Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2011 – 2012
Detectie en epidemiologie van Chlamydia psittaci op Belgische kippenbedrijven
Ellen Audenaert Promotor: Prof. dr. Daisy Vanrompay Tutor: Stefanie Lagae
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Cel- en genbiotechnologie
Auteursrecht De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. Toestemming om bepaalde delen van dit werk openbaar te maken in enige vorm moet aangevraagd worden bij de auteur zelf.
7 juni, 2012
De promotor,
De auteur,
Prof. dr. D. Vanrompay
Ellen Audenaert
II
DANKWOORD Twee jaar geleden had ik niet kunnen denken dat ik aan een tweede thesis zou zijn begonnen… Zonder de steun van vele mensen zou me dit, ook deze keer, niet gelukt zijn. Daarom zou ik op de eerste plaats mijn promotor prof. dr. Daisy Vanrompay willen bedanken die mij de mogelijkheid heeft geven deze thesis uit te voeren in het laboratorium voor Immunologie en Biotechnologie van de Dierlijke Cel. Stefanie Lagae, bedankt voor je begeleiding, het geduld, het aanbrengen van verbeteringen en de motivatie tijdens mijn onderzoek. Ik wil ook alle mensen van het labo bedanken, in het bijzonder Leentje, Kristien, Evelien, Isabelle en Annelien voor alle praktische tips en hulp. Onder het motto gedeelde smart is halve smart mag ik zeker mijn mede-thesissers niet vergeten: Lien, Lien, Eveline, Silke, Bieke, Sofie en Magali! Zoals beloofd, speciaal voor Lien De Vogelaere, nog een extra aparte vermelding ! Ik wil ook mijn ouders bedanken die altijd voor me klaar stonden en me dagelijks meer dan 100% hebben gesteund, gemotiveerd en geholpen (jaja, ook om me ’s morgens te roepen om op te staan! ;-). Last but not least wil ik mijn familie (Frank, Sandra, Peter) en vrienden bedanken die me het thesisleven even lieten vergeten. Ik denk hierbij aan de kleine Jari, die waterwormen aan het zoeken was in het gras; Bernd voor het lekkere koken en me steeds te willen helpen met die wiskunde; Mieke en Eva voor jullie fijne gezelschap op de pastateams en de wekelijkse spinning; Nathalie voor de vele rondjes skeeleren en om m’n drang van dessertjesmaken en het winkelen mee te delen (en het nalezen natuurlijk); Liesbeth, Leentje & Kristien voor jullie opbeurende (telefoon)gesprekken; Julie & Amelie voor jullie eeuwige optimisme; Toon, mijn enige mede-student en thesisser op kot; dé collega’s (en Kathleen) voor het ter beschikking stellen van jullie PC en het gezelschap ‘s middags (en Arno, niet vergeten de groetjes te doen aan Elise!) en aan oom Walther: nee, zelfs met dit diploma heb ik geen groene vingers gekregen. In het bijzonder nog een speciale vermelding voor Timothy, tja, wat zou ik toch doen zonder jou. Bedankt! Ellen Audenaert
III
INHOUDSOPGAVE Afkortingenlijst ................................................................................................................................................... 1 Samenvatting ...................................................................................................................................................... 2 1
Literatuurstudie .................................................................................................................................. 3
1.1
Chlamydiaceae ................................................................................................................................... 3
1.1.1
Algemeen ........................................................................................................................................... 3
1.1.2
Classificatie ......................................................................................................................................... 3
1.1.3
Morfologie.......................................................................................................................................... 4
1.1.4
Ontwikkelingscyclus............................................................................................................................ 5
1.1.5
Kenmerken Chlamydiaceae ................................................................................................................ 6
1.1.5.1
Energieparasieten............................................................................................................................... 6
1.1.5.2
Membraan van de Chlamydiaceae ...................................................................................................... 7
1.1.6
Gastheren en pathogenese ................................................................................................................. 7
1.1.6.1
Chlamydia trachomatis ....................................................................................................................... 7
1.1.6.2
Chlamydia suis .................................................................................................................................... 7
1.1.6.3
Chlamydia muridarum ........................................................................................................................ 8
1.1.6.4
Chlamydia felis ................................................................................................................................... 8
1.1.6.5
Chlamydia caviae................................................................................................................................ 8
1.1.6.6
Chlamydia abortus.............................................................................................................................. 8
1.1.6.7
Chlamydia pecorum ............................................................................................................................ 8
1.1.6.8
Chlamydia pneumoniae ...................................................................................................................... 8
1.1.6.9
Chlamydia psittaci .............................................................................................................................. 9
1.2
Chlamydia psittaci .............................................................................................................................. 9
1.2.1
Algemeen ........................................................................................................................................... 9
1.2.2
Serovars en genotypes...................................................................................................................... 10
1.2.3
Epidemiologie ................................................................................................................................... 11
1.2.4
Detectie ............................................................................................................................................ 12
1.2.4.1
Cultuur gebaseerde methodes .......................................................................................................... 12 IV
1.2.4.2
Serologie .......................................................................................................................................... 12
1.2.4.3
Moleculaire detectie ......................................................................................................................... 13
1.2.5
Behandeling...................................................................................................................................... 13
1.2.6
Preventie en controle ....................................................................................................................... 13
2
Doel .................................................................................................................................................. 15
3
Materiaal en Methode ...................................................................................................................... 16
3.1
Celkweek .......................................................................................................................................... 16
3.1.1
Supplementen en oplossingen voor celkweek .................................................................................. 16
3.1.1.1
L-glutamine ...................................................................................................................................... 16
3.1.1.2
Hitte geïnactiveerd feutaal kalfsserum (H.I. FCS) .............................................................................. 16
3.1.1.3
Vancomycine .................................................................................................................................... 16
3.1.1.4
Vitamines ......................................................................................................................................... 16
3.1.1.5
Streptomycine .................................................................................................................................. 16
3.1.1.6
Trypsine-EDTA .................................................................................................................................. 16
3.1.1.7
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) ............................................................................................ 16
3.1.2
Media celkweek................................................................................................................................ 16
3.1.2.1
Minimaal Essentieel Medium (MEM) voor BGM cellen ..................................................................... 16
3.1.2.2
compleet Minimaal Essentieel Medium (cMEM) voor BGM cellen .................................................... 17
3.1.2.3
THP1 medium ................................................................................................................................... 17
3.1.3
BGM cellen ....................................................................................................................................... 17
3.1.3.1
Initiatie BGM cultuur ........................................................................................................................ 17
3.1.3.2
Splitsen BGM cellen .......................................................................................................................... 17
3.1.4
THP1 cellen ....................................................................................................................................... 18
3.1.5
Cellen tellen: BGM en THP1 cellen .................................................................................................... 18
3.2
Chlamydia psittaci stockproductie in BGM cellen ............................................................................. 18
3.2.1
Supplementen voor stockproductie .................................................................................................. 19
3.2.1.1
Cycloheximide .................................................................................................................................. 19
3.2.1.2
Fungizone ......................................................................................................................................... 19
V
3.2.1.3
Glucose-oplossing ............................................................................................................................. 19
3.2.1.4
Overige supplementen en oplossingen ............................................................................................. 19
3.2.2
Media celkweek en buffers ............................................................................................................... 19
3.2.2.1
compleet Chlamydia kweekmedium (cCKM) ..................................................................................... 19
3.2.2.2
Compleet THP1 medium ................................................................................................................... 19
3.2.2.3
Sucrose-fosfaat-glutamaat buffer (SPG) ............................................................................................ 19
3.2.2.4
20 mM Tris-waterstofchloride – 150 mM kaliumchloride.................................................................. 19
3.2.3
Inoculatie van BGM cellen met C. psittaci ......................................................................................... 20
3.2.4
Directe immunofluorescentiekleuring (DIF) ...................................................................................... 20
3.2.5
Vrijstellen van de EBs/RBs ................................................................................................................ 20
3.2.6
Opzuivering van de EB en RB Stock volgens de methode van Timms: discontinue gradiëntcentrifugatie met urografine-76 ............................................................................................................................ 21
3.2.7
Bepaling titer van de C. psittaci EB stock........................................................................................... 22
3.3
Tunel experiment ............................................................................................................................. 22
3.4
Staalname voor ELISA, infectiviteitstitratie en real-time PCR ............................................................ 23
3.4.1
Oplossingen ...................................................................................................................................... 23
3.4.1.1
SPG
3.4.1.2
Phorbol 12-myristaat 13-acetate (PMA) ........................................................................................... 23
3.4.1.3
Glucose-oplossing ............................................................................................................................. 23
3.4.2
Inoculatie voor ELISA, infectiviteitstitratie en real-time PCR ............................................................. 23
3.4.3
ELISA ................................................................................................................................................ 24
3.4.4
Infectiviteitstitratie ........................................................................................................................... 24
3.4.5
Real-time PCR ................................................................................................................................... 24
3.4.5.1
RNA extractie ................................................................................................................................... 24
3.5
Enveloppe studie: PCR analyse ......................................................................................................... 25
3.5.1
Oplossingen ...................................................................................................................................... 25
3.5.1.1
Kloonanalysebuffer (KAB) ................................................................................................................. 25
3.5.1.2
STD buffer ........................................................................................................................................ 25
3.5.1.3
DNA stabilisatiebuffer ....................................................................................................................... 25
............................................................................................................................................ 23
VI
3.5.1.4
Ladingsbuffer .................................................................................................................................... 26
3.5.1.5
Tris-boor-EDTA-buffer (TBE) (20x) stockoplossing ............................................................................. 26
3.5.1.6
TBE-buffer (0,5x)............................................................................................................................... 26
3.5.2
DNA isolatie uit swabs ...................................................................................................................... 26
3.5.3
Nested PCR voor diagnostiek van C. psittaci: ronde 1 ....................................................................... 26
3.5.4
Nested PCR voor diagnostiek van C. psittaci: ronde 2 ....................................................................... 27
3.5.5
Gelelektroforese ............................................................................................................................... 28
3.5.5.1
Gel bereiden ..................................................................................................................................... 28
3.5.5.2
Gelelektroforese ............................................................................................................................... 28
3.6
Enveloppestudie: Isolatie C. psittaci.................................................................................................. 28
3.6.1
Oplossingen ...................................................................................................................................... 28
3.6.1.1
Transportmedium ............................................................................................................................. 28
3.6.1.2
Vancomycine voor transportmedium ............................................................................................... 28
3.6.2
Detectie C. psittaci in swabs ............................................................................................................. 28
4
Resultaten ........................................................................................................................................ 29
4.1
Enveloppestudie ............................................................................................................................... 29
4.1.1
PCR ................................................................................................................................................... 29
4.1.2
Isolatie.............................................................................................................................................. 30
4.1.3
Scores van de isolatie ....................................................................................................................... 31
4.1.4
Enquêtes .......................................................................................................................................... 31
4.2
THP1 cellen ....................................................................................................................................... 36
4.2.1
Apoptose .......................................................................................................................................... 36
4.2.2
Infectiviteitstitratie ........................................................................................................................... 36
5
Discussie ........................................................................................................................................... 37
5.1
Enveloppestudie ............................................................................................................................... 37
5.2
THP1 cellen ....................................................................................................................................... 40
5.2.1
Apoptose .......................................................................................................................................... 40
5.2.2
Infectiviteitstitratie ........................................................................................................................... 41
VII
6
Conclusie en toekomstperspectieven ............................................................................................... 42
7
Literatuurlijst .................................................................................................................................... 43
VIII
AFKORTINGENLIJST
Afkorting
Betekenis
BGM
Buffalo Green Monkey
cCKM CFT cMEM Cfsph DIF EB EDTA
compleet chlamydia kweekmedium Complement fixatie test compleet minimaal essentieel medium Center for food security and public health Directe immunofluorescentiekleuring Elementair lichaam Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
ELISA FITC-dUTP H.I. FCS IB
Enzyme linked immunosorbent assay Fluoresceïne geconjugeerd deoxyuridinetrifosfaat Hitte geïnactiveerd feutaal kalfsserum Intermediair lichaam
KAB LGV LPS
Kloonanalysebuffer Lymfogranuloma venereum Lipopolysacchariden
mAb MIF MOI MOMP MoPn PBS PMA
Monoclonaal antilichaam Micro-immunofluorescentie Multiplicity of infection Major outer membraan eiwit Muis pneumonitis biovar Fosfaat gebufferde zoutoplossing Phorbol 12-myristAat 13-acetate
RB RFLP
Reticulair lichaam Restrictie fragment lengte polymorfisme
SPG TBE TdT TUNEL VS
Sucrose-fosfaat-glutamaat buffer Tris-boor-EDTA-buffer Terminaal deoxynucleotidyl enzyme TdT-mediated dUTP nick end labeling Variabel segment
VAZG
Vlaams Agentschap Zorg en Gezondheid
1
SAMENVATTING Chlamydia psittaci is een obligaat intracellulaire, Gram-negatieve bacterie waarvan negen genotypes gekend zijn (A-F, E/B, WC en M56). De bacterie is reeds vastgesteld in minimaal 465 vogelspecies. Een infectie van C. psittaci in vogels, aviaire chlamydiose, wordt meestal gekarakteriseerd door ademhalingsproblemen maar kan ook asymptomatisch verlopen. De geïnfecteerde dieren scheiden C. psittaci uit via nasale, orale en faecale secreties. Zoönotische overdracht van C. psittaci naar de mens is reeds aangetoond. Bij infectie van de mens spreekt men van psittacose. De symptomen van psittacose zijn voornamelijk geassocieerd met ademhalingsproblemen. Infecties met C. psittaci kunnen enkel behandeld worden met antibiotica aangezien er geen vaccin beschikbaar is. Het ontbreken van specifieke symptomen bij aviaire chlamydiose vormt een groot risico voor zoönotische overdracht naar onder meer werknemers op pluimveebedrijven. In een eerste luik van deze thesis werd daarom een epidemiologisch studie verricht naar het voorkomen van C. psittaci op Belgische kippenbedrijven. Via isolatie en nested PCR werd C. psittaci gedetecteerd bij 86,3% van de onderzochte kippen en in 87,5% van de onderzochte werknemers werden Chlamydiaceae aangetoond. De belangrijkste conclusies uit deze studie werden reeds in de literatuur vastgesteld. Ten eerste lijkt isolatie gevoeliger te zijn voor de detectie van C. psittaci in veldstalen dan nested PCR. Ten tweede wordt het endemisch voorkomen van C. psittaci op pluimveebedrijven bevestigd. C. psittaci vormt een belangrijke kostenpost voor pluimveehouders, een effectief vaccin is dus nodig. Ten slotte lijkt zoönotische overdracht van C. psittaci van kippen naar werknemers op te treden, genotypering van de isolaten is echter noodzakelijk om dit vermoeden te bevestigen. Wegens het risico op zoönotische overdracht zijn maatregelen voor de controle van aviaire chlamydiose noodzakelijk om psittacose bij mensen te voorkomen. In een tweede luik van de thesis werd de virulentie en het vermogen om celdood te induceren van C. psittaci 92/1293 in humane macrofagen nagegaan. Uit in vitro studies blijkt dat C. psittaci 92/1293 heel virulent is voor kippenmacrofagen. Bij humane macrofagen lijkt dit ook zo te zijn. Daarnaast lijkt C. psittaci 92/1293 geen celdood te induceren in humane macrofagen. Verder onderzoek hieromtrent is nog nodig.
2
1 1.1
LITERATUURSTUDIE CHLAMYDIACEAE
1.1.1 ALGEMEEN Chlamydiae zijn Gram-negatieve, obligaat intracellulaire bacteriën die beschikken over een unieke ontwikkelingscyclus waarin wordt afgewisseld tussen een infectieuze en een vegetatieve vorm. Daarnaast zijn chlamydiae verantwoordelijk voor een reeks acute en chronische infecties bij zowel mens als dier (Holst et al., 1991).
1.1.2 CLASSIFICATIE Door de toenemende kennis van morfologie, ontwikkeling, biologie en moleculaire data is de taxonomische status van chlamydiae doorheen de tijd sterk veranderd (Moulder, 1966; Beeckman, 2009; Vanrompay et al., 1995a). Voor de reclassificatie in 1999 werden chlamydiae geplaatst in een aparte orde; de Chlamydiales. Deze orde omvatte de familie Chlamydiaceae en het genus Chlamydia met de species C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae en C. pecorum. Op basis van 16S en 23S ribosomale homologie werd in 1999 de orde Chlamydiales opgesplitst in twee genera: Chlamydia en Chlamydophila (Everett et al., 1999). Tevens werden er drie extra families geïntroduceerd: Parachlamydiaceae, Simkaniaceae (Everett et al., 1999) en de Waddliaceae (Rurangirwa et al., 1999). Deze opsplitsing binnen de familie van de Chlamydiaceae werd niet geaccepteerd door wetenschappers. Dit kwam omdat ze slechts gebaseerd was op sequentiehomologie. Verder leverde ze geen praktische bijdrage omdat er tussen de nieuwe genera geen biologisch verschil was (Schachter et al., 2001). Aldus werd in 2009 het voorstel naar voor gebracht voor de hereniging van Chlamydia en Chlamydophila tot Chlamydia (Stephens et al., 2009).
Figuur 1-1: Huidige taxonomie van de orde Chlamydiales (Wheelhouse and Longbottom, 2011).
3
Begin 2011 werd dit goedgekeurd (Wheelhouse and Longbottom, 2011). De orde Chlamydiales omvat nu de familie Chlamydiaceae en het genus Chlamydia waartoe negen species behoren; C. trachomatis, C. muridarum, C. suis, C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. abortus, C. caviae en C. felis (Figuur 1-1).
1.1.3 MORFOLOGIE Er bestaan morfologisch drie verschillende vormen van Chlamydiaceae: het elementair lichaam (EB), het reticulair lichaam (RB) en het intermediair lichaam (IB) (Figuur 1-2). De EB is een klein elektronendens sferisch lichaam met een diameter van 0,2 à 0,5 μm. De EB is metabolisch inactief. Dit is ook te zien aan het bacteriële nucleoïd dat zeer compact is door de condensatie van het nucleaire materiaal via bacteriële histonachtige eiwitten zoals HctA en HctB (Abdelrahman and Belland, 2005). De EB is infectieus en dringt, na vasthechting, de cellen binnen. Het vormt er een membraan omsloten vacuole, de inclusie. Na een groeifase zal de EB zich omvormen tot de metabolisch actieve RB. In tegenstelling tot de EB kan de RB niet overleven in de extracellulaire omgeving. De differentiatie van EB naar RB gaat gepaard met de ontwinding van het chromatine waardoor transcriptie mogelijk wordt. Daarnaast is de RB groter dan de EB en meet in diameter ongeveer 0,5 à 1,5 μm. Via binaire fissie zal de RB een intravacuolaire inclusie vormen waarin RBs matureren tot nieuwe EBs. Tijdens deze maturatie kan de morfologisch intermediaire vorm (IB) worden geobserveerd. De IB is ongeveer 0,3-1 μm groot en heeft een centrale elektronendense kern waarrond de nucleoïdvezels radiaal zijn geschikt. Cytoplasmatische granules zijn dens gepakt ter hoogte van de periferie van de IB (Andersen and Vanrompay, 2003).
