Microbial Biotechnology BIO-512 (ATW) • Plant Growth Promoting Rhizobacteria o Symbiotic PGPR (Rhizobia) o Non-symbiotic PGPR • Microbial Insecticide (Bt) • Genetic Engineering of Plant • Therapeutic Agent and Vaccin • Molecular Diagnosis • Assignment (8-10 pages)
Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR): Rhizobia
Dr. Aris Tri Wahyudi
Department of Biology FMIPA Bogor Agricultural University
Biological N2-Fixation ~Approximately 80 % is free N2 ~It can not be used by microbes, directly ~It must be converted to N2-fixed: Nitrogen Fixation ~Microbe : Symbiotic; Non-Symbiotic ~Enzyme: Nitrogenase ~Biofertilizer
Biological Nitrogen Fixation
N2 (~80 %)
Air
N2 Fixation
NH3
Non-Symbiotic
Symbiotic
N-Compound Amino Acid
Cell Activity To Plant
Carbohydrate
Root Nodule Bacterium : N2 Fixation
Nitrogen Fixation N2+8H++8e-+16MgATP
2NH3+H2+16 MgADP+16Pi
Nitrogenase
Symbiotic: Bradyrhizobium, Rhizobium, Azorhizobium, etc Non-symbiotic: Azospirillum, Azotobacter, etc
Symbiotic N2 Fixing Bacteria: (Form Root Nodule)
1. Azorhizobium 2. Bradyrhizobium 3. Rhizobium Azorhizobium : Form root nodule and stem nodule Stem Nodule : Sesbania rostrata
RHIZOBIA
Metabolism and Translocation Hasil fiksasi N2 yaitu NH3, diekskresikan sel Rhizobium atau Bradyrhizobium masuk ke bintil (nodul) NH3 dlm bintil diproses menjadi : Tropik Temperate glutamin 11% 9% Asparagin 81% 88% ureide Asam amino 8% 3% ditranslokasikan ke tanaman bagian atas lewat xylem. Bakteri bintil akar memperoleh sumber energi (karbohidrat) dari hasil fotosintesis tanaman (fotosintat) dari tanaman bagian atas ke akar lewat phloem.
Sesbania rostrata
Rhizobium Tumbuh cepat (3-5 hari) diatas YMA, 2-4 mm diameter Menghasilkan asam DNA : 59-64% G+C Membentuk bintil pada pepolongan subtropis Waktu generasi ~ 4 jam
Bradyrhizobium Tumbuh lambat (5-7 hari) di atas YMA, diameter < sama dgn 1 mm Menghasilkan basa DNA : 61-65% G+C Membentuk bintil pada pepolongan tropis Waktu generasi ~ > 8jam
Bradyrhizobium japonicum Bacterial root nodule of soybean Gram negative Fix N2 molecular Slow growing Potential strain : inoculant
Bradyrhizobium japonicum Strains
Fig. Root Nodule Formation of Siratro by Bradyrhizobium japonicum
Fig. Physical map of the complete sequence of Bradyrhizobium japonicum USDA110
Nitrogen (N2) Fixation Nitrogenase: 1. Komponen I : Mo-Fe-protein = dinitrogenase 2. Komponen II : Fe-protein = dinitrogenase reduktase Nitrogenase dikontrol oleh gen nif K. pneumoniae : > 20 gen nif teridentifikasi Gen-gen nif H D K nif H-----sintesis dinitrogenase reduktase nif D, nif K------sintesis dinitrogenase Nitrogenase sensitif terhadap oksigen (O2) Bakteri aerob : punya mekanisme khusus untuk mempertahankan O2 intraseluler tetap rendah Bakteri anaerobik fakultatif : Fiksasi N2 pada ada O2 atau tanpa O2 Bakteri anaerob : tanpa O2
Gen-gen nif pertama kali dipelajari pada K. pneumoniae ~dekat dengan E. coli ~model yang paling baik Fe-protein : terdiri dari 2 unit (dimer) disandikan oleh gen nifH 60 kDa Mo-Fe protein : tdr 4 subunit (tetradimer) : nifDK Gen-gen nif terletak pada plasmid (Rhizobium) dan pada kromosom (Bradyrhizobium) Penyusunan gen-gen nif sangat bervariasi : R. meliloti : nif HDK berdampingan B. japonicum : nif H terpisah dari nif DK+ 17 kb nif E, N, S, B terletak diantaranya K. pneumoniae: nif HDK berdampingan Ekspresi gen nif dipengaruhi oleh faktor lingkungan: NH3 dan O2 berlebih menghambat aktivitas nitrogenase
Structure of Symbiotic Genes in Bradyrhizobium japonicum
nodVW
nifDKE N X
nifS nifB fixA
Cluster II
Nod-2
70 kb
? Cluster I
Lokus III II
nifH fixBCX
I nolA nodD D1
nodYABCSUIJ
Orf123 nodZ fixR nifA fixA
Biological Nitrogen Fixation : Klebsiella pneunoniae
Klebsiella pneumoniae
Nitrogenase Complex Two protein components: nitrogenase reductase and nitrogenase
Nitrogenase reductase is a 60 kDa homodimer with a single 4Fe-4S cluster Very oxygen-sensitive Binds MgATP 4ATP required per pair of electrons transferred Reduction of N2 to 2NH3 + H2 requires 4 pairs of electrons, so 16 ATP are consumed per N2
Why should nitrogenase need ATP?
