműen a mátrix oldalon jelentkezett. A lipid anyagcsere és a ROS keletkezés között meglévő kapcsolat felderítése újabb lendületet kapott a felfedezéssel, amely szerint számos rendellenesség, mint például a diabétesz sajátja a megváltozott lipidanyagcsere, illetve oxidatív stressz. Vázizomban kimutatták, hogy az oxidatív stressz inzulinrezisztenciához vezet. A korábbi megfigyeléssel összhangban sikerült kimutatni, hogy alacsony, fiziológiás palmitoil-karnitin koncentráció mellett a vázizmokban szignifikáns mértékű ROS keletkezik, amelynek meglehetősen csekély hatása van a mitokondriális membránpotenciálra.

6. 1.6. A ROS alapszintű termelődése és eliminációja Az irodalom nem egységes azzal a kérdéssel kapcsolatban, hogy milyen mértékben keletkezik az alap mitokondriális oxigénfogyasztás során ROS. Ez nem meglepő, hisz a tanulmányok meglehetősen nagy része izolált mitokondriumokon készül, amelyekben a redox alkotók közel sem fiziológiás állapotban találhatóak, így a redox potenciál értékük is módosult, valamint a reverz elektronáram sem zárható ki (ami tekintélyes mértékű ROS képződést generálhat). Mindezen megfigyelések alapján azt valószínűsítették, hogy a teljes oxigénfogyasztás, mintegy 2%-a fordítódik ROS termelődésére. A korábban említett mesterséges vizsgálati körülményekből fakadó limitáló tényezők ellenére ezt az értéket igen széles körben idézték és alapul vették. Később, a fiziológiás körülményeket sokkal inkább megközelítő körülmények között elvégzett vizsgálatok a korábbi értéket egy nagyságrenddel 0.2%-ra csökkentették. Ez az alacsonyabb érték természetesen nem azt


Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok jelenti, hogy az alap ROS szint jelentéktelen, mindössze csak annyit, hogy a mitokondriális ROS termelés a legtöbb szövet esetében nem annyira súlyos mértékű, mint azt korábban gondoltuk. Ahogy arról még szót ejtünk, a szuperoxid diszmutáz (SOD) felfedezése kulcsszerepet játszott a mitokondriális ROS és H2O2 termelődés megértése szempontjából. A sejtben két intracelluláris SOD fordul elő: SOD2, egy mangán-függő enzim a mátrixban, illetve a SOD1, egy réztartalmú enzim elsősorban a citoszólban. Mindkét enzim a szuperoxidot (O2-) alakítja H2O2-dá, amelyet ezt követően a kataláz hatástalanít. Ez utóbbi folyamat során víz és oxigén keletkezik. A kataláz mellett fontos megemlítenünk a glutation peroxidázokat, amelyek szintén a H2O2 vízzé alakításában játszanak fontos szerepet. Sőt a mitokondriumban a kataláz hiányában a glutation peroxidázok játszanak igen fontos szerepet. A szuperoxid, amely nem kerül azon nyomban hatástalanításra közvetlenül reagálhat az oxidált citokróm c-vel vagy a citokróm c oxidázzal. A mátrix azon tulajdonságát, amely szerint képes egész nagymértékű ROS terheléssel is megbirkózni jól demonstrálta 1 mM mátrix NADH NAD+-dá és 2 ROS-sá történő rapid fotooxidációja. Ez a rendkívül hatékony ROS eltávolító rendszer azt valószínűsíti, hogy a mitokondriumból felszabaduló és így mérhető ROS mindössze csak igen csekély hányada lehet az ott keletkező teljes ROS mennyiségnek.


2. fejezet - Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája Az enzimes antioxidánsokon kívül számos kis molsúlyú molekuláról gondoljuk, hogy antioxidáns tulajdonsággal rendelkezik. Ezek között találunk olyanokat, amelyeket szervezetünk képes előállítani, mint például a bilirubint, a liponsavat, az ubikinont, vagy a húgysavat, másokat pedig a táplálékkal kell felvennünk, mint például az E-, vagy a C-vitamint. Természetesen ez a felsorolás sem lehet teljes, ennyi különböző molekulával pedig nem tudunk jelen tankönyv keretében foglalkozni, ezért kiválasztottunk egyet, a sok közül, amellyel egy kicsit bensőségesebb viszonyt teremtünk. Választásunk, talán nem is oly meglepő módon, a Cvitaminra esett. Valószínűleg nincs még egy ilyen molekula, amelyet ennyi legenda övezne és ennyire erős kötelékek kötnének a magyar (pato)biokémia múltjához és jelenéhez.

1. 2.1. Fontos funkcióinak felismerése, hiánybetegsége a skorbut Hiánybetegségét, a skorbutot már az egyiptomiak is leírták, a figyelem középpontjába a XV-XVIII század között a nagy felfedezések idején került, amikor a tengerészek rettegett betegsége lett. A skorbut legjellemzőbb tünetei, melyek patobiokémiai hátterével a későbbiekben foglalkozni fogunk a fragilis erek, fogvesztés, lassú sebgyógyulás, már bezáródott sebek újra kinyílása, csontfájdalmak, csontleépülés, szívelégtelenség, enyhébb hiány esetében, gyengeség, légúti fertőző betegségek kialakulása. A skorbutról és lehetséges kezelési módjáról az első komoly tudományos munkát „A treatise of the scurvy” címmel James Lind közölte 1753-ban. Dr. Lind a Salisbury hajó orvosaként, a hasonló állapotú skorbutos betegeket csoportokra osztotta, majd mindegyik csoportnak különböző diétát írt elő (kontroll csoport, vitriol, ecet, tenger víz, narancs-citrom, szerecsendió). Az első ismert kontrollcsoportos kísérlet eredményeként megállapította, hogy a skorbut leghatásosabb ellenszere a citrusdiéta. Majd kétszáz év telt el mire kiderült, hogy a James Lind narancsaiban található „skorbut ellenes faktor” egy hat szénatomos cukorszármazék, az aszkorbinsav. Az aszkorbinsavat marha mellékveséből, narancsból és káposztából elsőként Szent-Györgyi Albert izolálta 1928-ban. Kezdetben egy mellékvesehormonnak vélte és rendkívül csodálkozott, hogy az növényekben is előfordul, ezért kezdetben az „ignose” (csuda tudja) és „godnose” (Isten tudja) elnevezéseket javasolta, majd a skorbut ellenes hatásra utalva, az újonnan felfedezett anyag szerkezetének felderítőjével, Walter N Haworth-tel együtt az aszkorbinsav elnevezés mellett döntöttek.

2. 2.2. Mi áll a skorbut tüneteinek hátterében? A Cvitamin funkciói Az aszkorbinsav az emlős sejtekben legalább 8 enzim kofaktora. Ezek közül vitathatatlanul a legismertebb a proli- és lizil-hidroxiláz, amelyek fontos szerepet töltenek be a kollagén bioszintézisben. A prolil- és aszparaginil-hidroxiláz pedig az O2 érzékelésben. Az említett enzimek mindegyike aktív helyükön vasat tartalmaz. Az aszkorbinsav hiányában szintetizált kollagén nem kellő mértékben hidroxilált és így nem formál megfelelő szálakat, ennek következménye a kötőszöveti elégtelenség, a lassú sebgyógyulás, a fragilis erek. Állapotos nők esetében a nem megfelelő kollagén szintézis a magzatburok korai repedését is okozhatja. A réz tartalmú enzim, a dopamin-β-hidroxiláz szintén aszkorbátot igényel. A szóban forgó enzim, felelős a dopamin noradrenalin átalakulásért. Nem megfelelő működése okozhatja a skorbutban tapasztalható hangulatváltozást, letargiát. A zsírsav anyagcseréjében kulcsszerepet játszó karnitin bioszintézise során két enzim nélkülözhetetlen kofaktora az aszkorbát, így hiányában a karnitin bioszintézis is hiányt szenved, amely következménye az elégtelen zsírsavoxidáció, amely csökkent mértékű oxidatív foszforilációhoz, ATP hiányhoz vezet. Így ez utóbbi következménye lehet a skorbutban tapasztalható gyengeség, fáradtság. További aszkorbátot igénylő enzimek vesznek részt a tirozin anyagcserében, illetve a peptid hormonok stabilitásához szükséges amid csoportok hormonmolekulákra juttatásában. Itt meg kell álljunk egy szóra! A bevezetőben említett legendák közül szeretnénk kettőt kiválasztani és egy kicsit részletesebben foglalkozni velük. Az első ilyen legenda az aszkorbinsav kollagén hidroxilációban betöltött szerepe. Ahogy láttuk a legtöbb skorbut tünet hátterében az elégtelen kollagén hidroxilációból fakadó kötőszöveti rendellenesség áll.


Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája Az emberi testhőmérsékleten végbementő termostabil tripla helikális kollagén szerkezethez elengedhetetlen a prolin és lizin oldalláncok hidroxilációja. A prolin hidroxilációja -X-Pro-Gly- tripleteknél következik be, a reakciót a kollagén prolil 4-hidroxiláz katalizálja. Az enzim az endoplazmás retikulum lumenében található, 2oxoglutarátot (α-ketoglutarátot), oxigént, ferro vasat és aszkorbátot igényel működéséhez (2.1. ábra). A kollagénben található lizin hidroxilációja a X-Lys-Gly részleteknél következik be. A folyamatot a lizil 5hidroxiláz katalizálja, amely a prolil 4-hidroxilázhoz hasonlóan kofaktorként 2-oxoglutarátot, ferro vasat és oxigént igényel. A lizil 5-hidroxiláz szintén az endolpazmás retikulum lumenében található homodimer formában.

2.1. ábra - A kollagén hidroxilációja

Ebből fakad az első legenda, amely szerint a hidroxilációhoz aszkorbát szükséges. A valóság azonban az, hogy a hidroxiláció maga nem igényli az aszkorbát jelenlétét. A hidroxilázok két folyamatban játszanak szerepet: az egyikben az oldalláncok hidroxilálódnak, míg a 2-oxoglutarát dekarboxilálódik és molekuláris oxigén fogy (2.2. ábra). A molekuláris oxigén atomjai a hidroxil csoportba, illetve a szukcinát újonnan képződő karboxil csoportjába épülnek be. Ez a reakció aszkorbát-független. A hidroxilázok által katalizált másik reakció a 2oxoglutarát dekarboxilezése, amely a hidroxilációtól függetlenül zajlik, de szintén molekuláris oxigént igényel azonban aszkorbát-függő (2.2. ábra). Ez esetben, a ferro vas oxidálódik (ferri vassá) és a fehérje mindaddig inaktív marad, amíg a ferri vasat az aszkorbát vissza nem redukálja ferro vassá. Habár ez utóbbi reakcióarány meglehetősen alacsony (1-4%), de még a (hidroxilálandó) szubsztrátfehérjék telítési koncentrációja mellett is lejátszódik, így az aszkorbát elengedhetetlen az oxidált enzim újraaktiválásához. A lizil hidroxiláció esetében az aszkorbátot helyettesíteni tudták DTT-vel és ciszteinnel, igaz jóval kisebb reakció rátával. Az aszkorbinsav


Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája funkciónak tárgyalásakor a hidroxilációban betöltött szerepét követően egészen biztos antioxidáns szerepköre következik, ha nem ez kerül elsőként tárgyalásra.

2.2. ábra - Az aszkorbát szerepe a prolin hidroxilációjában

Antioxidáns sajátságok: Az aszkorbát talán legismertebb kémiai sajátsága, hogy redukálószerként képes viselkedni. Erre kiváló példát szolgáltat, hogy a duodénumban a ferri (III) vasat ferro (II) vassá redukálja, így elősegítve a vas felvételét, a korábban már említett módon a lizil-, aszparaginil- és prolil-hidroxázokat aktív formában tartja azáltal, hogy az aktív centrumban található vas iont ferro vassá redukálja. Ha megnézzük az aszkorbát redox potenciálját (DHA/AFR: -0,17 V, AFR/aszkorbát: 0,28 V), megállapíthatjuk, hogy képes az olyan reaktív vegyületek, mint a hidroxil gyök (OH., H+/ H2O: 2,31 V), és a szuperoxid anion (O2.-, 2H+/H2O2: 0,94), vagy az urát gyök (HU.-, H+/UH2-:0,59 V) redukciójára. Az aszkorbát egy elektron átadásával (donálásával) szemidehidroaszkorbáttá, vagy más néven aszkorbil gyökké (AFR), ami további oxidációval dehidroaszkorbáttá (DHA) alakul. Az aszkorbil gyök nem túlságosan reaktív, mivel sem igazán oxidáló, sem igazán redukáló sajátságokkal nem rendelkezik és a molekuláris oxigén szuperoxiddá történő redukciójára sem képes lényeges mértékben (ha egyáltalán reakcióba lép vele). Az aszkorbil gyök gyenge reaktivitása adja az aszkorbát antioxidáns sajátságának esszenciáját: a reaktív vegyületek reakcióba lépnek az aszkorbáttal és egy jóval kisebb mértékben reaktív vegyület az aszkorbil gyök képződik.

Az aszkorbil gyök lassú diszproporcionálódáson mehet keresztül, amely révén az aszkorbát egy része regenerálódhat.

A DHA vizes oldatban igen instabil és a lakton gyűrű felnyílásával diketo-gulonáttá alakul. Az aszkorbát vizes oldatban pH=7.4-en stabil, hacsak nincsenek átmeneti fém ionok az oldatban, amelyek az aszkorbát igen gyors oxidációját katalizálják. A réz sók igen kiváló katalizátorok, így ha C-vitaminban gazdag táplálékot szeretnénk enni, rézedényben ne tároljuk, vagy készítsük el a zöldségeket. A réz és a vas az aszkorbát igen gyors oxidációját váltják ki, amely során H2O2 és .OH keletkezik. Az irodalomban számos helyen előforduló beszámolókat, amelyek szerint az aszkorbát károsítja a DNS-t, illetve különféle állati, köztük tumor sejteket minden bizonnyal a médiumban található átmenetifémek kiváltotta ROS képződése okozza.


Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája Itt az ideje, hogy a másik ködbe vesző aszkorbát legendával foglalkozzunk! A molekula megismerését követően viszonylag gyorsan fellángoltak a viták, hogy milyen mennyiségben érdemes fogyasztanunk. A skorbut kialakulása már 10 mg/nap bevitelével elkerülhető, a napi ajánlott bevitel Magyarországon jelenleg 60 mg/nap, terápiás céllal azonban akár néhány ezer mg/nap aszkorbátot is a szervezetbe szoktak juttatni. Tekintve, hogy a C-vitamin vízoldható molekula kizárólag különböző membránba ágyazott transzporterek segítségével juthat el a sejtekbe, sejtorganellumokba. A következőkben a különböző C-vitamin transzportereket kívánjuk áttekinteni, továbbá a transzporterek kinetikai tulajdonságai alapján gyakorlati érvényű becslést adni az ésszerű aszkorbát bevitelről.

3. 2.3. A C-vitamin felszívódása, sejtmembránon keresztüli transzportja A C-vitamin szükségletünket természetes források és étrend kiegészítők fogyasztásából fedezzük. A C-vitamin, étrendben található leggyakoribb formája, az L-aszkorbinsav és annak oxidált formája, az Ldehidroaszkorbinsav (DHA). Luminális oldali (kefeszegélyű) membrán vezikulum transzportaktivitása alapján megállapíthatjuk, hogy az aszkorbát és a DHA egyaránt felszívódik az emberi bélrendszer teljes hosszában. Mind az aszkorbát, mind a DHA felvétel, növekvő szubsztrát koncentráció hatására telíthetőnek bizonyult. Mindezen megfigyelések nagy affinitású ligand-transzporter kölcsönhatásra utalnak. A redukált forma, az L-aszkorbinsav felvétele aktív mechanizmus során valósul meg, két nátrium-függő Cvitamin transzporter (SVCT1 és SVCT2) segítségével (2.3. ábra), amelyek klónozása először 1999-ben valósult meg. Az SVCT1 egy nagy kapacitású, de kis affinitású (Km: 65-237 μM) aszkorbát transzporter. Előfordulása igen kifejezett az epitheliális szövetekben, ahol funkcióját, a szervezet C-vitamin homeosztázisának fenntartását, a táplálékkal bevitt aszkorbát felszívása, illetve a vesékben a visszaszívás révén fejti ki. Az SVCT1 transzporter gén kiütése 7-10-szeresére emelte a C-vitamin vizeletbe történő ürítésének mértékét. Ezzel párhuzamosan a Cvitamin vérszintje 50-70%-kal csökkent homozigóta mutánsok esetén a vadtípusú társakhoz képest. Az SVCT2 egy kis kapacitású, nagy affinitású (Km: 8-62 μM) transzporter. Az intracelluláris redox státusz fenntartása érdekében széles körben fejeződik ki, az aktív anyagcserét folytató és specializált sejtekben, szövetekben. Az SVCT2 génkiütött mutánsokkal végzett kísérletek alapján az SVCT2 elengedhetetlen a prenatális aszkorbinsav transzportfolyamatokhoz. Fontos szerepet tölt be a C-vitamin placentán keresztül történő transzportjában. A homozigóta génkiütött mutánsokat légzési elégtelenség és intracerebralis haemorrhagia jellemezte. A human jejunum luminális oldali membránjának DHA felvételi karakterisztikája egyértelműen különbözött az aszkorbát felvételétől. A DHA felvétele kis affinitású (Km ≈ 0,8 mM) nátrium-független facilitált diffúzióval valósul meg (2.3. ábra). A glukóz gátolta az aszkorbát felvételét, de a DHA felvételt nem. Ugyanakkor a transzport gátlási profil kizárta az SGLT1 (nátrium-függő glukóz transzporter) szerepét az aszkorbát transzportban. A bélcsatornából történő DHA felszívódásért felelős transzporter fehérjét a mai napig sem sikerült azonosítani.

2.3. ábra - A C-vitamin (aszkorbát, DHA) plazmamembrán és intracelluláris transzport rendszerei, transzportja


Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája

A C-vitamin plazma koncentrációja orális bevitel esetén igen feszes szabályozás alatt áll. Ennek következtében növekvő orális dózisok mellett a C-vitamin plazma koncentrációja egy telítési értékhez tart (2.4. ábra). Ennek két fő oka van: egyrészt, ahogyan arról már az előző bekezdésben szó volt, a transzporter fehérjék kapacitása korlátozott, másrészt pedig a két nátrium-függő transzporter aktivitását, a saját ligandja (az aszkorbát) finomra hangolja. A béllumen megemelkedett aszkorbát koncentrációja az SVCT1 mRNS szintjének csökkenését eredményezte enterocitákban. Az aszkorbát hasonló szabályozó szerepéről számoltak be SVCT2 esetén vérlemezkékben is. A közelmúltban derült ki, hogy a vázizom sejtek az SVCT2 transzporter expresszióját redox-állapotuk függvényében szabályozzák. Az SVCT2 mRNS és fehérje szintje egyaránt megemelkedett myotubulusok hidrogén-peroxiddal történt kezelését követően, ugyanakkor liponsavas antioxidáns kezelés hatására expressziója csökkent. Valószínűnek tűnik tehát, hogy a sejt redox állapota befolyásolja az SVCT2 expresszióját, ily módon az aszkorbát transzport és az intracelluláris koncentráció befolyásolásával reagálni képes a változó körülményekre. A C-vitamin plazmakoncentrációját nemcsak a felszívódás, de a vesében, az SVCT1 által történő visszaszívás is befolyásolja. Ennek megfelelően a biológiai hasznosíthatósága alacsonyabb dózisoknál majdnem teljes és a dózis növekedtével csökken: 30 mg esetén 87%, 100 mg esetén 80%, 200 mg esetén 72%, 500 mg esetén 63% és 1250 mg esetén kevesebb, mint 50%. Ezt a megfigyelést alátámasztotta a C-vitamin 3-kompartimentum farmakokinetikai modellje is. A modell alapján egyszeri 3 g-os orális dózis – a maximális tolerálható egyszeri dózis – 206 µmol/l csúcs plazmakoncentrációt eredményez, ehhez képest az 1,25 g-os dózis ettől csekély mértékben különböző 187µmol/l-es plazmakoncentrációt eredményez. Végezetül 200 mg esetén – amely mennyiség egy C-vitaminban gazdag táplálék elfogyasztásából származik – a koncentrációcsúcs 90 μmol/l körül várható. A DHA és a glukóz között fennálló szerkezeti hasonlóság miatt, már korán felmerült a glukóz transzporterek lehetséges szerepe a DHA sejtbe történő felvételében. S valóban Xenopus oocita expressziós modellrendszerben igazolták a GLUT1, GLUT3 és esetlegesen a GLUT4 részvételét a plazmamembránon keresztüli DHA felvételben (2.3. ábra). A DHA felvételét a szerkezeti analóg 2-deoxi-glukózzal, illetve a facilitált hexóz transzport gátló cytochalasin B gátolta. A látszólagos Km értékek (GLUT1: 1.1 mM, GLUT3: 1.7 mM, for GLUT4: 0.98 mM) az SVCT transzporterekénél kisebb affinitású transzportfolyamatokról tanúskodnak. A gyors intracelluláris DHA redukció egyfelől tekintélyes DHA gradiens fenntartását eredményezi, másfelől egy olyan vegyületet, amely nem szubsztrátja a GLUT transzportereknek. A DHA formában, GLUT transzportereken 12 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája keresztül, sejtekbe jutó C-vitamin mennyiségét mindazonáltal rendkívül nehéz megítélni, nehéz, mert normális fiziológiás körülmények között a glukóz jelentős kompetáló partnerként szerepel, ez a kompetíció a magasabb vércukorszinttel járó diabéteszben természetesen még fokozottabb mértékben jelentkezhet. Érdemes megemlíteni, hogy a vitamin a plazmában elsősorban redukált formában található, ami szintén az SVCT transzporterek hangsúlyosabb transzport szerepét húzza alá. Ugyanakkor fontos megjegyeznünk, hogy a humán diéta a redukált aszkorbát mellett, jelentős mennyiségben DHA-t is tartalmaz, illetve jelentős mennyiségben keletkezik a gasztrointesztinális traktus lumenében az aszkorbát oxidánsokkal történő reakciójában. Ezen kívül a DHA extracelluláris koncentrációja jelentős mértékű növekedést mutat olyan patológiás állapotokban, mint például a gyulladás. Igen valószínű, hogy ilyen és hasonló állapotokban a lokális prooxidáns produkció fokozza az aszkorbát, DHA átalakulást, mely révén előtérbe kerül a glukóz transzportereken keresztül történő C-vitamin transzport is.

2.4. ábra - A plazma C-vitamin koncentrációjának alakulása a C-vitamin bevitel függvényében

Forrás: Levine M, Conry-Cantilena C, Wang Y, Welch RW, Washko PW, Dhariwal KR, Park JB, Lazarev A, Graumlich JF, King J, Cantilena LR.: Vitamin C pharmacokinetics in healthy volunteers: evidence for a recommended dietary allowance. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996, 93, 3704-3709. A transzporterek telíthetősége, illetve a redox státusz redukált irányba történő eltolódása (amely szükségszerűen bekövetkezik magas C-vitamin dózisok esetén) következtében fellépő SVCT transzportfehérje szupresszió miatt az orális adagolás révén elérhető plazmakoncentráció erősen korlátos. Gyakorlatilag 200-400 mg/nap orális dózis esetén (itt érdemes megjegyezni, hogy a jelenlegi napi ajánlott bevitel mindössze 60 mg/nap) elérjük a telítési (80 μM körüli) plazmakoncentrációt (2.4. ábra). Ennél magasabb plazmakoncentrációt intravénás aszkorbát adagolással lehetséges elérni, ahol az intesztinális korlátok megszűnnek, kizárólag a vesén keresztüli ürüléssel kell komolyan számolnunk. Ezt a módszert alkalmazzák terápiás aszkorbát plazmakoncentráció elérésére.

4. 2.4. C-vitamin az endoplazmatikus retikulumban 13 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája Az aszkorbát intracelluláris importját követően további kompartmentalizáción megy keresztül. Az endomembrán-rendszerhez kötött aszkorbát termelő és felhasználó útvonalak, valamint a fehérje hidroxilációban és luminális reaktív oxigénvegyület képződés eliminálásban betöltött szerepe miatt, korán az érdeklődés homlokterébe került az endoplazmatikus retikulumba (ER) történő aszkorbát és DHA transzport. Patkánymáj endoplazmatikus retikulum eredetű mikroszómán végzett kísérletek alapján az aszkorbát vezikuláris felvétele preferáltan DHA formájában történik GLUT-típusú transzportfehérjéken keresztül, majd a lumenben visszaredukálódik aszkorbáttá (2.3. ábra). Az ER lumenben az aszkorbát több hidroxiláz kofaktora (prolin- és lizin-hidroxiláz), valamint itt történik az ERasszociált L-gulonolakton-oxidáz által katalizált aszkorbát bioszintézis utolsó lépése is az arra képes állati fajokban. Mindemellett az aszkorbát jelenlétét antioxidáns sajátsága nélkülözhetetlenné teszik az itt lejátszódó reaktív oxigénvegyület termeléssel járó folyamatok, mint például a fehérjefolding. Ahogy már említettük a lumenben lejátszódó hidroxiláció nagy szerepet kap a szekrécióra kerülő kollagén termostabil triplahelikális szerkezetének kialakításában. A prolin hidroxilációja a kollagén-prolin-4-hidroxiláz (C-P4H) által katalizált reakcióban X-Pro-Gly tripletmotívumokon történik. A folyamat zavartalan lejátszódásához az enzim 2-oxoglutarát, oxigén, Fe2+ és aszkorbát kofaktorokat igényel. A C-P4H szerkezete α2β2 heterotetramer, amelynek β-alegysége a fehérjefolding folyamatában kiemelt szereppel bíró PDI (Protein Diszulfid Izomeráz). A lizin hidroxilációja a homodimer lizin-5-hidroxiláz (L5H) katalizálta reakció során X-Lys-Gly motívumokon történik. A folyamat zavartalan lejátszódásához az enzim kofaktorigénye megegyezik a C-P4H-val. Számos patológiás, a kötőszövetet érintő betegség köthető a L5H-t kódoló génekhez. Az L5H-1 izoformát kódoló PLOD1 gén mutációja kyphoscoliosis (Ehlers-Danlos Szindróma VI-os típus, EDS VI) kialakulásával jár, míg az L5H-2 izoforma PLOD2 mutációja a Bruck 2-es szindrómával hozható összefüggésbe, amelyben a lizin oldalláncok csökkent mértékű hidroxilációja figyelhető meg. A fent említett hidroxilációs reakciók csökkent aszkorbát mennyiség mellett alulműködnek, és patológiás esetekhez vezetnek. A skorbut kialakulása az aszkorbinsav hiánybetegsége, amely egy részről a kollagén struktúrfehérje csökkent mértékű hidroxiláltságából fakadó stabilitási problémáknak tudható be, másrészről pedig a fáradékonyság és a depresszió az aszkorbinsav-függő metabolitok (mint pl. a karnitin, dopamin) bioszintézisének hiányából fakad.

