Onderzoek naar de aangeboren immuunrespons van Chlamydia psittaci in humane macrofagen

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Vakgroep Immunologie

Academiejaar 2011–2012

Onderzoek naar de aangeboren immuunrespons van Chlamydia psittaci in humane macrofagen

Bieke Soen

Promotor: Prof. dr. Daisy Vanrompay Tutor: Stefanie Lagae

Scriptie voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Bio-ingenieurswetenschappen Afstudeerrichting Cel- en Genbiotechnologie

De auteur en promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. The author and promoter give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using from this thesis. Gent, mei 2012

De promotor Prof. dr. Daisy Vanrompay

De tutor Stefanie Lagae

De auteur Bieke Soen

Woord vooraf Het rijden van een bergetappe in de Tour met aankomst bergop. Zo heb ik het verloop van mijn masterproef ervaren. Aanvankelijk was het parcours nog redelijk vlak, de aanloop naar de bergen. De eerste maanden verliep alles dan ook vlot en kwam de literatuurstudie geleidelijk tot stand. Maar toen kwamen af en toe wat kleine hellingen die moesten genomen worden en was er ook wat pech onderweg. Het typische wispelturige gedrag van onderzoek. Maar na bergop volgt natuurlijk altijd bergaf. Even relaxen als het probleem werd opgelost en het experiment slaagde. Op het einde van de rit kwam de laatste en steilste col eraan. Nog even volhouden en een laatste spurt bergop tot aan de finish. Ik stond er natuurlijk niet alleen voor en wil dan ook een aantal mensen bedanken. In de eerste plaats ben ik mijn ploegmanager, Prof. dr. Daisy Vanrompay, heel dankbaar voor het uitstippelen van het af te leggen parcours en de te gebruiken tactiek. Ook wil ik Stefanie Lagae van harte bedanken. Zij was niet alleen een plezante begeleidster, maar ook een fantastische mental coach. Mijn dank gaat ook uit naar Annelien Dumont voor het beantwoorden van mijn vragen en de praktische tips in het labo. Daarnaast stonden er ook heel wat supporters langs de weg. Bedankt aan mijn vrienden, familie en verloofde voor de steun en het aanhoren van mijn frustraties. Bieke Soen Gent, mei 2012

ii

Samenvatting Chlamydia psittaci is een obligaat intracellulaire bacterie die ademhalingsinfecties veroorzaakt bij vogels en mensen. Bij een systemische infectie zal de bacterie zich vermenigvuldigen in bloedmonocyten en -macrofagen. Aangezien de macrofaag een belangrijke rol speelt in de aangeboren immuunrespons is het uniek dat C. psittaci in staat is om te overleven en zich te vermenigvuldigen in deze immuuncel. Daarom onderzoekt deze masterproef de respons van het aangeboren immuunsysteem in humane macrofagen na infectie met Chlamydia psittaci. THP1-cellen werden ge¨ınfecteerd met EB’s van de laag virulente CP3 stam. Na 2u, 4u, 8u, 12u, 18u, 24u, 36u, 48u en 72u werden stalen genomen voor infectiviteitstitratie, ELISA en RNA-extractie. De infectiviteitstitratie werd uitgevoerd om na te gaan of er een verband is tussen de aangeboren immuunrespons van de macrofagen en het aantal aanwezige C. psittaci partikels. Via de ELISA werd aangetoond welke inflammatoire cytokines werden geproduceerd. Na RNA-extractie werd een expressie-analyse uitgevoerd van een aantal Pattern Recognition Receptors (PRR’s) via Real Time PCR. De cytokines die in detecteerbare hoeveelheden werden geproduceerd zijn IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8 en GM-CSF. Deze veroorzaken enerzijds een ontstekingsreactie en anderzijds het rekruteren van immuuncellen, waaronder macrofagen, naar de plaats van infectie. Er wordt gehypothetiseerd dat C. psittaci de gemobiliseerde macrofagen infecteert en ze op die manier gebruikt als transportmiddel doorheen het lichaam. Zo kan de bacterie een systemische infectie veroorzaken. De expressie-analyse gaf een suggestie via welke pathways de productie van de inflammatoire cytokines wordt geactiveerd. De resultaten suggereren een activatie van oppervlaktereceptoren vroeg na infectie, die later post-infectie wordt aangevuld met activatie van enkele intracellulaire receptoren. Wegens het ontbreken van een significante opregulatie voor TLR2 vroeg na infectie, lijkt de TLR2/TLR1/TLR6-NF-κB/AP1 pathway niet de oorzaak voor de cytokinerespons. De significante opregulatie van TLR4 2u post-infectie suggereert een rol voor deze oppervlaktereceptor in de productie van de drie gedetecteerde pro-inflammatoire cytokines (IL-1β, TNF-α en IL-6). De significante opregulatie van NLRP3 en ASC duiden op een activatie van het inflammasoom. Aangezien een geactiveerd NLRP3/ASC inflammasoom

iii

iv nodig is voor de omzetting van pro-IL-1β tot Il-1β, kan dit een verklaring zijn voor de aanwezigheid van IL-1β in het supernatans van de ge¨ınfecteerde THP1-cellen. De expressie-analyse suggereert bovendien een rol voor NOD2 in de productie van pro-inflammatoire cytokines. Een mogelijke verklaring voor de aanwezigheid van IL-8 is de activatie van NOD1. Om dit aan te tonen zal in de toekomst een expressie-analyse uitgevoerd worden voor NOD1. Bovendien vormt expressie-analyse geen sluitend bewijs voor de aanwezigheid van de PRR’s. Analyse op eiwitniveau is noodzakelijk om de bovenstaande suggesties te bevestigen.

Summary Chlamydia psittaci is an obligate intracellular parasite. The bacteria causes respiratory infections in birds and humans. C. psittaci is capable of causing a systemic infection. In that case, the bacteria replicates in blood monocytes and macrophages. The survival and replication of C. psittaci in macrophages is a unique feature, because macrophages have an important role in innate immunity. This Masterthesis examines the response of the innate immune system of human macrophages upon infection with Chlamydia psittaci. THP1-cells were inoculated with EBs from the low virulent CP3 strain. Samples for infectivity titration, ELISA and RNA-extraction were taken 2h, 4h, 8h, 12h, 18h, 24h, 36h, 48h and 72h post-infection. The infectivity titration was performed to evaluate if there is an association between the innate immune response and the amount of bacteria present. The ELISA detected inflammatory cytokines produced upon infection. RNA-extraction was followed by Real Time PCR for expression analysis of a number of Pattern Recognition Receptors (PRRs). Cytokines produced in detectable amounts are IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8 and GM-CSF. These cytokines cause an inflammatory response, but also the recruitment of immune cells, such as macrophages, to the site of infection. C. psittaci is able to infect these mobilized macrophages. It is hypothesized that the bacteria uses macrophages to transport themselves throughout the body. This could explain how C. psittaci causes systemic infections. Expression analysis on a number of PRRs was performed to evaluate which pathways are used in the production of the detected inflammatory cytokines. The results suggest an activation of surface receptors early post infection, followed by activation of certain intracellular receptors later upon infection. TLR2 was not significantly upregulated early in the infection. Because of that, the TLR2/TLR1/TLR6-NF-κB/AP1 pathway does not seem to be responsible for the cytokine response. Significant upregulation of TLR4 2h post-infection suggests a role for this surface receptor in the production of the three detected pro-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α en IL-6). Significant upregulation of NLRP3 and ASC indicates an activation of the inflammasome. This could explain the presence of IL-1β in the supernatans of infected THP1cells, because an active NLRP3/ASC inflammasome is essential in converting pro-IL-1β into IL-1β. Furthermore the expression analysis suggests a role for NOD2 in the production of

v

vi pro-inflammatory cytokines. A possible explanation for the presence of IL-8 is an activation of NOD1. Real Time PCR for this cytoplasmic receptor will be performed in the future in order to examine this hypothesis. The performed expression analysis is no evidence for the actual presence and activation of the PRRs. Analysis on protein level is necessary to confirm the above suggestions.

Inhoudsopgave 1 Introductie

1

2 Literatuurstudie 2.1 Taxonomie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1 Taxonomie van Chlamydia psittaci . . . . . . . . . . . 2.1.2 Serotypering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Chlamydiosis en psittacosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1 Chlamydiosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.2 Psittacosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3 Ontwikkelingscyclus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1 Aanhechting en internalisatie . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2 Primaire differentiatie en vermenigvuldiging . . . . . . 2.3.3 Modificatie van de inclusie en nutriëntacquisitie . . . . 2.3.4 Secundaire differentiatie en verspreiding . . . . . . . . 2.3.5 Ontsnappen aan het immuunsysteem van de gastheer 2.4 Chlamydia psittaci in macrofagen . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1 Celcyclus en systemische infectie . . . . . . . . . . . . 2.4.2 Gelimiteerde replicatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.3 Actieve inhibitie van replicatie . . . . . . . . . . . . . 2.5 Intracellulaire receptoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.1 NOD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.2 NALP3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.3 TLR3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.4 TLR9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.5 MBL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3 Materialen en methoden 3.1 Stockproductie van C. psittaci CP3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.1 Gebruikte oplossingen en media . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.2 In cultuur brengen en splitsen van Buffalo Green Monkey (BGM) cellen 3.1.3 C. psittaci CP3 stockproductie in BGM-cellen . . . . . . . . . . . . . 3.1.4 C. psittaci CP3 (EB’s en RB’s) opzuivering . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.5 EB/RB opzuivering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.6 Titratie van de C. psittaci CP3 EB stock . . . . . . . . . . . . . . . . vii

2 2 2 3 5 5 6 9 10 10 11 11 12 13 13 13 14 16 16 17 18 19 19 21 21 21 24 25 25 26 27

3.2

3.3

3.4

3.5

Experiment voor staalname . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Gebruikte oplossingen en media . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2 In cultuur brengen, tellen en splitsen van THP1-cellen (humane cytachtige cellen) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.3 Opzet van het experiment voor staalname . . . . . . . . . . . . 3.2.4 Staalname . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ELISA voor humane cytokines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1 Overzicht protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.2 Verwerking data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Infectiviteitstitratie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1 BGM-cellen planten en inoculeren . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.2 Directe immunofluorescentiekleuring . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.3 Data-analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Real Time PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.1 RNA-extractie en bepalen van de RNA-concentratie . . . . . . 3.5.2 cDNA synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.3 Testen van de primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.4 Opstellen van de standaardcurves . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.5 Real Time PCR met stalen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.6 Verweking data en data-analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4 Resultaten 4.1 Titratie EB-stock CP3 . . . . . . . 4.2 ELISA voor humane cytokines . . 4.3 Infectiviteitstitratie . . . . . . . . . 4.4 Real Time PCR . . . . . . . . . . . 4.4.1 Testen van de primers . . . 4.4.2 Resultaten Real Time PCR

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . . . . mono. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

30 30 31 32 32 32 33 33 33 33 34 34 34 35 37 37 38

. . . . . .

39 39 39 42 43 43 45

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

29 29

5 Discussie

49

6 Conclusie

56

A Referenties

57

B User Manual Multi-Analyte ELISArray Kit

67

C Titratie EB-stock CP3

84

D ELISA

85

E Infectiviteitstitratie

87

F Real Time PCR

89

viii

Afkortingen AP1 ASC AT ATP BGM-cellen CAD cCKM cMEM cRPMI-medium Da DEPC DMSO dNTP dsRNA EB EDTA ELISA FW GTP GM-CSF H.I. FCS hsp IB ICAM-2 ICKM IDO IFN IL IMEM

Activator Protein 1 Apoptosis-associated Speck-like domain containing a Caspase recruitment domain Annealingstemperatuur Adenosine Triphosphate Buffalo Green Monkey cellen Coronary Artery Disease compleet Chlamydia Cultuur Medium compleet Minimaal Essentieel Medium complete Roswell Park Memorial Institute medium Dalton Diethylpyrocarbonaat Dimethylsulfoxide Deoxyribonucleotide Triphosphate dubbelstrengig RNA Elementary Body Ethyleendiaminetetra-azijnzuur Enzym-Linked Immuno Sorbent Assay Forward Guanine Triphosphate Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor Heat Inactivated Fetal Calf’s Serum heat shock protein Intermediate Body Intercellular Adhesion Molecule 2 Incompleet Chlamydia Cultuur Medium Indolamine 2,3-Dioxygenase Interferon Interleukine Incompleet Minimaal Essentieel Medium ix

iNOS KAB KT LFA-1 LPS LRR Mac-1 MBL MEM MHC MIP MOI MOMP MTOC NF-κB NK-cellen NO NOD OMPA PAMP PBS PCR-RFLP PDI PEI PMA PRR RB REV RIG-1 ROS RPM RPMI-medium rRNA siRNA SPF SPG SPG + AB Tarp

inducible Nitric Oxide Synthase Kloonanalysebuffer Kamertemperatuur (18°C) Lymphocyte Function-associated Antigen 1 Lipopolysacchariden Leucine Rich Repeats Macrophage Antigen 1 Mannose Bindend Lectine Minimaal Essentieel Medium Major Histocompatibility Complex Macrophage Infectivity Potentiator Multiplicity Of Infection Major Outer Membrane Protein Microtubuli Organiserend Centrum Nucleaire Factor κB Natural Killer cellen Nitric Oxide Nucleotide-bindend Oligomerisatie Domein Outer Membrane Protein A Pathogen Associated Molecular Pattern Phosphate Buffered Saline Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Protein Disulfide Isomerase Polyethyleenimine Phorbol-12-myristaat-13-acetaat Pattern Recognition Receptor Reticulate Body Reverse Retinoid-inducible Gene 1 Radical Oxygen Species Revolutions Per Minute Roswell Park Memorial Institute medium ribosomaal RNA small interfering RNA Specific Pathogen Free Sucrose Phosphate Glutamate Sucrose Phosphate Glutamate + Antibiotica Translocated Actin-recruiting Phosphoprotein

x

TCID Th-cellen TNF TLR TTSS Uro VLA-4

Tissue Culture Infection Dose T helper cellen Tumor Necrosis Factor Toll-like Receptor Type Three Secretion System Urografin-76 Very Late Antigen 4

xi

Hoofdstuk 1

Introductie Chlamydia psittaci is een obligaat intracellulaire bacterie die ademhalingsinfecties veroorzaakt bij vogels en mensen. Na infectie met C. psittaci zal de bacterie zich in de eerste plaats vermenigvuldigen in de epitheliale cellen van de bovenste luchtwegen. Later kan de bacterie worden teruggevonden in de epitheliale cellen en macrofagen van de onderste luchtwegen. Bij een systemische infectie zal de bacterie zich vermenigvuldigen in bloedmonocyten en -macrofagen. Aangezien de macrofaag een belangrijke rol speelt in de aangeboren immuunrespons is het uniek dat C. psittaci in staat is om te overleven en zich te vermenigvuldigen in deze immuuncel. Deze masterproef beoogt het onderzoek naar de herkenning van Chlamydia psittaci door de humane macrofaag via oppervlakte- en intracellulaire receptoren, alsook de cytokines en chemokines die aangemaakt worden na infectie. In het hoofdstuk Literatuurstudie wordt het theoretisch kader van deze masterproef geschetst. Hoofdstuk Materialen en Methoden omschrijft in detail welke tools werden toegepast in het onderzoek. De manier waarop stalen werden bekomen en hoe die geanalyseerd werden, komt hier uitgebreid aan bod. De resultaten van de uitgevoerde testen zijn dan weer terug te vinden in hoofdstuk 4. Het interpreteren en verklaren van de resultaten gebeurt tijdens de discussie, om tot een conclusie te komen in het laatste hoofdstuk. Alle gebruikte referenties zijn terug te vinden in bijlage A.

1

Hoofdstuk 2

Literatuurstudie 2.1 2.1.1

Taxonomie Taxonomie van Chlamydia psittaci

De complete taxonomie van Chlamydia psittaci is superrijk Bacteria; superstam Chlamydiae/Verrucomicrobia groep; stam Chlamydiae; klasse Chlamydia; orde Chlamydiales; familie Chlamydiaceae; genus Chlamydia; species psittaci. (NCBI, 2011) Tot eind jaren tachtig bestond er binnen de orde van de Chlamydiales slechts één familie; de Chlamydiaceae. Toen ging men er vanuit dat deze familie twee species kende. Deze waren Chlamydia psittaci en Chlamydia trachomatis. (Everett, 2000) Daar kwam eind jaren tachtig en begin jaren negentig verandering in met de ontdekking dat het tot nog toe gekende genus Chlamydia ook twee andere species omvatte. Ze kregen de namen Chlamydia pecorum en Chlamydia pneumoniae. (Grayston, 1989; Fukushi, 1992) In 1999 lanceerden Everett et al een revolutionair idee op basis van de analyse van 16S en 23S rRNA genen en fenotypische, morfologische en genetische informatie. Het ging om het opsplitsten van de negen gekende species in twee genera: Chlamydia en Chlamydophila. Daarnaast werden binnen de orde van de Chlamydiales drie nieuwe families Chlamydia-achtigen voorgesteld. Deze families zijn Parachlamydiaceae, Simkaniaceae en Waddliaceae. Een voorstelling van deze taxonomie is terug te vinden in figuur 1.1. (Everett, 1999) Er kwam echter heel wat protest tegen de introductie van de nieuwe genera. Schachter et al vonden bijvoorbeeld dat er niet genoeg sequentieverschil was op DNA-gebied om de indeling in twee genera te maken. (Schachter, 2001) Ook Stephens kwam met argumenten in het nadeel van de nieuwe taxonomie. Een eerste argument bestaat erin dat de meeste species meer dan 97% sequentiesimilariteit hebben in hun genoom. Dit is voldoende om van verschillende species te spreken, maar niet om ze op te delen in verschillende genera. Er is inderdaad een clustering zichtbaar wanneer de 16S rRNA-sequenties worden bekeken. Deze

2

Hoofdstuk 2. Literatuurstudie

3

schijnbare opdeling is echter enkel te wijten aan een vroege opdeling in geologische tijd en hun isolatie van de exogene microbiële genenpool door hun levenscyclus in inclusievacuoles. Daarom wordt tot op de dag van vandaag het voorstel van Everett nog altijd niet aanvaard. De meeste wetenschappers gebruiken dan ook de indeling die weergegeven is in figuur 1.2. (Stephens, 2009) In 2009 werd een werkgroep opgericht die definitief een einde zou moeten maken aan de discussie. (Greub, 2010) Recent (9th German Chlamydia Workshop in Ascona, Zwitsterland, 22-25 februari 2011) heeft het subcommittee of the international committee on systematics of prokaryotes (ICSP) beslist dat Chlamydophila psittaci toch tot het genus Chlamydia behoort. Dus Cp. psittaci werd gewijzigd naar C. psittaci. In wat volgt zal het centrale organisme in deze masterproef dan ook aangeduid worden als Chlamydia psittaci of C. psittaci.

2.1.2

Serotypering

Binnen het species C. psittaci is een grote diversiteit aan serologisch te onderscheiden stammen aanwezig. De eerste testen die werden ontwikkeld waren indirecte micro-immunofluorescentie testen. Ze maakten gebruik van serovar-specifieke monoclonale antilichamen. (Andersen, 1991a) Zo werden de eerste vier serovars ontdekt, ze werden vernoemd naar het gastheerorganisme: kalkoen, psittacine vogel, duif en eend. (Andersen, 1991b) Later kregen de serovars respectievelijk de naam serovar D, serovar A, serovar B en serovar C. (Vanrompay, 1993) Serovars E en F werden het eerst ge¨ısoleerd uit Noord-Amerikaanse vogels. Het bewijs voor deze twee nieuwe serovars werd ook geleverd met behulp van monoclonale antilichamen, maar daarnaast werden nog enkel bijkomende technieken gebruikt. Deze technieken zijn restrictie endonuclease analyse van het volledige genoom en PCR-RFLP analyse van het gen voor het major outer membrane protein (MOMP), dit is het Omp1 gen. (Andersen, 1997) Daarnaast werd in hetzelfde jaar gebruik gemaakt van de 16S rRNA gen sequentie voor het typeren van C. psittaci. (Takahashi, 1997) Verder onderzoek bracht nog een zevende serovar aan het licht; serovar E/B. Het is het resultaat van een onderzoek dat zich richtte op het gen voor het outer membrane protein A of kortweg het ompA gen. Op dit gen werd RFLP uitgevoerd en het werd bovendien ook gesequeneerd. Het ompA gen van serovar E/B vertoonde sterke homologie met dat van serovars A, B en E, vandaar de naam voor dit nieuwe serovar. (Geens, 2005a) Kort daarna werd een species- en een genotype-specifieke Real Time PCR ontwikkeld. De methode werkt snel en is zeer gevoelig, vandaar dat ze gebruikt kan worden in epidemiologisch onderzoek bij zowel vogels als mensen. (Geens, 2005b)


4

Figuur 2.1: Taxonomie binnen de orde van de Chlamydiales volgens Everett et al. Gebaseerd op (Everett, 2000)

Figuur 2.2: Taxonomie binnen de orde van de Chlamydiales volgens Stephens et al. Gebaseerd op (Stephens, 2009)


2.2

5

Chlamydiosis en psittacosis

Chlamydia psittaci is een intracellulaire Gram-negatieve bacterie die vogels en mensen infecteert. De ziekten worden respectievelijk chlamydiosis en psittacosis genoemd. Door het gevaar op zo¨ onotische overdracht, is het één van de meest behandelde ziekten in vogels. Vooral mensen die veel in contact komen met vogels, zoals werknemers van kippen- en kalkoenbedrijven, lopen gevaar op een infectie. De huidige behandeling, bij zowel vogels als mensen, is het toedienen van het antibioticum doxycycline. (West, 2011)

2.2.1

Chlamydiosis

Gastheerbereik Chlamydiale infecties werden reeds gerapporteerd in zo’n 460 vogelsoorten van 30 verschillende ordes, maar vooral de orde van de Psittaciformes lijkt zeer gevoelig. (Kaleta, 2003) C. psittaci werd ge¨ısoleerd uit onder andere papegaaien, psittacine vogels, eenden, kalkoenen en andere soorten pluimvee. In kalkoenen werden serovars B, D en E teruggevonden, maar serovar D is voor deze vogelsoort het meest virulent. Bij gedomesticeerde eenden is dan weer vooral serovar C actief. (Eidson, 2002) Transmissie Chlamydia psittaci wordt uitgescheiden in de faeces en in nasale en oculaire secreties van besmette vogels. (Smith, 2011) De overdracht tussen vogels gebeurt dan ook door inhalatie of indigestie van dit gecontamineerd materiaal. (West, 2011) Gedomesticeerde vogels kunnen in contact komen met de bacterie via water dat gecontamineerd wordt door besmette wilde vogels. (Harkinezhad, 2009) Buiten het gastheerorganisme is C. psittaci tamelijk labiel, maar de bacterie kan wel meer dan een maand infectieus blijven indien ze omgeven is door organisch materiaal zoals faeces. Soms gebeurt het dat ge¨ınfecteerde vogels er gezond uitzien, terwijl ze toch met tussenpozen het organisme uitscheiden. Het uitscheiden gebeurt vooral wanneer de vogels onder invloed staan van stressfactoren. (Smith, 2011) Daarom kan het belangrijk zijn om een periodieke screening naar C. psittaci uit te voeren in pluimveebedrijven. (West, 2011) Symptomen De incubatieperiode varieert van drie dagen tot meerdere weken. Soms is de ziekte moeilijk vast te stellen, omdat symptomen kunnen uitblijven. De symptomen van chlamydiosis zijn bovendien niet eenduidig. Het gaat ondermeer om letargie, anorexia, mucopurulente oogen neusexcreties, conjunctivitis en diarree. Bij zware infecties komen extreme vermagering en uitdroging voor die uiteindelijk fataal kunnen worden voor de vogel. De ernst van de