Figuur 1-2: Elektronenmicroscopisch beeld van een inclusie van C. psittaci in geïnfecteerde L929 cellen waarin de verschillende morfologische vormen van Chlamydiaceae zichtbaar zijn; EB, IB en RB. Figuur overgenomen uit (Andersen and Vanrompay, 2003).
4
1.1.4 ONTWIKKELINGSCYCLUS De ontwikkelingscyclus van Chlamydiaceae is een complex proces dat bestaat uit verschillende stappen. De cyclus start met de vasthechting van de EBs aan de eukaryote gastheercel waarna de EB in de cel internaliseert. Vervolgens differentieert de EB tot RB, repliceert en verlaat finaal de cel na lyse van de cel of via exocytose (Figuur 1-3).
Figuur 1-3: De basiscyclus van Chlamydiaceae omvat de volgende stadia: 1) Aanhechting en internalisatie van de EBs; 2) Differentiatie van EB tot RB; 3) Bacteriële replicatie en vorming van de inclusie; 4) Expansie van de inclusie en transitie van RB tot EB; 5) Vrijstelling van de bacteriën uit de gastheercel en infectie van nieuwe gastheercellen door EBs (Cocchiaro and Valdivia, 2009; Andersen and Vanrompay, 2003).
Moleculair gezien is de vasthechting van C. psittaci aan de gastheercel een tweestapsproces. Initieel is het contact reversibel en gebeurt via elektrostatische interacties van de bacterie met heparaansulfaat bevattende glycosaminoglycanen op de cel. Hierop volgt een tweede irreversibele binding, de receptoren van deze interactie zijn echter nog niet geïdentificeerd (Dautry-Varsat et al., 2005; Abdelrahman and Belland, 2005). Voor de internalisatie worden er twee mogelijke mechanismes voorgesteld. Het eerste mechanisme maakt gebruik van een zipper-achtig microfilament afhankelijke fagocytose. De receptoren voor de internalisatie bevinden zich waarschijnlijk in cholesterolrijke membranen, de lipid rafts. Door het zippermechanisme wordt een signaleringspathway geactiveerd in de cel waardoor het cytoskelet van de cel wordt herschikt en internalisatie mogelijk wordt. Het tweede mechanisme maakt gebruik van een receptorgemedieerde endocytose met de vorming van clathrine coated pits. Tijdens het internalisatieproces worden er effector eiwitten getransloceerd in de gastheercel via het type drie secretiesysteem (Beeckman, 2009). Het type drie secretiesysteem is een belangrijk eiwitcomplex waarmee Gram-negatieve bacteriën eiwitten, de effectoren, actief kunnen secreteren (Beeckman, 2009). Ongeveer één à drie uur na de internalisatie bevinden de EBs zich in membraan afgeleide niet-verzuurde vacuoles, inclusies genaamd, die omringd worden door talloze mitochondria (Figuur 1-4 B). Kinesine speelt mogelijks een rol in het rekruteren van de mitochondria naar de inclusie (Escalante-Ochoa et al., 1999; Vanrompay et al., 1996). Dit is noodzakelijk voor C. psittaci aangezien deze niet in staat is om zichzelf van ATP te voorzien. De inclusies vermijden fagolysosomale fusie en bewegen naar de nuleaire regio in ongeveer acht à twaalf uur, waar ze zich omvormen tot RB. Tijdens het omvormingsproces worden de zwavelbruggen van de buitenste membraaneiwitten van de EB gereduceerd en wordt DNA, RNA en eiwitsynthese geïnitieerd.
5
Dit veroorzaakt groei en binaire fissie van de RBs. Binaire fissie vertoont karakteristiek een zandloper profiel in de vacuole zoals te zien is in Figuur 1-4 C. Naarmate de ontwikkelingscyclus vordert, vergroot de inclusie door het toenemende aantal bacteriën. Een inclusie kan wel 100 tot 500 organismen bevatten. Ongeveer 30 uur na internalisatie van de EBs, vormen de eerste RBs zich weer om tot EB welke opnieuw infectieus zijn (Figuur 1-4 D). Bij de meeste C. psittaci stammen wordt C. psittaci vrijgesteld door lyse, hoewel exocytose ook reeds is vastgesteld (Figuur 1-4 E) (Andersen and Vanrompay, 2003). In het geval van persistentie wordt afgeweken van deze ontwikkelingscyclus. Persistente Chlamydiaceae zijn niet in staat om de ontwikkeling van RB naar infectieuze EB te volbrengen, maar blijven metabolisch actief. Persistente RBs hebben een afwijkende morfologie; ze zijn ovaal, sterk vergroot en vormen kleine inclusies. Omdat ze continu DNA repliceren en niet delen, accumuleren ze chromosomen. De persistente vormen zijn geassocieerd met chronische infecties. Persistente RBs kunnen zich terug omvormen tot normale RBs en infectieuze EBs. Hoe Chlamydiaceae tussen de normale en de persistente vorm afwisselen is onbekend (Belland et al., 2003; Hogan et al., 2004; Harkinezhad et al., 2009a).
Figuur 1-4: (A) Buffalo Green Monkey (BGM) cellen één uur na inoculatie met C. psittaci; een EB heeft zich vastgehecht aan een microvillus. (B) BGM cellen met een membraan omgeven geïnternaliseerde EB die wordt omringd door mitochondria (M) (één uur na inoculatie met C. psittaci). (C) Een BGM cel, 18 uur na inoculatie met C. psittaci. Merk de inclusie op met delende RBs die worden gekarakteriseerd door een zandloper profiel (H) nabij de nucleus (N) van de BGM cel. (D) Een BGM cel 52 uur na inoculatie met C. psittaci. Merk de grote inclusies op en de elementaire lichaampjes die de inclusie schijnbaar proberen te verlaten. (E) BGM cellen, 50 uur na inoculatie met C. psittaci. Merk de aanwezigheid van RBs, IBs en EBs op. Figuren overgenomen en bewerkt uit (Andersen and Vanrompay, 2003; Vanrompay et al., 1996).
1.1.5 KENMERKEN CHLAMYDIACEAE 1.1.5.1 ENERGIEPARASIETEN Chlamydiaceae zijn obligaat intracellulaire bacteriën. Dit is te verklaren doordat Chlamydiaceae slechts beschikken over een gedeelte van de energetische pathways (glycolytische-, pentosefosfaat- en citroenzuurpathway) en sommige biosynthetische pathways ontbreken. Zo missen ze de enzymen voor het genereren van ATP. In deze context worden Chlamydiaceae ook energieparasieten genoemd, omdat ze voor hun ontwikkeling afhankelijk zijn van de actieve mitochondriën van de gastheercel (Becker, 1996; Stratton, 2000).
6
1.1.5.2 MEMBRAAN VAN DE CHLAMYDIACEAE Hoewel Chlamydiaceae behoren tot de Gram-negatieve bacteriën, wordt er in hun celwand nauwelijks peptidoglycaan gedetecteerd. Nochtans beschikken ze wel over de enzymen voor peptidoglycaansynthese (McCoy and Maurelli, 2006). Inter- en intramoleculaire zwavelbruggen tussen het major outer membraan eiwit (MOMP) en lipopolysacchariden (LPS) zijn verantwoordelijk voor het behoud van de structurele stabiliteit van het membraan (Perez Melgosa et al., 1991; Kosma, 1999). Daarnaast spelen MOMP en LPS een belangrijke rol bij infectie van de gastheercel (Holst et al., 1991). MOMP is een cysteïnerijk oppervlakte-eiwit van bijna 40 kDa dat ongeveer 60% van het totaal aantal oppervlakte-eiwitten in bacteriën uitmaakt (Caldwell et al., 1981). Het wordt gecodeerd door het ompA gen. Naast een structurele functie heeft MOMP een belangrijke functie als porine (Hackstadt et al., 1985). Porines zijn membraankanalen die algemeen worden teruggevonden in het buitenste membraan van Gram-negatieve bacteriën. Ze dienen als kanaal voor het uitwisselen van nutriënten, afvalstoffen en antibiotica maar ook als receptor voor bacteriofagen (Wang et al., 2006). Via structurele studies (Caldwell and Judd, 1982), monoclonale antilichamen (Matikainen and Terho, 1983) en vergelijkende sequentieanalyse van de MOMP genen (Dean et al., 1991), werden vier variabele segmenten in het MOMP (VS1-VS4) onderscheiden (Stephens et al., 1988). Antilichamen gericht tegen de meest immunodominante epitopen (VS1, VS2 en VS4) zijn in staat zijn om infecties met Chlamydiaceae te neutraliseren. Daarnaast kunnen species- en subspecies-specifieke epitopen worden bepaald via de VS4 epitoop (Conlan et al., 1989). Het tweede voornaamste antigen op het bacteriële oppervlak is LPS. LPS is een glycolipide van ongeveer 10 kDa dat bestaat uit drie covalent verbonden delen: het lipide A, een kern met polysacchariden en het O-antigen. Lipide A is verantwoordelijk voor de verankering van LPS in het buitenste bacteriële membraan. Het kerngedeelte bevat onder meer ketodeoxyoctonaat (Kdo), heptoses, ethanolamine, N-acetylglucosamine, glucose en galactose (Milton and Kwang-Shin, 1996). Het specifieke epitoop van het Kdo is αKdo-(2→8)-αKdo(2→4)-αKdo tri-saccharide, dit epitoop komt voor bij alle species van de familie Chlamydiaceae (Lobau et al., 1995). Het O-antigen is een polysaccharideketen met species-specifieke monosacchariden (Milton and KwangShin, 1996).
1.1.6 GASTHEREN EN PATHOGENESE 1.1.6.1 CHLAMYDIA TRACHOMATIS C. trachomatis omvat twee humane biologische varianten (biovars): trachoma en lymfogranuloma venereum (LGV). Hierbij omvat de biovar trachoma op zich nog eens veertien serologische varianten (serovars) en de biovar LGV vier serovars. Deze serovars kunnen onder meer infectieuze blindheid (trachoma), bindvliesonsteking (conjunctivitis), longontsteking (pneumonia) en de seksueel overdraagbare aandoening LGV veroorzaken. De meeste species van C. trachomatis worden herkend door monoclonale antilichamen (mAb) tegen het VS4 epitoop in MOMP, hoewel deze mAb ook kunnen kruisreageren met C. suis of C. muridarum (Everett, 2000).
1.1.6.2 CHLAMYDIA SUIS C. suis is alleen nog maar geïsoleerd uit varkens waar ze conjunctivitis, enteritis, peumonie en een hoge incidentie aan schijnbaar asymptomatische infecties veroorzaakt. Sommige species zijn resistent aan sulfadiazine en/of tetracycline. Verschillende species bevatten een extrachromosomaal plasmide.
7
1.1.6.3 CHLAMYDIA MURIDARUM Twee stammen van C. muridarum; muis pneumonitis biovar (MoPn) en SFPD zijn reeds geïsoleerd uit respectievelijk muis en hamster. SFPD is voor zover bekend niet in staat om ziekte te veroorzaken. Een infectie met MoPn is asymptomatisch of kan een pneumonie veroorzaken in muizen. MoPn is gevoelig voor sulfadiazine (Everett, 2000).
1.1.6.4 CHLAMYDIA FELIS C. felis is endemisch bij huiskatten en veroorzaakt voornamelijk conjunctivitis, rhinitis en respiratoire problemen. Zoönotische overdracht op de mens is ook al vastgesteld (Schachter et al., 1969; Everett, 2000).
1.1.6.5 CHLAMYDIA CAVIAE C. caviae infecteert voornamelijk het mucosale epitheel en is opvallend specifiek voor cavia’s. Alle gekende isolaten beschikken over een identieke ompA sequentie (Everett, 2000).
1.1.6.6 CHLAMYDIA ABORTUS C. abortus is lang gekarakteriseerd geweest als zijnde C. psittaci. De pathogenese van C. abortus is echter niet dezelfde; C. abortus koloniseert namelijk de placenta. Initiële symptomen zijn niet specifiek zoals koorts, hoofdpijn, duizeligheid en overgeven. Abortus vindt meestal kort na het verschijnen van de klinische symptomen plaats. C. abortus is endemisch bij herkauwers en is geassocieerd met abortus bij paarden, konijnen, cavia’s, muizen en varkens (Everett, 2000; Cfsph (Center for food security and public health), Avian Chlamydiosis, 2009).
1.1.6.7 CHLAMYDIA PECORUM C. pecorum is pathologisch en serologisch zeer divers en veroorzaakt infecties bij verschillende zoogdieren waaronder rundvee, schapen en geiten, koala’s en varkens. De infecties leiden tot abortus, conjunctivitis, hersenvliesontsteking, enteritis, pneumonia en polyartritis. Infecties met C. pecorum veroorzaken bij koala’s afwijkingen bij de voortplanting en urinewegontstekingen. Infectieuze Chlamydiaceae worden waarschijnlijk via de faeces verspreid (Everett, 2000; Cfsph, Avian Chlamydiosis, 2009).
1.1.6.8 CHLAMYDIA PNEUMONIAE C. pneumoniae omvat drie biovars namelijk TWAR, Koala en Equine. TWAR infecteert mensen, Koala en Equine infecteren respectievelijk koala’s en paarden. De benaming TWAR is gebaseerd op de namen van de twee originele isolaten; Taiwan (TW-183) en acuut ademhalings-isolaat genaamd AR-39 (Microbiology and immunology online, 2010). TWAR is in eerste instantie een respiratoire pathogeen die longontsteking of bronchitis veroorzaakt bij jongeren en jong volwassenen, bij ouderen worden hevigere ziektesymptomen veroorzaakt. C. pneumonia wordt ook geassocieerd met onder meer atherosclerose, Alzheimer en acute en chronische ademhalingsziekten. Koala-isolaten werden geïsoleerd uit het oculair en urogenitale stelsel en zijn niet zeer pathogeen. Van het Equine C. pneumoniae isolaat is enkel een respiratoir isolaat beschikbaar (Everett, 2000; EMBL-EBI, 2011).
8
1.1.6.9 CHLAMYDIA PSITTACI Chlamydia psittaci veroorzaakt aviaire chlamydiose en psittacose bij respectievelijk vogels en de mens. Het verloop van infecties kan variëren van asymptomatisch tot acuut en chronisch. Transmissie gebeurt meestal na contact met geïnfecteerde vogels. Infecties kunnen enkel behandeld worden met antibiotica aangezien er geen vaccin beschikbaar is (DeSchrijver, 2003).
1.2
CHLAMYDIA PSITTACI
1.2.1 ALGEMEEN Hoewel de naam C. psittaci anders doet vermoeden, immers psittaci is afkomstig van het Latijnse woord voor papegaai, is de bacterie reeds vastgesteld in 467 vogelspecies verspreid over 30 verschillende vogelordes (Stewardson and Grayson, 2010). Vogels vormen dus het grootste reservoir van C. psittaci. C. psittaci veroorzaakt psittacose of papegaaienziekte bij papegaaiachtigen. In niet-papegaaiachtigen (duiven en pluimvee) wordt de ziekte vaak ornithose genoemd of meer algemeen aviaire chlamydiose. Aviaire chlamydiose zal verder worden gebruikt als een meer algemene term om deze ziekte te benoemen bij zowel papegaaiachtigen als niet-papegaaiachtigen. De incubatieperiode van aviaire chlamydiose varieert van drie dagen tot enkele weken (Smith, 2010). Een infectie bij vogels is vaak systemisch waarbij de meeste organen worden geïnfecteerd zoals het bindvlies, het respiratoire systeem en het gastro-intestinale stelsel. Een infectie kan gepaard gaan met onduidelijke, plotse, acute of chronische symptomen met periodieke uitscheiding van de bacterie. Niet-specifieke symptomen omvatten onder meer lusteloosheid, een slechte veerconditie, gewichtsverlies, afscheiding van oculaire- of nasale secreties en excretie van groene tot geelgroene ontlasting. In het slechtste geval vindt uithongering en uitdroging plaats met finaal sterfte. De hevigheid van de symptomen is onder meer afhankelijk van het serotype van de bacterie, de mate van infectie, stress factoren, het vogelspecies en de nutritionele- en gezondheidstoestand van de vogel (West, 2011; Smith, 2010; Everett, 2000). Bij een infectie van C. psittaci bij de mens spreekt men van psittacose (Mayer, 2009). De eerste erkenning van psittacose werd toegeschreven aan Ritter in 1880. Ritter merkte tevens een mogelijke link op tussen psittacose en vogels (Ridgway, 1986). Het klinisch verloop van een infectie met C. psittaci werd bepaald. Primaire replicatie vindt plaats in de bovenste luchtwegen waar epitheliale cellen worden geïnfecteerd. Vervolgens worden de epitheliale cellen en macrofagen van de onderste luchtwegen geïnfecteerd. Hierdoor wordt intense replicatie doorheen het volledige ademhalingsstelsel mogelijk waarna de bacteriën zich over het hele lichaam kunnen verspreiden. Hierbij worden verschillende organen aangetast zoals het hart, de lever en het gastrointestinaal stelsel (Beeckman and Vanrompay, 2009b; Vanrompay et al., 1995b). De incubatieperiode van C. psittaci bij de mens bedraagt vijf tot veertien dagen (Beeckman and Vanrompay, 2009b). C. psittaci veroorzaakt vooral respiratoire infecties met zeer variabele klinische symptomen gaande van asymptomatisch tot fataal bij gebrek aan behandeling. De voornaamste symptomen zijn plotse koorts (tot 40,5˚C), rillingen, hoofdpijn, een onbehagelijk gevoel, spierpijn, hoesten en kortademigheid (West, 2011; Smith, 2010). Soms wordt bloederig slijm opgehoest of worden andere symptomen zoals niet-specifieke uitslag of gastrointestinale problemen zoals overgeven, abdominale pijn en diarree vastgesteld. In zeldzame gevallen kan C. psittaci onder meer myocarditis, endocarditis, hersenvliesontsteking en geelzucht veroorzaken. Bij zwangere vrouwen is onder meer atypische pneumonie, hepatitis, sepsis en premature geboorte of foetale dood vastgesteld (Longbottom and Coulter, 2003; NASPHV, 2010).
