Nagyfelbontású elválasztástechnikai módszerek kifejlesztése és alkalmazása biológiailag aktív és gyógyszer-jelölt molekulák analízisében

Nagyfelbontású elválasztástechnikai módszerek kifejlesztése és alkalmazása biológiailag aktív és gyógyszer-jelölt molekulák analízisében Doktori értekezés

Dobos Zsófia Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Idei Miklós Hivatalos bírálók: Dr. habil. Janáky Tamás egyetemi docens Biczókné Dr. Magyar Anna tud. főmunkatárs, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Prof. Dr. Klebovich Imre egyetemi tanár Dr. habil. Torkos Kornél egyetemi docens, Dr. Hrabák András egyetemi docens, Ph.D.

Budapest 2009

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék ............................................................................................................... 2 Rövidítések jegyzéke........................................................................................................ 4 1.

Bevezetés.................................................................................................................. 6 1.1

A kapilláris elektroforézis története ................................................................. 6

1.2

A kapilláris elektroforézis készülék felépítése ................................................. 6

1.3

Elektroforézis.................................................................................................. 13

1.3.1

Elektroozmotikus áramlás ...................................................................... 15

1.3.2

Az elektroozmotikus áramlás szabályozása ........................................... 18

1.3.4

Analítikai paraméterek ........................................................................... 20

1.4

Kapillárelektroforézis technikák ismertetése.................................................. 22

1.4.1

Kapilláris zónaelektroforézis (CZE )...................................................... 22

1.4.2

Kapilláris gélelektroforézis (CGE)......................................................... 23

1.4.3

Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) .......................................... 23

1.4.4

Kapilláris izotachoforézis (CITP)........................................................... 24

1.4.5

Kapilláris elektrokromatográfia (CEC) .................................................. 25

1.4.6

Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) .............................. 26

1.4.6.1

Az elválasztás elve ............................................................................. 26

1.4.6.2

Retenciós faktor.................................................................................. 30

1.4.6.3

A MEKC elválasztást jellemző fizikai paraméterek .......................... 33

1.4.6.4

Alkalmazási területek ......................................................................... 34

2.

Célkitűzések ........................................................................................................... 37

3.

Módszerek .............................................................................................................. 38 3.1

Vegyszerek ..................................................................................................... 38

3.2

Vizsgált vegyületek ........................................................................................ 38

3.3

Vizsgált pszeudostacioner fázisok.................................................................. 39

3.4

Készülékek ..................................................................................................... 40

3.4.1

ISCO Model 3850 Capillary Electropherograph.................................... 40

3.4.2

Beckman P/ACE System 5500 ............................................................... 41

3.5

Pufferek .......................................................................................................... 41

3.6

Minták............................................................................................................. 42

3.6.1

MDR-peptidek ........................................................................................ 42

2

3.6.2 3.7 4.

Hidrofobicitás ................................................................................................. 42

Eredmények ............................................................................................................ 43 4.1

Számítások...................................................................................................... 43

4.2

CLOGP-tmic..................................................................................................... 44

4.3

CLOGP-tprop,mic ............................................................................................... 45

4.4

A pszeudostacioner fázisok összehasonlítása................................................. 46

4.4.1 4.5 5.

Tesztanyagok .......................................................................................... 42

A CLOGP50 érték ................................................................................... 46

Metilén szelektivitás....................................................................................... 47

Megbeszélés ........................................................................................................... 51 5.1

CLOGP-tmic..................................................................................................... 51

5.2

CLOGP-tprop,mic ............................................................................................... 54

5.3

A pszeudostacioner fázisok összehasonlítása................................................. 57

5.3.1 5.4

A CLOGP50 érték ................................................................................... 61

Metilén szelektivitás....................................................................................... 63

6.

Következtetések...................................................................................................... 65

7.

Összefoglalás .......................................................................................................... 66

8.

Irodalomjegyzék ..................................................................................................... 68

Saját közlemények.......................................................................................................... 76 Köszönetnyilvánítás ....................................................................................................... 78

3

Rövidítések jegyzéke BOC

t-butiloxikarbonil

k’

retenciós faktor

Bzl

benzil

k’HPLC

retenciós faktor a HPLC-nél

CE

kapilláris elektroforézis

L

a kapilláris teljes hossza

(Capillary Electophoresis)

Ld

a kapilláris hossza az injektálási

CGE

kapilláris gélelektroforézis

CIEF

kapilláris izoelektromos

LiPFOS lítium-perfluoroktán-szulfonát

fókuszálás

MDR

multidrog rezisztens

kapilláris izotachoforézis

Me

metil

CITP

ponttól a detektorig

CLOGP számított LOGP érték CMC

MEKC micelláris elektrokinetikus

kritikus micella koncentráció

kromatográfia

CTAC cetil-trimetilammónium-klorid

MS

tömegspektrometria (Mass

CZE

kapilláris zónaelektroforézis

D

diffúziós állandó

N

elméleti tányérszám

Dmc

a micella diffúziós állandója

pI

izoelektromos pont

E

elektromos térerő

q

az ion töltése

EOF

elektroozmotikus áramlás

r

az ion sugara

(Electro Osmotic Flow)

R

felbontás

a részecskére ható elektromos erő

SC

nátrium-kolát

SDC

nátrium-deoxikolát

Fe

Spectrometry)

FMOC 9-fluorenilmetiloxikarbonil Fs

a közeg által kifejtett surlódási erő

SDS

nátrium-dodecilszulfát

GC

gázkromatográfia

t0

elektroozmotikus áramláshoz

(Gas Chromatography)

tartozó idő

HPLC nagyfelbontású/nagynyomású

taq

folyadékkromatográfia

a vizes fázisra vonatkozó fázistartózkodási idő

(High Performance Liquid

tBu

t-butil

Chormatography)

tm

migrációs idő

tmic

a micelláris fázisra vonatkozó

HTAB hexadecil-trimetilammóniumbromid

fázistartózkodási idő

k"

módosított retenciós faktor

tprop,mic normalizált fázistartózkodási idő

K

megoszlási hányados

tr

4

retenciós idő

TTAB tetradecil-trimetilammónium-

ε

dielektromos állandó

bromid

ζ

zeta-potenciál

v

az ion sebessége

η

az oldat viszkozitása

V

feszültség

μapp,mc

látszólagos micelláris mobilitás

vEOF

az elektroozmotikus áramlás

μe

elektroforetikus mozgékonyság

sebessége

μeo

az elektroozmotikus áramlás

VM

a mozgó fázis térfogata

VS

a micelláris fázis térfogata

w

az alapvonali csúcsszélesség

mobilitása μEOF

az elektroozmotikus áramlás mozgékonysága

értéke időben

μl

látszólagos mozgékonyság

Z

benziloxikarbonil

μmc

micellák mobilitása

α

szelektivitás

σ

a jel standard deviációja

5

1.

Bevezetés

1.1

A kapilláris elektroforézis története

A kapilláris elektroforézis az 1970-es években alakult ki a hagyományos elektroforézis módszerekből. Az elválasztástechnikai alkalmazás kifejlesztése J. W. Jorgenson, S. Hjerten és K. D. Lukacs nevéhez fűződik [1 ,2 ,3 ,4]. Az első szabadzónás elektroforézist Hjerten végezte, kisméretű, 3 mm-es kapillárist használva [5]. Azonban a kapilláris méretéből adódóan sok gyakorlati problémát tapasztaltak, ami a későbbiekben egy kisebb belső átmérőjű kapilláris segítségével már kiküszöbölhető volt. Ezeket a kísérleteket

1979-ben

Mikkers

és

munkatársai

200

µm

belső

átmérőjű

politetrafluoretilén kapillárisban végezték. 1981-ben Jorgenson és Lukacs kidolgozták a 100 μm-nél kisebb belső átmérőjű kapillárisban végzett elektroforetikus elválasztás elméleti hátterét. A kapilláris elektroforézis mai formáját a 80-as évek elején érte el. A nyolcvanas évek elején kezdték bevezetni a különféle elektroforézis technikákat. •

1983-ban Hjertén kidolgozta a kapilláris gélelektroforézis módszerét. A módszerben rejlő előnyökről Cohen és Karger 1987-ben jelentettek meg publikációt [6].

•

1984-ben Terabe és munkatársai írták le a micelláris elektrokinetikus kromatográfiát, és annak elméleti hátterét [7,8].

•

Az első készülékek 1989-ben jelentek meg a kereskedelemben.

•

A kilencvenes években egyszerre több új technika jelent meg, mint pl.: kapilláris izoelektromos

fókuszálás,

kapilláris

izotachoforézis,

kapilláris

elektrokromatográfia, affinitás kapilláris elektroforézis.

1.2

A kapilláris elektroforézis készülék felépítése

A készülék fő részei a következők: mintaadagoló egység, kapilláris, puffertartályok a kapilláris

két

végénél,

elektródok,

amelyek

a

puffertartályokba

merülnek,

nagyfeszültségű tápegység, termosztát egység, detektor, vezérlő egység, adatgyűjtő és adatfeldolgozó egység (számítógép) (1. ábra). Természetesen a rendszer több detektorral, különféle mintaadagoló rendszerekkel tovább bővíthető.

6

1. ábra A kapilláris elektroforézis készülék szerkezeti felépítése Mintaadagolás: a minta injektálása többféle módon történhet. Változtatható osztásarányú mintaosztón (splitteren) keresztüli injektálás: Az injektálás mechanikus úton történik, mikrofecskendővel. Az injektált mennyiség általában a µl nagyságrendbe tartozik. A teljes injektált térfogat adott arányban megoszlik az analizáló és a megosztó kapilláris között, és így az injektált mintának csak egy meghatározott hányada kerül az analizáló kapillárisba. A kapillárisba jutó minta mennyisége a megosztó kapilláris méretének, illetve az injektált minta térfogatának megváltoztatásával szabályozható. Elektroozmotikus (elektrokinetikus) injektálás (ld. 2. ábra) Ennél az injektálási technikánál a minta kapillárisba való juttatása feszültséggel történik, amely hatására elektroozmotikus áramlás jön létre a rendszerben. A minta komponensei saját mobilitásuk mértékében kerülnek a rendszerbe. Az injektált minta mennyisége a feszültség mértékével és annak idejével változtatható. A módszer hátránya hogy az egyes komponensek különböző mennyiségben kerülnek a rendszerbe, vagyis a mozgékonyabb komponensből több jut a kapillárisba, mint a kevésbé mozgékonyból.

7

Hidrodinamikus injektálás (ld. 2. ábra) Három fő típusa van: •

Pneumatikus injektálás: a minta bevitel külső nyomással történik.

•

Vákuumos injektálás: a minta vákuum hatására jut a rendszerbe.

•

Hidrosztatikus injektálás: miközben a kapilláris a mintatartó edénybe merül, bemeneti oldalát magasabbra emelik, mint a kapilláris kimeneti oldalát. A rendszerbe juttatott minta mennyisége a szintkülönbséggel és az idő hosszával szabályozható.

2. ábra A hidrosztatikus injektálás különböző változatainak és az elektroozmotikus injektálás vázlatos rajza

8

Kapilláris A kapilláris anyagának kémiailag és elektromosan inertnek, UV és látható fényt áteresztőnek, hajlékonynak, de ugyanakkor kellően szilárdnak és nem túl drágának kell lennie. Ezen követelményeket jelenlegi ismereteink szerint a kvarc elégíti ki leginkább. A legelterjedtebb az ún. ömlesztett kvarc („fused silica”) kapilláris azonban néhány esetben alkalmaznak polietilén, illetve teflon kapillárist is. A kvarcot már régóta használják optikai cellák és gázkromatográfiás (GC) kolonnák anyagául is. A GC-s kolonnákhoz hasonlóan, a CE kapillárisokat is poliimid védőréteggel borítják a kapilláris erősítése és könnyebb kezelhetősége érdekében. A detektálás helyén, az optikai ablakban ez a műanyag réteg könnyen leégethető, vagy lekaparható. A kapilláris lecsupaszított néhány mm-es szakasza azonban igen törékennyé válik, így óvatosan kell vele bánni. Általában 25-75 μm belső és 350-400 μm külső átmérőjű kvarc kapillárisok használatosak. A meghatározás idejét tekintve a rövid kapillárisok alkalmazása előnyös. A leggyakrabban használatos effektív kapillárishosszúság 50-75 cm. Ennél 5-15 cm-rel nagyobb a kapilláris teljes hossza, vagyis a detektor és a kapilláris kimeneti vége közötti távolság. Legelőnyösebb, ha az effektív hosszúság a kapilláris teljes hosszának lehető legnagyobb részét kiteszi a nagy elektromos térerő használata és a kapilláris kondícionálásához illetve az elemzéshez szükséges idő csökkentése miatt. A nemborított kvarc kapillárisok szabad szilanol csoportjai kölcsönhatásba léphetnek a mintakomponensek molekuláival és adszorpciót idézhetnek elő a fal felületén. Ennek visszaszorítása érdekében a kapillárisok belső felületét különböző borítóréteggel szokták ellátni, például: poli-(akrilamid), poli-(etilénglikol), poli-(etilénimin), poli(vinilpirrolidon) réteggel [9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]. Puffertartó A puffertartó edények teremtik az elektromos kapcsolatot a beléjük merített kapilláris és elektród között. A hagyományosan normál polaritásnak nevezett elrendezés esetén a kapilláris bemeneti, úgynevezett inlet vége az anóddal, kimeneti vagy detektor oldali, úgynevezett outlet vége a katóddal teremt közvetlen kapcsolatot. Ellentétes elrendezés esetén fordított polaritásról beszélhetünk.

9

Tápegység Leggyakrabban 10-30 kV feszültséget biztosító tápegységet alkalmaznak. A migrációs idők nagyfokú reprodukálhatóságához (± 0,1%) jól szabályozott feszültség szükséges. A feszültséget a kapilláris végeihez platina elektródok vezetik. A készülék megfelelő működésének ellenőrzéséhez szükséges a feszültség hatására kialakuló áram mérése, mely tipikusan nem haladja meg a 100 μA-t. Termosztát A reprodukálható elválasztáshoz elengedhetetlen az elektroforézis során keletkező hő hatékony elvezetése és az állandó hőmérséklet biztosítása, ezért a kapillárist általában valamilyen termosztát rendszerrel veszik körül. A kapilláris nagy fajlagos felülete lehetővé teszi, hogy az elválasztás alatt fejlődő Joule-hőt a termosztáló rendszer hatékonyan el tudja vezetni. A kapilláris termosztálása nagyon lényeges, mert az analizált komponensek mobilitása 1 ºC hőmérsékletingadozás hatására kb. 2%-kal változik [18,19]. Detektor A CE technikáknál a detektálás egyfajta kihívásnak számít a kapilláris kis átmérője és a felhasznált, csupán nanoliternyi térfogatú minta miatt. Bár a CE egyike a legkevesebb mintamennyiséget felhasználó módszereknek, mégsem tekinthető nyomanalitikai módszernek, mivel nagyon kis koncentrációk meghatározására nem alkalmas, vagy pedig elődúsítási eljárás alkalmazása szükséges. A kapilláris elektroforézisben, hasonlóan a HPLC-hez, sokféle detektálási módszert alkalmaznak. A leggyakrabban alkalmazott módszerek, módszercsoportok: ultraibolya (UV)-, látható (VIS)- és fluoreszcens- vagy lézer indukált fluoreszcens-, elektrokémiai-, refraktometriás-, lángionizációs detektálás, indirekt detektálás, tömegspektrometriás-, illetve nukleáris mágneses rezonancián alapuló detektálási módszerek. A módszerek egy része lehetővé teszi a mintakomponensek folyamatos, az analízissel egyidejű („on-line”, „on column”) detektálását, de előfordul az analízist követő („off-line”) detektálás is, amikor az elválasztott komponenseket kinyerik a kapillárisból, majd a kinyert frakciókat analizálják.