6

symptomen en ziekte zijn afhankelijk van de vogelsoort, virulentie van de stam, infectiedosis, stressfactoren, immuunstatus van de vogel en of er al dan niet een behandeling wordt opgestart. (Smith, 2011) Diagnose Er zijn heel wat testen ontwikkeld voor de soms moeilijke diagnose van C. psittaci. Er wordt aangeraden om een combinatie van verschillende testen te gebruiken. Voorbeelden van verschillende testen zijn de bacterie in cultuur brengen, detectie van antilichamen, detectie van antigenen en detectie van bacterieel DNA. (Smith, 2011) Behandeling Momenteel worden vogels met chlamydiosis behandeld met het antibioticum doxycycline. Er wordt voor dit tetracycline gekozen omdat het beter wordt geabsorbeerd en trager wordt geëlimineerd uit het lichaam, waardoor het in lagere dosis of minder frequent kan toegediend worden. De medicatie kan toegediend worden via voedsel en water, maar kan ook rechtstreeks oraal worden aangeboden of via injectie. Daarnaast zijn nog twee alternatieven voorhanden. Het gaat om injectie van oxytetracycline en voedsel met chlortetracycline. (Smith, 2011) Bij de behandeling van ge¨ınfecteerde vogels zijn een aantal maatregelen van groot belang. De vogels moeten apart worden gezet en al het mogelijk ge¨ınfecteerd materiaal moet worden gedesinfecteerd. De vogels ondervinden best zo weinig mogelijk stress tijdens de behandeling en er wordt ook aangeraden om hun lichaamsmassa op te volgen. Bovendien moeten de verzorgers extra op hygiëne letten omwille van het zoönotisch risico. (Smith, 2011) Er wordt ook gewerkt aan een eerste DNA-vaccin. Kalkoenen werden ge¨ımmuniseerd met een DNA-plasmide dat het gen bevat voor het MOMP. Voor het ompA gen werden de codons aangepast naar het condongebruik van vogels. Transfectie werd geoptimaliseerd door het gebruik van polyplexen met lineair en vertakt polyethyleenimine (PEI). Het polymeer bindt het DNA-plasmide elektrostatisch en beschermt het bovendien tegen extracellulaire nucleases. Intramusculaire toediening van polyplexen met vertakt PEI werd vergeleken met toediening via aerosol in SPF-kalkoenen. Uit deze experimenten bleek de intramusculaire toediening de beste immunisatie met zich mee te brengen. Verder onderzoek is nog nodig om het DNAvaccin te optimaliseren. (Verminnen, 2010)

2.2.2

Psittacosis

Zoo ¨nose Vogels vormen het grootste reservoir voor de overdracht van C.psittaci naar mensen. (Kaleta, 2003) Ge¨ınfecteerde vogels scheiden de bacterie uit via faeces en secreties van het ademhalings-


7

stelsel. Inhalatie van aerosolen die uit deze bronnen ontstaan infecteren mensen. Daarnaast worden ook infecties opgelopen na snavel-mond contact. Andere mogelijkheden zijn contact met gevederte en weefsels van ge¨ınfecteerde dieren. Dagelijks contact met vogels verhoogt dan ook de kans op infectie. (West, 2011) Maar ook kort contact met vogels of uitwerpselen kunnen genoeg zijn om de bacterie in te ademen. Daarom gebeurt het soms dat patiënten met psittacosis zich de bron van besmetting niet meer kunnen herinneren. (Smith, 2011) Transmissie van persoon naar persoon werd reeds gesuggereerd, maar nog niet bewezen. (Hughes, 1997) Symptomen De incubatieperiode van psittacosis bedraagt tussen 5 en 14 dagen. De ernst van de ziekte varieert van milde niet-specifieke symptomen tot systemische infecties met ernstige longontsteking. Voordat antimicrobiële geneesmiddelen bestonden, had psittacosis in 15% tot 20% van de gevallen een dodelijke afloop. Sinds de toepassing van antibiotica loopt de ziekte maar zelden fataal af. Personen met symptomatische infecties ondervinden typisch een plotse opkomst van koorts, koude rillingen, hoofdpijn, duizeligheid en myalgie. Gewoonlijk hebben ge¨ınfecteerden last van een droge hoest die soms vergezeld is door moeilijke ademhaling of een beklemmend gevoel op de borst. Soms worden ook een vergrote milt en een niet-specifieke uitslag vastgesteld. Op radiografische beelden van de longen kunnen infiltraten aanwezig zijn op de longlobben of in het interstitieel vocht. (Smith, 2011) Diagnose De diagnose stellen op een symptomatische manier kan soms moeilijk zijn door de aspecificiteit van de symptomen. De minder ernstige infecties worden vaak verward met andere respiratoire pathogenen. Daarom worden volgende testen gehanteerd: isolatie van de bacterie, detectie van antilichamen, detectie van antigenen en detectie van bacterieel DNA via PCR eventueel gevolgd door sequenering, Real Time PCR of nested PCR. (Smith, 2011) Behandeling C. psittaci infecties in mensen worden typisch behandeld met tetracyclines. Milde tot gematigde gevallen kunnen verholpen worden met een orale toediening van doxycycline of tetracycline hydrochloride. De behandeling wordt tenminste 10 dagen voortgezet. Ernstige infecties moeten behandeld worden via intraveneuze toediening van doxycycline hyclaat. De meeste infecties reageren na 10 tot 14 dagen op de antibioticumtherapie, hoewel een terugval kan gebeuren. Aan sommige patiënten kunnen echter geen tetracyclines worden toegediend wegens allergie, zwangerschap of te jonge leeftijd. Het beste alternatief voor deze mensen zijn macrolide antibiotica. Meestal worden antibiotica niet profylactisch toegediend. Uitzonderlijk wordt het toch gedaan na een mogelijke blootstelling aan C. psittaci. (Smith, 2011)


8

Volksgezondheid Er werden heel wat maatregelen vastgelegd om het risico op besmetting te minimaliseren. Ten eerste moeten mensen die veel in contact komen met vogels of ander gecontamineerd materiaal, zoals werknemers van pluimveebedrijven, bewust gemaakt worden van het mogelijke gezondheidsrisico. Bovendien moeten deze personen beschermd worden tijdens het mogelijke contact. Dit kan door beschermende kledij, handschoenen, een veiligheidsbril en een mondmasker te dragen. De karkassen van besmette vogels moeten worden bevochtigd met detergent. Algemene hygiëne van de kooien en het geregeld wegnemen van fecaal materiaal zijn van uiterst belang. Het identificeren van de bron van psittacosis wordt vergemakkelijkt door alle gegevens van aankoop, symptomen en verkoop bij te houden. Er wordt ook aangeraden om geen vogels aan te kopen die tekenen vertonen van chlamydiosis. Nieuw aangekochte vogels en zieke vogels worden best in quarantaine geplaatst om een uitbraak te voorkomen. Vogels die vaak in contact komen met mensen worden best regelmatig gescreend op infecties. (Smith, 2011) Maar niet alleen rechtstreeks contact is gevaarlijk voor de volksgezondheid. Ook grasmaaien en andere tuinieractiviteiten kunnen de mens in contact brengen met besmette uitwerpselen van vogels. (Telfer, 2005)


2.3

9

Ontwikkelingscyclus

Chlamydia psittaci is een obligaat intracellulaire bacterie met een unieke bifasische levenscyclus. (Escalante-Ochoa, 1998) Deze cyclus wisselt af tussen drie morfologisch verschillende vormen: het elementair lichaampje (EB, 0.2-0.3 µm), het reticulair lichaampje (RB, 0.5-2 µm) en een derde tussenvorm die voorkomt tijdens de transformatie van RB’s naar EB’s, het intermediair lichaampje (IB, 0.3-1 µm). De EB’s zijn infectieus en metabolisch inactief. Eens in de cel differentiëren de EB’s naar de metabolisch actieve RB’s. De RB’s gaan zich vervolgens in de gastheercel vermenigvuldigen via binaire deling. (AbdelRahman, 2005) Deze deling gebeurt in een niet-verzuurde vacuole die inclusie wordt genoemd. (Harkinezhad, 2009) Daarna gaan ze terug over in de EB-vorm, klaar om nieuwe cellen te infecteren. (AbdelRahman, 2005)

Figuur 2.3: Chlamydiale ontwikkelingscyclus. (Longbottom, 2003)


2.3.1

10

Aanhechting en internalisatie

De initiële interactie van EB’s met de celmembraan van de gastheercel is bij de meeste species reversibel en van elektrostatische aard. De bacterie interageert met heparaan sulfaat dat aanwezig is op glycosaminoglycanen van de gastheercelmembraan. (Dautry-Varsat, 2005) Aan de kant van de EB is het OmpA eiwit belangrijk. (AbdelRahman, 2005) Na deze initiële binding volgt een irreversibele binding. Hiervoor werden al veel receptorkandidaten naar voor gebracht. Aan de kant van de bacterie gaat het onder andere om glycosaminoglycanen en MOMP. Reeds voorgestelde gastheerreceptoren zijn mannose-receptor, mannose-6-fosfaatreceptor en oestrogeenreceptor. (Cocchiaro, 2009) Onmiddellijk na deze irreversibele binding wordt door het elementair lichaampje het eiwit Tarp in de gastheercel gebracht via het type III secretiesysteem (TTSS). De betrokkenheid van een functioneel TTSS blijkt uit het feit dat het Tarp al gedetecteerd wordt in het cytoplasma, terwijl het EB zich nog extracellulair bevindt. In de gastheercel wordt Tarp snel gefosforyleerd op tyrosine-residuen. Deze fosforylatie is sterk gecorreleerd met rekrutering van actine. Het tyrosine kinase die de fosforylatie verzorgt is nog niet ge¨ıdentificeerd. (Clifton, 2004) Voor de tijdelijke hermodelering van het cytoskelet maken Chlamydiaceae gebruik van kleine gastheer GTPase’s van de Rho familie. Het gebruikte GTPase hangt hierbij af van het Chlamydia species. Het actine wordt zodanig gemanipuleerd dat de celmembraan geleidelijk dichtvouwt rond het elementair lichaampje en zo wordt het EB opgenomen in de gastheercel. Het volledige proces van actinerekrutering en internalisatie gebeurt voor de meeste species ongeveer in anderhalve minuut. (Dautry-Varsat, 2005) Eens ge¨ınternaliseerd worden EB’s herverdeeld van de periferie van de cel naar de regio van het Golgi-apparaat. Dit gebeurt doordat de vacuole via het cytoskelet wordt verplaatst naar het microtubuli organiserend centrum (MTOC) met behulp van het motoreiwit dyne¨ıne. (Harkinezhad, 2009)

2.3.2

Primaire differentiatie en vermenigvuldiging

Initieel lijkt de inclusiemembraan nog op de celmembraan van de gastheer, maar geleidelijk aan worden gastheercomponenten vervangen door bacterieel geproduceerde eiwitten. (Scidmore, 2003) Dit gaat gepaard met de differentiatie van het infectieus EB naar het metabolisch actief RB. Deze overgang wordt gekarakteriseerd door decondensatie van het nucleo¨ıde en vergroting van het organisme. (Harkinezhad, 2009) Door de decondensatie van het chromosoom wordt het genoom transcriptioneel actief. Reeds 15 minuten post-infectie worden al nieuwe bacteriële prote¨ınes geproduceerd. (Plaunt, 1988) Na de primaire differentiatie, ongeveer 8 uur post-infectie, starten de RB’s met de vermenigvuldiging. Dit gebeurt met behulp van binaire fissie binnenin de inclusie. RB’s blijven nauw geassocieerd met de inclusiemembraan. (Harkinezhad, 2009)


2.3.3

11

Modificatie van de inclusie en nutri¨ entacquisitie

Genexpressie tijdens primaire differentiatie heeft twee grote functies. Systemen opzetten voor nutriëntacquisitie en het modificeren van de inclusievacuole. Deze functies zorgen ervoor dat de inclusies kunnen ontsnappen aan de endocytotische pathway. (AbdelRahman, 2005) Dit houdt in dat de inclusies geen verzuring en geen fusie met het lysosoom ondergaan zoals andere endocytotische vesikels. (Harkinezhad, 2009) In plaats daarvan gebruiken chlamydiale inclusies een subset van vesikels afkomstig van het Golgi-apparaat. Specifiek zijn het vesikels die sfingomyeline en cholesterol bevatten. (Hackstadt, 1996; Carabeo, 2003) De Inc-prote¨ınen zijn een groep prote¨ınen die teruggevonden worden in de inclusiemembraan. Er wordt gesuggereerd dat deze eiwitten betrokken zijn bij de interactie met gastheereiwitten. Er werd aangetoond dat verschillende Inc-eiwitten afgeschreven worden binnen de eerste twee uur na infectie. Daarom worden ze aanzien als kandidaten voor chlamydiale factors die van belang zijn bij de modificatie van de inclusies. (AbdelRahman, 2005) De inclusies van C. psittaci worden omringd door talrijke mitochondria. Mogelijks speelt kinesine een rol in de rekrutering van mitochondria. C. psittaci is minder goed uitgerust voor de aanmaak van zijn eigen ATP dan andere Chlamydia species. Het zich omringen met mitochondria is een alternatief mechanisme om ATP te verkrijgen van de gastheer. (Vanrompay, 1996) Bacteriën die vermenigvuldigen in het cytosol van de cel hebben vrij toegang tot de daar aanwezige nutrënten. Chlamydiaceae moeten hun nutriënten echter eerst transporteren doorheen de inclusiemembraan. De mechanismen waarmee dit gebeurt zijn niet echt duidelijk. Omdat de inclusie zich heeft losgemaakt van de endosomale pathway is het onwaarschijnlijk dat nutriënten geleverd worden via deze weg. (Harkinezhad, 2009) De inclusiemembraan is wel permeabel voor moleculen met een moleculair gewicht tussen 100 en 520 Da. (Grieshaber, 2002) Nadat deze kleine moleculen via passieve diffusie in het lumen van de inclusie komen, worden ze via specifieke membraan transporters in de bacteriële membraan opgenomen. Voor het transport van moleculen groter dan 520 Da over de inclusiemembraan werden nog geen transportermoleculen gevonden.(Harkinezhad, 2009)

2.3.4

Secundaire differentiatie en verspreiding

Door het intensief vermenigvuldigen van de bacterie, wordt de inclusie alsmaar groter. De bouwstenen voor de groei van de inclusie zijn afkomstig van een subset van vesikels die afgeleid worden van het Golgi-apparaat. Op die manier vergroot het membraanoppervlak. Aangezien elk RB verantwoordelijk kan zijn voor 1000 nieuwe RB’s, geraakt de inclusie overvol. Daardoor beginnen RB’s de associatie met de inclusiemembraan te verliezen, wat het signaal zou kunnen zijn voor de terugdifferentiatie naar infectieuze EB’s. (Harkinezhad, 2009) Het verwijderen


12

van het TTSS van het intern oppervlak van de inclusie zou een kritische stap kunnen zijn in het loslaten van de RB’s. (Bavoil, 2000) Tijdens secundaire differentiatie gebeurt de expressie van een aantal late genen. Micro-array analyses brachten 26 late genen naar voor. (Belland, 2003) Daarbij zitten genen die coderen voor het outer-membrane complex en prote¨ınen die betrokken zijn bij het condenseren van het chromosoom. (AbdelRahman, 2005) Daarnaast zijn nog een aantal prote¨ınes aanwezig waarvan wordt voorspeld dat de functie belangrijk is voor de vorming van de hoge mate van disulfide-crosslinking die terug te vinden is in het outer-membrane complex. (Belland, 2003) Tijdens de late fase van expressie worden ook prote¨ınes aangemaakt die EB’s nodig hebben tijdens de vroege fase van de cyclus. (AbdelRahman, 2005) Op het einde van de cyclus, ongeveer 50 uur post-infectie, volgt de verspreiding van de nieuwe EB’s en ook nog enkele ongedifferentieerde RB’s. De verspreiding wordt mogelijk door lyse van de gastheercel en de inclusie of door reverse endocytose. Soms gebeurt het dat de cyclus verandert in het voordeel van persistentie. Persistente bacteriën slagen er niet in te differentiëren van RB naar EB. In de plaats daarvan blijven ze metabolisch actief. Ze accumuleren chromosomen doordat ze continu DNA repliceren, maar niet delen. Deze persistente vormen kunnen wel snel terug transformeren naar normale RB’s of infectieuze EB’s. (Harkinezhad, 2009)

2.3.5

Ontsnappen aan het immuunsysteem van de gastheer

Chlamydiaceae manipuleren verschillende signaalpathways om de activering van de aangeboren immuunrespons te verhinderen. Deze respons kan namelijk nadelig zijn voor zowel de bacterie, als voor het overleven van de gastheer. Het gaat om de inhibitie van apoptose en het manipuleren van de NF-κB pathway. (Cocchiaro, 2009) Het effect van een Chlamydia-infectie op het apoptotisch signaal is complex. Het belang van een goeie tijdelijke regulatie van de pathway blijkt uit het feit dat chlamydiale ontwikkeling verstoord wordt wanneer apoptose van de gastheercel te vroeg plaatsvindt. (Ying, 2008) Chlamydia blokkeren apoptose hoofdzakelijk via de inhibitie van de vrijlating van cytochroom c uit de mitochondria.(Fan, 1998) De NF-κB transcriptie factor reguleert verschillende facetten van de aangeboren en adaptieve immuniteit. De subeenheden p50 en p65 vormen samen het heterodimeer complex NF-κB. Het complex wordt getransloceerd naar de kern waar het transcriptie regelt van verschillende proinflammatoire cytokines. (Hayden, 2006) Een stap in de activatie van NF-κB is de degradatie van IκBα via ubiquitine gemedieerde proteolyse. (Sun, 2008) Verschillende mechanismen voor NF-κB inhibitie werden reeds ontdekt bij Chlamydiaceae. Tijdens infectie met Chlamydia trachomatis wordt de p65-subunit afgebroken. (Lad, 2007) Ook de ubiquitinatie van IκBα wordt onderdrukt tijdens infecties. (Negrate, 2008)


2.4

13

Chlamydia psittaci in macrofagen

Tijdens de initiële replicatie van Chlamydia psittaci in epitheelcellen van het ademhalingsstelsel worden macrofagen aangetrokken naar de plaats van infectie. De normale taak van macrofagen bestaat uit het vormen van de eerste defensielijn van het aangeboren immuunsysteem. (Beeckman, 2010) C. psittaci is echter ook in staat om macrofagen te infecteren. De bacterie werd dan ook al gedetecteerd in monocyten/macrofagen. (Vanrompay, 1995) Doordat C. psittaci macrofagen infecteert, is het in staat zich te verspreiden naar andere organen in het lichaam via de bloedcirculatie om zo een systemische infectie te veroorzaken. Op die manier worden monocyten en macrofagen gebruikt als transportmiddel. (Beeckman, 2010)

2.4.1

Celcyclus en systemische infectie

Onderzoek rond infectie door C. psittaci in macrofagen leidde tot een aantal interessante resultaten. Monocyten zijn reeds aanwezig in de vroege fase van infectie. Deze monocyten differentiëren gedurende de infectie naar inflammatoire macrofagen. Net zoals bij de celcyclus in epitheelcellen wordt internalisatie tot stand gebracht door invaginatie van de celmembraan van de macrofaag of met behulp van clathrine gecoate pits. Hoog virulente stammen veroorzaken herstructurering van het actine van de gastheercel naar de plaats van aanhechting. C. psittaci vervolgt daarna zijn weg naar de kern. Ook in macrofagen zijn er inclusies die erin slagen de fagolysosomale fusie te omzeilen. Bovendien vervagen in de loop van de infectie de inclusiemembranen, wat erop wijst dat de bacterie vrij wordt losgelaten in het cytoplasma van de cel. (Beeckman, 2010) Om een systemische infectie te veroorzaken, moeten de ge¨ınfecteerde macrofagen vanuit het bloed andere weefsel binnendringen. Het mechanisme hiervoor is reeds opgehelderd voor C. pneumoniae en het is goed mogelijk dat ditzelfde mechanisme gebruikt wordt door C. psittaci. (Beeckman, 2010) Monocyten/macrofagen ge¨ınfecteerd met C. pneumoniae vertonen een verhoogde expressie van LFA-1, VLA-4 en Mac-1 op hun celoppervlak. (May, 2003) Minstens één van deze integrinen, LFA-1, is in staat te binden met ICAM-2, een receptor die aanwezig is op het oppervlak van rustende endotheelcellen. (de Fougerolles, 1991) De verhoogde expressie van integrinen op ge¨ınfecteerde macrofagen zorgt ervoor dat de macrofagen beginnen te rollen over de wand van een bloedvat en daarna op de wand vasthechten. Na vasthechting kunnen de monocyten/macrofagen dan tussen de endotheelcellen door het onderliggende weefsel binnendringen. (May, 2003)

2.4.2

Gelimiteerde replicatie

In tegenstelling tot de infectie in epitheelcellen zal de bacterie nooit het volledige cytoplasma van de gastheercel bezetten. Dit betekent dat er slechts een gelimiteerde replicatie en overleving van C. psittaci plaatsvindt in macrofagen. Een eerste mogelijke verklaring voor deze


14

verminderde activiteit is dat niet alle bacteriën van het inoculum even efficiënt kunnen binden en binnengaan in de cel als bij de infectie van epitheelcellen. Een andere verklaring is dat de fusie met het fagosoom minder efficiënt wordt verhinderd. De verminderde vermenigvuldiging heeft trouwens een groot voordeel voor Chlamydia psittaci. Te sterke vermenigvuldiging zou immers de antigeen presenterende macrofaag activeren. Bij sterkere vermenigvuldiging zouden meer chlamydiale prote¨ınen verwerkt worden tot peptidefragmenten in het proteasoom. Deze fragmenten zouden daarna door de macrofaag op MHC I gepresenteerd worden aan CD8+ T-cellen. Dit initieert de differentiatie van deze laatstgenoemde cellen tot cytotoxische T-lymfocyten. Bovendien zou de geactiveerde macrofaag een verhoogde fagocytose vertonen. Daardoor zouden chlamydiale antigenen via MHC II gepresenteerd worden aan CD4+ T-cellen. De IFN-γ productie van deze geactiveerde T-cellen zou resulteren in een nog verdere activatie van de cytotoxische T-lymfocyten. De gelimiteerde replicatie van C. psittaci in macrofagen zorgt er voor dat deze sterke activatie van het immuunsysteem niet plaatsvindt, wat de bacterie toelaat om een systemische infectie te veroorzaken. (Beeckman, 2010)

2.4.3

Actieve inhibitie van replicatie

De macrofaag draagt ook actief bij tot het limiteren van replicatie van bacteriën. Bij infectie met C. psittaci gebeurt dit niet door een oxidatieve uitbarsting zoals bij vele andere bacteriën. Het anti-chlamydiale mechanisme is onafhankelijk van zuurstof en wordt in macrofagen gestimuleerd door IFN. (Rothermel, 1986) Het mechanisme wordt gestimuleerd door IFN-γ alleen of door een combinatie van IFN-β met LPS. De interferonen induceren het enzym indolamine-2,3-dioxygenase (IDO). Het enzym katalyseert de decyclisatie van het aminozuur tryptofaan, dat essentieel is voor C. psittaci. De degradatie van tryptofaan zorgt er dus voor dat de vermenigvuldiging van Chlamydophila psittaci wordt gelimiteerd om de intracellulaire infectie te contoleren. (Carlin, 1989) Bovendien wordt de inductie van IDO versterkt door IL-1β. (Paguirigan, 1994; Carlin, 1995) Daarnaast staat nog een ander mechanisme onder controle van interferonen. In het mechanisme activeert de infectie, IFN-γ of TNF het induceerbaar enzym nitric oxide synthase (iNOS) dat de productie van antimicrobieel NO katalyseert. De rol van NO op infectie door Chlamydia trachomatis werd onderzocht in iNOS − /− muizen. Daaruit bleek dat de productie van reactief stikstof niet nodig is voor de eliminatie van de infectie, maar dat NO wel een rol speelt in het vermijden van een systemische infectie. (Igietseme, 1998) Ook de toegenomen vatbaarheid van iNOS − /− muizen voor C. pneumoniae duidt op een beschermende rol voor iNOS tijdens infectie.(Rottenberg, 1999) C. pneumoniae antigenen veroorzaken in muismacrofaagcultuur een productie van NO en IL-12/p40. De toevoeging van IFN-β verhoogt de NO-activiteit, maar verlaagt de inductie van IL-12/p40. Dit suggereert een controlerende rol voor IFN-β tijdens de infectie. IL-12 is immers een pro-inflammatoir cytokine en door de


15

secretie ervan te inhiberen wordt een overreactie die tot weefselschade kan leiden vermeden. De pathway die de inductie van iNOS teweegbrengt, wordt gecontroleerd door MyD88. Dit gebeurt via twee verschillende pathways: NF-κB activatie en fosforylatie van MAPK JNK. Dit laatste leidt tot de nucleaire translocatie van c-Jun, één van de twee componenten van het AP1-complex. Daarnaast is ook de fosforylatie van de MyD88-onafhankelijke transcriptiefactoren STAT1 en IRF1 nodig. (Rodriguez, 2008) Er is nog een derde mechanisme dat de groei van de intracellulaire bacteriën in macrofagen regelt. Het mechanisme is werkzaam na infectie met zowel C. psittaci als C. trachomatis. Macrofagen brengen slechts één ijzer-exporter tot expressie. Het gaat om het celoppervlakte eiwit ferroportine. Macrofagen die dit eiwit tot expressie brengen zijn in staat de groei van intracellulaire bacteriën te remmen. Via de ijzer-exporter wordt het ijzer uit de macrofaag gepompt. Dit limiteert de groei van de bacteriën, omdat het ijzer essentieel is voor hun ontwikkeling. Dit werd ontdekt door een toename in de groei van de pathogeen na toevoeging van hepcidine dat bindt op ferroportine, waarna de exporter wordt ge¨ınternaliseerd en gedegradeerd. Ook proeven met mutante muizen bevestigen het belang van ferroportine. (Paradkar, 2008)


2.5

16

Intracellulaire receptoren

Toll-like receptoren (TLR’s), samen met nog andere receptoren, zijn Pattern Recognition Receptors (PRR’s). Ze maken deel uit van het aangeboren immuunsysteem en zijn aanwezig op het oppervlak of in het cytosol van verschillende soorten cellen. Ze detecteren pathogen associated molecular patterns (PAMP’s), dit zijn geconserveerde microbiële motieven die typisch voorkomen op het oppervlak van bacteriën, zoals bijvoorbeeld lipopolysacchariden (LPS) of peptidoglycaan. (Athman, 2004) C. psittaci brengt een groot deel van zijn levenscyclus door binnenin de ge¨ınfecteerde cel. Het is dan ook waarschijnlijk dat de herkenning door het immuunsysteem verloopt via intracellulaire receptoren. De rol van intracellulaire receptoren van het immuunsysteem bij infecties met C. psittaci werd nog niet onderzocht. Daarom is dit stuk van de literatuurstudie gebaseerd op onderzoeken bij andere familieleden van de Chlamydiaceae.