9
1.2.2 SEROVARS EN GENOTYPES Voor taxonomische en epidemiologische toepassingen is het belangrijk om binnen een specifiek species verschillende stammen te kunnen onderscheiden. Bij serotypering wordt een species verder opgedeeld op basis van specifieke structuren die worden herkend door antilichamen (Vanrompay et al., 1997). Serotypering van C. psittaci gebeurt via antilichamen gericht tegen bijvoorbeeld het MOMP eiwit. Hiermee is het mogelijk om C. psittaci op te delen in acht serovars: zes serovars afkomstig uit vogels (A tot en met F) en twee serovars afkomstig uit zoogdieren; WC en M56 (Tabel 1-1). Serovar A is endemisch bij papegaaiachtigen maar kan ook ziekte veroorzaken bij de mens. Serovar B is endemisch bij duiven en werd reeds geïsoleerd uit kalkoenen en bij een abortus bij melkvee. Serovar C is onder meer geïsoleerd uit eenden, een zwaan, een kalkoen en een patrijs. Serovar D wordt voornamelijk geïsoleerd uit kalkoenen maar werd ook reeds geïsoleerd uit meeuwen, een parkiet en uit de mens. Serovars C en D vormen bovendien een beroepsrisico voor werknemers van onder meer kippenbedrijven en slachterijen. Serovar E (gekend als Cal-10, MP of MN) is reeds geïsoleerd uit verscheidene mensen en vogels wereldwijd. Serovar F is alleen nog maar geïsoleerd uit een parkiet en een kalkoen en is ook reeds vastgesteld bij de mens. Serovars WC en M56 zijn tijdens uitbraken in zoogdieren geïsoleerd (Geens et al., 2005a; Beeckman and Vanrompay, 2009b; Everett, 2000; Stewardson and Grayson, 2010). De nadelen van deze serologische testen zijn onder meer de beperkte beschikbaarheid van goede antilichamen (Herring, 1993) en de nood aan een grote hoeveelheid antigen om detectie mogelijk te maken (Vanrompay et al., 1997). Bij genotypering wordt een species verder opgedeeld op basis van verschillen in de gensequentie. Voor de genotypering van C. psittaci kunnen volgende technieken worden gebruikt: PCR restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) van ompA (Vanrompay et al., 1997; Sayada et al., 1995), PCR sequentie analyse (Everett et al., 1999), genotype-specifieke real-time PCR (Geens et al., 2005b) en micro-arrays (Sachse et al., 2008). Belangrijke voordelen van deze genotyperingsmethodes zijn dat ze een snelle identificatie en classificatie van stammen toelaten. Via genotypering wordt C. psittaci opgedeeld in negen verschillende genotypes (Tabel 1-1). Deze negen genotypes (A-F, E/B, M56 en WC) komen grotendeels overeen met de acht serovars; genotype A komt voor in papegaaiachtigen, B in duiven, C in eenden en ganzen, D in kalkoenen, E in onder meer in duiven en eenden, F in parkieten, E/B in eenden, WC in vee en M56 in knaagdieren (Sachse et al., 2008). Tabel 1-1: Overzicht van de verschillende serotypes en genotypes in C. psittaci. Gebaseerd op (Stewardson and Grayson, 2010; Beeckman and Vanrompay, 2009b).
Serovar
Genotype
A B C D E F
A B C D E F
WC M56
WC M56 E/B
Meest gebruikelijke gast: voorbeelden Papegaaiachtigen: grasparkieten, valkparkiet, parkiet Duifachtigen: duiven Eendachtigen: eenden, ganzen, zwanen Hoendervogels: kalkoenen, fazanten, kippen Struthioniformes: struisvogels, duiven, eenden Werd enkel nog maar geïsoleerd uit een parkiet en een kalkoen Vee Knaagdieren Eenden
10
Infectie vastgesteld bij de mens Ja Ja Ja Ja Ja Ja
Ja
Een bijkomend voordeel van deze moleculaire technieken tegenover serotypering is dat het ompA genotype E/B te onderscheiden is van genotype E en B, iets wat niet mogelijk is met serovar specifieke monoclonale antilichamen (Beeckman and Vanrompay, 2009b).
1.2.3 EPIDEMIOLOGIE Tot 1932 werd aangenomen dat infecties met C. psittaci enkel in papegaaiachtigen konden voorkomen. Pas na een uitbraak in 1950 bij mensen die in contact waren gekomen met geïnfecteerde kalkoenen, werd het belang van vogels als bron van infectie gezien (Verminnen et al., 2008). De lijst van vogelsoorten waarbij infecties met C. psittaci kunnen voorkomen neemt snel toe. Zoals reeds vermeld is C. psittaci reeds vastgesteld in 467 vogelspecies verspreid over 30 verschillende vogelordes. Voornamelijk papegaaiachtigen (kaketoes, papegaaien, parkieten en lori's) en duifachtigen (duiven) worden geïnfecteerd. Papegaaiachtigen, wedstrijdduiven en duiven in stedelijke en landelijke gebieden vormen een belangrijk reservoir van zoönotische psittacose (Beeckman and Vanrompay, 2009b). Tussen vogels onderling wordt C. psittaci veelal overgedragen via besmette luchtpartikels afkomstig van nasale en oculaire secreties en faecaal materiaal. Verticale transmissie van de bacterie kan gebeuren via eieren (Everett, 2000). Sommige vogels zijn drager en scheiden de bacterie slechts tijdelijk uit. Bepaalde stressfactoren zoals transport, veranderingen in omgevingstemperatuur, overvolle kooien en verplaatsingen kunnen de uitscheiding activeren of stimuleren (Deschuyffeleer et al., 2011). Daarnaast is het elementaire lichaam bestand tegen uitdroging waardoor het maandenlang kan overleven in organisch afval (West, 2011). Tot ongeveer 25 jaar geleden hadden Amerikaanse en Europese kalkoenbedrijven te maken met explosieve uitbraken van C. psittaci (Verminnen et al., 2008). Deze uitbraken vormden een grote kostenpost voor bedrijven onder meer omdat karkassen worden afgekeurd bij het slachten en een antibioticumbehandeling dient opgestart te worden om verdere mortaliteit te voorkomen (Vanrompay et al., 1993). Explosieve uitbraken zijn nu echter zeldzaam geworden (Verminnen et al., 2008). C. psittaci is vandaag de dag bijna endemisch in de Europese kalkoenbedrijven (Van Loock et al., 2005a) en waarschijnlijk ook bij kalkoenen in de VS. De genotypes A, B, D, E, F en E/B werden reeds uit Europese kalkoenen geïsoleerd. Deze genotypes vormen mogelijks ook een gevaar voor de mens en de volksgezondheid. Zo zijn er al verschillende gevallen gemeld van werknemers in zowel de Amerikaanse als Europese pluimvee-industrie die besmet werden met C. psittaci (Verminnen et al., 2008; Vanrompay et al., 1993; Gaede et al., 2008; Lederer and Muller, 1999). Mensen kunnen op verschillende manieren worden geïnfecteerd met C. psittaci. Meestal vindt infectie plaats door het inademen van bacteriën wanneer urine, ademhalingssecreties of gedroogde faeces van geïnfecteerde vogels worden verspreid in de lucht onder de vorm van fijne druppeltjes of stofpartikels. Andere bronnen van blootstelling omvatten onder meer mond-snavel contact of contact met pluimen of organen van geïnfecteerde dieren. De voornaamste bron van infecties zijn papegaaiachtigen, daarnaast is ook overdracht van pluimvee en vrij rondvliegende vogels zoals duiven en roofvogels mogelijk (Smith, 2010). Mensen die tijdens hun dagdagelijkse bezigheden in contact komen met vogels in volières, op pluimveebedrijven, in dierenwinkels, dierenziekenhuizen en als vogelbezitter lopen het grootste risico op een infectie (Cfsph, Avian Chlamydiosis, 2009; Cfsph, Zoonotic Chlamydiae from Mammals, 2005). Tevens kan transiënte blootstelling aan geïnfecteerde vogels en/of een gecontamineerde omgeving een infectie veroorzaken (West, 2011). Artsen zijn verplicht alle gevallen van psittacose te melden. Desalniettemin is de werkelijke incidentie van psittacose niet gekend omdat infecties niet altijd worden gemeld of door een incorrecte diagnose.
11
In België werden van 1996 tot 2007 jaarlijks ongeveer 10 patiënten gemeld met uitzonderlijk 23 en 39 gevallen in 2002 en 2003 (Longbottom and Coulter, 2003; The World Organisation for Animal Health (OIE) - Handistatus, 2004; Beeckman and Vanrompay, 2009b; Harkinezhad et al., 2009b). Uit een studie van Harkinezhad et. al blijkt dat deze aantallen in België onderschat worden. In deze studie werd het voorkomen van C. psittaci bij 540 “gezonde” personen onderzocht. Er werd bij 12,7% van de deelnemers het DNA van C. psittaci aangetoond (Harkinezhad et al., 2009b). Het risico op een infectie met C. psittaci is van groot belang voor de volksgezondheid. Infecties worden immers niet alleen veroorzaakt door huisdieren (papegaaien, kanaries, …) of stadsduiven. Maar overdracht vanuit de omgeving is ook mogelijk, bijvoorbeeld bij tuinieren. Daarnaast kan C. psittaci maandenlang infectieus blijven in de omgeving (Smith, 2010; Telfer et al., 2005). Overdracht van mens op mens is daarentegen zeldzaam (Harkinezhad et al., 2009b).
1.2.4 DETECTIE Infecties met C. psittaci blijven vaak onopgemerkt. Dit is enerzijds zo omdat infecties vaak asymptomatisch zijn en anderzijds vertonen symptomatische infecties veelal griepachtige symptomen. Voor deze symptomen wordt dan vaak een antibioticumkuur gestart om “secundaire bacteriële” infecties te voorkomen. In veel gevallen worden diagnostische testen voor C. psittaci niet uitgevoerd (Harkinezhad, 2008). Verschillende methodes voor het detecteren van C. psittaci infecties zijn echter wel beschikbaar. Deze methodes zijn gebaseerd op kweek, op serologische detectie en moleculaire detectie en karakterisatie (Andersen and Vanrompay, 2000; Beeckman and Vanrompay, 2009b).
1.2.4.1 CULTUUR GEBASEERDE METHODES Het principe van cultuur gebaseerde methodes is de isolatie van het causatieve agens tijden de acute fase van een infectie, alvorens een behandeling met antibiotica wordt gestart. Dit is de meest betrouwbare methode om de aanwezigheid van leefbare bacteriën aan te tonen (Beeckman and Vanrompay, 2009b; Andersen and Vanrompay, 2000). Verschillende celtypes zijn reeds beschreven voor de opkweek van C. psittaci zoals BGM cellen, HeLa cellen en Afrikan Green Monkey (Vero) cellen. Groei van C. psittaci wordt meestal bevestigd met immunofluorescentietechnieken en negatieve stalen worden meermaals heropgekweekt ter bevestiging van het negatieve resultaat (Andersen and Vanrompay, 2003; Beeckman and Vanrompay, 2009b). De opkweek van C. psittaci is echter veeleisend. Er is een speciaal L3 veiligheidslabo vereist en daarom wordt deze methode weinig frequent toegepast (Stewardson and Grayson, 2010).
1.2.4.2 SEROLOGIE Bij serologische testen worden antilichaamtiters gemeten. Een positief resultaat wordt bekomen wanneer een viervoudige toename in antilichaamtiter bij gepaarde sera wordt gemeten. Frequent gebruikte serologische methoden voor de detectie van Chlamydiaceae in de mens zijn de complement fixatie test (CFT), microimmunofluorescentie (MIF) en enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) (Andersen and Vanrompay, 2003). In de CFT wordt de aanwezigheid van antilichamen gericht tegen Chlamydiaceae nagegaan. Dit gebeurt door aan het te testen serum, test-antigenen (genus-specifieke lipopolysacchariden) toe te voegen. Indien in het staal antilichamen aanwezig zijn tegen Chlamydiaceae, zullen deze test-antigen-antilichaam complexen vormen. Deze complexen worden vervolgens gebonden door complementeiwitten uit het serum. Rode bloedcel-antilichaam complexen die vervolgens worden toegevoegd, zullen niet lyseren omdat het 12
complement reeds “opgebruikt” is. Indien geen antilichamen voor de test-antigenen aanwezig zijn, zullen de rode bloedcel-antilichaam complexen wel worden gelyseerd (Stewardson and Grayson, 2010). Wegens de lage specificiteit van deze test, immers door kruisreactie kunnen ook antilichamen tegen andere Gram-negatieve bacteriën worden gedetecteerd, wordt deze test niet veel meer toegepast (Griffiths et al., 1996). MIF is veel gevoeliger en specifieker dan CFT omdat hier species-specifieke oppervlakte antigenen van Chlamydiaceae worden gebruikt in plaats van lipopolysacchariden. Kruisreactiviteit blijft echter een probleem (Stewardson and Grayson, 2010).
1.2.4.3 MOLECULAIRE DETECTIE Door de beperkte discriminerende eigenschappen van serologische testen worden nu vooral nucleïnezuurgebaseerde diagnostische testen specifiek voor Chlamydiaceae gebruikt. Via PCR kan een snelle en specifieke diagnose worden gesteld en bovendien is de kans op kruisreactiviteit met andere species kleiner. Verschillende vormen van PCR zijn reeds ontwikkeld zoals; real-time PCR, nested PCR en multiplex PCR. De primers zijn gericht tegen onder meer het ompA-gen en het gen coderend voor het inclusiemembraan eiwit A (incA-gen) (Stewardson and Grayson, 2010).
1.2.5 BEHANDELING Het antibioticum bij uitstek voor psittacosis is doxycycline. Doxycycline is namelijk intracellulair actief en de farmacodynamica is goed gekend (Yung and Grayson, 1988). Voor kinderen en zwangere vrouwen wordt een alternatieve behandeling met macrolides zoals azithromycine, roxithromycine en erythromycine geadviseerd (Stewardson and Grayson, 2010). Van infecties kan men eenvoudig herstellen door het innemen van antibiotica. Hoewel overdracht van resistentiegenen beperkt is door de obligaat intracellulaire levensstijl van chlamydia, werd tetracycline resistentie reeds vastgesteld bij C. suis (Dugan et al., 2004). Bovendien kan naast horizontale overdracht, ook resistentie ontstaan als gevolg van puntmutaties. Het gebruik van antibiotica dient daarom zoveel mogelijk te worden beperkt om resistentie te vermijden (Beeckman and Vanrompay, 2009b).
1.2.6 PREVENTIE EN CONTROLE Volledige eliminatie van aviaire chlamydiose is praktisch onmogelijk omdat er nog geen vaccin beschikbaar is en er een groot aantal potentiële dragers is (Van Droogenbroeck et al., 2009). Er kunnen echter wel stappen ondernomen worden om het risico op een infectie te beperken. Nieuwe vogels moeten altijd onderzocht worden op symptomen van de ziekte. Daarnaast moeten deze minimaal 30 dagen in quarantaine verblijven en getest worden op C. psittaci. Er mag geen contact mogelijk zijn met wilde vogels of ongedierte omdat deze dieren als mechanische vector kunnen optreden. Regelmatig dienen de voorzieningen te worden schoongemaakt en gedesinfecteerd. C. psittaci is gevoelig voor verschillende desinfectantia zoals quaternaire ammonium componenten, chlorofenolen, iodofore desinfectantia, formaldehyde, glutaraldehyde, isopropylalcohol en natriumhydroxide. C. psittaci is ook gevoelig aan vochtige warmte van 121°C gedurende minimaal 15 minuten of droge lucht van 160-170°C gedurende minimaal één uur. De kooien moeten worden geordend zodat er een minimale transfer van faeces, voedsel en veren mogelijk is. Daarnaast moeten de ruimtes goed worden geventileerd om aërosolvorming en kruiscontaminatie te minimaliseren. Routinematig gebruik van profylactische antibiotica wordt afgeraden wegens de ontwikkeling van antibioticumresistentie (Cfsph, Zoonotic Chlamydiae from Mammals, 2005).
13
Geïnfecteerde vogels moeten behandeld worden onder toezicht van een dierenarts. Bij een infectie is het belangrijk goed te ontsmetten omdat C. psittaci lang infectieus kan blijven in de omgeving. Het gebruik van beschermende kledij zoals handschoenen en een gezichtsmasker wordt hierbij aanbevolen. Omdat het behandelen van dieren bijna altijd effectief is, is euthanaseren van de dieren niet nodig (Vanrompay et al., 1999).
14
2
DOEL
Chlamydiaceae zijn obligaat intracellulaire, Gram-negatieve bacteriën die repliceren via een unieke bifasische cyclus. Taxonomisch gezien omvat de familie Chlamydiaceae het genus Chlamydia waartoe verschillende species behoren (C. trachomatis, C. muridarum, C. suis, C. pneumoniae, C. psittaci, C. abortus, C. caviae en C. felis, C. pecorum). In deze thesis wordt meer specifiek onderzoek verricht naar het species Chlamydia psittaci. C. psittaci veroorzaakt aviaire chlamydiose bij vogels en is reeds in 467 vogelspecies gedetecteerd. Het verloop van een infectie varieert van ademhalingsproblemen tot aspecifieke symptomen zoals lusteloosheid en gewichtsverlies. C. psittaci kan ook overgedragen worden naar de mens. Overdracht naar de mens gebeurt meestal door het inademen bacteriën die werden uitgescheiden door geïnfecteerde vogels. Infecties bij de mens worden psittacose genoemd en worden meestal gekarakteriseerd door ademhalingsproblemen. Men neemt aan dat C. psittaci endemisch aanwezig is op pluimveebedrijven. In een eerste luik van deze thesis wordt daarom het voorkomen van C. psittaci op Belgische kippenbedrijven onderzocht alsook de overdracht naar de werknemers van deze bedrijven. In een tweede luik wordt de invloed van C. psittaci op de apoptose van de humane macrofaag/monocyt cellijn THP1 onderzocht. De replicatie van C. psittaci gebeurt immers typisch binnenin de gastheercel in membraangebonden vacuoles, de inclusies. Tijdens deze fase is het overleven van C. psittaci cruciaal. Daarom wordt onderzocht hoe C. psittaci stam 92/1293 de apoptotische pathway van de gastheercel beïnvloedt. Daarnaast wordt ook de infectiviteit van C. psittaci stam 92/1293 onderzocht in THP1 cellen.
15
3 3.1
MATERIAAL EN METHODE CELKWEEK
3.1.1 SUPPLEMENTEN EN OPLOSSINGEN VOOR CELKWEEK 3.1.1.1 L-GLUTAMINE L-glutamine (Gibco, 2530-024) wordt gebruiksklaar aangekocht, uitverdeeld in 15 ml falcons en bewaard bij -20°C.
3.1.1.2 HITTE GEÏNACTIVEERD FEUTAAL KALFSSERUM (H.I. FCS) FCS (Sigma, F7524030M3396) wordt voor gebruik geïnactiveerd door incubatie gedurende 30 min bij 56°C, uitverdeeld in 50 ml falcons en bewaard bij -20°C.
3.1.1.3 VANCOMYCINE Los 500 mg vancomycine (GlaxoSmithKline, 725-IS-562-F12) op in 100 ml BiDest. Verdeel de vancomycine, na sterilisatie over een 220 nm filter (Millipore), over 15 ml falcons. Bewaar de oplossing bij -20°C.
3.1.1.4 VITAMINES De vitamine oplossing (Gibco, 11120-037) wordt gebruiksklaar aangekocht, uitverdeeld in 15 ml falcons en bewaard bij -20°C.
3.1.1.5 STREPTOMYCINE Los 1 g streptomycinesulfaat (Gibco, 11860-083) op in 100 ml BiDest, steriliseer deze oplossing via filtratie over een 220 nm filter en verdeel uit over 15 ml falcons. Bewaar de oplossing bij -20°C.
3.1.1.6 TRYPSINE-EDTA Trypsine-EDTA (Gibco, 25200) wordt gebruiksklaar aangekocht, uitverdeeld over 50 ml falcons en bewaard bij -20°C.