10

Legelterjedtebb módszer az ultraibolya detektálás melynek előnye, hogy a mintakomponenseket az elválasztás megszakítása nélkül, egyenesen a kapillárisban képes detektálni külön detektorcella nélkül [20, 21]. Az érzékenység és a lineáris kimutatási tartomány ugyan javítható a kapilláris belső átmérőjének növelésével, ezt azonban korlátozza az a tény, hogy nagyobb áramerősségek alkalmazása a kapilláris jelentős felmelegedését vonja maga után [9]. A túlzott áramfelhasználás (és így hőtermelődés) elkerülése érdekében olyan speciális kapillárisokat állítottak elő, melyek átmérőjét csupán az optikai fényút helyén növelték meg. Ilyen kapilláristípust képviselnek a buborékcellás, a Z-cellás vagy a szögletes keresztmetszetű kapillárisok (3. ábra) [22, 23].

3. ábra Speciális alakú kapillárisok és kapilláris toldatok [22] Az UV detektorok közül a forgó monokromátoros illetve a diódasoros detektort is alkalmazzák a CE készülékekben. Először 1989-ben kísérleteztek diódasoros detektor alkalmazásával, ami azóta eléggé elterjedt. [24, 25]. Ez a típusú detektor nemcsak egy hullámhosszon képes detektálni az elnyelést, hanem az egyes komponensek UV spektrumát is képes felvenni. A spektrum alapján segítséget kaphat az analitikus az egyes komponensek kémiai azonosításában és a kapott csúcsok tisztaságának (egységességének) ellenőrzésében.

11

Az UV detektáláshoz (érzékenységi határ: 10-8-10-5 M) viszonyítva érzékenyebb módszereknek bizonyulnak a fluoreszcencia (érzékenységi határ: 10-9-10-7 M) és a lézer indukált fluoreszcencia (érzékenységi határ: 10-16-10-14M) detektálási technikák [21, 26, 27]. Ezekben az esetekben az elválasztást megelőzően, vagy azt követően gyakran kell származékképzéshez folyamodni [27]. Rendkívül jelentős a tömegspektrometriás (MS) detektálásnak az alkalmazása a kapilláris elektroforézisben, mivel nemcsak rendkívül érzékeny (mérési határ: 10-9-10-5 M), hanem lehetőséget ad a kémiai szerkezet meghatározására is. A kapilláris elektroforézis készülék tömegspektrométerhez való kapcsolása például a következő esetekben volt kivitelezhető: elektrospray tömegspektrometria (CE/ES-MS = Capillary Electrophoresis / Electrospray Mass Spectometry) [28, 29, 30], mátrix-asszisztált lézerdeszorpciós / ionizációs „time-of-flight” tömegspektrometria (CE/MALDI-TOF-MS

=

Capillary

Electrophoresis/Matrix-Assisted

Laser

Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectometry) [31,32], egyenletes folyású, gyorsított atombombázó tömegspektrometria (CE/CF-FAB MS = Capillary

Electrophoresis/Continuous

Flow-Fast

Spectometry)[33].

12

Atom

Bombardment

Mass

1.3

Elektroforézis

Az elektroforetikus elválasztási módszerek alapja, hogy az elektromos térben, az oldott

anyagok különböző sebességgel vándorolnak. Egy ion sebességét a következő egyenlettel írhatjuk le:

v = μe ⋅ E 1 ahol v az ion sebessége, μe az elektroforetikus mozgékonyság, E az elektromos térerő. Az elektromos térerő az alkalmazott feszültség és a kapilláris hosszának hányadosa. Egy adott ion és közeg esetén a mozgékonyság állandó, és az adott ionra jellemző. Egy részecske mozgékonyságát a részecskére ható elektromos erő (Fe) és a közeg által kifejtett súrlódási erő (Fs) határozza meg. Az elektromos erő a Fe = q ⋅ E 2 a súrlódási erő (ideális gömb alakú ionok esetében) pedig a Fs = −6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ v 3 egyenlettel írható le, ahol q az ion töltése, η az oldat viszkozitása, r az ion sugara, v az ion sebessége. Az elektroforézis során e két erő egyenlő, irányuk ellentétes, amiből következik, hogy:

q ⋅ E = −6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ v 4 A 4. egyenlet segítségével az ion sebességét kifejezve az 1. egyenletbe behelyettesítve a mozgékonyságot fizikai állandókkal leíró egyenletet kapjuk:

μe =

q 6 ⋅ π ⋅η ⋅ r 5

13

Az egyenletből egyértelműen látszik, hogy a kisméretű, nagy töltésű részecskéknek a legnagyobb a mozgékonysága, míg a nagyméretű de kis töltésű részecskék kisebb mobilitással rendelkeznek. Az abszolút (elektroforetikus) mozgékonysági adatok, melyek végtelen híg oldatra és teljes töltésű (α=1, lásd 4. ábra) részecskékre vonatkoznak, megtalálhatók a különböző fizikai állandókat tartalmazó táblázatokban. Az abszolút mozgékonysági értékektől a kísérleti úton kapott relatív (effektív) mozgékonysági értékek általában eltérnek, mivel ez utóbbi értékek függnek a pH-tól (az oldott anyag pK-jától) és a közeg (puffer) összetételétől. Az abszolút és relatív mozgékonyság közötti különbséget mutatja be a 4. ábra. Ha két részecske abszolút mozgékonysága teljes töltés mellett megegyezik, elvileg nem választható el egymástól, holott valójában e részecskék különböző pK értékük, és pH által megszabott töltésük miatt különböző mozgékonysággal rendelkeznek [9].

4. ábra Két gyenge sav mozgékonyságának pH függése [9]

14

1.3.1

Elektroozmotikus áramlás

Az elektroozmotikus áramlás (EOF = Electroosmotic Flow) a kapilláris elektroforézis egyik legfontosabb jelensége, amely nagymértékben befolyásolja az elválasztást. A szakirodalomban

ritkábban,

de

használatos

az

elektroendoozmotikus

áramlás

megnevezés is. Az elektroozmotikus áramlás a kapilláris belsejét kitöltő folyadék egyirányú áramlását jelenti. Az EOF a folyadék kapilláris beli tömegtranszportja, mely a kapilláris belső falán kialakult felületi töltések (kettős réteg) következménye. Az EOF vektoriálisan (az irány lényeges!) hozzáadódik az oldott anyagok mozgékonyságán alapuló áramláshoz, de az elválasztásra nincs hatással. Kvarc kapilláris alkalmazása esetén a felületi szilanol csoportok pH függő disszociációjának következtében a kapilláris belső felszíne negatív töltésűvé válik, minek hatására a puffer kationjai feldúsulnak, a fal közelében elektromos kettősréteget hozva létre. Ez a kettős réteg a fal felületének közvetlen közelében egy zeta (ζ) potenciállal jellemezhető, és pár száz nanométer vastagságú [4].(5. ábra és 6. ábra)

5. ábra A kapilláris falán kialakuló kettős réteg ábrázolása [9]

15

6. ábra A ζ-potenciál csökkenése a kapilláris falától a puffer belseje felé haladva [36] a: adszorbeált ionokból álló kötött réteg; b: mozgékony (diffúz) ionréteg; c: puffer Helmholz egyenlete [4] alapján:

ζ =

4 ⋅ π ⋅ η ⋅ μ eo

ε 6

ahol μeo az elektroozmotikus áramlás mobilitása (hányadosa), és ε a dielektromos állandó. A zeta potenciál pH-függő, mivel az ömlesztett szilika szilanol csoportjai gyenge savak. Magas pH-n, amikor a szilanol csoportok teljes mértékben deprotonálódnak, a zeta potenciál elérheti a –120 mV értéket [3]. A kettősréteg felszínhez közeli része statikus jellegű, míg a faltól távolabb elhelyezkedő diffúz része feszültség alkalmazásának hatására elmozdul a katód irányába. A diffúz kationos réteg magával vonja a pufferoldat teljes tömegét és ez a katód felé irányuló áramlás a tulajdonképpeni elektroozmotikus áramlás, amely a következő egyenletes sebességgel (vEOF) jellemezhető [4]: v EOF = (ε ⋅ ζ / η ) ⋅ E 7 vagy

μ EOF = (ε ⋅ ζ / η ) 8 ahol vEOF az EOF sebessége, μEOF az EOF mozgékonysága, ζ a zéta potenciál és ε a dielektromos állandó.

16

A kapillárisbeli EOF fontos jellemzője a dugószerű áramlási profil (7. ábra). Mivel az áramlás hajtóereje egyenletesen oszlik el a kapillárisban, egyáltalán nincs nyomásesés a kapillárison belül, s így az áramlás teljesen egyenletesnek tekinthető.

7. ábra Áramlási profilok és a hozzájuk tartozó részecske zónák Ezzel szemben a HPLC-re jellemző áramlási profil parabolikus, lamináris jellegű, mivel a falhoz közelebb eső folyadék kisebb áramlási sebességgel halad a kapilláris közepéhez viszonyítva. A kapilláris elektroforézisre jellemző lapos áramlási profil 1-2 nagyságrenddel is megnövelheti az elválasztás során elérhető elméleti tányérszámot a HPLC-hez viszonyítva [3]. Az EOF egy másik fontos előnye, hogy az gyakorlatilag az összes részecskét, függetlenül azok töltésétől, azonos irányú mozgásban tartja. A szokásos körülmények mellett (vagyis amikor a kapilláris belső felülete negatív töltésű) az áramlás az anódtól a katód irányába történik. A katód felé nemcsak a kationok vándorolnak, de az anionok is, mivel az EOF akár egy nagyságrenddel is nagyobb lehet az anionok sebességénél. Így a kationok, töltés nélküli részecskék és az anionok akár egyetlen CE-s futtatással is elemezhetők (8. ábra). Azonban a semleges molekulák szétválasztása nem valósítható meg szabad zónás kapilláris elektroforézises eljárással, de a micelláris elektrokinetikus kromatográfia

kiváló

kapilláris

elektroforézis

mintakomponensek analízisére.

17

alternatívát

nyújt

a

semleges

8. ábra A mintakomponensek detektálási sorrendje az elektroozmotikus áramlás hatására, pozitív polaritás esetén [23]

1.3.2

Az elektroozmotikus áramlás szabályozása

Bár a meghatározásoknál az EOF általában előnyös, gyakran szükséges annak szabályozása. Nagy pH értékeknél az EOF akár olyan gyors is lehet, hogy az még az elválasztás megtörténte előtt a részecskék elúcióját okozza. Kis pH értékeknél viszont a negatív töltésű fal kationos részecskék adszorpcióját okozhatja (ez különösen a bázikus fehérjék elválasztásánál jelenthet problémákat). Az EOF szabályzásához elsősorban a kapilláris felületi töltésének vagy a puffer viszkozitásának megváltoztatása szükséges. Az EOF szabályozásának módszereit és a változtatott paraméter hatásának összefoglalását az 1. Táblázat tartalmazza.

18

1. Táblázat Az EOF szabályozásának módszerei [9]

1.3.3

Mozgékonyság és migrációs idő

A szabad zónás kapilláris elektroforézis különböző elektroforetikus sebességű, illetve különböző migrációs idővel (tm) rendelkező mintakomponensek szétválasztására alkalmas módszer. A migrációs idő alatt a mintakomponensek az Ld utat teszik meg a

19

kapilláris belsejében, amely a kapilláris injektálási végétől a detektálás pontjáig terjed. A kapilláris teljes hossza az adott feszültségre létrejövő térerősséget határozza meg: E =V / L

9 ahol L a kapilláris teljes hossza. A migrációs idő és más kísérleti paraméterek alapján számítható ki a látszólagos mozgékonyság (μl)

LD L ⋅L = D t⋅E t ⋅V

μ1 =

10 ahol μl=μe+μEOF , V a feszültség, LD a kapilláris effektív hossza (injektálási ponttól a detektorig), L a kapilláris teljes hossza, t a migrációs idő és E az elektromos térerő[9].

1.3.4

Analitikai paraméterek

Az elválasztást a szelektivitás, az elméleti tányérszám és a felbontás jellemzik [23]. Szelektivitás A szelektivitás számszerűleg két mintakomponens mobilitáskülönbségének és az átlagmobilitásuknak a hányadosa:

α=

μ 2 − μ1 μ1 + μ 2 2 11

Elméleti tányérszám

N=

μ eff ⋅ E 2⋅D 12

ahol D a diffúziós állandó.

20

Felbontás Az elválasztástechnikában a végső cél a mintának komponenseire való bontása. A felbontás a legegyszerűbben a következőképpen adható meg: R=

2(t 2 − t1 ) t 2 − t1 = 4 ⋅σ w1 + w2

13 ahol t a migrációs idő, w az alapvonali csúcsszélesség értéke időben és σ a jel standard deviációja [9,23].

21

1.4

Kapillárelektroforézis technikák ismertetése

A CE alapvető módszerei a kapilláris zónaelektroforézis (CZE), a kapilláris gélelektroforézis (CGE), a kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF), a kapilláris izotachoforézis (CITP) és a micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC). 1.4.1

Kapilláris zónaelektroforézis (CZE )

A mai napig a legelterjedtebb kapilláris elektroforézis technika a szabadzónás kapillárelektroforézis. A kapillárist homogén pufferrel töltik fel, majd a minta injektálása után feszültséget kapcsolnak a rendszerre, amelynek hatására adott erősségű, hosszanti irányú elektromos tér (E) jön létre. Az elektromos tér hatására a mintakomponensek vándorlása kezdődik meg, mely töltés és molekulaméret függvényében a komponensek szétválásához vezet (9. ábra). A módszer hátránya, hogy a semleges, illetve az azonos fajlagos töltéssel bíró molekulákat nem lehet egymástól elválasztani. A kvarc kapillárison az elválasztás sorrendje a következő: kationok, semleges molekulák, anionok. Az elválasztás során leggyakrabban alkalmazott puffer a foszfát, borát és citrát puffer. A pufferekkel szemben követelmény, hogy azok fajlagos elnyelése illetve mozgékonysága kicsi legyen. Biológiai puffereket is szokás alkalmazni (Tris, CAPS), azonban ezek hátránya a jelentős UV elnyelés, viszont kicsi a Joule-hő fejlődés.