5. 2.5. C-vitamin a mitokondriumban Habár a mitokondriális aszkorbát/dehidroaszkorbát transzport megléte több mint 30 éve ismert, mégis számos részlet csak a közelmúltban vált ismertté. Szarka András és Bánhegyi Gábor 2004-ben tett megfigyelését, mely szerint a C-vitamin dehidroaszkorbát formában kerül a mitokondriumba egy évvel később Golde és munkatársai humán vese sejtkultúra eredetű mitokondriumok esetén is megerősítették. Sztereoszelektív, a dehidroaszkorbát transzporttal kompetáló mitokondriális D-glukóz felvételt tudtunk megfigyelni. Az in silico tanulmányokkal összhangban, a GLUT1 transzporter mitokondriális jelenlétét (2.3. ábra) alátámasztották a GFP és az immunoblot vizsgálatok is. A GLUT1 kizárólagos mitokondriális C-vitamin transzporter hegemóniáját Lee és munkatársainak 2010-es megfigyelése törte meg, mely szerint az aorta simaizom sejtek, illetve inzulin-stimulálta adipociták mitokondriumaiban jelentős mértékű GLUT10 kifejeződés figyelhető meg. A külsődlegesen kifejezett GLUT10 fokozni tudta a mitokondriumba belépő jelölt dehidroaszkorbát mennyiségét, ezzel párhuzamosan csökkent a hidrogén-peroxid kezelt simaizom sejtekben mérhető reaktív oxigénvegyületek mennyisége is. Ez a védőhatás adipociták esetében fokozható volt inzulinkezeléssel, illetve felfüggeszthető volt glukóz előkezeléssel, vagy GLUT10 mRNS interferenciával simaizom sejtekben. Egészen az idei évig úgy gondoltuk, hogy a C-vitamin kizárólagosan dehidroaszkorbát formájában képes a mitokondriális belső membránon átjutni. A redukált forma, az aszkorbát akkumulációja nem volt igazolható sem humán vese, sem patkány májszövet eredetű mitokondriumok esetében. Egy, a közelmúltban megjelent tanulmány azonban nátriumfüggő SVCT2 transzporter expresszióról számolt be U937 humán mieloid leukémia sejtek mitokondriumaiban (2.3. ábra). Ez a megfigyelés arra utalhat, hogy a redukált forma, az aszkorbinsav is képes a mitokondriális belső membránon történő átjutásra. Természetesen ezen transzportmechanizmus általános meglétének és relevanciájának bizonyításához további független kísérletes eredmények szükségesek.


Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája A különböző GLUT izoformák által a mitokondriumba transzportált dehidroaszkorbát meglehetősen instabil molekula, továbbá antioxidáns tulajdonságokkal kizárólag az aszkorbát rendelkezik, így a mátrixba jutott, vagy ott keletkezett, dehidroaszkorbátnak vissza kell redukálódnia aszkorbáttá, különben fiziológiás körülmények között perceken belül elveszik az instabil lakton gyűrű felnyílása miatt. A patkány májszövet eredetű mitokondrium preparátumhoz adott dehidroaszkorbát a mitokondriumba transzportálódva, ott aszkorbáttá alakulva millimolos nagyságrendű koncentrációt ért el. Az intramitokondriális aszkorbát reciklálással kapcsolatban több mechanizmus is elképzelhetőnek látszik. A mitokondrium képes alfa-lipoinsav függő módon aszkorbáttá redukálni a dehidroaszkorbátot. Szelénium deficiens patkányokból származó mitokondriumokon végzett kísérletek alapján a tioredoxin reduktáz, ha kis mértékben is, de szerepet vállal az aszkorbát mitokondriumon belüli reciklálásában. A dehidroaszkorbát adagolásra megfigyelhető nagyfokú glutation szint csökkenés, illetve a glutation depléció hatására jelentős mértékben visszaeső dehidroaszkorbát redukció alapján valószínűsíthető, hogy a glutation függő aszkorbát redukció emlős mitokondriumban a fő dehidroaszkorbát redukciós útvonalak egyike lehet. A mitokondriális elektrontranszport lánc szubsztrátjait, illetve inhibitorait használva sikerült bebizonyítani az elektrontranszfer lánc szerepét a mitokondriális dehidroaszkorbát redukcióban. A redukció legvalószínűbb helye a mitokondriális komplex III.

6. 2.6. Vajon milyen szerepet tölthet be a C-vitamin a mitokondriumban? A kérdés megválaszolása során figyelembe kell vennünk, hogy az itt működő légzési elektrontranszport lánc miatt a mitokondrium a sejt legjelentősebb reaktív oxigénvegyület termelő organelluma. A megemelkedett reaktív oxigénvegyület szint a mitokondriális membránpotenciál összeomlását idézheti elő, amely aztán apoptózishoz vezethet. Hidrogén-peroxiddal kezelt HL-60-as sejtek esetében a mitokondriális membránpotenciál részleges megőrzését, a mitokondriális citokróm c felszabadulását el lehetett kerülni a sejtek dehidroaszkorbáttal történő előkezelésével. Az előző esethez hasonlóan dehidroaszkorbát előkezeléssel elkerülhető volt a mitokondriális membránpotenciál zsugorodása és a következményes programozott sejthalál FAS kiváltotta apoptózisban monociták esetében, illetve humán endothel sejtekben hipoxia-reperfúzió hatására. Mindezen megfigyelések azt valószínűsítik, hogy a mitokondriális C-vitamin jelentős mértékben hozzájárul a mitokondriális membrán potenciál megőrzéséhez. A C-vitamin anti-apoptotikus hatását minden bizonnyal reaktív oxigén vegyület fogó sajátságán keresztül fejti ki. Egy ma általánosan elfogadott elképzelés szerint az örökítő anyag (membránnal elhatárolt, védett) sejtmagba telepítése, a DNS állomány védelme miatt történt. A humán sejtek (ahogyan minden eukarióta sejt) a sejtmagon kívül is rendelkeznek DNS-sel. Az extranukleáris örökítő anyag, a mitokondriumban található (utalva, annak egykori önálló prokarióta létformájára). A mitokondriális DNS (mtDNS) így ugyancsak kitett az ott képződött, erősen mutagén reaktív oxigénvegyületeknek. Így nem meglepő, hogy az aszkorbát egyértelműen védelmet nyújtott a mtDNS-ben a 8-oxo-dG (egy DNS oxidációs származék) és az apurinidációs/apiriminidációs helyek mennyiségének felszaporodása ellen. Ezen megfigyelésekhez hasonlatosan jelentős mértékben csökkenteni lehetett retina pigment epithelium sejtek esetében a hidrogén-peroxid kiváltotta mtDNS léziókat.

7. 2.7. Mennyi is az annyi? Mind a mai napig nehéz tisztán látni, egyik legfontosabb vitaminunk, a C-vitamin optimális adagolásával kapcsolatban. A plazmamembrán és az intracelluláris membránokban található C-vitamin (aszkorbát és DHA) transzporterek és transzportfolyamatok középpontba állításával szerettünk volna tisztább képet festeni. A transzporterek telíthetősége, illetve redox regulációja miatt, a manapság oly sokszor és a mindennapi élet számos területén hallott, C-vitamin megadózisban történő orális adagolása erősen megkérdőjelezhető. Ugyanakkor, azt is tisztán kell látnunk, hogy a napi ajánlott bevitel (60 mg/nap) a transzporterek telíthetőségétől igencsak messze eső, alacsony érték. Amennyiben kizárólag a transzporterek karakterisztikáját vesszük alapul, ettől jelentősen magasabb napi bevitel (200-400 mg/nap) lenne indokolt. Természetesen ez csak egyféle megközelítés, nem foglalkoztunk a C-vitamin anyagcserével fiziológiás, illetve patológiás körülmények között, és a megadózisban történő adagolás esetleges vesekárosító hatásaival. Az optimális vitaminmennyiség meghatározásához ezen igen fontos tényezők semmiképpen sem elhanyagolhatóak. Végezetül, de semmiképpen sem utolsó sorban, meg kell említenünk az egyes emberek között fennálló


Több mint antioxidáns – a C-vitamin patobiokémiája genetikai, illetve életmódbeli, élethelybeli különbségeket, amelyek jelentős mértékben módosíthatják napi Cvitamin igényüket.


3. fejezet - A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek Mindkét korábbi fejezetben láttuk, hogy a mitokondrium központi szerepet játszik az energia előállítás, a redox háztartás, illetve a sejthalál folyamatában. Pontosan ezen fontos szerepe miatt egyre nagyobb figyelem irányul erre a sejtszervecskére, azonban a mitokondriális DNS, illetve az annak eltéréseiből fakadó patobiokémiai folyamatok ez idáig méltatlanul kevés figyelmet kaptak, a következő két fejezetben ezt a hiányt szeretnénk bepótolni.

1. 3.1. A mtDNS eredete A mitokondriális oxidatív foszforilációs rendszer és a teljes mitokondriális proteom egyik különleges sajátsága, hogy egyes elemeit a nukleáris genom (nDNS), míg másokat a mitokondriális genom (mtDNS) kódolja. A mitokondrium az α-protobaktériummal ápol rokonságot. Az eukarióta sejtek úgy 2 milliárd évvel ezelőtt jelentek meg feltehetően az α-protobaktériumok és archaebaktériumok fúziójával. Feltehetően mind a mai napig zajlik a mtDNS fragmentumainak nukleuszba történő áthelyeződése és az evolúció során ily módon került át számos respirációs lánc elem génje a sejtmagba. Az eddig vizsgálat alá vont különböző eredetű mtDNS-ek közös sajátsága volt, hogy a citokróm b és a citokróm c oxidáz I-es alegységének génje minden esetben a mtDNS-ben maradt. Vajon mi lehet ennek az oka? Egyes vélekedések szerint ezen gének terméke túlságosan is hidrofób ahhoz, hogy gond nélkül a mitokondriumba szállítódjék abban az esetben, ha a nukleuszba helyeződne a génje. A hozzávetőlegesen 750-1000 fehérjéből álló élesztő mitokondriális proteom mintegy 25%-a felelős a mtDNS fenntartásáért, illetve kifejeződéséért. Ez azt jelenti, hogy nagyjából 200-250 magban kódolt fehérje szükségeltetik egy maréknyi mtDNS által kódolt fehérje kifejezéséhez. Egyelőre nem teljesen világos, hogy miért is maradhatott fenn az evolúció során egy ilyen rendkívül „gazdaságtalan” felállás, ha mindössze csak annyi áll a háttérben, hogy néhány géntermék a kelleténél nagyobb fokú hidrofóbicitást mutat. Egy érdekes alternatív hipotézis szerint a mtDNS fennmaradásának hátterében regulációs okok állhatnak, mely szerint az oxidációs foszforilációs rendszer biogenezise igényli a respirációs elektrontranszfer lánc alegységeinek és a mtDNS direkt kapcsolatát.

2. 3.2. Bevezetés a mitokondriális betegségekbe Ahogy láttuk a mitokondriumot érintő rendellenességek fakadhatnak a magban kódolt, de mitokondriumba irányított fehérjék, illetve a mitokondriumban kódolt, mitokondriumban lokalizálódott fehérjék eltéréséből. Jelen fejezetben kizárólag a mtDNS defektusaival és azok következményeként kialakult betegségekkel foglalkozunk. A mitokondriális genom vizsgálhatóságának egyre könnyebbé válása, valamint a humán konszenzus szekvencia elérhetővé válása hozzájárultak ahhoz, hogy kiderüljön egyre több genetikai betegség hátterében valamilyen mtDNS rendellenesség áll. Meglehetősen nehéz megjósolni a mtDNS betegségek tényleges prevalenciáját, mivel igen változatos klinikai kép formájában jelennek meg és rendkívül sokféle kiváltó mutáció állhat a hátterükben. Az egyik gyakori pont mutáció (3243A>G) finn populáció körében való előfordulásáról vannak adatok, amelyek azt mutatják, hogy hozzávetőlegesen minden 6000 emberből 1 érintett, ugyanakkor a brit populációra vonatkozó becslések azt mutatják, hogy minden 3500 emberből 1 szenved mtDNS betegségben, vagy esélyes, hogy kifejlődjön benne. Igen fontos megemlítenünk, hogy egyre nagyobb annak a valószínűsége, hogy az életünk során szerzett mtDNS mutációknak és mitokondriális diszfunkciónak szerepe lehet az öregedésben (lásd ezen jegyzet erről szóló fejezetét) és az öregedéssel kapcsolatos megbetegedésekben, mint például a diabéteszben.

3. 3.3. Mitokondriális genetika: alapok Minden sejtmaggal rendelkező sejtben megtaláljuk a mitokondriumokat, ahol az oxidatív foszforiláció révén a celluláris ATP fő előállítói. Az oxidatív foszforilációs apparátus magában foglalja a respirációs elektrontranszfer láncot (I-IV komplex) és az ATP-szintázt (V komplex). A sejten belül egyedül a mitokondrium tartalmaz extrakromoszómális DNS-t (természetesen növényekben a mitokondriumon kívül a kloroplaszt is, most ezzel nem foglalkozunk részletesebben). A mitokondriumok tehát duális nDNS és mtDNS kontroll alatt állnak. A mitokondriális genom egy több kópiában jelen lévő cirkuláris kettősszálú DNS molekula, amely az emberekben 17 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek 16569 bp hosszú. A mtDNS az oxidatív foszforilációs apparátus 13 nélkülözhetetlen polipeptid láncát és a kifejezésükhöz szükséges 2 rRNS-t, illetve 22 tRNS-t kódolja (3.1. ábra). A többi respirációs lánc fehérjealegység a mtDNS fenntartásáért felelős fehérjékkel egyetemben a sejtmagban kódoltak és citoplazmatikus riboszómákon transzlálódnak, majd szignálszekvenciájuk alapján kerülnek szortírozásra és transzportra az organellum megfelelő helyére. A mitokondriális genetika szinte minden aspektusában eltér a mendeli genetikától. Gondoljunk csak az uniparentális (egyszülős) öröklésre, vagy arra, hogy egy sejten belül számtalan kópiában fordul elő a mitokondriális genom. Ezen főbb jellegzetességekre és patobiokémiai jelentőségükre mind szeretnénk kitérni a következőkben.

3.1. ábra - A mitokondriális DNS

Forrás: Larsson NG: Somatic Mitochondrial DNA Mutations in Mammalian Aging Annu. Rev. Biochem. 2010, 79, 683–706

4. 3.4. Az emlős mtDNS replikációja és transzkripciója A kétszálú cirkuláris mtDNS asszimetrikusan tartalmazza a guanin és citozin nukleotidokat, így egy nehéz (H) és egy könnyű (L) lánc jön létre (3.1. ábra). Az mtDNS transzkripciója policisztronos és egy-egy fő promóteren indul meg mindkét láncon: a könnyű lánc promóteren (light strand promóter, LSP) és a nehéz lánc promóteren (heavy strand promoter, HSP) (3.1. ábra). Az alapvető transzkripciós gépezet három fehérje együtteséből áll és teljes mértékben sikerült in vitro rekonstruálni: a mitokondriális RNS polimerázból (POLRMT), a mitokondriális transzkripciós faktor B2-ből (TFB2M) és a mitokondriális transzkripciós faktor A-ból (TFAM). Érdekes módon a POLRMT legközelebbi rokona a bakteriofág RNS polimerázok és egy meglehetősen nagyméretű N-terminális toldalékot visel, amelynek valószínűleg a transzkripció transzlációhoz kapcsolásában van szerepe.


A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek A TFB2M nélkülözhetetlen a transzkripció során, mivel a POLRMT iniciációhoz szükséges katalitikus helyének egyik alkotója. A TFAM pedig azon túl, hogy az egyik transzkripciós faktor, az mtDNS egyik csomagoló fehérjéje, beburkolja és nukleotidszerű kompakt formába hozza a mitokondriális DNS-t. Jelenleg emlős sejtkultúrán és szöveteken nyert adatok alapján úgy gondoljuk, hogy 15-20 bp-onként található egy TFAM kópia és szinte biztosra vehető, hogy a teljes mtDNS molekulát beburkolja. Egy ilyen mtDNS nukleoid 100 nm átmérőjű és egyetlen mtDNS kópiát tartalmaz. Az ily módon csomagolt mtDNS jelentős része a mátrixban található, vagy lazán kötődik a belső membrán mátrix felőli oldalához. A mtDNS replikációja szintén nem nélkülözheti a POLRMT-t, amely a rövid RNS primer megszintetizálásáért felelős, mind a könnyű, mind a nehéz lánc replikációs origójánál (O L, OH). A mtDNS replikációjához szükséges repliszómának minimálisan tartalmaznia kell a mtDNS polimerázt (POLG), a csillogó helikázt (nevét az érdekes elszórt lokalizációja után kapta, a mikroszkópos képen megjelölve úgy ragyog, mint megannyi ragyogó csillag az égbolton), és a mitokondriális egyszálú-DNS kötő fehérjét. A PLOG atomi szerkezetét felderítették és kiderült, hogy egy alegység POLG A alegységet és két POLG B alegységet tartalmaz. A mtDNS replikáció mechanizmusa a közelmúltban fellángolt intenzív viták tárgya. Szerkezeti és biokémiai vizsgálatok alapján úgy gondoltuk, hogy a mtDNS replikációja a szál-kiszorításos modell alapján zajlik. A modell értelmében a vezető (nehéz) szál replikációja történik meg elsőként, amely a rövid nem kódoló, regulációs szakasz (D-loop) OH pontjánál indul meg. Amikor a vezető szál replikációja a genom 2/3 részén már lezajlott, akkor indul meg a késlekedő (könnyű) lánc replikációja az O L pontnál. Így a könnyű lánc szintézise gond nélkül végbemehet az ellenkező irányba. A közelmúltban kétdimenziós gélelektroforézissel nyert eredmények alapján azonban elkezdték ezt a modellt vitatni és a jóval konvencionálisabb vezető-szál, követőszál koordinált modellt preferálják. A vitát tovább fokozta egy harmadik D-loop origójú modell felvetése. A 13 mtDNS által kódolt oxidatív foszforilációban szerepet játszó fehérje mitokondriális riboszómákon íródik át. A mitokondriális tRNS-ben és rRNS-ben bekövetkező mutációk patológiás következményekkel járnak, hiszen a mitokondriális transzláció megszakadásához vezethetnek.

5. 3.5. Homoplazmia és heteroplazmia Patogén mtDNS mutációt első ízben 1988-ban írtak le. A patogén mtDNS mutációt hordozó betegek igen gyakran a vad típusú és a mutáns mtDNS molekulák keverékével rendelkeznek, ezt az állapotot heteroplazmiának nevezzük (ezzel analóg módon a megegyező mtDNS-t hordozó sejtek, szövetek esetében homoplazmiáról beszélünk). A mutációs terhelés ugyanazon család tagjai között igen jelentős eltérést mutathat, ahogyan ugyanazon szövet különböző sejtjei is igen eltérő mutációs érintettséget mutathatnak. Ezen egyenlőtlen mtDNS mutációs eloszlás az érintett szöveteken belül mozaikos respirációs lánc deficienciához vezet. Heteroplazmia esetén egy bizonyos mutációs arány, küszöb mutációs arány felett jelentkeznek a betegségre jellemző klinikai tünetek, illetve a jellegzetes biokémiai eltérések.

6. 3.6. A mutáns mtDNS szegregációja szomatikus szövetekben A heteroplazmikus mtDNS mutációk szomatikus szövetekben megfigyelhető mitotikus szegregációja, illetve a mtDNS anyai ágon történő öröklése az emlős mitokondriális genetika sarokkövei. Sajnos fontosságuk ellenére még jelenleg is kevéssé ismertek sejtbiológiai szinten. Természetesen az alapvető összefüggések már feltárásra kerültek. A mtDNS replikációja nem kötött a sejtciklushoz, egy sejtosztódás során egy adott mtDNS molekula akár többször is replikálódhat, de az is előfordulhat, hogy egyszer sem. Ez a replikációs módozat lehetővé teszi, hogy a sejtosztódások során egy adott mutáció klonálisan expandáljon, vagy teljesen eltűnjön. A mtDNS turnovere az egyes szövetekben nem ismert pontosan, patkány agyszövetben 14 napos fél-életidőről számoltak be. Tehát a mtDNS, igen valószínűleg, minden egyes szövetben folyamatosan replikálódik, amely poszt-mitotikus sejtek esetében is lehetővé teszi az mtDNS mutációk szegregálódását. Ahogy azt már korábban megjegyeztük a heteroplazmikus mtDNS mutációk csak akkor váltanak ki respirációs lánc diszfunkciót, ha az egy adott küszöbértéket meghalad. A küszöbérték pedig a mutáció és az érintett szövet típusától függ. Jelenleg teljesen elfogadott az a vélekedés, hogy a patogén mtDNS mutációk szegregációja nagymértékben random folyamat. A mitokondriumok egy dinamikus hálózatot alkotnak, amely folyamatos fúzión és hasadáson megy keresztül. Ez a folyamat biztosítja, hogy az adott sejt mitokondriális hálózatának géntermék tartalma folyamatosan 19 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek keveredjék. A folyamat a fennmaradás feltétele, mivel a fúzió blokkolása a mtDNS elvesztését okozta. A respirációs lánc deficiencia a mitokondriális hálózat fragmentációjához vezetet sejtvonalak illetve egér szövetek esetében. A mitokondriumok minőségi kontrolljában felvetődött az autofagocitózis szerepe, amely például az eritrocita differenciáció során végzi a mitokondriumok eltávolítását. Emlős sejtvonalakon nyert információk azt mutatták, hogy a Parkin, ami egy E3-ubikvitin ligáz mutálódott fiatal kórban megjelenő Parkinson kórban. A Parkin áthelyeződik a sérült funkciójú mitokondriumokba, hogy elősegítse azok autofagocitózissal történő degradációját. Természetesen itt meg kell jegyeznünk, hogy ezen mitokondriális minőségi kontroll létezéséről szóló bizonyítékokat fokozott Parkin expresszióra bírt transzformáns sejtekből nyerték, amelyek ráadásul igen drasztikus mitokondriális toxinkezelést kaptak. Így ezek a valóságos körülményektől merőben eltérő kondíciókkal rendelkeztek. Ezt figyelembe véve különösen érdekes, hogy mitokondriális betegséggel rendelkező pácienseknek gyakran rendelkeznek romló respirációs lánc funkcióval és az idő előrehaladtával akkumulálódó mtDNS mutációkkal, amely megkérdőjelezi a felvetett mitokondriális minőségi kontroll hatásosságát. A közeljövőben különösen fontos lenne a sejtvonalak esetében megfigyelt minőségi kontroll gyakorlati megerősítése.

7. 3.7. A mtDNS anyai öröklésmenetének princípiumai Az emlős mtDNS anyai öröklésmenetét közel 40 éve fedezték fel. Igen nagy meglepetést okozott, amikor 30 évvel ezelőtt kiderült, hogy az mtDNS genotípusa néhány generáció alatt szinte teljes mértékű változáson mehet át. A kísérleti állatokon leírt rapid szegregációs jelenséget számos patogén heteroplazmikus mtDNS mutációt hordozó humán család esetében is megerősítették. Ezt a szegregációs jelenséget a női ivarsejtek esetében tapasztalható üvegnyak (bottleneck) mechanizmusnak tulajdonítják, amely során az ivari őssejtek mtDNS kópiáinak mindössze igen kis része kerül át a petesejtekbe. Az egér csíra(ivar)sejtvonalon keresztüli mtDNS mutáció átadás nem neutrális, hanem egy meglehetősen jelentős mértékű tisztító szelekciót mutat a káros mtDNS mutációk kiszűrése érdekében. Az öregedéssel foglalkozó fejezetben is említésre kerülő mtDNS mutátor egér a POLG egy hibajavító enzimaktivitásban sérült változatát fejezi ki, amely a szerzett mtDNS mutációk számának jelentős mértékű felhalmozódásához vezet. Ezen mtDNS mutátor egerekben keletkezett, láthatóan random pont mutációk anyai átadása erős szelekciót mutat, mely során az aminosav cserével járó mutációk nagyrészt kiszelektálódnak, míg a tRNS, vagy rRNS géneket érintő mutációk nagyobb toleranciában részesülnek. Érdekes módon a mtDNS mutátor egér leszármazottjaiban megjelenő mutációs spektrum nagyfokú hasonlóságot mutat a humán populációban természetesen előforduló mutációs spektrumhoz. Mindez azt sugallja, hogy az emberekben természetes módon megjelenő mtDNS mutációs spektrum hátterében mtDNS replikációs hibák állhatnak, amelyek az anyai csíravonal tisztító szelekcióján átestek. Ezen tisztító szelekciós folyamat molekuláris hátteréről jelenleg semmiféle információval sem rendelkezünk. Elméletileg egy ilyen szelekciós folyamat több különböző szinten jelenhet meg. A mtDNS szintjén meglehetősen nehéz elképzelni, mivel ez a replikáció blokkolásával, vagy mtDNS megsemmisítésével járna, anélkül, hogy a mutáns géntermék bármiféle funkcionális teszt alá esne. Sokkal inkább elképzelhető egy organellum szintjén zajló funkcionális mtDNS teszt. Egy ilyen jellegű vizsgálat magába foglalhatja a petesejt fejlődésének bizonyos szakaszai alatt bekövetkező mitokondriális hálózat fragmentációt, így lehetővé téve, egyes (individuális) mtDNS molekulák kifejeződését és az ezt követőegyetlen mitokondriumot érintő funkcionális respirációs lánc funkció kiolvasást. Az is elképzelhető, hogy a csírasejtek (ivarsejtek) érése során versengés alakul ki az egyes sejtek között és az mtDNS mutációval rendelkezők hátrányba kerülnek, vagy apoptotizálnak. A tRNS-t, illetve az rRNS-t kódoló gének mutációi jóval nagyobb eséllyel túlélik a tisztogatási folyamatot, mint az aminosav cserét előidéző mutációk, ami összhangban van azzal a megfigyeléssel, mely szerint a humán mtDNS-t érintő patogén mutációk legnagyobb részt a tRNS géneket érintik, annak ellenére, hogy mindösszesen a mitokondriális genom ~9%-át foglalják el. Az üvegnyak mechanizmus elképzelhető, hogy a tisztogató szelekciós folyamathoz kapcsolódik, de az sem kizárt, hogy egy független védő folyamat. Természetesen az sem zárható ki, hogy a mtDNS kópiaszámának leszabályozása és a mitokondriális hálózat fragmentációja elősegíti a női ivarsejtekben zajló tisztogató szelekciós folyamatot. Az üvegnyak mechanizmus azonban szintén megakadályozhatja a kisszámú, de veszélyes mtDNS mutáció anyaágon történő elterjedését.