3.1.1.7 FOSFAAT GEBUFFERDE ZOUTOPLOSSING (PBS) PBS (Sigma, D8662) wordt gebruiksklaar aangekocht en bewaard bij 4°C.
3.1.2 MEDIA CELKWEEK 3.1.2.1 MINIMAAL ESSENTIEEL MEDIUM (MEM) VOOR BGM CELLEN Los 93,9 g poeder voor MEM (Gibco, 0820234DJ) op in 10 l BiDest en stel de pH in op 4,1. Autoclaveer de oplossing gedurende 15 min bij 121˚C en laat de iMEM afkoelen bij kamertemperatuur. Bewaar bij 4°C. 16
Voeg net voor gebruik 7,5% natriumbicarbonaatoplossing (Gibco, 25080-094) toe aan iMEM zodat MEM wordt bekomen.
3.1.2.2 COMPLEET MINIMAAL ESSENTIEEL MEDIUM (CMEM) VOOR BGM CELLEN Voeg aan 425 ml MEM: 50 ml H.I. FCS (10%), 5 ml L-glutamine (1%), 5 ml vitamines (1%); 10 ml vancomycine (2%) en 5 ml (1%) streptomycine toe voor het bekomen van 500 ml cMEM.
3.1.2.3 THP1 MEDIUM Voeg aan 500 ml RPMI 1640 met GlutaMAX (Gibco, 61870-010) 5,75 ml streptomycine (1%); 11,5 ml vancomycine (2%) en 57,5 ml H.I. FCS (10%) toe voor het bekomen van het THP1 medium.
3.1.3 BGM CELLEN Voor de productie van C. psittaci EBs zijn BGM cellen vereist. Hiervoor worden BGM cellen opgegroeid in weefselkweekflessen en gesplitst om de 2 dagen.
3.1.3.1 INITIATIE BGM CULTUUR -
Ontdooi een cryovial met BGM cellen uit de vloeibare stikstof Los de cellen op in 10 ml cMEM dat reeds werd opgewarmd tot 37˚C in het warmwaterbad Centrifugeer (Rotina 420R Hettich, UK) gedurende 10 min aan 300 x g bij 18˚C Neem het supernatans af en los de celpellet op in 20 ml cMEM dat reeds werd opgewarmd tot 37˚C in het warmwaterbad Incubeer in de 5% CO2-incubator bij 37˚C
3.1.3.2 SPLITSEN BGM CELLEN BGM cellen worden dagelijks geïnspecteerd onder de omgekeerde lichtmicroscoop (Nikon Eclipse TS100, VS) en om de 2 dagen gesplitst als volgt: -
Plaats cMEM (zie sectie 3.1.2.2), trypsine-EDTA, H.I. FCS en PBS bij 37˚C in het warmwaterbad Neem het medium van de BGM cellen af Was de cellen met 20 ml PBS en plaats de weefselkweekfles gedurende 5 à 10 min horizontaal bij 37˚C Maak de cellen los door 2 ml trypsine-EDTA toe te voegen en plaats maximaal 5 minuten horizontaal bij 37˚C Neem na enkele minuten de weefselkweekfles uit de incubator, houd de fles vertikaal en klop zijdelings om de cellen sneller los te maken Inactiveer het trypsine door 2 ml H.I. FCS toe te voegen Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 min aan 300 x g bij kamertemperatuur Neem het supernatans af met een steriele pasteurpipet Resuspendeer de celpellet in 6 ml cMEM, neem hiervan 2 ml en leng aan tot 20 ml cMEM voor een weefselkweekfles van 75 cm2 Incubeer in de 5% CO2-incubator bij 37˚C
17
3.1.4 THP1 CELLEN THP1 cellen zijn niet adherent en worden dagelijks onder de omgekeerde lichtmicroscoop (Nikon Eclipse TS100, VS) bekeken en om de 2 dagen gesplitst. -
Plaats het medium bij 37˚C in het warmwaterbad Breng de THP1 cellen over in een centrifugeerbuis en centrifugeer gedurende 10 min aan 300 x g bij 18°C Resuspendeer de celpellet in 6 ml THP1 medium, neem hiervan 2 ml en leng aan tot 20 ml THP1 medium voor een weefselkweekfles van 75 cm2 Incubeer in de 5% CO2-incubator bij 37˚C
3.1.5 CELLEN TELLEN: BGM EN THP1 CELLEN -
Los de BGM of de THP1 celpellet na centrifugatie op in 1 ml cMEM respectievelijk THP1 medium dat reeds werd voorverwarmd tot 37˚C in het warmwaterbad Los 10 µl van deze celsuspensie op in 90 µl tryptaanblauw (Sigma, T8154) Breng hiervan 10 µl naar een Neubauer telkamer (Marienfeld superior, Duitsland) en bepaal het aantal cellen
Figuur 3-1: Neubauer telkamer (Caprette, 2007): het principe van deze telkamer is als volgt; tel het aantal cellen in het centrale gedeelte van de telkamer. Het volume waarin deze cellen zijn opgelost is 0,1 μl. Dit aantal cellen wordt vervolgens omgerekend naar het aantal cellen in de 1 ml door te vermenigvuldigen met 10 000.
-
3.2
Bereken op basis van dit aantal, het aantal cellen in de totale celoplossing en plant de cellen aan de gewenste concentratie in een weefselkweekfles (Figuur 3-1) Incubeer de weefselkweekfles in de 5% CO2-incubator bij 37˚C
CHLAMYDIA PSITTACI STOCKPRODUCTIE IN BG M CELLEN
C. psittaci is een obligaat intracellulaire bacterie. Voor de stockproductie van infectieuze EBs wordt een eukaryote gastheercellijn gebruikt; de Buffalo Green Monkey (BGM) nierepitheelcellijn. Voor de stockproductie van C. psittaci worden de BGM cellen eerst geïnoculeerd met C. psittaci. Om de groei van C. psittaci goed op te kunnen volgen, wordt in containertjes het infectieproces gelijktijdig ingezet. De infectiestatus van de cellen in de containertjes kan eenvoudig worden bepaald via een directe immunofluorescentiekleuring. Wanneer voldoende C. psittaci inclusies aanwezig zijn, worden de C. psittaci RBs en EBs vrijgesteld door het lyseren van de BGM cellen. Hierna worden de EBs gescheiden van de RBs via gradiënt ultracentrifugatie volgens de methode van Timms. De titer van de EB stock kan finaal worden bepaald door een titratiereeks op te stellen.
18
3.2.1 SUPPLEMENTEN VOOR ST OCKPRODUCTIE 3.2.1.1 CYCLOHEXIMIDE Los 500 mg cycloheximide (Sigma, C-7698) op in 50 ml BiDest. Filtersteriliseer deze oplossing over een 220 nm filter en verdeel per 10 ml over 5 flessen van 100 ml. Leng dit vervolgens aan met 90 ml PBS en bewaar bij 4°C.
3.2.1.2 FUNGIZONE Fungizone (Gibco, 15290-026) wordt gebruiksklaar aangekocht en bewaard bij -20°C.
3.2.1.3 GLUCOSE-OPLOSSING Los 275 mg glucose op per ml PBS, filtersteriliseer en bewaar bij 4°C.
3.2.1.4 OVERIGE SUPPLEMENTEN EN OPLOSSINGEN Zie sectie 3.1.1: L-glutamine, H.I. FCS, vancomycine, vitamines, streptomycine, trypsine en PBS.
3.2.2 MEDIA CELKWEEK EN BUFFERS 3.2.2.1 COMPLEET CHLAMYDIA KWEEKMEDIUM (CCKM) Los 2,75 g glucose per 500 ml MEM op en filtersteriliseer, dit is incompleet Chlamydia kweekmedium (iCKM). Voor 500 ml compleet Chlamydia kweekmedium (cCKM) wordt aan 448,6 ml iCKM: 25 ml H.I. FCS (5%); 5 ml Lglutamine (1%); 5 ml vitamines (1%); 10 ml vancomycine (2%); 5 ml streptomycine (1%); 1,1 ml cycloheximide (0,22%) en 0,5 ml fungizone (0,1%) toegevoegd. Bewaar de cCKM bij 4°C.
3.2.2.2 COMPLEET THP1 MEDIUM Voeg 2% glucose-oplossing (zie sectie 3.2.1.3) toe aan 98 ml RPMI 1640 met GlutaMAX. Bewaar bij 4°C.
3.2.2.3 SUCROSE-FOSFAAT-GLUTAMAAT BUFFER (SPG) Los 74,6 g sucrose (Sigma, 84.097); 5,1 g monokaliumfosfaat (Sigma-Aldrich, P9791); 1,2 g dikaliumfosfaat (Sigma, 60353-250G) en 0,9 g L-glutaminezuur kaliumzout monohydraat (Sigma, 243-094-0) op in 1 l BiDest. Breng dit op pH 7 met 1 M zoutzuur of 1 M natriumhydroxide, filtersteriliseer en bewaar bij -20˚C.
3.2.2.4 20 MM TRIS-WATERSTOFCHLORIDE – 150 MM KALIUMCHLORIDE Los 0,24 g Tris (Sigma, T6066) op in 100 ml BiDest en breng op pH 7,5 voor de bereiding van 20 mM Triswaterstofchloride. Los vervolgens 1,12 g kaliumchloride op in 100 ml 20 mM Tris-waterstofchloride, filtersteriliseer en verdeel in falcons. Bewaar de oplossing bij 4˚C.
19
3.2.3 INOCULATIE VAN BGM CELLEN MET C. PSITTACI -
Plant BGM cellen in weefselkweekflessen van 75 cm2 en 2 containertjes Neem een cryovial met C. psittaci isolaat uit de -80˚C, ontdooi in het warmwaterbad en plaats dan op ijs Neem het medium van de 24 uur oude BGM cellen af Inoculeer een weefselkweekfles met 0,3 ml, sluit de fles af en leg deze gedurende 3 uur op een kantelend platform bij 37˚C Inoculeer 2 containertjes met 24 uur oude BGM cellen met 75 μl inoculum en centrifugeer gedurende 1 uur aan 2000 x g bij 37˚C Voeg 20 ml cCKM toe per weefselkweekfles en 1 ml cCKM per containertje Incubeer de weefselkweekfles en de containertjes (volledig dichtgedraaid) bij 37˚C in de 5% CO2incubator, voer na 3 en 6 dagen een directe immunofluorescentiekleuring uit
3.2.4 DIRECTE IMMUNOFLUORE SCENTIEKLEURING (DIF) In de DIF kleuring worden EBs en RBs gedetecteerd door het toevoegen van gelabelde antilichamen tegen LPS. Deze antilichamen zijn gelabeld met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) (Oxoid, K610111-2). Hierdoor vertonen de EBs en RBs een groene fluorescentie bij visualisatie met een fluorescentiemicroscoop. -
-
Neem het medium van de containers af en fixeer de monolaag door 1 ml ijskoude methanol (VWR international, 20903) toe te voegen en deze gedurende 10 min bij -20˚C te plaatsen Verwijder de methanol Blokkeer gedurende 30 min met een oplossing van PBS en 5 % H.I. FCS bij kamertemperatuur Verdun het Imagen reagens van de Chlamydia-kit (Oxoid, K610111-2) tweemaal in PBS (per container is in totaal 25 μl verdund reagens nodig) en plaats de Imagen reagens verdunning 5 min bij kamertemperatuur, afgeschermd van licht Maak een vochtige kamer klaar en plaats bij 37˚C Breng 25 μl verdund Imagen reagens op elk dekglaasje Incubeer de stalen in een vochtige kamer gedurende 45 min bij 37˚C Was de dekglaasjes tweemaal gedurende 5 min met 2 ml PBS Was de dekglaasjes met 2 ml BiDest gedurende 30 seconden en voeg 2 ml BiDest toe Neem met een fijne pincet de dekglaasjes uit de containers en leg deze op Torck papier te drogen aan de lucht met de cellen naar boven gericht Neem de mounting vloeistof uit de koelkast en laat deze 5 min bij kamertemperatuur staan alvorens te gebruiken Breng 2 druppels mounting vloeistof op een preparaat en leg de dekglaasjes met de cellen naar beneden op het preparaat Bevestig het dekglaasje op het preparaat met behulp van nagellak Bewaar de preparaten in het donker bij 4˚C en lees deze finaal af met de fluorescentiemicroscoop (Olympus type BX41)
3.2.5 VRIJSTELLEN VAN DE E BS/RBS De EBs en RBs worden vrijgesteld uit de BGM cellen door deze eerst in te vriezen met SPG en de cellen vervolgens te soniceren. Door de centrifugatiestap die hierop volgt, wordt het celdebris verwijderd. Vervolgens worden bij de ultracentrifugatie de EBs en RBs gepelleteerd. -
Voeg 20 ml SPG toe per weefselkweekfles van 75 cm2 en bewaar bij -80˚C Ontdooi de flessen voorzichtig in een warmwaterbad en gebruik een celschraper om alle cellen naar de bodem van de weefselkweekflessen te schrapen Soniceer de flessen gedurende 1 min bij 50 kC Breng de oplossing over in falcons 20
-
Centrifugeer gedurende 10 min aan 2400 x g bij 4˚C Ultracentrifugeer (Beckman Coulter) het supernatans gedurende 45 min aan 45000 x g bij 4˚C Resuspendeer de celpellet in 2 ml SPG met 40 μl vancomycine (2%); 20 μl streptomycine (1%) en 2 μl (0,1%) fungizone en bewaar deze bij -80˚C tot de EB/RB opzuivering
3.2.6 OPZUIVERING VAN DE E B EN RB STOCK VOLGEN S DE METHODE VAN TIMMS: DISCONTINUE GRADIËNT CENTRIFUGATIE MET UROGRAFINE-76 Omdat enkel EBs infectieus zijn, worden finaal EBs gescheiden van RBs via gradiënt ultracentrifugatie. De C. psittaci EBs en RBs worden hierbij in een discontinue gradiënt van urografine gebracht, gevolgd door ultracentrifugatie. Na de ultracentrifugatie bevinden de RBs zich ter hoogte van de 32%-44% interfase en de EBs ter hoogte van de 44%-55% interfase (Figuur 3-2). De interfases worden gecollecteerd, opgelost in SPG en geultracentrifugeerd. De bekomen pellets worden vervolgens weer geresuspendeerd in SPG met antibiotica en bewaard bij -80˚C.
Figuur 3-2: De verschillende fases bekomen na ultracentrifugatie met een gradiënt van Urografine-76.
-
Bereid de gradiëntoplossingen van Urografine (Bayer, 80727624) met Tris-waterstofchloride (zie 3.2.2.4):
Tabel 3-1: Oplossingen voor de discontinue gradiëntcentrifugatie.
-
Gradiënt
Urografine-76 (ml)
Tris-HCl (ml)
Totaal (ml)
60% 54% 44% 32%
6,32 5,68 4,63 3,78
1,68 2,32 3,37 5,22
8 8 8 8
Pipetteer voorzichtig 2,65 ml van elke gradiëntoplossing in een ultracentifugeerbuis met bovenop 1 ml van de C. psittaci stock Ultracentifugeer aan 50000 x g bij 4˚C gedurende 60 min Collecteer de band met RBs en transfereer deze naar een steriele ultracentrifugeerbuis, herhaal deze stap voor de EBs Leng elke buis aan tot een volume van 60 ml met SPG en ultracentifugeer aan 50000 x g bij 4˚C gedurende 60 min Resuspendeer de C. psittaci EB en RB pellets in 1 ml SPG met antibiotica (1 μl fungizone, 10 μl streptomycine en 20 μl vancomycine) en bewaar bij -80˚C
21
3.2.7 BEPALING TITER VAN D E C. PSITTACI EB STOCK De titer van C. psittaci EB stock wordt bepaald door BGM cellen te inoculeren met een verdunningsreeks van de bekomen EB stock en de containers vervolgens te kleuren via DIF kleuring. De kleinste verdunning waarbij C. psittaci wordt gedetecteerd in de cellen, geeft een idee over de titer van de C. psittaci EB stock. -
3.3
Plant BGM cellen in containers aan 300000 cellen/ml Maak in viervoud een verdunningsreeks van de EB stock in PBS gaande van 10-1 tot 10-20 Neem het medium van 24 uur oude BGM cellen, inoculeer elke container met 75 μl van iedere verdunning van de verdunningsreeks en centrifugeer gedurende 1 uur aan 2000 x g bij 37˚C Neem het inoculum af en voeg 1 ml cCKM toe per containertje Incubeer de containers (volledig dichtgedraaid) gedurende 72 uur bij 37˚C in de 5% CO2-incubator Voer de DIF kleuring uit zoals beschreven in sectie 3.2.4
TUNEL EXPERIMENT
In de literatuur wordt gesuggereerd dat C. psittaci interfereert met de geïnduceerde celdood van de gastheercel. Om dit na te gaan wordt de mate van apoptose vergeleken tussen THP1 cellen die werden geïnoculeerd met C. psittaci en zijn negatieve controle. Tijdens apoptose worden enkel- en dubbelstrengige DNA breuken gegenereerd, welke via de TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) kleuring kunnen gedetecteerd worden (Roche, 11684795910). Bij deze kleuring worden de cellen eerst gefixeerd op dekglaasjes en vervolgens gepermealiseerd en geïncubeerd met een labelingsmix. Deze mix bevat het terminaal deoxynucleotidyl enzyme (TdT) en fluoresceïne geconjugeerd deoxyuridinetrifosfaat (FITC-dUTP). Het TdT voegt FITC-dUTP’s toe aan vrije 3’ hydroxylgroepen van enkel- en dubbelstrengige DNA-breuken. Na het wassen van de dekglaasjes, wordt de inbouw van FITC-dUTPs nagegaan via fluorescentiemicroscopie (Figuur 3-3).
Figuur 3-3: Principe van de TUNEL kleuring: enkel- en dubbelstrengige breuken worden gelabeld met FITC-dUTP’s door het TdT en gevisualiseerd via fluorescentiemicroscopie. Figuur overgenomen en bewerkt uit (Roche, 2010).
-
Breng THP1 cellen over naar een falcon Centrifugeer aan 300 x g bij 18˚C gedurende 4 minuten Tel het aantal cellen zoals beschreven in sectie 3.1.5 Breng het aantal THP1 cellen aan een concentratie van 300000 cellen/ml Voeg 50 ng/ml PMA (Sigma, P8139) toe Plant de THP1 cellen en voorzie steeds 3 containers per tijdstip (2 containers voor inoculatie met C. psittaci en 1 als negatieve controle) Incubeer de containers bij 37˚C in de 5% CO2-incubator gedurende 24 uur Haal de EBs uit de -80˚C en plaats op ijs Neem van alle containers het medium af Inoculeer 2 containers aan een multiplicity of infection (MOI) van 1 en voeg bij de negatieve controle 100 µl PBS Draai de dop goed dicht, centrifugeer aan 1300 x g bij 4˚C gedurende 15 min 22
-
3.4
Voeg aan elke container 1 ml compleet THP1 medium toe Incubeer de containers (volledig dichtgedraaid) bij 37˚C in de 5% CO2-incubator Voer na 24 u, 48 u en 72 u de TUNEL kleuring uit als volgt: Bereid de fixatiebuffer: 4% paraformaldehyde in PBS Neem het medium af en voeg 1 ml fixatiebuffer per container toe Incubeer gedurende 1 uur op kamertemperatuur Bereid de permeabilisatiebuffer: 0,1% triton X-100 (VWR, 28817.295) in 0,1% natriumcitraat (Fisher, S328053) Was de glasslides met PBS Incubeer met permeabilisatiebuffer voor 2 minuten op ijs Maak TUNEL (Roche, 11684795910) reactiemix (175 µl labelingsoplossing en 17,5 µl enzyme) en mix goed Was de slides tweemaal met PBS Voeg 50 µl TUNEL reactiemix toe aan de glasslides en incubeer gedurende 1 uur in een vochtige kamer bij 37˚C Was de glasslides 3 maal met PBS Monteer de glasslides zoals beschreven in 3.2.4
STAALNAME VOOR ELISA, INFECTIVITEITSTITRATIE EN REAL-TIME PCR
Op geïnfecteerde THP1 cellen (MOI=1) worden op 2 u, 4 u, 8 u, 12 u, 18 u, 24 u, 36 u, 48 u en 72 u post infectie stalen genomen voor ELISA, een infectiviteitstitratie en real-time PCR.