2.5.1

NOD

Nucleotide-bindend oligomerisatie domein (NOD) prote¨ınes zijn intracellulaire receptoren van het aangeboren immuunsysteem, het zijn cytosolische PRR’s. NOD1 en NOD2 herkennen verschillende motieven in het peptidoglycaan van de bacteriële celwand. NOD1 herkent D-γglutamyl-meso-DAP dipeptide in het peptidoglycaan van Gram-negatieven. NOD2 fungeert dan weer als herkenner van zowel Gram-negatieve als Gram-positieve bacteriën, omwille van zijn reactie op muramyl dipeptide aanwezig in het peptidoglycaan van alle bacteriën. (Athman, 2004) Detectie door NOD1 en NOD2 leidt tot de activatie van NF-κB. NF-κB is een transcriptiefactor die eens geactiveerd de expressie van inflammatoire cytokines en chemokines aanschakelt. (Lee, 2007) Uit verschillende onderzoeken blijkt er een rol weggelegd voor NOD-prote¨ınes bij de afweer van cellen tegen Chlamydiaceae. De resultaten van een aantal van deze onderzoeken worden hieronder besproken. Opitz et al onderzochten de rol van NOD1 in de activatie van endotheelcellen na infectie door Chlamydia pneumoniae. De infectie leidt in endotheelcellen immers tot activatie van NF-κB. Deze transcriptiefactor zorgt voor een verhoogde expressie van cytokines, zoals IL-8, chemokines en adhesiemolecules. NOD1 gen silencing met behulp van siRNA blokkeerde de IL-8 productie. Hieruit blijkt dat NOD1 onmisbaar is voor de activatie van NF-κB. Daarnaast werd via testen met Rip2 -/- HEK293 cellen bewezen dat Rip2 betrokken is bij de signalisatie tussen NOD1 en NF-κB. (Opitz, 2005) Enkele jaren later volgde een ander onderzoek over Chlamydia pneumoniae, maar dan in macrofagen. Infectie van Rip2-/- muizen vertoonde een sterke vertraging in de afweer tegenover C. pneumoniae door macrofagen in de longen, waardoor een chronische infectie ontstond. Dit


17

is te wijten aan een verslechterde NO-productie en een uitgestelde rekrutering van neutrofielen. Zowel NOD1-/- als NOD2-/- muizen vertoonden een vertraagde afweer, wat aantoont dat beide receptoren de intracellulaire bacterie herkennen. (Shimada, 2009) Buchholz en Stephens onderzochten dan weer hoe de endogene IL-8 respons in epitheelcellen tot stand komt na infectie met Chlamydia trachomatis. RNAi werd gebruikt voor de knockdown van zowel MyD88, de partner voor TLR signalisatie, en NOD1 en zijn partner Rip2. Daaruit bleek dat de IL-8 respons in een vroeg stadium van de infectie onafhankelijk is van TLR’s, maar afhankelijk is van NOD1/Rip2. (Buchholz, 2008) Al eerder werd aangetoond dat de activatie van NF-κB en de secretie van pro-inflammatoire cytokines na in vitro infectie met Chlamydia trachomatis of Chlamydia muridarum tot stand komen door stimulatie van NOD1. Deze resultaten suggereren dat beide Gram-negatieven op zijn minst het minimale motief van peptidoglycaan, wat herkend wordt door NOD1, produceren. Verder onderzoek wees uit dat het genoom van Chlamydia alle enzymen nodig voor peptidoglycaansynthese effectief codeert. (Welter-Stahl, 2006)

2.5.2

NALP3

NALP staat voor de drie domeinen die aanwezig zijn in het eiwit: NACHT, LRR en PYD. PYD is het aminoterminaal domein, NACHT is een nucleotide-bindend en oligomerisatie domein en LRR zijn leucine-rich-repeats. NALP3 behoort, zoals de andere NALP’s tot de familie van de NOD-like receptoren. (Meylan, 2006) NALP3, ook gekend als NLRP3, komt vooral voor in macrofagen en leukocyten in perifeer bloed. Het eiwit herkent bacterieel mRNA en extracellulair ATP. Na activatie vormt het NALP3 een inflammasoom samen met het adaptoreiwit ASC, Cardinal en Caspase-1. Dit leidt dan weer tot de activatie van Caspase-1 dat daardoor in staat wordt om immatuur pro-IL-1β om te zetten naar matuur IL-1β, een proinflammatoir cytokine. Het pro-IL-1β wordt in de cel pas aangemaakt na TLR-signalisatie. Er is dus een dubbel signaal nodig om tot matuur IL-1β te komen: één via een TLR en een ander signaal via het inflammasoom. (Lee, 2007) Enkele wetenschappers onderzochten het belang van NALP3 voor de afweer tegen verschillende Chlamydia species. De activatie van twee verschillende pathways is nodig in rustende macrofagen om te komen tot de productie van matuur IL-1β na infectie met C. pneumoniae. Het eerste signaal verloopt via TLR2 en NF–κB. Dit signaal leidt tot de inductie van pro-IL-1β. Acitvatie van het NLRP3/ASC inflammasoom is dan weer essentieel om Caspase-1 te activeren, dat op zijn beurt het pro-IL-1β omzet tot matuur IL-1β. Dit gebeurt allemaal relatief vroeg in de ontwikkelingscyclus van C. pneumoniae, voor de RB-vermenigvuldiging. Ook bleek dat zowel LPS als ATP nodig zijn voor de ge¨ınduceerde IL-1β secretie. Hoe het inflammasoom wordt


18

aangeschakeld is nog niet gekend, maar het lijkt dat K+ -efflux, lysosomale verzuring en het loslaten van cathepsine B noodzakelijk zijn. Productie van radicale zuurstofspecies (ROS) zou dan weer niet van belang zijn. Het onderzoek suggereert dat het IL-1β belangrijk is voor het behoud van de weefselstructuur in de longen gedurende het weefselherstel volgend op acute longontsteking. (He, 2010) Een jaar later bevestigde een gelijkaardig onderzoek bovenstaande resultaten. Shimada et al kwamen ook tot de conclusie dat C. pneumoniae infectie van macrofagen IL-1β secretie induceert via het NLRP3/ASC inflammasoom. In tegenstelling tot de vaststelling van He et al leek cathepsine B waarschijnlijk geen rol te spelen in de activatie van het inflammasoom. Wat wel belangrijk is bij de activatie van het inflammasoom zijn intrede van de bacterie en de novo prote¨ınesynthese door de bacterie. (Shimada, 2011) Niet enkel in macrofagen, maar ook in cervicale epitheelcellen speelt NLRP3 een rol bij de activatie van Caspase-1. Dit bleek uit onderzoek met C. trachomatis in HeLa-cellen. De resultaten suggereren dat productie van ROS zorgt voor de NLRP3 gemedieerde activatie van Caspase-1. Dit ROS wordt dan weer tot stand gebracht door K+ -efflux die afhankelijk is van de secretie van bacteriële prote¨ınes via het type III secretie systeem van C. trachomatis. (Abdul-Sater, 2009) In 2009 was er een gelijkaardig onderzoek met de muisvariant Chlamydia muridarum. Ook bij deze infectie bleek de productie van IL-1β door macrofagen belangrijk te zijn bij het opruimen van de bacterie en het tot stand komen van het ziektebeeld in de oviduct. Prestimulatie van de macrofagen met LPS verhoogde de secretie van het cytokine. Bovendien was de secretie van IL-1β afhankelijk van Caspase-1, K+ -efflux, maar ook van de activiteit van serineproteases. De onderzoekers kwamen bovendien tot de conclusie dat levende bacteriën, maar niet groei van de bacteriën, noodzakelijk is voor cytokine secretie door de macrofagen. (Prantner, 2009)

2.5.3

TLR3

Toll-like receptor 3 herkent typisch viraal dsRNA en zijn synthetisch analoog poly(I:C). Deze PRR bevindt zich meestal intracellulair in het endosoom, maar werd ook al teruggevonden op het oppervlak van de cel. Ze komt voornamelijk voor op volgende celtypen: dendritische cellen, muismacrofagen en epitheel- en endotheelcellen. De signalisatie bij deze receptor verloopt op een MyD88-onafhankelijk manier. De gebruikte adaptormolecule wordt TRIF genoemd. De TRIF-pathway leidt via dimerisatie van de transcriptiefactor IRF3 tot expressie van IFN-β. (Lee, 2007) De conclusies rond IFN-β secretie door epitheelcellen van de muisoviduct na infectie met C. muridarum kwamen in twee stappen. In 2007 bewezen Derbigny et al dat de secretie van IFN-β afhankelijke was van de vermenigvuldiging van C. muridarum en dat IRF3 en


19

TRIF absoluut noodzakelijk zijn. Er bleven nog twee mogelijke PRR-kandidaten over na het onderzoek: TLR3 en een ongekende TRIF-afhankelijke PRR. Er werd gedacht dat TLR3 onwaarschijnlijk was als trigger, omdat C. muridarum geen structureel dsRNA bevat en het ook niet aanmaakt als intermediair tijdens de vermenigvuldiging. (Derbigny, 2007) De oplossing volgde in 2010. Met behulp van siRNA, dominant-negatieve TLR3 mutanten en TLR3 deficiënte oviductepitheelcellen werd aangetoond dat de IFN-β-productie wel degelijk afhankelijk is van TLR3. Er moet dus een andere ligand bestaan voor TLR3 naast dsRNA. Bovendien werd bewezen dat TLR3-signalisatie in macrofagen ge¨ınfecteerd met C. muridarum niet nodig is voor IFN-β productie. Dit duidt erop dat de geactiveerde pathway afhangt van het ge¨ınfecteerde celtype. (Derbigny, 2010)

2.5.4

TLR9

Deze receptor is net zoals TLR3 een endosomale PRR. TLR9 staat in voor de herkenning van bacteriële en virale ongemethyleerde CpG motieven in DNA. De receptor is aanwezig in plasmato¨ıde dendritische cellen, NK-cellen, eosinofielen in neutrofielen. TLR9 kan drie MyD88afhankelijke pathways activeren. Een eerste pathway leidt via fosforylatie en dimerisatie van de transcriptiefactor IRF7 tot expressie van IFN-α. Daarnaast zijn er nog twee verschillende wegen die de secretie van pro-inflammatoire cytokines veroorzaken. De eerste verloopt via MyD88-TRAF6-IRF5, de tweede via MyD88-TRAF6-TAK1-MAPK/IKK-AP1/NF-κB. (Lee, 2007) De rol van TLR9 in de afweer van Chlamydia-infecties is nog vrij onbekend. De PRR kwam enkel naar boven in een onderzoek in verband met dendritische cellen die de allergische respons moduleren tijdens Chlamydia-infecties. Na¨ıeve CD4+ T-cellen werden in vitro samengebracht met DC’s die net waren ge¨ısoleerd uit muizen ge¨ınfecteerd met Chlamydia. Dit veroorzaakte een significant hoger niveau van TLR9-mRNA in de dendritische cellen. (Han, 2004) Eerder bleek al dat CpG, wat herkend wordt door TLR9, de novo en gevestigde allergische reacties in dierlijke en humane modellen kan inhiberen. (Bohle, 2002; Jain, 2002; Krieg, 2002) Er wordt dan ook gespeculeerd dat chlamydiale infectie, via modulatie van TLR-expressie, de functie van DC’s kan veranderen. Deze veranderde functie resulteert in een afname van de allergeenspecifieke Th2-respons en een toegenomen Th1-cel ontwikkeling. (Han, 2004)

2.5.5

MBL

Mannose-bindend lectine (MBL) is een humaan collectine. Het is een belangrijk eiwit van het aangeboren humoraal immuunsysteem en maakt deel uit van de primaire defensielijn. Mannose-bindend lectine wordt tijdens de acute fase respons gesecreteerd door hepatocyten. MBL heeft meerdere carbohydraat-herkenningsdomeinen en kan daarmee binden op suikergroepen op het oppervlak van een groot gamma micro-organismen. (Dommett, 2006) Voorbeelden van dergelijke suikergroepen zijn het lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën


20

en lipoteicho¨ınezuur van Gram-positieve bacteriën. (Lee, 2007) MBL is niet alleen in staat om bepaalde micro-organismen te opsoniseren, maar het kan ook het complementsysteem activeren. (Dommett, 2006) MBL inhibeert in vitro de infectie van HeLa-cellen door C. trachomatis, C. pneumoniae en C. psittaci. MBL bindt namelijk aan het glycoprote¨ıne MOMP op het oppervlak van de EB’s en verhindert zo de vasthechting van de EB’s aan gastheercellen, waardoor infectie onmogelijk wordt. (Swanson, 1998) Daarnaast is ook een verband ontdekt tussen Chlamydia pneumoniae, MBL en coronary artery disease (CAD). Na testen op 210 CAD-patiënten en 257 gezonde personen bleek dat de infectie met C. pneumoniae leidt tot de ontwikkeling en progressie van ernstige CAD in patiënten die een genetisch variatie hebben in het MBL-gen. (Rugonfalvi-Kiss, 2002)

Hoofdstuk 3

Materialen en methoden 3.1 3.1.1

Stockproductie van C. psittaci CP3 Gebruikte oplossingen en media

Gebruikte oplossingen • L-glutamine oplossing: de L-glutamine oplossing (Gibco, Invitrogen, 25030-024) werd verdeeld over tien falcons van 10 ml. Daarna werd de oplossing voor gebruik bewaard bij -20°C. • Vitamine oplossing: de vitamine oplossing (Gibco, Invitrogen, 11120-037) werd verdeeld over tien falcons van 10 ml. Daarna werd de oplossing voor gebruik bewaard bij -20°C. • Hitte ge¨ınactiveerd foetaal kalf serum (H.I. FCS): eerst werd het bevroren FCS (Integro, 5-04710) ontdooid in een warmwaterbad bij 37°C. Daarna werd het hitte ge¨ınactiveerd door het FCS 30 minuten in een warmwaterbad van 56°C te plaatsen. Tot slot werd het FCS verdeeld in falcons van 50 ml en voor gebruik bewaard bij -20°C. • Vancomycine oplossing: eerst werd 500 mg vancomycine (GlaxoSmithKline, 9718313/1) afgewogen en opgelost in 100 ml BiDest. De oplossing werd vervolgens gesteriliseerd met een Millipore 220 nm filter. Tot slot werd de vancomycine oplossing verdeeld over tien falcons van 10 ml en voor gebruik bewaard bij -20°C. • Streptomycinesulfaat oplossing: eerst werd 1 g streptomycinesulfaat (Gibco, Invitrogen, 11860-038) afgewogen en opgelost in 100 ml Bidest. De oplossing werd vervolgens gesteriliseerd met een Millipore 220 nm filter. Tot slot werd de streptomycinesulfaat oplossing verdeeld over tien falcons van 10 ml en voor gebruik bewaard bij -20°C. • Trypsine-EDTA: de trypsine-EDTA oplossing (Gibco, Invitrogen, 25300-062) werd verdeeld in tien falcons van 10 ml. Daarna werd de oplossing voor gebruik bewaard bij -20°C. 21

Hoofdstuk 3. Materialen en methoden

22

• Steriel phosphate buffered saline (PBS): steriel Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (Sigma, D8537) werd gebruiksklaar aangekocht en bewaard bij 4°C. • Cycloheximide oplossing: eerst werd 500 mg cycloheximide (Sigma, C-7698) afgewogen. Het cycloheximide werd opgelost in 50 ml BiDest. De oplossing werd vervolgens gesteriliseerd met een 220 nm Millipore filter. De gesteriliseerde oplossing werd herverdeeld over 5 flessen van 100 ml; 10 ml per fles. Daarna werd elke fles aangelengd met 90 ml steriel PBS. De flessen werden afgesloten met tape en voor gebruik bewaard bij 4°C. • Fungizone oplossing: deze oplossing werd gebruiksklaar aangekocht (Gibco, Invitrogen, 15290-026). Het flesje werd bewaard bij -20°C. • 20 mM TrisHCl - 150 mM KCl: eerst werd 0.24 g Tris (Acros Organics, 77-86-1) opgelost in 85 ml BiDest, waarna de pH op 7.5 werd gezet met behulp van 0.1 M HCl. De oplossing werd met BiDest aangevuld tot een totaal volume van 100 ml. Op die manier werd 20 mM TrisHCl bekomen. In deze 100 ml 20 mM TrisHCl werd vervolgens 1.12 g KCl (Sigma-Aldrich, 12636-250G) opgelost. Deze oplossing werd vervolgens gesteriliseerd met een Millipore 220 nm filter. • Urografin-76 (Uro): deze gebruiksklare oplossing (Bayer, BE116182) heeft een concentratie van 76 volume % en werd bewaard bij kamertemperatuur. • Methanol: omdat de methanol (Acros Organics, 176840010) ijskoud moet zijn, werd ze bewaard in de diepvries bij -20°C. • Kleurreagens: Imagen Chlamydia-kit voor immunofluorescentie kleuring (Oxo¨ıd, K610112) • Niet steriel PBS: eerst werd 40.0 g NaCl (Acros Organics, 194090050), 1.0 g KCl (SigmaAldrich, 12636-250G), 7.2 g Na2 HPO4 (Fluka, 71640) en 1.2 g KH2 PO4 (Sigma-Aldrich, 60220-500G) afgewogen. Dit werd samen opgelost in 4.5 liter BiDest en de pH werd ingesteld op 7.4. Daarna werd met BiDest verder aangelengd tot een volume van 5 liter. Het PBS werd gealiquoteerd per liter, geautocleveerd en bewaard bij 4°C. Net voor gebruik werd het PBS 10 keer verdund met BiDest. • PBS + 5% H.I. FCS: voor de aanmaak van 100 ml PBS + 5% H.I. FCS werd 5 ml H.I. FCS toegevoegd aan 95 ml niet steriel PBS.


23

Gebruikte media • Minimaal essentieel medium (MEM) : 93.9 g poeder voor MEM (Gibco, Invitrogen, 11700-077) werd opgelost in 10 l Bidest. De pH werd gemeten en ingesteld op 4.1 tot 4.2 met behulp van 1 M HCl. De oplossing werd verdeeld over 10 flessen van 1 l en daarna voor exact 15 min geautoclaveerd bij 121°C. Na afkoelen tot op kamertemperatuur werden de flessen bewaard in de koelkast bij 4°C. • Incompleet minimaal essentieel medium (IMEM) : vlak voor gebruik werd aan 500 ml MEM 15 ml natriumbicarbonaat (Gibco, Invitrogen, 25080-060) toegevoegd. Hierdoor veranderde de kleur van geel naar rood. Het IMEM werd vervolgens bewaard in de koelkast bij 4°C en zo snel mogelijk opgebruikt. • Compleet minimaal essentieel medium (cMEM) : voor de bereiding van 500 ml cMEM werd aan 425 ml IMEM het volgende toegevoegd: 50 ml H.I. FCS (10%), 5 ml Lglutamine oplossing (1%), 5 ml vitamine oplossing (1%), 5 ml streptomycine oplossing (1%) en 10 ml vancomycine oplossing (2%). • Incompleet Chlamydia cultuur medium (ICKM): eerst werd 2.75 g glucose (Gibco, Invitrogen, 15023-021) afgewogen en opgelost in 500 ml MEM. Deze oplossing werd gesteriliseerd met een 220 nm Millipore filter en vervolgens herverdeeld over 5 flessen van 100 ml. Het ICKM werd voor gebruik bewaard bij 4°C. • Compleet Chlamydia cultuur medium (cCKM): voor de bereiding van 500 ml steriel cCKM werd aan 448.4 ml ICKM het volgende toegevoegd: 25 ml H.I. FCS (5%), 5 ml L-glutamine oplossing (1%), 5 ml vitamine oplossing (1%), 10 ml vancomycine oplossing (2%), 5 ml streptomycinesulfaat oplossing (1%), 1.1 ml cycloheximide oplossing (0.22%) en 0.5 ml fungizone oplossing (0.1%). • Sucrose fosfaat glutamaat (SPG): voor het maken van 1 l SPG werd 74.6 g sucrose (Sigma, 84097-1KG), 5.1 g KH2 PO4 (Sigma-Aldrich, 60220), 1.2 g K2 HPO4 (Sigma, 60353-250G) en 0.9 g L-glutaminezuurmonokaliumzout (Sigma, G-1501) afgewogen. Daarna werd alles opgelost in 1000 ml BiDest. De pH werd ingesteld op 7.0. De oplossing werd vervolgens gefiltreerd over een 220 nm autoclaveerbare topfilter. Het SPG werd verdeeld in flessen van 500 ml en werd bewaard bij -20°C. Na opening werd het bewaard bij 4°C. • SPG + antibiotica (SPG + AB): voor de aanmaak van 2 ml SPG + AB werd aan 1.938 ml SPG het volgende toegevoegd: 20 µl streptomycinesulfaat oplossing (1%), 40 µl vancomycine oplossing (2%) en 2 µl fungizone oplossing (0.1%).


3.1.2

24

In cultuur brengen en splitsen van Buffalo Green Monkey (BGM) cellen

De eerste stap in de stockproductie van C. psittaci CP3 is het bekomen van voldoende BGMcellen. Daarvoor werd gestart met een continue cultuur die voorhanden was in het labo. In een volgende stap werden deze cellen gebruikt om de vermenigvuldiging van C. psittaci mogelijk te maken. Op die manier konden voldoende bacteriën bekomen worden om een inoculatie-experiment op te zetten. Protocol voor het 1/3 splitsen van BGM-cellen De BGM-cellen werden dagelijks ge¨ınspecteerd onder de microscoop en werden om de twee dagen gesplitst. Na twee dagen waren de cellen telkens mooi gegroeid tot een dichte monolaag. Eerst werden alle gebruiksoplossingen bij 37°C in het warmwaterbad geplaatst, met daarbij ook de te gebruiken hoeveelheid cMEM. Per nieuw geplante fles van 75 cm2 was 20 ml cMEM nodig. Aangezien er 1/3 gesplitst werd, werd elke fles van 20 ml gesplitst naar drie flessen en was er dus 60 ml cMEM nodig per oorspronkelijke fles. Met een steriele pasteurpipet werd het weefselkweekmedium afgezogen uit de weefselkweekfles. Vervolgens werd 20 ml steriel PBS (37°C) op de cellen gebracht om deze te wassen. De fles werd 5 tot 10 min horizontaal geplaatst bij 37°C om de wasstap te voltooien. Na het wassen werd het PBS terug afgezogen met een steriele pasteurpipet. De volgende stap was het trypsineren van de cellen om deze los te maken van de wand van de fles en van elkaar. Dit gebeurde door 2 ml trypsine-EDTA toe te voegen per fles van 75 cm2 , waarna de fles maximum 5 minuten horizontaal werd geplaatst bij 37°C. Na enkele minuten werd de weefselkweekfles uit de incubator genomen. De fles werd verticaal gehouden en er werd zijdelings op geklopt, waardoor de cellen naar beneden gleden. Om de werking van het trypsine te stoppen, zodat de cellen niet beschadigd werden, werd daarna zo snel mogelijk 2 ml H.I. FCS toegevoegd aan het trypsine-EDTA waar de cellen in gesuspendeerd waren. Deze celsuspensie werd dan overgebracht in een 10 ml falcon om 10 min te centrifugeren aan 200xg (1000 RPM) bij kamertemperatuur (18°C). De centrifugatie zorgde ervoor dat de cellen een pellet vormden onderin de falcon. Het supernatans werd afgezogen met een steriele pasteurpipet, om vervolgens de pellet te resuspenderen in 6 ml cMEM. In elk van de drie nieuwe weefselkweekflessen werd 18 ml cMEM gebracht en daarna werd per fles 2 ml van de bekomen celsuspensie toegevoegd. Wanneer de cellen geplant moesten worden in containertjes, werd de pellet opgelost in 60 ml en werd in elk containtertje 1 ml van deze celsuspensie gebracht.