N2 reduction to ammonia is thermodynamically favorable However, the activation barrier for breaking the N-N triple bond is enormous 16 ATP provide the needed activation energy
NitrogenaseFunction
Symbiotic Genes in Bradyrhizobium
Gene nifA nifH
nifDK
nifB nifE
Species B. japonicum B. sp (Parasponia) B. japonicum B. sp (cowpea) B. sp (Parasponia) B. japonicum B. sp (cowpea) B. sp (Parasponia) B. japonicum B. sp (Parasponia) B. japonicum B. sp (Parasponia)
function transcriptional regulator of nif & fix expression structural gene for dinitrogenase reductase structural genes for dinitrogenase Fe MoCo synthesis Fe MoCo synthesis
Symbiotic Genes in Bradyrhizobium (Continued)
Gen nifN nifS fixA fixBC
Species
fixIJ
B. japonicum B. japonicum B. japonicum B. sp (Parasponia) B. japonicum
fixR
B. japonicum
Function Fe Moco synthesis Maturation of nitrogenase Electron transport to nitrogenase Electron transport to nitrogenase Sequence similarity to family of two-component regulatory proteins Function unknown : sequence similarity to dehydrogenases
Hydrogen Uptake (HUP) Penambatan N2 NH3, selalu dibebaskan H2 Gen hup+ (hidrogen uptake) menyandikan : hidrogenase, meningkatkan fiksasi N2 simbiotik
Beberapa Alasan : 1. Oksidasi H2, memungkinkan pengambilan kembali ATP yang digunakan oleh nitrogenase 2. Oksidasi H2 mengurangi resiko penghambatan nitrogenase oleh H2 3. Penggunaan O2 untuk mengoksidasi H2 dapat melindungi nitrogenase terhadap O2. nitrogenase sensitif thd O2.
Hidrogenase
Energi
ATP Generation
ATP
Electron Carrier
Komplek Nitrogenase N2
H+
ADP
H2
Bradyrhizobium japonicum: hup+ and hupRhizobium leguminosarum
2NH3
Nodulation A. Tahap-tahap pembentukan bintil akar 1. Pengenalan thd pasangan yg benar pd tanaman dan pelekatan bakteri ke rambut akar 2. Penyerbuan rambut akar oleh bakteri melalui pembentukan benang infeksi (infection threat) 3. Perjalanan bakteri ke akar utama lewat benang infeksi 4. Pembentukan bakteroid dlm sel tanaman 5. Pembelahan sel tanaman dan bakteri yg terus menerus, menghasilkan bintil akar dewasa
Akar tanaman pepolongan mengeluarkan bahan organik untuk menarik mikroorganisme di sekitar perakaran (termasuk BBA) Pelekatan BBA dgn akar pepolongan tergantung dari makromolekul pd permukaan rambut akar yg berinteraksi dgn polisakarida BBA makromolekul : lektin polisakarida : 2-deoksiglukosa (R. trifolii) Rambut akar selanjutnya melengkung, lalu bakteri masuk membentuk benang infeksi. Sel-sel akar yg berdekatan menjadi terinfeksi BBA Sel yg terinfeksi, terangsang membelah (Sitokinin). Bakteri dlm sel tanaman membelah, berganda, menggembung membentuk sel yg tdk beraturan dan bercabang : bakteroid Dikelilingi membran sel tanaman (peribacteroid membrane) fiksasi nitrogen mulai terjadi
Root Nodule Formation 1. Pengenalan thd pasangan dan pelekatan bakteri ke rambut akar 2. Ekskresi nod faktor yang menyebabkan pelengkungan rambut-rambut akar 3. Penyerbuan rambut akar oleh bakteri dan pembentukan benang infeksi (infection threat) 4. Perjalanan bakteri ke akar utama 5. Pembentukan bakteroid dlm sel tanaman 6. Pembelahan sel tanaman dan bakteri yg terus menerus, menghasilkan bintil akar dewasa
Nodulation Tanaman Pea Bean Clover Alfalfa Soybean Siratro Lupinus Parasponia