3.4.1 OPLOSSINGEN 3.4.1.1 SPG Zie sectie 3.2.2.3.
3.4.1.2 PHORBOL 12-MYRISTAAT 13-ACETATE (PMA) PMA (Sigma, P8139) is lichtgevoelig en wordt daarom in het donker bewaard. Los 1 g PMA op in 2 ml DMSO en soniceer vervolgens gedurende 1 min. Breng de oplossing over naar 18 ml gefiltersteriliseerde RPMI 1640 GlutaMAX zonder supplementen en bewaar de oplossing bij 20˚C.
3.4.1.3 GLUCOSE-OPLOSSING Zie sectie 3.2.1.3.
3.4.2 INOCULATIE VOOR ELISA, INFECTIVITEITSTITRATIE EN REAL-TIME PCR -
Plant THP1 cellen aan een concentratie van 300000 cellen/ml en voeg aan het medium 50 ng/ml PMA toe voor de aanhechting van de cellen. Neem na minimaal 24 uur het medium af en inoculeer aan een MOI van 1 Centrifugeer gedurende 15 min aan 1300 x g bij 4˚C Voeg 1 ml THP1 medium met glucose-oplossing toe per container Incubeer de containers (volledig dichtgedraaid) bij 37˚C in de CO2-incubator Neem na 2 u, 4 u, 8 u, 12 u, 18 u, 24 u, 36 u, 48 u en 72 u stalen voor ELISA (zie sectie 3.4.3), de infectiviteitstitratie (zie sectie 3.4.4) en voor real-time PCR (zie sectie 3.4.5)
23
3.4.3 ELISA Bij ELISA ofwel de enzyme linked immunosorbent assay wordt de aanwezigheid van specifieke eiwitten nagegaan via antilichamen die gericht zijn tegen het eiwit van interesse. -
Neem na 2 u, 4 u, 8 u, 12 u, 18 u, 24 u, 36 u, 48 u en 72 u 500 μl supernatans Bewaar bij -80˚C
3.4.4 INFECTIVITEITSTITRAT IE Bij de infectiviteitstitratie wordt op de verschillende tijdspunten supernatans afgenomen. Omdat C. psittaci infectieus moet blijven, wordt aan het supernatans SPG toegevoegd. Van het supernatans van de verschillende tijdspunten wordt vervolgens een verdunningsreeks gemaakt gaande van 10-1 tot 10-6. Deze reeks wordt opnieuw geïnoculeerd in containers met 24 uur oude BGM cellen zodat de titer van het supernatans kan worden bepaald. -
Neem na 2 u, 4 u, 8 u, 12 u, 18 u, 24 u, 36 u, 48 u en 72 u 500 μl supernatans Voeg 500 μl SPG toe Bewaar bij -80˚C Maak een verdunningsreeks van het supernatans in PBS gaande van 10-1 tot 10-6 Inoculeer 24 uur oude BGM cellen met 75 μl van iedere verdunning Centrifugeer gedurende 1 uur aan 2000 x g bij 37˚C Voeg 1 ml cCKM toe per containertje Incubeer de containertjes (volledig dichtgedraaid) bij 37˚C in de 5% CO2-incubator Voer na 6 dagen een DIF kleuring (zie 3.2.4) uit
3.4.5 REAL-TIME PCR 3.4.5.1 RNA EXTRACTIE Voor het isoleren van RNA worden in eerste instantie de cellen gelyseerd. Hierbij worden DNA, RNA en eiwitten vrijgesteld. Vervolgens wordt door het toevoegen van chloroform een scheiding bekomen tussen een waterige en organische fase. RNA bevindt zich in de waterige fase, DNA in de interfase en eiwitten in de organische fase. Na het afnemen van de waterige fase wordt finaal het RNA neergeslagen door het toevoegen van isopropanol. Omdat RNA op zich zeer onstabiel en gevoelig is aan degradatie door RNases, is het van belang RNase-vrij te werken. -
Voeg 1 ml TRIR (Invitrogen, AM9738) toe aan de vastgehechte THP1 cellen Incubeer gedurende 5 min op kamertemperatuur Pipetteer het lysaat 10 maal stevig op-en-neer door de pipet Plaats 10 min op ijs Bewaar eventueel in de -80°C Werk RNase-vrij in de trekkast en desinfecteer alle gebruiksmiddelen grondig met 70% ethanol Laat de stalen ontdooien op kamertemperatuur Vortex de stalen kort zodat geen celpellet meer zichtbaar is Voeg 200 µl chloroform (Roth, 3313.1) toe in de trekkast Beweeg de stalen voorzichtig gedurende 15 sec Laat gedurende 2 à 3 min staan bij kamertemperatuur Centrifugeer aan 12000 x g bij 4°C gedurende 15 min 24
-
3.5
Vul steriele RNase vrije epjes met 500 µl isopropanol (Roth, 6752.3) Neem voorzichtig de bovenste waterige fase af en breng het over in de epjes met isopropanol Draai de epjes voorzichtig om Incubeer de stalen gedurende 10 min bij kamertemperatuur Centrifugeer aan 12000 x g bij 4°C gedurende 15 min Neem het supernatans voorzichtig af Was met 1 ml 75% ethanol (verdun hiervoor de 99,9% ethanol (Roth, 9065.3) met DEPC water (SigmaAldrich, 95284)) Centrifugeer aan 5300 x g bij 4°C gedurende 5 min Neem het supernatans af Laat de pellet gedurende 10 min drogen aan de lucht Los de pellet op in 10 µl DEPC Bepaal de RNA concentratie via de nanodrop (ThermoScientific 2000)
ENVELOPPE STUDIE: PCR ANALYSE
De aanwezigheid van C. psittaci op werknemers en kippen van Vlaamse kippenbedrijven werd nagegaan. Door een dierenarts werd per bedrijf van tien kippen en twee werknemers elk twee swabs genomen. Één swab was gevuld met transportmedium voor isolatie en de andere met DNA stabilisatiebuffer voor PCR analyse. De pakketjes werden per post teruggestuurd en bewaard in de -80°C tot verdere analyse.
3.5.1 OPLOSSINGEN 3.5.1.1 KLOONANALYSEBUFFER (KAB) 3.5.1.1.1 KAB: STOCK Los 50 mM kaliumchloride (Sigma, 12636-250G), 20 mM Tris-waterstofchloride (Sigma, 11611-4) en 4 mM magnesiumdichloride (Merck, 1161020250) op in 950 ml BiDest en voeg 1 ml Tween 20 (Sigma, P9616) toe. Filtersteriliseer (pH 8,3) de oplossing en aliquoteer per 50 ml in falcons. Bewaar de stockoplossing bij -20°C.
3.5.1.1.2 KAB: MASTERMIX Voeg aan 9,920 ml kloonanalysebuffer 20 µl van elk nucleotide (Invitrogen, 10297-01) toe zodat de eindconcentratie van iedere dNTP 200 µmol/l bedraagt. Leng de oplossing aan met 600 µl DEPC (Sigma-Aldrich, 95284) en aliquoteer in epjes. Bewaar de KAB bij -20°C.
3.5.1.2 STD BUFFER Los 0,1 mol/l Tris-waterstofchloride (Sigma, 11611-4); 0,05 mol/l kaliumchloride (Sigma 12636-250G); 0,025 mol/l magnesiumdichloride-hexahydraat (Merck, 1161020250) en 0,5% Tween 20 (Sigma, P9616) op in 1 l BiDest en filtersteriliseer over een 220 nm filter. Bewaar de buffer bij -20°C.
3.5.1.3 DNA STABILISATIEBUFFER De RNA/DNA stabilisatiebuffer (Roche, 11934333001) wordt gebruiksklaar aangekocht.
25
3.5.1.4 LADINGSBUFFER Los 4 g sucrose (Sigma, 84.097) en 0,01 g broomfenolblauw (VWR, 2937) op in 10 ml BiDest. Aliquoteer de ladingsbuffer en bewaar bij -20°C.
3.5.1.5 TRIS-BOOR-EDTA-BUFFER (TBE) (20X) STOCKOPLOSSING Los 121 g Tris-waterstofchloride (Sigma, 11611-4); 61,7 g boorzuur (Acros, 180570010) en 7,44 g dinatrium EDTA dihydraat (Acros, 147855000) op in 1 l BiDest. Bewaar de buffer bij kamertemperatuur.
3.5.1.6 TBE-BUFFER (0,5X) Leng 25 ml TBE-buffer (20x) stockoplossing aan tot 1 l met BiDest. Bewaar de buffer bij kamertemperatuur.
3.5.2 DNA ISOLATIE UIT SWA BS Aan de swabs die werden opgestuurd was reeds DNA stabilisatiebuffer toegevoegd. Deze buffer lyseert de cellen en inactiveert nucleases waardoor nucleïnezuren bewaard kunnen worden. Tot verdere analyse worden de swabs bewaard bij -80°C. Na het ontdooien van de swabs worden deze geschud. De buffer wordt vervolgens overgebracht in steriele epjes en korte gecentrifugeerd gedurende 10 minuten om mogelijke contaminatie te verwijderen. Vervolgens worden de cellen in het staal neergeslagen via een centrifugatie gedurende een uur. De celpellet wordt opgelost in STD buffer waardoor de cellen worden gelyseerd. Vervolgens wordt proteïnase K toegevoegd voor degradatie van de eiwitten. Het overblijvende DNA wordt bewaard bij -80°C. -
Haal de swabs uit de -80˚C en ontdooi in het warmwaterbad bij 37°C Schud de swabs gedurende 1 uur aan 3000 rpm bij 4°C Breng de stalen met DNA stabilisatiebuffer over naar steriele epjes Centrifugeer gedurende 10 min aan 1150 x g bij 21°C Neem het supernatans voorzichtig af en breng over in een steriel epje Centrifugeer gedurende 1 uur aan 13000 x g bij kamertemperatuur Neem het supernatans voorzichtig af Resuspendeer de pellet in 198 µl STD buffer Voeg 2 µl proteïnase K (20 mg/ml; Sigma, P8044) toe Incubeer de epjes gedurende 1 uur bij 56°C Incubeer de epjes vervolgens gedurende 10 min bij 99°C voor de inactivatie van het proteïnase K Bewaar het DNA bij -80°C
3.5.3 NESTED PCR VOOR DIAGNOSTIEK VAN C. PSITTACI: RONDE 1 Nested PCR is een variant van de conventionele PCR waarbij er twee paar primersets worden gebruikt in plaats van één primerset. De eerste set primers in deze nested PCR genereert een bandje van 872 bp, de tweede set primers genereert een product van 472 bp. De amplificatieproducten worden gevisualiseerd via gelelektroforese. Per reactie wordt een positieve en een negatieve controle meegelopen. De positieve controle is genomisch DNA van C. psittaci stam 92/1293, als negatieve controle wordt MilliQ gebruikt. Bij ieder staal wordt gecontroleerd voor inhibitie door naast het staal ook een plasmide mee te amplificeren als interne controle, deze controle genereert een fragment van 703 bp. Alle stappen voor DNA amplificatie en analyse van de PCR producten worden uitgevoerd op verschillende locaties om contaminatie te minimaliseren.
26
-
Bereid de mastermix op ijs; voor 5 stalen wordt aan 250 µl KAB 1 µM externe forward en 1 µM reverse primer (Invitrogen) (Tabel 3-2), 0,5 µl Taq buffer (Sphaero, TP05a) en 0,1 Unit Taq polymerase (Sphaero, TP05a) toegevoegd. Voorzie per PCR steeds een negatieve en een positieve controle en per staal steeds een interne controle om eventuele inhibitie na te gaan.
Tabel 3-2: Sequentie van de externe primers.
Primer Externe forward Externe reverse -
-
Sequentie (5’-3’) (lengte) CCT GTA GGG AAC CCA GCT GAA (21 bp) GGT TGA GCA ATG CGG ATA GTA T (22bp)
Verdeel per staal 45 µl mastermix Voeg 5 µl DNA toe per staal en aan de interne controle stalen wordt 5 µl DNA en 10 ng interne controle plasmide toegevoegd. Aan de negatieve controle wordt 5 µl MilliQ toegevoegd en aan de positieve controle wordt 5 μl van het DNA van C. psittaci stam 92/1293 toegevoegd. Voer de eerste ronde van de nested PCR uit volgens:
Tabel 3-3: PCR protocol van de eerste ronde van de nested PCR.
Stap Initiële denaturatie 20 cylci
-
Temperatuur
Finale extensie
95˚C 95˚C 59˚C 72˚C 72˚C
Hold
16˚C
Denaturatie Annealing Extensie
Tijd 5 min 1 min 2 min 3 min 5 min
Bewaar de amplificatieproducten bij -20°C
3.5.4 NESTED PCR VOOR DIAGNOSTIEK VAN C. PSITTACI: RONDE 2 -
Bereid de mastermix op ijs; voor 5 stalen wordt aan 250 µl kloonanalysebuffer 1 µM interne forward en 1 µM reverse primer (zie Tabel 3-4), 0,5 µl Taq buffer en 0,1 Unit Taq polymerase toegevoegd
Tabel 3-4: Sequentie van de interne primers.
Primer Interne forward Interne reverse -
Sequentie (5’-3’) (lengte) GCA GGA TAC TAC GGA GA (17 bp) GGA ACT CAG CTC CTA AAG (18 bp)
Voer de tweede PCR ronde van de nested PCR uit volgens:
Tabel 3-5: PCR protocol van de tweede ronde van de nested PCR.
Stap Initiële denaturatie 25 cylci
Denaturatie Annealing Extensie
Finale extensie Hold -
Bewaar de amplificatieproducten bij -20°C
27
Temperatuur 95˚C 95˚C 47˚C 72˚C 72˚C 16˚C
Tijd 5 min 1 min 2 min 3 min 3 min
3.5.5 GELELEKTROFORESE 3.5.5.1 GEL BEREIDEN -
Los 1 g agarose (Invitrogen, 15510-027) op in 99 ml TBE buffer (0,5x) Kook het mengsel op tot een homogene vloeistof Koel het mengsel af onder de kraan Breng de kam aan in de vorm en giet de agarose uit Verwijder de kam na het stollen van de gel en breng de gel over in het bakje voor gelelektroforese
3.5.5.2 GELELEKTROFORESE -
3.6
Voeg 5 µl MilliQ en 2 µl ladingsbuffer toe aan 5 µl van de amplificatieproducten Laad de BenchTop ladder (Promega, G7541) en de stalen en loop de gel bij 100 Volt gedurende 45 min Kleur de gel gedurende 20 min in het ethidiumbromide bad en visualiseer de gel
ENVELOPPESTUDIE: ISOLATIE C. PSITTACI
3.6.1 OPLOSSINGEN 3.6.1.1 TRANSPORTMEDIUM Weeg 3,42 g sucrose (Sigma, S1888) af en los op in 15 ml BiDest. Weeg 0,62 g natriumdiwaterstoffosfaat (Sigma, 71640-250G) af en los op in 5 ml BiDest. Weeg 0,107 g dinatriumwaterstoffosfaat-dihydraat (Vel, 2314487) af en los op in 5 ml BiDest. Voeg 50 μl gentamycine (50 mg/ml) (Gibco,15750-037) bij 5 ml BiDest. Breng al deze oplossingen samen en leng aan tot 50 ml met BiDest. Filtersteriliseer over een 220 nm filter en voeg vervolgens 2,5 ml H.I. FCS, 50 μl fungizone en 100 μl vancomycine voor transportmedium toe.
3.6.1.2 VANCOMYCINE VOOR TRANSPORTMEDIUM Weeg 1 g vancomycine (GlaxoSmithKline, 725-IS-562-F12) af en los op in 20 ml BiDest. Filtersteriliseer over een 220 nm filter, verdeel over falcons en bewaar bij -20 °C.
3.6.2 DETECTIE C. PSITTACI IN SWABS -
Neem de swabs uit de -80˚C en ontdooi in het warmwaterbad Schud de swabs gedurende 1 uur aan 300 rpm bij 4°C Breng de stalen met transportmedium over naar steriele epjes Bewaar de stalen bij -80°C Inoculeer, in tweevoud, 24 uur oude BGM cellen met 75 μl van elk staal en centrifugeer gedurende 1 uur aan 2000 x g bij 37˚C Voeg 1 ml cCKM toe per container Incubeer de containers (volledig dichtgedraaid) bij 37˚C in de 5% CO2-incubator Voer na zes dagen een DIF kleuring uit zoals beschreven in 3.2.4 Voeg aan de andere reeks 1 ml SPG toe en bewaar bij -80˚C
28
4 4.1
RESULTATEN ENVELOPPESTUDIE
In de enveloppestudie werd de epidemiologie van C. psittaci op Vlaamse pluimveebedrijven onderzocht. Onder leiding van een dierenarts werden hiervoor per bedrijf twee faryngale swabs (één met transportmedium en één met RNA/DNA stabilisatiebuffer) genomen van tien kippen en twee werknemers. De swabs met transportmedium werden gebruikt voor isolatie, de swabs met RNA/DNA stabilisatiebuffer voor PCR. Daarnaast werd ook een vragenlijst ingevuld om extra informatie te verkrijgen over de kippen en de werknemers. Er werd onder meer gepeild naar de frequentie waaraan ademhalingssymptomen worden geobserveerd en het toedienen van antibiotica bij de kippen en de medische achtergrond van de werknemers. Na de staalname werden de swabs en bijbehorende vragenlijst teruggestuurd per post waarna de swabs werden bewaard bij -80˚C tot nader onderzoek. In totaal werden de stalen van acht verschillende kippenbedrijven onderzocht, wat het totaal op 80 stalen van kippen en 16 stalen van werknemers brengt.
4.1.1 PCR Op de swabs met RNA/DNA stabilisatiebuffer werd een DNA extractie uitgevoerd. Op dit DNA werd vervolgens een nested PCR uitgevoerd voor de specifieke detectie van het DNA van C. psittaci. Detectie van C. psittaci resulteert in een bandje van 472 bp en een bandje van 872 bp. Een voorbeeld van een gel met een positief en negatief staal wordt gegeven in Figuur 4-1.
Figuur 4-1: Voorbeeld van een gel met een positief en een negatief staal. Van links naar rechts is de gel als volgt geladen: positieve controle, 1 kb BenchTop DNA ladder, staal kip 1 (negatief staal), inhibitie-controle staal 1, staal kip 2 (positief staal) en inhibitie-controle van staal 2. Bij de positieve controle is het karakteristieke bandje van 472 bp en 872 bp zichtbaar. Bij de interne controle is het karakteristieke bandje van 703 bp zichtbaar.