3.1.3

25

C. psittaci CP3 stockproductie in BGM-cellen

Protocol voor C. psittaci stockproductie in BGM-cellen De eerste stap was het afzuigen van het weefselkweekmedium van de 24 uur oude celcultuur uit een weefselkweekfles van 50 ml met behulp van een steriele pasteurpipet. Daarna werd 200 µl CP3 inoculum (109 kiemen/ml) toegevoegd aan 30 ml PBS. Per fles van 50 ml werd 5 ml van deze inoculatievloeistof op de cellen gebracht. Vervolgens werden de weefselkweekflessen met inoculatievloeistof 3 uur ge¨ıncubeerd op een kantelende tafel in de incubator bij 37°C. Hierbij werd gecontroleerd of het inoculum met de gehele monolaag in contact kwam tijdens het kantelen. Intussen werd het weefselkweekmedium van twee containertjes met een 24 uur oude monolaag BGM-cellen geaspireerd met een steriele pasteurpipet. Deze containertjes werden ook ge¨ınoculeerd met dezelfde inoculatievloeistof; 75 µl inoculatievloeistof per containertje. De containertjes werden vervolgens 1 uur gecentrifugeerd aan 2300 RPM bij 37°C. Na de incubatie werd er per fles van 50 ml 45 ml cCKM gebracht bij het reeds aanwezige inoculum. Per containertje werd 1 ml cCKM toegevoegd aan het inoculum. Tot slot werden de weefselkweekflessen en de twee containertjes in de incubator geplaatst bij 37°C en werd de cultuur elke dag geobserveerd onder de microscoop. 3 dagen na de inoculatie werden de containertjes gekleurd via een directe immunofluorescentie kleuring (zie sectie 3.1.6) als positieve controle voor de inoculatie.

3.1.4

C. psittaci CP3 (EB’s en RB’s) opzuivering

Protocol voor de C. psittaci opzuivering De opzuivering kon worden gestart, omdat de kleuring van de controlecontainertjes een positief resultaat gaf. In een eerste stap werd 50 ml SPG toegevoegd aan elke weefselkweekfles. De flessen werden daarna bij -80°C geplaatst tot de vloeistof volledig bevroren was. De inhoud van de flessen werd traag opnieuw ontdooid. Dit gebeurde door de flessen eerst wat open te draaien om te ontluchten. Vervolgens werden ze onder stromend koud water gehouden. De verdere ontdooiing vond plaats in het warmwaterbad van 37°C, waarbij af en toe geschud werd om de ontdooiing te bevorderen. Met een celschraper werden alle cellen naar de bodem van de fles geschraapt. Om de cellen te doen barsten werd vervolgens 1 minuut gesoniceerd bij 50 kC. De oplossing werd overgebracht in falcons van 50 ml en bewaard in de diepvries bij -80°C tot ultracentrifugatie. Na traag ontdooien werd het celdebris verwijderd door centrifugatie aan 3200 RPM voor 10 minuten bij 4°C. Op het supernatans van deze centrifugatie werd daarna een ultracentrifugatie uitgevoerd. Dit gebeurde aan 25000 RPM (45000xg) voor 45 minuten bij 4°C. De bekomen pellets werden geresuspendeerd in 1 ml SPG + AB en bewaard in een cryovial bij -80°C.


3.1.5

26

EB/RB opzuivering

Protocol voor de scheiding van EB en RB (EB/RB opzuivering) Eerst moest een discontinue gradiënt van Urografin worden aangemaakt. Hierbij werd gestart met een Urografin oplossing met een volumeprocent van 76. Van elk Uro-percentage werd 8 ml bereid, dit is genoeg om twee gradiënten aan te leggen. Voor het bereiden van de verschillende Uro-percentages werd tabel 3.1 gebruikt. Tabel 3.1: Uro-percentages voor de aanmaak van een discontinue gradiënt.

Gradiënt

Urografin-76 (ml)

TrisHCl-KCl (ml)

Totaal (ml)

60%

6.32

1.68

8

54%

5.68

2.32

8

44%

4.63

3.37

8

32%

3.78

5.22

8

Twee steriele gradiënt tubes werden gevuld met 2.65 ml Uro 60%, 2.65 ml Uro 54%, 2.65 ml Uro 44% en 2.65 ml Uro 32%. De laagjes werden druppel per druppel op elkaar aangebracht en na elke laag werd het niveau aangeduid met een streepje. Daarna werd 1 ml C. psittaci CP3 stock voorzichtig op de gradiënt gebracht. De gradiënt werd vervolgens geultracentrifugeerd gedurende 60 minuten aan 50000xg bij 4°C. Het resultaat hiervan wordt schematisch weergegeven in figuur 3.1.

Figuur 3.1: Eindresultaat na ultracentrifugatie voor EB/RB opzuivering.

Uit deze gradiëntbuis werden vervolgens de bandjes gecollecteerd. Eerst werd het bandje met EB’s afgezogen en overgebracht naar een steriele 60 ml ultracentrifugeerbuis. Hieraan werd SPG toegevoegd tot een totaal volume van 60 ml werd bekomen. Met het RB-bandje


27

werd dezelfde procedure uitgevoerd. Beide buizen werden daarna ge-ultracentrifugeerd aan 50000xg voor 45 minuten bij 4°C. Het SPG werd afgenomen en de pellets werden elk apart opgelost in 1 ml SPG + AB en bewaard bij -80°C in cryovials.

3.1.6

Titratie van de C. psittaci CP3 EB stock

In 65 containertjes werden BGM-cellen geplant. Hiervoor werd het protocol gebruikt voor het 1/3 splitsen van BGM-cellen (zie sectie 3.1.2). Inoculeren van de BGM-cellen Eerst werd de vial met EB-stock uit de -80°C gehaald en op ijs geplaatst. 20 geautoclaveerde epjes werden elk gevuld met 450 µl steriel PBS (zie sectie 3.1.1). Vervolgens werd een 1/10 verdunningsreeks aangemaakt van de EB-stock. Dit gebeurde door 50 µl EB-stock toe te voegen aan het epje met label 10−1 en dit daarna even op de vortex te plaatsen. Met een nieuwe pipettip werd 50 µl van het het 10−1 -epje overgepipetteerd in het 10−2 -epje en dit epje werd opnieuw gevortext. Zo werd verder gewerkt tot een verdunning van 10−20 werd bekomen. Wanneer een epje afgewerkt was, werd het net als de stock op ijs geplaatst. Van 65 containertjes met een 24 uur oude monolaag van BGM-cellen werd het medium geaspireeerd. De inoculatie van de containertjes gebeurde met 75 µl inoculumvloeistof volgens tabel 3.2. Tabel 3.2: Tabel met de gebruikte verdunningen en het aantal containertjes voor de titratie van de C. psittaci CP3 EB stock.

Verdunning 10−1 10−2 10−3

Aantal containertjes

Verdunning

Aantal containertjes

1

10−11

4

1

10−12

4 4

1

10−13

10−4

1

10−14

4

10−5

2

10−15

4

3

10−16

4

4

10−17

4

4

10−18

4

4

10−19

4

4

10−20

4

10−6 10−7 10−8 10−9 10−10

De containertjes werden 1 uur gecentrifugeerd aan 2300 RPM bij 37°C. Dit gaf de bacteriën de kans om zich goed aan de cellen vast te hechten. Na de centrifugatie werd de inoculumvloeistof terug afgenomen. Dit is nodig om een accurate titratie te kunnen uitvoeren. Niet vastgehechte bacteriën zouden immers de titratie onnauwkeurig maken. Op elk containertje werd daarna 1


28

ml cCKM (zie sectie 3.1.1) gebracht. Alle containertjes werden ge¨ıncubeerd voor 6 dagen in de incubator bij 37°C vooraleer de glaasjes gekleurd werden voor onderzoek onder de microscoop. Protocol voor directe immunofluorescentie kleuring van C. psittaci EB’s Eerst werd bij elk containertje de aanwezige laag BGM-cellen gefixeerd. Om dit te kunnen doen, werd eerst het medium geaspireerd. Op elk containertje werd vervolgens 1 ml ijskoude methanol gebracht. Daarna werden ze 10 minuten bij -20°C geplaatst. Na die 10 minuten werd het methanol afgezogen en werd in elk containertje 1 ml PBS + 5% H.I. FCS gebracht. De blokvloeistof werd 30 minuten in de containertjes gelaten bij kamertemperatuur (18°C). Intussen werd een 1/2 verdunning aangemaakt van het kleurreagens. Deze verdunning werd minstens 5 minuten bij kamertemperatuur geplaatst alvorens ze te gebruiken. Ook werd de vochtige kamer al bij 37°C geplaatst in de incubator. Na 30 minuten werd de blokvloeistof afgenomen en werd per container 25 µl verdund kleurreagens op het glaasje gebracht. De containertjes incubeerden 45 minuten in de vochtige kamer bij 37°C. Daarna startte het wassen. Eerst twee maal met 2 ml PBS voor 5 minuten. De containers werden vervolgens nog twee maal gewassen met 2 ml BiDest voor 30 seconden. Na de tweede maal wassen met BiDest werd het BiDest in de containertjes gelaten, omdat dit het eenvoudiger maakt om de dekglaasjes uit de containertjes te halen. De dekglaasjes, waarop de cellen aanwezig waren, werden met een pincet uit de containers verwijderd en het glaasje werd langs beide zijden afgedept op Torck papier. Vervolgens werden de glaasjes aan de lucht gedroogd met de cellen naar boven. De mounting vloeistof uit de Imagen-kit werd intussen uit de koelkast gehaald en 5 minuten bij kamertemperatuur gelegd alvorens ze te gebruiken. Op de draagglaasjes werden vervolgens twee druppeltjes mounting vloeistof aangebracht, één druppeltje links en eentje rechts. De dekglaasjes werden met de cellen naar beneden op de druppeltjes gelegd en vervolgens vastgezet met een klein beetje doorzichtige nagellak. De dekglaasjes werden in het donker bewaard bij 4°C tot aflezen. Titratie van C. psittaci EB’s De dekglaasjes werden onderzocht onder de microscoop (Olympus BX41, vergroting 600x). Ze werden belicht met een kwik-lamp (EXFO S-cite, series 120 Q). Het aantal positieve glaasjes per verdunning werd bepaald. Gebaseerd op deze waarnemingen werd de weefselcultuur infectiedosis (TCID) bepaald met formule 3.1.


Log10 (T CID50 ) = x0 −

met

29

Xr d +d∗ 2 n

(3.1)

   x0 = - log10 van de grootste verdunning waarbij alle dekglaasjes positief zijn     d = log van de verdunningsfactor 10

  n = aantal dekglaasjes per verdunning - het aantal niet-afleesbare dekglaasjes     r = het aantal positieve dekglaasjes per verdunning startend van de verdunningen onder x0

3.2

Experiment voor staalname

3.2.1

Gebruikte oplossingen en media

Gebruikte oplossingen Volgende gebruikte oplossingen werden reeds omschreven in sectie 3.1.1: H.I. FCS, vancomycine oplossing en streptomycinesulfaat oplossing. • Steriel glucose: voor de aanmaak van 150 ml steriel glucose werd 825 mg glucose (Gibco, 15023-021) opgelost in 150 ml PBS. Daarna werd de oplossing gefiltersteriliseerd met een Millipore 220 nm filter. Op die manier werd steriel glucose bekomen met een concentratie van 5.5 mg/ml. Gebruikte media • Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium met glutamax (Gibco, Invitrogen, 72400-021): dit steriel medium werd gebruiksklaar aangekocht. • Compleet RPMI (cRPMI): hiervoor werd 57.5 ml H.I. FCS (10%), 5.75 ml streptomycinesulfaat oplossing (1%) en 11.5 ml vancomycine oplossing (2%) toegevoegd aan 500 ml RPMI 1640 medium met glutamax. • Chlamydia THP1-medium: voor de aanmaak van 100 ml Chlamydia THP1-medium werd 2 ml van het steriel glucose bij 98 ml cRPMI gebracht.


3.2.2

30

In cultuur brengen, tellen en splitsen van THP1-cellen (humane monocytachtige cellen)

In cultuur brengen van THP1-cellen De vial uit het stikstofvat werd zo snel mogelijk ontdooid in het warmwaterbad van 37°C. Daarna werd de inhoud van de vial toegevoegd aan 10 ml steriel RPMI 1640 medium met glutamax. Vervolgens werd dit 10 minuten gecentrifugeerd aan 300xg bij 18°C. Het medium werd daarna afgenomen met een steriele pasteurpipet en de pellet werd heropgelost in 20 ml cRPMI. De celsuspensie werd overgebracht naar een weefselkweekfles die met losgeschroefde dop werd ge¨ıncubeerd bij 37°C in de CO2 -incubator bij 5% CO2 . Tellen en 1/3 splitsen van THP1-cellen Aangezien THP1-cellen niet adherent zijn, werd de celsuspensie van de weefselkweekfles overgebracht in een falcon. Daarna volgde een centrifugatie van 10 minuten aan 300xg bij 18°C. Het medium werd afgenomen met een steriele pasteurpipet en de pellet werd heropgelost in 6 ml cRPMI. Van deze celsuspensie werd 10 µl genomen en in 90 µl trypaanblauw (0.4%, Sigma, T8154) gebracht. 10 µl hiervan werd in een Neubauer-telkamer gebracht en daarna werden de levende, niet-blauwe cellen geteld in een volume van 0.1 µl. Wanneer bleek dat er voldoende (20.106 in 75 cm2 ) cellen aanwezig waren, werden de cellen 1/3 gesplitst. Daarvoor werd 2 ml van de celsuspensie in elk van de drie nieuwe weefselkweekflessen (75 cm2 ) gebracht waarin reeds 18 ml cRPMI aanwezig was.

3.2.3

Opzet van het experiment voor staalname

THP1-cellen planten De celsuspensie van weefselkweekflessen van 20 ml werd overgebracht in falcons. De falcons werden daarna 10 minuten gecentrifugeerd aan 300xg bij 18°C. De pellets werden elk opgelost in 1 ml cRPMI en de cellen werden geteld. Vervolgens werden de cellen verdund in cRPMI tot een concentratie van 300 000 cellen per ml. 54 containertjes werden geplant met 1 ml van deze verdunning. Tenslotte werd aan elk containertje 50 ng/ml phorbol-12-myristaat-13acetaat (PMA) oplossing toegevoegd. Deze PMA-oplossing werd bekomen door 1 mg PMA op te lossen in 2 ml dimethylsulfoxide (DMSO, Acros Organics, 67-68-5). De oplossing werd daarna gesoniceerd gedurende 60 seconden. Vervolgens werd de oplossing overgepipetteerd in 18 ml RPMI zodat een concentratie werd bekomen van 50 µg/ml. De PMA-oplossing werd vervolgens uitverdeeld in epjes en bewaard bij -20°C. Het PMA zorgde ervoor dat de THP1-cellen gingen differentiëren naar macrofagen en zich vasthechtten op het glaasje.


31

Infectie van de THP1-cellen met de C. psittaci CP3 EB stock Van elk van de 54 containertjes werd het medium afgezogen met een steriele pasteurpipet. De C. psittaci CP3 EB stock werd verdund in steriel PBS tot een eindconcentratie werd bekomen van 300 000 bacteriën per 100 µl. De helft van de containers werd daarna ge¨ınoculeerd met 100 µl verdunde stock, op die manier werd een MOI van 1 bekomen. Op de andere helft, de containertjes voor negatieve controle, werd 100 µl steriel PBS gebracht. Vervolgens werden alle 54 containertjes 15 minuten gecentrifugeerd aan 2300 RPM bij 4°C. Na de centrifugatie werd in elk containertje 1 ml Chlamydia THP1-medium gebracht. Tot slot werden alle containertjes goed dichtgedraaid en in de incubator geplaatst bij 37°C.

3.2.4

Staalname

Na 2u, 4u, 8u, 12u, 18u, 24u, 36u, 48u en 72u werden drie verschillende stalen genomen, telkens van drie ge¨ınfecteerde en drie controle containertjes. Het eerste staal gebeurde met het oog op een ELISA voor humane cytokines. Het tweede staal werd genomen om later een infectiviteitstitratie uit te voeren. Voor dit tweede staal was SPG nodig, de aanmaak hiervan werd reeds beschreven in sectie 3.1.1. Op het laatste staal werd later een RNA-extractie uitgevoerd. • ELISA: 800 µl van de vloeistof aanwezig in het containertje werd overgebracht naar een steriel epje. De epjes werden bewaard bij -80°C. • Infectiviteitstitratie: 200 µl van de vloeistof aanwezig in het containertje werd overgebracht naar een steriel epje. Daarbij werd een gelijke hoeveelheid SPG gevoegd. De epjes werden bewaard bij -80°C. • RNA-extractie: op het dekglaasje in het lege containertje werd 1000 µl TRIzol Reagent (Gibco, Invitrogen 15596-026) gebracht. Na een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur werd het lysaat 10 maal stevig door een pipettip geduwd met een micropipet. Het lysaat werd nog 10 minuten op ijs gezet alvorens het te bewaren bij -80°C.


3.3

32

ELISA voor humane cytokines

Voor de analyse van humane cytokines werd een Multi-Analyte ELISArray Kit gebruikt van SABiosciences. Deze kit werd ontwikkeld voor het simultaan meten van de volgende inflammatoire cytokines: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17α, IFN-γ, TNF-α en GM-CSF. De ELISArray werkt volgens het principe van de sandwich ELISA. De ELISA werd uitgevoerd voor de ELISA-stalen van 12u, 18u, 24u, 36u, 48u en 72u en dit voor twee van de drie infecties.

3.3.1

Overzicht protocol

De Multi-Analyte ELISArray Kit gebruikt een standaard ELISA-techniek. De 96-well plaat was gecoat met de twaalf specifieke antilichamen. Incubatie zorgde ervoor dat deze antilichamen konden binden met het specifieke doeleiwit. Vervolgens werden via verschillende wasstappen de ongebonden prote¨ınen weggespoeld. In een volgende stap werden de gebiotinyleerde detectie-antilichamen toegevoegd aan de welletjes. Er werd opnieuw gewassen om de ongebonden detectie-antilichamen te verwijderen. Daarna werd het avidine-horseradish peroxidase conjugaat toegevoegd. Er werd opnieuw gewassen waarna de colorimetrische substraatoplossing werd toegevoegd. Dit gaf een blauwe kleur die direct in proportie was met de hoeveelheid aanwezig cytokine in het staal. De kleurontwikkeling werd gestopt met behulp van een stopoplossing. Tot slot werd de 450 nm absorbantie gemeten, werden de gegevens verwerkt en werden de waarden tussen de verschillende stalen vergeleken. De volledige User Manual is terug te vinden in bijlage B

3.3.2

Verwerking data

In een eerste stap werd nagegaan welke absorbantiewaarden kleiner waren dan het dubbel van de absorbantiewaarde voor de negatieve controle van dat cytokine op die plaat. Volgens het protocol zijn deze waardes niet betrouwbaar en mogen ze niet ge¨ınterpreteerd worden. De concentraties voor deze waarden werden dan ook niet verder verwerkt. Alle absorbantie-waarden tussen 0.00 en 2.50 liggen binnen het lineaire bereik van de analyse. Alle metingen gaven een waarde kleiner dan 2.50 wat betekent dat de lineariteit tussen cytokineconcentratie in ng/ml en absorbantie kon gebruikt worden voor het verwerken van de data. Daarom werd voor elk cytokine op elke plaat een standaardcurve gemaakt. Voor deze curves werden twee data punten gebruikt. Ten eerste de absorbantiewaarde van de negatieve controle, die een concentratie van 0 ng/ml werd toegekend. Het tweede punt werd bepaald via de absorbantiewaarde van de positieve controle met als concentratie 1 ng/ml. Deze laatste concentratie werd berekend aan de hand van de startconcentratie van de antigenen in de Standard Cocktail (1 µg/ml) en de verdunningen die vervolgens gemaakt werden van deze


33

standaard oplossing. Met behulp van de standaardcurven werden daarna de concentraties van de cytokines bepaald in ng/ml.

3.4 3.4.1

Infectiviteitstitratie BGM-cellen planten en inoculeren

In 216 containertjes werden BGM-cellen geplant. Hiervoor werd het protocol gebruikt voor het 1/3 splitsen van BGM-cellen (zie sectie 3.1.2). Na 24 uur werden de cellen ge¨ınoculeerd met de stalen genomen voor infectiviteitstitratie. Eerst werden de epjes met de stalen voor infectiviteitstitratie uit de -80°C gehaald en op ijs gezet. Daarna werden 108 steriele epjes gevuld met 180 µl steriel PBS. Van elk van de 18 stalen werd een 1/10-verdunningsreeks gemaakt. Dit gebeurde door eerste 20 µl van het staal in het eerste epje te brengen en dit te vortexen. Daarna werd uit dit eerste epje 20 µl genomen en in het tweede epje gebracht. Zo werd verder gewerkt tot een verdunning van 10−6 werd bekomen. Daarna werd het medium van de containertjes geaspireerd met een steriele pasteurpipet. Vervolgens werden met elke verdunning twee containertje ge¨ınoculeerd met 75 µl van de verdunning. De containertjes werden voor 1 uur gecentrifugeerd aan 2300 RPM bij 37°C. Daarna werd het inoculum afgenomen met een micropipet en werd in elk containtertje 1 ml cCKM (zie sectie 3.1.1) gebracht. Daarna werden de containertjes dichtgedraaid en voor zes dagen ge¨ıncubeerd in de incubator bij 37°C.

3.4.2

Directe immunofluorescentiekleuring

Zes dagen na de inoculatie werden de containertjes gefixeerd en vervolgens gekleurd volgens het protocol in sectie 3.1.6. Van elk glaasje werd genoteerd of er EB’s aanwezig waren of niet.

3.4.3

Data-analyse

Voor elk tijdstip werd per infectie de log10 (TCID50 ) berekend met behulp van vergelijking 3.1. Dit leverde per tijdstip drie logaritmische waarden op. Voor de statistische data-analyse werd dus gewerkt met 7 populaties: 0u, 12u, 18u, 24u, 36u, 48u en 72u. Waarbij elke populatie bestond uit de drie logaritmische waarden. Aangezien drie waarden onvoldoende zijn om op een correcte manier te bepalen of de populaties normaal verdeeld zijn, werd gewerkt met nietparametrische testen. De testen werden uitgevoerd met het Graphpad Prism programma. In de eerste plaats werd een Dunn’s Multiple Comparison test uitgevoerd die alle gemiddelden twee aan twee vergelijkt met elkaar. In tweede instantie werden alle populatiegemiddelden twee aan twee vergeleken met behulp van een Mann Whitney test.


3.5 3.5.1

34

Real Time PCR RNA-extractie en bepalen van de RNA-concentratie

De 54 stalen die genomen werden voor RNA-extractie, werden uit de -80°C gehaald en op ijs geplaatst. Na het ontdooien werden de stalen gedurende vijf minuten gevortext bij kamertemperatuur, totdat de pellet volledig weg was. Tijdens het vervolg van het protocol werd RNAse vrij gewerkt. De volgende stap is de fasescheiding. In de trekkast werd 200 µl chloroform (Roth, 3313.1) toegevoegd aan de stalen, waarna de epjes voor 15 seconden lichtjes werden bewogen. De epjes werden daarna twee tot drie minuten bij KT geplaatst. Vervolgens werden ze gecentrifugeerd voor 15 minuten aan 13500 RPM bij 4°C. Hierdoor waren in de epjes drie fasen te zien: onderaan (rood) het chloroform, de witte interfase met DNA en bovenaan de waterige fase die het RNA bevatte. RNAse vrije epjes werden gevuld met 500 µl isopropanol (Roth, 6752.3). De bovenste waterige fase werd voorzichtig afgenomen en in de epjes met isopropanol gebracht. De epjes werden zachtjes ge¨ınverteerd en daarna tien minuten ge¨ıncubeerd bij KT. Daarna volgde een centrifugatie van tien minuten aan 13500 RPM bij 4°C. Er werd goed gelet op de plaatsing van de epjes in de centrifuge, omdat de pellet niet altijd goed zichtbaar was. Na de centrifugatie werd het RNA nog gewassen. Het supernatans werd voorzichtig afgenomen aan de tegenovergestelde zijde van de pellet. Daarna werd het RNA gewassen met 1 ml 75% ethanol (0.75 ml ethanol (Roth, 9065.3) + 0.25 ml DEPC water (Sigma, 95284-1L)), waarbij goed op en neer werd gepipetteerd. Dan volgde opnieuw een centrifugatie: vijf minuten, 7500 RPM, 4°C. Opnieuw werd het supernatans voorzichtig afgenomen zonder de pellet op te zuigen. Als laatste werd de RNA-pellet opgelost in 10 µl DEPC water. Daarna werd de RNA-concentratie van de 54 stalen bepaald met behulp van een Nanodrop toestel (Thermo Scientific). Hierbij werd eerst het achtergrond signaal bepaald door een blankmeting uit te voeren met DEPC water. Dit gebeurde door 2 µl DEPC water aan te brengen op het ’naaldje’ van de nanodrop. Daarna werd dit druppeltje verwijderd met een absorberend papiertje. Vervolgens werd elk staal gemeten door 2 µl van het staal aan te brengen op het toestel. Tussen elke meting werd het ’naaldje’ afgeveegd met een doekje.