8. 3.8. A mtDNS betegségek klinikai sajátságai Mitokondrium minden sejtmaggal rendelkező sejtben megtalálható, így nem meglepő, hogy az mtDNS betegségek számos szövettípust érintenek és a klinikai megjelenési formái is igen változatosak. A klasszikus mtDNS szindrómák valamelyikében szenvedő betegek esetében a klinikai sajátságok jellegzetesek és a klinikai diagnózis is meglehetősen egyértelmű. Számos esetben azonban a klinikai tünetek nem igazán specifikusak és a


A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek mtDNS betegség csak egy a számtalan lehetséges diagnózis közül. Ezekben az esetekben a mitokondriumra mutató fontos diagnosztikai vezérfonal lehet az anyai ágú családi érintettség, illetve többféle szövettípus érintettsége. A betegek egy jelentős részének esetében a diagnózist többféle vizsgálat alapján lehet felállítani, ilyenek lehetnek a hisztokémiai, biokémiai vizsgálatok, melyek során meghatározzák a respirációs lánc defektus pontos természetét. A mitokondriális genom vizsgálata, amely során első körben a gyakori mutációkra keresnek, majd a teljes mitokondriális genom szekvenálását is elvégezhetik ritka, vagy új mutációk fellelése végett. Itt azonban meg kell jegyeznünk, hogy ez diagnosztikai szempontból nem mindig célravezető, mivel a mitokondriális genom igen variábilis és az új szekvencia változatok interpretálása a patogenicitás szempontjából igen nehézkes lehet. Az mtDNS betegség akkurátus diagnosztizálása azonban a beteget és a családtagjait érintő súlyos következmények miatt szükségszerű.

9. 3.9. Klasszikus mtDNS szindrómák Ahogy azt korábban már megjegyeztük, az első humán mitokondriális defektust 1988-ban írták le és két szindróma a Kearns–Sayre szindróma (KSS) és a Léber-féle öröklött optikus neuropátia (Leber Hereditary Optic Neuropathy; LHON) tanulmányozása vezetett el hozzá. A KSS-ban egyedülálló nagy-méretű (általában sporadikus) mtDNS mutációkat, valamint egyértelmű mitokondriális szerkezeti és citokémiai abnormalitásokat találtak a betegekből származó izom biopsziákban. A LHON esetében a szigorú anyai öröklésmenet egyértelmű volt és az ND (NADH dehidrogenáz) géncsaládot (az I-es komplex alegységeit kódoló) érintő pont mutációkat írtak le. 1988 óta számos mitokondriális genomot érintő mutációt írtak le és társítottak különböző megbetegedésekhez. A mitokondriális betegségek az ATP szintézis csökkenésével járnak együtt, így elsősorban a nagy energiaigényű szöveteket érinti, mint például az agy-, szívizom-, vázizomszövetek.

10. 3.10. Klinikai szindrómák, amelyek hátterében nagy valószínűséggel mtDNS eltérés áll Az elmúlt 1-2 évtizedben számos olyan klinikai szindrómát ismertünk meg, amelyek mtDNS mutációkkal hozhatók összefüggésbe. A mtDNS és különböző betegségek közötti összefüggések megerősödésében és egyre gyakoribb felismerésében részben szerepet játszhat viszonylag könnyű szekvenálhatósága, habár az egyes báziscserék patogenicitásának azonosítása nehézségekbe ütközhet. Ezen betegségekre jó példa a progresszív külsődleges szemizombénulás, a Pearson és a Leigh szindróma, a mozgás kiváltotta izomfájdalom, a fáradtság és rabdomiolízis, illetve az amino-glikozid kiváltotta halláskárosodás. Ezek közül néhány esetben, mint például a progresszív külsődleges oftalmoplégia esetében a mtDNS betegség a legvalószínűbb ok, azonban más esetekben, mint például a Leigh szindróma esetében is igen hosszú a lehetséges genetikai okok listája.

11. 3.11. A mtDNS rendellenességek szerepe gyakori betegségekben A klinikusok számára a legnagyobb nehézséget az jelenti, hogy a mtDNS betegséggel rendelkezők ritkán mutatnak klasszikus fenotípust, tüneteket és a mtDNS-sel kapcsolatos problémák számos gyakori klinikai szindróma differenciáldiagnosztikájában megjelenik. Erre igen jó példát szolgáltat a leggyakoribb anyagcsere betegség, a diabétesz, amelynek hátterében mtDNS defektus is állhat. A mtDNS-t érintő betegségek tehát diabéteszt okozhatnak, de ezek a betegek a teljes diabéteszes populáció csak igen csekély (hozzávetőlegesen 12%-át) hányadát teszik ki. Tekintve, hogy számos mtDNS mutáció okozhat diabéteszt, egyszerűen gyakorlattól elrugaszkodott, indokolatlan és rendkívül költséges lenne minden diabéteszes embert ezen, betegséget kiváltó mutációkra szűrni. A mtDNS betegségben szenvedő betegek gyakori klinikai tüneteit felsoroló táblázaton (táblázat) végigtekintve nyílvánvalóvá válik, hogy nehéz eldönteni, hogy melyik (klinikai tünetekkel rendelkező) beteg esetében keressünk lehetséges mtDNS betegséget. A további diagnosztikai nehézségekre jól rávilágít egy közelmúltban megjelent tanulmány, amely egyértelmű összefüggést mutatott egy nagy család tagjaiban előforduló homoplazmikus mitokondriális tRNS mutáció és a hipertenzióval, hipomagnéziával, valamint hiperkoleszterinémiával jellemezhető metabolikus szindróma között. Ha figyelembe vesszük, hogy az olyan állapotok, mint a hipertenzió és a hiperkoleszterinémia rengeteg embert érintenek, akkor beláthatjuk, hogy a potenciális mtDNS rendellenességgel rendelkező emberek száma is igen magas. Azt azonban mindenképpen észben kell tartanunk, hogy minden egyes ilyen beszámoló izolált családokról szól. Az epidemiológiai felmérések szerint a mtDNS mutációk incidenciája a specifikus betegségek (fenotípusa) között alacsony. További nehézséggel, mint például a klinikai tünetek specifikus kombinációjával is számolnunk kell az mtDNS rendellenességek diagnosztizálása esetén. Erre jó példa a mitokondriális diabétesszel gyakran társuló süketség, 21 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek vagy a stroke-szerű epizódok gyakran járnak migrén-szerű tünetekkel. Vitathatatlan, hogy számos, mtDNS mutációval rendelkező beteg évekig, vagy akár sohasem kerül diagnosztizálásra. Ezen sokat segíthetnek a direkt mitokondriális betegségekre berendezkedett centrumok felállítása.


4. fejezet - Mitokondrium, oxidatív stressz és öregedés Valószínűleg nincs még egy olyan orvostudományi kutatási terület, amely annyira régen és oly intenzíven foglalkoztatná az emberiséget, mint az öregedés és az örök fiatalság titka. A szabad gyökök öregedésben betöltött szerepével komolyabban a XX. század közepén kezdtek el foglalkozni, amikor felfedezték, hogy a (röntgen) sugárzás és az oxigénmérgezés következtében in situ képződő reaktív oxigénvegyületek (ROS) felelősek a következményes toxicitásért. Denham Harman, azon megfigyelésekre alapozva, hogy a sugárzás mutációt, rákot és öregedést okoz, azzal a hipotézissel állt elő, hogy a normális oxigén felhasználó metabolikus útvonalak által termelt ROS (ezek közül is elsősorban a hidroxil- és hidroperoxil gyökök) lényeges szerepet kapnak az öregedés folyamatában. A teória újabb lendületet kapott és elfogadottsága jelentősen megnövekedett a szuperoxid-diszmutáz felfedezésével, illetve a H2O2in vivo létezésének leírásával. Harman 1972-ben módosította korábbi teóriáját, arra a megfigyelésre hivatkozva, amely szerint emlős sejtekben a mitokondrium felelős a ROS döntő részének képződéséért. Az ezt követő évek során számos tanulmány igazolta, hogy az oxidatív sérülések mértéke fokozódik az életkor előrehaladtával. Harman módosított teóriájával összhangban kiderült, hogy a mitokondriális DNS-t (mtDNS) érintő mutációk (deléciók, pontmutációk) mértéke fokozódik oxidatív stressz hatására és igen jelentős mértékben megnő az életkor növekedtével. Mind a mai napig felmerül a kérdés, hogy vajon az oxidatív károsodásoknak kóroki szerepe van-e az öregedés folyamatában, az élethossz meghatározásában, vagy „csak” szimplán velejárói a kórral együtt járó betegségeknek. A mitokondriumot központba helyezve úgy is feltehetjük a kérdést, hogy a mitokondriális defektusok (az mtDNS mutációk) az öregedés kiváltó okainak egyike, vagy csak velejárói, következményei annak?

1. 4.1. Oxidatív stressz és mitokondriális DNS Tekintve, hogy a mtDNS, a mitokondriális ROS termelő folyamatok közelében található, tekintélyes mértékű oxidatív stressz hatásnak van kitéve, ennek eredménye a nukleáris DNS-től háromszor magasabb oxidatív DNS károsodási szint is. A mtDNS-t érintő deléciók és pontmutációk száma a kor előrehaladtával drámai mértékben megnő. Míg a deléciók gyakorlatilag kimutathatatlanok fiatal korban, addig idős korban a mtDNS akár 2%-a is érintett lehet. Ez alól természetesen az idegrendszer sem képez kivételt. Számos esetben számoltak be rágcsáló és humán agysejtek esetében egyértelműen korfüggő módon emelkedő mtDNS deléciós rátáról. In situ citokróm c oxidáz (COX) aktivitásfestés során heterogén festődés figyelhető meg idős substantia nigra neuronok esetén. Ezzel egyidejűleg megfigyelték, hogy a COX-negatív neuronok magasabb arányban tartalmaznak mtDNS deléciókat, mint a COX-pozitívak. A mutációk kétségtelenül szomatikus (és nem örökletes) mutációk voltak, mivel az egyes neuronok egyedi mintázatú (deléciós) mtDNS-t tartalmaztak. Az egyre szaporodó megfigyelések afelől sem nagyon hagynak kétséget, hogy az öregedés során, az oxidatív károsodások száma megnő az emlős agyban. Heves viták arról sem dúlnak, hogy a mitokondriumban képződött ROS hozzájárul az mtDNS mutációk létrejöttéhez. A közelmúlt eredményei alapján jelenleg úgy gondoljuk, hogy a kettősszálú törések lehetnek az mtDNS deléciók mediátorai. Ugyanis a kettősszálú törések nagyméretű deléciókhoz vezettek egér izom és agysejtek esetében, tovább erősítve a feltételezést, mely szerint ez a mechanizmus lehet döntő részben felelős az öregedéssel együtt járó mtDNS deléciókért. Ezeket a kettősszálú töréseket okozhatják a ROS vegyületek, azonban a hátterében a replikációs villa leállása is lehet. Ezeket, a potenciálisan ROS kiváltotta mtDNS mutációkat (deléciókat és pontmutációkat) olyan öregedéssel kapcsolatos rendellenességekkel hozták összefüggésbe, mint a sporadikus neurodegeneratív rendellenességek, a II-es típusú diabétesz és a szívbetegségek. Ha mindezek a megfigyelések nem is adnak választ a kérdésünkre, hogy a mutáns mtDNS akkumulációjának, illetve az oxidatív stressznek van-e okozati szerepe az öregedésben, azért azt valószínűsítik, hogy a mutáns mtDNS (és az oxidatív károsodások) az adott élőlény élettartamától függetlenül hasznos öregedési biomarkerként viselkedhetnek.

2. 4.2. ROS-mtDNS mutáció-ROS ördögi kör? Térjünk vissza Harman elméletéhez, amely szerint az öregedés, illetve az azzal összefüggésbe hozható degeneratív megbetegedések (többek között) a ROS káros hatásainak tudhatók be. A sejten belül az elsődleges 23 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Mitokondrium, oxidatív stressz és öregedés ROS forrás a mitokondriális elektrontranszfer lánc, így a mitokondrium tekinthető az oxidatív károsodás elsődleges célpontjának is. Ezen teóriára, megfigyelésekre építve az öregedés szabadgyökös, illetve mitokondriális teóriája egy ördögi kör meglétét vetíti elénk, amely jelentős mértékben hozzájárul az öregedés folyamatához. Az „ördögi kör” szerint a normális metabolizmus során az elektrontranszfer lánc ROS-et termel. Ez a ROS termelés a mitokondriális lipidek, fehérjék és nukleinsavak károsodását idézi elő. A ROS kiváltotta mtDNS mutációk csökkent funkciójú respirációs lánc alegységek szintéziséhez vezetnek, amelyek a respirációs lánc diszfunkcióját okozzák és így felerősítik a ROS termelődését. Ez az ördögi kör jó eséllyel, az mtDNS mutációk idővel történő exponenciális felszaporodását váltja ki, amely öregedéshez és az azzal együtt járó degeneratív megbetegedésekhez vezet. Tekintélyes számú morfológiai, bioenergetikai, biokémiai és genetikai adat támogatta a kör meglétét. Az idősebb emberekben nagyobb méretű és kevesebb mitokondriumot találunk és a mitokondriális abnormalitások, mint vakuolák, abnormális kriszták és parakristályos zárványok is gyakrabban előfordulnak. Ne felejtsük el, hogy az emlősök öregedése az mtDNS mutációk akkumulációjával, illetve a fehérjék oxidatív károsodásával járt együtt és egyre nagyobb a konszenzus afelől is, hogy létezik, egy korral együtt járó, a kor előrehaladtával folyamatosan romló respirációs lánc funkció csökkenés is. Végezetül, számos tanulmány számolt be különböző állatfajok esetében a ROS képződés és a maximális élettartam között fennálló korrelációról. Ugyanakkor azt sem szabad elfelejtenünk, hogy az összes rendelkezésünkre álló adat nem más, mint puszta korreláció és ezért nem zárhatjuk ki annak a lehetőségét sem, hogy a mitokondriális károsodás és a ROS termelés az öregedés következménye és nem pedig hajtóereje annak. A kérdés megválaszolásához nagymértékben segítséget nyújt a közelmúltban létrehozott mtDNS mutátor egér.

3. 4.3. Az mtDNS mutátor egér Az mtDNS mutátor egér kulcsszerepet kapott a ROS, mtDNS károsodás és öregedés közötti összefüggés tisztázásában. Az egérben, az mtDNS replikációjáért felelős DNS polimeráz γ (Polg) hibajavító funkciójához szükséges 3’-5’exonukleáz aktivitását elrontották. Az aktivitás szempontjából kritikus konzervált aszpartát oldalláncot alaninre cserélték (a Polg A alegységében). Ennek következtében a Polg exonukleáz aktivitása igen jelentős mértékben csökkent, míg a szintetikus aktivitása nem változott meg. Az mtDNS mutátor egerek egészen 25 hetes életkorukig teljesen normális megjelenést mutattak, ekkor azonban enyhe mértékű gerinc deformitás (kyphosis) és kopaszság (alopécia) alakult ki. Ahogy az állatok öregedtek a gerinc deformitás egyre súlyosbodott és változó mértékű kopaszság jelent meg. Az állatok átlagos élettartama 48 hét volt és mindegyikük elpusztult a 61 hetes életkor előtt. Az mtDNS mutátor egerek súlygyarapodása a 15-20 hét között elkezdett visszaesni és 24 hetes korukban elkezdték a testsúlyukat veszteni. A kopaszodás a humán öregedés természetes velejárója, ahogy a 60 éves kor feletti testsúlyvesztés is, hasonlóan a 1.5 évnél idősebb egerekhez. A mtDNS mutátor egerek testzsír és szubkután zsírtartalma, általános megjelenésükkel összhangban csökkent volt. Emberek esetében a testzsírtartalom 65 éves kor felett elkezd csökkenni és a szubkután zsírtartalom csökkenése is általánosnak mondható az öregedő bőr esetében. A csontozat ásványi anyag sűrűségét (BMD) meghatározva, az egyértelmű csökkenést mutatott 40 hetes mtDNS mutátor egerek esetében, amely konzisztens az osteoporosis klinikai sajátságaival (jellegzetes kyphosis). Szintén hasonló tendenciát lehetett megfigyelni a csont ásványi anyag tartalom (BMC) alakulásában 40 hetes állatok esetében. A pontosabb BMD és BMC meghatározás érdekében a vizsgálatokat preparált femuron is elvégezték, ebben az esetben a 20 hetes állatok esetében nem tapasztaltak különbséget a vad típusú és a mtDNS mutátor egerek között, viszont 40 hetes életkorra jelentős mértékben csökkent mind a BMD, mind a BMC a mtDNS mutátor egerekből származó femur esetében. Összefoglalva a röntgen denzitometria felfedte a test összetételében bekövetkezett főbb változásokat, az mtDNS mutátor egérre jellemző korai csökkent zsírtartalmat és az oszteoporózis kialakulását. A humán öregedés igen hasonló módon gerinc deformitással és csontritkulással jár együtt. A laboratóriumi paramétereket áttekintve szembeötlő volt a 25 hetes korban perifériális vérből vad típusú állatokhoz képest mért csökkent hemoglobin tartalom. Az mtDNS mutátor egerekben tapasztalható anémia makrociter és hipokromatikus volt. A mutáns egerekben ezen kívül a májban extramedulláris hematopoézist és lép megnagyobbodást lehetett megfigyelni. Mindkét megfigyelés az öregedő egerek jellemzője. Itt érdemes megjegyezni, hogy az idősödő emberek esetében tapasztalható ismeretlen etiológiájú anémia szintén gyakran tapasztalható probléma. A szívsúly, testsúlyhoz viszonyított aránya is megnövekedett az mtDNS mutátor egerekben. A 40 hetes mutáns állatok bal szívkamra lumene is jelentős mértékben megnőtt. Hasonlóan megnövekedett szívsúly és bal kamra hipertrófia figyelhető meg az öregedő humán szív esetében is. A mutáns egerek szívizom szövetén végzett hisztokémiai vizsgálatok mozaikos citokróm C deficienciát fedtek fel, amely kimutatható öregedő (mtDNS 24 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Mitokondrium, oxidatív stressz és öregedés mutációkkal jobban terhelt) humán szívizom szövet és neuronok esetében is. Ezzel összhangban nagyobb méretű és abnormális mitokondriumok voltak láthatók a mutáns állatokból származó szívizomszövet fénymikroszkópos vizsgálata során. A mutáns egerek esetében mindkét nemre kiterjedő csökkent fertilitás volt tapasztalható. A vizsgált 15 nőstény közül egyik sem lett terhes 20 hetes kora után és mindössze egyetlen kisméretű utód született a mutáns hímek és vad típusú nőstények pároztatása esetén is. A mutáns hím egyedek kisebb méretű herékkel rendelkeztek 12 hetes korukat követően, amelyek csökkent mennyiségű spermiumot tartalmaztak. A 40 hetes állatok pedig már kiterjedt tesztikuláris csatorna rendellenességgel rendelkeztek. Humán esetben is a korral csökken a nők termékenysége, illetve a férfiak esetében csökken a spermiumok száma. A mutáns egerek mitokondriális DNS-ét southern blottal megvizsgálva, igen kiterjedt szöveti eloszlást mutató rövidebb, ~12 kbp (a normális mtDNS hossz 16569 bp) körüli mtDNS-t lehetett detektálni. A deléciót tartalmazó mtDNS mennyisége nem változott az időben és eloszlása hasonló értéket mutatott az összes vizsgált szövetben. A teljes hosszal rendelkező mtDNS száma hozzávetőlegesen a vad típusban mérhető 70%-át érte el. Ez a csökkenés azonban nem érintette az mtDNS expresszióját. A mutáns egerek agyából, májából és szívizmából izolált minták esetében a szomatikus mtDNS pontmutációk száma mintegy 3-5-szöröse volt a vad típus esetében tapasztaltnak. Az mtDNS-en belül mutációs forrópontot nem lehetett találni, az eltérések egyenletesen oszlottak el a teljes mitokondriális genomban. A mutáns egerek szívizom szövetében progresszív respirációs lánc enzimaktivitás csökkenés jelentkezett, ami csökkent mitokondriális ATP produkciós rátával járt együtt. Ez utóbbi összhangban van azzal a feltételezéssel, hogy a deficienciák hátterében az mtDNS-t érintő mutációk állnak. Mutáns egerek sorozatát létrehozva kimutatták, hogy a maternálisan öröklött mtDNS mutációk egy alap mutációs szintet jelentenek, amelyekre ráülve fejti ki a szomatikus mutagenezis a hatását. A viszonylag alacsony szintű petesejttel átadott mtDNS mutációnak önmagában egész élethosszon keresztül tartó következményei lehetnek, amely korai öregedéshez is vezethet. Ezek az öröklött mtDNS mutációk szomatikus mutációkkal kombinálódva komoly rizikótényezőt jelenthetnek különböző fejlődési rendellenességek kialakulásához. A mtDNS mutátor egér kapcsán nyert információk egyértelmű kísérletes kapcsolatot jelentenek a megnövekedett számú szomatikus mtDNS mutáció, a respirációs lánc diszfunkció és az öregedő fenotípus között. A cikk elején felvetett kérdésre úgy tűnik részben már választ kaphatunk, azonban a mitokondriális ROS szerepe még mindig tisztázásra vár.

4. 4.4. Egy váratlan fordulat: az mtDNS mutátor egér és a ROS kapcsolata Ahogy láttuk, az mtDNS mutátor egér, jelentős mértékű szomatikus mtDNS mutációval rendelkezik, amely korai öregedéssel és csökkent élettartammal jár együtt. A Polg mutáns állat alkalmas annak kiderítésére, hogy a megnövekedett mtDNS mutációs ráta következtében kialakult respirációs lánc deficiencia fokozott ROS termelést von-e maga után, amely az mtDNS további károsítása révén beindíthatja az ördögi kört. Mindenki arra számított, hogy legalább néhány olyan pontmutáció akad, amely fokozott ROS termelést idéz elő az mtDNS mutátor egérben. Ezért volt különösen meglepő, hogy sem emelkedett ROS termelést, sem oxidatív károsodást nem tapasztaltak különböző életkorú mutáns egerekből származó szövetekben, sejtekben. Ahogy korábban láttuk a mitokondriális öregedés teória egy ördögi kör meglétét tételezte fel, amely szerint az mtDNS mutációk számának – a felgyorsult oxidatív stressz miatt – exponenciális mértékben kellene növekednie. A mutáns egerekben azonban a gesztáció félidejétől a késői felnőttkorig a mtDNS mutációk lineáris növekedését tapasztalták, amely arra utal, hogy az ördögi kör mégsem létezik. Számos tanulmány számol be a fokozott ROS termelés, oxidatív károsodás és az öregedés között fennálló szoros viszonyról, korrelációról. Ezen kívül azok a beavatkozások, amelyek az élettartam meghosszabbodását érik el, egyúttal mérséklik az öregedéssel kapcsolatos oxidatív módon károsodott molekulák számának növekedését is. Az öregedés és ROS kapcsolatára korábban számos esetet említettünk, ezeken kívül ide tartoznak a kalória restrikciós kísérletek, illetve a genetikailag módosított gyümölcslegyeken és férgeken végzett kísérletek eredményei is. Az igazsághoz hozzátartozik, (ahogy arra korábban is utaltunk), hogy az öregedés szabad gyökös teóriáját támogató eredmények nagy részben indirektek és számos eredmény ellentmond annak. Erre szolgáltat szintén példát az a tanulmány, amelyben hosszú életű gyümölcslégy törzsekben a citoszólban található Cu-ZnSOD és kataláz enzimek túltermeltetése semmiféle kedvező hatást nem váltott ki a mutáns legyek túlélésére. A Mn-SOD, vagy a tioredoxin reduktáz transzgénként történő bevitele, a genetikai háttér többi részének 25 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Mitokondrium, oxidatív stressz és öregedés változatlanul hagyása mellett szintén nem befolyásolta az élettartamot. Ugyanakkor egy másik tanulmány az élettartam 48%-os megnyúlásáról számolt be a Cu-Zn-SOD enzimet túltermelő gyümölcslegyek esetében, a kataláz túltermeltetése azonban semmilyen további hatással nem bírt. A sort folytathatnánk még azokkal a genetikus egérmodellekkel, amelyekben megváltoztatták a különböző antioxidáns enzimek kifejeződésének mértékét, de ez esetben az eredmény még inkább konfúzus. Fontos arról is említést tennünk, hogy a ROS nem csupán, mint az oxidatív károsodások kiváltói ismeretesek, hanem fontos jelátviteli szerepet is betöltenek.

5. 4.5. Záró gondolatok, konklúzió Összefoglalásképp elmondhatjuk, hogy még mindig intenzív viták zajlanak a ROS, oxidatív stressz, öregedésben betöltött szerepéről. Az mtDNS mutátor egér révén nagy valószínűséggel kijelenthetjük, hogy a megnövekedett számú mtDNS mutáció és az emelkedett ROS produkció között nincs közvetlen összefüggés, ezen kívül az oxidatív stressz öregedésben betöltött közvetlen szerepét is erősen megkérdőjelezhetjük. Az mtDNS mutátor egérben úgy fejlődik ki az öreg fenotípus, hogy az oxidatív stressz bármilyen látható növekedését tapasztalnánk, azonban respirációs lánc deficienciát mutat. Így ez utóbbi sokkal inkább lehet potenciális jelölt a korai öregedés elsődleges kiváltójának szerepére. A respirációs lánc diszfunkció az élettanilag kritikus sejtekben bioenergetikai deficitet okozva csökkentheti a sejthalálhoz szükséges jel küszöbértékét, amely replikatív hanyatlást okozhat az őssejtekben, így felgyorsítva az öregedés folyamatát. Az „életelixír” megtalálása tehát még várat magára, talán a hozzávezető út egyik fontos állomása lehet az antimtDNS mutátor állatmodell kifejlesztése, amely révén már bizton megválaszolhatjuk a kérdést, hogy a lecsökkentett mtDNS mutáció szám hozzájárul-e az élet meghosszabbításához.


