OPTIMASI METODE PREPARASI DAN EKSTRAKSI SAMPEL Stevia rebaudiana (Bert.) DALAM PROSES KRISTALISASI STEVIOSIDA Yohanes Martono, Yohan, Lusiawati Dewi Prodi Kimia Fakultas Sains dan Matematika Universitas Kristen Satya Wacana Jl. Diponegoro 52 – 60 Salatiga e-mail:
[email protected]
ABSTRAK Stevia rebaudiana Bert. merupakan tanaman herbal yang mengandung senyawa glikosida alami dimana kemanisannya mencapai 300 kali sukrosa dan aman dikonsumsi. Senyawa glikosida alami yang dominan dalam Stevia rebaudiana (Bert.) adalah steviosida yang dapat dikristalkan dan dijadikan alternatif pengganti gula. Tujuan penelitian ini adalah melakukan optimasi preparasi sampel yang meliputi defatisasi dan non defatisasi untuk tiap metode ekstraksi (maserasi dan berkesinambungan) dalam proses kristalisasi steviosida. Sebagai parameter megoptimasi preparasi dan metode ekstraksi sampel adalah efektifitas deklorofilasi dan kadar steviosida. Efektifitas deklorofilasi ditentukan secara spektrofotometri sedangkan penetapan kadar steviosida digunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa metode preparasi dan ekstraksi sampel yang paling efisien dan aplikatif adalah nondefatisasimaserasi, dengan efektifitas deklorofilasi dan kadar steviosida secara berturut-turut sebesar 98,80% dan 9,17%. Keywords: optimasi, Stevia rebaudiana (Bert.), steviosida
PENDAHULUAN Kebutuhan pemanis semakin meningkat seiring dengan peningkatan produksi pangan dunia. Saat ini, pemenuhan kebutuhan pemanis di masyarakat dipenuhi dengan kehadiran gula sukrosa. Bila dilihat dari sisi kesehatan, gula sukrosa memiliki efek samping seperti obesitas, bahkan dapat memicu timbulnya penyakit diabetes. Dari efek samping tersebut, berbagai macam solusi dihadirkan seperti penggunaan pemanis sintetis yang rendah kalori seperti sakarin dan siklamat. Sebenarnya, pemanis sintetis ini hanya ditujukan untuk penderita diabetes atau konsumen dengan diet rendah kalori. Berdasarkan beberapa penelitian, ternyata pemanis ini bersifat karsinogenik apabila digunakan secara berlebihan dan berkesinambungan dalam jangka waktu yang lama (Mudjajanto, 2005). Dewasa ini, masyarakat cenderung mencari alternatif pemanis alami pengganti gula sukrosa maupun pemanis sintetis yang tidak hanya aman dikonsumsi tetapi juga rendah kalori. Salah satu alternatif pemanis alami tersebut adalah steviosida dari Stevia rebaudiana (Bert.) dengan tingkat kemanisan 200 hingga 300 kali sukrosa (Philip, 1987). Beberapa penelitian menyebutkan bahwa steviosida mengandung kalori yang rendah sampai dengan nol kalori (Moraes dkk, 2001) sehingga aman bagi penderita diabetes atau konsumen yang sedang melakukan diet. Berdasarkan hasil penelitian, steviosida aman dikonsumsi oleh masyarakat umum karena tidak mempunyai efek teratogenik (Yodyingguard dan Bunyawong, 1991), mutagenik (Suttajit dkk., 1993), atau karsinogenik (Xili dkk., 1992). Oleh sebab itu, penelitian untuk mengekstrak daun stevia menjadi kristal yang mengandung steviosida yang tinggi dan mempunyai visualisasi kristal yang dapat diterima masyarakat akan memiliki potensi ekonomi yang besar.