3.5.2

cDNA synthese

Eerst werd X µl RNA (1 µg) en (12-X) µl DEPC water in een eppendorfje gebracht en op ijs geplaatst. Om secundaire structuren in het RNA te verwijderen werd het RNA vijf minuten bij 70°C geplaatst en daarna direct terug op ijs. Vervolgens werd de Mastermix (Thermo scientific, Verso cDNA Kit, AB-1453/C) gemaakt. Iedere reactie bestaat uit 4 µl 5x cDNA synthesis buffer, 2 µl dNTP mix, 1 µl Oligo dT, 1 µl Verso enzyme Mix en 1 µl RT Enhacer. 8.2 µl van deze Mastermix werd toegevoegd aan ieder eppendorfje en de eppendorfjes werden telkens terug op ijs geplaatst. De eppendorfjes werden in het PCR-toestel gezet en hierbij


35

werd nagekeken of ze goed gesloten waren. Het PCR-toestel voerde volgend programma uit: 1 uur op 47°C (reverse elongatie) gevolgd door 2 minuten op 95°C (inactivatie). Na het programma werd het cDNA overgebracht in een nieuw epje van 1.5 ml en 1/20 verdund door toevoeging van 380 µl DEPC water. Daarna werd het cDNA bewaard bij -80°C.

3.5.3

Testen van de primers

Infectie van THP1-cellen met LPS In een eerste stap werden 1 500 000 THP1-cellen geplant in een weefselkweekflesje van 5 ml. Hiervoor werd gewerkt zoals beschreven in sectie 3.2.3. Na 24 uur werden deze cellen ge¨ınfecteerd met LPS opgezuiverd uit E. coli E11.B4. Van deze eiwit-oplossing (1 mg/ml) werd 200 µl rechtstreeks in het celmedium gebracht. 4 uur later werd het supernatans afgenomen en werden de cellen gelyseerd met 1550 µl Trizol Reagent. Dit werd voor 5 minuten ge¨ıncubeerd bij kamertemperatuur, waarna het lysaat 10 maal stevig door een pipet werd geduwd. Het lysaat werd vervolgens 10 minuten op ijs gezet om daarna verder te gaan met een RNA-extractie gevolgd door cDNA-synthese zoals beschreven in secties 3.5.1 en 3.5.2 respectievelijk. PCR voor het testen van de primers Aanmaak kloonanalysebuffer Hiervoor werd eerst een kloonanalysebuffer stockoplossing gemaakt met een pH van 8.3. Voor deze stockoplossing werd 3.75 g KCl (50 mM), 2.42 g Tris (20 mM) en 0.41 g MgCl2 (2 mM, Fractopur, 1.16102.0250) opgelost in 950 ml BiDest. Hieraan werd vervolgends 1 ml Tween 20 (VWR, 28 829.183) toegevoegd. De pH werd ingesteld op 8.3 en de stockoplossing werd bewaard bij 4°C. Voor het aanmaken van de eigenlijke kloonanalysebuffer (KAB) werd aan 9.920 ml stockoplossing 20 µl toegevoegd van elk dNTP (Invitrogen, 10297-018), waardoor de eindconcentratie van elk dNTP 200 µM bedroeg. In een volgende stap werd hieraan 600 µl (6 %) MilliQ toegevoegd. De KAB werd verdeeld in epjes. In elk epje werd 250 µl KAB gebracht, genoeg voor analyse van 5 stalen. PCR De primers werden opgezocht in de literatuur en besteld bij Invitrogen. De sequenties van de primers worden weergegeven in tabel 3.3. Eerst werden de primers opgelost tot een concentratie van 200 µM in de gepaste hoeveelheid MilliQ. Daarna werd de Mastermix aangemaakt in het pre-PCR-lokaal, waarbij op ijs werd gewerkt. Voor elk primerpaar werd aan een epje KAB (250 µl) het volgende toegevoegd: 0.5 µl SuperTaq-buffer (HT, TP05b), 0.5 µl SuperTaq-enzym (HT, TP05a), 1.5 µl FW-primer en 1.5 µl REV-primer. Vervolgens werd,


36

nog steeds in het pre-PCR-lokaal, 45 µl van elke Mastermix in een verschillend PCR-epje gebracht. Zo werd voor elk primerpaar een PCR-epje bekomen met 45 µl van de correcte Mastermix. Daarna werd in het PCR-lokaal 5 µl van het cDNA, dat werd bekomen na infectie van THP1-cellen met LPS, toegevoegd aan elk PCR-epje. Volgend PCR-programma werd doorlopen: preheating tot 95°C, 10 minuten bij 95°C, 45 cycli van 30 seconden 95°C, 30 seconden bij annealingstemperatuur en 30 seconden bij 72°C en tot slot na de cycli nog 5 minuten bij 72°C. Het PCR-product werd bewaard bij -20°C. Tabel 3.3: De sequenties van de gebruikte primers met de bijhorende annealingstemperatuur (AT) en referenties.

Primer

Sequentie van 5’ naar 3’

AT

Referentie

TLR1 FW TLR1 REV TLR2 FW TLR2 REV TLR3 FW TLR3 REV TLR4 FW TLR4 REV TLR6 FW TLR6 REV TLR9 FW TLR9 REV β-actine FW β-actine REV NLRP3 FW NLRP3 REV ASC FW ASC REV NOD1 FW NOD1 REV NOD2 FW NOD2 REV RIG I FW RIG I REV

CAG TGT CTG GTA CAC GCA TGG T TTT CAA AAA CCG TGT CTG TTA AGA GA GGC CAG CAA ATT ACC TGT GTG AGG CGG ACA TCC TGA ACC T CCA AGC CTT CAA CGA CTG AT TTC CAG AGC CGT GCT AAG TT TCC ATA AAA GCC GAA AGG TG CTG AGC AGG GTC TTC TTC AC GGA TAG CCA CTG CAA CAT CA TTG GTT TTC ACG GGT AGG TC GCT AGA CCT GTC CCG CAA TA ACA CTT GGC TGT GGA TGT TG TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G CTT CCT TTC CAG TTT GCT GC TCT CGC AGT CCA CTT CCT TT AGT TTC ACA CCA GCC TGG AA TTT TCA AGC TGG CTT TTC GT GTC ACT GAG GTC CAT CTG AAC CAT CCA CTC CTG GAA GAA CCT CAT GTG CTG CTA CGT GTT CTC CCT GCC ACA ATT GAA GAG GTG TGT TCT CAG ATG CCT TGG ATG CAC TGC TCA CCA GAT TGC AT

60°C 60°C 60°C 60°C 60°C 60°C 60°C 60°C 60°C 60°C 60°C 60°C 60°C 60°C 55°C 55°C 55°C 55°C 60°C 60°C 60°C 60°C 55°C 55°C

Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Tamaki, 2011 Abdul-Sater, 2009 Abdul-Sater, 2009 Abdul-Sater, 2009 Abdul-Sater, 2009 Tang, 2011 Tang, 2011 Tang, 2011 Tang, 2011 Conceicao, 2010 Conceicao, 2010


37

Agarosegel De PCR-producten werden gecontroleerd met behulp van een agarosegel. Hiervoor werd eerst een 1% agarosegel gegoten. Deze werd na stolling geladen met 12 µl oplossing, bestaande uit 2 µl loadingbuffer, 5 µl milliQ en 5 µl staal. Daarnaast werd ook een oplossing voor het bekomen van een ladder geladen. Daarna werd de gel gerund voor 35 min bij 100 V. Na ontwikkeling van de gel in een EtBr-bad werd een UV-foto genomen.

3.5.4

Opstellen van de standaardcurves

Voor het opstellen van de standaardcurves werd verder gewerkt met de PCR-producten bekomen bij het testen van de primers. Hiervoor werd eerst en vooral de DNA-concentratie bepaald van deze positieve controles met behulp van het Nanodrop toestel. Dit gebeurde volgens de procedures beschreven in sectie 3.5.1, maar dan voor DNA en met als blank MilliQ. Vervolgens werd met behulp van het moleculair gewicht van de voorspelde amplicons berekend hoeveel DNA-moleculen of kopijen per µl aanwezig waren in de positieve controles. Met behulp van dit gegeven kon dan een verdunning aangemaakt worden van de PCR-producten tot concentraties van 107 , 106 , 105 , 104 , 103 , 102 en 10 kopijen per µl. Met deze verdunningen werd vervolgens een Real Time PCR uitgevoerd. Hiervoor werd in de eerste plaats voor elk primerpaar een primerdilutie aangemaakt. Deze bestond telkens uit 786 µl DEPC water, 16 µl FW primer en 16 µl REV primer. Daarna werd de Mastermix voor de Real Time PCR aangemaakt. De Mastermix werd zo aangemaakt dat ze per reactie bestond uit 12.5 µl Sybr Green PCR Mastermix (Qiagen, 204074), 2 µl van de aangemaakte primerdilutie en 5.5 µl DEPC water. Vervolgens werd 20 µl van de Mastermix gebracht per epje. Daarna werd per epje 5 µl van de verdunningen gebracht. Hierbij werden telkens 2 epjes geladen met dezelfde verdunning. Daarna volgde het PCR-programma dat wordt beschreven in tabel 3.4. Tabel 3.4: Programma voor Real Time PCR.

hold

10 min bij 95°C

45 cycli

30 sec bij 95°C 30 sec bij annealingstemperatuur (AT) 30 sec bij 72°C (hier werd de fluorescentie gemeten)

melt

van 75°C naar 90°C stijgend met 0.3°C per stap: de eerste stap wordt aangehouden voor 50 sec, alle andere stappen voor 5 sec

3.5.5

Real Time PCR met stalen

In de eerste plaats werd voor elk primerpaar een primerdilutie aangemaakt. Deze bestond telkens uit 786 µl DEPC water, 16 µl FW primer en 16 µl REV primer. Daarna werd de


38

Mastermix voor de Real Time PCR aangemaakt. De Mastermix werd zo aangemaakt dat ze per reactie bestond uit 12.5 µl Sybr green PCR Mastermix, 2 µl van de aangemaakte primerdilutie en 5.5 µl DEPC water. Vervolgens werd 20 µl van de Mastermix gebracht per epje. Daarna werd per epje 5 µl staal gebracht. Met staal wordt hier het cDNA bedoeld dat werd bekomen na verwerking van de stalen genomen tijdens het experiment voor staalname. Hierbij werden zowel de drie ge¨ınfecteerd als de drie controlestalen gebruikt. Daarna volgde het PCR-programma dat wordt beschreven in tabel 3.4.

3.5.6

Verweking data en data-analyse

Het opstellen van de standaardcurves en de berekening van de concentraties in de stalen gebeurde met het programma Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2. Daarna werden alle concentratiedata geëxporteerd naar Excel voor verdere verwerking. De expressie van β-actine werd gebruikt als interne controle bij de relatieve kwantificatie van het RNA. Daarom werd eerst een correctiefactor opgesteld voor elk staal met behulp van de concentratie (het aantal kopijen per µl) van het β-actine amplicon in elk staal. Alle daaropvolgende verwerking en analyses werden uitgevoerd met de gecorrigeerde waarden en voor elk gen afzonderlijk. In een volgende stap werd voor elk tijdstip een gemiddelde berekend van de gecorrigeerde concentraties van de drie controlestalen. Dit gemiddelde werd daarna gebruikt voor het berekenen van de X fold upregulation voor de stalen genomen na infectie. Hiervoor werd elke gecorrigeerde concentratie van de infectiestalen gedeeld door het gemiddelde van de controlestalen voor dat tijdstip. Op die manier werden dus voor de infectiestalen drie upregulation waarden bekomen per tijdstip. Van deze waarden werd opnieuw een gemiddelde berekend en ook een standaarddeviatie. Om na te gaan of de opregulatie significant was, werden telkens de gemiddelden van twee populaties met elkaar vergeleken. Per tijdstip en per gen bestond populatie 1 telkens uit de drie gecorrigeerde concentratiewaarden van de drie controlestalen en populatie 2 uit de drie gecorrigeerde concentratiewaarden van de drie infectiestalen. De statistische test die hiervoor werd gebruikt, is de Mann Whitney test. Het gebruiken van een niet-parametrische test was noodzakelijk door het lage aantal waarden per populatie. Daarnaast werd de Mann Whitney test ook gebruikt om te verifiëren of de X fold upregulation significant stijgt en daalt in de tijd. Hierbij werden voor elk gen de X fold waarden tussen de verschillende tijdstippen vergeleken. De testen werden uitgevoerd met behulp van het Graphpad Prism programma.

Hoofdstuk 4

Resultaten 4.1

Titratie EB-stock CP3

Het aantal positieve glaasjes per verdunning is terug te vinden in bijlage C. Hieronder wordt de berekening weergegeven van de concentratie volgens formule 3.1.

Xr d +d∗ 2 n 3 1 = 10 − + 1 ∗ 2 4 = 10.25

Log10 (T CID50 ) = x0 −

T CID50 = 1010.25 ≈ 1010 Het resultaat van de EB-stock titratie is dus 1010 TCID50 /ml.

4.2

ELISA voor humane cytokines

De resultaten werden verwerkt zoals vermeld in sectie 3.3.2. Voor elk cytokine werd per tijdstip een gemiddelde en een standaardafwijking bepaald voor de ng/ml concentratie. Deze resultaten zijn weergegeven in bijlage D en worden nog eens extra grafisch ge¨ıllustreerd in figuren 4.1, 4.2 en 4.3. Zoals beschreven in materialen en methoden, werd tijdens de ELISA ook de concentraties bepaald voor IL-2, IL-4 en IL-17α. De resultaten voor deze cytokines hadden allemaal een waarde van 0 ng/ml en werden dan ook niet opgenomen in tabellen en figuren.

39

Hoofdstuk 4. Resultaten

40

Figuur 4.1: De gemiddelde cytokineconcentraties en hun bijhorende standaardafwijkingen in ng/ml. inf = stalen van ge¨ınfecteerde THP1-cellen, MOC = stalen van MOC-ge¨ınfecteerde THP1-cellen



41


Uit de waarden in de tabel en de figuren is duidelijk te zien dat slechts enkele van de geteste cytokines in voldoende mate werden opgereguleerd om gedetecteerd te worden door de ELISA. IL-1β vertoont een toename in concentratie over de tijd. Bovendien blijft de concentratie van IL-1β onder de detectiegrens voor alle MOC-infecties, behalve op het tijdstip 48u. IL-6 is enkel waar te nemen in kleine concentraties in het supernatans van de ge¨ınfecteerde cellen vanaf tijdstip 48u. IL-8 werd gedetecteerd in het supernatans van zowel ge¨ınfecteerde als nietge¨ınfecteerde THP1-cellen. De concentratie van IL-8 in het supernatans van de ge¨ınfecteerde cellen is steeds hoger dan deze voor de MOC-ge¨ınfecteerde cellen. Opnieuw is hier een afwijking waar te nemen op tijdstip 48u. De concentratie van TNF-α vertoont een mooie stijgende lijn van 2u tot 48u en na 48u een licht dalende trend. Deze trend doet zich opnieuw enkel voor bij de ge¨ınfecteerde cellen en niet bij de MOC-ge¨ınfecteerde cellen. Ook voor TNF-α wordt een onregelmatigheid vastgesteld op tijdstip 48u. Tot slot werd GM-CSF gedetecteerd in lage concentraties in het supernatans van de ge¨ınfecteerde cellen vanaf 36u. IL-1α, IL-10, IL-12 en IFN-γ werden niet geproduceerd door de THP1-cellen na infectie met C. psittaci CP3.


4.3

42

Infectiviteitstitratie

De resultaten voor het aflezen van de infectiviteitstitratie zijn terug te vinden in bijlage E. Voor elk tijdstip werd per infectie de log10 (TCID50 ) berekend met behulp van vergelijking 3.1. Dit leverde per tijdstip drie logaritmische waarden op. Telkens werd van deze drie waarden een gemiddelde en een standaardafwijking bepaald. Deze zijn terug te vinden in tabel 4.1 en worden grafisch ge¨ıllustreerd in figuur 4.4. Tabel 4.1: Gemiddelden en bijhorende standaardafwijkingen per tijdstip van de log10 (TCID50 ) berekend voor de infectiviteitstitratie.

Tijdstip

Gemiddelde

Standaardafwijking

0u 12u 18u 24u 36u 48u 72u

5.477 0.6667 1.500 3.000 3.333 4.167 4.000

0.0 0.7638 0.5000 0.0 0.5774 0.2887 0.5000

Figuur 4.4: Gemiddelden en bijhorende standaardafwijkingen per tijdstip van de log10 (TCID50 ) berekend voor de infectiviteitstitratie. De cijfers (1), (2) en (3) verwijzen naar de cijfers in tabel 4.2.


43

Op het tijdstip 0u werden 300 000 EB’s ge¨ınoculeerd in de THP1-cellen. De log10 van het aantal bacteriën, 5.48 is dan ook de waarde weergegeven op tijdstip 0u in figuur 4.4. De logaritmische waarden op de andere tijdstippen vertonen een stijgend verloop in de tijd met een stagnatie op 48u en 72u. In figuur 4.4 worden bovendien de significante verschillen aangeduid die naar voor kwamen tijdens de statistische analyse. Dit werd nagegaan met twee niet-parametrische testen: Dunn’s Multiple Comparison test en de paarsgewijze vergelijking via de Mann Withney testen. Enkel de significante verschillen worden weergegeven in tabel 4.2. Tabel 4.2: Significante verschillen voor de infectiviteitstitratie bepaald via verschillende nietparametrische testen.

(1) (2) (3)

4.4 4.4.1

gebruikte test

p-waarde

Dunn’s Multiple Comparison test: 0u vs 12u Dunn’s Multiple Comparison test: 0u vs 18u Mann Whitney test: 0u vs 24u

<0.05 <0.05 0.0469

Real Time PCR Testen van de primers

Figuur 4.5: UV-foto van de agarosegel voor de positieve controle van de primers. Van links naar rechts: ladder, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR9, β-actine, ASC, NLRP3 en RIG-1.


44

Met behulp van de UV-foto’s van de agarosegel kon bepaald worden of de primers specifiek waren. Uit de gel op figuur 4.5 kan vermoed worden dat de primers voor TLR5 specifiek zijn, maar bij het opstellen van de standaardcurve bij Real Time PCR bleek dat de smeltcurve verschillende pieken vertoonde. Er werden dan ook geen verdere analyses uitgevoerd voor TLR5. Op de gel is duidelijk te zien dat het eerste gebruikte primerpaar voor RIG-1 niet specifiek genoeg is. Er zijn namelijk verschillende PCR-producten te zien in dit laantje van de gel. Daarom werd besloten om eerst een ander primerpaar te testen. Het resultaat van dit nieuwe primerpaar voor RIG-1, het paar dat vermeld staat in tabel 3.3, is te zien op figuur 4.6 in het vierde laantje. Hier zijn twee mooie bandjes te zien. Het bovenste en zwaarste bandje is het amplicon en het onderste bandje zijn de primers. Dit primerpaar produceert dus maar één amplicon en kan dus als specifiek genoeg gezien worden om mee verder te werken.

Figuur 4.6: UV-foto van de agarosegel voor de positieve controle van de primers. Van links naar rechts: ladder, NOD1, NOD2 en RIG1.

Figuur 4.7: UV-foto van de agarosegel voor de positieve controle van de primers. Van links naar rechts: ladder, NOD1 en NOD2.

Op figuur 4.6 wordt ook het resultaat van de PCR voor de amplificatie van NOD1 en NOD2 weergegeven. Wegens het produceren van meerdere amplicons, werden voor NOD1 en NOD2 nieuwe primers gezocht. De sequenties van deze nieuwe primers zijn terug te vinden in tabel 3.3 en het resultaat wordt voorgesteld in figuur 4.7. Deze gel duidt op specificiteit voor het NOD2-primerpaar. Voor NOD1 is de specificiteit op de gel niet zo duidelijk na te gaan. Tijdens het opstellen van de smeltcurve met de primers voor NOD1 bleek echter dat ze toch niet specifiek genoeg waren. Er werden dan ook geen verdere analyses uitgevoerd voor NOD1.


4.4.2

45

Resultaten Real Time PCR

In figuren 4.8 tot en met 4.11 wordt weergegeven in welke mate de expressie van bepaalde PRR’s van het aangeboren immuunsysteem verandert bij infectie met C. psittaci in THP1cellen. De positive X fold upregulation waarden geven aan hoeveel keer de expressie bij de ge¨ınfecteerde stalen verhoogd wordt ten opzicht van de niet-ge¨ınfecteerde controles. Negatieve waarden betekenen een lagere expressie van de receptor tijdens infectie ten opzichte van de niet-ge¨ınfecteerde controles. Een sterretje (*) betekent een significant hogere expressie in ge¨ınfecteerde stalen ten opzichte van niet-ge¨ınfecteerde stalen. Een bolletje (°) betekent een significant lagere expressie in ge¨ınfecteerde stalen ten opzicht van niet-ge¨ınfecteerde stalen. De letters boven de X fold waarden duiden op significante verschillen in expressie tussen de verschillende tijdstippen voor één PRR. Enkel verschillende letters duiden op een significant verschil, terwijl het voorkomen van één of meerdere gelijke letters duidt op het ontbreken van een significant verschil. De tabel met de waarden en bijhorende standaardafwijkingen is terug te vinden in bijlage F. TLR1 werd hoog opgereguleerd tijdens de infectie (figuur 4.8). Reeds 2u post-infectie werd TLR1 118.83 keer significant opgereguleerd. 4u na infectie werd een piek gedetecteerd (237.73 keer), gevolgd door een significante daling op tijdstip 8u (21.89 keer). Ook op tijdstippen 18u en 72u komt TLR1 significant meer tot expressie in ge¨ınfecteerde THP1-cellen dan in nietge¨ınfecteerde cellen, respectievelijk 3.44 en 2.65 keer. Op de overige tijdstippen was de opof neerregulatie niet significant. TLR2 vertoonde weinig significante opof neerregulaties. Enkel op tijdstip 18u was de opregulatie significant (4.32 keer). TLR4 kende 2u post-infectie een significante opregulatie van 119.90 keer. Daarna werd een significante daling ingezet. Er werd dan ook een significante neerregulatie gedetecteerd 8u (-10.62 keer), 24u (-2.27 keer) en 72u (-2.03 keer) post-infectie. Ook TLR6 werd 21.19 keer significant opgereguleerd 2u na de infectie van de cellen met Chlamydia psittaci. Op 4u post-infectie werd een significante daling waargenomen die op tijdstip 8u eindigde in een significante neerregulatie van -10.84 keer. Op de latere tijdspunten werden naast de significante opregulatie op 18u (3.92 keer) geen significante opof neerregulaties aangetoond.


46

Figuur 4.8: Gemiddelde X fold upregulation met bijhorende standaarddeviatie voor de expressie van TLR1, TLR2, TLR4 en TLR6.

Figuur 4.9: Gemiddelde X fold upregulation met bijhorende standaarddeviatie voor de expressie van TLR3 en TLR9.


47

Figuur 4.10: Gemiddelde X fold upregulation met bijhorende standaarddeviatie voor de expressie van NLRP3 en ASC.

Figuur 4.11: Gemiddelde X fold upregulation met bijhorende standaarddeviatie voor de expressie van RIG-1 en NOD2.