In totaal werden er 80 kippenstalen en 16 stalen van de werknemers onderzocht op de aanwezigheid van DNA van C. psittaci. In twaalf van de 80 kippenstalen (15%) en in drie van de zestien (18,75%) werknemers werd DNA van C. psittaci aangetoond (Tabel 4-1).
29
Tabel 4-1: Overzicht van het aantal positieve PCR reacties per bedrijf, afzonderlijk voor de kippen en de werknemers.
Kippen
BB
BD
BG
BI
BJ
LE
LN
MBA
Totaal
0 10 0%
0 10 0%
2 10 20%
6 10 60%
0 10 0%
0 10 0%
4 10 40%
0 10 0%
12 80 15,00%
Werknemers
BB
BD
BG
BI
BJ
LE
LN
MBA
Totaal
PCR
0 2 0%
0 2 0%
0 2 0%
1 2 50%
0 2 0%
0 2 0%
2 2 100%
0 2 0%
3 16 18,75%
PCR
Aantal positieve PCRs Aantal PCR reacties % Aantal positieve PCRs Aantal PCR reacties %
Om bij negatieve stalen uit te kunnen sluiten dat deze het gevolg zijn van inhibitie, werd elk staal getest op inhibitie door er een extra PCR reactie op uit te voeren waaraan een inhibitie controle plasmide werd toegevoegd. Het inhibitie controle plasmide is een pcDNA1 vector waarop het ompA gen (472 bp) van C. psittaci met een extra fragment van 231 bp van het ompA werd gekloneerd zoals beschreven in Van Loock et al. (Van Loock et al., 2005b). Hierdoor genereert de inhibitiecontrole een bandje van in totaal (472 bp + 231 bp) 703 bp. In geen enkele PCR reactie werd echter inhibitie geobserveerd. Naast inhibitiecontroles werden er per PCR reactie nog twee extra controles meegelopen; een negatieve en een positieve controle. Via de negatieve controle wordt de PCR mastermix getest op de aanwezigheid contaminatie. Via de positieve controle wordt de werking van de PCR reactie zelf gecontroleerd. De negatieve controles van alle bedrijven testten negatief, de positieve controles van alle bedrijven testten positief.
4.1.2 ISOLATIE Voor de isolaties werden 80 kippenstalen en 16 stalen van werknemers onderzocht. Bij de kippen werd C. psittaci aangetoond in 63 (86,3%) van de 73 containers waarin groei mogelijk was. Bij de werknemers werden Chlamydiaceae gedetecteerd in 14 (87,5%) van de 16 werknemers (Tabel 4-2). In enkele containers (bedrijf LE en MBA) waren de BGM cellen niet gegroeid tot een volwaardige monolaag. Voor deze containers moet het experiment daarom herhaald moeten worden. Tabel 4-2: Overzicht van het aantal containers per bedrijf waarvoor isolatie van Chlamydiaceae mogelijk was alsook het aantal containers waarin celgroei van de BGM cellen werd gedetecteerd.
Kippen Isolatie bacteriën Containers met celgroei Werknemers Isolatie bacteriën Containers met celgroei
BB
BD
BG
BI
BJ
LE
LN
MBA
Totaal
10 10
0 10
10 10
10 10
10 10
9 9
10 10
4 4
63 73 86,30%
BB
BD
BG
BI
BJ
LE
LN
MBA
Totaal
2 2
0 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
14 16 87,50%
Al de werknemers die positief werden getest via isolatie of de nested PCR, werken op een bedrijf waarop bij de kippen ook C. psittaci werd aangetoond. Slechts één bedrijf (12,5%) scoort voor zowel de kippen als de werknemers volledig negatief voor Chlamydiaceae, zowel via PCR als via isolatie (bedrijf BD).
30
4.1.3 SCORES VAN DE ISOLATIE Aan de preparaten voor isolatie van C. psittaci werd een score (Tabel 4-3) toegekend. Deze score is gebaseerd op het aantal elementaire lichaampjes die worden geteld in het preparaat (zie Figuur 4-2) van de isolatie. Vervolgens werd de som van de scores per bedrijf genomen en gedeeld door het totale aantal containers waarin groei van BGM cellen mogelijk was. Hierdoor werd er een gemiddelde score per bedrijf bekomen (Tabel 4-4). Tabel 4-3: Scoresysteem voor de preparaten met EB: elementair lichaam en IPC: inclusie positieve cel.
Score 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Beschrijving Negatief 1-3 EBs 3-10 EBs en/of 1-2 IPCs 10-30 EBs en/of 2-10 IPCs 30-50 EBs en/of 10-20 IPCs >50 EBs en/of 20-50 IPCs ½ van het veld bevat IPC Het volledige veld bevat IPCs
Figuur 4-2: Afbeelding van het preparaat van bedrijf BG van kip 1 (links) en van werknemer 2 (rechts). Inclusies zijn aangeduid met pijltjes. Tabel 4-4: Overzicht van de gemiddelde score van de isolaties per bedrijf voor de kippen en de werknemers.
Kippen Gemiddelde score per bedrijf Werknemers Gemiddelde score per bedrijf
BB
BD
BG
BI
BJ
LE
LN
MBA
0,55
0,00
0,60
0,75
0,80
0,78
0,65
1,00
BB
BD
BG
BI
BJ
LE
LN
MBA
0,75
0,00
1,00
0,50
0,50
1,00
0,50
1,00
4.1.4 ENQUÊTES In totaal werden de stalen onderzocht van acht verschillende kippenbedrijven. Daarnaast is er per bedrijf een enquête beschikbaar waarin de bedrijfsgegevens en de frequentie van ademhalingsproblemen bij de kippen worden nagegaan. Van drie van de acht bedrijven zijn er bovendien enquêtes beschikbaar waarin de medische achtergrond van de werknemers nader wordt onderzocht. In totaal werden er drie types bedrijven onderzocht; drie bedrijven met vleeskuikens, twee bedrijven met vleeskuikenmoederdieren en drie bedrijven met leghennen. 31
Bij geen enkel bedrijf was buitenloop van de kippen mogelijk. De leeftijd van de dieren die wordt gehouden ligt tussen 0 en zes weken voor de bedrijven met vleeskuikens, tussen 18 en 60 weken voor bedrijven met vleeskuikenmoederdieren en tussen 17 en 83 weken voor bedrijven met leghennen. Het totale aantal kippen die per ronde per bedrijf worden gehouden ligt tussen de 1600 en 65000 kippen. In de enquêtes werden ook de sanitaire maatregelen bevraagd. Bij de meeste bedrijven wordt hiervoor een periode van leegstand voorzien van twee tot acht weken en wordt er ontsmet met ontsmettingsmiddelen (waaronder Megades en CID20). Er werden ook enkele vragen gesteld omtrent het observeren van ademhalingsproblemen bij de kippen en de gevolgen daarvan. Ademhalingsproblemen worden geobserveerd op vijf (MBA, LE, BJ, BN en LN) van de acht onderzochte bedrijven. Van deze vijf bedrijven worden er op drie bedrijven antibiotica toegediend via het drinkwater. Op één bedrijf (LE) wordt een patroon in de ademhalingsproblemen geobserveerd wanneer de dieren 16 tot 18 dagen oud zijn. Medische enquêtes zijn beschikbaar van de werknemers van de bedrijven MBA, BD en BB. Deze enquêtes zijn afkomstig van twee vrouwen en vier mannen tussen de 20 en 49 jaar oud. Al deze werknemers wonen op of nabij (<1 km) pluimveebedrijven en hebben dagelijks minimaal 1 uur contact met kippen. Op het moment van de staalname ondervonden de werknemers geen medische klachten en namen ook geen antibiotica in. Vier werknemers, afkomstig van bedrijven MBA en BB, ondervinden meermaals per jaar wel klachten van koorts, spierpijn, hoesten, braken, buikpijn en diarree. Bij geen enkele werknemer werd er door een arts ooit één van de volgende diagnoses gesteld: ornithose, psittacose, pneumonie, myocarditis, endocarditis, pericarditis, hepatitis, meningitis of sepsis. Een volledig overzicht van alle informatie uit de enquêtes is te vinden in Tabel 4-5, Tabel 4-6 en Tabel 4-7.
32
Tabel 4-5: Overzicht van de bedrijfsgegevens van elk bedrijf uit de enveloppestudie. Bedrijf
MBA
BB
BD
LE
BJ
BN
BI
LN
Type bedrijf
Vleeskuikenmoederdieren Nee
Leghennen
Vleeskuikenmoederdieren Nee
Vleeskuikens
Vleeskuikens
Vleeskuikens
Leghennen
Leghennen
Nee
Nee
Nee
Nee
Is het een biologisch bedrijf? Buitenloop
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Leeftijd van de dieren die worden gehouden Het aantal dieren per ronde
18-60 weken
17-83 weken
18-60 weken
0-6 weken
0-6 weken
0-6 weken
16-80 weken
41000
17500
1600
65000
22000
50000
17-75 weken 59000
Hoeveel stallen zijn er op het bedrijf Dichtheid van bezetting (kippen/m²)
5
4
2
2
3
2
2
1
7,2
7
7
23,3
22
Welke sanitaire maatregelen worden er genomen?
4 weken leegstand en ontsmetting met CID20
2 weken leegstand en ontsmetting
6-8 weken leegstand
6 dagen leegstand, reinigen en ontsmetten (Formol, Megades)
Ontsmetten met Megades en peroxide in waterlijn
Ontsmetten met CID20
3 weken leegstand en kuisen
Gemiddelde mortaliteit (%)
10%
5%
1,6%
2%
Zijn er andere bedrijven in de buurt?
op 1 km en op 5 km
op 1 km en 3 km
op 4 km en op 44 km
op 1 km
op 35 km, 10 km en 25 km
op 10 km
32 weken
31 weken
5 weken
4 weken
5,5 weken
Tussen 9% en 10% op 1,5 km, 3 km, 5 km en 5 km 21 weken
Leeftijd bemonstering Symptomen op moment van bemonstering
Nee
9
Ja, ademhalingsproblemen door Aspergillus fumigatus
Nee
Ontsmetting en desinfectie met Megades
Tabel 4-6: Overzicht van de ademhalingssymptomen per bedrijf. Bedrijf
MBA
BB
BD
LE
BJ
BN
BI
LN
Frequentie van observeren ademhalingssymptomen? Worden er hiervoor antibiotica toegediend?
Tot 10% van de tomen Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Tot 10% van de tomen Ja, tot 10% van de tomen via doxycycline via drinkwater
Tot 50% van de tomen
Nooit
Tot 10% van de tomen Ja, tot 10% van de tomen via doxycycline via drinkwater
Ja, tot 10% van de tomen via doxycycline en soludox in het drinkwater
Nooit
Tot 10% van de tomen Nooit
Is er een patroon in de ademhalingssymptomen?
Nee
Nee
Nee
Ja, op 16-18 dagen oud
Nee
Nee
Nee
Nee
33
Tabel 4-7: Overzicht van de informatie uit de medische enquêtes van zes werknemers. Bedrijf
MBAWerknemer 1
MBAWerknemer 2
BDWerknemer 1
BDWerknemer 2
BBWerknemer 1
BBWerknemer 2
Geslacht
Man
Vrouw
Man
Man
Man
Vrouw
Leeftijd
48
49
20
39
33
30
Woonachtig in de buurt van pluimveebedrijf?
Ja, eigen bedrijf
Ja, eigen bedrijf
Ja
Ja, eigen bedrijf
Ja
Ja, nabij een legkippenbedrijf en bedrijf met broedkippen (1 km)
Functie
Verzorging en controle
Verzorging en controle
Helpen
Bedrijfsleider
Zaakvoerder
Helpen
Sinds hoe lang oefent u deze functie uit?
25 jaar
30 jaar
2 jaar
17 jaar
6 (en 11 jaar)
3 jaar
Welke handelingen voert u voor deze functie uit?
Verzamelen grondeieren, herstellingen en controle
Enten, opfok en controle van dieren en verzamelen eieren en grondeieren en controle hiervan
Eieren rapen
Dagelijkse controle van kippen
Controle en eieren rapen
Controle en eieren rapen
Frequentie van handelingen?
Dagelijks
Dagelijks
Dagelijks
Dagelijks
Dagelijks
Dagelijks
Tijdsduur van contact / dag
8 uur
8 uur
1 uur
3 uur
3 uur
3 uur
Had u hiervoor ook een professionele functie waarin veel contact is met dieren?
Nee
Ja, afkomstig van bedrijf
Nee
Nee
Ja, met legkippen
Nee
Huisdieren
Nee
Nee
Nee
Nee
Ja, katten
Ja, katten
Medische achtergrond Rookt u?
Nee
Nee, ik ben gestopt sinds 1987
Nee
Nee
Nee
Nee
Ondervond u medische klachten voor de afname van de swabs?
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nam u antibiotica in voor het afnemen van de swabs?
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Heeft u last van astma?
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Heeft u last van allergie?
Ja, van huisstofmijt
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Laat u zich vaccineren tegen griep?
Ja
Ja
Nee
Nee
Nee
Nee
34
Wat is uw frequentie van antibioticainname?
Nvt
Nvt
Nvt
Nvt
Hoe lang is het geleden dat u antibiotica innam?
Nvt
Nvt
Nvt
16 maand
Wat was de reden hiervan?
Nvt
Nvt
Nvt
Geboorte
Welk antibioticum nam u in?
Nvt
Nvt
Nvt
Heeft u sinds u op het bedrijf werkt klachten van: Koorts?
Meermaals
Meermaals *
Nooit
Nooit
Meermaals
Meermaals
Spierpijn?
Meermaals
Meermaals *
Nooit
Nooit
Nooit
Meermaals
Pijnlijke ogen?
Meermaals
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Meermaals
Huiduitslag?
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Meermaals
Nooit
Niet-productieve hoest?
Meermaals
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Productieve hoest?
Meermaals
Meermaals *
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Ophoesten van slijmen met bloed?
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Pijnlijke of moeilijke ademhaling?
Heeft hiervan meermaals per jaar last, soms last van stof vooral bij schoonmaken van stallen
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Maag- darmklachten Braken
Meermaals
Meermaals *
Nooit
Nooit
Nooit
Nooit
Buikpijn
Meermaals
Meermaals *
Nooit
Nooit
Meermaals
Nooit
Diarree
Meermaals
Meermaals *
Nooit
Nooit
Meermaals
Nooit
* Klachten zijn niet gerelateerd aan het werk in de stallen
Werd door een arts ooit de diagnose gesteld van: Ornithose of psittacose?
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Pneumonie?
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Myocarditis?
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Endocarditis?
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Pericarditis?
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Hepatitis?
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Meningitis?
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Sepsis?
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
35
4.2
THP1 CELLEN
4.2.1 APOPTOSE Om het effect van Chlamydiaceae op de apoptose van THP1 cellen te bestuderen, werd gebruik gemaakt van de TUNEL in situ celdood detectie kit. Via TUNEL is het mogelijk om DNA fragmenten fluorescent te labelen en deze vervolgens te bekijken via fluorescentiemicroscopie. Uit de TUNEL kleuring blijkt dat C. psittaci waarschijnlijk geen celdood induceert.
4.2.2 INFECTIVITEITSTITRAT IE Om informatie te verkrijgen over de virulentie van de C. psittaci stam 92/1293 in humane macrofagen werd een infectiviteitstitratie uitgevoerd op het supernatans van geïnfecteerde THP1 cellen (MOI=1) op 2 u, 4 u, 8 u, -1 12 u, 18 u, 24 u, 36 u, 48 u en 72 u post infectie. Bij een infectiviteitstitratie wordt een verdunningreeks (10 tot 10-6) van het supernatans van geïnfecteerde cellen geïnoculeerd in BGM cellen. Als titer van de C. psittaci EBs in het supernatans wordt de kleinste verdunning genomen waarin het aantal EBs te bepalen zijn. De verdunningsreeks (10-1 tot 10-6) van het supernatans die werd getest bleek echter onvoldoende hoog om de titer van het supernatans te bepalen. In alle verdunningen was er namelijk groei mogelijk van C. psittaci waardoor de titer niet exact bepaald kon worden. De infectiviteitstitratie zou daarom opnieuw gemaakt moeten worden voor hogere verdunningen.
36
5 5.1
DISCUSSIE ENVELOPPESTUDIE
Uit de data van de nested PCR en de isolaties blijkt er een opvallend verschil te zijn in de gevoeligheid van detectie voor Chlamydiaceae. Zo werd C. psittaci bij kippen via isolatie in 86,3% van de stalen aangetoond en via nested PCR slechts in 15% van de stalen. Nested PCR lijkt daarom minder gevoelig te zijn voor de detectie van C. psittaci dan isolatie. Dit verschil in detectie is mogelijks te verklaren door het feit dat PCR een hogere detectielimiet heeft dan isolatie. Zoals uitgewerkt in Figuur 5-1 heeft PCR, in theorie, een minimale detectiegrens van 400 DNA kopijen/2 ml RNA/DNA stabilisatiebuffer terwijl er bij isolatie, in theorie, een detectiegrens is van 25 (levensvatbare) bacteriën/2 ml transportmedium (Uyttendaele, 2011-2012). Daarnaast is er bij isolatie ook nog een groeiperiode mogelijk waarin Chlamydiaceae gedurende zes dagen kunnen groeien en de kans op detectie ook toeneemt. In de literatuur werd de verhoogde gevoeligheid van isolatie in vergelijking met nested PCR voor de detectie van C. psittaci ook reeds aangetoond (Sting et al., 2006).
Figuur 5-1: Vergelijken minimale detectielimiet van PCR en isolatie.
Voor het verschil in detectie tussen isolatie en nested PCR bij de werknemers is er mogelijks nog een reden. Bij nested PCR wordt immers specifiek C. psittaci gedetecteerd, bij isolaties worden Chlamydiaceae gedetecteerd. De literatuur beschrijft dat C. psittaci enkel voorkomt bij vogels, bij de mens kunnen naast C. psittaci ook andere Chlamydiaceae worden gedetecteerd zoals bijvoorbeeld C. trachomatis. Hierdoor kan het zijn dat het aantal werknemers waarbij Chlamydiaceae werd gedetecteerd via isolaties een overschatting is van het werkelijke aantal gevallen waarin C. psittaci aanwezig is. Uit de isolaties blijkt dat C. psittaci bij 86,3% van de onderzochte kippen werd gedetecteerd, nochtans is de frequentie waaraan ademhalingsproblemen worden geobserveerd laag en wordt de aanwezigheid gekarakteriseerd door een lage mortaliteit (Tabel 4-6). De afwezigheid van symptomen bij pluimvee dat geïnfecteerd is met C. psittaci werd onder meer reeds vastgesteld door Laroucau et al. (Laroucau et al., 2009). In deze studie werd de aanwezigheid van Chlamydiaceae op Franse kippenslachterijen onderzocht. Hoewel Chlamydiaceae bij de meeste dieren werden gedetecteerd, vertoonden deze geen klinische symptomen van ziekte. Harkinezhad et al. (Harkinezhad et al., 2009a) verklaart dit fenomeen door het feit dat veel vogels chronisch zijn geïnfecteerd en geen symptomen van ziekte vertonen tot ze worden gestresseerd. De vogels scheiden dan periodiek Chlamydiaceae uit welke mensen en/of andere vogels kunnen infecteren. Daarnaast zijn de klinische symptomen van infecties met C. psittaci zeer variabel en sterk afhankelijk van het species en de leeftijd van de vogels en de C. psittaci stam (Andersen and Vanrompay, 2003).