Salah satu cara untuk mendapatkan kristal dari steviosida adalah dengan metoda ekstraksi. Ekstraksi yang dikembangkan adalah ekstraksi pelarut yang dikombinasi dengan langkah-langkah yang lain seperti klarifikasi, penyesuaian pH dan kristalisasi (Moraes dkk, 2001; Philips, 1987). Keuntungan dari penggunanan metoda ini adalah mudah digunakan. Pelitian ini bertujuan mengoptimasi preparasi sampel yang meliputi defatisasi dan non defatisasi untuk tiap metode ekstraksi (maserasi dan berkesinambungan) dalam proses kristalisasi steviosida. BAHAN DAN METODE Bahan Sampel yang digunakan adalah daun Stevia rebaudiana (Bert.) yang diperoleh dari Tawangmangu, Kabupaten Karanganyar, Jawa Tengah. Bahan kimia yang digunakan diantaranya adalah aquades, eter, etanol, heksan, kaolin, CaO (Merck), asam sitrat, asetonitril (J.T. Baker 9017-03), metanol (Merck 1.06009.2500). Piranti Piranti yang digunakan antara lain almunium, buchner, cabinet drying, cawan petri, kolf (Schott duran, made in German), corong pisah (Schott duran, made in German), erlenmeyer, gelas ukur (Pyrex), grinder (AIRLUX), kertas saring, labu ukur (Pyrex), mortar, neraca analitik (Mettler H80), penangas air (Memmert), pH meter (Hanna Hl9812, made in Romania), plat almunium (3 × 15 cm), power supply (Goldstar), rotary evaporator (Buchi R114), sentrifuge (Swing Type centrifuge Model C-40N Tomy seiko co, ltd), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Smart Line, Knauer Advanced Scientific Instruments), spektrofotometer (Shimadzu, UVmini 1240), dan sokhlet. Metode Preparasi Sampel Sampel dibersihkan dari tanah, kemudian dikeringkan dengan cabinet drying selama 24 jam dan dihaluskan menggunakan grinder. Defatisasi Sampel 100 gram sampel didefatisasi menggunakan sokhlet dengan pelarut heksan sebanyak 1 L untuk masing-masing langkah optimasi. Defatisasi dilakukan hingga warna larutan menjadi bening. Residu hasil defatisasi selanjutnya digunakan untuk optimasi ekstraksi. Ekstraksi Sampel dengan Metode Berkesinambungan (Sokhletasi) Masing-masing 100 gram sampel defat dan non defat diekstraksi menggunakan metode ekstraksi berkesinambungan dengan sokhlet. Sejumlah masing-masing 2 L etanol ditambahkan untuk mengekstrak steviosida. Ekstraksi dilakukan hingga warna larutan menjadi bening.
Ektraksi Sampel Dengan Metoda Maserasi Masing-masing 100 gram sampel defat dan non defat dimaserasi dengan 2 L etanol secara bertingkat (4×500 mL masing-masing 1 jam). Kemudian residu dan filtrat dipisahkan melalui penyaringan. Deklorofilasi Filtrat hasil metoda maserasi dan ekstraksi berkesinambungan dipekatkan dengan rotary evaporator hingga volume menjadi setengah dari volume awal. Selanjutnya, hasil dari pemekatan ditambahkan aquades dengan perbandingan 1:1 dan penambahan 1% garam (NaCl) dari total volumenya. Elektrolisis dilakukan selama 2,5 jam dengan menggunakan plat alumunium (ukuran 3×15 cm) sebagai elektrode. Arus dan tegangan digunakan power supply adalah 0,9 A dan 16,931,6 V secara berurutan. Filtratnya disaring dan siap untuk perlakuan selanjutnya Redefatisasi Larutan hasil deklorofilasi dipisahkan dari pengotornya dengan corong pisah menggunakan pelarut eter. Langkah ini digunakan untuk memisahkan fase air yang mengandung steviosida dan fase organik sebagai pengotornya. Partisi dilakukan secara bertingkat dengan penambahan eter 2×100 mL. Klarifikasi Fase air hasil defatisasi diatur pH-nya menggunakan asam sitrat 50% hingga pH 3. Kristalisasi Larutan sampel yang telah diklarifikasi diatur kembali pH-nya menjadi pH 10,5 menggunakan larutan CaO 50%. Filtrat hasil penyaringan diatur kembali pH-nya menjadi pH 7 dengan menggunakan asam sitrat 50%. Untuk menghilangkan sisa-sisa lemak, larutan didefatisasi kembali dengan pelarut eter (1×100 mL), kemudian dipartisi dengan pelarut etil asetat secara bertingkat (5×100 mL). Fase organik diambil dan dipekatkan dengan rotary evaporator. Setelah dipekatkan maka akan terbentuk kristal putih. Untuk memaksimalkan pembentukan kristal, maka larutan disimpan dalam lemari es semalam (0-5 °C). Analisis Sampel Analisis Ekstrak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Identifikasi steviosida dilakukan dengan menggunakan KCKT. Sebagai fase diam KCKT adalah RP C18 dan fase geraknya adalah asetonitril, metanol, dan air dengan flow rate 1,5mL/menit. Elusi fase gerak dilakukan secara isokratik menggunakan (aquades:methanol=70:20):(acetonitril)=76:24, dan volume sampel yang diinjeksikan adalah 20μL. Deteksi pemisahan menggunakan Detektor UV Smart Line Knauer pada panjang gelombang 217nm. Analisis Spektra Steviosida dari Ektraksi Secara Spektroskopi Kristal steviosida dilarutkan dalam metanol. Larutan steviosida kemudian dilihat pola serapan cahayanya pada panjang gelombang 200-400 nm.