9. ábra Zónaektroforézis elválasztásának sematikus ábrája ●: kationok ■: semleges molekulák ▲: anionok [23]

22

1.4.2

Kapilláris gélelektroforézis (CGE)

A gélelektroforézis is a zónaelektroforézis elvén alapul, de az elválasztás egy molekulaszűrő hatással rendelkező gélben vagy polimer oldatban megy végbe (10. ábra). Az elválasztásra hatással van a molekula mérete, töltése és alakja. Az elektroozmotikus áramlás kiküszöbölésére általában kovalensen módosított belső felületű kapillárist alkalmaznak. A klasszikus gélelektroforézishez viszonyítva a kapillárisban végzett gélelektroforézis során 10-100-szor nagyobb térerővel lehet dolgozni, minimális felmelegedés mellett. A detektálás közvetlenül a kapillárisban történik. A módszer előnyei közé tartozik az automatizálhatóság. Az agarózzal, dextránnal, poli-(akrilamid)-dal, poli-(akrilamid/bisakrilamid)-dal és más gélekkel töltött kapillárisokban elsősorban nagyméretű biomolekulák: oligonukleotidok, DNS restrikciós fragmensek, PCR termékek, RNS fragmensek és fehérjék méret szerinti elválasztását szokták megvalósítani [21, 28, 35, 36, 37, 38, 39, 40].

10. ábra Az elválasztás sematikus ábrája CGE-nél [23] 1.4.3

Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF)

Az izoelektromos fókuszálás során pH gradienst alkalmaznak az elválasztás megvalósítására. A kapillárist úgynevezett amfolit oldatokkal töltik fel, amely különböző izoelektromos ponttal rendelkező ikerionos pufferek keverékéből áll. A kapilláris bemeneti és kimeneti végét sav illetve lúg oldatba merítik. A feszültség rákapcsolásakor a kapillárisban dinamikus pH gradiens alakul ki. Az elválasztani kívánt mintát az amfolit oldattal együtt töltik a kapillárisba. A mintakomponensek az izoelektromos pontjuknak megfelelő zóna elérésekor megállnak (11. ábra). A fókuszálás

23

után a mintakomponenseket nyomás vagy sóadagolás hatására juttatják el a detektorig. Az elválasztás során az elektroozmotikus áramlás teljes visszaszorítása szükséges, amit leggyakrabban a kapillárisfal kovalens vagy dinamikus borítása révén szoktak elérni. Kapilláris izoelektromos fókuszálással már a 0,005 pI egységnyi különbséggel rendelkező mintakomponensek elválasztása is megvalósítható [23]. A módszert elsősorban peptidek és fehérjék elválasztására illetve pI értékének meghatározására alkalmazzák. A módszer tömegspektrometriás csatolt technikával fontos alkalmazás a proteomikában. [41, 42, 43, 44, 45, 46].

11. ábra Az elválasztás sematikus ábrája CIEF esetében. A kapilláris töltete a mintakomponensek és az amfolitok (A, B, C, D, E, F,G,H) keveréke [23] 1.4.4

Kapilláris izotachoforézis (CITP)

Az izotachoforézisben a mintakomponenseket egy vezető (legnagyobb elektroforetikus mobilitású iont tartalmazó „leading”) és egy záró (legkisebb elektroforetikus mobilitású iont tartalmazó „terminating”) zóna közé szorítják be úgy, hogy az elektroforézis során a komponensek elektroforetikus mobilitáskülönbségük alapján elkülönülő sávokba sorakoznak fel, mely sávok azonos (a vezető ion által meghatározott) sebességgel haladnak át a kapillárison. (12. ábra) Az izotachoforézises eljárást gyakran használják mintaelőkészítés során dúsító lépésként szabad zónás kapilláris elektroforézist, micelláris elektrokinetikus kromatográfiát, kapilláris gélelektroforézist, vagy más elválasztásokat megelőzően [23, 24, 47, 48].

24

12. ábra Az elválasztás sematikus ábrája ITP esetén L: vezető zóna T: záró zóna

1.4.5

Kapilláris elektrokromatográfia (CEC)

A kapilláris elektrokromatográfia a kromatográfia és az elektroforézis előnyös tulajdonságait

kombinálja.

A

mintakomponensek

elválasztása

kromatográfiás

kölcsönhatáson alapul, míg a vándorlást a kapillárisban az elektroozmotikus áramlás biztosítja. Az áramlási profil ily módon dugószerű marad, ami így nem okoz csúcsszélesedést [49]. A kapilláris elektrokromatográfiát sikerrel alkalmazzák gyógyszerkutatásban és minőségi ellenőrzésben [50], biomolekulák: fehérjék, nukleinsavak, peptidek, antitestek elválasztásában és analízisében [51, 52], királis elválasztások területén [53, 54], DNS adduktok analízisében [55].

25

1.4.6

Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC)

1.4.6.1 Az elválasztás elve A micelláris elektrokinetikus kromatográfiát Terabe és munkacsoportja vezette be 1984ben [7, 8] és azóta az egyik legelterjedtebb elválasztási módszerré vált. A kapilláris zónaelektroforézissel

a

töltéssel

rendelkező

mintakomponensek

elválasztása

megvalósítható, azonban a semleges molekulák vándorlási sebessége között ezzel a módszerrel nem lehet különbséget tenni. A MEKC alkalmazásával már a töltéssel nem rendelkező mintakomponensek elválasztására is lehetőség nyílik, a töltéssel rendelkező mintakomponensek elválasztásával egy időben. Az alkalmazott elektrolit oldat általában valamilyen anionos felületaktív anyagot tartalmaz (pH 6-10 között), a kritikus micellakoncentrációt (CMC) meghaladó mennyiségben, amikor is a felületaktív anyag micellákat képez (13. ábra). A belül hidrofób, kívül negatív töltésű micellák pszeudoállófázist alkotnak [49]. A mintakomponensek hidrofób, vagy elektrosztatikus kölcsönhatásba léphetnek a micellákkal és ezáltal a klasszikus kromatográfiához hasonlóan, a mintakomponensek megoszlanak a puffer vizes fázisa és a micellák hidrofób belseje között. Az elválasztás során a micellák szerepe hasonló a kromatográfiás álló fázisokéhoz, ezért a micellákat gyakran nevezik pszeudostacioner fázisnak illetve pszeudoállófázisnak. (14. ábra)

13. ábra Micellák lehetséges szerkezete [23]

26

14. ábra A micelláris elektrokinetikus kromatográfiás elválasztás elve [23]

A rendszer feszültség alá helyezésekor, a micellák μapp,mc látszólagos micelláris mobilitással vándorolnak a kapillárisban. Ez a mobilitás a micellák mobilitásának (μmc) és az elektroozmotikus áramlásnak az összegével egyenlő:

μ app ,mc = μ mc + μ eo 14 Anionos micellák esetében a két mobilitás irányultsága ugyan ellentétes, azonban az elektroozmotikus áramlás mobilitása általában meghaladja a micellák ellentétes irányú mobilitásának mértékét, és így a micellák a gyors elektroozmotikus áramlás hatására a katód irányába mozdulnak el. A micellák hosszú migrációs idővel, de áthaladnak a detektor előtt. A MEKC-ben a mintakomponensek retencióját az adott komponens hidrofobicitása határozza meg. Az elválasztás során három fő csoportot különböztetünk meg: Vannak olyan hidrofil vegyületek, amelyek nem lépnek kölcsönhatásba a micellákkal, azaz mindvégig a vizes fázisban tartózkodnak, és csak az elektroozmotikus áramlás

27

hatására mozdulnak el a kapillárisban. Ezeknek a vegyületeknek a migrációs ideje megegyezik az elektroozmotikus áramláshoz tartozó t0 idővel Vannak olyan erősen hidrofób vegyületek, amelyek a micellák belsejében tartózkodnak és a micellákkal együtt mozognak a kapillárisban, vagyis a migrációs idejük megegyezik a micellák migrációs idejével. (μapp, i=μapp, mc) Az előző két csoportba nem tartozó vegyületek a hidrofobicitásuk által meghatározott arányban idejük egy részét a vizes, másik részét a micelláris fázisban töltik. Anionos tenzidek esetében: t0 ≤tm≤tmc A leggyakrabban alkalmazott micellaképző anyagok az anionos tenzidek, és ezek közül is a leggyakrabban a nátrium-dodecilszulfátot (SDS) alkalmazzák [56,57,58,59,60] Kationos felületaktív anyagok alkalmazásánál bizonyos koncentráció alkalmazásakor az elektroozmotikus áramlás értéke nulla lesz, és adott koncentráció felett az áramlási irány megváltozik [4,57]. Ennek magyarázata az, hogy a pozitív töltésű részükkel elektrosztatikus kölcsönhatásba lépnek a kapilláris negatív töltésű falával és a hidrofób rész a kapilláris belseje felé fordul. A további micellaképzők pedig kettős réteget alakítanak ki a kapilláris fala mentén, így a kapilláris belső felületére a pozitív töltés lesz jellemző (15. ábra). A nemionos és ikerionos micellaképzők enyhébb hatással vannak az elektroozmotikus áramlásra, és a fehérjék szerkezetére is [61,56]. Az epesavak sói is gyakran használt biológiai felületaktív anyagok. Rendelkeznek mind hidrofil, mind hidrofób csoportokkal és vizes oldatokban királis micellákat képeznek, tehát optikai izomerek elválasztását is lehetővé teszik. Előfordul, hogy más, pl. SDS pufferoldatokhoz adagolják az elválasztás jobb felbontása érdekében [62, 63]. Kevert micellás rendszerrel tovább lehet fokozni az elválasztás szelektivitását és hatékonyságát [64]. A MEKC-ban alkalmazott micellaképzők csoportosítását a 2. Táblázat tartalmazza.

28

15. ábra A kapilláris belső felületén kialakuló kettős réteg kationos micellaképző alkalmazásakor 2. Táblázat A MEKC-ban alkalmazott felületaktív anyagok csoportosítása, valamint azok vizes oldatra vonatkozó CMC értékei [23]

29

1.4.6.2 Retenciós faktor A klasszikus folyadékkromatográfiában a retenciós faktort (k’) az állófázis és a mozgó fázis közötti megoszlás jellemzésére alkalmazzák, aminek értéke az alábbi egyenlet alapján számítható: k ' HPLC =

tr − t0 t0

15 ahol tr a retenciós idő, t0 pedig a holtidő. A micelláris elekrtokinetikus kromatográfiában a HPLC analógiájára 1984-ben Terabe és munkatársai vezették be a retenciós faktor fogalmát [7]. Mivel a MEKC-ban mindkét fázis mozog, a megfelelő komponensek retenciós faktorát korrigálni kell. A MEKC-ban alkalmazott retenciós faktor számítását az alábbi egyenlet írja le: k' =

tm − t0 V =K∗ s t 0 (1 − t m / t mc ) VM

16 ahol K a megoszlási hányados, Vs a micelláris fázis térfogata és VM a mozgófázis térfogata. Az adott mérési körülményhez tartozó t0 illetve tm értékeket metanol illetve szudán (III) injektálásával szokták meghatározni [7, 8]. A 16. egyenlet alapján jól látható, ha tmc értéke végtelen, azaz a micelláris fázis állófázissá lényegül, akkor a retenciós faktort meghatározó képlet azonossá válik a klasszikus retenciós faktor képletével. Ha egy adott mintakomponens a migrációs ideje alatt végig a vizes fázisban tartózkodik, akkor a hozzá tartozó retenciós faktor, k’=0. Amennyiben a mintakomponens az elválasztás során végig a micella belső zsebében tartózkodik, azaz tm=tmc, a retenciós faktor k’=∞. Elmondható tehát hogy a Terabe által bevezetett retenciós faktor értéke nulla és végtelen között mozog. (16. ábra)

30

500

400

k'

300

200

100

0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

tm (min)

16. ábra A k’ paraméter változása a migrációs idő függvényében (t0=4 min, tmc=40 min) [65] Munkacsoportunk 1996-ban vezette be a módosított retenciós faktort, amelynek jele k”. Ez a fajta retenciós faktor az alábbi egyenlet alapján számítható [65]: k" =

tm − t0 t mc − t 0

17 Amennyiben egy mintakomponens az elválasztás során a migrációs ideje során végig a vizes fázisban tartózkodik, azaz tm=t0, akkor a hozzá tartozó k” érték 0. Ha a mintakomponens az elválasztás ideje alatt a migrációs idejének teljes hányadát a micelláris fázisban tölti, azaz tm=tmc, akkor k”=1. Amennyiben a mintakomponens a migrációs ideje egy részét a micelláris, másik részét pedig a vizes fázisban tölti, azaz t0 < tm < tmc, akkor k” értéke nulla és egy közé esik. A k” paraméter nagy előnye hogy véges tartományban mozognak az értékei. (17. ábra)

31

1,0

0,8

k"

0,6

0,4

0,2

0,0 5

10

15

20

25

30

35

40

tm (min)

17. ábra A k” paraméter változása a migrációs idő függvényében (t0=4 min, tmc=40 min) [65] Korábban szimulált adatok felhasználásával munkacsoportunk kimutatta, hogy az újonnan bevezetett k” módosított retenciós faktor meredeksége állandó a migrációs idő függvényében, tehát adott migrációs idő különbségnek (Δtm) ugyanaz a k” retenciós faktor különbség (Δk”) felelt meg a migrációs ablak teljes hosszában. A k” paraméter nagy előnye, hogy számíthatók belőle a vizes (taq) illetve a micelláris (tmic) fázisra vonatkozó fázistartózkodási idők

t mic = t mc k " 18

t aq = t 0 (1 − k ") 19

A két egyenlet összege kiadja a migrációs időt: t m = t mic + t aq = t 0 (1 − k ") + t mc k " 20

32

1.4.6.3 A MEKC elválasztást jellemző fizikai paraméterek

A MEKC-ben is mint más folyadékkromatográfiás módszernél is az elválasztást a szelektivitás, az elméleti tányérszám és a felbontás jellemzi [4]. Szelektivitás:

α = k ' 2 / k '1 21

Ahol k’1 és k’2 két egymást követő retenciójú mintakomponens retenciós faktorai. Elméleti tányérszám: N=

μ app ⋅ Ld ⋅ E 2 ⋅ Dmc 22

Ahol Dmc a micella diffúziós állandója. Felbontás: Rs =

1 − t 0 / t mc N 1/ 2 α − 1 k'2 ⋅ ⋅ ⋅ α 1 + k ' 2 1 + (t 0 / t mc )k '1 4 23 [66]

Ahol N az elméleti tányérszám, α a szelektivitás. A képletben az utolsó tag jelenti a különbséget a hagyományos HPLC-nél alkalmazott képlethez képest. Ahogy a tmc érték eléri az egyet, a képlet utolsó tagja értékben nulla lesz, és ily módon a HPLC-nél is alkalmazott képlethez jutunk. Ha a tmc értéke egy, az azt jelenti, hogy a micelláris fázis nem mozog, azaz állófázisnak tekinthetjük. A 23. egyenlet alapján a felbontóképességet a hatékonyság, szelektivitás és a retenciós faktorok révén lehet optimalizálni. Jó felbontást eredményez, ha széles a migrációs idő ablak, vagyis a t0 és a tmc által határolt időintervallum, amit az elektroozmotikus áramlás visszaszorításával, vagy nagy elektroforetikus mobilitással rendelkező anionos micellákkal lehet elérni. Az elválasztást a micellák méretének, töltésének, térszerkezetének változtatása révén lehet befolyásolni (18. ábra).