5. fejezet - A fehérjék nem enzimes glikációja, késői glikációs végtermékek Az ötödik fejezettel a tankönyv első részét alkotó oxidatív stressz, mitokondriális patobiokémia területéről a fehérje térszerkezettel, a térszerkezet megváltozásával, hibás kialakulásával kapcsolatos patobiokémiai területre térünk át. A diabéteszben szenvedő emberek kardio-vaszkuláris halálozási aránya a teljes populációhoz viszonyítva, több mint kétszeres. Emiatt a betegséget a szív koronária betegség ekvivalensnek is tartják. Diabéteszben egy sor hemodinamikai és metabolikus faktor játszik össze így okozva ezt a szomorú eredményt. Mind az I-es típusú diabétesz esetén végzett Diabétesz Kontrol és Komplikáció Vizsgálat (Diabetes Control and Complications Trial: DCCT), mind a II-es típusú diabétesz esetén végzett Egyesült Királyság Prospektív Diabétesz Tanulmány (UK Prospective Diabetes Study: UKPDS) egyértelmű okozati összefüggést mutatott a krónikus hiperglikémia és a hosszú távú diabéteszes szövődmények között. Egyre nehezebben megdönthető bizonyítékok szólnak amellett, hogy a fehérje glikáció, a késői glikációs végtermékek (advanced glycation endproducts: AGEs) kulcsszerepet játszanak az érelmeszesedés folyamatában, különösen diabéteszben. Az AGE akkumulációja nem csupán a hiperglikémia fokáról ad információt, hanem egyféle kumulált metabolikus terhelés markerként is felfoghatjuk (amely a hiperglikémiáról és a hiperlipidémiáról is információt szolgáltat), valamint képet formálhatunk az oxidatív stresszről és gyulladásról. Az AGE-k és az AGE receptorok interakciója gyulladást és endotél diszfunkciót vált ki.

1. 5.1. AGE képződés és szerkezet A redukáló cukrok, mint például a glükóz nem-enzimes módon reagálnak az aminosavak, lipidek és nukleinsavak amino csoportjaival. A nem-enzimes glikáció során először a glükóz és az aminocsoportok között az amidkötést tartalmazó, labilis Schiff bázis jön létre. Hosszabb idő (néhány hét) alatt egy lassúbb izomerizáció következik be, amelynek eredményeképpen egy stabil, de mégsem teljesen irreverzibilis szerkezetű vegyület, a ketoamin kötést tartalmazó Amadori termék jön létre (5.1. ábra). A hosszú életidejű szerkezeti fehérjékben a glikáció eredményeképpen létrejött Amadori termékek további átalakulásokon mennek keresztül, melynek eredményeképpen egy meglehetősen heterogén vegyületcsoport az AGE-k jönnek létre (5.2. ábra). A folyamat Maillard reakció néven is ismert és az 1900-as évek elején került leírásra, amikor megfigyelték, hogy a redukáló cukrok jelenlétében hő kezelt aminosavak egy jellegzetes színű, sárgás-barnás terméket képeznek.

5.1. ábra - A fehérjék nem enzimes glikációja

Ahogy említettük a késői glikáció lassan jó néhány hét alatt lejátszódó folyamat, így a hosszú életidejű fehérjéket érinti. A folyamat elsődleges célpontjai közé a kötőszöveti mátrix és a bazális membrán szerkezeti elemei tartoznak, mint a kollagén, a mielin, a C3 komplement, a tubulin, a plazminogén aktivátor és a fibrinogén. Urémiában, ami rendkívül nagymértékű AGE akkumulációval jár együtt, azonban rövidebb életidejű komponensek, mint lipid összetevők és nukleinsavak is érintettek.


A fehérjék nem enzimes glikációja, késői glikációs végtermékek

5.2. ábra - A késői glikációs termékek képződése

A glikáció, a korai szakaszban különös mértékben, koncentráció függő folyamat, így diabéteszben jelentős mértékben megemelkedik a glikált fehérjék mennyisége. Az AGE képződését az átmeneti fémionok katalizálják, míg a redukálószerek, például az aszkorbát gátolja. A glükóz viszonylag alacsony mértékben képes glikációra, viszont a sejtben előforduló cukrok, a glukóz-6-foszfát és a fruktóz jóval gyorsabban, jelentősebb mértékben képez AGE-t. Amennyiben oxdatív körülmények is társulnak a glikáció mellé, a képződött termékeket glikoxidációs termékeknek nevezzük. Ez utóbbiakra kiváló példát szolgáltat az AGE-k közé tartozó pentozidin és Nε-[karboximetil]-lizin (CML) (5.3. ábra). A Maillard reakció során különösen fontosak az Amadori átrendeződés során képződő reaktív intermedierek. Ezek a vegyületek, mint α-dikarbonilek és oxoaldehidek ismertek és olyan vegyületek tartoznak közéjük, mint a 3-deoxiglukozon (3-DG) és a metilglioxál (MGO). A 3-DG az Amadori termékek nem oxidatív átrendeződése és hidrolízise révén képződik, illetve az egyik poliol útvonal termékből a fruktóz-3-foszfátból. Itt muszáj néhány szó erejéig kitérnünk a poliol útvonalra. A poliol útvonal egy, két lépésből álló metabolikus út, amely során a glükóz szorbittá redukálódik, amely ezt követően fruktózzá alakul. Az útvonal egyike azon folyamatoknak, amelyet (legalább részben) felelőssé tesznek a diabéteszes hiperglikémia sejtszintű toxicitásáért. Ezt a következő tényezők támasztják alá: 1. akkor aktiválódik, amikor az intracelluláris glükóz koncentráció megemelkedik, 2. a lépéseket katalizáló mindkét enzim (aldóz reduktáz, szorbit dehidrogenáz) megtalálható azon szervekben, szövetekben, amelyeket a diabéteszes szövődmények érintenek, 3. a reakcióút termékei és a megváltozott kofaktor egyensúly olyan celluláris stresszt váltanak ki, amely a diabéteszes szövődmények helyszínén fordul elő. Az útvonal első és egyben sebesség meghatározó lépését katalizáló enzim, az aldóz reduktáz gátlása reprodukálható módon meggátolta a diabéteszes retinopátia kifejlődését diabéteszes rágcsáló modell esetében. A klinikai vizsgálatok azonban egyelőre nem teljesen homogén eredménnyel jártak. A metilglioxál szintén nem oxidatív folyamatok során képződik az anaerob glikolízisben, illetve a többszörösen telítetlen zsírsavak oxidatív bomlása során. Ezen kívül MGO keletkezhet a fruktózból trióz-foszfátokra történő 28 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A fehérjék nem enzimes glikációja, késői glikációs végtermékek fragmentálódása révén, illetve a keton testek és a treonin katabolizmusa során. Habár ezek a termékek alapvetően nem oxidatív úton keletkeznek, paradox módon mégis oxidatív stresszt és apoptózist válthatnak ki. A közelmúltban kiderült, hogy a metilglioxál és a 3-DG is a glikációs folyamat majd minden lépése során keletkezhet, így a glükóz, vagy a Schiff bázis degradációjával a korai lépések során, illetve az Amadori termékből (pl.: fruktóz-amin) a glikációs reakció középidejében. Ezért az α-oxoaldehideket egyféle központi vegyületeknek tekinthetjük, amelyek a Maillard reakció révén történő glükóz átalakulás, a poliol útvonal és számos in vivo faktor átalakulása, mint a ketontestek, vagy a treonin katabolizmusának és a lipid peroxidáció eredményei. Így ezen központi vegyületek (metilglioxál és a 3-DG) révén valósul meg minden említett esetben az AGE képződés. A reaktív dikarbonil prekurzorok, a lipidperoxidációs termékek akkumulációját és a glikoxidációt karbonil stressznek nevezzük. Ezen karbonil prekurzorok akkumulációja oxidatív AGE (mint a CML, vagy a pentozidin) képződéshez vezethetnek, vagy pedig nem oxidatív AGE vegyületek képződhetnek, mint a 3-DG-ből képződő deoxiglukazon-lizin dimer: DOLD, vagy a MGO-ből képződő metilglioxál lizin dimer: MOLD. A karbonil stressz ezen közelmúltban leírásra került jelensége megfigyelhető mind diabéteszben, mind urémiában és feltehetően közrejátszik mindkét esetben a vaszkuláris károsodás felgyorsulásához. Néhány AGE vegyület szerkezetét sikerült felderíteni, közéjük tartozik a CML, a pentozidin és a pirralin (5.3. ábra)

5.3. ábra - Néhány AGE vegyület szerkezete


A fehérjék nem enzimes glikációja, késői glikációs végtermékek


A fehérjék nem enzimes glikációja, késői glikációs végtermékek Az ismert AGE molekulák immunológiailag különbözőek és egymás mellett megtalálhatóak a különböző hordozófehérjéken, mint az albumin, a hemoglobin, a szemlencse krisztallin és az LDL. A vérben a pentozidin és a CML 90%-a albuminhoz kötött, a maradék 10% szabadon található. A pentizidin és a CML a legjobban karakterizált AGE vegyületek, ezen belül is glikoxidácós termékeként tartják számon őket. Erre bizonyítékul szolgál az az in vitro megfigyelés, amely szerint antioxidánsok a CML képződését csökkentették. Többszörösen telítetlen zsírsavak fém katalizálta oxidációja, fehérjék jelenlétében, szintén CML képződéséhez vezetett, amely arra utal, hogy a lipidek oxidációjának szerepe lehet az AGE képződésben. Éppen ezért a CML általános oxidatív stressz marker szerepet tölthet be, amely szintje mind a szénhidrátok, mind a lipidek oxidációja során megemelkedik.

2. 5.2. Külsődleges AGE források Bár a legtöbb esetben az AGE képződés endogén, külsődleges forrásból is származhat, mint például a táplálkozás és a dohányzás. Habár, az egyértelműen bizonyított, hogy a cigarettafüst vaszkuláris betegséghez vezethet, azonban, hogy a külsődleges AGE-nek milyen szerepe van a folyamatban, különösképp pedig diabéteszben az nem ismert. Mindenesetre dohány eredetű AGE vegyületeket sikerült megfigyelni szemlencse krisztallin és koronária artéria falak esetében. Az élelmiszerek hőkezelése nem enzimes barnulásukat, a Maillard reakció lejátszódását eredményezi. A heterogén vegyületszerkezet miatt és megfelelően érzékeny analitikai módszer hiányában nehéz megítélni a külsődleges AGE szerepét és AGE poolhoz való hozzájárulását. Az orális biológiai hozzáférhetőség azonban meglehetősen alacsonynak (10% körülinek) tűnik. Valószínűleg nagyon csekély mértékű a felszívódása, mivel a keresztkötések enzimes és kémiai hidrolízisnek ellenállóak.

3. 5.3. AGE keresztkötések kialakulása Az AGE szerkezetek heterogenitása ellenére kialakulásuk közös vonása a keresztkötések létrejötte. A folyamat által érintett fehérjék általában stabilak és hosszú életidejűek. A keresztkötések kialakulásának kémiája komplex és korántsem ismert teljes mértékben, ami biztosnak tűnik, hogy a lizin oldalláncok kiemelt szerepet játszanak. Az AGE vegyületek által kiváltott patológiás keresztkötések kialakulása, a fehérje mátrix fokozott merevségéhez vezet, ezáltal lerontva annak funkcióját és megnövelve a hidrolízissel szembeni ellenállását, ami végső soron a szövet újraszervezését lehetetleníti el. Ezek a változások a kor előrehaladtával fokozatosan alakulnak ki és diabétesz esetén felgyorsulnak, ily módon a diabéteszre tekinthetünk úgy, mint felgyorsult öregedésre. Poszt-mortem humán aorták esetében az AGE szint jól korrelált az aorta merevségével, rugalmatlanságával. Diabéteszes betegek veséjében immunhisztokémiai vizsgálatok során jelentős mértékű pirralin, krosslin és pentozidin (mind AGE vegyület) akkumulációt lehetett mérni. A keresztkötések kialakulásának fiziológiás következményei közé tartozik a vese glomerulusok szklerózisa, a kapilláris bazális membrán megvastagodása és az érelmeszesedés. Az érelmeszesedés folyamatában nem csak a keresztkötések kialakulása játszik szerepet, hanem az érfalak mátrixkomponensein képződő AGE által csapdába ejtett lipoproteinek is. Ez lerontja az érfalakból történő koleszterin eltávolítás folyamatát, amely lipoprotein akkumulációhoz és makrovaszkuláris betegségek kialakulásához vezet. Újkeletű megfigyelések azt mutatták, hogy ha egyébként egészséges állatokba exogén AGE-módosított fehérjéket juttatunk, akkor azok széleskörű kémiai és biológiai aktivitást mutatnak. Az AGE képződés és a szöveti elváltozások közötti összefüggést szintén alátámasztották az adatok. Egészséges, normális vércukorszinttel rendelkező állatok esetében a magas szöveti AGE szint elegendőnek bizonyult, hogy nagyszámú biokémiai, sejtes és kórélettani eltérést, a diabéteszre jellemző vaszkulopátiát okozzon. A kísérletek során in vitro előállított AGE keresztreakciót adtak az in vivo keletkezett AGE ellen termeltetett antitestekkel. Az AGE-albumin infúzió jelentős mennyiségű AGE kovalens kötődését eredményezte a patkány és nyúl aorta extracelluláris mátrixában. Az így létrejött AGE szintek hasonló nagyságúak, mint amit diabéteszes humán aortákban figyeltek meg. Az AGE vegyületek élőszervezetbeli sorsával kapcsolatban több teória is napvilágot látott. Az exogén AGE-albumin intakt molekulái közvetlenül a szöveti mátrix fehérjéivel reagálhatnak a lehetséges AGE keresztkötő részeken keresztül. Egy másik alternatíva szerint az AGE-albumin egy proteolítikus emésztésen és denaturálódáson mehet keresztül, amely növelheti az AGE reaktivitását, tovább segítve ezzel a fehérjék keresztkötéseit. Az AGE felhalmozódása az egyébként normális szubendotéliális és perivaszkuláris üregekben jelentős mononukleáris sejtbeszűrődéssel jár együtt. Ez a megfigyelés egybecseng azzal a korábbi megfigyeléssel, amely szerint az AGE-módosított szolubilis és mátrix fehérjék in vitro kemotaktikus aktivitással bírnak, amely bőségesen elegendő ahhoz, hogy monocita migrációt indítsanak meg intakt endotéliális egysejtrétegen keresztül. Az aterogenezis kezdeti szakaszára jellemző a


A fehérjék nem enzimes glikációja, késői glikációs végtermékek monociták beszűrődése, ezért talán az AGE indukálta kemotaxis a diabéteszes vaszkulopátia egy korai eseménye.

4. 5.4. AGE és AGE receptor kapcsolat A mai napig számos AGE receptort azonosítottak, ezek közé tartozik: makrofág szkevendzser receptor I-es, IIes típus, receptor AGE (RAGE), oligoszacharil transzferáz-48 (AGE-R1), 80K-H foszfoprotein (AGE-R2) és a galektin-3 (AGE-R3). Az említett receptorok a sejtek igen széles körében fejeződnek ki, mint például a simaizom sejtek, monociták, makrofágok, endotél sejtek, podociták, asztrociták és mikroglia sejtek. Néhány receptor esetében leírásra került, hogy diabéteszben fokozódik a kifejeződésük: fokozott galektin-3 kifejeződést találtak diabéteszes állatmodellben, szintén fokozott RAGE expresszióról számoltak be diabéteszes erek és vesék esetében. A legalaposabban karakterizált receptor a RAGE. Immunokémiai vizsgálatok szerint az endotél sejteken expresszálódik, különösen az érelmeszesedés által érintett területeken. In vitro kísérletek arra utalnak, hogy az AGE-RAGE kapcsolat kialakulása oxidatív stresszt és az NF-κB transzkripciós faktor aktiválását váltja ki. Az NF-κB egy szabadgyök érzékeny transzkripciós faktor, amely az endothelin-1, a VCAM-1 a szöveti faktor és a trombomodulin transzkripcióját befolyásolja. A transzkripciós faktort olyan AGE kiváltotta antioxidáns depléciós állapotokhoz is kötötték, amelyben a glutation, a C-vitamin és a nitrogén-monoxid szintje csökkent. Mindezen eredmények arra utalnak, hogy az AGE-RAGE kapcsolat létrejötte oxidatív stresszhez vezet, amelynek fontos szerepe lehet a gyulladás folyamatában. Ezt az a további megfigyelés is alátámasztani látszik, mely szerint fagociták a gyulladás helyszínén mieloperoxidáz aktivitásuk révén CML-t állítanak elő. Ez az útvonal a hiperglikémiától független és megmagyarázhatja az AGE jelenlétét a nem diabéteszes emberek érelmeszesedési lézióiban, ahogy más gyulladásos betegségekben is, mint például a rheumatoid arthritis. Állatkísérletek során a RAGE receptor blokkolása mind a vaszkuláris lézió kialakulását, mind a vaszkuláris permeabilitás csökkenését eredményezte, amely így csökkentette a diszfunkció mértékét.

5. 5.5. AGE metabolizmus A legfontosabb tényezőnek az AGE eltávolítás folyamatában a szöveti makrofágokon található AGE receptorokat tartják. A degradációt követően a kisméretű, szolubilis AGE peptideket kiürítik, majd a vérárammal a vesébe kerülnek, amely filtrálja őket. Ebből az következik, hogy megfelelő eliminációjuk jó vesefunkcióhoz, megfelelő kreatinin clearance (értékhez) kötött. Bármilyen vesefunkciót érintő rendellenesség így AGE akkumulációhoz, endotél károsodáshoz és így vaszkuláris betegséghez vezethet. A közelmúltban végzett kísérletek alapján a máj szinuszoid sejtek, mint például a Kupffer és endotél sejtek által kifejezett szkevendzser receptorok fontos szerepet játszanak a keringésben található AGE fehérjék endocitotikus felvételében. Így ezen rendszer hibája, vagy az AGE túltermelése szintén hozzájárulhat, a vesefunkciótól függetlenül, az AGE felhalmozódásához. In vitro megfigyelések szerint az inzulin is hozzájárulhat az AGE plazmából történő eltávolításához az IRS (inzulin receptor szubsztrát) és IP3 kináz útvonalon keresztül. Az útvonalat egyértelműen vaszkuloprotektívnek tartják, mivel az NO szintjének emelkedését és a cukor zsír-, illetve izomsejtek általi felvételét fokozza.

6. 5.6. Az AGE képződés következményei diabéteszben A diabéteszben megfigyelhető vaszkuláris károsodások egyik kiváltójának a hiperglikémiát jelölik meg. A vaszkuláris károsodások olyan mikrovaszkuláris szövődményekben nyilvánulnak meg, mint a retinopátia, a neuropátia, a nefropátia, illetve makroveszkuláris betegségek. Habár a szövődményekhez vezető folyamatok nem ismertek teljes mértékben, három útvonal szerepét tartják rendkívül fontosnak: a protein kináz C aktiválódását, a már említésre került poliol útvonalat, illetve az AGE képződést. A folyamatokra vonatkozó megfigyelések a protein kináz gátlószer LY333531, az aldóz reduktó gátló ponalrestat és a RAGE oldható extracelluláris domén alkalmazásával kapott eredményekre alapoznak. Mindezen gátlószerek alkalmazása csökkentette a cukorbetegség szövődményeit, igaz állatmodellek esetén. A hiperglikémia fokozza a ROS termelődését és oxidatív stresszhez vezet. A stresszben felszaporodó, azt kiváltó oxidáns vegyületek, mint a szuperoxid anion a H2O2 és a lipid peroxidok fehérje fragmentálódáshoz, oxidációhoz és keresztkötések kialakulásához vezetnek. Az AGE képződés szintén ROS termelődéshez vezet, illetve csökkenti a NO koncentrációját, amely szintén oxidatív stresszhez vezet. Tekintve, hogy a NO vazodilatációs és a vaszkuláris simaizom sejtekre antiproliferatív hatással rendelkezik, az AGE akkumulációja 32 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A fehérjék nem enzimes glikációja, késői glikációs végtermékek érfal megvastagodásban, csökkent érfal rugalmasságban, magas vérnyomásban és endotél diszfunkcióban nyilvánulhat meg. Az AGE szövődött vaszkuláris károsodásokra további bizonyítékot szolgáltat az olyan szubendotéliális szerkezeti fehérjék keresztkötése, mint a kollagén és a laminin. A folyamat feltételezhetőleg szerepet játszik a szövet újrastrukturálásában, amelynek eredménye a simaizom proliferáció és a megnövekedett vaszkuláris permeabilitás. Mindezen változások igen fontos diabétesszel együtt járó kórtani sajátságok. További fontos AGE kiváltotta vaszkulopátiás sajátságok a megváltozott koaguláció és fibrinolízis. Pontosabban a csökkent vérlemezke élettartam és megnövekedett aggregáció. Megváltoznak a véralvadási faktorok, mint az anti-trombin III, a szöveti faktor és a trombomodulin, illetve a fibrin stabilizáció. Mindezen folyamatok eredményeképpen egy pro-koaguláns állapot alakul ki. Igen hasonló állapot alakul ki diabéteszben is, amikor a vérlemezke funkció és a von Willebrand faktor szenved el változást, illetve csökken a fibrinolízis mértéke, megnövekszik a fibrinogén szint.

7. 5.7. Az AGE képződés, mint terápiás célpont Az AGE képződés terápiás célú csökkentése a keresztkötések kialakulásának csökkentésére kell, hogy irányuljon. Ezen felül az AGE depozitok csökkenthetőek a már létrejött keresztkötések felbontásával, illetve az AGE celluláris felvétel és degradáció fokozása révén. A szövődmények csökkentése elméletileg elérhető AGE receptor blokkolókkal, mint például receptor ellenes, azokat semlegesítő antitestekkel, vagy a receptort követő jelátviteli folyamatok lecsendesítésével. Ez utóbbi antioxidánsok alkalmazásával viszonylag egyszerűen kivitelezhető. A gátlószerek fejlesztését megnehezíti, hogy az AGE vegyületek meglehetősen komplex és rendkívül heterogén vegyülethalmazt alkotnak. Sokszor az is gondot jelent, hogy az in vitro eredmények nem ültethetők át in vivo folyamatokra. Mind a mai napig az aminoguanidin a legbiztatóbb védőszer a glikációs folyamatok ellen. Diabéteszes állatmodellek esetében csökkenteni tudta a diabéteszes retinopátiát, neuropátiát és nefropátiát. Természetesen gyógyszerként való alkalmazásához még majom, illetve ezt követően klinikai teszteken is bizonyítania kell.


6. fejezet - A fehérjetekeredés (folding) patobiokémiája A fehérjetekeredés zavarai hozzák létre a fehérjeszerkezeti betegségek (más néven proteopátiák, konformációs vagy folding betegségek) nagy csoportját, melybe számos jól ismert, viszonylag gyakori súlyos, progresszív és jelenleg még gyógyíthatatlan kórkép (pl. Alzheimer betegség, Parkinson-kór, prion betegség) tartozik. A húszféle fehérjealkotó aminosav összekapcsolódásával létrejövő polipeptidláncok akkor válnak működőképes fehérjékké, ha felveszik a rájuk jellemző térszerkezetet. A térszerkezet felvételének folyamatát fehérjetekeredésnek vagy foldingnak nevezzük. A térszerkezetet meghatározó információt alapjában már az aminosav sorrend tartalmazza, aminek következtében kísérleti körülmények között az izolált, denaturált, kisebb méretű fehérje külső segítség nélkül is képes lehet feltekeredni és aktív térszerkezét kialakítani. Nagyméretű fehérjék esetében és in vivo viszonyok között (a sejten belüli fehérjekoncentráció elérheti a 400 mg/ml-t) viszont megnő annak a valószínűsége, hogy szabálytalan kölcsönhatások jönnek létre fehérjén belül vagy fehérjék között. Ezáltal rendkívüli mértékben megnövekszik a működésképtelen fehérjék, illetve a fehérje-aggregátumok képződésének a veszélye. A sejt három alapvető mechanizmussal védekezhet ez ellen. Megelőző mechanizmusként a dajkafehérjék (chaperonok) működnek. Ezek a fehérjék azonnal kapcsolódnak a transzláción újonnan átesett (vagy valamilyen okból denaturálódott) polipeptidlánchoz, így időlegesen megakadályozzák a más fehérjékkel való összetapadást és elősegítik a normális térszerkezet ki- vagy visszaalakulását. A dajkafehérjék minden szubcelluláris kompartimentumban magas koncentrációban vannak jelen, ahol intenzív fehérjeszintézis és folding történik (citoszól, endoplazmás retikulum lumen). A már véglegesen a hibás szerkezetben rögzült, illetve esetleg aggregátumokat is képező fehérjék esetében már csak a proteolízis a járható megoldás. A proteolízist megelőzheti a foldinghibás fehérjék egyenkénti felismerése, megjelölése. Az ubikvitin konjugáló enzimkomplexek felismerik a hibás térszerkezetet , és egy kis fehérje, az ubikvitin hozzákapcsolásával megjelölik. A különféle proteázokból felépülő másik komplex, a proteaszóma, felismeri az ubikvitinált fehérjéket, ATP-függő módon teljesen letekeri és proteolítikus alegységei segítségével oligopeptidekre bontja őket. Ha a hibás fehérjék már aggregátumokat képeznek vagy tömegesen fordulnak elő, a makroautofágia folyamatában bomolhatnak le a lizoszómákban, sokszor az őket tartalmazó organellumokkal együtt. Természetesen ezen folyamatok működése során a szerkezeti hibás fehérje és annak funkciója eltűnik, viszont nem jön létre konformációs betegség. Erre a legismertebb példa a cisztás fibrózis nevű igen súlyos, elsősorban a tüdőt érintő betegség, melyben a CFTR gén mutációja megváltozott szerkezetű cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor fehérje szintézisét eredményezi. A mutáns fehérje akár meg is tarthatná normál szerepét (plazmamembrán klorid csatornaként működik), azonban a minőségellenőrzési mechanizmusok szerkezeti eltérését felismerik és elindítják a proteolízis útján. A harmadik lehetőség a foldinghibás, aggregálódott fehérjék sejten belüli elkülönítése. Ilyenkor a foldinghibás, ubikvitinált fehérjék (melyek aggregációjuk miatt a proteaszómába nem fértek be) a mikrotubulusok mentén a centriólumhoz, a sejtmag közelébe szállítódnak, ahol aggreszómákat (víz- és detergens-oldhatatlan zárványokat) képeznek. Az aggreszómaképződést azokban a sejtekben tapasztalhatjuk, ahol a foldinghibás fehérjék mennyisége meghaladja a chaperon- és proteaszómakapacitást. Bár az aggreszómák megjelennek több konformációs betegségben is, lényegében mégis citoprotektív mechanizmusnak tartják létrejöttüket. Ha a chaperon-mediált, proteolítikus és aggreszóma-képző mechanizmusok elégtelenek, előállnak a fehérjeszerkezeti betegségek. Ezen betegségek főként extracelluláris fehérjéket érintenek, mivel a sejten kívül a korábban ismertetett védelmi eszközök már nem működnek. A dajkafehérjék és a proteolítikus mechanizmusok komolyabb zavarai az élettel összeegyeztethetetlenek, így a fehérjeszerkezeti betegségekért azok klienseinek, illetve szubsztrátjainak kóros módosulásai felelősek. Ennek oka mutáció, vagy a fehérjemolekula szerzett szerkezeti változása lehet. A fehérjeszerkezeti betegségek esetében a patomechanizmus alapvetően kétféle lehet. Az egyik esetben a hibás térszerkezetű fehérje nem képes korábbi funkcióját ellátni, vagyis a foldinghiba funkcióvesztéssel párosul. Mivel az egészséges allél képes a normál funkció ellátására, a funkcióvesztéses mutáció által létrehozott kórkép recesszív módon öröklődik. A proteopátiák azonban általában új, káros funkció megjelenésével, funkciónyeréssel is párosulnak, ekkor a betegség domináns módon öröklődik. Az új, káros funkció lehet maga a fehérjeaggregátum létrejötte, emellett a megváltozott szerkezetű fehérje kóros makromolekuláris kapcsolatokat is kialakíthat, így alapvetően befolyásolhatja a sejt homeosztázisát. 34 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A fehérjetekeredés (folding) patobiokémiája