48

Figuur 4.9 geeft de X fold upregulation weer van TLR3 en TLR9. De significante open neerregulaties voor TLR3 werden waargenomen op 2u (3.99 keer), 4u (6.07 keer) en 8u (-9.77 keer) post-infectie. De significante stijging tussen 2u en 4u post-infectie werd gevolgd door een significante daling tot 8u post-infectie. Daarna waren de opof neerregulaties niet meer significant. TLR9 kende net zoals TLR3 significante open neerregulaties op tijdspunten 2u (5.94 keer), 4u (7.80 keer) en 8u (-14.13 keer). Hier was de initiële stijging niet significant, maar de daaropvolgende daling naar tijdstip 8u wel. Daarna kwam terug een significante stijging met een piek van significante opregulatie (11.30 keer) 18u post-infectie. 12u, 24u, 36u, 48u en 72u post-infectie was de expressie van TLR9 niet significant hoger of lager dan in de niet-ge¨ınfecteerde stalen. X fold upregulation waarden voor NLRP3 en ASC zijn terug te vinden op figuur 4.10. De receptor NLRP3 werd significant verhoogd tot expressie gebracht na infectie op tijdstippen 2u en 4u, respectievelijk 18.54 en 9.30 keer. Ook op tijdstippen 18u (2.80 keer) en 72u (1.72 keer) was de expressie van NLRP3 significant hoger in de ge¨ınfecteerde THP1-cellen ten opzicht van de niet-ge¨ınfecteerde cellen. Net als NLRP3 kende ASC een significante opregulatie 2u (17.24 keer) en 4u (16.09 keer) post-infectie. Daarnaast werd op tijdspunten 24u en 48u een significante opregulatie waargenomen, respectievelijk 8.58 en 13.00 keer. Voor ASC was de daling in X fold upregulation tussen 4u en 12u significant. Ook na 48u werd een significante daling aangevat. Tot slot wordt de X fold upregulation voor RIG-1 en NOD2 weergegeven in figuur 4.11. Op 2u en 4u kende RIG-1 een significant toegenomen expressie met X fold waarden van respectievelijk 18.12 en 20.29 keer. Daarna volgde een significante afname tot 8u post-infectie om terug significant te stijgen tot 18u post-infectie. Op dit laatste tijdstip werd bovendien een significante opregulatie waargenomen (7.95 keer), net zoals op tijdstip 72u (3.58 keer). De dalende lijn van de X fold waarden na 18u was niet significant. Na de significante opregulatie van NOD2 2u post-infectie (55.80 keer) werd een dalende lijn ingezet die als significant werd aangetoond. Op 4u was er dan ook een significante opregulatie met als waarde 4.09 keer en op 8u een significante neerregulatie met als waarde -6.33 keer. De daaropvolgende tijdstippen vertoonden geen significante opof neerregulaties. Ook de verschillen in X fold waarden waren niet langer significant.

Hoofdstuk 5

Discussie De infectiviteitstitratie gaat na hoeveel bacteriën aanwezig zijn in het supernatans van de THP1-cellen op verschillende tijdstippen na infectie. Er werd ge¨ınoculeerd met een MOI van 1. Op tijdstippen 12u en 18u is een significant lagere hoeveelheid C. psittaci CP3 partikels aanwezig dan de hoeveelheid gebruikt voor inoculatie. Na 12 u hebben de EB’s nog niet voldoende tijd gehad om hun cyclus te voltooien. Er heeft zich bijgevolg nog geen lyse voorgedaan van THP1-cellen. Na 18u en 24u is een stijging waar te nemen in het aantal gedetecteerde bacteriën. Geleidelijk aan wordt in de ge¨ınfecteerde cellen de ontwikkelingscyclus beëindigd. Enkele macrofagen zullen dus lyseren, waarbij EB’s worden vrijgesteld in het supernatans. Deze EB’s zullen al starten aan een tweede infectiecyclus en dus al nieuwe macrofagen binnendringen. Op 48u en 72u vindt een piek plaats in het aantal gedetecteerde Chlamydia psittaci. In veel cellen is de tweede ontwikkelingscyclus op het punt gekomen van cellyse. Op die manier komen heel veel bacteriën tegelijkertijd vrij in het medium. Om te onderzoeken hoe de macrofagen reageren op infectie met C. psittaci werd in de eerste plaats via ELISA nagegaan welke inflammatoire cytokines geproduceerd worden. De geanalyseerde cytokines zijn terug te vinden in sectie 3.3. De resultaten voor IL-2, IL-4 en IL-17α werden echter niet opgenomen in bijlage D en ook niet in de figuren van sectie 4.2. Dit werd zo gedaan omdat deze cytokines nooit tot expressie komen in humane macrofagen. De gemeten waarden bedroegen dan ook 0 ng/ml. Wegens irrelevantie worden deze cytokines niet verder besproken. In hoofdstuk 4 werd gewezen op de onverwacht hoge gemiddelde concentraties voor bepaalde cytokines in het supernatans van de controlestalen op tijdstip 48u. Omdat dit slechts op één tijdspunt naar voor komt, wordt een fout in het experiment vermoed. Waarschijnlijk vond een contaminatie plaats tijdens het uitvoeren van de ELISA. Dit kan de verhoogde detectie van bepaalde cytokines op dit tijdstip in de controlestalen verklaren. Daarnaast werd IL-8 in stijgende mate gedetecteerd in het supernatans van de MOC-ge¨ınfecteerde cellen. Een mogelijke verklaring is het ontbreken van inhiberende signalen in de weefselcultuur omgeving. 49

Hoofdstuk 5. Discussie

50

Zo werd reeds aangetoond dat IL-10 de spontane productie van IL-8 in humane monocyten in cultuur kan inhiberen. (Gesser, 1997) Bovendien werd IL-10 noch in de controlestalen, noch in de ge¨ınfecteerde stalen gedetecteerd. Dit is in tegenstelling tot eerder onderzoek door Beeckman et al. Tijdens die studie werden HD11-cellen, dit zijn kippenmacrofagen, ge¨ınfecteerd met Chlamydia psittaci aan een MOI van 100. 4u na de infectie werd een hoge IL-10 respons waargenomen. (Beeckman, 2010) Waarschijnlijk komt dit door het gebruik van de hoge MOI. De hoge infectiedosis maakt het immers noodzakelijk om de immuunrespons te onderdrukken zodat weefselschade beperkt blijft. Waarschijnlijk is het onrealistisch dat in vivo 100 bacteriën één macrofaag binnendringen. Hoeveel het er dan wel zijn is niet geweten, maar er wordt aangenomen dat een MOI van 1 meer de werkelijkheid nabootst. De MOI van 1 die tijdens het experiment voor staalname werd gebruikt, zorgt voor een milde immuunrespons in de humane macrofagen. Deze moest niet in evenwicht gebracht worden met inhibitorische cytokines. Bovendien tonen preliminaire data aan dat de IL-10 respons van HD11-cellen ge¨ınfecteerd met een MOI van 1 ook zeer laag is. Daaruit kan geconcludeerd worden dat de IL-10 respons van macrofagen na infectie met Chlamydia psittaci MOI-afhankelijk is. Vijf cytokines werden in detecteerbare hoeveelheden geproduceerd tijdens de infectie: IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8 en GM-CSF. IL-1β is een pro-inflammatoir cytokine dat op verschillende manieren bijdraagt tot de ontstekingsreactie. Zo stimuleert het de secretie van andere cytokines, waaronder IL-6. Dit is misschien de verklaring waarom IL-6 pas vanaf 48u post-infectie wordt gedetecteerd. IL-1β is daarnaast een chemokine voor neutrofielen, monocyten en leukocyten. TNF-α is ook een pro-inflammatoir cytokine. De rol van deze molecule in de ontstekingsreactie is onder andere het verhogen van de permeabiliteit van de bloedvaatjes in het weefsel. Daardoor krijgen allerhande immuuncellen gemakkelijker toegang tot de plaats van ontsteking. De stijgende trend in de concentraties van IL-1β en TNF-α kan geassocieerd worden met het toenemend aantal bacteriën dat werd waargenomen tijdens de infectiviteitstitratie. Geleidelijk aan komen meer en meer bacteriën vrij in het supernatans. Hierdoor worden meer en meer macrofagen aangezet tot de productie van pro-inflammatoire cytokines. Het derde pro-inflammatoir cytokine is IL-6. Dit interleukine induceert onder andere de productie van acute-fase prote¨ınes in de lever. IL-6 vormt een intermediaire modulator tussen het aangeboren en het adaptief imuunsysteem. Ook IL-8 werd geproduceerd als respons op infectie. Het is een chemokine dat polymorfonucleaire cellen aantrekt naar de infectieplaats. De gemobiliseerde cellen kunnen dan meewerken om de infectie op te ruimen. Het laatste gedetecteerde cytokine, GM-CSF, is een groeifactor. Macrofagen die werden aangetrokken naar de plaats van infectie worden door deze molecule gestimuleerd in hun groei.


Figuur 5.1: PRR pathways. http://www.invivogen.com/docs/PRR-signaling-2011.pdf

51


52

De cytokines die hierboven werden besproken zorgen enerzijds voor het rekruteren van immuuncellen naar de plaats van infectie en anderzijds veroorzaken ze een pro-inflammatoire respons. In de eerste plaats is dit een natuurlijke reactie van het immuunsysteem. Op die manier kan de infectie immers efficiënter opgeruimd worden. Misschien speelt dit ook wel in het voordeel van Chlamydia psittaci. Wanneer de bacterie zijn ontwikkelingscyclus heeft voltooid en massaal nieuwe EB’s vrijkomen uit de ge¨ınfecteerde cellen, zijn reeds nieuwe macrofagen ter plaatse. Op die manier kunnen de EB’s deze nieuwe macrofagen infecteren en een nieuwe cyclus aanvatten. Er wordt gehypothetiseerd dat C. psittaci de macrofagen gebruikt als transportmiddel doorheen het lichaam. Op die manier kan de bacterie immers een systemische infectie veroorzaken. De expressie van de pro-inflammatoire cytokines kan verlopen via twee transcriptiefactoren: NF-κB en AP1 (zie figuur 5.1). De transcriptiefactoren worden geactiveerd door verschillende PRR’s. Om enig idee te krijgen via welke pathway de cytokines worden geactiveerd, werd de expressie van enkele PRR’s nagegaan via Real Time PCR. Na activatie kunnen PRR’s namelijk hun eigen transcriptie verhogen. Een verhoogde expressie van een PRR kan dus een teken zijn voor zijn activatie. De aanwezigheid van het mRNA vormt echter geen sluitend bewijs. De aanwezigheid van de PRR’s en hun activatie zou moeten aangetoond worden op eiwitniveau, want er kan nog post-transcriptionele en post-translationele silencing plaatsvinden. De aanwezigheid van oppervlaktereceptoren zou bijvoorbeeld kunnen aangetoond worden via flowcytometrie, waarbij specifieke gelabelde antilichamen worden gebruikt. Via Werstern blot zouden zowel oppervlakte- als intracellulaire receptoren kunnen worden gedetecteerd. TLR1 en TLR6 komen significant hoger tot expressie in ge¨ınfecteerde cellen versus MOCge¨ınfecteerde cellen. De X fold upregulation is vooral hoog op tijdstip 2u en voor TLR1 ook op tijdspunt 4u. Vroeg in de ontwikkelingscyclus bevindt C. psittaci zich nog ter hoogte van het celoppervlak van de THP1-cellen. TLR1 en TLR6 zijn PRR’s die aanwezig zijn op het oppervlak van de macrofagen en die beide dezelfde liganden herkennen als TLR2. Waarschijnlijk herkennen TLR1 en TLR6 peptidoglycaan of een lipoprote¨ıne op het oppervlak van de EB’s. Het kan dat op die manier de TLR’s geactiveerd worden en langs die weg hun eigen expressie verhogen. Aangezien zowel TLR1 als TLR6 een heterodimeer moet vormen met TLR2, wordt verwacht dat ook deze laatste TLR verhoogd tot expressie komt vroeg na infectie. De resultaten tonen echter enkel een significant verhoogde expressie aan van TLR2 op tijdstip 18u. Een herhaling van het experiment zou kunnen bevestigen of TLR2 effectief niet verhoogd tot expressie komt vroeg na infectie. Misschien wordt TLR2 ge¨ınhibeerd door effectoreiwitten die worden aangeleverd door C. psittaci via het type III secretiesysteem (TTSS). Dit zou betekenen dat TLR2 geen heterodimeer kan vormen met TLR1 of TLR6 en er dus via deze weg geen activatie van NF-κB of AP1 zou plaatsvinden. Het is dan ook zeer twijfelachtig dat deze pathway een verklaring is voor de aanwezigheid van IL-1β, IL-6 en TNF-α in het supernatans van de macrofagen na infectie met Chlamydia psittaci. Bovendien


53

blijkt uit preliminaire data dat ook HD11-cellen geen verhoogde expressie vertonen voor TLR2 na infectie met C. psittaci. Door testen met INP0007, een TTSS-inhibitor, wordt vermoed dat het secretiesysteem hiervoor verantwoordelijk is. Tot slot zou de significante toename in expressie voor zowel TLR1, TLR2 en TLR6 18u post-infectie het gevolg kunnen zijn van de start van de tweede infectiecyclus. Voor TLR1 komt hier ook nog het tijdstip 72u bij. Voor TLR4 werd een significant verhoogde expressie waargenomen 2u post-infectie. Ook deze PRR komt voor op het oppervlak van de macrofaag en kan dus in contact komen met C. psittaci nog voor internalisatie van de bacterie. TLR4 herkent bacterieel LPS met behulp van de co-receptor CD14. Een mogelijkheid is dat TLR4 chlamydiaal LPS herkent en na activatie zijn eigen expressie verhoogd. Bovendien kan geactiveerd TLR4 ook de expressie van de drie gedetecteerde pro-inflammatoire cytokines induceren. Dit kan verlopen via de activatie van zowel AP1 als NF-κB. Om beter na te gaan of de TLR4-pathway wordt geactiveerd, zou een expressie-analyse kunnen uitgevoerd worden voor de co-receptor CD14. Er werden al een aantal onderzoeken uitgevoerd naar de pro-inflammatoire cytokine respons van verschillende celtypes als reactie op verschillende Chlamydia species. Zo werd onder andere aangetoond dat heat shock protein 60 (hsp60) TLR-gemedieerde activatie induceert, maar de verantwoordelijke signaalreceptors verschillen van studie tot studie. Eén studie toonde de betrokkenheid aan van zowel TLR2 als TLR4 (Vabulas, 2001), terwijl een andere studie een kleine rol voor TLR4 en een grote voor TLR2 voorstelde (Prebeck, 2001). Twee onderzoeksgroepen konden enkel de betrokkenheid van TLR4 aantonen (Sasu, 2001; Bulut, 2002) en één groep kon enkel de activatie van TLR2 bewijzen (Netea, 2002). Bas et al concludeerden dan weer dat de pro-inflammatoire cytokine respons van humane macrofagen op Chlamydia trachomatis EB’s gemedieerd wordt via het lipoprote¨ıne Macrophage Infectivity Potentiator (MIP). De gestimuleerde pathways bleken te verlopen via TLR2/TLR1/TLR6 met de hulp van CD14, maar niet via TLR4. (Bas, 2008) De resultaten in deze masterproef doen vermoeden dat TLR4 vooral belangrijk is vroeg na infectie. TLR3 en TLR9 zijn endosomale PRR’s. TLR3 wordt geactiveerd door binding met viraal dsRNA. De resultaten voor dit gen gaven een significante opregulatie vroeg na infectie. Dit is een onverwacht resultaat, aangezien C. psittaci geen virus is. Een herhaling van het experiment zou kunnen uitwijzen of TLR3 effectief wordt opgereguleerd of misschien getriggerd wordt door een andere ligand. Deze laatste optie werd al gesuggereerd in een ander onderzoek. Derbigny et al onderzochten de IFN-β respons van oviduct epitheelcellen op Chlamydia muridarum. De onderzoekers gebruikten siRNA, dominant-negatieve TLR3 mutanten en TLR3-deficiënte oviduct epitheelcellen. De testen toonden aan dat de IFN-β secretie tijdens C. muridarum infectie afhankelijk is van functioneel TLR3. Aangezien er geen dsRNA geassocieerd is met Chlamydia-infecties, werd gesuggereerd dat een andere niet-nucle¨ınezuur component verantwoordelijk is voor de activatie van TLR3. De onderzoeksgroep stelde nog


54

een tweede hypothese voor. Misschien dat de infectie met Chlamydia een cellulaire respons veroorzaakt in de oviduct epitheelcellen waarbij cellulair dsRNA wordt aangemaakt. (Derbigny, 2010) TLR9 herkent dan weer ongemethyleerd CpG-rijk DNA, dat onder andere voorkomt in bacteriën. TLR9 werd in het experiment significant verhoogd tot expressie gebracht 2u en 4u post-infectie. Dit suggereert de aanwezigheid van chlamydiaal CpG DNA in de endosomen heel vroeg na inoculatie. Het lijkt onwaarschijnlijk dat op dat moment in de ontwikkelingscyclus van C. psittaci CP3 reeds bacterieel DNA vrijkomt in het endosoom. De opregulatie van TLR9 18u post-infectie kan beter verklaard worden. Op dit late tijdstip in de ontwikkelingscyclus van C. psittaci CP3 is de aanwezigheid van bacterieel DNA waarschijnlijker. Een gelijkaardige respons werd waargenomen in een nog niet gepubliceerd onderzoek waarbij HD11-cellen, kippenmacrofagen, werden ge¨ınfecteerd met C. psittaci aan een MOI van 1. De preliminaire data vertonen een sterke opregulatie van TLR21, het homoloog van TLR9 in kippen. NLRP3 en ASC zijn samen aanwezig in het cytoplasmatisch inflammasoom dat geactiveerd wordt door bacterieel RNA of verhoogde ATP-concentraties. Het geactiveerd inflammasoom staat in voor het activeren van Caspase-1, dat op zijn beurt pro-IL-1β omzet naar actief IL-1β. NLRP3 en ASC vertoonden beide een significant toegenomen expressie 2u en 4u postinfectie. NLRP3 kwam bovendien 18u en 72u na inoculatie verhoogd tot expressie en ASC op 24u en 48u. Op deze latere tijdstippen werd ook IL-1β gedetecteerd. Dit suggereert dat er een activatie plaatsvindt van het inflammasoom, waardoor pro-IL-1β wordt omgezet tot IL-1β. De aanwezigheid van pro-IL-1β kan verklaard worden door de verhoogde expressie van verschillende TLR’s. Om de activatie van het inflammasoom verder te onderzoeken zou de aanwezigheid van Caspase-1 moeten worden nagegaan. Activatie van het NLRP3/ASC inflammasoom werd reeds aangetoond in macrofagen na infectie met C. pneumoniae. De productie van pro-IL-1β verloopt er via TLR2 en NF-κB. Dit gebeurt allemaal vroeg in de ontwikkeling van C. pneumoniae, nog voor de RB-vermenigvuldiging. (He,2010) Dit zou de opregulatie van NLRP3 en ASC vroeg na infectie kunnen verklaren. De latere opregulatie zou dan kunnen geassocieerd worden met het starten van volgende cycli. NOD2 vertoonde enkel een significant verhoogde expressie op tijdstip 2u en 4u. NOD2 bevindt zich in het cytoplasma van de cel en herkent een motief in peptidoglycaan. Na activatie kan NOD2 de expressie van pro-inflammatoire cytokines veroorzaken, zowel via de AP1- als de NF-κB-pathway. Het is mogelijk dat NOD2 vroeg in de ontwikkelingscyclus van C. psittaci in aanraking komt met het peptidoglycaan in de celwand van de bacterie en na activatie zijn eigen expressie verhoogd. Aangezien NOD1 ook een motief herkent in peptidoglycaan wordt voor deze PRR dezelfde opregulatie verwacht. In de nabije toekomst zullen dan ook voor NOD1 geschikte primers gezocht worden om Real Time PCR uit te voeren. Het belang van NOD1


55

en NOD2 werd immers al aangetoond tijdens infectie met C. pneumoniae. (Shimada, 2009) Bovendien werd NOD1 geassocieerd met IL-8 productie in endotheelcellen na infectie met C. pneumoniae (Opitz, 2005) en in epitheelcellen na infectie met C. trachomatis (Buchholz, 2008). Via expressie-analyse van NOD1 zou een eventueel verband tussen deze PRR en het gedetecteerd IL-8 kunnen worden aangetoond. De laatste PRR die werd onderzocht is RIG-1. De resultaten gaven een significant toegenomen expressie 2u, 4u, 18u en 72u post-infectie. RIG-1 staat in voor de herkenning van dsRNA. Net zoals bij TLR3 is de aanwezigheid van dsRNA vroeg na infectie onwaarschijnlijk. De opregulatie op tijdstippen 2u en 4u zijn dan ook moeilijk te verklaren. Later in de ontwikkelingscyclus van CP3 is de aanwezigheid van dsRNA waarschijnlijker. Dit zou een verklaring kunnen zijn voor de activatie en bijgevolg verhoogde expressie van deze PRR. Ook RIG-1-activatie is een mogelijke verklaring voor de gedetecteerde pro-inflammatoire cytokines. Activatie van RIG-1 leidt immers tot activatie van NF-κB.

Hoofdstuk 6

Conclusie De aangeboren immuunrespons van Chlamydia psittaci in humane macrofagen komt tot stand via een complex netwerk van interacties en pathways. Alhoewel de weg naar het volledig ontrafelen van dit netwerk nog lang is, creëert deze masterproef toch enige inzage in de betrokken mechanismen. Macrofagen spelen duidelijk een rol in de aangeboren immuunrespons tegen C. psittaci. Hun productie van pro-inflammatoire cytokines, IL-1β, TNF-α en IL-6, zorgt immers voor het aanvatten van een ontstekingsreactie en het rekruteren van verschillende immuuncellen naar de plaats van infectie. De secretie van IL-8 lokt dan weer macrofagen die geholpen worden in hun groei door de groeifactor GM-CSF. Aangezien C. psittaci systemische infecties kan veroorzaken, is de immuunrespons niet altijd voldoende om de infectie op te ruimen. Het aantrekken van macrofagen speelt hier wellicht in het voordeel van de bacterie. C. psittaci kan de gemobiliseerde macrofagen infecteren om zich op die manier te verspreiden via het bloed. In deze hypothese gebruikt Chlamydia psittaci de macrofaag als beschermend transportmiddel doorheen het lichaam. De resultaten van de expressie-analyse geven enige aanwijzing welke pathways mogelijks betrokken zijn in de cytokinerespons. Vroeg na de infectie vindt waarschijnlijk een activatie plaats van oppervlaktereceptoren, die later post-infectie wordt aangevuld met activatie van enkele intracellulaire receptoren. Een expressie-analyse vormt echter geen sluitend bewijs. Het aantonen van een activatie van de receptoren zou moeten gebeuren op eiwit-niveau. Om na te gaan welke PRR’s een belangrijke rol spelen in de aangeboren immuunrespons moeten enkel bijkomende in vitro onderzoeken gebeuren. Een combinatie van verschillende antilichamen tegen verschillende TLR’s zou kunnen aantonen welke oppervlaktereceptoren noodzakelijk zijn voor de cytokinerespons. Voor zowel oppervlakte- als intracellulaire receptoren kunnen knock-out cellijnen gebruikt worden om het belang van de verschillende PRR’s na te gaan. Een ander mogelijkheid is het transfecteren van PRR’s in HEK-cellen en hierbij een reportersysteem gebruiken om hun activatie te onderzoeken. 56

Bijlage A

Referenties Literatuurstudie Taxonomie NCBI Taxonomy Browser. (2011) Taxonomy browser Chlamydophila psitttai . http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Infoid=83554lvl= 3keep=1srchmode=1unlocklin=f (geraadpleegd op 7 november 2011). EVERETT, K.D.E. (2000) Chlamydia and Chlamydiales: more than meets the eye. Veterinary Microbiology, 75, 109-126. GRAYSTON, J.T., KUO, C., CAMPBELL, L.A., WANG, S. (1989) Chlamydia pneumoniae sp. nov. for Chlamydia sp. Strain TWAR. International Journal of Systematic Bacteriology, 39, 88-90. FUKUSHI, H. and HIRAI, K. (1992) Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia Strains Derived from Ruminants. International Journal of Systematic Bacteriology, 42, 306308. EVERETT, K.D.E., BUSH, R.M., ANDERSEN, A.A. (1999) Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revise taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. International Journal of Systematic Bacteriology, 49, 415-440. SCHACHTER, J., STEPHENS, R.S., TIMMS, P. et al.(2001) Radical changes to chlamydial taxonomy are not necessary yet. International Journal of Systematic Bacteriology, 51, 249. STEPHENS, R.S., MYERS, G., EPPINGER, M., BAVOIL, P.M. (2009) Divergence without difference: phylogenetics and taxonomy of Chlamydia resolved. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 55, 115-119.