33

18. ábra

Különböző térszerkezetű (anionos) micellák sematikus ábrája. A fehér kör a micellaképző hidrofil részét jelöli. (A) hosszú alkilláncú micellaképző (B) mikroemulzió (C) polimerizált felületaktív anyag (pl.:polySUA) (D) csillag polimer (E) dendrimer [66]. A retenciós faktorok általában lineárisan nőnek a micellaképzők koncentrációjával [23], a micellaképzők koncentrációjának növelését azonban korlátozza a feszültség arányos emelkedése,

amely

felmelegedéshez

vezet.

Az

elválasztás

szempontjából

legmegfelelőbb micellaképző kiválasztása után a szelektivitást a puffer koncentrációja, pH-ja, vagy más adalékok (pl. urea, metanol, királis szelektorok: ciklodextrinek, epesavak) használata révén lehet fokozni. Az adalékokkal szabályozni lehet az elektroozmotikus áramlás mértékét, meg lehet akadályozni a fal felületére történő adszorpciót, illetve be lehet vezetni egy újabb elválasztási mechanizmust [4, 27, 63, 67, 68, 69]. A szabad zónás kapilláris elektroforézishez hasonlóan polimeres falborítással is lehet optimalizálni az elválasztást, mint pl. poli-(akrilamid), polibrén és poli(vinilszulfonát) felhasználásával [70, 71]. 1.4.6.4 Alkalmazási területek

A micelláris elektrokinetikus kromatográfiát mint módszert gyakran alkalmazzák gyógyszerhatóanyagok és más vegyületek hidrofobicitásának jellemzésére [72, 73]. A gyógyszerek, gyógyszer jelölt molekulák hidrofobicitása fontos szerepet játszik a molekula biológiai hatásmechanizmusában, mivel ahhoz, hogy a molekula hatását a megfelelő helyen kifejthesse, apoláris lipid mebránokon kell átjutnia. A gyógyszer tervezés egyik fontos eszköze a molekula hidrofobicitásának becslése fizikai-kémiai paramétereik alapján. Ennek eszköze Hansch javaslata óta a logP érték (oktanol/víz megoszlási hányados logaritmusa) meghatározása [74,75]. E módszer alkalmazásának

34

nehézségei (anyag-, idő- és munkaigény) a figyelmet részben a kémiai szerkezet alapján végzett

számítógépes

hidrofobicitás

becslés

(CLOGP),

predikció,

illetve

az

elválasztástechnikai módszerek felé fordították, amikor is az elválasztástechnikai módszer alkalmazása során nyert adatokat alkalmazzák és a hidrofobicitás jellemzésére. A MEKC analízis során mért kisérleti adattal, illetve az ebből számolt kapacitás faktorral (k’) jellemzik a vizsgált molekula hidrofobicitását. Különösen jelentőssé váltnak a gyors elválasztási módszerek (így a MEKC is) a kombinációs molekula könyvtárak megjelenésével, alkalmazásával, mert rendkívül nagyszámú molekula gyors jellemzésére van szükség. A módszer továbbá alkalmas peptidek és analógjaik [76], aminosavak [77], fehérjék [78], vitaminok [79], enantiomerek [80, 81], DNS-adduktok analízisére [82]. A MEKC-t mint módszert élelmiszeranalítikai célokra is alkalmazzák. Burton és munkatársai a kávéban található koffein meghatározására fejlesztettek ki módszert. A leggyakrabban alkalmazott SDS fázis mellet kipróbálták cetil-trimetilammóniumkloridot (CTAC) is mint micellaképzőt. Tapasztalataik szerint jobb reprodukálhatóság volt elérhető. Ennek oka, hogy a CTAC lecsökkentette a kávéban található kationos összetevők falhoz való adszorpcióját. [83] A bűnügyi laboratóriumokban is alkalmazzák a MEKC-t, többek között illegális kábítószerek, illetve robbanószermaradékok meghatározában.[83] A MEKC segítségével királis elválasztás is megvalósítható. Ebben az esetben valamilyen természetes vagy szintetikus királis micellaképzőt alkalmaznak, vagy valamilyen nem királis micellaképzőt kevernek ciklodextrinekkel. A leggyakrabban alkalmazott királis felületaktív anyagok az epesavak. Számos olyan biológiai folyamat létezik, amelyet nehéz direkten vizsgálni, mint például a vér-agy gáton való átjutás, biológiai hozzáférhetőség, adszorpció vagy penetráció biológiai membránokon. Az ilyen összetett jelenségek becslésére általánosan elfogadott az egyszerűsített modellrendszerek alkalmazása. A kromatográfiás módszerek, beleértve a MEKC-t is, megbízható és egyszerű utat kínálnak olyan tulajdonságok vizsgálatára, amelyek fontos szerepet játszanak egyes biológiai folyamatokban [84, 85, 86].

35

A klinikai vizsgálatok során is alkalmaznak MEKC-ás technikákat. Az irodalomban található módszerek között szerepel biomarkerek és metabolitok testfolyadékból történő meghatározása is. A biomarkerek fontos szerepet játszanak bizonyos betegségek korai diagnosztizálásában, míg a metabolitok vizsgálata gyógyszerkutatásban játszhat fontos szerepet. A testnedvekben legtöbb célvegyület nagyon kis koncentrációban találhatók meg, ezért nagyon fontos a megbízható nagy érzékenységű kimutatási módszer alkalmazása. A plazma minták direk injektálásával történő cefotaxime és annak deacetilezett

metabolitjának

MEKC-ás

meghatározását

először

Nakagawa

és

munkatársai írták le. A CZE és MEKC mérések összehasonlításából kitűnik, hogy a MEKC-ra épülő meghatározás egyszerűbb, gyorsabb, pontosabb és érzékenyebb, mint a CZE-en alapuló módszer [87].

36

2.

Célkitűzések

MEKC módszer alkalmazása a kiválasztott vegyületcsoportok hidrofobicitásának meghatározására az elválasztás során kapott retenciós adatok alapján. Egy olyan módszer kidolgozása, amely jellemzi az elválasztás során alkalmazott pszeudostacioner fázis hidrofobicitását és a mintával való kölcsönhatását. Mindezt a MEKC-ban

alkalmazott

normalizált

retenciós

faktor

segítségével

kívánom

meghatározni. Bizonyítani kívánom, hogy a MEKC mérések során kapott retenciós idők alapján nem csak a vizsgált vegyület hidrofobicitása jellemezhető, hanem a vizsgált vegyületek segítségével maguk az elválasztás során alkalmazott fázisok hidrofobicitása is jellemezhető. Mindezen jellemzések után az alkalmazott fázisok várhatóan összehasonlíthatóvá válnak. A MEKC mérések során az alkil-benzol homológ sor esetében kapott paraméterek segítségével meg kívánom határozni a vizsgálatok során alkalmazott pszeudostacioner fázisok metilénszelektivitását. Továbbá igazolni kívánom azt a feltételezésemet, miszerint az újonnan bevezetett paraméter, a normalizált retenciós faktor alkalmas a metilénszelektivitás meghatározására is.

37

3.

Módszerek

3.1

Vegyszerek

A kísérletek során az alábbi vegyszerek kerültek felhasználásra: A nátrium-dodecilszulfát (SDS) a Fluka terméke (Buchs, Svájc). Az aceton, a nátriumhidroxid (NaOH), a sósav (HCl), és a bórsav (H3BO3) analitikai tisztaságban a Reanaltól (Budapest, Magyarország) került beszerzésre. Míg a HPLC tisztaságú acetonitri a Chemolab (Budapest, Magyarország) terméke. A peptidszintézisek során felhasznált aminosavak a Bachem-től (Bubendorf, svájc) származnak. A foszforsav, a szudán III, a lítiumhidroxid, a nátrium dihidrogén-foszfát monohidrát, a dinátrium hidrogén foszfát, a dinátrium tetraborát és a metanol a Merck (Darmstadt, Németország) termékei. A nátrium-kolát (SC), tetradecil-trimetilammónium-bromid (TTAB), hexadeciltrimetilammónium-bromid (HTAB) és a lítium-perfluoroktán-szulfonát (LiPFOS) a Fluka-tól került beszerzésre, míg a nátrium-deoxikolát (SDC) az Aldrich-tól (Milwaukee, WI, USA) származik. A reagens tisztaságú teszt vegyületek (alkil-benzolok, alkil-fenolok, alkoholok, és az egyéb aromás vegyületek) forrása több különböző gyártótól való, azonban a tisztaságukról elmondható hogy reagens vagy annál nagyobb tisztaságúak voltak. Az oldatok elkészítéséhez az Elgastat UHP (Elga, Anglia) víztisztító készülék által előállított ioncserélt, baktériummentes és szerves szennyezőktől mentes vizet használtuk. 3.2

Vizsgált vegyületek

Munkám során a vizsgált vegyületek az alábbi csoportokba sorolhatók: •

Alkil-benzolok: benzol, toluol, etil-benzol, propil-benzol, butil-benzol

•

Alkil fenonok: propiofenon, butirofenon, valerofenon, heptanofenon

•

Alkoholok: pentán-1,5-diol, bután-1-ol, pentán-3-ol, pentán-1-ol

38

•

Vegyes csoport: anilin, o-toluidin, benzaldehid, metil-benzoát, naftalin

•

MDR-peptidek

MDR peptidek Az alábbiakban felsorolt di-, tri- és tetrapeptidek a munkacsoportunk által szintetizált hidrofób, multidrog rezisztencia ellenes hatásra tesztelt, tehát potenciális reverzin molekulák. A peptideket hagyományos vizes fázisú módszerrel szintetizáltuk, a peptidszintézist követően a szabad karboxil- és amino- végződéseket védő csoportokat nem választottuk le.

A

•

(Z-Pro)2-Lys-OMe

•

[BOC-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe

•

[BOC-Asp(OBzl)-Lys(Z)]-OtBu

•

[BOC-Pro-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe

•

[BOC-Pro-Pro-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe

•

[BOC-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe

•

FMOC-Glu[Lys(Z)OtBu]2 védőcsoportok

rövidítései:

BOC:

t-butiloxikarbonil;

tBu:

t-butil;

Z:

benziloxikarbonil; FMOC: 9-fluorenilmetiloxikarbonil; Bzl: benzil; Me: metil. 3.3

Vizsgált pszeudostacioner fázisok

Munkám során a vizsgálni kívánt pszeudostacioner fázisok kiválasztásánál fontos szempont volt, hogy jellegében egymástól eltérő micellaképző anyagok kerüljenek a vizsgálati csoportba. Így a felületaktív anyagok között szerepel anionos, kationos, oldallánc hosszúságában két metilén-csoportban eltérő illetve perfluorozott felületaktív anyag. A kiválasztott fázisképzők a következők: nátrium-dodecilszulfát (SDS), nátriumdeoxikolát (SDC), nátrium-kolát (SC), tetradecil-trimetilammónium-bromid (TTAB), hexadecil-trimetilammónium-bromid (HTAB) és a lítium-perfluoroktán-szulfonát (LiPFOS) (19. ábra).

39

SDS

TTAB

HTAB

SC

SDC

LiPFOS 19. ábra

A vizsgálatok során alkalmazott micellaképző vegyületek szerkezeti képlete 3.4 3.4.1

Készülékek ISCO Model 3850 Capillary Electropherograph

A micelláris elektrokinetikus kromatográfiás vizsgálatok az MDR peptidek esetében ISCO Model 3850 Capillary Electropherograph (Lincoln, NE, USA) készüléken történtek. Az elválasztások nem módosított belső felületű, 50 μm belső átmérőjű és 375 μm külső átmérőjű ömlesztett kvarc kapillárisban (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) zajlottak, amelynek teljes hossza 60 cm, a detektorablakig pedig 40 cm. A minták injektálása a gyárilag beépített, változtatható osztásarányú mintaosztón (split)

40

keresztül zajlott, a mérések során minden esetben az 1:1000 osztásaránnyal történt, vagyis minden esetben az osztófejbe injektált minta 1/1000 része (1 μl mintából 1 nl) jutott a kapillárisba. Mérések során mindkét: pozitív (anód az injektor felől), illetve negatív (katód az injektor felől) polaritás alkalmazásra került. A feszültség 21 kV-ra lett beállítva, optimalizálást követően. A detektálás spektrofotométerrel, az adatgyűjtés és feldolgozást az ISCO ChemResearch vezérlő, adatgyűjtő és adatfeldolgozó rendszerével történt. 3.4.2

Beckman P/ACE System 5500

Az MDR-peptidek kivételével a tesztvegyületek méréseit Roses és munkatársai végezték Barcelonában, egy Beckman P/ACE 5500-as diódasoros UV detektorral szerelt kapilláris elektroforézis készüléken. A borítatlan kvarc kapilláris effektív hossza 40 cm volt, 50 μm belső átmérő mellett. A kapilláris kondicionálása minden egyes micellaképző közötti váltás esetén az alábbiak szerint történt: 5 perc vizes mosás, 20 perc mosás 1 M-os lúggal, 10 perc mosás vízzel, 10 perc mosás 0,1 M-os lúggal, 20 perc mosás az elválasztó pufferrel. Minden egyes futtatás előtt a kapilláris 5 percen keresztül át lett öblítve a futtató pufferrel. Az elválasztás 25°C-on anionos felületaktív anyagok esetén +15 kV feszültséggel, kationos felületaktív anyagok esetén -15 kV-tal történt. A detektálás 214 nm-en zajlott. Az injektálás nyomással történt, 0,5 p.s.i.*1sec (1 p.s.i.= 6894,76 Pa). 3.5

Pufferek

Az MDR peptidek esetében a futtatóelegy 0,1 M Na-borát puffer (pH=7,70) amely 75 mM SDS-t tartalmaz. A Na-borát puffer elkészítése 0,1 mol H3BO3 és 0,05 mol NaOH 1000 ml vízben való oldásával készült, amelynek pH-ja 0,1 M-os HCl oldat segítségével pH=7,70-re lett beállítva. LiPFOS esetében a puffer készítése az alábbiak szerint történt. 40 mM LiPFOS került oldásra vízben, H3PO3 hozzáadása mellett (20 mM), a pH =7,0-ra lett beállítva LiOHdal. Az SDS 40 mM, a SC 80 mM, a TTAB 20 mM, a HTAB 20 mM koncentrációban került oldásra pH=7,00-es 20 mM-os nátrium foszfát pufferben.

41

A SDC 40 mM koncentrációban került oldásra 20 mM-os nátriumfoszfátnátriumtetraborát pufferben pH=8,0 mellett. 3.6 3.6.1

Minták MDR-peptidek

A peptidek oldására acetonitril-víz = 1:1 elegyében került sor, 1 mg/ml koncentrációval. Az peptidet tartalmazó oldatok szűrve lettek, egyszerhasználatos szűrőfeltétek segítségével (Spartan 13 (Schleicher and Schuell, Dassel, Németország). A szudán-III oldása acetonitrilben történt, 1 mg/ml koncentrációban, ami a „micelláris marker”. 3.6.2

Tesztanyagok

A tesztvegyületek 2 mg/ml koncentrációban kerültek oldásra metanolban, ami egyben „áramlás marker” is, és kb. 2 mg/ml koncentrációban dodekafenont is tartalmaz, ami „micelláris marker”-ként funkcionál. Minden oldat szűrésre került, 0,45 μm-es szűrő felhasználásával (Albet). 3.7

Hidrofobicitás

Az egyes vegyületekhez tartozó hidrofobicitás értékeket egy interneten keresztül elérhető

számítógépes

program

segítségével

számoltam

ki.