HASIL DAN DISKUSI Ekstraksi steviosida dari Stevia rebaudiana (Bert.) telah melalui beberapa tahap antara lain ekstraksi sampel, defatisasi sampel, dan kristalisasi sampel. Ekstraksi sampel dilakukan dengan menggunakan variasi empat metode yaitu metode defatisasi-berkesinambungan (A), defatisasi-maserasi (B), nondefatisasi-berkesinambungan (C), dan nondefatisasi-maserasi (D). Keempat metode ini menggunakan pelarut etanol. Hasil penelitian Moraes dan Machado (2001) menunjukkan bahwa penggunaan pelarut etanol memberikan hasil yang lebih jernih bila dibandingkan dengan menggunakan air dan metanol, dan relatif aman bagi konsumsi masyarakat. Dalam penelitian ini tahap penghilangan pengotor juga dilakukan agar tidak menghambat pembentukan kristal. Proses penjernihan larutan steviosida menggunakan kaolin karena kaolin mudah didapatkan, murah, dan sangat cepat dalam mengikat pengotor yang menghambat pembentukan kristal steviosida. Selain pengotor, lemak dalam ekstrak steviosida dapat dihilangkan dengan defatisasi sampel menggunakan pelarut dietil eter secara ekstraksi cair-cair. Hasil yang didapat menunjukkan bahwa komponen-komponen non polar seperti lemak dapat terangkat dan dipisahkan. Langkah penting lain dalam penelitian ini adalah menghilangkan pengaruh warna hijau pigmen daun dengan cara deklorofilasi menggunakan metode elektrokoagulasi selama 2,5 jam (Jumpaton dkk., 2006). Hal ini dimaksudkan supaya warna hijau dari pigmen nantinya tidak mempengaruhi visualisasi kristal saat pemisahan (Moraes dan Machado, 2001). Efektifitas deklorofilasi masing-masing metode dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Data Efektifitas Deklorofilasi Pada Tiap Sampel. Absorbansi A664 Sampel
Efektifitas(%)
Sebelum deklorofilasi
Setelah deklorofilasi
A
28,6
0,16
99,44
B
52,9
2,27
94,76
C
18,2
2,12
88,35
D
39,1
0,47
98,80
Pada Tabel 1. dapat dilihat bahwa, langkah deklorofilasi memiliki efektifitas penyusutan warna lebih dari 85%. Penyusutan intensitas warna diakibatkan dari pemecahan klorofil menjadi turunannya yaitu feofitin yang dikarenakan kehilangan atom Mg. Hasil ini sesuai dengan hasil penelitian Jumpatong dkk (2006) dan Martono dkk (2007) yang menyatakan bahwa deklorofilasi menghilangkan pigmen yang memperbaiki visualisasi kristal. Setelah deklorofilasi, proses klarifikasi dilakukan dengan penambahan kaolin untuk menghilangkan sisa klorofil. Klarifikasi merupakan langkah penting karena akan memberikan kualitas visual produk yang lebih baik (Moraes dan Machado, 2001). Pembentukan kristal juga dipengaruhi oleh perubahan pH larutan secara ekstrim (Dubois, 2005). Oleh karena itu, pada penelitian ini, pH larutan steviosida dirubah secara ekstrim dari pH 3 menjadi pH 10,5. Pada penelitian ini, pH larutan disesuaikan ke lingkungan asam dengan menggunakan asam sitrat 50%. Penggunaan asam sitrat ini berfungsi untuk mengikat logam,
protein, dan warna sebagai pengotor agar diperoleh kristal yang lebih baik (Kumar dan Sampath, 1986). Tabel 2. Data Kadar Steviosida (%) Dalam Kristal. Metoda Kadar Steviosida Defatisasi – Berkesinambungan (A) 5,42 Defatisasi – Maserasi (B) 10,30 Nondefatisasi – Berkesinambungan (C) Nondefatisasi – Maserasi (D) 9,17 Pada Tabel 2. dapat dilihat data kadar steviosida dalam kristal pada berbagai metode preparasi ekstraksi sampel yang dilakukan. Perbedaan utama antara metode A, B, C, dan D adalah pada proses ekstraksinya. Metode A dan C menggunakan suhu yang lebih tinggi (70 oC) dalam waktu yang lama secara berkesinambungan. Penggunaan suhu tinggi dalam waktu yang lama secara berkesinambungan ternyata dapat menyebabkan senyawa steviosida terdegradasi dan atau berubah bentuk (Kroyer, 2010). Hal ini terlihat dari hasil penelitian yaitu pada metode A dan C memiliki kadar steviosida yang lebih rendah dibanding metode B dan D. Salah satu faktor yang harus dipertimbangkan secara aplikatif adalah efisiensi. Walaupun metode B mengandung steviosida lebih tinggi dibanding metode D, tetapi metode D lebih efisien dibanding metode B. Kadar steviosida metode D (9,17%) tidak berbeda jauh dengan metode B (10,30%). Oleh karena itu, metode D menjadi metode yang selanjutnya dioptimalkan untuk proses kristalisasi steviosida. Kromatogram dari standar steviosida dan kristal hasil ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 1.