37
Vandaag de dag komen infecties met C. psittaci dus zeer frequent voor op pluimveebedrijven. In tegenstelling tot vroeger vertonen de dieren bij een infectie minder ademhalingsproblemen en wordt minder of zelfs geen sterfte geobserveerd (Verminnen et al., 2006). De observatie dat in 86,3% van de onderzochte kippen C. psittaci werd gedetecteerd en de frequentie van het observeren van ademhalingsproblemen en mortaliteit laag is, bevestigt het feit dat C. psittaci endemisch aanwezig is op bijna alle Belgische pluimveebedrijven. In de literatuur worden verschillende referenties teruggevonden die bevestigen dat zoönotische overdracht van C. psittaci naar de mens mogelijk is. Zo werden in 2005 in Duitsland 24 mensen geïnfecteerd door een uitbraak van psittacose bij pluimvee (Gaede et al., 2008). Één patiënt overleed zelfs aan deze infectie. Een analyse van de C. psittaci isolaten duidde op de aanwezigheid van genotype A en genotype E/B. Genotype A werd gedetecteerd in de drie patiënten die het meeste ziek waren. Door Harkinezhad et al. werd in 2007 in een Belgische papegaaienkwekerij onder meer de overdracht van C. psittaci onderzocht naar de beheerder van de kwekerij, de dierenarts en de dierenartsassistente (Harkinezhad et al., 2007). C. psittaci werd bij al de onderzochte personen gedetecteerd. Dit was tevens de eerste studie waarin de transmissie van C. psittaci genotype E/B van papegaaien naar de mens werd gemeld. Genotype E/B veroorzaakt geen zware symptomen bij mensen of vogels. In een studie van Vanrompay et al. werd de transmissie onderzocht van C. psittaci op Belgische papegaaienkwekerijen van papegaaien naar werknemers. Bij zeven van de 47 personen die op de faciliteit werkten werd het DNA van C. psittaci gentoype A en E/B gedetecteerd. In 2010 onderzocht Dickx et al. de zoönotische overdracht van C. psittaci van duiven naar de duivenmelkers in een duivenfaciliteit (Dickx et al., 2010a). Bij vier van de 32 (12,5%) duivenmelkers werd C. psittaci gedetecteerd. Genotypering was mogelijk voor twee stalen, deze wees op de detectie van C. psittaci genotype D. In 2010 werd door Dickx et al. ook de zoönotische transmissie van C. psittaci op een kippenslachterij en een kalkoenenslachterij onderzocht (Dickx et al., 2010b). 7,6% en 6% van de werknemers op de kippenslachterij werden positief getest via PCR respectievelijk cultuurmethodes. Op de kalkoenenslachterij testten 87% en 61% van de werknemers positief voor respectievelijke detectie via PCR en cultuur. Bij al de stalen van de werknemers die via genotypering bepaald konden worden, werd genotype D gedetecteerd. Ook uit deze enveloppestudie blijkt overdracht van C. psittaci van kippen op werknemers op te treden. Immers alle werknemers in deze studie die dagelijks in contact komen met kippen waarop C. psittaci is aangetoond, zijn positief voor Chlamydiaceae. Zoönotische overdracht van C. psittaci blijkt ook uit de medische enquêtes die beschikbaar zijn voor de werknemers van drie verschillende bedrijven: BB, MBA en BD. Bedrijf BD is het bedrijf dat negatief testte op C. psittaci zowel via isolaties als via de nested PCR. Dit blijkt ook uit de enquêtes van de werknemers. Op het moment van de staalname ondervonden deze geen symptomen en namen geen antibiotica in. Ook uit de enquête blijkt dat ze geen medische problemen ondervinden die zijn gerelateerd aan infecties met C. psittaci (Tabel 4-7). Bij de werknemers van de overige twee bedrijven, BB en MBA, werd wel C. psittaci gedetecteerd via isolaties. Op het moment van de staalname ondervonden de werknemers geen medische klachten, noch werden deze behandeld met antibiotica. Bij geen enkele werknemer is ooit de diagnose ornithose of psittacose gesteld. Uit de enquêtes blijkt echter dat drie (75%) van de vier werknemers, van de bedrijven BB en MBA, meermaals per jaar medische klachten ondervinden die gerelateerd zijn aan infecties met C. psittaci (spierpijn en koorts). Deze vier werknemers zijn vermoedelijk drager van C. psittaci, de diagnose ornithose of psittacose is echter nog nooit gesteld. Om met zekerheid te kunnen besluiten dat C. psittaci die op de kippen werd gedetecteerd identiek is aan de Chlamydiaceae die bij de werknemers werden gedetecteerd, dient het genotype van de isolaten te worden bepaald.
38
Uit bovenstaand resultaat blijkt dat C. psittaci een groot risico vormt voor zoönotische overdracht naar werknemers van kippenbedrijven maar ook voor werknemers van slachterijen en voor dierenartsen. Dit benadrukt het belang van risicoanalyse en maatregelen voor het inperken van infecties met C. psittaci. Risicoanalyse en risicomanagement voor het omgaan met en verwerken van gevogelte worden in Deschuyffeleer et al. (Deschuyffeleer et al., 2011) toegelicht. Op de eerste plaats is het belangrijk om infecties en blootstelling aan geïnfecteerd materiaal zoveel mogelijk te elimineren. Indien dit niet mogelijk is, is het belangrijk van risicovolle processen zoveel mogelijk te vervangen door minder risicovolle. Denk hierbij aan het mechaniseren van bepaalde processen. Voor het minimaliseren van de kans op infecties worden collectieve en persoonlijke beschermingsmaatregelen aanbevolen. Deze maatregelen worden uitgebreid toegelicht in Deschuyffeleer et al. (Deschuyffeleer et al., 2011). Tenslotte moeten al deze handelingen goed opgevolgd en gecontroleerd worden door een arbeidsdeskundige. Ondanks de hoge prevalentie van C. psittaci, werden er op één bedrijf (12,5%), bedrijf BD, geen Chlamydiaceae gedetecteerd. Het is onwaarschijnlijk dat de aanwezigheid van C. psittaci op een bedrijf zou gemist zijn ten gevolge van de staalname. In de enveloppestudie werden stalen ter hoogte van de farynx genomen. De hoge gevoeligheid voor het detecteren van C. psittaci via faryngale swabs werd aangetoond door Andersen et al. (Andersen, 1996). In dit artikel werd een vergelijkende studie uitgevoerd voor de detectie van C. psittaci via faryngale, faecale en cloacale swabs bij experimenteel geïnfecteerde parkieten en kalkoenen. Faryngale swabs bleken het meest accuraat te zijn voor de detectie van C. psittaci en maakten ook detectie mogelijk van vroege infecties, infecties die bijna geklaard waren en klinisch asymptomatische infecties. Een verklaring voor de betere detectie via faryngale swabs is te vinden in een studie van Tappe et al. (Tappe et al., 1989). Hierin werd aangetoond dat bij geïnfecteerde kalkoenen de laterale neusholtes zeer lang geïnfecteerd blijven. Secreties van deze holtes zijn belangrijk voor het bevochtigen van de nasale mucosa en worden afgevoerd via de farynx. Ook excreties van de longen worden afgevoerd via de farynx. Daarbij wordt het ademhalingssysteem pas als laatste geklaard van een infectie. Deze redenen verklaren waarschijnlijk de hoge gevoeligheid van faryngale swabs tegenover faecale of cloacale swabs. Een bijkomend voordeel van faryngale swabs is bovendien dat deze eenvoudig te nemen zijn. Op basis van deze testen kunnen we besluiten dat er op bedrijf BD geen C. psittaci heerst. Zo worden er namelijk ook nooit ademhalingsproblemen geobserveerd bij kippen en ondervinden de werknemers geen medische klachten die geassocieerd zijn met infecties met C. psittaci. Op basis van de enquêtes blijkt de bedrijfsvoering van bedrijf BD nochtans niet sterk verschillend te zijn van de overige zeven bedrijven waarop de isolaties en/of PCR wel positief testten. Het enige grote verschil is het aantal dieren dat per ronde wordt gehouden (Tabel 4-5). Op dit bedrijf worden er per ronde ongeveer 1600 kippen gehouden terwijl er op de overige zeven bedrijven per ronde minimaal tien maal meer (17500 tot 65000 kuikens/kippen) worden gehouden. Daarnaast blijkt de zes tot acht weken lange leegstand van de stallen van bedrijf BD beduidend langer te zijn in vergelijking met de leegstand van de stallen bij de overige zeven bedrijven. Bij drie bedrijven (BJ, LN en BN) wordt er geen leegstand van de stallen vermeld, van de overige vier bedrijven is er sprake van 6 dagen (LE), twee weken (BB), drie weken (BI) en vier weken (MBA) leegstand van de stal. De leegstand van de stal op bedrijf BD is dus minimaal anderhalf tot tweemaal langer dan de langste periode van leegstand van de overige stallen. Hoewel er geen specifiek ontsmettingsmiddel of ontsmettingsprocedure wordt vermeld in de enquête van bedrijf BD, doet dit toch vermoeden dat er een reden is voor de zes tot acht weken lange leegstand van dit bedrijf. Mogelijks een zeer grondige ontsmettingsprocedure.
39
In de enquêtes werd ook het observeren van ademhalingsproblemen nader bevraagd. Op één bedrijf, bedrijf LE, wordt een patroon gedetecteerd in de ademhalingsproblemen. Op dit bedrijf, een vleeskuikenbedrijf, komt dit patroon tot uiting wanneer de kuikens 16 tot 18 dagen oud zijn. Dit fenomeen is mogelijks te verklaren doordat kuikens gedurende de eerste twee weken nog beschermd worden door maternale antilichamen. Na twee tot drie weken nemen de maternale antilichamen geleidelijk af tot deze nagenoeg afwezig zijn na vier weken (Verminnen et al., 2008; Ahmed, 2003). Vanaf drie tot vier weken kunnen kuikens dus pas voor een eerste maal worden geïnfecteerd. Omdat de kuikens dan nog geen immunologisch geheugen hebben ontwikkeld, gaat deze eerste infectie (meestal) gepaard met klinische symptomen (Van Loock et al., 2005a). Dit vormt mogelijks een verklaring voor het patroon in de ademhalingsproblemen op dat bedrijf. Op de overige twee bedrijven waarop vleeskuikens worden gehouden in de leeftijd van 0 tot 6 weken (bedrijven BJ en BN) werd dit patroon niet vermeld. Mogelijks zijn de ademhalingssymptomen op deze bedrijven minder opvallend en werden ze daarom niet opgemerkt. Tenslotte werden de data uit de enquêtes en de scores van de isolaties statistisch verwerkt. De detectie van C. psittaci bij kippen was niet significant gecorreleerd aan de aanwezigheid van ademhalingsproblemen bij kippen of het toedienen van antibiotica. Immers C. psittaci kan aanwezig zijn in dragers die geen klinische symptomen van ziekte vertonen. Er werd ook geen correlatie gedetecteerd tussen de score per bedrijf en de leeftijd waarop de kuikens en kippen werden bemonsterd. Ook de scores voor de drie verschillende soorten bedrijven: leghennen (65%), vleeskuikenmoederdieren (50%) en vleeskuikens (72,6%) bleken niet significant verschillend. Er werd ook geen verband gedetecteerd tussen de scores en de dichtheid van bezetting van de kippen in de kippenstallen, noch op basis van het kippenras, noch op basis van de gemiddelde mortaliteit.
5.2
THP1 CELLEN
5.2.1 APOPTOSE Apoptose of geprogrammeerde celdood is essentieel voor verschillende eukaryotische processen zoals embryogenese, de ontwikkeling van het immuunsysteem en de eliminatie van beschadigde cellen. Apoptotische cellen vertonen karakteristiek afwijkingen in de kern en het cytoplasma zoals “blebbing” van de plasmamembraan en nucleaire desintegratie waarbij het DNA wordt gefragmenteerd (Roche, 2010). De inductie van apoptose gebeurt via een extrinsieke of een intrinsieke signaleringspathway. De extrinsieke signalering wordt geïnitieerd door de binding van een ligand op zijn receptor bijvoorbeeld het Fas ligand op de Fas receptor. De intrinsieke signalering gebeurt via de activatie en oligomerisatie van eiwitten (vb BAX) welke assembleren in de mitochondriale membraan en deze destabiliseren (Byrne and Ojcius, 2004). Apoptose is verschillend van necrose, een ander proces dat resulteert in celdood. Necrose heeft typisch een ontsteking tot gevolg terwijl apoptotische cellen worden gefagocyteerd en ontsteking zelfs wordt onderdrukt door de productie van anti-inflammatoire cytokines zoals tumor growth factor β en interleukine 10 (Savill and Fadok, 2000; Byrne and Ojcius, 2004). Een groot aantal pathogenen, waaronder Chlamydiaceae, zijn in staat om te interfereren met apoptose. Chlamydiaceae zijn in staat om in bepaalde omstandigheden apoptose te induceren en in andere omstandigheden apoptose net actief te inhiberen.
40
Uit de TUNEL kleuring valt af te leiden dat C. psittaci waarschijnlijk geen celdood induceert. Verder onderzoek hiernaar wordt aangewezen om dit te bevestigen. Via TUNEL worden er immers DNA breuken gedetecteerd welke een indicatie geven dat apoptose optreedt. DNA breuken kunnen echter ook duiden op bijvoorbeeld een late necrose of autolyse (Nishizaki et al., 1999). Anderzijds zijn er ook situaties mogelijk waarin apoptose wordt geïnduceerd zonder DNA degradatie. Daarom wordt er aangeraden van altijd een tweede onafhankelijke test uit te voeren, naast TUNEL, voor het karakteriseren van celdood voor het al dan niet bevestigen van apoptose (Roche, 2008).
5.2.2 INFECTIVITEITSTITRATIE Hoewel de titer van het supernatans in dit experiment niet exact te bepalen was, is het toch mogelijk dit resultaat te vergelijken met een infectiviteitstitratie van de C. psittaci stam CP3 op THP1 cellen die werd uitgevoerd door Bieke Soen. Dit experiment werd in dezelfde omstandigheden uitgevoerd, maar de verdunningsreeks van 10-1 tot 10-6 die hier werd getest bleek echter wel voldoende om de titer van het supernatans te bepalen. De C. psittaci stam 92/1293 lijkt meer virulent te zijn voor de humane THP1 cellen dan de C. psittaci stam CP3. Dit werd ook aangetoond in een studie van Beeckman et al. (Beeckman and Vanrompay, 2009a). In deze studie werd de pathogeniciteit van de hoog virulente C. psittaci genotypes A en D (waaronder C. psittaci 92/1293) vergeleken met het laag virulente genotype B (waaronder C. psittaci CP3) in de kippen monocyt/macrofaag HD11 cellen. De lagere virulentie van genotype B in kalkoenen uit zich onder meer in een langere incubatieperiode, het feit dat de maximale replicatie wordt uitgesteld en dat het tropisme minder strikt is dan bij de hoog pathogene genotypes A en D (Vanrompay et al., 1994).
41
6
CONCLUSIE EN TOEKOMSTPERSPECTIEVEN
In een eerste luik van deze thesis, de enveloppestudie, werd C. psittaci gedetecteerd bij 86,3% van de onderzochte kippen en werden Chlamydiaceae gedetecteerd in 87,5% van de onderzochte werknemers. Uit deze studie volgen ook nog enkele conclusies die reeds in andere epidemiologische studies werden aangetoond. Ten eerste blijkt dat isolaties gevoeliger zijn voor de detectie van C. psittaci in veldstalen dan nested PCR. Ten tweede wordt het endemisch voorkomen van C. psittaci op pluimveebedrijven bevestigd. Ten slotte lijkt zoönotische overdracht van C. psittaci van kippen naar werknemers op te treden. Genotypering van de isolaten van de kippen en werknemers is echter noodzakelijk om dit vermoeden te bevestigen. De eerste conclusie wijst vooral op de nood aan gevoelige technieken die snel resultaten genereren voor de diagnose van C. psittaci. Isolaties zijn zeer gevoelig, de belangrijkste nadelen van deze methode zijn dat het een tijdrovende techniek (minimaal zes dagen) is en dat er een L3 laboratorium en ervaring vereist is. Nested PCR is minder tijdrovend maar ook hier is een gespecialiseerd laboratorium vereist en bovendien lijkt de techniek veel minder gevoelig dan isolatie. De laatste twee conclusies hebben belangrijke gevolgen. Enerzijds vormt het endemisch voorkomen van C. psittaci een belangrijke kostenpost voor pluimveehouders. Om infecties met C. psittaci te bestrijden worden antibiotica, veelal preventief, ingezet. Wegens het risico op het ontwikkelen van antibioticumresistentie, moet het gebruik van antibiotica zoveel mogelijk worden ingeperkt. Er is dus nood aan een effectief vaccin. Anderzijds vormt de kans op zoönotische overdracht van C. psittaci een groot gevaar voor de mens. Omdat de ziekteverschijnselen van deze infecties sterk kunnen verschillen, is in de eerste plaats de herkenning van de symptomen een belangrijke stap. Dit is niet alleen van belang voor mensen die dagelijks in contact komen met pluimvee maar ook bijvoorbeeld voor mensen die vogels als huisdier houden. Alsook artsen zouden meer moeten gewezen worden op het herkennen van de symptomen. Het niet herkennen van de symptomen is waarschijnlijk een van de belangrijkste redenen waardoor het aantal psittacose infecties in België wordt onderschat (Harkinezhad et al., 2009b). De ontwikkeling van betere methodes voor het vaststellen van infecties zou daarom bijdragen tot het correct diagnosticeren van psittacose. Daarnaast zijn ook maatregelen voor de controle van aviaire chlamydiose bij vogels nodig voor het beschermen van mensen tegen psittacose. Door het Vlaams Agentschap Zorg en Gezondheid (VAZG, 2012) werden hiervoor reeds richtlijnen opgesteld. Deze richtlijnen hebben betrekking tot ontsmetting, de behandeling van infecties, algemene preventieve maatregelen en maatregelen die moeten genomen worden in geval van infecties. Deze conclusies zijn gebaseerd op de resultaten van de enveloppestudie waarin acht kippenbedrijven werden onderzocht. Om deze conclusies (statistisch) beter te onderbouwen is het aangeraden om meer bedrijven in de studie te betrekken en is verder onderzoek nodig. In het tweede luik van deze thesis werd de virulentie van de C. psittaci stam 92/1293 in humane macrofagen nagegaan via een infectiviteitstitratie. In kippenmacrofagen werd de hogere virulentie van C. psittaci stam 92/1293 in vergelijking met C. psittaci CP3 reeds aangetoond in een studie van Beeckman et al. (Beeckman and Vanrompay, 2009a). Ook bij humane macrofagen lijkt C. psittaci stam 92/1293 meer virulent te zijn dan de C. psittaci stam CP3. Daarnaast lijkt C. psittaci 92/1293 geen celdood te induceren in humane monocyten/macrofagen. Verder onderzoek hieromtrent is nodig.