(www.daylight.com/daycgi/clogp) A program a Hansch-Leo fragmens konstans módszer alapján végzi a CLOGP értékek számítását, azaz a kémiai szerkezet alapján prediktálja a hidrofobicitás értékeket.

42

4. 4.1

Eredmények Számítások

A kutatócsoportunkban korábban végzett mérésekből származó eredményeket, valamint Martí Roses és munkatársa által rendelkezésemre bocsájtott mérési adatokat a következő protokoll szerint dolgoztam fel. Minden egyes vegyülethez az adott fázison három párhuzamos mérés adatai álltak rendelkezésemre. Az egyes mérésekhez tartozó t0, tm, és tmc értékek alapján a 16. és 17. egyenlet felhasználásával mind a hat különböző pszeudoállófázisra vonatkozóan kiszámítottam a k’ és k” értékeket. Ezekből az értékekből képzett átlagértékeket használtam fel későbbi számításaim során. Minden egyes számított érték esetében igaz hogy a szórás érétke kisebb volt, mint 2%. A tmic értékek számítását a 18. egyenlet alapján végeztem el. Párhuzamosonként külön, külön, majd a kapott értékeket ebben az esetben is az utolsó lépésben átlagoltam. A későbbi számítások során mérésenként külön-külön számítottam ki az egyes vegyületre vonatkozó paramétereket, majd utolsó lépésben végeztem el az átlagszámítást. A CLOGP értékek számításához a 3.7 fejezetben már korábban ismertetett számítógépes programot alkalmaztam. Az egyes vegyületek szerkezeti képlete alapján számított logP értékeket a többi számítás eredménnyel együtt táblázatos formában foglaltam össze. Az ily módon számított eredményeket a 3., 4. és 5. Táblázat tartalmazza.

43

4.2

CLOGP-tmic

Korábban alkil-benzolok, és alkil-fenolok esetében SDS pszeudoállófázison már vizsgálták a minta hidrofobicitása és fázistartózkodási ideje közötti összefüggéseket. Munkám során ezeket a vizsgálatokat kiterjesztettem más felületaktív anyagokra is, amelyek közt nem csak a leggyakrabban alkalmazott anionos micellaképzők szerepelnek, hanem van kationos felületaktív anyag is. A vizsgálatokat más laboratóriumból származó kísérleti eredményeket is felhasználva végeztem, hogy a módszer alkalmazhatóságát bizonyítsam. A CLOGP valamint fázistartózkodási idő összehasonlításokat hat különböző micellaképző esetén végeztem el, nevezetesen SDS, TTAB, HTAB, SC, SDC, LiPFOS. Általánosságban elmondható, hogy minél nagyobb a vizsgált vegyület hidrofobicitása, annál nagyobb annak fázistartózkodási ideje, bármely pszeudostacioner fázist is tekintjük [88]. CLOGP = A ⋅ log t mic + B 24

Az egyes vegyületekhez tartozó CLOGP és fázistartózkodási idő értékeket az 3., 4. és 5. Táblázat tartalmazza.

44

4.3

CLOGP-tprop,mic

A CLOGP és a log tmic értékek közötti jó lineáris összefüggés lehetővé teszi, hogy a tmic értéket a minta hidrofobicitását jól jellemző paraméterként alkalmazzuk. Mivel az abszolút idő értékeket nehéz összehasonlítani, a HPLC-hez hasonlóan, szükséges egy relatív mennyiség bevezetése. A normalizált fázistartózkodási időt (tprop,mic) az alábbi egyenlettel definiáltam [88]: t prop ,mic =

t mic tm

25

A 25. egyenlet kifejezi, hogy a minta a teljes migrációs idő (tm) hányad részét töltötte a pszeudostacioner fázisban. A tprop,mic érték minden pszeudostacioner fázis, valamint az alkil-benzolok, alkil-fenolok, alkoholok, MDR-peptidek esetében is meghatározásra került. Ezeket az értékeket a 3., 4. és 5. Táblázat tartalmazza. Minél magasabb a CLOGP érték annál magasabb a tprop,mic érték, azaz a vizsgált anyag a teljes migrációs idejének nagyobb hányadát tölti a hidrofób micelláris fázisban. A hidrofóbabb molekulák (pl.: a benzolszármazékok hosszabb alkil-szénlánccal) a teljes migrációs idejük nagyobb részét töltik a micelláris fázisban, míg a kevésbé hidrofób molekulák a migrációs idejük kisebb hányadát. A tprop,mic értékek és a hidrofobicitás adatok közötti összefüggés az alábbi egyenlettel írható le: CLOGP = A ⋅ log t prop ,mic + B 26

45

4.4

A pszeudostacioner fázisok összehasonlítása

Ha abból a feltételezésből indulunk ki, hogy a tprop,mic paraméter alkalmas a vegyületek hidrofobicitásának jellemzésére, akkor abból az is következik, hogy maga a pszeudostacioner fázis is jellemezhetővé válik egy ismert hidrofobicitású anyag alapján. Ha

egy

ismert

hidrofobicitású

fázistartózkodási

idejéből

hidrofobicitásáról,

azaz

vegyületet

információt hogy

vizsgálunk,

kaphatunk

mennyire

hajlamos

a

annak

normalizált

pszeudostacioner kölcsönhatásba

fázis

lépni

a

pszeudostacioner fázis a vizsgált vegyülettel. Ez a kölcsönhatás a minta micellában való szolubilizálhatósága. Minél nagyobb egy vizsgált hidrofób vegyület normalizált fázistartózkodási ideje, azaz a teljes migrációs idejének minél nagyobb hányadát tölti a pszeudostacioner fázisban, annál inkább hajlamos az adott fázis kölcsönhatásba lépni a vizsgált vegyülettel, ami hosszabb retenciós időt eredményez. A jellemzés alapjául szolgáló adatokat a 3., 4. és 5. Táblázat mutatja. 4.4.1

A CLOGP50 érték

Felhasználva a jó korrelációt a CLOGP és a normalizált fázistartózkodási idő között, meghatározható a CLOGP50 érték. Ez egy virtuális vegyület hidrofobicitás értéke, amely vegyülethez tartozó tprop,mic érték egyenlő 0,5-del. Mindez azt jelenti, hogy a vizsgált vegyület a migrációs idejének pontosan 50%-át tölti a pszeudostacioner fázisban. A CLOGP50 mint javasolt paraméter, az egyenlő megoszláshoz tartozik a hidrofil vizes és a hidrofób micelláris fázis között, és ez által jellemzi az adott pszeudostacioner fázis visszatartó erejét. Az alacsony CLOGP50 érték egy a vizsgált vegyülettel hatékonyan, nagymértékben kölcsönható micelláris fázist jelent, míg egy magas CLOGP50 érték azt jelenti, hogy az adott fázis csak magas hidrofobicitás értékkel rendelkező vegyületekkel lép majd szoros kölcsönhatásba.

Következésképpen ez a fázis kevésbé tekinthető

hatékonynak illetve hidrofobnak. Összefoglalva, minél alacsonyabb egy adott fázis CLOGP50 értéke, annál nagyobb mértékben hat kölcsön a hidrofób jellegű vegyületekkel, azaz nagyobb a hidrofobicitása.

46

4.5

Metilén szelektivitás

A hidrofób vagy metilén szelektivitást általában úgy interpretálják, mint egy homológ sor szomszédos tagjainak relatív retencióját, ahol a sor tagjai között csak egy metilén csoportnyi különbség van. Ez a paraméter függ a hidrofób kölcsönhatástól, ami az állófázis és a tesztvegyület között alakul ki [89]. A Martin egyenlet alapján, egy növekvő szénatomszámú homológ sor esetében lineáris összefüggés van a retenciós faktor logaritmusa és a szénatomszám között [90]. A MEKC-ban alkalmazott pszeudostacioner

fázis

metilén

szelektivitása

jellemezhető

a

normalizált

fázistartózkodási idő értékekkel. Az illesztés paramétereit az alábbi egyenlet tartalmazza: log t prop ,mic = A ⋅ log Z + B 27

Ahol Z az alkil lánc szénatomszáma. Ezeket a paramétereket az alkil-benzol homológ sor esetében minden pszeudostacioner fázisra meghatároztuk. A 27. egyenlet meredeksége (A), ami a metilénszelektivitást jellemzi. A metilén szelektivitás számításához szükséges adatokat a 3., 4. és 5. Táblázat tartalmazza.

3. Táblázat

4. Táblázat

47

48

benzol* toulol ethylbenzol propilbenzol butilbenzol propiofenon butirofenon* valerofenon heptanofenon pentán-1,5-diol bután-1-ol pentán-3-ol pentán-1-ol anilin* o-toluidin* benzaldehid* metilbenzoát* naftalin*

2,142 2,641 3,17 3,699 4,228 2,11 2,638 3,168 4,226 -0,635 0,823 1,132 1,352 0,991 1,364 1,495 2,111 3,31

tesztvegyületek CLOGP

0,776088 2,196477 5,545475 17,01383 53,2628 2,751747 6,334904 16,18006 0,04765 0,198054 0,274291 0,63222 0,412916 0,846651 0,850329 2,693173 11,60105

k' 0,095673 0,229748 0,428104 0,694684 0,876128 0,335113 0,5371 0,747698 0,00996 0,042157 0,058454 0,117436 0,089106 0,162141 0,133386 0,357042 0,715091

k"

tmic 3,137093 7,564056 14,17929 23,21024 29,46388 7,84194 12,56899 17,49761 0,18897 0,770566 1,04389 2,29653 1,505065 2,885267 3,130319 7,146729 13,47664

SDS

0,436957 0,68714 0,847198 0,944463 0,981554 0,733454 0,863662 0,941792 0,044451 0,165311 0,215249 0,387317 0,292209 0,458479 0,459525 0,729227 0,920635

tprop,mic 0,67905 1,851538 4,432315 12,38061 33,01183 1,293308 3,045514 7,791198 0,04429 0,336591 0,704426 0,404824 1,225248 12,93425

k'

tmic 2,679467 5,245182 7,746628 9,927171 11,00681 4,555592 7,297054 10,00343 0,159683 1,395015 2,333576 1,516467 3,744396 7,731176

TTAB

0,227582 0,445477 0,657892 0,843045 0,934711 0,347022 0,555842 0,761989 0,021105 0,135444 0,260291 0,167342 0,362911 0,865825

k"

*: tesztvegyületek

0,404425 0,64931 0,815913 0,925259 0,970584 0,563948 0,752811 0,886246 0,042412 0,251828 0,413289 0,288167 0,550609 0,928226

tprop,mic 0,94292 2,621937 6,423349 17,03205 33,15656 1,692607 4,091959 11,17809 0,438038 0,908331 0,525733 1,582964 19,31747

k'

0,31564 0,561882 0,758565 0,892824 0,941909 0,455821 0,669422 0,846902 0,171853 0,300432 0,198501 0,428449 0,900927

k"

tmic 3,041927 5,415047 7,310539 8,604435 9,077493 4,330301 6,359512 8,045569 1,768463 3,089919 2,051273 4,420913 9,243801

HTAB

3. Táblázat A tesztvegyületekhez tartozó CLOGP, k’, k”, tmic és tprop,mic értékek SDS, TTAB és HTAB fázisokon

0,485311 0,723905 0,865289 0,944539 0,970716 0,628612 0,803611 0,917885 0,304603 0,47597 0,344577 0,612822 0,950473

tprop,mic

49

benzol* toulol ethylbenzol propilbenzol butilbenzol propiofenon butirofenon* valerofenon heptanofenon pentán-1,5-diol bután-1-ol pentán-3-ol pentán-1-ol anilin* o-toluidin* benzaldehid* metilbenzoát* naftalin*

2,142 2,641 3,17 3,699 4,228 2,11 2,638 3,168 4,226 -0,635 0,823 1,132 1,352 0,991 1,364 1,495 2,111 3,31

tesztvegyületek CLOGP

0,874663 2,664591 7,046037 19,17997 40,16027 0,992824 2,285914 5,698134 31,5188 0,04624 0,153863 0,168604 0,394468 0,184114 0,331169 0,348014 1,143929 10,30758

k' 0,229563 0,475765 0,705829 0,867189 0,931828 0,200287 0,365243 0,588531 0,887436 0,017342 0,057381 0,063183 0,132575 0,065056 0,113617 0,119591 0,307237 0,801539

k"

tmic 3,560847 7,38221 10,95486 13,46161 14,46627 4,710777 8,613933 13,92966 21,10404 0,210704 0,707058 0,763823 1,670523 0,861586 1,45634 1,505887 3,909928 10,01667

SC

0,466571 0,727118 0,875715 0,950443 0,975702 0,498196 0,695668 0,850704 0,969248 0,042366 0,133343 0,144277 0,28288 0,155485 0,24878 0,258165 0,533566 0,911548

tprop,mic 0,41703 1,507073 4,572593 13,22551 30,35022 0,727948 1,652295 4,552828 0,033238 0,053574 0,061265 0,116669 0,120949 0,2081 0,251207 0,724051 8,033845

k'

tmic 1,425288 3,802132 6,643981 8,74695 9,65837 2,396486 4,338895 7,312966 0,137477 0,206933 0,255463 0,444207 0,459849 0,76594 0,903467 2,241552 7,936962

SDC

0,135715 0,362019 0,632571 0,832758 0,919516 0,199777 0,361691 0,609563 0,011194 0,020109 0,019629 0,041507 0,043107 0,071969 0,087329 0,214274 0,750431

k"

*: tesztvegyületek

0,294299 0,601128 0,82055 0,929704 0,968098 0,421278 0,622966 0,819909 0,032168 0,050849 0,057728 0,104478 0,107894 0,172251 0,20077 0,419964 0,889304

tprop,mic 0,302376 0,647469 1,240498 2,609694 5,553342 2,95933 5,668858 11,12367 53,18499 0,089232 0,227838 0,313677 0,637974 0,234711 0,414539 0,870207 2,459112 1,308659

k'

0,064011 0,12773 0,219087 0,371147 0,556715 0,394204 0,554845 0,709726 0,921187 0,019023 0,046447 0,063361 0,118794 0,049709 0,087928 0,16224 0,339114 0,234468

k"

tmic 0,962746 1,921169 3,295271 5,582548 8,373803 6,161459 8,671868 11,09249 14,39584 0,334604 0,837317 1,13001 2,178216 0,761306 1,285692 2,508039 5,626159 3,374343

LiPFOS

4. Táblázat A tesztvegyületekhez tartozó CLOGP, k’, k”, tmic és tprop,mic értékek SDS, TTAB és HTAB fázisokon

0,232171 0,393003 0,553663 0,722958 0,847397 0,747086 0,849783 0,917318 0,981492 0,08203 0,18556 0,238773 0,389473 0,190091 0,292627 0,465262 0,710359 0,566834

tprop,mic

5. Táblázat

Az MDR peptidekhez tartozó CLOGP, tmic és tprop,mic értékek MDR-peptidek

CLOGP

tmic

tprop,mic

(Z-Pro)2-Lys-OMe

3,78

9,608

0,693

[BOC-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe

4,99

12,42

0,762

[BOC-Asp(OBzl)-Lys(Z)]-OtBu

5,58

10,69

0,723

[BOC-Pro-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe

5,75

11,98

0,753

[BOC-Pro-Pro-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe

6,6

12,18

0,757

[BOC-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe

6,66

12,78

0,769

FMOC-Glu[Lys(Z)OtBu]2

9,82

22,99

0,905

50

5. 5.1

Megbeszélés CLOGP-tmic

A korábbi feltételezések helyesnek bizonyultak, miszerint jó lineáris összefüggés fedezhető fel a log tmic és a CLOGP értékek között. Ez igaz mind a hat különböző pszeudostacioner fázis esetében. A lineáris összefüggést a 24. egyenlet írja le. Az illesztések paramétereit a 6. Táblázat tartalmazza, ahol az egyenes egyenlete Y=A*X+B, azaz Y=CLOGP, X=log tmic.