1. 6.1. A fehérjeszerkezeti betegségek legnagyobb csoportja – az amiloidózisok Az amiloidózis során a normálisan szolubilis fehérjék oldhatatlanná válnak, és az extracelluláris térben lerakódva károsítják az érintett szövet/szerv funkcióit. Az oldhatatlan, fibrilláris szerkezetű, keményítőszemcsékre (innen a név) emlékeztető lerakódásokat amiloidnak nevezzük. 1854-ben Rudolf Virchow vezette be az elnevezést, majd igen hamar kiderült, hogy ezek a képződmények fehérjéket és nem szénhidrátokat tartalmaznak. Szerkezetükben a fehérjék másodlagos szerkezeténél megismert béta-lemez struktúrához hasonló, ismétlődő szakaszokat találunk. Az amiloidózis eredetét tekintve örökletes és szerzett lehet, következményei és tünetei is igen változatosak. A kialakult amiloidokkal szemben mind a dajkafehérjék, mind a proteolítikus mechanizmusok hatástalanok. Keletkezésük ezért többnyire irreverzibilis. Az amiloid kialakulása a különböző amiloidózisokban alapvetően három okra vezethető vissza. Leggyakoribb ok az olyan mutáció, amely a natív térszerkezetet destabilizálja, és így kedvez az aggregációra hajlamos intermedierek felhalmozódásának. Az amiloidózisok gyakran csak idős korban manifesztálódnak, és így a mutáció az utódokra is átadódhat. Ezeket a formákat ezért örökletes (familiáris) amiloidózisnak nevezzük. A súlyosabb fehérjeszerkezeti destabilizációt okozó mutációk viszont már fiatal korban is előidézhetnek amiloidózist, gyors lefolyásúak, így öröklődésük valószínűsége kicsi. Sok amiloidózisnak ismerjük fiatalkori és öregkori változatát is. Az amiloidózisok szerzett formáiban a normál aminosavszekvenciájú fehérje valamilyen oknál fogva elveszíti natív térszerkezetét, részlegesen letekeredik, és a chaperon-mediált és proteolítikus mechanizmusokat elkerülve aggregátumokat alkot. Az aggregátumok szám- és méretbeli növekedése végül a betegség kialakulásához vezet. Ezeknek a szórványos (sporadikus) formáknak a megjelenése kizárólag idős korban történik. Száz év feletti életkorban az amiloidózis valószínűsége már több mint 70%. A harmadik lehetőség az indukált amiloidózis. Bizonyos fehérjeaggregátumok azzal a speciális tulajdonsággal rendelkeznek, hogy egy másik sejtbe vagy akár szervezetbe jutva képesek az ott található, egészséges fehérjéket is az aggregáció útjára kényszeríteni. Az ilyen megváltozott térszerkezetű fehérjék ezért fertőzőnek tekinthetők. Az ebbe a csoportba tartozó fehérjéket prionoknak nevezzük. A prionok eredeti kialakulása történhet spontán vagy mutációval, az indukált aggregációban viszont általában normál szekvenciájú fehérjék csatlakoznak az aggregátumhoz. További érdekesség, hogy különleges szerkezeti tulajdonságától eltekintve a prion normális élettani funkciót ellátó fehérje, sőt bizonyos esetekben még amiloid formája sem okoz betegséget, hanem fiziológiás funkciót lát el.

1.1. 6.1.1. Az amiloidózisok formái Az amiloidózisok etiológiailag egységes betegségcsoportot alkotnak. A konkrét patomechanizmus tekintetében azonban az egyes betegségek lényeges eltéréseket mutatnak, ami osztályozásukat és különböző csoportokban történő tárgyalásukat indokolja . Az amiloidózisokat alapvetően két nagy csoportba sorolják, attól függően, hogy az amiloid a szervezet sok pontján szisztémásan rakódik-e le, vagy szövetspecifikusan, elsősorban az idegszövetben, gyakran az idegsejtek belsejében jelenik-e meg. A fehérjeszerkezeti betegségek közé tartozó neurodegeneratív kórképeket egyébként három alosztályba sorolhatjuk, a hagyományos amiloidózisok (Alzheimer betegség, Parkinson kór) mellett külön csoportot képeznek a poliglutamin betegségek (Huntington kór, Kennedy betegség, spinális és bulbális izomatrófia, spinocerebelláris ataxia) és a prionbetegségek (Creutzfeldt -Jakob kór, kuru, Gerstmann-Straussler-Sheinker szindróma, fatális familiális inszomnia, kergemarhakór, scrapie, stb.).

1.2. 6.1.2. Szisztémás amiloidózisok Az amiloidózisok legrégebben ismert formái a szisztémás amiloidózisok, melyekben a szervezet számos szövetét érintő, gyakran hatalmas tömegű aggregátum lerakódása figyelhető meg . Ezekben a betegségekben az amiloid az agy kivételével gyakorlatilag minden szervben lerakódhat, és az adott szerv működésének elégtelenségéhez vezet. Húszegynéhány szisztémás amiloidózist okozó fehérjét ismerünk, esetükben az aggregátum kialakulása az általános mechanizmus szerint folyik, az aggregációt kiváltó ok azonban sokféle lehet. A szisztémás amiloidózist okozó egyes fehérjék között sem aminosav sorrendjük, sem natív térszerkezetük tekintetében nincs hasonlóság, csupán az amiloidképző hajlam a közös tulajdonságuk . Ezek a fehérjék szekréciós, a szérumban normál körülmények között is jelenlevő fehérjék. Aggregációjukat vagy 35 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A fehérjetekeredés (folding) patobiokémiája tartósan megemelkedett koncentrációjuk ( nem-örökletes amiloidózisok), vagy mutációjuk (örökletes amiloidózisok) okozza. Az aggregátumok extracellulárisan keletkeznek, a fő felépítő fehérje mellett egyéb komponenseket, például glukózaminoglikánokat és proteoglikánokat is nagy mennyiségben tartalmazhatnak, melyek fokozzák az aggregátumok stabilitását. A továbbiakban a leggyakoribb szisztémás amiloidózisokat ismertetjük. Reaktív szisztémás (AA) amiloidózisban krónikus gyulladásos betegségek (például reumatoid artritisz, Crohn betegség, tuberkulózis ) a szérum amiloid A (SAA ) akut fázis fehérje szintjének emelkedését idézik elő, amelyből egy 76 kDa-os proteolítikus fragmentum keletkezik. Az amiloid aggregátumok elsősorban a lépben, vesében és májban rakódnak le. A betegség veseelégtelenséget okozhat. A monoklonális immunoglobulin által okozott amiloidózisok (szisztémás amiloid könnyű lánc vagy AL vagy primer amiloidózis) leginkább mielóma multiplexhez és monoklonális gammopátiákhoz kapcsolódva jelentkeznek, amelyekben egy monoklonális ellenanyag kóros túltermelését az okozza, hogy a plazmasejtek egy klónja jóindulatúan, vagy az esetek 20-30%-ában rosszindulatúan elszaporodik. Az amiloid az immunoglobulin könnyű (AL) vagy ritkábban nehéz (AH) láncából is kialakulhat, és az agy kivételével bármilyen szerv parenchimális szövetében lerakódhat. A vérben és a vizeletben magas koncentrációt elérő könnyű láncokat Bence-Jones fehérjének is nevezik. A hemodialízis-asszociált amiloidózis során a β2-mikroglobulin szintje emelkedik. Az akut veseelégtelenség következtében a fehérjét a vese nem bontja le és a β2-mikroglobulin a dialízis membránon sem képes áthatolni, így a koncentrációja tartósan magas marad, ami hosszantartó kezelés során szisztémás amiloidózishoz vezet. A szenilis szisztémás amiloidózis (ATTR) nevének megfelelően tipikus öregkori betegség, előfordulása jelentősen megemelkedik 70 év fölött, és 100 éves kor után gyakorlatilag teljesen általánossá válik. Az amiloid ebben az esetben a normál transztiretinből (TTR; tiroxin és retinol transzportáló szérumfehérje) alakul ki, ami nagyobbrészt tünetmentesen rakódik le a kapillárisokban és a szívben. A TTR mutációja jellegzetes példája a szisztémás amiloidózisok másik nagy csoportjának, amelyekben az amiloid kiválását a prekurzor fehérjének a natív szerkezetet destabilizáló, amiloidképző hajlamot növelő mutációja okozza. A betegségek ebben a csoportban azonban autoszomális domináns módon öröklődnek, korábban jelennek meg és gyorsabb lefolyásúak, mint az előző csoport amiloidózisai. A TTR mutációi például a familiáris amiloid polineuropátia kórképét okozzák, a perifériás idegek, a szív és a vese károsodásával, végül elégtelenségével. Ha májtranszplantációra nem kerül sor (a transztiretint a máj termeli), a betegség tíz éven belül halálhoz vezet.

2. 6.2. Szövetspecifikus amiloidózisok A szövetspecifikus amiloidózisok legtöbbje a központi idegrendszert érintő neurodegeneratív betegségek csoportjába tartozik. Hasonló tünetegyüttest hoznak létre, melynek jellemzői a mozgáskoordinációs problémák, érzelmi/pszichés zavarok , progresszív demencia és végül a teljes szellemi-fizikai leépülés.

2.1. 6.2.1. Alzheimer betegség Az Alzheimer betegség (AD) tipikus időskori agykérgi neurodegeneratív betegség, egyben a legismertebb amiloidózis és az egyik legelsőként felismert fehérjeszerkezeti betegség. 1906-ban észlelte Alois Alzheimer az általa kezelt beteg agyában az agykéreg idegsejtjei felületének fehéres lerakódásait, az ú.n. plakkokat. Az idegsejtek belsejében neurofibrilláris gubancokat találunk, emellett még granulovakuoláris elváltozásokat és Lewy testeket (eozinofil citoplazmai zárványok) is gyakran lehet megfigyelni. Az elváltozások főképp a parietális és temporális lebenyben jelennek meg, ahol a szinapszisok degenerációjával, az idegsejt pusztulással, végül az érintett területek atrófiájával járnak együtt. A betegek igen kis hányadában (familiáris vagy korai Alzheimer betegség) mutációkat találunk az amiloid prekurzor protein (APP) vagy a preszenilin 1 és 2 fehérje génjében. Ilyenkor a betegség autoszomális domináns módon öröklődik és 65 éves kor előtt jelenik meg. Az esetek többsége a sporadikus vagy késői kezdetű Alzheimer betegség csoportjába tartozik. Az extracelluláris amiloid plakkok fő komponense a sejtfelszíni amiloid prekurzor fehérje (APP) egy rövid fragmentuma. Az APP metabolizmusa során fiziológiás körülmények között két helyen hasad el, ezeket az átalakulásokat a szekretáz nevű enzimek katalizálják. Az α- és β-szekretáz aktivitás különböző helyeken hasítja le az APP extracelluláris doménjét. A γ-szekretázok nagyméretű multiprotein komplexet képeznek a


A fehérjetekeredés (folding) patobiokémiája membránban, melyeknek enzimaktivitása a preszenilineknek tulajdonítható. A γ-szekretázok hasítási helye az APP transzmembrán doménjében van. Az α és γ helyen történő hasítás esetén nem keletkezik amiloid. Ha az APP hasítása nem az α és γ helyeken, hanem a β-szekretáz közreműködésével a β és γ helyeken történik, akkor 40-42 aminosav hosszúságú, limitált oldhatóságú β-amiloid peptid (Aβ) képződik. Az Alzheimer betegségben a tau fehérje is kóros aggregációt mutat (taupátia). A tau fehérje a mikrotubulusasszociált fehérjék (MAP) közé tartozik, foszforilált formában stabilizálja a mikrotubulusokat. Ha hiperfoszforilálódik, létrehozza a betegségre jellegzetes intracelluláris neurofibrilláris gubancokat, megakadályozva az idegsejt citoszkeletonjának normál működését.

2.2. 6.2.2. Parkinson kór A Parkinson kór a második leggyakoribb fehérjeszerkezeti neurodegeneratív betegség, James Parkinson írta le 1817-ben. A betegség általában 60 év körül jelentkezik, legjellemzőbb tünete a nyugalmi remegés, a mozgások lassulása és elindításának zavara, apróléptű, csoszogó járás, mimikaszegénység, majd pszichés problémák (szorongás, alvászavar, depresszió) is felléphetnek, végül az elbutulás is megjelenik. A betegség legjellemzőbb jegyei az elsősorban a substantia nigra dopamin neurotranszmitterrel működő (dopaminerg) neuronjaiban megjelenő citoplazmai aggregátumok, a Lewy-testek. A betegség az esetek túlnyomó részében sporadikusan jelenik meg, az időskori forma ritkán autoszomális domináns módon öröklődik. Ebben az esetben a mutáció az α-szinukleint érinti, amely egy eddig még nem tisztázott funkciójú szinaptikus fehérje. A fehérje elsősorban a preszinaptikus terminálokban fordul elő, ahol a szinaptikus vezikulák lokalizációjának szabályozásán keresztül a szinaptikus transzmisszió befolyásolásában játszhat szerepet. A betegség egy ritka, autoszómális recesszív módon öröklődő fiatalkori változatában a parkin nevű, ismeretlen funkciójú fehérje mutációja figyelhető meg, a tünetek hasonlóak, de ebben az esetben általában nem jelennek meg a Lewy -testek. Feltételezik, hogy a parkin mint egy E3 ubikvitin ligáz komplex tagja egy jelenleg ismeretlen citotoxikus fehérje lebontását segíti elő.

2.3. 6.2.3. Poliglutamin betegségek A poliglutamin betegségek (másként trinukleotid vagy CAG repeat betegségek) a többi aggregációs betegséghez hasonlóan progresszív, halálos betegségek, kiváltó okuk minden esetben egy-egy idegrendszeri fehérje aggregációja. A legismertebb ide tartozó kórképek a Huntington kór, a spinobulbáris izomatrófia és a spinocerebelláris ataxia különböző típusai. A Huntington kór példáján mutatjuk be ezeket a betegségeket. A Huntington kórban az ismeretlen funkciójú ubikviter, igen sok jelátvitelben, sejtciklusban, transzkripcióban szerepet játszó fehérjével kölcsönhatásba lépő fehérje, a huntingtinmutációja figyelhető meg. A 4. kromoszómán található gén harmadik exonja egy szokatlan, ismétlődő poliglutamin szakaszt kódol, amelyben a glutamin egészséges egyedekben is többször megismétlődik. A kisszámú ismétlődés önmagában még nem okoz problémát, viszont a glutamint kódoló ismétlődő CAG kodon a DNS replikációja során hajlamos stabil hajtű szerkezetet kialakítani, és replikációs csúszást okozni, ami az ismétlődések számának megnövekedésében nyilvánul meg. Ez a tendencia annál erőteljesebben jelentkezik, minél nagyobb a CAG kodon ismétlődési száma, tehát a poliQ régió növekedése önmagát erősítő módon történik meg. A betegekben a glutamin ismétlődési száma a 120-at is elérheti, ami már a fehérje oldhatóságának csökkenésével jár, és aggregátumok kialakulásához vezet. A betegség kialakulása egyértelmű korrelációt mutat a poliQ szakasz fizikai tulajdonságaival, mintegy 30 ismétlődés alatt a poliQ szakasz rendezetlen és oldható állapotban van, míg efölött oldhatatlan β szerkezet kialakulása közben stabilizálódik. A Huntington betegség esetében tehát gyakran megfigyelhető, hogy a glutamin ismétlődési száma generációról generációra növekszik, és ezzel párhuzamosan a betegség egyre fiatalabb korban és súlyosabb formában jelentkezik. A betegség neuropatológiai alapja az aggregátumok intracelluláris megjelenése és az ennek következtében lejátszódó sejtpusztulás. A folyamatban szerepet játszhat egyes sejtfehérjéknek az aggregálódott huntingtinhez való megváltozott kötődése. A tünetek leggyakrabban 40-45 éves korban jelennek meg. A neuronok pusztulása a legnagyobb mértékű a nucleus caudatus és putamen területein, így az akaratlagos mozgások szabályozása sérül leginkább. A mozgáskoordinációs zavarok között merevség (rigor ), és akaratlan, rángásos mozdulatok (hiperkinézis ) figyelhetők meg, amelyek a betegség későbbi szakaszában beszéd- és nyelési nehézségeket okoznak. A kontrollálatlan mozgást gyakran vitustáncnak (chorea) nevezik. A beteg állapotának fokozatos romlása mintegy 10-15 év alatt halálhoz vezet. A fiatalkori forma gyorsabb lefolyású.

3. 6.3. Prion betegségek 37 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A fehérjetekeredés (folding) patobiokémiája Ebbe a betegségcsoportba számos régóta ismert, valamint több újonnan felbukkanó kórkép tartozik, melyeknek közös patomechanizmusára csak nemrég derült fény. A legrégebben, több mint 200 éve ismert prion betegség a juhokat megbetegítő scrapie (surlókór). A kuru (nevetőhalál) a kannibálok járványszerűen terjedő betegsége, melyet az emberi agyvelő fogyasztása okozott. A prion betegség további ismert formái, a Creutzfeldt-Jakob betegség, a Gerstmann-Straussler-Scheinker szindróma és az öröklődő halálos álmatlanság igen gyors lefolyású neurodegeneratív betegségek. A prion betegségek egyik újabban leírt válfaja a kergemarhakór vagy szarvasmarha szivacsos agysorvadás (Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE). A fenti betegségek esetén a fertőző jelleget igen hamar felismerték, azonban a kórokozót sehogyan sem találták. Az egymástól látszólag független betegségek patológiájának hasonlóságait felismerve megalkották a "lassú vírus" hipotézist. A lassú vírusok olyan betegségeket okoznak, melyekre a hosszú lappangás, a tünetek lassú, de halálhoz vezető kifejlődése és rendszerint központi idegrendszeri károsodás jellemző. Kimutatták azonban, hogy a kórokozó ellenáll a hagyományos patogének elleni kezelésnek (UV besugárzás, DNáz kezelés, hőkezelés, kémiai sterilizáció). A kórokozó izolálásával kiderült, hogy csak fehérjét tartalmaz, a hagyományos értelemben vett örökítő anyagot (DNS, RNS) nem. Ez a megfigyelés volt a „csak fehérje" hipotézis alapja, amely szerint a betegség terjedéséért egy hibás szerkezetű, önmaga szerkezetét replikáló fehérje (proteinaceous infectious particle, prion) a felelős. A prion tulajdonképpen fertőző amiloid, mely háromféle módon jelenhet meg a szervezetben: mutáció révén, sporadikusan a fehérjeszerkezet spontán változásával, illetve zoonózisként. A szervezetben kialakulva vagy oda bejutva a normális térszerkezetű azonos fehérje szerkezetét a maga képére formálja. Ennek megfelelően, a prion fehérje génjére homozigóta null-mutáns egerekben nem lehet prion betegséget kiváltani. A normál prion fehérje funkciója ismeretlen: hiánya állatmodellben nem okoz tüneteket. Feltételezik, hogy a hosszú távú memória kialakításában lehet szerepe. A fehérje betegséget nem okozó formáját PrPC-nek (celluláris forma), a patológiásan átalakultat PrPSc-nek (scrapie forma) nevezik. A sporadikus formákban a PrP C és PrPSc között az aminosav sorrendben vagy poszttranszlációs módosításokban nincs különbség, csupán konformációs eltérés figyelhető meg közöttük, amennyiben a PrPC-ben az α-hélix, a PrPSc-ben a β-redő dominál. A két formát legegyszerűbben proteolítikus érzékenységük különbsége alapján lehet elkülöníteni. Az örökletes betegségeket mutációk okozzák, amelyek közül eddig több tucatnyit azonosítottak. A mutációk elsősorban a fehérje helikális szakaszait érintik. Ha a fertőzés a táplálékkal jut a szervezetbe, akkor a prionok rendszerint a bélből a nyirokrendszer közvetítésével jutnak el a központi idegrendszerbe. A konformáció-változás előidézésével kapcsolatban kétféle elképzelés létezik, mindkettő a PrP C és PrPSc fizikai kontaktusát feltételezi, és az átalakulás autokatalitikus jellegét hangsúlyozza. A heterodimer vagy templátasszisztált modell szerint a PrPSc heterodimert képez a PrPC-vel, majd katalizálja konverzióját PrPSc-vé. A modell feltételezi, hogy a PrPSc termodinamikailag stabilabb, mint a PrP C, de a PrPC → PrPSc átalakulás kinetikailag gátolt, az aktiválási energiát a PrPSc, mint katalizátor szolgáltatja. A modell hiányossága, hogy az aktiválás energiaforrásáról nem tudunk, illetve eddig PrP Sc monomert nem sikerült kimutatni. Ezeket a problémákat próbálja megoldani a nukleációs-polimerizációs modell azt feltételezve, hogy a PrPSc nem monomer állapotban, hanem oligomerként működik katalizátorként, illetve így stabilizálódik. A két modell csak a mechanizmus molekuláris részleteiben különbözik, kinetikai megnyilvánulásuk jól írja le a betegség megfigyelt lefolyását. A fertőzéssel kapcsolatos konformációs átmenetre vonatkozóan az egyik legérdekesebb megfigyelés a fajok közötti átvitel nehézségére utaló „faji korlát" megfigyelése. Eszerint egyik fajból a másikba sokszor lehetetlen átvinni a priont, a fertőző fajának megfelelő prion fehérje transzgénjét hordozó fajba azonban igen, amit az eltérő fajból származó PrPC és PrPSc formák nem produktív kölcsönhatásával magyaráznak. Az emberi prionbetegségek lefolyása eltérő, annak ellenére, hogy ugyanazon fehérje kóros konformációváltozása okozza őket. Ennek a látszólagos ellentmondásnak az a magyarázata, hogy a vad típusú és a különböző mutációkat hordozó prion fehérje többféle amiloid konformációt is kialakíthat (prion törzsek), amelyek a vírustörzsekhez hasonlóan stabilan fenntarthatók. A különböző törzsek, bár mindegyikre jellemző az agy szivacsszerű degenerációja, eltérő neuronális léziókat okoznak. Az ennek következtében kialakuló tünetek, a betegség lappangási ideje, lefolyása és súlyossága is eltérő. A neurodegeneratív betegségekre jellemző általános tünetek: mozgáskoordinációs zavarok, kóros reflexek és izommerevség, bénulás, elbutulás, nyugtalanság, zavarodottság, depresszió a prion betegségekben is jelentkeznek. A patológiás elváltozások között az agyszövet szivacsos degenerációja, az idegsejtek számának megfogyatkozása, és a prion aggregátum lerakódása a legjellemzőbbek. Megjegyzendő, hogy a prionokra jellemző indukált konformációs változásokat ki lehet mutatni a többi amiloidózisban (Aβ amiloidózis, amiloid A amiloidózis, tauopátia, szinukleinopátia), valamint poliglutamin betegségek, szuperoxid dizmutáz-1 aggregáció esetén is.


A fehérjetekeredés (folding) patobiokémiája

4. 6.4. Egyéb konformációs betegségek A megváltozott konformáció miatti fokozott aggregációs hajlamot lehet megfigyelni a sarlósejtes anémiában (hemoglobin mutáció: HbS), szürkehályogban (krisztallinok), és sok más emberi betegségben is.


7. fejezet - A szekréciós pálya patobiokémiája és az UPR Az eukarióta sejt egyik legfontosabb jellegzetessége a membránnal körülvett organellumok létezése a citoplazmában. A sejt kompartimentációja lehetőséget teremt arra, hogy speciális aktivitások egymástól térben elkülönülten működhessenek. A sejt endomembrán rendszerén belül az endoplazmás retikulum, a Golgi, az endoszómák és a lizoszómák, valamint az őket egymással és a sejtfelszínnel funkcionálisan összekötő vezikulák egymással szorosan összefüggő rendszert, a szekréciós pályát alkotják. A rendszer elemei bár térben elkülönülnek, de időben folyamatosak; így az endoplazmás retikulumhoz kötött riboszómákon szintetizálódó fehérjék, valamint az ugyanott képződő membránalkotó lipidek a szekréciós pálya bármely pontján felbukkanhatnak. A szekréciós pálya luminális kompartimentumának jellemzői sok tekintetben hasonlítanak az extracelluláris térre, így azt a sejt belső külvilágának tekinthetjük. A szekréciós pálya működését örökletes és szerzett betegségek egyaránt károsíthatják. Az örökletes kórképek alapvető okai nagyjából három csoportba sorolhatók. Legsúlyosabbak a biogenezis zavarai, melyek az adott kompartimentum teljes funkciókiesésével járnak. Ennek részleges példáival a lizoszómális betegségek körében találkozhatunk. A membrántranszport zavarai közvetlenül vagy közvetetten befolyásolhatják az intraluminális folyamatokat, a szubsztrátellátás elégtelenségét vagy a termékek felhalmozódását okozva. Végül a kompartimentumra jellemző enzimek defektusa a szubsztrátok intraluminális akkumulációjával jár. A háromféle patogenezis végső eredménye azonban hasonló, az úgynevezett tárolási betegségekben manifesztálódnak, melyeknek az endoplazmás retikulumra, a Golgira és a lizoszómákra specifikus változatai egyaránt ismertek. A szekréciós pálya szerzett betegségei általában a luminális homeosztázis megzavarása révén fejtik ki hatásukat. Ezekben az esetekben általában egy alapbetegséghez (pl. vírusfertőzés, elhízással kapcsolatos kórképek, anyagcserebetegségek) társulnak a szekréciós pálya zavarai. A szekréciós pálya genetikai eredetű és szerzett betegségei egyaránt kiváltják a sejt védekező mechanizmusait, s így másodlagos patológiás eltérések kiindulópontjai lehetnek. A lumen összetételének változását a sejt stresszként érzékeli (organellum stressz). A szekréciós pálya adott tagja és a sejtmag között beinduló jelátviteli mechanizmusok segítenek a stressz megoldásában, illetve hosszasan fennálló, leküzdhetetlen distressz esetén beindítják a programozott sejthalál mechanizmusait.