42
7
LITERATUURLIJST
(Cfsph, Avian Chlamydiosis, 2009). http://www.cfsph.iastate.edu. (Cfsph, Zoonotic Chlamydiae from Mammals, 2005). http://www.cfsph.iastate.edu. (Microbiology and immunology online, 2010). http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/chlamyd.htm. (The World Organisation for Animal Health (OIE) - Handistatus, 2004). http://www.oie.int. Abdelrahman, Y. M. &Belland, R. J. (2005). The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiol Rev 29(5): 949-959. Ahmed, Z. (2003). Role of Maternal Antibodies in Protection Against Infectious Bursal Disease in Commercial Broilers. International Journal of Poultry Science. Andersen, A. A. (1996). Comparison of pharyngeal, fecal, and cloacal samples for the isolation of Chlamydia psittaci from experimentally infected cockatiels and turkeys. J Vet Diagn Invest 8(4): 448-450. Andersen, A. A. &Vanrompay, D. (2000). Avian chlamydiosis. Rev Sci Tech 19(2): 396-404. Andersen, A. A. &Vanrompay, D. C. (2003). Avian Chlamydiosis (psittacosis, ornithosis). 11e editie Diseases of poultry, Y. M. Saif. Becker, Y. (1996). Chapter Chlamydia. Medical Microbiology. 4th edition. Beeckman, D. (2009). Examining the Role of Type III Secretion in the Biology and Intracellular Pathogenesis of Chlamydophila psittaci. PhD thesis, Ghent University, Ghent, Belgium. Beeckman, D. S. &Vanrompay, D. C. (2009a). Biology and intracellular pathogenesis of high or low virulent Chlamydophila psittaci strains in chicken macrophages. Vet Microbiol 141(3-4): 342353. Beeckman, D. S. &Vanrompay, D. C. (2009b). Zoonotic Chlamydophila psittaci infections from a clinical perspective. Clin Microbiol Infect 15(1): 11-17. Belland, R. J., Nelson, D. E., Virok, D., Crane, D. D., Hogan, D., Sturdevant, D., Beatty, W. L. &Caldwell, H. D. (2003). Transcriptome analysis of chlamydial growth during IFN-gamma-mediated persistence and reactivation. Proc Natl Acad Sci U S A 100(26): 15971-15976. Byrne, G. I. &Ojcius, D. M. (2004). Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol 2(10): 802-808. Caldwell, H. D. &Judd, R. C. (1982). Structural analysis of chlamydial major outer membrane proteins. Infect Immun 38(3): 960-968. Caldwell, H. D., Kromhout, J. &Schachter, J. (1981). Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. Infect Immun 31(3): 1161-1176. Caprette, D. R. (2007). Experimental Biosciences - Introductory laboratory Bioc 211. Cocchiaro, J. L. &Valdivia, R. H. (2009). New insights into Chlamydia intracellular survival mechanisms. Cell Microbiol 11(11): 1571-1578. 43
Conlan, J. W., Ferris, S., Clarke, I. N. &Ward, M. E. (1989). Surface-exposed epitopes on the major outer-membrane protein of Chlamydia trachomatis defined with peptide antisera. J Gen Microbiol 135(12): 3219-3228. Dautry-Varsat, A., Subtil, A. &Hackstadt, T. (2005). Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol 7(12): 1714-1722. Dean, D., Patton, M. &Stephens, R. S. (1991). Direct sequence evaluation of the major outer membrane protein gene variant regions of Chlamydia trachomatis subtypes D', I', and L2'. Infect Immun 59(4): 1579-1582. DeSchrijver, K. (2003). Psittacose, nog steeds een diagnostische en epidemiologische uitdaging. Vlaamse infectieziektenbulletin 46/2003/4 Deschuyffeleer, T. P., Tyberghien, L. F., Dickx, V. L., Geens, T., Saelen, J. M., Vanrompay, D. C. &Braeckman, L. A. (2011). Risk Assessment and Management of Chlamydia psittaci in Poultry Processing Plants. Ann Occup Hyg. Dickx, V., Beeckman, D. S., Dossche, L., Tavernier, P. &Vanrompay, D. (2010a). Chlamydophila psittaci in homing and feral pigeons and zoonotic transmission. J Med Microbiol 59(Pt 11): 13481353. Dickx, V., Geens, T., Deschuyffeleer, T., Tyberghien, L., Harkinezhad, T., Beeckman, D. S., Braeckman, L. &Vanrompay, D. (2010b). Chlamydophila psittaci zoonotic risk assessment in a chicken and turkey slaughterhouse. J Clin Microbiol 48(9): 3244-3250. Dugan, J., Rockey, D. D., Jones, L. &Andersen, A. A. (2004). Tetracycline resistance in Chlamydia suis mediated by genomic islands inserted into the chlamydial inv-like gene. Antimicrob Agents Chemother 48(10): 3989-3995. EMBL-EBI (2011). http://www.ebi.ac.uk/2can/genomes/bacteria/Chlamydophila_pneumoniae.html. Escalante-Ochoa, C., Ducatelle, R., Charlier, G., De Vos, K. &Haesebrouck, F. (1999). Significance of host cell kinesin in the development of Chlamydia psittaci. Infect Immun 67(10): 5441-5446. Everett, K. D. (2000). Chlamydia and Chlamydiales: more than meets the eye. Vet Microbiol 75(2): 109-126. Everett, K. D., Bush, R. M. &Andersen, A. A. (1999). Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int J Syst Bacteriol 49 Pt 2: 415-440. Gaede, W., Reckling, K. F., Dresenkamp, B., Kenklies, S., Schubert, E., Noack, U., Irmscher, H. M., Ludwig, C., Hotzel, H. &Sachse, K. (2008). Chlamydophila psittaci infections in humans during an outbreak of psittacosis from poultry in Germany. Zoonoses Public Health 55(4): 184-188. Geens, T., Desplanques, A., Van Loock, M., Bonner, B. M., Kaleta, E. F., Magnino, S., Andersen, A. A., Everett, K. D. &Vanrompay, D. (2005a). Sequencing of the Chlamydophila psittaci ompA gene reveals a new genotype, E/B, and the need for a rapid discriminatory genotyping method. J Clin Microbiol 43(5): 2456-2461.
44
Geens, T., Dewitte, A., Boon, N. &Vanrompay, D. (2005b). Development of a Chlamydophila psittaci species-specific and genotype-specific real-time PCR. Vet Res 36(5-6): 787-797. Griffiths, P. C., Plater, J. M., Horigan, M. W., Rose, M. P., Venables, C. &Dawson, M. (1996). Serological diagnosis of ovine enzootic abortion by comparative inclusion immunofluorescence assay, recombinant lipopolysaccharide enzyme-linked immunosorbent assay, and complement fixation test. J Clin Microbiol 34(6): 1512-1518. Hackstadt, T., Todd, W. J. &Caldwell, H. D. (1985). Disulfide-mediated interactions of the chlamydial major outer membrane protein: role in the differentiation of chlamydiae? J Bacteriol 161(1): 25-31. Harkinezhad, T. (2008). Molecular epidemiology of Chlamydophila psittaci in psittacine birds and humans and prevention by DNA vaccination. PhD thesis, Ghent University, Ghent, Belgium. Harkinezhad, T., Geens, T. &Vanrompay, D. (2009a). Chlamydophila psittaci infections in birds: a review with emphasis on zoonotic consequences. Vet Microbiol 135(1-2): 68-77. Harkinezhad, T., Verminnen, K., De Buyzere, M., Rietzschel, E., Bekaert, S. &Vanrompay, D. (2009b). Prevalence of Chlamydophila psittaci infections in a human population in contact with domestic and companion birds. J Med Microbiol 58(Pt 9): 1207-1212. Harkinezhad, T., Verminnen, K., Van Droogenbroeck, C. &Vanrompay, D. (2007). Chlamydophila psittaci genotype E/B transmission from African grey parrots to humans. J Med Microbiol 56(Pt 8): 1097-1100. Herring, A. J. (1993). Typing Chlamydia psittaci--a review of methods and recent findings. Br Vet J 149(5): 455-475. Hogan, R. J., Mathews, S. A., Mukhopadhyay, S., Summersgill, J. T. &Timms, P. (2004). Chlamydial persistence: beyond the biphasic paradigm. Infect Immun 72(4): 1843-1855. Holst, O., Brade, L., Kosma, P. &Brade, H. (1991). Structure, serological specificity, and synthesis of artificial glycoconjugates representing the genus-specific lipopolysaccharide epitope of Chlamydia spp. J Bacteriol 173(6): 1862-1866. Kosma, P. (1999). Chlamydial lipopolysaccharide. Biochim Biophys Acta 1455(2-3): 387-402. Laroucau, K., Vorimore, F., Aaziz, R., Berndt, A., Schubert, E. &Sachse, K. (2009). Isolation of a new chlamydial agent from infected domestic poultry coincided with cases of atypical pneumonia among slaughterhouse workers in France. Infect Genet Evol 9(6): 1240-1247. Lederer, P. &Muller, R. (1999). [Ornithosis--studies in correlation with an outbreak]. Gesundheitswesen 61(12): 614-619. Lobau, S., Mamat, U., Brabetz, W. &Brade, H. (1995). Molecular cloning, sequence analysis, and functional characterization of the lipopolysaccharide biosynthetic gene kdtA encoding 3deoxy-alpha-D-manno-octulosonic acid transferase of Chlamydia pneumoniae strain TW-183. Mol Microbiol 18(3): 391-399. Longbottom, D. &Coulter, L. J. (2003). Animal chlamydioses and zoonotic implications. J Comp Pathol 128(4): 217-244.
45
Matikainen, M. T. &Terho, P. (1983). Immunochemical analysis of antigenic determinants of Chlamydia trachomatis by monoclonal antibodies. J Gen Microbiol 129(8): 2343-2350. Mayer, G. (2009). Chlamydia. http://pathmicro.med.sc.edu/2009-bactpdf/54Chlamydia2009.pdf. McCoy, A. J. &Maurelli, A. T. (2006). Building the invisible wall: updating the chlamydial peptidoglycan anomaly. Trends Microbiol 14(2): 70-77. Milton, R. J. S. &Kwang-Shin, K. (1996). Chapter 2: Structure of Lipopolysaccharides. Medical Microbiology. 4th edition. Moulder, J. W. (1966). The relation of the psittacosis group (Chlamydiae) to bacteria and viruses. Annu Rev Microbiol 20: 107-130. NASPHV (2010). Compendium of Measures To Control Chlamydophila psittaci Infection Among Humans (Psittacosis) and Pet Birds (Avian Chlamydiosis). Nishizaki, K., Yoshino, T., Orita, Y., Nomiya, S. &Masuda, Y. (1999). TUNEL staining of inner ear structures may reflect autolysis, not apoptosis. Hear Res 130(1-2): 131-136. Perez Melgosa, M., Kuo, C. C. &Campbell, L. A. (1991). Sequence analysis of the major outer membrane protein gene of Chlamydia pneumoniae. Infect Immun 59(6): 2195-2199. Ridgway, G. L. (1986). Chlamydial infections in man. Postgrad Med J 62(726): 249-253. Roche (2008). Apoptosis, Cytotoxicity and Cell Proliferation - Chapter 5: Apoptosis – DNA Fragmentation in Individual Cells. http://www.roche-applied-science.com. Roche (2010). In situ cell death detection kit, fluorescein. Instructions for Use - REF 11684795910. Rurangirwa, F. R., Dilbeck, P. M., Crawford, T. B., McGuire, T. C. &McElwain, T. F. (1999). Analysis of the 16S rRNA gene of micro-organism WSU 86-1044 from an aborted bovine foetus reveals that it is a member of the order Chlamydiales: proposal of Waddliaceae fam. nov., Waddlia chondrophila gen. nov., sp. nov. Int J Syst Bacteriol 49 Pt 2: 577-581. Sachse, K., Laroucau, K., Hotzel, H., Schubert, E., Ehricht, R. &Slickers, P. (2008). Genotyping of Chlamydophila psittaci using a new DNA microarray assay based on sequence analysis of ompA genes. BMC Microbiol 8: 63. Savill, J. &Fadok, V. (2000). Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature 407(6805): 784-788. Sayada, C., Andersen, A. A., Storey, C., Milon, A., Eb, F., Hashimoto, N., Hirai, K., Elion, J. &Denamur, E. (1995). Usefulness of omp1 restriction mapping for avian Chlamydia psittaci isolate differentiation. Res Microbiol 146(2): 155-165. Schachter, J., Ostler, H. B. &Meyer, K. F. (1969). Human infection with the agent of feline pneumonitis. Lancet 1(7605): 1063-1065. Schachter, J., Stephens, R. S., Timms, P., Kuo, C., Bavoil, P. M., Birkelund, S., Boman, J., Caldwell, H., Campbell, L. A., Chernesky, M., Christiansen, G., Clarke, I. N., Gaydos, C., Grayston, J. T., Hackstadt, T., Hsia, R., Kaltenboeck, B., Leinonnen, M., Ojcius, D., McClarty, G., Orfila, J., Peeling, R., Puolakkainen, M., Quinn, T. C., Rank, R. G., Raulston, J., Ridgeway, G. L., Saikku, P., Stamm, W. E., Taylor-Robinson, D. T., Wang, S. P. &Wyrick, P. B. (2001). Radical changes 46
to chlamydial taxonomy are not necessary just yet. Int J Syst Evol Microbiol 51(Pt 1): 249; author reply 251-243. Smith (2010). Compendium of measures to control Chlamydia psittaci infection among humans (psittacosis) and pet birds (avian chlamydiosis), 2010. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep 49(RR-8): 3-17. Stephens, R. S., Myers, G., Eppinger, M. &Bavoil, P. M. (2009). Divergence without difference: phylogenetics and taxonomy of Chlamydia resolved. FEMS Immunol Med Microbiol 55(2): 115-119. Stephens, R. S., Wagar, E. A. &Schoolnik, G. K. (1988). High-resolution mapping of serovar-specific and common antigenic determinants of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. J Exp Med 167(3): 817-831. Stewardson, A. J. &Grayson, M. L. (2010). Psittacosis. Infect Dis Clin North Am 24(1): 7-25. Sting, R., Lerke, E., Hotzel, H., Jodas, S., Popp, C. &Hafez, H. M. (2006). [Comparative studies on detection of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila abortus in meat turkey flocks using cell culture, ELISA, and PCR]. Dtsch Tierarztl Wochenschr 113(2): 50-54. Stratton, C. W. (2000). The pathogenesis of systemic chlamydial infections: Theoretical considerations of host cell energy depletion and its metabolic consequences. Antimicrobics and infectious diseases newsletter. Tappe, J. P., Andersen, A. A. &Cheville, N. F. (1989). Respiratory and pericardial lesions in turkeys infected with avian or mammalian strains of Chlamydia psittaci. Vet Pathol 26(5): 386-395. Telfer, B. L., Moberley, S. A., Hort, K. P., Branley, J. M., Dwyer, D. E., Muscatello, D. J., Correll, P. K., England, J. &McAnulty, J. M. (2005). Probable psittacosis outbreak linked to wild birds. Emerg Infect Dis 11(3): 391-397. Uyttendaele, M. (2011-2012). Moleculair microbiële technieken. Moleculair microbiële technieken Partim: Implementatie van moleculaire technieken in de levensmiddelenmicrobiologie. Van Droogenbroeck, C., Van Risseghem, M., Braeckman, L. &Vanrompay, D. (2009). Evaluation of bioaerosol sampling techniques for the detection of Chlamydophila psittaci in contaminated air. Vet Microbiol 135(1-2): 31-37. Van Loock, M., Geens, T., De Smit, L., Nauwynck, H., Van Empel, P., Naylor, C., Hafez, H. M., Goddeeris, B. M. &Vanrompay, D. (2005a). Key role of Chlamydophila psittaci on Belgian turkey farms in association with other respiratory pathogens. Vet Microbiol 107(1-2): 91-101. Van Loock, M., Verminnen, K., Messmer, T. O., Volckaert, G., Goddeeris, B. M. &Vanrompay, D. (2005b). Use of a nested PCR-enzyme immunoassay with an internal control to detect Chlamydophila psittaci in turkeys. BMC Infect Dis 5: 76. Vanrompay, D., Butaye, P., Sayada, C., Ducatelle, R. &Haesebrouck, F. (1997). Characterization of avian Chlamydia psittaci strains using omp1 restriction mapping and serovar-specific monoclonal antibodies. Res Microbiol 148(4): 327-333. Vanrompay, D., Charlier, G., Ducatelle, R. &Haesebrouck, F. (1996). Ultrastructural changes in avian Chlamydia psittaci serovar A-, B-, and D-infected Buffalo Green Monkey cells. Infect Immun 64(4): 1265-1271. 47
Vanrompay, D., Cox, E., Volckaert, G. &Goddeeris, B. (1999). Turkeys are protected from infection with Chlamydia psittaci by plasmid DNA vaccination against the major outer membrane protein. Clin Exp Immunol 118(1): 49-55. Vanrompay, D., Ducatelle, R. &Haesebrouck, F. (1994). Pathogenicity for turkeys of Chlamydia psittaci strains belonging to the avian serovars A, B and D. Avian Pathol 23(2): 247-262. Vanrompay, D., Ducatelle, R. &Haesebrouck, F. (1995a). Chlamydia psittaci infections: a review with emphasis on avian chlamydiosis. Vet Microbiol 45(2-3): 93-119. Vanrompay, D., Ducatelle, R., Haesebrouck, F. &Hendrickx, W. (1993). Primary pathogenicity of an European isolate of Chlamydia psittaci from turkey poults. Vet Microbiol 38(1-2): 103-113. Vanrompay, D., Mast, J., Ducatelle, R., Haesebrouck, F. &Goddeeris, B. (1995b). Chlamydia psittaci in turkeys: pathogenesis of infections in avian serovars A, B and D. Vet Microbiol 47(3-4): 245256. VAZG (2012). Vlaams agentschap zorg en gezondheid, Psittacose, gezondheid.be/.
http://www.zorg-en-
Verminnen, K., Duquenne, B., De Keukeleire, D., Duim, B., Pannekoek, Y., Braeckman, L. &Vanrompay, D. (2008). Evaluation of a Chlamydophila psittaci infection diagnostic platform for zoonotic risk assessment. J Clin Microbiol 46(1): 281-285. Verminnen, K., Van Loock, M., Hafez, H. M., Ducatelle, R., Haesebrouck, F. &Vanrompay, D. (2006). Evaluation of a recombinant enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Chlamydophila psittaci antibodies in turkey sera. Vet Res 37(4): 623-632. Wang, Y., Berg, E. A., Feng, X., Shen, L., Smith, T., Costello, C. E. &Zhang, Y. X. (2006). Identification of surface-exposed components of MOMP of Chlamydia trachomatis serovar F. Protein Sci 15(1): 122-134. West, A. (2011). A Brief Review of Chlamydophila psittaci in Birds and Humans. Topics in Medicine and Surgery. Wheelhouse, N. &Longbottom, D. (2011). Endemic and Emerging Chlamydial Infections of Animals and Their Zoonotic Implications. Transbound Emerg Dis. Yung, A. P. &Grayson, M. L. (1988). Psittacosis--a review of 135 cases. Med J Aust 148(5): 228-233.
48