TTAB

4

4

2

2

CLOGP

CLOGP

SDS

0

-2 -1,0

0

-0,5

0,0

0,5

1,0

-2 -1,0

2,0

4

4

2

2

0

-2 -1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

-2 -1,0

2,0

-0,5

0,0

SDC

0,5

1,0

1,5

2,0

SC

0,5

1,0

4

4

2

2

0

1,5

2,0

LiPFOS

log tmic

CLOGP

CLOGP

0,0

0

log tmic

-2 -1,0

-0,5

log tmic

CLOGP

CLOGP

1,5

HTAB

log tmic

0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2 -1,0

-0,5

log tmic

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

log tmic

20. ábra

A hat különböző fázishoz tartotó log tmic vs. CLOGP grafikonok és a hozzájuk tartozó lineáris illesztések

51

6. Táblázat

A log tmic vs. CLOGP ábrákhoz tartozó lineáris illesztések paraméterei A

B

R2

SD

Prob
SDS

2,01097

0,77049

0,94184

0,3061

<0.0001

TTAB

2,8925

0,59623

0,88531

0,33863

<0.0001

HTAB

3,6509

0,02174

0,87926

0,34744

<0.0001

SC

2,1995

1,00156

0,95007

0,29782

<0.0001

SDC

1,89946

1,69714

0,92048

0,35791

<0.0001

LiPFOS

2,36995

1,18108

0,71358

0,71331

<0.0001

Az összehasonlításokat vegyületcsoportokra bontva is elvégeztem. Ahol is külön lineáris illesztéseket végeztem a benzolokra, fenolokra, alkoholokra és az MDRpeptidekre SDS pszeudostacioner fázison. Minden egyes vegyületcsoport esetében jó lineáris korreláció volt tapasztalható (21. ábra). Az illesztések paramétereit a 7. Táblázat foglalja össze. A tmic értékeket a 3., 4. és 5. Táblázat tartalmazza.

10

10

Fenonok

8

8

6

6

CLOGP

CLOGP

Benzolok

4

4

2

2

0

0

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

-1,0

log tmic

10

6

6

4

0,5

1,0

1,5

0,5

1,0

1,5

log tmic

4

2

2

0

0

-0,5

0,0

MDR-peptidek 8

CLOGP

CLOGP

Alkoholok 8

-1,0

-0,5

10

0,0

0,5

1,0

1,5

-1,0

log tmic

-0,5

0,0

log tmic

21. ábra

Az SDS fázison mért négy különböző vegyületcsoporthoz tartozó log tmic vs. CLOGP grafikon, és a hozzá tartozó lineáris illesztések

52

7. Táblázat

Az SDS fázison mért négy különböző vegyületcsoporthoz tartozó tmic vs. CLOGP ábrákhoz tartozó lineáris illesztések paraméterei A

B

R2

SD

Prob
Benzolok

2,05106

0,97648

0,9518

0,20964

0,00456

Fenonok

3,00418

-0,60255

0,98961

0,07626

0,06501

Alkoholok

1,92051

0,88745

0,94305

0,2617

0,02889

MDR-peptidek

14,69961

-10,0806

0,88714

0,69464

0,00152

53

5.2

CLOGP-tprop,mic

A tprop,mic értékeket a 25. egyenlet alapján kiszámítottam az összes vegyületre mind a hat különböző pszeudostacioner fázis esetében, ezeket a 3., 4. és 5. Táblázat tartalmazza. Az így számított tprop,mic értékek logaritmusa és a CLOGP adatok közötti összefüggést a 22. ábra szemlélteti. Minden állófázis esetében elvégeztem a lineáris illesztést, amelynek paramétereit a 8. Táblázat foglalja össze. A fázistartózkodási idők normalizálását követően továbbra is fennáll a jó lineáris összefüggés.

TTAB

4

4

2

2

CLOGP

CLOGP

SDS

0

-2 -1,5

0

-1,0

-0,5

0,0

0,5

4

4

2

2

0

-2 -1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

-2 -1,5

1,0

-1,0

0,0

-0,5

SDC

0,5

1,0

SC

0,0

0,5

4

4

2

2

0

1,0

LiPFOS

log tprop,mic

CLOGP

CLOGP

-0,5

0

log tprop,mic

-2 -1,5

-1,0

log tprop,mic

CLOGP

CLOGP

-2 -1,5

1,0

HTAB

log tprop,mic

0

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

-2 -1,5

log tprop,mic

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

log tprop,mic

22. ábra

A hat különböző fázishoz tartozó log tprop,mic vs. CLOGP értékek és a hozzájuk tartozó lineáris illesztések

54

8. Táblázat

A log tprop,mic vs. CLOGP ábrához tartozó lineáris illesztések paraméterei A

B

R2

SD

Prob
SDS

3,13967

3,10852

0,82678

0,52825

<0.0001

TTAB

4,48706

3,56349

0,86632

0,36559

<0.0001

HTAB

5,16937

3,5078

0,8555

0,38011

<0.0001

SC

3,16466

3,46059

0,9119

0,39562

<0.0001

SDC

2,36917

3,41409

0,89795

0,40546

<0.0001

LiPFOS

3,70426

3,5751

0,74318

0,67545

<0.0001

A vizsgált vegyületeket csoportokra bontva SDS fázis esetében külön is elvégeztem a lineáris illesztéseket, amelyeket a 23. ábra szemléltet. Az illesztett egyenesek paramétereit a 9. Táblázat foglalja össze. 9. Táblázat

Az SDS fázison mért négy különböző vegyületcsoporthoz tartozó tprop,mic vs. CLOGP ábrákhoz tartozó lineáris illesztések paraméterei A

B

R2

SD

Prob
Benzolok

5,27787

3,8383

0,84487

0,37612

0,02725

Fenolok

9,44475

3,34491

0,96912

0,13147

0,11246

Alkoholok

2,21669

2,44845

0,9672

0,19859

0,01654

MDR-peptidek

49,40606

11,95408

0,89562

0,66803

0,00124

55

10

10

Fenonok

8

8

6

6

CLOGP

CLOGP

Benzolok

4

4

2

2

0

0

-1,4

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

-1,4

log tprop,mic

10

6

6

CLOGP

CLOGP

8

4

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

log tprop,mic

4

2

2

0

0

-1,2

-1,0

MDR-peptidek

Alkoholok 8

-1,4

-1,2

10

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

log tprop,mic

-1,4

-1,2

-1,0

-0,8

log tprop,mic

23. ábra

Az SDS fázison mért négy különböző vegyületcsoporthoz tartozó log tprop,mic vs. CLOGP grafikon, és a hozzá tartozó lineáris illesztések A fenti eredmények alapján elmondható, hogy a normalizált fázistartózkodási idő alkalmas a vizsgált vegyületek hidrofobicitásának jellemzésére. A számítások alapjául szolgáló adatokat a 3., 4. és 5. Táblázat tartalmazza.

56

5.3

A pszeudostacioner fázisok összehasonlítása

A tény, hogy a tprop,mic paraméter alkalmasnak bizonyult a vegyületek hidrofobicitásának jellemzésére, még egy pozitív dolgot von maga után. Nem csupán a vizsgált anyag hidrofobicitása vált jellemezhetővé a paraméter segítségével, de a pszeudostacioner fázis és a minta közötti kölcsönhatás is. Mindez jól illusztrálható például a toluollal (mint az alkil-benzol sor tagja) vagy a propiofenonnal (alkil-fenon sor tagja). Ezeknek a vegyületeknek a normalizált fázistartózkodási ideje nagyobbnak bizonyul HTAB „fázis” esetében, mint TTAB „fázison”. Ezek az adatok eleget tesznek a szerkezeten alapuló feltételezéseknek: a HTAB micellák (két metilén csoporttal hosszabb alkil lánccal rendelkezik, mint a TTAB) erősebb kölcsönhatást tesznek lehetővé, mint a TTAB micellái, ami nagyobb normalizált fázistartózkodási idő értékekben nyilvánul meg. Hasonló eredményeket kaptunk az alkil-benzol valamint az alkil-fenon sor minden egyes tagjára, valamint a vegyes csoport tagjaira (26. ábra). Egy ismert hidrofobicitású vegyület normalizált fázistartózkodási ideje alkalmas a MEKC-ban alkalmazott pszeudostacioner fázisok jellemzésére. Azonban sokkal megbízhatóbb eredmény érhető el, ha nem csupán egy tesztvegyületet alkalmazunk, hanem több vegyületből összeállított csoportot használunk a pszeudostacioner fázis és a vizsgált anyagok közötti kölcsönhatás jellemzésére. Éppen ezért az összehasonlítást elvégeztük egy széles hidrofobicitási skálát lefedő gondosan összeválogatott vegyületcsoporttal, ahol a vegyületek szerkezete és jellege is eltérő (bázikus, semleges, poláris, nagyon vagy kevésbé hidrofób). A kiválasztott tesztvegyületek esetében (anilin, o-toluidin, benzaldehid, benzol, metil-benzoát, butirofenon, naftalin; csillaggal jelölt vegyületek a 3. és 4. Táblázatban) a különböző fázisokon kapott normalizált fázistartózkodási idő adatokat a 3., 4. és 5. Táblázat tartalmazza. A tesztvegyületekhez tartozó normalizált fázistartózkodási idők és azok hidrofobicitása közötti összefüggéseket a különböző pszeudostacioner fázisokon a 24. ábra és a 25. ábra szemlélteti. A tesztvegyületek esetén kapott eredmények összehasonlítása HTAB és TTAB fázison alátámasztották a toluol és a propiofenon esetében kapott eredményeket és az abból levont következtetéseket. A normalizált fázistartózkodási idő minden egyes

57

tesztvegyület esetében magasabb értéket mutatott HTAB fázison, mint TTAB fázison (26. ábra) ami azt jelenti, hogy a HTAB erősebb kölcsönhatásba lép a tesztvegyületekkel, valamint nagyobb a hidrofobicitása a TTAB pszeudostacioner fázisénál. Ezek az eredmények összhangban vannak a Muijseelar [84] vagy Terabe [7] illetve a saját korábban végzett számításainkkal [91]: azok a pszeudostacioner fázisok, amelyeket hosszabb alkil-lánccal rendelkező felületaktív anyagok alkotnak, a hidrofób vegyületeket tovább tartják vissza, mint a rövidebb alkil-lánccal rendelkezők (25. ábra).

1,0

SDS TTAB HTAB SC SDC LiPFOS

0,8

tprop,mic

0,6

0,4

0,2

na fta lin

bu tir of en on

be nz ol

be nz al de hi d m et ilb en zo át

oto lu id in

an ilin

0,0

24. ábra A kiválasztott tesztvegyületekhez tartozó normalizált fázistartózkodási idők a hat különböző pszeudostacioner fázison

58

SDS

TTAB 4

CLOGP

CLOGP

4

2

0 -0,6

0 -0,5

-0,4

-0,3

-0,1

0,0

-0,6

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

SC

log tprop,mic

4

2

0 -0,6

-0,5

HTAB

CLOGP

CLOGP

-0,2

log tprop,mic

4

2

0 -0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

-0,9

CLOGP

0 -0,8

-0,6

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,2

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

LiPFOS

2

0 -0,9

0,0

-0,4

log tprop,mic

4

2

-1,0

-0,8

SDC

log tprop,mic

4

CLOGP

2

log tprop,mic

-0,8

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

log tprop,mic

25. ábra

A kiválasztott tesztvegyületek különböző állófázisokra vonatkozó log tprop,mic vs. CLOGP értékekei tartozó lineáris illesztések (Az egyenesek egyenleteit a 10. Táblázat tartalmazza)

59

lu

ol

ilb

o en l op z ilb ol bu enz ol til pr ben op z io ol bu fen ti r o n o va fen le o ro n fe no n an o- ilin t be olu n z id i n m ald et eh ilb en id zo n a át fta lin pr

et

nz

to

be

tprop,mic

TTAB HTAB

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

26. ábra

A normalizált fázistartózkodási idő összehasonítása TTAB és HTAB állófázis esetében

60

5.3.1

A CLOGP50 érték

A CLOGP50 értékek kiszámítása a 26. egyenlet alapján történt, ahol tprop,mic értéke egyenlő 0,5. A számított CLOGP50 érékeket az összes vizsgált fázisra összefoglalva a 10. Táblázat tartalmazza. A legalacsonyabb CLOGP50 érték a SDS pszeudostacioner fázis esetében tapasztalható, míg a legmagasabb értékkel a SDC rendelkezik. A már korábban vizsgált normalizált fázistartózkodási idő adatok alapján az tapasztalható, hogy a HTAB fázis hidrofóbabbnak bizonyult, mint a TTAB pszeudostacioner fázis (24. ábra). Mindezekkel összhangban a HTAB esetében kisebb CLOGP50 értéket kapunk, mint TTAB fázis esetén (10. Táblázat). A CLOGP50 érték alapján a pszeudostacioner fázisok között meghatározható egy sorrend. A kölcsönhatás mértéke alapján a következő csökkenő sorrend állítható fel a vizsgált pszeudostacioner fázisok között: SDS > HTAB > TTAB > SC > LiPFOS > SDC (27. ábra). Ez a sorrend megfelel Yang és Khaledi korábbi tapasztalatainak [92] ahol három fázist (SDS, LiPFOS és SC) vizsgáltak és a következő hidrofobicitás alapján csökkenő sorrendet kapták: SDS > SC > LiPFOS [92]. A CLOGP50 érték, amely egy tesztvegyületsor segítségével kerül meghatározásra, jellemzi a MEKC során alkalmazott pszeudostacioner fázis hajlandóságát a mintával való kölcsönhatásba lépésre, azaz a pszeudostacioner fázis hidrofób jellegét.