1. 7.1. Fehérjeszintézis az endoplazmás retikulumon Az endoplazmás retikulum felszínéhez kötődő riboszómákon történik a szekréciós és membránfehérjék szintézise. A szintetizálódó fehérjék a transzlációval egyidejűleg a transzlokon peptid csatornán (Sec61 komplex) keresztül bejutnak az endoplazmás retikulum lumenébe, ahol poszttranszlációs módosításokon mennek át, és felveszik natív konformációjukat. Ezeknek a fehérjéknek a foldingját az endoplazmás retikulum lumenben speciális dajkafehérjék végzik, melyek három kategóriába sorolhatók. (1) A foldázok fokozzák a folding egyes lépéseinek sebességét. Tipikus képviselőjük a peptidil-prolil cisz/transz izomeráz, ide tartoznak még a diszulfid hidak kialakításáért felelős elektron transzfer lánc oxidoreduktázai (protein diszulfid izomeráz, ERp72, Ero1 stb.). Mivel az endoplazmás retikulumban lejátszódó fehérjetekeredés – eltérően a legtöbb kompartimentumtók – oxidatív reakciókat is magában foglal, azt oxidatív protein foldingnak nevezzük. (2) A molekuláris dajkafehérjék elősegítik a natív konformáció kialakulását, de nem gyorsítják a folyamatot. Szerepük van a minőségellenőrzési folyamatokban is. A citoszólban található megfelelőikkel azonos csoportokba sorolhatók, jellegzetes képviselőik a glukóz-regulált dajkafehérjék (GRP78, GRP94). (3) A lektinszerű dajkafehérjék (kalnexin, kalretikulin) a glikoproteinek foldingjában és minőségellenőrzésében vesznek részt. Az endoplazmás retikulum dajkafehérjéi működésükhöz a környezet megfelelő redoxpotenciálját, energiaellátottságát (ATP) és kalciumszintjét igénylik. A foldingban résztvevő, a fentiekben felsorolt fehérjék szerepe meglehetősen általános, az újonnan szintetizálódott fehérjék nagy részének foldingját elősegítik. Ismertek azonban olyan dajkafehérjék is, melyek csak egy vagy néhány ügyfélfehérje foldingjára szakosodtak. Ilyen például a Hsp47, a prokollagén chaperonja, vagy az egazin, a β-glukuronidázt az endoplazmás retikulum lumenben megtartó membránfehérje. Az endoplazmás retikulum luminális kompartimentumának összetétele jellegzetes, és fontos a folding szempontjából. Jól ismert pl. a citoszólnál több mint három nagyságrenddel magasabb, az extracellulárissal közel azonos intraluminális kalcium koncentráció. A fehérjeszekrécióban résztvevő sejtek endoplazmás


A szekréciós pálya patobiokémiája és az UPR retikulumában a fehérjekoncentráció is igen magas (150-200 g/l, ~2 mM). A magas fehérjekoncentráció miatt a diffúziós állandó alacsonyabb a lumenben, tehát a fehérje-fehérje kölcsönhatások valószínűsége növekszik. Ez a körülmény megkönnyíti a foldinghibák megjelenését, ezért az intraluminális dajkafehérjék mennyisége is igen magas. Ismert, hogy a kis redox-aktív molekulák közül a glutation diszulfid (GSSG) koncentrációja magasabb, míg a (redukált) glutationé (GSH) alacsonyabb a lumenben, mint a citoszólban. A citoszólra jellemző GSH/GSSG arány 30-100:1, míg az endoplazmás retikulum lumenben 1-3:1. A lumen tiol-diszulfid redoxpotenciálja tehát jóval magasabb a citoszólénál. Minden olyan hatás, mely a lumen homeosztázisát befolyásolja (pl. a fehérjekoncentráció emelkedése, a kalciumszint csökkenése, a GSH/GSSG arány változása) hatással van az oxidatív folding lefolyására, ezáltal endoplazmás retikulum stresszt okoz, mely beindítja a később ismertetendő stresszválaszokat.

1.1. 7.1.1. A szekréciós fehérjék minőségi ellenőrzése A nem-natív konformációjú fehérjék a natívnál magasabb energiaszintet képviselnek. Ezt a hidrofób aminosav oldalláncoknak a fehérje felszínén való megjelenése okozza. A folding hibás termékeit tehát egyrészt a felületi hidrofóbicitás, másrészt specifikus poszttranszlációs módosításaik (glikoziláltság, diszulfid hidak) megléte vagy hiánya alapján lehet felismerni. A minőségellenőrzési mechanizmusok már a szekréciós pálya kezdetén (többnyire az endoplazmás retikulumban) felismerik az ilyen fehérjéket, és megakadályozzák továbbhaladásukat a vezikuláris transzport pályáján. A legfontosabb hibafelismerő dajkafehérjék a GRP78 (alias BiP) és az UGGT (UDP-glukóz:glikoprotein glikoziltranszferáz). A BiP N-terminális ATP/ADP és C-terminális szubsztrátkötőhellyel rendelkező dajkafehérje. Az ADP-t kötő BiP nagy affinitással köti a nem-natív konformációjú fehérjék rövid felszíni hidrofób szakaszait. Az ADP cseréje ATP-vel a szubsztrát távozásához és további foldingjához vezet. Mind a nukleotid cserét, mind az ATP hidrolízisét co-chaperonok szabályozzák. A glikoproteinek minőségellenőrzésének kulcsenzime az UGGT, a folyamatot kalnexin ciklusnak nevezik. A szekréciós és membránfehérjék nagyrésze glikoprotein. N-glikozilációjuk kotranszlációsan megkezdődik, amint a fehérje megjelenik a lumenben. A transzlokon luminális végénél elhelyezkedő oligoszachariltranszferáz felismeri a konszenzus glikozilációs motívumot (Asn – X – Ser/Thr). Az aszparagin oldalláncra ezután az oligoszachariltranszferáz átviszi a dolichol-pirofoszfát hordozón már összeszerelt oligoszacharid szerkezetet, mely két N-acetilglukózamin, kilenc mannóz és három glukóz egységből áll. Az N-glikozilált fehérjén ezután megkezdődik az oligoszacharid oldallánc módosítása. A két disztális glukózt a glukozidáz I és glukozidáz II enzimek távolítják el, ezután a glikoprotein a kalnexinhez kötődik. A tekeredés befejeztével a végleges konformációját felvett glikoprotein felszabadul a fehérje-fehérje kölcsönhatásokból, és elindulhat a szekréciós pályán. A foldinghibás fehérjék viszont disszociációs-reasszociációs körforgásba kerülnek; a disszociált glikoprotein deglukozilálódik/reglukozilálódik a glukozidáz II és az UGGT katalizálásával. A reglukozilációhoz UDP-glukóz szükséges. Az UGGT a foldinghibás fehérjék felületi hidrofób szekvenciáit és oligoszacharid oldalláncait egyidejűleg képes felismerni. A glukóz egység újbóli beépítése visszaküldi a fehérjét a kalnexin ciklusba. A fehérje többször is átmehet a glikoziláció-deglikozilációs cikluson, ami időt ad a glikoprotein érésére. A mannóz egységek lehasítása a glikoproteinről véget vet a folding próbálkozásoknak és a véglegesen selejtnek ítélt fehérjét a citoszólba való visszajuttatásra ítéli, ahol az proteaszomális lebontás áldozata lesz (endoplazmás retikulum asszociált degradáció, ERAD). A kalnexin ciklusból a kijáratot az α(1,2)-mannozidáz őrzi; a reakció lassú („mannóz-timer”) és időt ad a foldingra.

2. 7.2. Az endoplazmás retikulum stressz Az intraluminális környezet bármilyen változása, illetve az organellumra jellemző reakciók abszolút vagy relatív elégtelensége egyaránt kiválthatja az endoplazmás retikulum stresszválaszt. Minthogy az endoplazmás retikulum legfontosabb funkciója a fehérjeszintézis, a legtöbb endoplazmás retikulum stresszt kiváltó okot a fehérjeszintézis, poszttranszlációs módosítás és folding területén írták le. Viszonylag keveset tudunk a lipidek, szénhidrátok és xenobiotikumok endoplazmás retikulum-függő metabolizmusával kapcsolatos stresszről. Az endoplazmás retikulum stresszre adott sejtválasznak két fő összetevője van. Egyrészről a sejt növeli az endoplazmás retikulum méretét és funkcionális kapacitását a membrán foszfolipidek és az endoplazmás retikulum chaperonok, foldázok és lektinek fokozott szintézisével. Másrészről megpróbálja az endoplazmás retikulumra nehezedő terhelést csökkenteni a transzláció leállításával és a felhalmozódott fehérjék proteolízisével. Ha ezek a mechanizmusok elégtelennek bizonyulnak, a sejt apoptózis révén felszámolja magát. 41 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A szekréciós pálya patobiokémiája és az UPR Az endoplazmás retikulum stresszel összefüggő jelátviteli pályák aktivitása minden sejtben kimutatható. Ez az alapaktivitás feltehetőleg szerepet játszik a tápláltsági állapot fiziológiás érzékelésében és a legfontosabb tápanyagok (glukóz, aminosavak) ingadozó szintjéhez való alkalmazkodásban. Ennek megfelelően az endoplazmás retikulum stressz több fiziológiás mechanizmusban is fontos szerepet játszik. A legismertebb példák: a B-limfocita átalakulása szekrécióra specializálódott plazmasejtté, valamint a májsejt endoplazmás retikulum proliferációja a biotranszformációs enzimek indukciója esetén, pl. fenobarbitál hatására. Az igazi patológiás endoplazmás retikulum stresszt okozhatják genetikai eltérések, illetve exogén hatások (pl. vírusinfekció, farmakológiai ágensek). Az utóbbiakat gyakran használják kísérletes endoplazmás retikulum stressz kiváltására. A legfontosabb ilyen ágensek a következők: • a fehérjeglikoziláció gátlószerei; • intraluminális kalciumot csökkentő szerek: Ca2+-ATPáz gátlók, ionofórok (hatásuk közvetett: a legtöbb intraluminális enzim (chaperonok, glikoziláció enzimei, oxidoreduktázok) optimális működéséhez szükséges a lumen normális kalciumkoncentrációja); • intraluminális redoxpotenciált befolyásoló redukáló- és oxidálószerek (a protein diszulfid izomeráz és más tiol-diszulfid oxidoreduktázok működéséhez szükséges optimális redoxpotenciált (-180 mV) változtatják meg, jelenlétükben a diszulfid kötések képződése zavart szenved); • integráns membránfehérjék és szekréciós fehérjék túltermelése (pl. vírusinfekció), mutáns fehérjék termeltetése.

3. 7.3. Jelátvitel az endoplazmás retikulum és a sejtmag között A minőségellenőrzésen megbukott fehérjék nem indulhatnak el a szekréciós pályán. További sorsuk többféle lehet. Kaphatnak még egy lehetőséget, további foldingon esnek át a lumenben, fokozva a zsúfoltságot és ezáltal stresszpályákat aktiválva. Visszakerülhetnek a citoszólba, ahol proteaszóma által végrehajtott proteolízisen esnek át (ERAD). Ha a retrotranszlokáció gátolt – például a foldinghibás fehérje aggregációs hajlama miatt – a makroautofágia folyamatában történik meg a proteolízis, az endoplazmás retikulum egy részével együtt (ERfágia). A fenti eseményekről több jelpálya szállít információt a sejtmagba. (Mivel a magot körülvevő membrán része az endoplazmás retikulumnak, a jelpályának nem kell szükségszerűen érintenie a citoszólt.) Közülük itt csak a legjobban ismertet, a selejtfehérje-választ (unfolded protein response, UPR) tárgyaljuk.

4. 7.4. Selejtfehérje válasz (unfolded protein response, UPR) Az endoplazmás retikulum lumenéből a selejtes fehérjék felhalmozódásáról transzmembrán fehérjék adnak hírt. Három fő szenzort ismerünk: IRE1, PERK és ATF6. Stresszmentes helyzetben ezen fehérjék N-terminális luminális doménjei BiP-pel kapcsolódnak. Endoplazmás retikulum stressz esetén a felhalmozódó selejtfehérjék kivonják a kötésből a BiP-et, az IRE1 és PERK fehérjék oligomerizálódással és autofoszforilációval, míg az ATF6 limitált proteolízissel aktiválódik. Az IRE1 extraluminális része kináz és endoribonukleáz doméneket tartalmaz. Az oligomerizálódott IRE1 transzautofoszforilálódik és így aktiválódik. Az aktív IRE1 egy tRNS ligázzal és egy NAD +-függő foszfatázzal együttműködve kihasít egy darabot az XBP1 elsődleges mRNS-éből. (A folyamat a pre-tRNS érésére emlékeztet.) Az átalakított mRNS átíródik fehérjévé, s az így képződött XBP1S transzkripciós faktorként működve fokozza az UPR célgének átíródását. Az ide tartozó gének promótere tartalmaz egy 22 bázispárból álló UPR elemet (UPRE), melyet minden UPR során indukálódó fehérje génjében megtaláltak. Az indukálódó fehérjék az endoplazmás retikulum membrán proliferációjához szükséges foszfolipid bioszintézisben, a foldingban (luminális chaperonok, glikoziltranszferázok), a minőségellenőrzésben és az ERAD-ban vesznek részt. A PERK citoplazmában lévő doménje oligomerizálódás után protein kináz aktivitású, az eukarióta iniciációs faktor 2α (eIF2α) szerinjét foszforilálja, ezzel gátolja a transzlációt. Ennek hatására először a rövid élettartamú fehérjék tűnnek el a sejtből, például a ciklin D1. A ciklin D1 eltűnése az ER stressz során leállítja a sejtciklust 42 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A szekréciós pálya patobiokémiája és az UPR G1 fázisban. Néhány fehérje transzlációját azonban nem gátolja az eIF2α foszforilációja, mint például az ATF4 transzkripciós faktorét. Az ATF4 fokozza az aminosav importban és a glutation bioszintézisben szereplő gének expresszióját. A PERK foszforilálja továbbá az Nrf2 transzkripciós faktort is. A foszforilált Nrf2 az ARE-hez (antioxidant response element) kötődve indukálja a biotranszformáció második fázisának sok enzimét (glutation-Stranszferáz, NADPH:kinon oxidoreduktáz, γ-glutamilcisztein-szintetáz, UDP-glukuronoziltranszferáz). Az ER stressz az egész sejt redox (antioxidáns) homeosztázisát felboríthatja, a fenti mechanizmus ez ellen nyújt védelmet. Az ATF6 C-terminális luminális doménje két Golgi lokalizációs szekvenciát (GLS1 és GLS2) tartalmaz. Az ATF6 működését is a BiP kötődése szabályozza, mely megakadályozza a fehérje továbbjutását a Golgiba. BiP kötés hiányában, vagyis endoplazmás retikulum stressz esetén az ATF6 a Golgiba vándorol, két helyi proteáz (S1P és S2P) által katalizált limitált proteolízisen megy át és aktiválódik. A felszabaduló N-terminális citoplazmai rész ezután transzkripciós faktorként funkcionál. Kötődik a DNS ERSE-I és ERSE-II (endoplazmás retikulum stress element) szekvenciáihoz. A kötés indukálja a legtöbb endoplazmás retikulum-rezidens dajkafehérjét és a CHOP/GADD153 proapoptotikus transzkripciós faktort. Az UPR tehát csökkenti a transzlációra nehezedő terhet, illetve növeli a folding kapacitását. Enyhébb stressz esetén ez elegendő ahhoz, hogy a foldinghibás fehérjék feldolgozása után a sejt visszatérhessen rendes működéséhez. Súlyosabb esetben a makroautofágia endoplazmás retikulum-függő fajtája, az ER-fágia aktiválódik. Bár az autofágiát eredetileg a programozott sejthalál egyik típusaként tartották számon, újabb megfigyelések alapján inkább preventív mechanizmusnak tűnik: gátlása fokozza az apoptotikus sejtválaszt ER stressz esetén, míg indukciója a sejtet rezisztensebbé teszi az apoptózissal szemben. Az autofágia tulajdonképpen alternatív ERAD mechanizmust jelent, melynek során nagy mennyiségben tudnak eliminálódni az aggregációra hajlamos foldinghibás vagy rendellenes fehérjék. Az autofagoszómák bekebelezhetik és lebonthatják az ER nagyobb darabjait is, annak tartalmával együtt. Az ER stresszt az autofágiával összekötő jelátviteli módozatok még kevésbé ismertek. Hosszan fennálló, vagy igen erős endoplazmás retikulum stressz előbb-utóbb aktiválja a programozott sejthalál mechanizmusait. Az apoptózis folyamatát intrinsic és extrinsic pályák irányítják. Mivel az endoplazmás retikulum lumene az extracelluláris térhez hasonló, nem meglepő, hogy az endoplazmás retikulum stressz mind az intrinsic, mind az extrinsic mechanizmusra jellemző vonásokat mutat. Az endoplazmás retikulum egyes károsodásaira jellemző, hogy melyik útvonalat indítják be. Az intrinsic jelpálya részeként stressz hatására az endoplazmás retikulum membránban a Bak és Bax proapoptotikus fehérjék (a mitokondriális eredetű apoptózissal analóg módon) konformációváltozáson és/vagy oligomerizáción mennek át, melynek eredményeképpen a lumenben raktározott Ca2+ felszabadul. Az emelkedett citoplazmai [Ca2+] aktiválja a kalpain nevű proteázt, mely az endoplazmás retikulumra specifikus kaszpáz kaszkádot indít be. A felszabadult kalciumot a mitokondrium veszi fel, ahol a kalciumtúlterhelés a membránpotenciál összeomlásához és a mitokondriális apoptotikus útvonal másodlagos aktiválódásához vezet. Az UPR valamennyi jelpályája kiválthatja a CHOP transzkripciós faktor indukcióját. A CHOP egyebek között a Bcl-2 antiapoptotikus fehérje szintjének csökkenését, a proapoptotikus Bax és Bak fehérjék szintjének emelkedését és mitokondriumba vándorlását váltja ki. Endoplazmás retikulum stresszben az IRE1 heterotrimert képezhet a TRAF2 (TNF receptor-associated factor 2) és az ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase) fehérjékkel, mely a c-Jun N-terminális kináz (JNK) aktiválásán keresztül apoptózishoz vezet. A folyamat rendkívül hasonlít az apoptózis extrinsic, halálreceptorok által kiváltott mechanizmusához, és egyben demonstrálja, hogy az endoplazmás retikulum lumene a sejt belső környezete.

5. 7.5. A szekréciós pályával összefüggő betegségek A szekréciós pályával összefüggő örökletes betegségek nagyrészét a szekréciós fehérjék génjének mutációja okozza, mely a termék tekeredésének zavarához vezet. Ilyenkor a fehérje megbukik a minőségellenőrzésen és az endoplazmás retikulum lumenben reked. Attól függően, hogy a mutáns fehérje funkcióképes-e vagy sem, illetve szubsztrátja lehet-e az ERAD-nak, több alcsoportot különböztethetünk meg. a. A mutáns fehérje funkcióképes lenne, csak azért marad a lumenben, mert a minőségellenőrzés selejtként ismeri fel. Ennek a csoportnak kiemelkedő fontosságú példája a cisztikus fibrózis. A mutáció által érintett CFTR (cisztikus fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor) fehérje az ABC-transzporterek családjába 43 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A szekréciós pálya patobiokémiája és az UPR tartozó plazmamembrán klorid csatorna, mely a glutation transzportjában is szerepet játszik. A mutáció nem érintené a fehérje transzporter működését, de a hibás folding miatt az nem jut el rendeltetési helyére. A mutáns fehérjét végül az ERAD mechanizmusa lebontja. A kórkép gyakorisága a kaukázusi rasszban 1:2500. A klorid transzport defektusa miatt a légutak és bélcsatorna a normálisnál sűrűbb nyákot termel, mely egyebek mellett légúti obstrukciót és ismétlődő bakteriális fertőzéseket okoz. A betegség mintegy 30 év alatt halálhoz vezet. A vad típusú fehérje génterápiás bevitele, a minőségellenőrzési rendszer farmakológiai elbutítása, illetve kémiai chaperonok alkalmazása enyhítheti a tüneteket. b. A mutáns nem működőképes, és az ERAD le tudja bontani. Ez a mechanizmus található meg egyebek között a familiáris hiperkilomikronémia (a lipoprotein lipáz érintettsége miatt), a hemofília A (VIII. faktor), a hiperkoleszterinémia (LDL receptor) által okozott betegségekben. A csoport legismertebb tagja mindazonáltal az α1-antitripszin deficiencia, mely a krónikus obstruktív tüdőbetegség egyik fontos rizikófaktora. c. A mutáns nem működőképes, felhalmozódik és aggregálódik a lumenben, mivel az ERAD nem tudja lebontani. Ezekben az esetekben a fehérje hiányát az endoplazmás retikulum dilatációja, károsodása és a következményes endoplazmás retikulum-függő autofágia vagy apoptózis súlyosbítja. Általában dominánsan öröklődő betegségek, az endoplazmás retikulum dajkafehérjéinek kifejezett indukcióját tartják fenn. Egyes neurodegeneratív betegségek, illetve az inzulin mutációja által okozott diabétesz egyik állatmodellje tartoznak ide. A szekréciós pálya szerzett betegségei általában egy alapbetegség patomechanizmusának részeként jelennek meg. Számos kórkép esetében megfigyelhető, hogy az endoplazmás retikulum stressz adaptív mechanizmusként aktiválódik. Akut kórképek esetén a folyamat segítheti a normál állapot helyreállítását, azonban krónikus esetekben sokszor inkább súlyosbítja a helyzetet. A legtöbb esetben a betegség által okozott redox egyensúlyzavar vagy anyagcserezavar tevődik át az endoplazmás retikulum lumenére, ahol az oxidatív folding károsításán keresztül vált ki endoplazmás retikulum stresszt. Az idetartozó kórképek listája> napról napra bővül: a hipoxiával járó kórképek, a neurodegeneratív betegségek, az elhízással járó anyagcserezavarok és a daganatos betegségek a legfontosabbak az ide tartozó betegségek közül.


8. fejezet - Fehérjelebontás – a lizoszóma A lizoszómák membránnal körülvett, változó méretű és megjelenésű organellumok. Elsődleges fontosságúak a sejt proteosztázisának szabályozásában. Szerepük a sejtből, valamint az extracelluláris térből származó anyagok – elsősorban makromolekulák – lebontása. Ezeket a reakciókat a lizoszóma lumenének savas hidrolázai katalizálják, melyek lipideket, szénhidrátokat, fehérjéket és nukleinsavakat egyaránt képesek bontani. A hidrolítikus reakciók savas pH (~5) mellett működnek optimálisan, melyet a lizoszóma membrán H+-ATPáza hoz létre. Az alacsony intraluminális pH hozzájárul a szubsztrátok denaturálódásához is. A hidrolázok savas pHoptimuma megakadályozza, hogy esetlegesen a citoszólba kikerülve nagy aktivitással tovább működjenek. Újabb megfigyelések szerint a lizoszómák magas kalcium tartalma (~0,5 mM) is szükséges megfelelő működésükhöz. A lebontandó makromolekulákat még nem tartalmazó, úgynevezett elsődleges lizoszóma elektronmikroszkóposan homogén szerkezetű, szabályos gömb alakú. A másodlagos lizoszóma már tartalmazza a lebontásra ítélt molekulákat és/vagy organellumokat, alakja változatos lehet és belseje egyenetlen. Egyes sejttípusokban a lizoszómák specializált formái (LRO, lysosome related organelles) figyelhetők meg. Ilyen például a melanoszóma a bőrben, a lítikus granulum a citotoxikus T-limfocitában, a trombociták granulumai, a lamelláris testek az alveoláris epiteliális sejtekben. A lizoszómákat érintő patológiás változások számos emberi betegség (lizoszomális tárolási betegségek, neurodegeneratív kórképek, mérgezések stb.) patomechanizmusában szerepelnek. Ezek a kórképek háromféle módon jöhetnek létre. Károsodhat (általában genetikai alapon) a lizoszomális enzimek szintézise vagy lizoszómába irányítása, a szubsztrátok lizoszómába juttatása, illetve a lizoszóma lumen megfelelő ion- és pH homeosztázisa.