Dinodulasi R. leguminosarum R. phaseoli R. trifolii R. meliloti B. japonicum B. japonicum B. lupini B. parasponiae
Kec Tumbuh cepat cepat cepat cepat lambat lambat lambat lambat
B. Pembentukan bintil akar : nodulasi 1. Sintesis polisakarida - B-1,2 glukan EPS ------ proses infeksi - Eksopolisakarida (EPS) ----- perkembangan nodul - Lipopolisakarida (LPS) ----- pembentukan nodul Mempunyai peranan penting utk nodulasi R. meliloti mutan (B-1,2 glukan) dpt membentuk bintil tapi tdk berisi bakteri (pseudonodul) -Mutan Rhizobium EPS : tidak mampu membentuk nodul Mampu membentuk nodul, tapi tdk mampu menambat N2 -Efek mutasi, bergantung pada inang -R. leguminosarum bv. phaseoli (EPS) : bintil normal -R. leguminosarum bv. viciae (EPS) : tdk membentuk bintil -Mutan R. leguminosarum bv. phaseoli (LPS) : mampu membentuk bintil akar, tapi tdk menambat N2
2. Gen-gen untuk nodulasi (nod) -Banyak dipelajari pd R. meliloti, R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. viciae -Pada plasmid pSym : gen-gen nod berada pd fragmen 20 kb Transfer pSym ke spesies lain (resipien), resipien mampu membentuk bintil penambat N2 -Transfer pSym ke Agrobacterium menyebabkan nodul abnormal, fix -Plasmid pSym pRL1JI dari R. leguminosarum bv. viciae -Dua kelompok gen nod : nod ABCIJ : nod umum nod EFGH : penentu spektrum inang nod D : nod regulator = juga penentu inang
Nodulation Genes in Bradyrhizobium
Gene nodABC nodD1 nodD2 nodI nodJ nodK
Species B. japonicum B. sp (Parasponia) B. japonicum B. sp (Parasponia) B. japonicum B. sp (Parasponia) B. japonicum B. sp (Parasponia) B. japonicum B. sp (Parasponia) B. sp. (Parasponia)
function Synthesis of essential factor for hair curling & cell div. Positive transcriptional regulation for gene expression Unknown function: mutation caused nodUnknown function: ATP dependent transport protein Unknown function: Membrane location Unknown function
Nadulation Genes in Bradyrhizobium (Continued)
Gene nodLMN nodSU nodV nodW nodY nodZ
Species B. sp (Parasponia) B. japonicum B. japonicum B. japonicum B. japonicum B. japonicum
Function Host range determination Unknown function Host range determination Transcriptional regulation Unknown function Genotype specific noduation
Structure of Nodulation Genes
R. leguminosarum
Model for Regulation of B. japonicum Nodulation Genes nodA nodY
nodD1 nodD1-box
nodY-box
Isoflavon
NodD1 Protein
DNA
Structure of nod Genes of R. leguminosarum bv. viciae Sym Plasmid pRL1JI
Aktivasi
nodM
nodL
nodE nodF
nodD
Represi
nodA nodB nodC nodI
nodJ
3. Regulasi ekspresi gen nod a. R. leguminosarum bv. viciae nod ABCIJ, nod FE, dan nod D ditumbuhkan pada media penumbuhan yang normal ----- hanya nod D yg ditranskripsi Jika eksudat akar (pea) ditambahkan pd media, nodFE dan nod ABCIJ aktif terekspresi, berarti eksudat akar tanaman inang dan gen nod D diperlukan untuk mengaktivasi operon nod. b. Flavonoid merupakan suatu inducer Flavon luteolin, menginduksi ekspresi gen nod R. meliloti 7,4-dihidroksi flavon, menginduksi ekspresi gen nod R. meliloti flavon dan flavanon mengaktivasi gen nod R. leguminosarum bv. viciae.
Biotechnological Application Biofertilizer Produksi inokulan untuk Tanaman Legum Inokulan pada Tanah Marginal & Netral Bioremediasi: Bioakumulasi Logam Berat