10. Táblázat

A különböző fázisokra vonatkozó log tprop,mic vs. CLOGP adatokhoz tartozó lineáris illesztések paraméterei és az azok alapján számított CLOGP50 értékek A

B

R2

SD

Prob
CLOGP50

SDS

3,89762

3,0134

0,79753

0,39396

0,00678

1,840099

TTAB

3,59088

3,20303

0,87369

0,31117

0,00202

2,122067

HTAB

4,1337

3,1559

0,8802

0,30304

0,00176

1,911532

SC

2,84

3,14461

0,95374

0,18832

0,000158

2,289685

SDC

2,42044

3,24954

0,96285

0,16877

<0.0001

2,520915

LiPFOS

2,28648

3,00187

0,42437

0,66427

0,11294

2,313571

61

0,2 0,1 0,0 -0,1

tprop,mic=0,5

-0,2

log tprop,mic

-0,3

SDS TTAB HTAB SC SDC LiPFOS

-0,4 -0,5 -0,6 -0,7 -0,8 -0,9 -1,0 -1,1 -1,2 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

CLOGP

27. ábra

A kiválasztott tesztvegyületekre vonatkozó log CLOGP vs. tprop,mic összefüggés ábrázolása és az egyes fázisokhoz tartozó CLOGP50 értékek grafikus ábrázolása

62

5.4

Metilén szelektivitás

Egy alkil-benzol homológ sor esetében határoztam meg a metilén szelektivitást jellemző paramétereket. Ezek a 27. egyenlet alapján a következők: Z az alkil lánc szénatomszáma, A az illesztett egyenes meredeksége, ami magát a metilén szelektivitást jellemzi. Ezeket a paramétereket az alkil-benzol homológ sor esetében minden pszeudostacioner fázisra meghatároztam. A vizsgált pszeudostacioner fázisok között metilénszelektivitás alapján az alábbi sorrend állítható fel: LiPFOS> SDC > TTAB > SDS > SC > HTAB (28. ábra). A LiPFOS bizonyult a leginkább metilénszelektív pszeudostacioner fázisnak, míg a HTAB legkevésbé szelektívnek. Az illesztett egyenesek paramétereit a különböző fázisok esetében a 11. Táblázat tartalmazza.

0,00 -0,05 -0,10

log tprop,mic

-0,15 -0,20

SDS TTAB HTAB SC SDC LiPFOS

-0,25 -0,30 -0,35 -0,40 -0,45 0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

log Z

28. ábra

A log Z vs. log tprop,mic ábra, a különböző fázisok metilénszelektivitásának meghatározásához

63

11. Táblázat

A log Z vs. log tprop,mic ábrához tartozó lineáris illesztések paraméterei A

B

R2

SD

Prob
SDS

0,26428

-0,15816

0,98614

0,01002

0,00695

TTAB

0,29739

-0,18327

0,99003

0,00954

0,005

HTAB

0,21807

-0,13546

0,98057

0,00981

0,00976

SC

0,21825

-0,1325

0,97496

0,01118

0,0126

SDC

0,35331

-0,21008

0,96909

0,02018

0,01558

LiPFOS

0,5583

-0,41143

0,99622

0,011

0,00189

64

6.

Következtetések

Bizonyítást nyert, hogy az újonnan bevezetett normalizált fázistartózkodási idő alkalmas a vizsgált vegyületek hidrofobicitásának jellemzésére, mivel jó lineáris korreláció van a paraméter logaritmusa és a CLOGP értékek között. A normalizált fázistartózkodási idő mint paraméter nagy előnye, hogy a normalizálásból adódóan, különböző körülmények között végzett mérések is összehasonlíthatóvá válnak. A paraméter nem csak a vegyület hidrofobicitásának jellemzésére alkalmas, hanem az állófázisok jellemzése is megvalósítható vele. Mindezt nem csak saját mérési adatok alapján mondhatjuk el, hanem tőlünk függetlenül végzett kísérleti eredményeken is igaznak bizonyult. A CLOGP50 érték jól jellemzi az adott pszeudostacioner fázis hidrofobicitását, azaz, hogy milyen mértékben képes kölcsönhatni az adott hidrofobicitású vegyületekkel. Elmondható, hogy minél alacsonyabb egy adott fázis CLOGP50 értéke, annál nagyobb mértékben hat kölcsön a hidrofób jellegű vegyületekkel, tehát nagyobb a hidrofobicitása. A korábban mások által meghatározott kísérletileg felállított sorrend megegyezik a számításaim alapján kapott szelektivitási sorrenddel. A normalizált fázistartózkodási idő jól alkalmazható a pszeudostacioner fázisok metilénszelektivitásának

meghatározására.

A

metilénszelektivitás

ismeretében

könnyebb a kísérlettervezés során megválasztani az elválasztáshoz alkalmas pszeudoállófázis fajtáját.

65

7.

Összefoglalás

Munkám

során

micelláris

elektrokinetikus

kromatográfiás

(MEKC)

technika

segítségével módszert fejlesztettem ki öt különböző vegyületcsoport hidrofobicitásának meghatározására. Összehasonlítottam a vizsgált vegyületek CLOGP értékeit a kutatócsoportunk által korábban bevezetett fázistartózkodási (tmic) valami az újonnan általam

bevezetett

normalizált

fázistartózkodási

időkkel

(tprop,mic=tmic/tm).

Az

összehasonlítások során jó lineáris korrelációt találtam a vizsgált értékek között, ami lehetővé teszi a vizsgált vegyületek hidrofobicitás értékének meghatározását. Az összehasonlításokat nem csupán a leggyakrabban alkalmazott nátrium-dodecilszulfát (SDS) fázison végeztem el, hanem másik öt, jellegében eltérő, köztük kationos micellaképző anyagokon is. A normalizált fázistartózkodási idő segítségével nem csupán a vizsgált vegyületek hidrofobicitása határozható meg, hanem az egyes módszerek során alkalmazott pszeudostacioner

fázisok

is

jellemezhetők.

Munkám

során

hat

különböző

pszeudoállófázison végeztem vizsgálatokat. A kapott eredmények alapján a normalizált fázistartózkodási idő segítségével bevezettem és egyúttal meghatároztam a különböző fázisokra vonatkozó CLOGP50 értékeket. A CLOGP50 érték egy olyan virtuális molekula hidrofobicitás értékét reprezentálja, amelyik a teljes migrációs idejének a felét a micelláris, felét pedig a vizes fázisban tölti. Számításaim alapján hidrofobicitásuk szerint az alábbi sorrend állítható fel a különböző pszeudostacioner fázisok között: SDS > HTAB > TTAB > SC > LiPFOS > SDC. A normalizált fázistartózkodási idő paraméter segítségével meghatároztam a kísérletek során alkalmazott pszeudoállófázisok metilénszeklektivitását, a Martin egyenlet felhasználásával (log tprop,mic=A*Z+B; Z az alkil lánc szénatomszáma). A számítások során egy alkil benzol homológ sor migrációs adatait használtam fel. A vizsgált pszeudostacioner fázisok között metilénszelektivitás alapján az alábbi sorrend állítható fel: LiPFOS> SDC > TTAB > SDS > SC > HTAB.

66

Summary Application of high performance separation techniques in the analysis of biologically active and drug candidate molecules

In this thesis I introduce a new technique using micellar electrokinetic chromatography (MEKC) for the determination of hydrophobocity. Comparison was made between the formerly introduced micellar phase residence time and the calculated hydrophobicity (CLOGP) values of the analytes, and linear correlation was found between them. I introduced a new parameter called micellar proportion (tprop,mic=tmic/tm), A good linear correlation was obtained between tprop,mic and the CLOGP of the analytes for the six different pseudostationary phases. There were both anionic and cationic among the studied pseudostationary phases is. Considering a given pseudostationary phase, tprop,mic as a relative quantity is a suitable parameter to characterize and compare experimentally the behaviour of the various analytes in MEKC. Applying a set of probe molecules with known hydrophobicity, the CLOGP50 value (showing the value of hydrophobicity of a virtual molecule spending exactly 50% of its migration time in the pseudostationary phase) has been calculated for each pseudostationary phase applied. This experimentally determinable numerical value (characterizing the pseudostationary phase) can be utilized to compare the hydrophobicity and hence retention ability of the pseudostationary phases. The order of the pseudostacionary phases: SDS > HTAB > TTAB > SC > LiPFOS > SDC The tprop,mic value was found to be applicable to compare the methylene selectivity of the different pseudostationary phases as well: logtprop,mic = A*Z+B, where Z is the number of carbon atoms of the alkyl chain in the alkyl benzene homologous series. Considering the methylene-selectivity the order of the pseudstacionary phases is: LiPFOS> SDC > TTAB > SDS > SC > HTAB.

67

8.

Irodalomjegyzék

1. Hjerten S., Free zone electrophoresis, Chromatogr Rev., 2: 122-219, 1967. 2. Jorgenson JW., Lukacs KD., Free-zone electrophoresis in glass capillaries, Clin Chem. 27: ,1551-3. 3. Khaledi MG., High performance capillary electrophoresis, Chemical Analysis Series, Vol. 146, John Wiley & Sons, Inc., 1998. 4. Li SFY., Capillary electrophoresis principles, practice and applications, Journal of Chromatography Library – vol. 52., Elsevier Science B. V., 1994. 5. Hjertén, S. High performance electrophoresis. Chromatogr. Rev. 1967; 9: 122219. 6. Cohen

A.,

Karger

BL.,

High-performance

sodium

dodecyl

sulfate

polyacrylamide gel capillary electrophoresis of peptides and proteins, J Chromatogr., 1987, 397: 409-17. 7. Terabe S., Otsuka K., Ichikawa K., Tsuchiya A., Ando T., Electrokinetic separations with micellar solutions and open-tubular capillaries, Anal. Chem., 1984, 56: 111-3. 8. Terabe S., Otsuka K., Ando T., Electrokinetic chromatography with micellar solution and open-tubular capillary, Anal. Chem., 1985, 57: 834-41. 9. http://www.muszeroldal.hu/measurenotes/kapillelfo.pdf

Dr

Gáspár

Attila,

Kapilláris elektroforézis 10. Belder D., Elke K., Husmann H., Influence of pH-value of methanolic electrolytes on electroosmotic flow in hydrophilic coated capillaries, J Chromatogr A., 2000, 868: 63-71. 11. Belder D., Husmann H., Warncke J., Directed control of electroosmotic flow in nonaqueous electrolytes using poly(ethylene glycol) coated capillaries, Electrophoresis, 2001, 22: 666-72. 12. Figeys D., Aebersold R., Capillary electrophoresis of peptides and proteins at neutral pH in capillaries covalently coated with polyethyleneimine, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 1997, 695: 163-8. 13. Horvath J., Dolnik V., Polymer wall coatings for capillary electrophoresis, Electrophoresis, 2001, 22: 644-55.

68

14. Mikus P., Kaniansky D., Fanali S., Separation of multicomponent mixtures of 2,4-dinitrophenyl labelled amino acids and their enantiomers by capillary zone electrophoresis, Electrophoresis, 2001, 22: 470-7. 15. Schmalzing D., Piggee CA., Foret F., Carrilho E., Karger BL., Characterization and performance of a neutral hydrophilic coating for the capillary electrophoretic separation of biopolymers, J Chromatogr A., 1993, 652: 149-59. 16. Smith JT., el Rassi Z., Capillary zone electrophoresis of biological substances with fused silica capillaries having zero or constant electroosmotic flow, Electrophoresis, 1993, 14: 396-406. 17. Yao XW., Wu D., Regnier FE., Manipulation of electroosmotic flow in capillary electrophoresis, J. Chromatogr. 1993, 636: 21-9. 18. Nock T., Dove J., McCord B., Mao D., Temperature and pH studies of short tandem repeat systems using capillary electrophoresis at elevated pH, Electrophoresis, 2001, 22: 755-62. 19. Wallingford RA., Ewing AG., Capillary electrophoresis, Adv. Chromatogr., 1989, 29: 1-76. 20. Prado MS., Steppe M., Tavares MF., Kedor-Hackman ER., Santo P., Method validation for diclofenac sodium in pharmaceuticals by capillary electrophoresis, J. Capillary Electrophor., 1999, 6: 125-9. 21. Zabzdyr JL., Lillard SJ., UV- and visible-excited fluorescence of nucleic acids separated by capillary electrophoresis, J. Chromatogr. A, 2001, 911: 269-76. 22. Engelhardt H., Beck W., Schmitt T., Capillary electrophoresis – methods and potentials,

Friedr.

Vieweg

&

Sohn

Verlagsgesellschaft

mbH,

Braunschweig/Wiesbaden, 1996. 23. Heiger DN., High performance capillary electrophoresis - an introduction, Hewlett Packard Company, France, 1992 24. Dankova M., Strasik S., Molnarova M., Kaniansky D., Marak J., Capillary zone electrophoresis of orotic acid in urine with on-line isotachophoresis sample pretreatment and diode array detection, J. Chromatogr. A, 2001, 916: 143-53. 25. Heiger DN., Kaltenbach P., Sievert HJ., Diode array detection in capillary electrophoresis, Electrophoresis, 1994, 15: 1234-1247.

69

26. Phillips TM., Analysis of single-cell cultures by immunoaffinity capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection, Luminescence, 2001, 16: 145-52. 27. Zhao S., Prasad C., Robertson HJ., Liu YM., Determination of enterostatin in human cerebrospinal fluid by capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection, Fresenius J. Anal. Chem., 2001, 369: 220-4. 28. Freudemann T., von Brocke A., Bayer E., On-line coupling of capillary gel electrophoresis with electrospray mass spectometry for oligonucleotide analyis, Anal. Chem., 2001, 73: 2587-93. 29. Von Brocke A., Nicholson G., Bayer E., Recent advances in capillary electrophoresis / electrospray-mass spectometry, Electrophoresis, 2001, 22: 1251-66. 30. Wahl JH, Goodlett DR, Udseth HR, Smith RD., Use of small-diameter capillaries for increasing peptide and protein detection sensitivity in capillary electrophoresis-mass spectrometry, Electrophoresis, 1993, 14: 448-57. 31. Johnson T., Bergquist J., Ekman R., Nordhoff E., Schurenberg A., Kloppel KD., Muller M.,Lehrach H., Gobom J., A CE-MALDI interface based on the use of prestructured sample supports, Anal. Chem., 2001, 73: 1670-5. 32. Zidkova J., Chmelik J., Determination of saccharides in fruit juices by capillary electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectometry, J. Mass. Spectrom., 2001, 36: 417-21. 33. Wolf SM., Vouros P., Incorporation of sample stacking techniques into the capillary electrophoresis CF-FAB mass spectrometric analysis of DNA adducts, Anal Chem., 1995, 67: 891-900. 34. Tábi Tamás, A deprenyl metabolikus N-oxidációjának vizsgálata királis kapilláris elektroforézissel 2006, Doktori értekezés, Semmelweis Egyetem, Gyógyszerhatástani Intézet 35. Barta C., Ronai Z., Sasvari-Szekely M., Guttman A., Rapid single nucleotide polymorphism analysis by primer extension and capillary electrophoresis using polyvinyl pyrrolidone matrix, Electrophoresis, 2001, 22: 779-82. 36. Eriksson HJ., Somsen GW, Hinrichs WL, Frijlink HW, de Jong GJ., Characterization of human placental alkaline phosphatase by activity and protein

70

37. Heller C., Principles of DNA separation with capillary electrophoresis, Electrophoresis, 2001, 22: 629-43. 38. Hiraoka A., Tominaga I, Hori K., Sodium dodecylsulfate capillary gel electrophoretic measurement of the concentration ratios of albumin and alpha2macroglobulin in cerebrospinal fluid and serum of patients with neurological disorders, J Chromatogr A., 2000, 895: 339-44. 39. Hong JW., Hosokawa K., Fujii T., Seki M., Endo I., Microfabricated polymer chip for capillary gel electrophoreis, Biotechnol. Prog., 2001, 17: 958-962. 40. Righetti PG., Gelfi C., Capillary electrophoresis of DNA for molecular diagnostics: an update, J Capillary Electrophor., 1999, 6: 119-24. 41. Hiraoka A., Seiki K, Oda H, Eguchi N, Urade Y, Tominaga I, Baba K., Charge microheterogeneity of the beta-trace proteins (lipocalin-type prostaglandin D synthase) in the cerebrospinal fluid of patients with neurological disorders analyzed by capillary isoelectrofocusing, Electrophoresis, 2001, 22: 3433-7. 42. Martinovic S., Pasa-Tolic, Masselon C, Jensen PK, Stone CL, Smith RD., Characterization of human alcohol dehydrogenase isoenzymes by capillary isoelectric focusing-mass spectrometry, Electrophoresis, 2000, 21: 2368-75. 43. Shen Y., Berger SJ, Anderson GA, Smith RD., High-efficiency capillary isoelectric focusing of peptides, Anal Chem., 2000, 72: 2154-9. 44. Shimura K., Wang Z, Matsumoto H, Kasai K., Synthetic oligopeptides as isoelectric point markers for capillary isoelectric focusing with ultraviolet absorption detection, Electrophoresis, 2000, 21: 603-10. 45. Sugano M., Hidaka H, Yamauchi K, Nakabayashi T, Higuchi Y, Fujita K, Okumura N, Ushiyama Y, Tozuka M, Katsuyama T., Analysis of hemoglobin and globin chain variants by a commonly used capillary isoelectric focusing method, Electrophoresis, 2000, 21: 3016-9. 46. Kilár, F., Recent applications of capillary isoelectric focusing, Electrophoresis 2003,24: 3908-3916.