1. 8.1. A lizoszomális proteóma kialakulása A lizoszomális enzimek az endoplazmás retikulum felszínéhez kapcsolódó riboszómákon szintetizálódnak, majd a lumenből vezikuláris transzporttal a Golgiba kerülnek. A cisz-Golgiban a leendő lizoszomális fehérjék szénhidrát oldalláncainak specifikus mannózai mannóz-6-foszfáttá foszforilálódnak. A reakciót két enzim katalizálja. Az első lépésben az UDP-N-acetilglukózamin:lizoszomális enzim N-acetilglukózamin-1foszfotranszferáz a fehérjéhez kötött oligoszaharid-lánc mannózához köti az N-acetilglukózamin-1-foszfátot és UMP szabadul fel. A második lépésben az N-acetilglukózamin-1-foszfodiészter-N-acetilglukózaminidáz lehasítja az N-acetilglukózamint. A lizoszomális rendeltetésű fehérjéket az első enzim ismeri fel az úgynevezett „jelfolt“ alapján, melyet a natív szerkezetű fehérjékben egymás mellé kerülő aminosav oldalláncok alakítanak ki. Megjegyzendő, hogy sok lizoszomális fehérje nem foszforilálódik ezzel a mechanizmussal, ezek irányításának módja jelenleg ismeretlen. A transz-Golgiban a mannóz-6-foszfát receptorok (MPR) felismerik, és specifikusan kötik a mannóz-6-foszfátot tartalmazó fehérjéket. Az MPR-ek a P-típusú lektinek (vagyis a mannóz-6-foszfát kötő lektinek, idem per idem) közé tartozó integráns membránfehérjék, intraluminális doménjük tartalmazza a mannóz-6-foszfát kötőhelyeket. Az MPR-ek megtalálhatók a transz-Golgiban, a korai, a késői és a sejtfelszínre visszatérő endoszómában valamint a plazmamembránban, de hiányoznak a lizoszómákból. A receptor ezek között az organellumok között vándorol, útvonalát a citoplazmai domén szignál szekvenciái határozzák meg. A lizoszomális enzim - MPR komplexek a transz-Golgit klatrinnal fedett vezikulákban hagyják el. A receptor a C-terminushoz közel citoplazmai irányultságú anionos aminosav oldalláncokat és egy dileucin motívumot (ACLL) tartalmaz, melyet GGA (Golgi-localized, gamma adaptin ear-containing, ADP-ribosylation factor-binding) adapter fehérjék ismernek fel. A GGA fehérjék a receptor mellett klatrin köpenyfehérjét és ADP-ribozilációs faktort is kötnek, melyek szükségesek a transzport vezikula kialakulásához. A kölcsönhatásokat a 150 aminosavból álló VHS domén szervezi, mely sok fehérjében megtalálható, fehérje – fehérje interakciókért felelős szekvencia. A transz-Golgiból elinduló vezikulák klatrin burkolatuktól megválva a korai endoszóma felé vándorolnak, majd egybeolvadnak azzal. A cél felismerésében és a fúzióban SNARE (soluble N-ethyl-maleimide-sensitive attachment receptor) fehérjék vesznek részt. Az endoszóma érése során a csökkenő luminális pH hatására a 45 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Fehérjelebontás – a lizoszóma

mannóz-6-foszfát foszfátcsoportjának negatív töltése csökken és leválik az MPR-ről. Az MPR a korai és késői endoszómából vezikuláris transzporttal, különböző irányító mechanizmussal visszakerülhet a transz-Golgiba. A korai és késői endoszómából az MPR egy része további vezikuláris transzporttal eljuthat a plazmamembránig. A sejtfelszínen mannóz-6-foszfát-tartalmú ligandokat és más, nem glikozilált fehérjéket köthetnek. Ez lehetőséget ad lizoszomális fehérjék sejtbe juttatására, melynek terápiás jelentősége van néhány lizoszomális betegség kezelésében. A sejtfelszínről az MPR AP2-t tartalmazó, klatrinnal fedett vezikulák révén gyorsan internalizálódik, amit több internalizációs szekvencia segít elő. A folyamat végállomása a korai endoszóma, mely így központi szerepet játszik az MPR irányításában. Többféle sejtben (hepatociták, Kupffer sejtek, leukociták) és számos szervben (pl. máj, vese, agy) a lizoszomális enzimek szintje normális a mannóz-6-foszfát jel szintézisének hiányában is (pl. I-sejt betegségben). Tehát a mannóz-6-foszfát jel nem az egyedüli, alternatív lehetőségeknek is léteznie kell. A savas foszfatáz és a glukocerebrozidáz például semmilyen sejttípusban nem tartalmaz mannóz-6-foszfát jelet. A savas foszfatáz transzmembrán fehérje, melynek citoplazmai farka tartalmazza a szignál szekvenciát.

2. 8.2. A lebontandó szubsztrátok felvétele A lebontandó makromolekulák változatos módon kerülhetnek be a lizoszóma lumenébe. Tömegesen vezikuláris úton (endocitózis, fagocitózis, makroautofágia), kisebb adagokban mikroautofágia révén, szelektíven pedig dajkafehérje-függő transzmembrán felvétellel kerülnek be az organellumba.

2.1. 8.2.1. Extracelluláris szubsztrátok Az extracelluláris térből a szubsztrátok endocitózissal juthatnak a sejtbe, majd az endoszóma egyesül az elsődleges lizoszómával. Fagocitózisra képes sejtekben a fagoszóma és az elsődleges lizoszóma fúziója alakítja ki a fagolizoszómát.

2.2. 8.2.2. Intracelluláris szubsztrátok A lizoszómák intracelluláris fehérjéket is bonthatnak. A sejt makromolekuláinak egyensúlyi állapotát biztosító egyik legfontosabb katabolikus folyamat a makroautofágia, melynek során a sejt saját összetevőit lizoszomálisan lebontja, majd az építőköveket újrahasznosítja. A makroautofágia során a sejt lebontásra ítélt részei (citoszól és organellumok egyaránt) dupla, kettős foszfolipidrétegű membránba csomagolódnak. A csomagoló membrán rövid, templátként funkcionáló, valódi lumennel nem rendelkező izoláló membrán formájában jelenik meg gyakran az endoplazmás retikulum közelében, majd egymást követő lépésekben, vezikulák és/vagy ciszternális membrándarabok fúziója révén hosszabbodik (elongáció), míg a kialakuló autofagoszóma körbe nem éri a szekvesztrálandó sejtrészletet. A szekvesztráció befejeződése után az autofagoszóma külső membránja egyesül a lizoszóma membránnal és autofagolizoszóma jön létre, míg a belső membránnal borított vakuóla (melyet autofág testnek is neveznek) a lizoszóma lumenébe kerül. Végül az autofág test membránját és belső tartalmát a lizoszomális hidrolázok lebontják. A mikroautofágia a citoszól fehérjéinek lassú, állandó lebontásáért felelős. Ilyenkor a lizoszóma membránján invaginációk jönnek létre, apró citoszóldarabkák internalizációját okozva. Az internalizált vezikula azután a lizoszómán belül szétesik, és tartalma hidrolízist szenved. Ezek a folyamatok nem specifikusak, de a lizoszóma arra is képes, hogy bizonyos fehérjéket szelektíven hidrolizáljon, melyhez citoszolikus és lizoszomális dajkafehérjékre, valamint a membránban található receptorra van szükség. A dajkafehérje-függő lizoszomális proteolízis éhezésben néhány nap alatt aktiválódik. Ez a szelektív mechanizmus a citoszól fehérjéinek 30%-ának lebontásáért felelős. Fiziológiás jelentőségű lehet, hogy éhezésben elsősorban a glikolízis és a proteaszomális fehérjebontás enzimei hidrolizálnak. A lebontandó fehérjék (pl. ribonukleáz A, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, aldoláz, foszfoglukomutáz, a proteaszóma fehérjéi) lizoszómába irányító KFERQ szignál szekvenciát tartalmaznak. A szekvenciát a citoszólban a hsc73 dajkafehérje ismeri fel. A hsc73-fehérje komplex kötődik a lizoszóma membránjában található LAMP-2A receptorfehérjéhez. A lebontandó fehérje egy még azonosítatlan csatornán keresztül a lumenbe jut, a lizoszomális hsc73 segítségével. (A lizoszomális hsc73 feltehetőleg a citoszólikus hsc73 készletből származik, hiszen ez a fehérje is tartalmazza a KFERQ szignál szekvenciát.) A teljes folyamat hőmérsékletfüggő, telíthető és ATP-t igényel.

2.3. 8.2.3. A végtermékek exportja



A lizoszomális hidrolízis kis molekulatömegű végtermékei az organellum membránján keresztül specifikus transzporterek révén kijutnak a citoszólba, ahol bekapcsolódhatnak különböző anabolikus vagy katabolikus folyamatokba. A transzporterek génjeinek mutációja lizoszomális tárolási betegségeket okozhat, a termékek felhalmozódnak a lumenben.

3. 8.3. Lizoszomális betegségek Lizoszomális betegséget okozhat a lizoszóma biogenezis általános zavara, vagy valamely lizoszomális enzim (vagy transzporter) aktivitásának hiánya. Az előbbi esetben több lizoszomális funkció is hiányozhat, az utóbbi esetben az enzim szubsztrátjai (vagy a transzporter ligandjai) felhalmozódnak a lizoszómákban és lizoszomális tárolási betegség jön létre. A két kategória átfedi egymást, biogenezis zavarokban is létrejöhet másodlagosan a lizoszomális szubsztrátok felhalmozódása.

3.1. 8.3.1. A lizoszóma biogenezis zavarai A lizoszóma biogenezis zavarai ritka, többnyire autoszomális recesszív öröklődésmenetet mutató kórképek. Az I-sejtes betegségben (mukolipidózis III) az UDP-N-acetilglukózamin:lizoszomális enzim N-acetilglukózamin 1foszfotranszferáz aktivitás hiányzik. Érdekes módon a betegekből származó enzim mesterséges szubsztrátokkal működik. A jelenség oka az, hogy az enzim lizoszomális hidrolázokat felismerő alegysége hiányzik. Így azok nem jelölődnek, és nem jutnak el az érett lizoszómáig. Ehelyett a szekréciós útvonalon az extracelluláris térbe kerülnek. A betegségnek elvileg teljes lizoszomális funkcióképtelenséggel kellene járnia. Hogy a helyzet mégsem ez, azt bizonyítja, hogy a mannóz-6-foszfáton kívül más lizoszómába irányító jelnek is kell léteznie. A Hermansky-Pudlak szindróma (HPS) több altípust magába foglaló betegségcsoport, melyet albinizmus, vérzési hajlam és lizoszomális ceroid-lipofuszcin felhalmozódás jellemez. A betegségben több sejtorganellum – melanoszómák, trombocita granulumok, és lizoszómák – érintett, ami azt sugallja, hogy a biogenezishez szükséges faktor hiányzik. A betegségért felelős géneket és azoknak több mutációját azonosították. A HPS fehérjék a fenti organellumok bioszintézisében résztvevő fehérjekomplexek felépítői. A mukolipidózis IV-es típusa neurodegeneratív jellegű lizoszomális betegség pszichomotoros retardációval és szemészeti eltérésekkel. A kórképet a mukolipin 1 fehérje mutációja okozza. A mukolipin 1 a késői endoszómákban és lizoszómákban található nem-szelektív kationcsatorna, melynek szerkezete a TRP csatornákéval rokon. (A TRP – tranziens receptor potenciál – csatornák szintén nem szelektív kationcsatornák, melyek nátrium, kalcium és magnézium ionok számára egyaránt átjárhatók, elsősorban a plazmamembránban találhatók.) A csatornán keresztül történő kalciumáramlás a lizoszómákra jellemző alacsony pH mellett gátolt, míg neutrális pH esetén a csatorna funkcionál. A mukolipin 1 mutációja esetén a lizoszóma biogenezis megreked a pre-lizoszomális, nem savas lumenű vezikulák szintjén. A Chediak–Higashi szindrómát (CHS) a citoszól 430 kDa molekulatömegű CHS fehérjéjének mutációja okozza. A CHS fehérje a lizoszomális mozgásokat irányítja, hiányában nem működik a fagocitózis.

3.2. 8.3.2. Lizoszomális tárolási betegségek A leggyakoribb öröklődő betegségek közé tartoznak, az ide tartozó mintegy 40 kórkép együttes prevalenciája körülbelül 1:5000. Autoszomális recesszív öröklésmenetűek, a Fabry-kór és a Hunter-szindróma kivételével, melyek X-kromoszómához kötött recesszív öröklésmenetűek. A lizoszómákban felhalmozódó szubsztrátok szerint megkülönböztetünk mukopoliszacharidózisokat, lipidózisokat, glikogenózisokat és oligoszacharidózisokat. A felhalmozódás következtében a lizoszómák száma és mérete is nő, elérheti a sejt térfogatának 50%-át. A tárolási betegség tehát visszahat a lizoszóma biogenezisre is, ezekben az állapotokban megfigyelhető a lizoszóma membránfehérjék indukciója. A le nem bontott szubsztrátok exocitózissal vagy a sejtek szétesésével a keringésbe kerülnek és kimutathatóak. A betegségek lefolyása és tünetei hasonlóak lehetnek, általánosak a csontrendellenességek, a szervek megnagyobbodása, a központi idegrendszer defektusai. A terápiás lehetőségek korlátozottak: Gaucher- és Fabry-kór esetén enzimatikus kezelést alkalmaznak, más esetekben korai csontvelő-transzplantáció csökkentheti a tüneteket. A Gaucher-kór a glukocerebrozidáz defektusa. Az enzim a glukocerebrozidokat glukózra és ceramidra hidrolizálja. A kórkép három típusa létezik. A legenyhébb formában csak a makrofágok érintettek, nincsenek neurológiai tünetek, csak máj- és lépmegnagyobbodás és csontléziók. Az élettartamot általában nem befolyásolja. A betegség enzimterápiával jól kezelhető, a bevitt exogén glukocerebrozidázt a makrofágok endocitózissal felveszik. A másik két típus súlyos neurológiai tüneteket és korai halált okoz. A Fabry-kór az α-galaktozidáz A defektusa. Eredményeképpen glikoszfingolipidek halmozódnak fel a lizoszómákban. A tünetek gyermek- vagy serdülőkorban jelentkeznek akut végtag- és hasi fájdalmak 47 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


formájában, néha lázzal. A bőrön angiokeratómák alakulnak ki, a szaruhártyán lerakódások. Idősebb korban veseelégtelenség, szívpanaszok is jelentkezhetnek. A tüneti kezelésen kívül az enzimterápia lehet eredményes: a rekombináns α-galaktozidáz A csökkenti a fájdalmat és a szövődmények kockázatát. A további lizoszomális tárolási betegségeket az alábbi táblázat foglalja össze: Lizoszomális (eponim)

tárolási

betegség A hiányzó enzimaktivitás

A felhalmozódó szubsztrát

Mukopoliszacharidózis I (Hurler- α-L-iduronidáz Scheie)

dermatánszulfát és heparánszulfát

Mukopoliszacharidózis II (Hunter) iduronát-2-szulfatáz

dermatánszulfát és heparánszulfát

Mukopoliszacharidózis IIIA

heparánszulfát

heparán-N-szulfatáz

(Sanfilippo A) Mukopoliszacharidózis IIIB

α-N-acetilglukózaminidáz

(Sanfilippo B) Mukopoliszacharidózis IIIC

acetil-KoA: α-glukózaminid

acetiltranszferáz

(Sanfilippo C) Mukopoliszacharidózis IIID

N-acetilglukózamin-6-szulfatáz

(Sanfilippo D) Mukopoliszacharidózis (Morquio A)

IVA galaktóz-6-szulfatáz

keratánszulfát, kondroitin-6-szulfát

Mukopoliszacharidózis (Morquio B)

IVB β-galaktozidáz

keratánszulfát

Mukopoliszacharidózis (Maroteaux-Lamy)

VI N-acetilgalaktózamin-4-szulfatáz (arilszulfatáz B)

dermatánszulfát

Mukopoliszacharidózis VII (Sly)

β-glukuronidáz

dermatánszulfát, kondroitin-4 és 6szulfát, heparánszulfát

Glikogenózis II

α-glukozidáz

glikogén

Schindler-kór

α-N-acetilgalaktózaminidáz

glikopeptidek, oligoszacharidok

α-Mannozidózis

α-mannozidáz

glikoproteinek

β-Mannozidózis

β-mannozidáz

Fukozidózis

α-fukozidáz

Szialidózis

neuraminidáz

Aszpartilglukózaminúria

aszpartilglukózaminidáz

aszpartilglukózamin

Niemann-Pick-kór A és B

savas szfingomielináz

szfingomielin

Galaktozilceramid lipidózis

galaktozilceramidáz

galaktozilszfingozin

Tay-Sachs-kór

β-hexózaminidáz A

GM2 gangliozid

Niemann-Pick-kór C

NPC1 és NPC2 fehérjék

koleszterol, glikolipidek

Cisztinózis

lizoszomális cisztin transzporter

cisztin

Metakromatikus leukodisztrófia

arilszulfatáz A

galaktozilceramid-3-szulfát

GM1 gangliozidózis

β-galaktozidáz

GM1 gangliozid (szialoglikolipid)

Sandhoff-kór

β-hexózaminidáz A és B

GM2 gangliozid

Salla-kór

lizoszomális sziálsav transzporter

sziálsav

(Pompe; l. 6.1.5.2)

(Krabbe)

Wolman-kór, tárolási betegség

koleszterolészter savas lipáz

koleszterolészterek, trigliceridek



Lizoszomális (eponim)

tárolási

betegség A hiányzó enzimaktivitás

A felhalmozódó szubsztrát

Farber-lipogranulomatózis

ceramidáz

Galaktoszialidózis

β-galaktozidáz + neuraminidáz + szialiloligoszaharidok lizoszomális védőfehérje

ceramid

4. 8.4. A lizoszomális ion- és pH homeosztázis zavarai A lizoszómák normál működését számos vegyület akadályozza. Az úgynevezett lizoszomotróp ágensek a lizoszómákban dúsulnak, és ott az intraluminális pH emelkedését okozzák. Közéjük tartoznak különböző aminok, H+-ionofórok, a vakuoláris típusú H+-ATPáz gátlószerei (bafilomicin A, konkanamicin A), aminoglikozid antibiotikumok, parazitaellenes szerek (kloroquin, suramin), fenotiazin származékok stb. Az intraluminális lúgosodás gátolja a hidrolázok működését, a lumenben a tárolási betegségekre emlékeztető módon emésztetlen szubsztrátok halmozódnak fel. Másodlagosan indukálódnak a lizoszóma biogenezis folyamatai, a lizoszómák száma és mérete növekszik. A lizoszomotróp ágensek aktiválhatják a lizoszómaeredetű apoptotikus útvonalat is. A lizoszómákat korábban csak a nekrotikus sejthalállal hozták összefüggésbe, az apoptózisban szerepüket az apoptotikus testek emésztésére korlátozva. Újabb eredmények szerint a lizoszomális enzimek korlátozott kijutása a citoszólba jól definiálható lizoszomális eredetű apoptózist okoz. Mindazon hatások, melyek a lizoszomális membrán permeabilitását fokozzák (így például reaktív oxigénszármazékok, lizoszomotróp ágensek, szfingozin, a Bcl-2 családba tartozó proapoptotikus fehérjék) nagy dózisban teljes lizoszóma permeabilizálást és nekrózist, kis dózisban részleges permeabilizálást és apoptózist okoznak. A kiszabaduló lizoszomális proteázok aktiválhatják a prokaszpázokat és a proapoptotikus Bid és Bax fehérjéket, így a folyamat az apoptózis klasszikus intrinsic pályája mentén bontakozik ki. Alzheimer-kórban új eredmények felvetik a csökkent lizoszomális acidifikáció szerepét. A hipotézis szerint preszenilin (transzmembrán fehérje, mely az endomembránokban és a plazmamembránban is megtalálható gamma-szekretáz proteáz komplex tagja) hiányában vagy mutációja esetén a lizoszomális v-ATPáz egy alegységének lizoszómába irányítása zavart szenved. Más kutatók cáfolják az elméletet, és ehelyett a csökkent lizoszomális kalcium koncentrációt tartják felelősnek a preszenilin hiányában kialakuló lizoszomális funkciózavarért.


9. fejezet - Proteosztázis – az ubikvitináció/proteaszóma rendszer A metazoák genomjában kódolt rengetegféle fehérje soha nincs egyszerre jelen egy meghatározott sejtben. A sejtek proteómája egyrészt jellegzetes az adott sejttípusra nézve, másrészt dinamikuan változik a belső és külső környezet kívánalmainak megfelelően, harmadrészt folyamatos kicserélődésben van, az elöregedett fehérjemolekulák újakkal pótlódnak. A metazoák hosszabb élettartamú sejtjei életük nagyrészét a nitrogén- és fehérjeegyensúly állapotában töltik, vagyis a transzláció és a fehérje lebontási folyamatok egyensúlyban vannak. A proteosztázist (vagyis fehérje homeosztázist) szabályozó folyamatok a szintézis és a lebontás oldalán egyaránt jelen vannak. A metazoák esetében a fehérjeszintézis szabályozása elsősorban a transzkripció szintjén valósul meg, de ismeretesek transzlációs kontroll mechanizmusok is. A másik oldal, vagyis a fehérjék intracelluláris degradációja nem kevésbé fontos folyamat. Egyrészt általános szabályozási szereppel is bír: egyes fehérjék (például transzkripciós faktorok, a sejtciklust szabályozó fehérjék) szelektív és gyors eltávolítása alapvető a sejtfunkciók szabályozásában. Másrészt a hibás, károsodott, elöregedett vagy nem megfelelően hajtogatódott fehérjék eltávolítása is életfontosságú. Az intracelluláris fehérjelebontás zöme két organellumhoz, a proteaszómához és a lizoszómához köthető. Míg a proteaszomális fehérjebontás szelektív, folyamatos és kisebb kapacitású, a lizoszomális lebontás inkább patofiziológiás állapotokban (éhezés, fehérjeaggregátumok megjelenése, organellum stressz) aktiválódik és nagyobb mennyiségű fehérje kevésbé szelektív proteolízisével jár. A lizoszóma működése külön fejezet tárgya, itt csak a proteaszóma rendszert ismertetjük. A proteaszomális fehérjebontást a két szakaszra osztható ubikvitin/proteaszóma rendszer végzi. Az első szakaszban az ubikvitináció jelöli ki a lebontandó fehérjéket, biztosítandó a rendszer szelektivitását. A második fázisban a lebontásra ítélt fehérjék bejutnak a proteaszómába, és ott oligopeptidekre darabolódnak. Az ubikvitinálás igen fontos a sejt különböző körülményekhez történő alkalmazkodásában. Különösen érdekes a transzkripciós faktorok gyors, változatos és fajtól függő ubikvitinálódása, mely a transzkripciós apparátus funkcionális rugalmasságát biztosítja. Az ubikvitináció és proteaszomális hidrolízis alapvető a károsodott, elöregedett, felesleges és hibás szerkezetű fehérjék eltakarításában is. Egyedülálló feladata a rendszernek az antigének processzálása. Az ubikvitináció – proteaszóma rendszer (továbbiakban UPS) zavarai a sejten belül felesleges, károsodott fehérjék felhalmozódásához és kicsapódásához vezetnek. Ezek mechanikusan is gátolhatják a sejtfunkciókat; még fontosabb, hogy az aggregáció apoptózishoz vezető folyamatokat indíthat el. Ezek nemcsak elméleti lehetőségek: az UPS zavarai állnak számos súlyos neurodegeneratív betegség (prion betegség, Alzheimer, Parkinson és Huntington kór, amiotrófiás laterálszklerózis) hátterében. Hogyan választja ki az UPS áldozatait? Az intracelluláris fehérjék élettartamát az aminosavszekvenciába beépített degradációs jel(ek) jelenléte határozza meg. A legelőször felismert ilyen szignál az N-terminális aminosav volt (N-terminális szabály). A fehérjék életideje szoros összefüggést mutat az N-terminális aminosav milyenségével. Emlősökben a rövid életidejű fehérjék N-terminálisán általában nagyobb méretű aminosavak (Arg, Lys, His, Leu, Phe, Trp, Tyr, Ile) találhatók. Ezen kívül még számos ubikvitinálódási szignált írtak le, melyek általában rövid régiók a fehérjeszekvenciában. A szignál lehet konstitutív, illetve feltételes; az utóbbiak poszttranszlációs módosítások (foszforiláció/defoszforiláció, hidroxiláció stb.) révén keletkeznek. A feltételes szignálok elsősorban rövid élettartamú transzkripciós faktorokra jellemzőek (HIF-1α, IκB). A fehérjék tartalmazhatnak stabilizációs szignált is, melyek több ponton akadályozhatják az UPS működését. A lebontásra való kijelölés a célfehérje adott lizinjének kovalens poszttranszlációs módosítását, poliubikvitinációját jelenti. (Megjegyzendő, hogy a monoubikvitináció és a poliubikvitináció bizonyos formái nem jelölik ki a fehérjét lebontásra. Degradációs szignálról csak akkor beszélhetünk, ha a célfehérjéhez egy olyan poliubikvitin lánc kötődik, amely minimálisan négy ubikvitin egységből áll, és ezek az ubikvitinek 48-as (esetleg 11-es) pozícióban található lizinjeiken keresztül kapcsolódnak egymáshoz.) A kisméretű, 76 aminosavból álló ubikvitin fehérje nevét annak köszönheti, hogy az egyik legkonzerváltabb, az eukariótákban általánosan nagy mennyiségben előforduló fehérje. Az elsőként beépülő ubikvitin C-terminális glicinjének karboxilcsoportja izopeptid kötést alakít ki a lebontandó fehérje lizinjének aminocsoportjával. Ezt követően a fehérjéhez most már kovalensen kötött ubikvitin megfelelő lizinjéhez kapcsolódik a következő ubikvitin egy