[A]
[B]
[C]
[D]
Gambar 1. Kromatogram [A].standar steviosida (tR=14,317), [B] Metode Defatisasi – Maserasi (tR=14,000), [C].Metode Defatisasi – Berkesinambungan (tR=14,067), [D]. Metode Nondefatisasi – Maserasi (tR=13,667)
Analisis Spektra dan Kadar Kandungan Steviosida dari Ekstrak Secara Spektroskopi Analisis kuantitatif secara spektrofotometri juga dapat dilakukan dengan melihat pola spektranya. Steviosida tidak menunjukan adanya serapan warna, oleh sebab itu pola spectra dari ekstrak hanya dilihat pada daerah serapan UV 200-400 nm yang ditunjukan pada Gambar 2. dibawah. Dari pola spektra yang diperoleh, diketahui bahwa ektrak steviosida mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 215 nm. Hasil penelitian Pasquel dkk. (2000), memberikan hasil serapan maksimum steviosida pada panjang gelombang 210 nm. Hal ini memperkuat hasil bahwa kristal yang diperoleh dalam penelitian ini telah mengandung steviosida.
[A]
[B]
[C]
[D]
Gambar 2. [A]Spektra standar steviosida [B]Spektra Defatisasi – Maserasi [C]Spektra Defatisasi – Berkesinambungan [D]Spektra Nondefatisasi – Maserasi.
KESIMPULAN Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa metode preparasi dan ekstraksi sampel yang paling efisien dan aplikatif adalah nondefatisasi-maserasi, dengan efektifitas deklorofilasi dan kadar steviosida secara berturut-turut sebesar 98,80% dan 9,17%. Daftar Pustaka Du Bois, G. E. 2005. SteviolmonosideAnalogs. http://www.freepatentsonline.com/4402990.html Jumpatong, K.,Weerachai Phutdhawong, and Duang Buddhasukh. 2006 Dechlorophyllation by Electrocoagulation. http://www.mdpi.org
Kim KK, Sawa Y, dan Shibata H. 1996. Hydroxylation of ent-kaurenoic acid to steviol in Stevia rebaudiana Bertoni-purification and partial characterization of enzyme. Arch Biochem Biophys; 332(2):223-230 Kumar dan Sampath, 1986. Method For Recovery of Stevioside. United States Patent 4599403 Kroyer Gerhard, 2010, Stevioside and Stevia-sweetener in food: application, stability and interaction with food ingredients. Switzerland 2010 Moraes, Ĕlida de Paula., Machado, Nádia Regina Camargo Fernandes. 2001.Clarification of Stevia Rebaudiana (Bert.) Bertoni extract by adsorption in modified zeolites. Maringáv.23, n. 6, p. 1375-1380 Mudjajanto, E.S. 2005. Keamanan Jajanan Tradisional. http://www.kompas.com/kompascetak/0502/17/ilpeng/1563189.htm. Martono, Yohanes., Hari Kristopo, Lydia Ruth Sihasale. 2007. Recovery Produk Ekstrak Steviosida sebagai Alternatif Pengganti Gula dari Stevia rebaudiana (Bert.). Salatiga, Program Penelitian Pemula (dibiayai oleh DIKNAS Propinsi Jawa Tengah). Philips, K.C. 1987. Stevia: step in developing a new sweetener. In:T.H.Grenby (Ed.), Development in Sweeteners 3, Elsevier, New York, p.1. Pasquel, A., Meireles, M.A.A., Marques, M.O.M., dan A.J. Petenate. (2000). Extraction Of Stevia Glycosides With CO2 + Water, CO2 + Ethanol, AND CO2 + Water+ Ethanol, Braz. J. Chem. Eng. São Paulo, vol.17 n.3: 438-448
Suttajit, M., Vinitketaumnuem, U., Meevatee, U. dan Buddhasukh, D. 1993Mutagenicity and Human Chromosomal Effect of Stevioside, a Sweetener From Stevia rebaudiana Bertoni. Environmental Health Perspective, 101 (Suppl.3), 53-56 Xili, L., Chengjiany, B.,Eryi X., Reiming, S., Yuenming, W., Haodong, S., dan Zhiyian, H. 1992 Chronic Oral Toxicity and Carcinogenicity Study of Stevioside in Rats. Food and Chemical Toxiology, 30, 957-965. Yodyinguard, V. dan Bunyawong, S. 1991. Effect of Stevioside on Growth and Reproduction. Human Reproduction,6 158-165.