57

Bijlage A. Referenties

58

GREUB, G. (2010) International Committee on Systematics of Prokaryotes: Subcommittee on the taxonomy of the Chlamydiae. Minutes of the inaugural closed meeting, 21 March 2009, Little Rock, AR, USA. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 60, 2691-2693. ANDERSEN, A.A. (1991a) Serotyping of Chlamydia psittaci Isolates Using Serovar-Specific Monoclonal Antibodies with the Microimmunofluorescence Test. Journal of Clinical Microbiology, 29, 707-711. ANDERSEN, A.A. (1991b) Comparison of Avian Chlamydia psittaci Isolates by Restriction Endonuclease Analysis and Serovar-Specific Monoclonal Antibodies. Journal of Clinical Microbiology, 29, 244-249. VANROMPAY, D., ANDERSEN, A.A., DUCATELLE, R. and HAESEBROUCK, F. (1993) Serotyping of European Isolates of Chlamydia psittaci from Poultry and Other Birds. Journal of Clinical Microbiology, 31, 134-137. ANDERSEN, A.A. (1997) Two new serovars of Chlamydia psittaci from North American birds. Journal of veterinary diagnostic investigation, 9, 159-164. TAKAHASHI, T., MASUDA, M., TSURUNO, T. et al. (1997) Phylogenetic Analyses of Chlamydia psittaci Strains from Birds Based on 16S rRNA Gene Sequence. Journal of Clinical Microbiology, 35, 2908-2914. GEENS, T., DESPLANQUES, A., VAN LOOCK, M. et al. (2005a) Sequencing of the Chlamydophila psittaci ompA Gene Reveals a New Genotype, E/B, and the Need for a Rapid Discriminatory Genotyping Method. Journal of Clinical Microbiology, 43, 2456-2461. GEENS, T., DEWITTE, A., BOON, N. and VANROMPAY, D. (2005b) Development of a Chlamydophila psittaci species-specific and genotype-specific real-time PCR. Veterinary research, 36, 787-797. Chlamydiosis en psittacosis WEST, A. (2011) A Brief Review of Chlamydophila psittaci in Birds and Humans. Journal of Exotic Pet Medicine, 20, 18-20. KALETA, E.F. and TADAY, E.M.A. (2003) Avian host range of Chlamydophila spp. Based on isolation, antigen detection and serology. Avian Pathology, 32, 435-462. EIDSON, M. (2002) Psittacosis/avian chlamydiosis. Journal of the American Veterinary Medical Association, 221, 1710-1712. SMITH, K.A., CAMPBELL, C.T., MURPHY, J. et al. (2011) Compendium of Measures to Control Chlamydophila psittaci Infection Among Humans (Psittacosis) and Pet Birds (Avian


59

Chlamydiosis), 2010 National Association of State Public Health Veterinarians (NASPHV). Journal of Exotic Pet Medicine, 20, 32-45. HARKINEZHAD, T., GEENS, T. and VANROMPAY, D. (2009) Chlamydophila psittaci infections in birds: A review with emphasis on zoonotic consequences. Veterinary Microbiology, 135, 68-77. VERMINNEN, K., BEECKMAN, D.S.A., SANDERS, N.N. et al. (2010) Vaccination of turkeys against Chlamydophila psittaci through optimised DNA formulation and administration. Vaccine, 28, 3095-3105. THEEGARTEN, D., SACHSE, K., MENTRUP, B. et al. (2008) Chlamydopihla spp. infection in horses with recurrent airway obstruction: similarities to human chronic obstructive disease. Respiratory Research, 9, article number 14. DEGRAVES, F.J., GAO, D., HEHNEN, H.-R. et al. (2003) Quantitative Detection of Chlamydia psittaci and C. pecorum by High-Sensitivity Real-Time PCR Reveals High Prevalence of Vaginal Infection in Cattle. Journal of Clinical Microbiology, 41, 1726-1729. JORGENSEN, D.M. (1997) Gestational Psittacosis in a Montana Sheep Rancher. Emerging Infectious Diseases, 3, 191-194. STEWARDSON, A.J. and GRAYSON, M.L. (2010) Psittacosis. Infectious Disease Clinics of North America, 24, 7-25. HUGHES, C., MAHARG, P., ROSARIO, P. et al. (1997) Possible nosocomial transmission of psittacosis. Infection Control and Hospital Epidemiology, 18, 165-168. GHERMAN, R.B., LEVENTIS, L.L. and MILLER, R.C. (1995) Chlamydial psittacosis during pregnancy- a case report. Obstetrics and Gynecology, 86, 648-650. MATSUI, T., NAKASHIMA, K., OHYAMA, T. et al. (2008) An outbreak of psittacosis in a bird park in Japan. Epidemiology and Infection, 136, 492-495. HEDDEMA, E.R., VAN HANNEN, E.J., DUIM, B. et al. (2006) An outbreak of psittacosis due to Chlamydophila psittaci genotype A in a veterinary teaching hospital. Journal of Medical Microbiology, 55, 1571-1575. GAEDE, W., RECKLING, K.-F., DRESENKAMP, B. et al. (2008) Chlamydophila psittaci infections in humans during an outbreak of psittacosis from poultry in Germany. Zoonoses and Public Health, 55, 184-188. PETROVAY, F. and BALLA, E. (2008) Two fatal cases of psittacosis caused by Chlamydophila psittaci. Journal of Medical Microbiology, 57, 1296-1298.


60

LAROUCAU, K., DE BARBEYRAC, B., VORIMORE, F. et al. (2009) Chlamydial infections in duck farms associated with human cases of psittacosis in France. Veterinary Microbiology, 135, 82-89. VAN DROOGENBROECK, C., BEECKMAN, D.S.A, VERMINNEN, K. et al. (2009) Simultaneous zoonotic transmission of Chlamydophila psittaci genotypes D, F and E/B to a veterinary scientist. Veterinary Microbiology, 135, 78-81. HOMMA, T., YAMAGUCHI, T., KOMATSU, N. et al. A case of acute psittacosis with severe abdominal pain. Journal of Medical Microbiology, 60, 547-549. TELFER, B.L., MOBERLEY, S.A., HORT, K.P. et al. (2005) Probable Psittacosis Outbreak Linked to Wild Birds. Emerging Infectious Diseases, 11, 391-397. Ontwikkelingscyclus ESCALANTE-OCHOA, C., DUCATELLE, R. and HAESEBROUCK, F. (1998) The intracellular life of Chlamydia psittaci : how do the bacteria interact with the host cell? FEMS Microbiology Reviews, 22, 65-78. ABDELRAHMAN, Y. and BELLAND, R. (2005) The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews, 29, 949-959. HARKINEZHAD, T., GEENS, T. and VANROMPAY, D. (2009) Chlamydophila psittaci infections in birds: A review with emphasis on zoonotic consequences. Veterinary Microbiology, 135, 68-77. LONGBOTTOM, D. and COULTER, L.J. (2003) Animal Chlamydiosis and Zoonotic Implications. Journal of Comparative Pathology, 128, 217-244. DAUTRY-VARSAT, A., SUBTIL, A. and HACKSTADT, T. (2005) Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cellular Microbiology, 7, 1714-1722. COCCHIARO, J.L. and VALDIVIA, R.H. (2009) New insights into Chlamydia intracellular survival mechanisms. Cellular Microbiology, 11, 1571-1578. CONANT, C.G. and STEPHENS, R.S. (2007) Chlamydia attachment to mammalian cells requires protein disulfide isomerase. Cellular Microbiology, 9, 222-232. ABROMAITIS, S. and STEPHENS, R.S. (2009) Attachment and Entry of Chlamydia Have Distinct Requirements for Host Protein Disulfide Isomerase. Plos Pathogens, 5, 12. CLIFTON, D.R., FIELDS, K.A., GRIESHABER, S.S., et al. (2004) A Chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America, 101, 10166-10171.


61

GRIESHABER, S.S., GRIESHABER, N.A. and HACKSTADT, T. (2006) Chlamydia trachomatis uses host cell dynein to traffic to the microtubule-organizing center in a p50 dynamitinindependent process. Journal of Cell Science, 116, 3793-3802. SCIDMORE, M.A., FISCHER, E.R. and HACKSTADT, T. (2003) Restricted Fusion of Chlamydia trachomatis Vesicles with Endocytic Compartments during the Initial Stages of Infection. Infection and Immunity, 71, 973-984. PLAUNT, M.R. and HATCH, T.P. (1988) Protein Synthesis Early in the Developmental Cycle of Chlamydia psittaci. Infection and Immunity, 56, 3021-3025. HACKSTADT, T., ROCKEY, D.D., HEINZEN, R.A. and SCIDMORE, M.A. (1996) Chlamydia trachomatis interrupts an exocytic pathway to acquire endogenously synthesized sphingomyelin in transit from the Golgi apparatus to the plasma membrane. EMBO Journal, 15, 964-977. CARABEO, R.A., MEAD, D.J. and HACKSTADT, T. (2003) Golgi-dependent transport of cholesterol to the Chlamydia trachomatis inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100, 6771-6776. VANROMPAY, D. CHARLIER, G., DUCATELLE, R. and HAESEBROUCK, F. (1996) Ultrastructural changes in avian Chlamydia psittaci serovar A-, B- and D-infected Buffalo Green Monkey cells. Infection and Immunity, 64, 1265-1271. GRIESHABER, S.S., SWANSON, J.A. and HACKSTADT, T. (2002) Determination of the physical environment within the Chlamydia trachomatis inclusion using ion-selective ratiometric probes. Cellular Microbiology, 4, 273-283. BAVOIL, P.M., HSIA, R-.C. and OJCIUS, D.M. (2000) Closing in on Chlamydia and it intracellular bag of tricks. Microbiology, 146, 2723-2731. BELLAND, R.J., ZHONG, G., CRANE, D.D. et al. (2003) Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100, 8478-8483. YING, S., PETTENGILL, M., LATHAM, E.R. et al. (2008) Premature apoptosis of Chlamydia-infected cells disrupts chlamydial development. The Journal of Infectious Diseases, 198, 1536-1544. FAN, T., LU, H., HU, H. et al. (1998) Inhibition of Apoptosis in Chlamydia-infected Cells: Blockade of Mitochondrial Cytochrome c Release and Caspase Activation. The Journal of Experimental Medicine, 187, 487-496.


62

HAYDEN, M.S., WEST, A.P. and GHOSH, S. (2006) NF-kappaB and the immune response. Oncogene, 25, 6758-6780. SUN, S-.C. and LEY, S.C. (2008) New insights into NF-κB regulation and function. Trends in Immunology, 29, 469-478. LAD, S.P., DA SILVA, C.J., PAN, Q. et al. (2007) Cleavage of p65/RelA of the NF-kappaB pathway by Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104, 2933-2938. NEGRATE, G., KRIEG, A., FAUSTIN, B. et al. (2008) ChlaDub1 of Chlamydia trachomatis suppresses NF-κB activation and inhibits IκBα ubiquitination and degradation. Cellular Microbiology, 10, 1879-1892. Chlamydia psittaci in macrofagen BEECKMAN, D.S.A. and VANROMPAY, D.C.G. (2010) Biology and intracellular pathogenesis of high or low virulent Chlamydophila psittaci strains in chicken macrophages. Veterinary Microbiology, 141, 342-353. VANROMPAY, D., MAST, J., DUCATELLE, R. et al. (1995) Chlamydia psittaci in turkeys: pathogenesis of infections in avian serovars A, B and D. Veterinary Microbiology, 47, 245-256. MAY, A.E., REDECKE, V., GRUNER, S. et al. (2003) Recruitment of Chlamydia pneumoniae-Infected Macrophages to the Carotid Artery Wall in Noninfected, Nonatherosclerotic Mice. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 23, 789-794. DE FOUGEROLLES, A.R., STACKER, S.A., SCHWARTING, R. and SPRINGER, T.A. (1991) Characterization of ICAM-2 and Evidence for a Third Counter-Receptor for LFA-1. The Journal of Experimental Medicine, 174, 253-267. ROTHERMEL, C.D., RUBIN, B.Y., JAFFE, E.A. and MURRAY, H.W. (1986) Oxygenindependent inhibition of intracellular Chlamydia psittaci growth by human monocytes and interferon-γ-activated macrophages. The Journal of Immunology, 137, 689-692. CARLIN, J.M., BORDEN, E.C. and BYRNE, G.I. (1989) Interferon-Induced Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity Inhibits Chlamydia psittaci Replication in Human Macrophages. Journal of Interferon Research, 9, 329-337. PAGUIRIGAN, A.M., BYRNE, G.I., BECHT, S. and CARLIN, J.M. (1994) Cytokine-mediated indoleamine 2,3-dioxygenase induction in response to Chlamydia infection in human macrophage cultures. Infection and Immunity, 62, 1131-1136. CARLIN, J.M. and WELLER, J.B. (1995) Potentiation of Interferon-Mediated Inhibition of


63

Chlamydia Infection by Interleukin-1 in Human Macrophage Cultures. Infection and Immunity, 63, 1870-1875. IGIETSEME, J.U., PERRY, L.L., ANANABA, G.A. et al. (1998) Chlamydial Infection in Inducible Oxide Synthase Knockout Mice. Infection and Immunity, 66, 1282-1286. ROTTENBERG, M.E., GIGLIOTTI ROTHFUCHS, A.C., GIGLIOTTI, D. et al. (1999) Role of Innate and Adaptive Immunity in the Outcome of Primary Infection with Chlamydia pneumoniae, as Analyzed in Genetically Modified Mice. Journal of Immunology, 163, 28292836. RODRIGUEZ, N., LANG, R., WANTIA, N. et al. (2008) Induction of iNOS by Chlamydophila pneumoniae requires MyD88-dependent activation of JNK. Journal of Leukocyte Biology, 84, 1585-1593. PARADKAR, P.N., DE DOMENICO, I., DURCHFORT, N. et al. (2008) Iron depletion limits intracellular bacterial growth in macrophages. Blood, 112, 866-874. Intracellulaire receptoren ATHMAN, R., PHILPOTT, D. (2004) Innate immunity via Toll-like receptors and Nod proteins. Current Opinion in Microbiology, 7, 25-32. LEE, M.S., KIM, Y.J. (2007) Signaling pathways downstream of pattern-recognition receptors and their cross talk. Annu. Rev. Biochem., 276, 447-480. ¨ OPITZ, B., FORSTER, S., HOCKE, A.C., MAASS, M., et al. (2005) Nod1-mediated endothelial cell activation by Chlamydophila pneumonia. Circulation research, 96, 319-326. SHIMADA, K., CHEN, S., DEMPSEY, P.W., et al. (2009) The NOD/RIP2 Pathway Is Essential for Host Defenses Against Chlamydophila pneumoniae Lung Infection. Plos Pathogens, 5, 13. BUCHHOLZ, K.R. and STEPHENS, R.S. (2008) The Cytosolic Pattern Recognition Receptor NOD1 Induces Inflammatory Interleukin-8 during Chlamydia trachomatis Infection. Infection and Immunity, 76, 3150-3155. WELTER-STAHL, L., OJCIUS, D.M., VIALA, J., et al. (2006) Stimulation of the cytosolic receptor for peptidoglycan, Nod1, by infection with Chlamydia trachomatis or Chlamydia muridarum. Cellular Microbiology, 8, 1047-1057. MEYLAN, E., TSCHOPP, J., KARIN, M. (2006) Intracellular pattern recognition receptors in the host response. Nature, 442, 39-44. HE, X., MEKASHA, S., MAVROGIORGOS, N., et al. (2010) Inflammation and Fibrosis


64

during Chlamydia pneumonia Infection Is Regulated by IL-1 and the NLRP3/ASC Inflammasome. The Journal of Immunology, 184, 5743-5754. SHIMADA, K., CROTHER, T.R., KARLIN, J., et al. (2011) Caspase-1 Dependent IL-1β Secretion Is Critical for Host Defense in a Mouse Model of Chlamydia pneumoniae Lung Infection. Plos One, 6, 13. ¨ ABDUL-SATER, A.A., KOO, E., HACKER, G. and OJCIUS, D.M. (2009) Inflammasomedependent Caspase-1 Activation in Cervical Epithelial Cells Stimulates Growth of the Intracellular Pathogen Chlamydia trachomatis. The journal of biological chemistry, 284, 26789-26796. PRANTNER, D., DARVILLE, T., SIKES, J.D., et al. (2009) Critical Role for Interleukin-1β (IL-1β) during Chalmydia muridarum Genital Infection and Bacterial Replication-Independent Secretion of IL-1β in Mouse Macrophages. Infection and Immunity, 77, 5334-5346. DERBIGNY, W.A., HONG, S.C., KERR, M.S., et al. (2007) Chlamydia muridarum Infection Elicits a Beta Interferon Response in Murine Oviduct Epithelial Cells Dependent on Interferon Regulatory Factor 3 and TRIF. Infection and Immunity, 75, 1280-1290. DERBIGNY, W.A., JOHNSON, R.M., TOOMEY, K.S., et al. (2010) The Chlamydia muridarum- Induced IFN-β Response Is TLR3-Dependent in Murine Oviduct Epithelial Cells. The Journal of Immunology, 185, 6689-6697. HAN, X., FAN, Y., WANG, S., et al. (2004) Dendritic cells from Chlamydia-infected mice show altered Toll-like receptor expression and play a crucial role in inhibition of allergic responses to ovalbumin. European Journal of Immunology, 34, 981-989. BOHLE, B. (2002) CpG motifs as possible adjuvants for the treatment of allergic diseases. International Archives of Allergy and Immunology, 129, 198-203. JAIN, V.V., KITAGAKI, K., BUSINGA, T., et al. (2002) CpG-oligodeoxynucleotides inhibit airway remodeling in a murine model of chronic asthma. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 110, 867-872. KRIEG, A.M. (2002) CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Annual Review of Immunology, 20, 709-760. DOMMETT, R.M., KLEIN, N. and TURNER, M.W. (2006) Mannose-binding lectin in innate immunity: past, present and future. Tissue Antigens, 68, 193-209. SWANSON, A., EZEKOWITZ, R.A.B., LEE, A. and KUO, C. (1998) Human mannosebinding protein inhibits infection of HeLa cells by Chlamydia trachomatis. Infection and Immunity, 66, 1607-1612.


65

RUGONFALVI-KISS, S., ENDRESZ, V., MADSEN, H.O., et al. (2002) Association of Chlamydia pneumoniae With Coronary Artery Disease and Its Progression Is Dependent on the Modifying Effect of Mannose-Binding Lectin. Circulation, 106, 1071-1076. Materialen en methoden Primers voor Real-Time PCR TAMAKI, Y., AKAKUBO, Y., HIRAYAMA, T., et al. (2011) Expression of Toll-like Receptors and Their Signaling Pathways in Rheumatoid Synovitis.The Journal of Rheumatology, 38, 810-820. ¨ ABDUL-SATER, A.A., KOO, E., HACKER, G. and OJCIUS, D.M. (2009) Inflammasomedependent Caspase-1 Activation in Cervical Epithelial Cells Stimulates Growth of the Intracellular Pathogen Chlamydia trachomatis. The journal of biological chemistry, 284, 26789-26796. TANG, L., ZHOU, X., WANG, Q., et al. (2011) Expression of TRAF6 and pro-inflammatory cytokines through activation of TLR2, TLR4, NOD1, and NOD2 in human periodontal ligament fibroblasts. Archives of Oral Biology, 56, 1064-1072. CONCEICAO, T.M., EL-BACHA, T., VILLAS-BOAS, C.S.A., et al. (2010) Gene expression analysis during dengue virus infection in HepG2 cells reveals virus control of innate immune response. Journal of Infection, 60, 65-75. Discussie GESSER, B., LEFFERS, H., JINQUAN, T., et al. (1997)Identification of functional domains on human interleukin 10. Immunology, 94, 14620-14625. BEECKMAN, D.S.A., ROTHWELL, L., KAISER, P. and VANROMPAY, D.C.G. (2010) Differential cytokine expression in Chlamydophila psittaci genotype A-, B- or D-infected chicken macrophages after exposure to Escherichia coli O2:K1 LPS. Developmental and Comparative Immunology, 34, 812820. VABULAS, R.M., AHMAD-NEJAD, P., DA COSTA, C., et al. (2001) Endocytosed HSP60s use toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 to activate the toll/interleukin-1 receptor signaling pathway in innate immune cells. The Journal of Biological Chemistry, 276, 31332-31339. PREBECK, S., KIRSCHNING, C., DURR, S., et al. (2001) Predominant role of toll-like receptor 2 versus 4 in Chlamydia pneumoniae-induced activation of dendritic cells. The Journal of Immunology, 167, 3316-3323. SASU, S., LA VERDA, D., QURESHI, N., et al. (2001) Chlamydia pneumoniae and chlamydial heat shock protein 60 stimulate proliferation of human vascular smooth muscle cells


66

via toll/like receptor 4 and p44/p42 mitogen-activated protein kinase activation. Circulation Research, 89, 244-250. BULUT, Y., FAURE, E., THOMAS, L., et al. (2002) Chlamydial heat shock protein 60 activates macrophages and endothelial cells through Toll-like receptor 4 and MD2 in a MyD88dependent pathway. The Journal of Immunology, 168, 1435-1440. NETEA, M.G., KULLBERG, B.J., GALAMA, J.M., et al. (2002) Non-LPS components of Chlamydia pneumoniae stimulate cytokine production through Toll-like receptor 2-dependent pathways. European Journal of Immunology, 32, 1188-1195. BAS, S., NEFF, L., VUILLET, M., et al. (2008) The Proinflammatory Cytokine Response to Chlamydia trachomatis Elementary Bodies in Human Macrophages Is Partly Mediated by a Lipoprotein, the Macrophage Infectivity Potentiator, through TLR2/TLR1/TLR6 and CD14. The Journal of Immunology, 180, 1158-1168. DERBIGNY, W.A., HONG, S.C., KERR, M.S., et al. (2007) Chlamydia muridarum Infection Elicits a Beta Interferon Response in Murine Oviduct Epithelial Cells Dependent on Interferon Regulatory Factor 3 and TRIF. Infection and Immunity, 75, 1280-1290. HE, X., MEKASHA, S., MAVROGIORGOS, N., et al. (2010) Inflammation and Fibrosis during Chlamydia pneumonia Infection Is Regulated by IL-1 and the NLRP3/ASC Inflammasome. The Journal of Immunology, 184, 5743-5754. SHIMADA, K., CHEN, S., DEMPSEY, P.W., et al. (2009) The NOD/RIP2 Pathway Is Essential for Host Defenses Against Chlamydophila pneumoniae Lung Infection. Plos Pathogens, 5, 13. ¨ OPITZ, B., FORSTER, S., HOCKE, A.C., MAASS, M., et al. (2005) Nod1-mediated endothelial cell activation by Chlamydophila pneumonia. Circulation research, 96, 319-326. BUCHHOLZ, K.R. and STEPHENS, R.S. (2008) The Cytosolic Pattern Recognition Receptor NOD1 Induces Inflammatory Interleukin-8 during Chlamydia trachomatis Infection. Infection and Immunity, 76, 3150-3155.

Bijlage B

User Manual Multi-Analyte ELISArray Kit

67

August 2011

Multi-Analyte ELISArray Handbook For the simultaneous detection of up to 12 cytokines or chemokines in multiple samples

Sample & Assay Technologies

QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN is the leading provider of innovative sample and assay technologies, enabling the isolation and detection of contents of any biological sample. Our advanced, high-quality products and services ensure success from sample to result. QIAGEN sets standards in:



Purification of DNA, RNA, and proteins



Nucleic acid and protein assays



microRNA research and RNAi



Automation of sample and assay technologies

Our mission is to enable you to achieve outstanding success and breakthroughs. For more information, visit www.qiagen.com.

Product Use Limitations

Multi-Analyte ELISArray Kits are intended for molecular biology applications. These products are not intended for the diagnosis, prevention, or treatment of a disease.

CONTENTS I.

Background and Introduction

4

II.

Materials Provided

6

III.

Additional Materials Required

6

IV.

Precautions

6

V.

Complementary Products

6

VI.

Protocol

7

A.

Sample Preparation and Handling

7

B.

Reagent Preparation

8

C.

Assay Procedure

9

D.

Data Analysis

VII.

Troubleshooting and Frequently Asked Questions

11 11

I. Background and Introduction The Multi-Analyte ELISArray Kits are designed to simultaneously profile the level of multiple cytokines and/or chemokines using the conventional and simple sandwich-based enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) technique. The 96-well ELISA microplate has been coated with a panel of twelve target-specific capture antibodies, one in each eight-well strip allowing you to obtain qualitative relative profiling results from up to six samples. Figure 1 displays the typical layout of a catalogued ELISArray Kit. Each kit also includes the corresponding detection antibodies, Antigen Standards, and a complete set of detection reagents for a colorimetric ELISA. The ELISArray Kits provide a rapid, simple and cost-effective solution for the assessment of protein expression changes for multiple protein targets in your experimental samples. We have screened commercially available antibodies to identify the capture and detection antibodies with the best sensitivity, best linearity and lowest background. All assays are optimized under uniform conditions to allow simultaneous detection with the same development or incubation time without compromising performance. Unlike other arraybased technologies, the ELISArray Kits enable you to analyze multiple protein targets without the need for special equipment. The Multi-Analyte ELISArray Kit uses a standard ELISA technique. Figure 2 displays an overview of the assay protocol. Incubation allows the capture antibodies to bind their specific protein of interest. After washing away unbound protein, biotinylated detection antibodies added to the wells also bind the captured analyte. After washing again to remove unbound material, an avidin-horseradish peroxidase conjugate is added. The wells are again washed and a colorimetric substrate solution is added, which produces a blue color in direct proportion to the amount of protein analyte present in the initial sample. The color development is stopped by adding stop solution, and the absorbance at 450 nm is read and compared across your samples.