Proteosztázis – az ubikvitináció/proteaszóma rendszer újabb izopeptid kötéssel. Ez a ciklus ismétlődik mindaddig, amíg a lánc eléri a fehérje proteaszómába való irányításához szükséges méretet. A fehérjék poliubkivitinációja három lépéses, enzimek által katalizált folyamat. Az első lépésben az ubikvitin aktiválódik. Az aktivációért felelős ubikvitin aktiváló enzim E1 néven is ismert. Az E1 által katalizált reakció során az enzim ATP energiáját felhasználva saját ciszteinjéhez kapcsolja az ubikvitint, melynek eredményeként egy makroerg tioészter kötés keletkezik a cisztein tiolja és az ubikvitin C-terminális karboxilcsoportja között. A folyamat következő lépéseként az aktivált ubikvitin átkerül az E2, vagy más néven ubikvitin konjugáló enzim ciszteinjére, így a nagy energiájú tioészter kötés nem vész el, csak átkerül egy másik fehérjére. Az utolsó lépésben az ubikvitin ligáz (E3) enzimek átviszik az ubikvitint a lebontandó fehérjére, kialakítva az izopeptid kötést. Az E3 fehérjéket szerkezetük és működésük alapján tovább oszthatjuk HECT és RING alcsaládokra. A HECT fehérjék közvetlenül az E2-ről viszik át az ubikvitint a célfehérjére, míg a RING alcsalád tagjai először saját ciszteinjükön kötik az ubikvitint, majd ezt követően továbbítják a lebontásra ítélt fehérjére. A poliubikvitinációs kaszkád egyes lépéseiben közreműködő fehérjéket kódoló gének száma nagyon eltérő. Az E1 enzimek családját kevesebb, mint 10 fehérje képviseli, és az E2 fehérjék száma is 50 alatt van. Ezekkel szemben az ubikvitin ligáz aktivitással rendelkező fehérjék a humán genom egyik legnagyobb géncsaládját alkotják a maguk több mint 600 eddig ismert képviselőjével. Az ubikvitináció specifikus működését az ubikvitin ligázok biztosítják, melyek egyszerre képesek felismerni a megfelelő E2 partnerüket és az ubikvitálandó fehérjét. Működésük érdekessége, hogy át tudnak váltani a szubsztrát fehérje ubikvitinálásáról az ubikvitin ubikvitinálására. Az UPS működése során az ubikvitin reciklálódik és újra felhasználódhat. Az ubikvitin eltávolítását a deubikvitináló izopeptidázok (DUB) végzik. A DUB1 a proteaszóma 19S alegységéhez kapcsolódik, szekvenciálisan hasít le egy-egy ubikvitin molekulát a lánc végéről. A DUB2 a teljes poliubikvitin láncot le tudja hasítani. A DUB3 a DUB2 által lehasított poliubikvitint bontja (mono)ubikvitin egységekre. A DUB enzimek működése megakadályozza az ubikvitin proteaszomális lebontását. A proteolízisre kijelölt fehérjék a citoplazmában és sejtmagban egyaránt nagy mennyiségben előforduló ATPfüggő proteáz rendszerbe, a 26S proteaszómába kerülnek. A proteaszóma szerkezete olyan hordóhoz hasonlítható, melynek mindkét fedele szabályozottan nyitható. A hordó képezi a proteaszóma 20S katalitikus alegységet, amelyet 4 heptamer gyűrű épít fel. A hordót alkotó proteázok aktív centruma a proteaszóma ürege felé tekint. Ez a szerkezet megakadályozza, hogy a proteaszóma hozzáférjen a citoplazmai, illetve sejtmagi fehérjékhez. Ugyanakkor a poliubikvitinált, proteaszóma üregébe bejutó fehérjék proteolízise rendkívül hatékony, mivel a 20S alegység egy processzív enzim komplex, szubsztrátját addig kötve tartja, amíg az teljes egészében néhány aminosavból álló peptidekre nem hasad. A lehető legteljesebb lebontást különböző helyeken hasító proteázok összehangolt működése biztosítja. A proteolízis végtermékei oligopeptidek, melyek át tudnak jutni a hordó oldalát képező proteázok közötti réseken. A fehérjék proteaszómába kerülését a hordó fedele, a 17 fehérjéből összeálló 19S alegység szabályozza. Funkcionálisan két részét különböztethetjük meg. Egyik része felelős a poliubikvitin szignál felismeréséért és az ubikvitin eltávolításáért, míg a másik a fehérje kitekerésével a proteaszómába jutást biztosítja. A 19S alegységnek ez a kettős funkciója lehetővé teszi, hogy a degradációs jellel rendelkező fehérjék azonosításukat követően denaturálódva jussanak be a proteaszóma üregébe. A fehérjék denaturációjáért az AAA (ATPases Associated with diverse cellular Activities) enzim család egyik tagja felelős. A család tagjai rendkívül változatos folyamatokban vesznek részt, közös jellemzőjük, hogy a kémiai energiát fizikaivá konvertálják, ugyanis az ATP makroerg kötését a fehérjék konformációjának megváltoztatására használják fel. A proteaszómák sajátos változata az immunoproteaszóma, melynek feladata az antigének processzálása. Az immunoproteaszóma módosított 20S alegységet tartalmaz; a „normál” konstitutív komponensek közül hármat citokinek által indukált fehérjék helyettesítenek. A citokin-indukált komponensek katalitikus aktivitásúak, feladatuk a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC-1) peptid-ligandjainak előállítása a citotoxikus T limfociták stimulálására. A 19S alegység helyett pedig a 11S regulációs alegység található meg a 20S alegység egyik vagy mindkét végen. Az immunoproteaszómák ATP-függő, de ubikvitinációtól független módon bontják a fehérjéket. Az immunoproteaszómák az endoplazmás retikulum (ER) külső felszínéhez kapcsolódnak, szorosan a poliriboszómák közelében. Az immunoproteaszómák által termelt peptidek a lumenbe pumpálódnak az antigénprocesszálással kapcsolt transzporter (TAP: transporter associated with antigen processing, az ABCtranszporterek családjába tartozó fehérjék) működése révén. A lumenben a peptidek kötődnek az MHC-1 (fő hisztokompatibilitási komplex) heterodimerekhez, mely egy immunglobulin nehéz láncból és egy β2mikroglobulinból áll. A komplex a vezikuláris transzport révén eljut a sejtfelszínre. Az endogén fehérjékből 51 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Proteosztázis – az ubikvitináció/proteaszóma rendszer származó peptideket a citotoxikus T sejtek komplementer T-sejt receptorai mint „sajátot” ismerik fel. Azonban ha a sejt fertőzött, az idegen fehérjékből keletkezett peptidek kiváltják a T sejtek proliferációját és citotoxikus aktivitását. Szintén az ER külső felszínén találjuk az ER-asszociált degradációért (ERAD) felelős proteaszómákat. Az ER lumenében felhalmozódó fehérjék (legyen a retenció oka a túltermelés, a folding zavara vagy más ok) végül proteolízis szubsztrátjaivá válnak. Mivel proteolítikus rendszer működtetése a lumenben veszélyes lehetne a részlegesen vagy egyáltalán nem korrekt konformációjú fehérjék állandó jelenléte miatt – melyeket egy ilyen rendszer nagy valószínűséggel megtámadna – a degradációra ítélt fehérjéket el kell távolítani a lumenből. A fehérjéket az ER lumen dajkafehérjéi ismerik fel, a diszulfid kötések redukálódnak, a glikoproteinek deglikozilálódnak és a fehérjék kitekerednek, majd a transzlokon csatornán keresztül visszajutnak a citoszólba. A lumenben aggregálódó foldinghibás fehérjék nem tudnak retrotranszlokálódni: eltávolításukat a makroautofágia tudja megoldani, viszont ez csak az ER részleges lebontásával lehetséges (ERfágia vagy retikulofágia). A citoszólba kijutott fehérjék már a transzlokon csatorna közelében poliubikvitinálódnak és a proteaszómába kerülnek. Az ERAD elemei tehát lényegében azonosak a szokványos intracelluláris proteolítikus útvonaléival. A rendszer sajátossága, hogy ubikvitin konjugáló enzimei (E2) és ubikvitin ligázai (E3) fehérjefehérje kölcsönhatás révén vagy transzmembrán szekvenciákkal szorosan kötődnek az ER membránjához. Az ERAD működésének zavara számos humán kórkép alapja. Az egyik leggyakoribb súlyos genetikai eredetű betegségben, a cisztikus fibrózisban az epitélsejtek plazmamembránjának klorid csatornájának génje mutációt szenved, ami súlyos légúti tünetekhez és hasnyálmirigy-elégtelenséghez vezet. A betegek legnagyobb részében a mutáció a képződő fehérje foldingzavarához és ER retenciójához vezet, majd a mutáns csatorna az ERAD során lebomlik. A természet tréfája, hogy a mutáns fehérje a plazmamembránban kielégítően működhetne, mint kloridcsatorna. A proteosztázis általános szabályozása mellett az UPS működése a transzkripciós kontroll egy speciális módját is lehetővé teszi. A transzkripciós faktorok nagyrésze igen instabil fehérje, rövid féléletidővel (akár 3-5 perc is lehet!). Gyors lebontásuk az UPS révén biztosítja a transzkripciós szabályozás flexibilitását. A legfontosabb transzkripciós faktorok közül részleteiben is ismert a p53, a c-Jun, c-Fos, MyoD és HIF-1α szintjének kontrollja. Az ubikvitinálódási szignál a transzkripciós faktorok esetében is követheti az N-terminális szabályt, illetve egyes esetekben (pl. HIF-1β, I κB) poszttranszlációs módosítások alakítják ki a szignált. A nukleáris faktor κB indukálható, dimér szerkezetű transzkripciós faktorok gyűjtőneve. Az ide tartozó transzkripciós faktorok azonos módon szabályozódnak. Nyugalmi állapotban komplexet képeznek gátló fehérjékkel (IκB), mely elfedi a NF-κB nukleáris lokalizációs szignálját (NLS) és a citoszólban tartja azt. Extracelluláris hatások az IκB gyors foszforilációjához, ubikvitinálódásához és proteolíziséhez vezetnek, a szabaddá vált NF-κB pedig bejutván a sejtmagba kifejti transzkripciós hatásait. A celluláris hipoxia érzékelésében legfontosabb a HIF-1 transzkripciós faktor szerepe. Heterodimer, mely a konstitutív HIF-1β-ból (=ARNT: aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocator) és az oxigén koncentrációjától függő HIF-1α-ból (normoxiás körülmények között a HIF-1α gyorsan lebomlik a proteaszómákban) keletkezik. A HIF-1α önmagában nem oxigén szenzor: szintjét többlépéses mechanizmus szabályozza. A von Hippel-Lindau (VHL) tumor szupresszor gén mutációja a hipoxiára érzékeny gének fokozott kifejeződésével jár. A gén által kódolt fehérje egy E3 ubikvitin ligáz alegységeként működik. A HIF-1α hidroxilációja előmozdítja a transzkripciós faktor kötődését a von HippelLindau fehérjéhez, s így a proteaszómális lebontás irányába küldi. A hidroxilációt a citoszólban prolil hidroxilázok végzik (nem azonosak a kollagén bioszintézis enzimeivel). Ezek az enzimek működésükhöz molekuláris oxigént, α-ketoglutarátot és aszkorbátot igényelnek. Az oxigén hiánya tehát gátolja a poszttranszlációs hidroxilálást, így a HIF-1α sejten belüli szintje emelkedik, dimert képez az ARNT-vel, és fokozza a hipoxia-szenzitív gének expresszióját. Az ubikvitináció vagy deubikvitináció eltérései állnak sok esetben a sejtek malignus transzformációjának hátterében. Tumor alakulhat ki mind az onkoproteinek stabilizációja, mind a tumor szupresszorok fokozott lebontása esetén. A proteaszóma szubsztrátjai között igen sok ubikvitinált onkoproteint (c-Myc, c-Fos, c-Jun, Src stb.) találunk. A p53 és p27 tumor szupresszor fehérjék destabilizációja szintén a tumor patogenezis fontos komponense lehet. A p53 tumor szupresszor fehérje az ubikvitináció legismertebb szubsztrátjai közé tartozik. Az ubikvitinációt a p53 esetében az Mdm2 nevű, RING domént tartalmazó E3 ubikvitin ligáz végzi. Az Mdm2 nemcsak a konjugálást hajtja végre, hanem el is távolítja a p53 fehérjét a sejtmagból, a p53-Mdm2 dimér specifikusan exportálódik a magpórusokon keresztül. A p53 normálisan igen rövid élettartamú a sejtben, csak stresszhatásra, pl. DNS károsodásra stabilizálódik. Több tumorban magas Mdm2 expressziót észleltek, ami felveti annak a gyanúját, hogy a p53 fokozott lebontása válthatta ki a rosszindulatú átalakulást.


Proteosztázis – az ubikvitináció/proteaszóma rendszer A legtöbb UPS-re visszavezethető patológiás elváltozást a neurodegeneratív betegségek között találjuk. Az öregedés során a sejteknek egyszerre csökken a fehérje hajtogató kapacitása és az UPS aktivitása, ennek eredményeként foldinghibás fehérjék és azok aggregátumai halmozódnak fel a sejtekben, hosszabb távon sejthalálhoz vezetve. Az UPS rendszer farmakológiai befolyásolása sok betegségben terápiás cél lehet. Az UPS közös elemeit (E1 és proteaszóma) érintő farmakológiai hatások nagyon sok folyamatot érinthetnek aspecifikusan, így használatuk általában előnytelen. Mindazonáltal néhány kórképben a proteaszóma gátlószerek jótékony hatásáról számoltak be. A mielóma multiplex esetében egy specifikus proteaszóma gátlószert (Bortezomib) már bevezettek a terápiába. Az E3 gátlószerek sokkal specifikusabb terápiás beavatkozás esélyét ígérik. Még ennél is célravezetőbb lehet a szubsztrátokhoz specifikusan kötődő kis molekulák alkalmazása.


10. fejezet - Felhasznált és ajánlott irodalom Anson, R.M., Hudson, E., Bohr, V.A.: Mitochondrial endogenous oxidative damage has been overestimated. FASEB J., 2000, 14, 355–360. Azzolini, C., Fiorani, M., Cerioni, L., et al.: Sodium-dependent transport of ascorbic acid in U937 cell mitochondria. IUBMB Life., 2013, 65, 149-153. Balaban, R.S., Nemoto, S., Finkel, T., et al.: Mitochondria, oxidants, and aging. Cell 2005, 120, 483–495. Balducci L.: Epidemiology of anemia in the elderly: information on diagnostic evaluation. J Am Geriatr Soc., 2003, 51, S2–9. Bánhegyi, G., Braun, L., Csala, M., et al.: Ascorbate metabolism and its regulation in animals. Free Radic. Biol. Med., 1997, 23, 793-803. Bánhegyi, G., Marcolongo, P., Puskás F., et al.: Dehydroascorbate and ascorbate transport in rat liver microsomal vesicles. J. Biol. Chem. 1998, 273, 2758-2762. Bratic, A., Larsson, N.G.: The role of mitochondria in aging. J Clin Invest., 2013, 123, 951–957. Braunwald, E. (ed).: Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine, W. B. Saunders Company, 1997. Chance, B., Sies, H., Boveris, A.: Hydroperoxide metabolism in mammalian organs.Physiol. Rev., 1979, 59, 527–605. Corpe, C., Tu, H., Wang, J., et al.: SVCT1 (Slc23a1) knock outmice: Slc23a1 as the vitamin C kidney reabsorptive transporter. FASEB J., 2007, 21, lb520. Cottrell, D.A., Blakely, E.L., Johnson, M.A., et al.: Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol Aging., 2001, 22, 265–272. de Grey, A.D.N.J.: A proposed refinement of the mitochondrial free radical theory of aging. BioEssays 1997, 19, 161–167. Dhar-Mascareño, M., Cárcamo, J.M., Golde, D.W.: Hypoxia-reoxygenation-induced mitochondrial damage and apoptosis in human endothelial cells are inhibited by vitamin C. Free. Radic. Biol. Med., 2005, 38, 1311-1322. Finkel, T.: Oxidant signals and oxidative stress. Curr. Opin. Cell Biol., 2003, 15, 247–254. Frenzel, H., Feimann, J.: Age-dependent structural changes in the myocardium of rats. A quantitative light- and electron-microscopic study on the right and left chamber wall. Mech Ageing Dev., 1984, 27, 29–41. Fukui, H., Moraes, C.T.: The mitochondrial impairment, oxidative stress and neurodegeneration connection: reality or just an attractive hypothesis? Trends Neurosci., 2008, 31, 251–256. Gallagher, I.M., Jenner, P., Glover, V., et al.: CuZn-superoxide dismutase transgenic mice: no effect on longevity, locomotor activity and 3H-mazindol and 3H-spiperone binding over 19 months. Neurosci. Lett., 2000, 289, 221–223. Gerschman, R., Gilbert, D. L., Nye, S. W., et al.: Influence of x-irradiation on oxygen poisoning in mice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954, 86,27–29. Gerschman, R., Gilbert, D. L., Nye, S. W., et al.: Oxygen poisoning and x-irradiation: a mechanism in common. Science, 1954, 119, 623–626. Gruss-Fischer, T., Fabian I.: Protection by ascorbic acid from denaturation and release of cytochrome c, alteration of mitochondrial membrane potential and activation of multiple caspases induced by H 2O2, in human leukemia cells. Biochem. Pharmacol., 2002, 63, 1325-1335. 54 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Felhasznált és ajánlott irodalom

Haines, D.C., Chattopadhyay, S., Ward, J.M.: Pathology of aging B6;129 mice. Toxicol Pathol. 2001, 29, 653– 661. Halliwell B. Free radicals in biology and medicine / Halliwell B., Gutteridge J.M.C. - 4th ed. - Oxford: Oxford University Press, 2007. Harman, D.: Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J. Gerontol. 1956, 11,298–300. Harman, D.: The biologic clock: the mitochondria? J. Am. Geriatr. Soc., 1972, 20, 145–147. Ingebretsen, O.C., Normann, P.T.: Transport of ascorbate into guinea pig liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta., 1982, 684, 21-26. Jarrett, S.G., Cuenco, J., Boulton, M.: Dietary antioxidants provide differential subcellular protection in epithelial cells. Redox Rep., 2006, 11, 144-152. Kalu, D.N.: Bone. Comprehensive Physiology., 2011, 395–412. KC, S., Cárcamo, J.M., Golde, D.W.: Vitamin C enters mitochondria via facilitative glucose transporter 1 (Glut1) and confers mitochondrial protection against oxidative injury. FASEB J., 2005, 19, 1657-1667. Kraytsberg, Y., Kudryavtseva, E., McKee, A.C., et al.: Mitochondrial DNA deletions are abundant and cause functional impairment in aged human substantia nigra neurons. Nat. Genet., 2006, 38, 518–520. Kujoth, G.C., Bradshaw, P.C., Haroon, S., et al.: The role of mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. PLoS Genet., 2007, 3, e24. Lagouge, M., Larsson, N.G.: The role of mitochondrial DNA mutations and free radicals in disease and ageing. J Intern Med., 2013, 273, 529–543. Larsson NG.: Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu Rev Biochem. 2010, 79, 683706. Lee YC, Huang HY, Chang CJ, et al.: Mitochondrial GLUT10 facilitates dehydroascorbic acid import and protects cells against oxidative stress: mechanistic insight into arterial tortuosity syndrome. Hum. Mol. Genet. 2010, 19, 3721-3733. Lee, S.S., Kennedy, S., Tolonen, A.C., et al.: DAF-16 target genes that control C. elegans life-span and metabolism. Science, 2003, 300, 644–647. Levine, M., Conry-Cantilena, C., Wang, Y., et al.: Vitamin C pharmacokinetics in healthy volunteers: evidence for a recommended dietary allowance. Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93, 3704-3709. Lewis, K.N., Andziak, B., Yang, T., et al.: The naked mole-rat response to oxidative stress: just deal with it. Antioxid Redox Signal., 2013, 19, 1388–1399. Li, X., Cobb, C.E., Hill, K.E., et al.: Mitochondrial uptake and recycling of ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys., 2001, 387, 143-153. Li, X., Cobb, C.E., May, J.M.: Mitochondrial recycling of ascorbic acid from dehydroascorbic acid: dependence on the electron transport chain. Arch. Biochem. Biophys., 2002, 403, 103-110. Lieber, M.R., Karanjawala, Z.E.: Ageing, repetitive genomes and DNA damage. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2004, 5, 69–75. MacDonald, L., Thumser, A.E., Sharp, P.: Decreased expression of the vitamin C transporter SVCT1 by ascorbic acid in a human intestinal epithelial cell line. Br. J. Nutr., 2002, 87, 97-100. Malo, C., Wilson, J.X.: Glucose modulates vitamin C transport in adult human small intestinal brush border membrane vesicles. J. Nutr., 2000, 130, 63-69. Mandl, J., Szarka, A., Bánhegyi, G.: Vitamin C: update on physiology and pharmacology. Br. J. Pharm., 2009, 157, 1097-1110. 55 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


Mattson, M.P., Magnus, T.: Ageing and neuronal vulnerability. Nat. Rev. Neurosci. 2006, 7, 278–294. McCord, J. M., Fridovich, I.: Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J. Biol. Chem., 1969, 244, 6049–6055. Meerwaldt R, Links T, Zeebregts C, Tio R, Hillebrands JL, Smit A.: The clinical relevance of assessing advanced glycation endproducts accumulation in diabetes. Cardiovasc Diabetol. 2008, 7, 29. Melov, S., Ravenscroft, J., Malik, S., et al.:Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science, 2000, 289, 1567–1569. Müller, F.L., Lustgarten, M.S., Jang, Y. et al.: Trends in oxidative aging theories. Free Radic Biol Med., 2007, 43, 477– 503. Müller-Höcker, J.: Cytochrome-c-oxidase deficient cardiomyocytes in the human heart--an age-related phenomenon. A histochemical ultracytochemical study. Am J Pathol., 1989, 134, 1167–1173. Murphy, C.T., McCarroll, S.A., Bargmann, C.I., et al.: Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature, 2003, 424, 277–283. Myllyharju, J., Kivirikko, K.I.: Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends Genet., 2004, 20, 33-43. Nekhaeva, E., Bodyak, N.D., Kraytsberg, Y., et al.: Clonally expanded mtDNA point mutations are abundant in individual cells of human tissues. Proc. Natl. Acad. Sci., 2002, 99, 5521–5526. Orr, W.C., Mockett, R.J., Benes, J.J., et al.: Effects of overexpression of copper-zinc and manganese superoxide dismutases, catalase, and thioredoxin reductase genes on longevity in Drosophila melanogaster. J. Biol. Chem., 2003, 278, 26418–26422. Orr, W.C., Sohal, R.S.: Extension of life-span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in Drosophila melanogaster. Science, 1994, 26, 1128–1130. Padayatty S.J., Sun, H., Wang, Y., et al.: (2004). Vitamin C pharmacokinetics: implications for oral and intravenous use. Ann. Intern. Med., 140, 533-537. Padayatty, S.J., Riordan, H.D., Hewitt, S.M., et al.: (2006). Intravenously administered vitamin C as cancer therapy: three cases. CMAJ, 174, 937-942. Pal, L., Santoro, N.: Age-related decline in fertility. Endocrinol Metab Clin North Am., 2003, 32, 669–688. Perez-Campo, R., López-Torres, M., Cadenas, S., et al.: The rate of free radical production as a determinant of the rate of aging: evidence from the comparative approach. J Comp Physiol B., 1998, 168, 149–158. Perez-Cruz, I., Carcamo, J.M., Golde, D.W.: Vitamin C inhibits FAS-induced apoptosis in monocytes and U937 cells. Blood, 2003,102, 336-343. Rigoulet M, Yoboue ED, Devin A: Mitochondrial ROS Generation and Its Regulation: Mechanisms Involved in H2O2Signaling ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING 2011, 14, 459-468. Ross, J.M., Stewart, J.B., Hagström, E., et al.: Germline mitochondrial DNA mutations aggravate ageing and can impair brain development. Nature, 2013, 501, 412–415. Rumsey, S.C., Daruwala, R., Al-Hasani, H., et al.: Dehydroascorbic acid transport by GLUT4 in Xenopus oocytes and isolated rat adipocytes. J. Biol. Chem., 2000, 275, 28246-28253. Rumsey, S.C., Kwon, O., Xu, G.W.,et al.: Glucose transporter isoforms GLUT1 and GLUT3 transport dehydroascorbic acid. J. Biol. Chem., 1997, 272, 18982-18989. Savini, I., Catani, M.V., Arnone, R., et al.: Translational control of the ascorbic acid transporter SVCT2 in human platelets. Free Radic. Biol. Med., 2007, 42, 608-616.



Savini, I., Rossi, A., Catani, M.V., et al.: Redox regulation of vitamin C transporter SVCT2 in C2C12 myotubes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007, 361, 385-390. Savini, I., Rossi, A., Pierro, C., et al.: SVCT1 and SVCT2: key proteins for vitamin C uptake. Amino Acids, 2008, 34, 347-355. Schriner, S. E., Linford, N. J., Martin, G. M., et al.: Extension of murine life span by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Science, 2005, 308, 1909–1911. Singh R, Barden A, Mori T, Beilin L.: Advanced glycation end-products: a review. Diabetologia. 2001, 44, 129146. Sotiriou, S., Gispert, S., Cheng, J., et al.: Ascorbic-acid transporter Slc23a1 is essential for vitamin C transport into the brain and for perinatal survival. Nat. Med., 2002, 8, 514-517. Sourris KC, Harcourt BE, Forbes JM.: A new perspective on therapeutic inhibition of advanced glycation in diabetic microvascular complications: common downstream endpoints achieved through disparate therapeutic approaches? Am J Nephrol. 2009, 30, 323-335. Srivastava, S., Moraes, C.T.: Double-strand breaks of mouse muscle mtDNA promote large deletions similar to multiple mtDNA deletions in humans.Hum. Mol. Genet., 2005, 14, 893–902. Szarka A, Bánhegyi G, Sümegi B.: Mitokondrium, oxidatív stressz és öregedés Orv Hetil. Közlésre elfogadva Szarka A, Lőrincz T.: A C-vitamin celluláris, intracelluláris transzportja: fiziológiás vonatkozások Orv Hetil. 2013, 154, 1651-1656. Szarka A, Lőrincz T.: The role of ascorbate in protein folding. Protoplasma. 2013, Közlésre elfogadva Szarka, A., Horemans, N., Bánhegyi, G., et al.: Facilitated glucose and dehydroascorbate transport in plant mitochondria. Arch. Biochem. Biophys., 2004, 428, 73-80. Taylor RW, Turnbull DM.: Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 2005, 6, 389-402. Taylor, R.W., Turnbull, D.M.: Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat. Rev. Genet., 2005, 6, 389– 402. Trifunovic, A., Hansson, A., Wredenberg, A., et al.: Somatic mtDNA mutations cause aging phenotypes without affecting reactive oxygen species production. Proc Natl Acad Sci, 2005, 102, 17993–17998. Trifunovic, A., Wredenberg, A., Falkenberg, M., et al.: Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature, 2004, 429, 417–423. Tsukaguchi, H., Tokui, T., Mackenzie, B., et al.: A family of mammalian Na+-dependent L-ascorbic acid transporters. Nature (London), 1999, 399, 70-75. Turpeenniemi-Hujanen, T.M., Puistola, U., Kivirikko, K.I.: Isolation of lysyl hydroxylase, an enzyme of collagen synthesis, from chick embryos as a homogeneous protein. Biochem. J., 1980, 189, 247-253. Van Remmen, H., Ikeno, Y., Hamilton, M. et al.: Life-long reduction in MnSOD activity results in increased DNA damage and higher incidence of cancer but does not accelerate aging. Physiol. Genomics, 2003, 16, 29– 37. Van Remmen, H., Qi, W., Sabia, M., et al.: Multiple deficiencies in antioxidant enzymes in mice result in a compound increase in sensitivity to oxidative stress. Free Radical Biol. Med., 2004, 36, 1625–1634. Vera, J.C., Rivas, C.I., Fischbarg, J., et al. : Mammalian facilitative hexose transporters mediate the transport of dehydroascorbic acid. Nature, 1993, 364, 79-82. Vera, J.C., Rivas, C.I., Zhang, R.H., et al.: Human HL-60 myeloid leukemia cells transport dehydroascorbic acid via the glucose transporters and accumulate reduced ascorbic acid. Blood, 1994, 84, 1628-1634.



Wanrooij, S., Goffart, S., Pohjoismäki, J.L., et al.: Expression of catalyticmutants of themtDNA helicase Twinkle and polymerase POLG causes distinct replication stalling phenotypes. Nucleic Acids Res., 2007, 35, 3238–3251. Wilson J.X.: Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr., 2005, 25, 105-125. Wilson, J.X., The physiological role of dehydroascorbic acid. FEBS Lett., 2002, 527, 5-9. Winkler, B.S.: In vitro oxidation of ascorbic acid and its prevention by GSH. Biochim. Biophys. Acta. 1987, 925, 258-264. Xu, D.P., Wells, W.W.: α-Lipoic acid dependent regeneration of ascorbic acid from dehydroascorbic acid in rat liver mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr. 1996, 28, 77-85.


Patobiokémia Szarka András, Bánhegyi Gábor

Recommend Documents