71

47. Buzinkaiova T., Polonsky J., Skacani I., Determination of fendiline and gallopamil bycapillary isotachophoresis, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 2001, 757: 215-20. 48. Sadecka J., Cakrt M., Hercegova A., Polonsky J., Skacani I., Determination of ibuprofen and naproxen in tablets, J Pharm Biomed Anal., 2001, 25: 881-91. 49. Kalász Huba, Lengyel József: A gyógyszerek szervezetbeni sorsa és vizsgáló módszerei,:14. fejezet Kapilláris elektroforézis írta: Szökő Éva ;Budapest 2004 50. Nishi H., Capillary electrophoresis of drugs: current status in the analysis of pharmaceuticals, Electrophoresis, 1999, 20: 3237-58. 51. Krull I.S., Sebag A, Stevenson R, Specific applications of capillary electrochromatography to biopolymers, including proteins, nucleic acids, peptide mapping, antibodies, and so forth, J Chromatogr A., 2000, 887: 137-63. 52. Walhagen K, Unger KK, Hearn MT., Capillary electrochromatography analysis of hormonal cyclic and linear peptides, Anal Chem., 2001, 73: 4924-36. 53. Chankvetadze B., Kartozia I, Breitkreutz J, Okamoto Y, Blaschke G., Effect of organicsolvent, electrolyte salt and a loading of cellulose tris (3,5dichlorophenyl-carbamate) on silica gel on enantioseparation characteristics in capillary electrochromatography, Electrophoresis, 2001, 22: 3327-34. 54. Fanali S., Catarcini P, Blaschke G, Chankvetadze B., Enantioseparations by capillary electrochromatography, Electrophoresis, 2001, 22: 3131-51. 55. Ding J., Vouros P., Capillary electrochromatography-mass spectometry for the separation and identification of isomeric polyaromatic DNA adducts derived from in vitro reactions, J. Chromatogr. A., 2000, 887: 103-13. 56. Ahuja ES, Preston BP, Foley JP., Anionic-zwitterionic mixed micelles in micellar electrokinetic chromatography: sodium dodecyl sulfate-N-dodecylN,N-dimethylammonium- 3-propane-1-sulfonic acid, J Chromatogr B Biomed Appl., 1994, 657: 271-84. 57. Furtos-Matei A, Li J, Waldron KC., Micellar electrokinetic chromatographic study of the interaction between enkephalin peptide analogs and charged micelles, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 1997, 695: 39-47. 58. Kim KR, La S, Kim A, Kim JH, Liebich HM., Capillary electrophoretic profiling and pattern recognition analysis of urinary nucleosides from uterine

72

myoma and cervical cancer patients, J Chromatogr B Biomed Sci Appl.., 2001, 754: 97-106. 59. Lucas C., Gliddon MJ., Safarpour MM., Cardaciotto S., Ahuja ES., Foley JP., Determination of avoparcin in animal formulations by capillary electrophoresis, J Capillary Electrophor., 1999, 6: 75-83. 60. Taga A., Suzuki S., Honda S., Capillary electrophoretic analysis of carbohydrates derivatized by in-capillary condensation with 1-phenyl-3-methyl5-pyrazolone, J Chromatogr A., 2001, 911: 259-67. 61. Collet J, Tribet C, Gareil P., Use of neutral surfactants for the capillary electrophoretic separation of hydrophobically modified poly(acrylic acids), Electrophoresis, 1996, 17: 1202-9. 62. Herrero-Martinez JM, Fernandez-Marti M, Simo-Alfonso E, Ramis-Ramos G., Determination

of

alkylphenol

ethoxylates

by

micellar

electrokinetic

chromatography with bile salts, Electrophoresis, 2001, 22: 526-34. 63. Zhao J, Yang G, Duan H, Li J., Determination of synthesized alpha-vitamin E by micellar electrokinetic chromatography, Electrophoresis, 2001, 22: 151-4. 64. Kang JW, De Reymaeker G, Van Schepdael A, Roets E, Hoogmartens J., Analysis of bacitracin by micellar electrokinetic capillary chromatography with mixed micelle in acidic solution, Electrophoresis., 2001, 22: 1356-62. 65. Idei M., Kiss É., Kéri Gy., Calculation of modified capacity factor in micellar electrokinetic chromatography, Electrophoresis, 1996, 17: 762-5. 66. Nishi H., Terabe S. Micellar electrokinetic chromatography:Perspectives in drug analysis J. Chromatogr A, 1996, 735: 3-27. 67. Camilleri

P.,

Chiral

surfactants

in

micellar

electrokinetic

capillary

chromatography, Electrophoresis, 1997, 18: 2322-30. 68. Liu Z, Zou H, Ye M, Ni J, Zhang Y., Effects of organic modifiers on retention mechanism and selectivity in micellar electrokinetic capillary chromatography studied by linear solvation energy relationships, J Chromatogr A., 1999, 863: 69-79. 69. Zhao S., Liu YM., Quantification of D/L-aspartic acids in Aplysia californica central nervous system by beta-cyclodextrin modified micellar electrokinetic chromatography, Biomed Chromatogr. 2001, 15: 274-9.

73

70. Bendahl L., Hansen SH, Gammelgaard B., Capillaries modified by noncovalent anionic polymer adsorption for capillary zone electrophoresis, micellar electrokinetic capillary chromatography and capillary electrophoresis mass spectrometry, Electrophoresis, 2001, 22: 2565-73. 71. Kim JB., , Otsuka K, Terabe S., On-line sample concentration in micellar electrokinetic chromatography with cationic micelles in a coated capillary, J Chromatogr A., 2001, 912: 343-52. 72. Ibrahim WAW, Hermawan D, Hasan MN, Rapid estimation of octanol-water partition coefficient for triazole fungicides by MEKC with sodium deoxycholate as surfactant: Chromatographia 2008, 68 : 5-6: 415-419. 73. Garcia-Ruiz, C., Garcia MA., Marina ML., Separation of a group of Nphenylpyrazole

derivatives

by

micellar

electrokinetic

chromatography:

application to the determination of solute-micelle association constants and estimation of the hydrophobicity, Electrophoresis, 2000 , 21: 2424-31. 74. Hansch, C., Fujita, T., p-σ-π Analysis. A Method for the Correlation of Biological Activity and Chemical Structure, J. Am. Chem. Soc., 1964, 86: 1616. 75. Leo, A. J., Hansch, C., Elkins, D., Partition coefficients and their uses, Chem. Rev., 1971, 7: 525. 76. Wu Y, Xie J, Wang F, Separation of small molecular peptides with same amino acid composition but different sequences by capillary electrophoresis .J. Sep. Science 2009, 32: 437-440. 77. Ladarola P, Ferrari F, Furnagalli M, Determination of amino acids by micellar EKC: Recent advances in method development and novel applications to different matrices Electrophoresis: 2008, 29: 224-236. 78. Lamb DH, Summa L, Lei QP, Duval G, Adam O., Determination of free carrier protein in protein-polysaccharide conjugate vaccines by micellar electrokinetic chromatography, J Chromatogr A., 2000, 894: 311-8. 79. Zhao J, Yang G, Duan H, Li J., Determination of synthesized alpha-vitamin E by micellar electrokinetic chromatography, Electrophoresis, 2001, 22: 151-4, 80. Preinerstorfer B, Lammerhofer M, Lindner W., Advances in enantioselective separations using electromigration capillary techniques Electrophoresis: 2009, 30: 100-132.

74

81. Ruta J, Perrier S, Ravelet C, Aptamer-Modified Micellar Electrokinetic Chromatography for the Enantioseparation of Nucleotides: Anal. Chem.: 2009, 81: 1169-1176. 82. Inagaki S, Esaka Y, Sako M, Goto M, Analysis of DNA adducts bases by capillary electrophoresis with amperometric detection, Electrophoresis: 2001, 22: 3408-3412 . 83. James P. Landers: Handbook of capillary electrophoresis:Chapter 2: Micellar electrokinetic chromatography by Jeffrey R Mazzeo 1997 CRC Press Int. 84. Muijselaar, P. G., J. Chromatogr. A 1997, 780, 117–127. 85. Roses, M., Rafols, C., Bosch, E., Martinez, A. M., Abraham,M. H., J. Chromatogr. A 1999, 845, 217–226. 86. Molero-Monfort, M., Martin-Biosca, Y., Sagrado, S., Villanueve- Camanas, R. M., Medina-Hernández, M. J., J. Chromatogr. A 2000, 870, 1–11. 87. James P. Landers: Handbook of capillary and microchip electrophoresis and associated microtechniques, Chatpter 3.4.1: p120, CRC Press Int. 88. Zs. Dobos, É. Kiss, B. Hallgas, Gy. Kéri, M. Idei: Micellar proportion: A parameter to compare the hydrophobicity of the pseudostationary phases or that of the analytes in micellar electrokinetic chromatography, Electrophoresis 2005, 26: 849-857. 89. Sándi Á., Szepesy L., Characterization of various reversed-phase columns using the linear free energy relationship: II. Evaluation of selectivity Journal of Chromatography A, 1998, 818, 19-30. 90. Karger, B. L., Snyder, L. R., Horváth, C., An Introduction to Separation Science, Wiley and Sons, New York 1973, 55. 91. Idei, M., Hollósy, F., Kiss, É., Tamás, B., Örfi, L., Seprödi, J.,Mészáros, G., Kéri, G., 25. Int. Symp. On High Performance Liquid Phase Separations, Maastricht, 2001, p. 123. 92. Yang, S., Khaledi, M. G., Chemical selectivity in micellar electrokinetic chromatography: characterization of solute-micelle interactions for classification of surfactants. Anal. Chem. 1995, 67, 499–508.

75

Saját közlemények

Az értekezés témájában megjelent közlemények Zs. Dobos, É. Kiss, B. Hallgas, Gy. Kéri, M. Idei: Micellar proportion: A parameter to

compare the hydrophobicity of the pseudostationary phases or that of the analytes in micellar electrokinetic chromatography, Electrophoresis 2005, 26, 849-857 A. Varga, M. Huszár, Zs. Dobos. É. Kiss, A. Horváth, M. Idei: Characterisation of mixed lithium dodecylsulphate / lithium perfluorooctanesulphonate pseudo-stationary phases in MEKC Electrophoresis 2009, 30, 1923–1928

Egyéb közlemények

M. Idei, É. Kiss, Zs. Dobos, B. Hallgas, Gy. Mészáros, F. Hollósy, Gy. Kéri,: Separation of anti-tumour peptides by capillary electrophoresis in organic solvent containing background electrolites, Electrophoresis 2003. pp. 829-833 B. Hallgas, T. Patonay, A. Kiss-Szikszai, Zs. Dobos, F. Hollósy, D. Erős, L. Őrfi, Gy. Kéri, M. Idei: Comparison of measured and calculated lipophilicity of substituted aurones and related compounds, Journal of Chromatography B, 2004 Volume 801, pp 229-235. Zs. Dobos, T. Lóránd, F. Hollósy, B. Hallgas, D. Erős, Gy. Mészáros, Gy. Kéri,M. Idei:

Determination of the basicity of Mannich ketones by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography B 2004 Volume 799, pp 179-183.

B. Hallgas, Zs. Dobos, E. Ősz, F. Hollósy, R.E. Schwab, E.Z. Szabó, D. Erős, M. Idei, Gy. Kéri and T. Lóránd: Characterization of lipophilicity and antiproliferative activity of

E-2-arylmethylene-1-tetralones

and

their

Chromatography B, 2005 Volume 819, pp 283-291

76

heteroanalogues,

Journal

of

B., Zs. Dobos, A. Agócs, M. Idei, Gy. Kéri, T. Loránd, Gy. Mészáros: Lipophilicity and antiproliferative

activity

profiling

of

2-benzylidencycloalkanones

Journal

Chromatography B, Volume 856, Issues 1-2, 1 September 2007, Pages 148-155

77

of

Köszönetnyilvánítás

Köszönetemet kívánom kifejezni: Dr. Idei Miklósnak témavezetőmnek, aki megismertetett a kapilláris elektroforézis módszerrel és értékes szakmai tanácsaival segítette kutatómunkámat, szakmai fejlődésemet. Prof. Dr. Kéri Györgynek az SE Peptidbiokémiai Kutatócsoport vezetőjének, hogy tudományos pályafutásomat figyelemmel kísérte, tanácsaival segítette. Prof. Dr. Mandl Józsefnek a SE Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai

Intézet

igazgatójának,

hogy

lehetőséget

adott

intézetében

kutatómunkám elvégzéséhez. Munkatársaimnak, az MTA Pathobiokémiai Kutatócsoport tagjainak, Dr. Horváth Anikónak, Dr. Vántus Tibornak, Huszár Mónikának, Hallgas Balázsnak, Varga Andrásnak, Tanai Henriettenek, Zdravicsné Szabó Editnek, Bökönyi Györgyinek és Tóvári Emőkének szakmai és emberi segítőkészségükért. A SE Kooperációs Kutató Központnak, hogy 3 éven keresztül ösztöndíjjal támogatták tanulmányaimat. Külön köszönettel tartozom még férjemnek, szüleimnek és barátaimnak a bíztató szavakért, támogatásért és sok segítségért, amelyek nélkül ez a dolgozat nem készülhetett volna el. És köszönöm kisfiamnak, Bercinek, aki türelemmel viselte, míg anya dolgozott.

78