Benefits of the Multi-Analyte ELISArray Kit: •

Multi-Protein Flexibility: Detect up to twelve cytokines or chemokines at once using the same incubation and development times.

•

High Performance: Profile with a high level of sensitivity and linearity with screened and verified capture and detection antibodies.

•

Ease of Use: No special equipment is required, only the ELISA plate reader already in your lab.

4

Cytokines 1 Negative Control

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Sample 1

B

Sample 2

C

Sample 3

D

Sample 4

E

Sample 5

F

Sample 6

G

Positive Control

H

Figure 1: Layout of Cataloged Multi-Analyte ELISArray Kits All wells of an eight-well strip are coated with the same capture antibody for the same cytokine or chemokine. A set of twelve strips in one ELISArray microplate therefore represents twelve cytokines or chemokines. See the information for the specific kit that you ordered for the list of proteins represented. The corresponding lettered wells of each row will characterize the same biological sample. Each ELISArray microplate therefore characterizes up to six biological samples plus positive and negative controls. 1. Prepare all reagents. Set up experimental samples, positive controls, and negative control. 2. Add 50 µl assay buffer into each well of ELISArray plate. Transfer 50 µl of samples and control samples into the appropriate wells of the ELISArray plate. Incubate 2 hours. 3. Wash three times. 4. Add 100 µl Detection Antibody Solution. Incubate 1 hour. 5. Wash three times. 6. Add 100 µl Avidin – HRP. Incubate 30 minutes. 7. Wash four times. 8. Add 100 µl Development Solution. Incubate 15 minutes in the dark. 9. Add 100 µl Stop Solution. Read OD 450 nm within 30 minutes.

Figure 2: Overview of the Multi-Analyte ELISArray Kit procedure. Total Time ~ 4.5 hours 5

II. Materials Provided: Component / Description Quantity BOX 1: Shipped on dry ice or blue ice packs. Store at -20 °C. Avidin-HRP Conjugate 1.5 ml tube 10% BSA 15 ml bottle Donkey Serum 15 ml bottle BOX 2: Shipped at ambient temperature. Store at 4 °C. 96-well pre-coated Capture Antibody microplate One plate carrying 12 x 8-well strips Detection Antibody Dilution Tube Strip One strip of 12 tubes Sample Dilution Buffer Stock 60 ml bottle Assay Buffer Stock 60 ml bottle Wash Buffer (10x Concentrate) 125 ml bottle Development Solution 25 ml bottle Stop Solution 60 ml bottle BOX 3: Shipped on dry ice or blue ice packs. Store at -20°C. 12 x 1.5 ml tubes Antigen Standards (1 g/mL) Detection Antibodies 12 x 1.5 ml tubes

Storage Conditions: Box 1 is shipped on dry ice or blue ice packs and should be stored in non-frost-free freezer at -20°C upon receipt. Box 2 is shipped at ambient temperature and should be stored at 4°C upon receipt. Box 3 is shipped on dry ice or blue ice packs and should be stored in non-frost-free freezer at -20°C upon receipt. Do not use kit beyond the expiration date printed on the label.

III. Additional Materials Required: 1. Standard ELISA Microplate Reader Capable of measuring 450 nm absorbance with a 570 nm correction wavelength 2. Calibrated Multi-Channel Pipettor 3. Wash Bottle 4. Microcentrifuge Tubes 5. Laboratory Timer 6. Culture Tubes

IV. Precautions 1. The Development Solution is toxic if inhaled or swallowed. Avoid contact with skin. Keep container tightly closed when not in use. 2. Stop Solution is an acidic solution. Wear eye, hand, face, and clothing protection when using this material.

V. Complementary Products: Single-Analyte ELISArray Kits

6

VI. Protocol: Please read through this entire protocol before beginning your experiment.

A. Sample Preparation and Handling: High quality input material is ESSENTIAL for obtaining good results. The most important prerequisite for any ELISA analysis experiment is consistent, highquality experimental samples. Therefore, the sample preparation and handling procedures are critical to the success of the experiment. Specimens should be clear, because residual traces of particulate matter, heme, lipids or other contaminants will interfere with the performance of the ELISA. 1. Recommended Preparation Methods: You will need roughly 650 l of each sample to complete the experiment. High quality protein samples for the ELISA experiment must be prepared using one of the following methods, each specific for your biological sample: a. Cell Culture Supernatants: Remove any particulate material by centrifugation for 10 minutes at 1000 x g and assay immediately, or aliquot and store samples at ≤-20°C. Avoid repeated freeze / thaw cycles. b. Serum: Use a serum separator tube and allow samples to clot for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 x g. Remove serum and assay immediately or store samples at ≤-20 °C. Avoid repeated freeze / thaw cycles. c. Plasma: Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as an anticoagulant. Within 30 minutes of collection, centrifuge for 10 minutes at 1000 x g. Assay immediately or store samples at ≤-20°C. Avoid repeated freeze / thaw cycles.

7

B. Reagent Preparation: Use only polypropylene tubes for the antigen and detection antibody steps. Briefly centrifuge any 1.5 ml tube in the kit before opening it in order to collect its contents at the bottom of the tube. 1.

ELISArray Kit Reagents: a. Thaw the 10% BSA and Donkey Serum at room temperature. Store on ice. b. Bring the Wash Buffer Concentrate, Assay Buffer Stock, Sample Dilution Buffer Stock and ELISArray plate to room temperature. Do not remove the ELISArray plate from its pouch at this time. c. Once finished with each reagent, return it to its proper storage conditions. d. Keep all other kit components at their recommended storage temperature until recommended by the protocol.

2.

Wash Buffer Visually inspect the Wash Buffer Concentrate to ensure that all components are in solution. If any precipitates are visible, briefly shake the bottle to suspend any precipitate. Dilute 50 ml of Wash Buffer Concentrate into de-ionized or distilled water (dH2O) to a final volume of 500 ml. Transfer to wash bottle. Keep at room temperature.

3.

Assay Buffer Dilute 0.6 ml of 10% BSA into a final volume of 30 ml with Assay Buffer Stock. Keep at room temperature.

4.

Sample Dilution Buffer: For cell culture supernatant samples, prepare Sample Dilution Buffer 1: Dilute 2 ml of 10% BSA into a final volume of 20 ml with Sample Dilution Buffer Stock. Store on ice. For serum or plasma samples, prepare Sample Dilution Buffer 2: Dilute 6 ml of Donkey Serum into a final volume of 20 ml with Sample Dilution Buffer Stock. Store on ice.

5. Sample Preparation If you wish to characterize dilutions of your samples to insure that the results are in the linear dynamic range of the assay, perform dilutions of your samples using the appropriate Sample Dilution Buffer.

8

C. Assay Procedure: NOTE: Very accurate and precise pipetting is critical to the reliability and consistency of any ELISA experiment. Make sure that all of your single- and multi-channel pipettors are calibrated before starting this protocol. Maintain incubation times and temperatures as consistent as possible across arrays and experiments for best results.

1. Generate an Antigen Standard Cocktail: a. Just before use, thaw the Antigen Standards on ice for 20 minutes. Vortex gently to mix well. b. In a single tube, prepare the Concentrated Antigen Standard Cocktail containing all 12 of the Antigen Standards by pipeting 10 l of each Antigen Standard into the same 880 l volume of the appropriate Sample Dilution Buffer to yield 1 ml of a Concentrated Antigen Standard Cocktail. NOTE: For Mix-N-Match ELISArrays see your Product Specification Sheet for Generating Antigen Standard Cocktail

c. Dilute 200 l of the concentrated Standard Antigen Cocktail into 800 l of the appropriate Sample Dilution Buffer for the final Antigen Standard Cocktail. 2. Remove the ELISArray plate from its pouch. Using a multi-channel pipettor, add 50 µl of Assay Buffer into each well of the ELISArray plate. NOTE: For best results, add all samples and reagents carefully by touching the pipette tips to the side of the wells just above the bottom and allowing the dispensed volume to run down the well wall. Do not blow out the last drop of volume dispensed to avoid introducing bubbles into the wells.

3. Add 50 l of the appropriate Sample Dilution Buffer into each well of Row A in the ELISArray plate to setup the negative control. NOTE: Change your pipette tips with every addition to avoid cross-contamination of the wells.

4. Add 50 l of each experimental sample or their dilutions to each well of their respective rows (B through G) in the ELISArray plate. 5. Add 50 l of the final Antigen Standard Cocktail into each well of Row H in the ELISArray plate to set up the positive control. 6. Cover the plate and gently shake or tap the plate for 10 seconds to mix. Incubate for 2 hours at room temperature on your bench-top. 7. Allow the Development Solution and Stop Solution to warm to room temperature in lab bench drawer protected from light. NOTE: Avoid prolonged exposure of the Development Solution to light or contact with water, air, or extreme temperature.

8. Dilute the Detection Antibodies just before the next step: a. Thaw the Detection Antibodies on ice for 30 minutes. b. Add 855 l of Assay Buffer to each tube of Detection Antibody. c. Mix well but gently. d. Transfer each detection antibody to its own empty tube of the Detection Antibody Dilution Tube Strip.

9

e. Be sure to add the Detection Antibodies to the tubes in the same left-to-right order as the capture antibodies in columns 1 through 12. See the Product Specification Sheet for the correct orientation. 9. Washing the ELISArray Plate: a. Decant or aspirate the contents of the wells. b. Wash wells by filling each well with 1x Wash Buffer (350 µl per well). c. Gently shake or tap the plate for 10 seconds to mix and follow by decanting or aspirating the solution. d. Blot the plate upside down on absorbent paper to remove any residual buffer. e. Repeat twice for a total of three washes. 10. Using a 12-channel pipettor, transfer 100 l of the dilute Detection Antibodies from the Dilution Tube Strip to the appropriate rows of the ELISArray plate. Cover the plate and gently shake or tap the ELISArray plate for 10 seconds to mix. Incubate for 1 hour at room temperature on your bench-top. NOTE: Be sure to correctly orient your Detection Antibody Dilution Tube Strip above row A of the ELISArray plate to transfer the correct Detection Antibody to its correct wells.

11. Prepare Avidin-HRP: Just before use, thaw the Avidin-HRP Conjugate on ice for 20 minutes. Vortex gently to mix well. Add 11 l of the Avidin-HRP Conjugate to 11 ml of Assay Buffer. NOTE: Avoid prolonged exposure of the Avidin-HRP Solution to light.

12. Wash ELISA wells as in step 9. 13. Add 100 l of dilute Avidin-HRP into all wells. Cover the plate and gently shake or tap the ELISArray for 10 seconds to mix. Incubate for 30 minutes at room temperature in the dark. 14. Wash ELISA wells as in step 9, except for a total of 4 washes. 15. Just before use, transfer 12 ml of the Development Solution from its original bottle into a clean multi-channel pipettor reservoir. NOTE: Use a different clean multi-channel reservoir for each solution to be dispensed.

16. Add 100 l of the Development Solution to each well. Incubate the plate for 15 minutes at room temperature in the dark. 17. Add 100 l of Stop Solution to each well in the same order as the Development Solution was added. The color in the wells should change from blue to yellow. 18.

Read absorbance at 450 nm within 30 minutes of stopping the reaction. If wavelength correction is available, subtract readings at 570 nm from the reading at 450 nm. NOTE: Subtracting the A450 reading by the A570 reading corrects for any minor optical imperfections in the ELISA plate. Uncorrected A450 readings may yield artificially high signals.

10

D. Data Analysis: 1. Processing the Raw Data a. Typical absorbance values should range from 0.00 to 2.50. Absorbance values greater than 2.50 are not within the linear range of the assay. Also, do not interpret absorbance values less then two times the negative control absorbance values for each antigen. b. For each antigen, subtract the observed absorbance by the absorbance of the negative control to obtain the corrected absorbance values. 2. Profiling Experiment a. For each antigen separately, compare the corrected absorbance values between samples to determine which cytokine or chemokine changes its protein level most or least dramatically. Be sure to account for any dilution of the samples. b. Follow up the profiling experiment with a more detailed analysis using the corresponding Single Analyte ELISArray Kit.

VII. Troubleshooting and FAQs For technical assistance and more information, please see our Technical Support Center at www.qiagen.com/Support or call one of the QIAGEN Technical Service Departments or local distributers (see back cover or visit www.qiagen.com).

11

Ordering Information Product

Contents

Cat. no.

Multi-Analyte ELISArray Kits

Antigen Standards, Detection Antibodies, Avidin-HRP Conjugate, 10% BSA, Donkey Serum, 96-Well Precoated Capture Antibody Microplate, Detection Antibody Dilution Tube Strip, Sample Dilution Buffer Stock, Assay Buffer Stock, 10x Wash Buffer, Development Solution, Stop Solution

Varies

For up-to-date licensing information and product-specific disclaimers, see the respective QIAGEN kit handbook or user manual. QIAGEN kit handbooks and user manuals are available at www.qiagen.com or can be requested from QIAGEN Technical Services or your local distributor

12

Notes

13

Notes

14

Trademarks: QIAGEN® (QIAGEN Group). LIMITED PRODUCT WARRANTY This warranty limits our liability to replace this product in the event the product fails to perform due to any manufacturing defect. QIAGEN makes no other warranties of any kind, expressed or implied, including without limitation, warranties of merchantability or fitness for a particular purpose. QIAGEN shall not be liable for any direct, indirect, consequential or incidental damages arising out of the use, the results of use or the inability to use this product. NOTICE TO PURCHASER Purchase of an ELISArray Kit does not grant rights to use the kit components for reproduction of any primer pair mix, to modify kit components for resale or to use the ELISArray Kit to manufacture commercial products without written approval of QIAGEN. No other license, expressed, implied or by estoppels, is granted. U.S. patents may cover the use of certain antibodies included in the ELISArray Kit. Presently, it is not clear under U.S. laws whether commercial users must obtain licenses from the owners of the rights to these U.S. patents before using the ELISArray Kit. Limited License Agreement Use of these products signifies the agreement of any purchaser or user of the Multi-Analyte ELISArray Kits to the following terms: 1.

The Multi-Analyte ELISArray Kits may be used solely in accordance with the Multi-Analyte ELISArray Handbook and for use with components contained in the Kits only. QIAGEN grants no license under any of its intellectual property to use or incorporate the enclosed components of these Kits with any components not included within these Kits except as described in the Multi-Analyte ELISArray Handbook and additional protocols available at www.qiagen.com.

2.

Other than expressly stated licenses, QIAGEN makes no warranty that these Kits and/or their use(s) do not infringe the rights of third-parties.

3.

These Kits and their components are licensed for one-time use and may not be reused, refurbished, or resold.

4.

QIAGEN specifically disclaims any other licenses, expressed or implied other than those expressly stated.

5.

The purchaser and user of these Kits agree not to take or permit anyone else to take any steps that could lead to or facilitate any acts prohibited above. QIAGEN may enforce the prohibitions of this Limited License Agreement in any Court, and shall recover all its investigative and Court costs, including attorney fees, in any action to enforce this Limited License Agreement or any of its intellectual property rights relating to these Kits and/or their components.

For updated license terms, see www.qiagen.com. © 2011 QIAGEN, all rights reserved.

www.qiagen.com Australia  Orders 1-800-243-800  Fax 03-9840-9888  Technical 1-800-243-066 Austria  Orders 0800-28-10-10  Fax 0800-28-10-19  Technical 0800-28-10-11 Belgium  Orders 0800-79612  Fax 0800-79611  Technical 0800-79556 Brazil  Orders 0800-557779  Fax 55-11-5079-4001  Technical 0800-557779 Canada  Orders 800-572-9613  Fax 800-713-5951  Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China  Orders 86-21-3865-3865  Fax 86-21-3865-3965  Technical 800-988-0325 Denmark  Orders 80-885945  Fax 80-885944  Technical 80-885942 Finland  Orders 0800-914416  Fax 0800-914415  Technical 0800-914413 France  Orders 01-60-920-926  Fax 01-60-920-925  Technical 01-60-920-930  Offers 01-60-920-928 Germany  Orders 02103-29-12000  Fax 02103-29-22000  Technical 02103-29-12400 Hong Kong  Orders 800 933 965  Fax 800 930 439  Technical 800 930 425 Ireland  Orders 1800 555 049  Fax 1800 555 048  Technical 1800 555 061 Italy  Orders 800-789-544  Fax 02-334304-826  Technical 800-787980 Japan  Telephone 03-6890-7300  Fax 03-5547-0818  Technical 03-6890-7300 Korea (South)  Orders 080-000-7146  Fax 02-2626-5703  Technical 080-000-7145 Luxembourg  Orders 8002-2076  Fax 8002-2073  Technical 8002-2067 Mexico  Orders 01-800-7742-639  Fax 01-800-1122-330  Technical 01-800-7742-436 The Netherlands  Orders 0800-0229592  Fax 0800-0229593  Technical 0800-0229602 Norway  Orders 800-18859  Fax 800-18817  Technical 800-18712 Singapore  Orders 1800-742-4362  Fax 65-6854-8184  Technical 1800-742-4368 Spain  Orders 91-630-7050  Fax 91-630-5145  Technical 91-630-7050 Sweden  Orders 020-790282  Fax 020-790582  Technical 020-798328 Switzerland  Orders 055-254-22-11  Fax 055-254-22-13  Technical 055-254-22-12 UK  Orders 01293-422-911  Fax 01293-422-922  Technical 01293-422-999 USA  Orders 800-426-8157  Fax 800-718-2056  Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737)

1062762 08/2011

Sample & Assay Technologies

Bijlage C

Titratie EB-stock CP3 Tabel C.1: Resultaten voor de titratie van de C. psittaci CP3 stock.

Verdunning

Aantal positieve glaasjes

10−1

1/1 1/1 1/1 1/1 2/2 3/3 4/4 4/4 3/4 4/4 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4

10−2 10−3 10−4 10−5 10−6 10−7 10−8 10−9 10−10 10−11 10−12 10−13 10−14 10−15 10−16 10−17 10−18 10−19 10−20

84

Bijlage D

ELISA Tabel D.1: De gemiddelde cytokineconcentraties en hun bijhorende standaardafwijkingen in ng/ml.

(ng/ml)

IL-1α

IL-1β

IL-6

IL-8

IL-10

12u-inf 12u-MOC 18u-inf 18u-MOC 24u-inf 24u-MOC 36u-inf 36u-MOC 48u-inf 48u-MOC 72u-inf 72u-MOC

0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000

0.0544 ± 0.048 0.0000 ± 0.000 0.0976 ± 0.083 0.0000 ± 0.000 0.1556 ± 0.008 0.0000 ± 0.000 0.1638 ± 0.093 0.0000 ± 0.000 0.2027 ± 0.043 0.2091 ± 0.222 0.2257 ± 0.060 0.0000 ± 0.000

0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.1210 ± 0.079 0.0000 ± 0.000 0.0576 ± 0.208 0.0000 ± 0.000

1.2144 ± 0.003 0.1840 ± 0.085 1.2508 ± 0.054 0.2116 ± 0.010 1.1046 ± 0.016 0.2611 ± 0.081 1.0160 ± 0.127 0.4509 ± 0.029 1.1038 ± 0.005 1.1603 ± 0.017 1.1889 ± 0.096 0.7415 ± 0.315

0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000

85

Bijlage D. ELISA

86

Tabel D.2: De gemiddelde cytokineconcentraties en hun bijhorende standaardafwijkingen in ng/ml (vervolg).

ng/ml

IL-12

IFN-γ

TNF-α

GM-CSF

2u-inf 12u-MOC 18u-inf 18u-MOC 24u-inf 24u-MOC 36u-inf 36u-MOC 48u-inf 48u-MOC 72u-inf 72u-MOC

0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000

0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000

0.2398 ± 0.222 0.0000 ± 0.000 0.5548 ± 0.344 0.0000 ± 0.000 0.8356 ± 0.177 0.0000 ± 0.000 1.6040 ± 0.750 0.0000 ± 0.000 2.0102 ± 0.226 1.0295 ± 0.408 1.6679 ± 0.174 0.0000 ± 0.000

0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0000 ± 0.000 0.0727 ± 0.119 0.0000 ± 0.000 0.1508 ± 0.126 0.0000 ± 0.000 0.1036 ± 0.029 0.0000 ± 0.000

Bijlage E

Infectiviteitstitratie

87

Bijlage E. Infectiviteitstitratie

88

Tabel E.1: Resultaten voor de infectiviteitstitratie van de ge¨ınfecteerde stalen.

Tijdstip staalname en verdunning

Infectie 1

Infectie 2

Infectie 3

12u

10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6

+ -

-

+ -

+ -

+ + -

+ + -

18u

10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6

+ + -

+ + -

+ -

+ + -

+ + -

+ + + -

24u

10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6

+ + + -

+ + + + -

+ + + + -

+ + + -

+ + + + -

+ + + -

36u

10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6

+ + + -

+ + + + -

+ + + + + -

+ + + + -

+ + + -

+ + + + -

48u

10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6

+ + + + + -

+ + + + -

+ + + + + -

+ + + + -

+ + + + + -

+ + + + + -

72u

10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6

+ + + + + -

+ + + -

+ + + + + -

+ + + + -

+ + + + + -

+ + + + + -

Bijlage F

Real Time PCR Tabel F.1: De gemiddelde X fold upregulation met bijhorende standaard deviatie.

2u 4u 8u 12u 18u 24u 36u 48u 72u

TLR1

TLR2

TLR3

TLR4

TLR6

118.83 ± 67.73 237.73 ± 69.42 21.89 ± 11.61 −0.78 ± 2.00 3.44 ± 1.57 4.80 ± 4.58 −0.42 ± 1.29 2.63 ± 5.16 2.65 ± 0.83

0.34 ± 2.96 −0.43 ± 2.26 −1.48 ± 0.03 −0.75 ± 1.66 4.32 ± 1.69 0.21 ± 2.24 −1.95 ± 0.87 0.55 ± 2.33 0.55 ± 1.62

3.99 ± 0.36 6.07 ± 0.96 −9.77 ± 11.29 −7.85 ± 6.33 −0.41 ± 2.93 −0.09 ± 2.44 −0.12 ± 2.35 −5.19 ± 9.09 2.03 ± 2.82

119.90 ± 48.32 2.27 ± 1.24 −10.62 ± 10.22 −1.99 ± 0.54 1.57 ± 0.65 −2.27 ± 0.88 −4.65 ± 1.91 −0.12 ± 3.00 −2.03 ± 0.54

21.19 ± 21.91 73.75 ± 67.64 −10.84 ± 6.90 −0.26 ± 1.34 3.92 ± 3.26 8.88 ± 5.96 −2.71 ± 4.16 −3.73 ± 7.17 2.34 ± 2.23

Tabel F.2: De gemiddeldeX fold upregulation met bijhorende standaard deviatie (vervolg).

2u 4u 8u 12u 18u 24u 36u 48u 72u

TLR9

NLRP3

ASC

RIG-1

NOD2

5.94 ± 2.05 7.80 ± 1.79 −14.13 ± 9.45 −5.83 ± 1.12 11.30 ± 15.98 10.87 ± 8.42 −0.91 ± 4.16 −11.23 ± 14.15 3.06 ± 1.84

18.54 ± 8.80 9.30 ± 4.83 −0.88 ± 2.88 −0.58 ± 1.48 2.80 ± 0.34 3.35 ± 5.08 0.60 ± 1.56 −0.10 ± 2.46 1.72 ± 0.14

17.24 ± 16.48 16.09 ± 15.40 −0.18 ± 2.62 −4.94 ± 3.29 −0.56 ± 1.65 8.58 ± 6.12 −3.86 ± 1.48 13.00 ± 7.06 −0.50 ± 1.44

18.12 ± 14.69 20.29 ± 17.79 −9.90 ± 7.84 −0.91 ± 2.20 7.95 ± 8.17 7.93 ± 7.38 0.40 ± 1.47 4.28 ± 4.57 3.58 ± 2.22

55.80 ± 32.71 4.09 ± 0.65 −6.33 ± 4.13 −34.81 ± 18.11 7.01 ± 14.45 0.10 ± 1.56 −0.39 ± 1.67 −1.60 ± 3.85 1.88 ± 0.67

89

Onderzoek naar de aangeboren immuunrespons van Chlamydia psittaci in humane macrofagen

Recommend Documents