Méretkizárásos módszer a szintetikus polimerek elválasztásában és a biopolimereknél

Méretkizárásos módszer a szintetikus polimerek elválasztásában és a biopolimereknél I. Szerves oldószerű méretkizárásos kromatográfia (polimerek elválasztása méret szerint) A GPC-ben (gélpermeációs kromatográfia) a fázisok szorpciós aktivitását és az ebből következő anyagátadást a fázisok között egyrészt a makromolekula diffúziós mozgékonysága határozza meg, másrészt a mérete a pórusokhoz képest. A GPC-vel megállapítható így a makromolekulák mérete, molekulatömege, diffúziós együtthatója, valamint néhány szerkezeti sajátság, például a polimer elágazósága, a kopolimerek méretének függése az összetételüktől

és

a

molekulatömegüktől,

meghatározható

az

izomerek

száma,

asszociátumok és komplexek jelenléte polimerkeverékekben, illetve az ezekhez tartozó egyensúlyi állandók. Állófázisok Polimerek elválasztására a következő állófázis-töltetek ismertek: makropórusos polimer, makropórusos szilika, makroretikuláris keresztkötött duzzasztott polimer-gél. Általános megfontolások: 1. a pórusok átmérője legyen összemérhető a vizsgált molekulák méretével. Ez elengedhetetlen a méret szerinti elválasztáshoz. 2. fontos cél, hogy a pórusméret-eloszlás olyan legyen, ami lineáris összefüggést ad kalibrációkor a retenciós térfogat és a molekulatömeg logaritmusa között.

A: teljes kizárás B:teljes áteresztés

3. legyen

1

különlegesen nagy a fajlagos pórustérfogata a töltetnek, az elválasztás nagy hatékonysága miatt fontos 4. a töltet anyagátadási ellenállása legyen minimális, a töltet szemcséibe minél könnyebben jusson be diffúzióval a makromolekula 5. az oszloptöltés hatékonyságának és a hidrodinamikai ellenállás csökkentésének érdekében a a töltet-részecskék alakja legyen gömbszerű, és a szemcseméreteloszlás legyen minél keskenyebb sávban. Ha ez teljesül, a kolonna hatékonysága jelentősen megnő. 6. „rigid” töltet esetén legyen jó a nedvesíthetőség, gél-töltet esetén pedig a duzzadóképesség a használt oldószerben 7. a töltet ne mutasson adszorpciós kölcsönhatást a vizsgált makromolekulákkal. Erre a következő szabály érvényes: poláris makromolekulákat poláris tölteten, poláris oldószerben, míg apoláris molekuákat apoláris állófázison, apoláris oldószerben választunk el. Általánosságban, olyan oldószert célszerű választani, amely nem kevésbé poláris, mint a vizsgált makromolekula egységei. Ebben az esetben monomolekuláris réteg alakulhat ki, ami gátolja az adszorpciót (bár enyhén csökkenti a pórus méretét). 8. a töltet legyen mechanikailag és kémiailag stabil, legyen hőálló.

Állófázis-töltetek: a) xerogel b) porózus üveg (aerogel) c) szilikagél (aerogel) d) szerves makropórusos töltet (aerogel-xerogel hibrid) e) agarose (aerogel-xerogel hibrid)

2

Gél alapú állófázisok („soft”):  xerogélek  a polimerláncokat szolvatáló oldószerekben (erősen poláris szerves o.sz., illetve vízben és vizes pufferben is lehet használni őket) nagy mértékben megduzzadnak  az oldószer eltávolítása után a duzzadt állapotban létező xerogél-hálózat összeesik, így száraz állapotban nem tartalmaz pórusokat  szemcseátmérő: 20-100 µm (duzzadt állapotban)  adszorpciós aktivitása nincs  gömb alakú töltet-részecskék  pkrit < 1 MPa  kémiai- és hőstabilitása kicsi

Szervetlen állófázisok („rigid”):  ide tartozik a szilikagél és a makropórusos üveg (MPG) mint állófázis  kémiailag ellenállók, és magas hőmérsékleten is használhatók, nagy nyomásállóság jellemzi őket  jó pórusméret-eloszlás érhető el  dp = 5 – 10 µm  szilikagél esetén

gömbszimmetrikus, makropórusos üvegnél szabálytalan

a

szemcsealak  jól nedvesíthető töltetek  a pórusméret nem változik meg az oldószerváltáskor  adszorpciós aktivitás kiküszöbölésére módosítani kell a felületét (MPG esetén lúgos kezelés)  MPG esetén nagyfokú szabályosság figyelhető meg a pórusszerkezetben  MPG állófázisok szemcseméret-eloszlása szűkebb a szilikagélénél  pkrit > 100 MPa

3

makropórusos üveg Szerves polimer állófázisok („semi-rigid”):  az egyik legfontosabb a sztirol-divinilbenzol kopolimer mint állófázis  a styragelek jó nedvesíthetőséget és részleges duzzadást mutatnak kloroformban, metilén-kloridban, THF-ben, toluolban, benzolban. Jól használhatók többek között a következő anyagok vizsgálatában: nemionos felületaktív anyagok, polibutadién, poliizobutilén,

poliizoprén,

poliakrilát,

gyanták,

poliamidok,

poliészterek,

poliuretánok, gumik, neoprén, polisztirol, PVC.  dp = 10 – 30 µm  gömbszimmetrikus szemcsék  a nem módosított felületű szemcséknek esetleg lehet adszorpciós aktivitása  pkrit ~ 20 MPa

4

Mozgófázisok Általános követelmények: a mozgófázis oldja a vizsgált molekulát, nedvesítse az állófázist. Előnyös tulajdonságok még: kis visz kozitású, nem gyúlékony, kicsi a toxicitása, a detektálást lehetővé teszi. A legfontosabb mozgófázisok: THF; 1,2,4 - triklórbenzol; o-diklórbenzol; toluol; N,N’ - DMF; metilén-klorid; etilén-diklorid ; kloroform; m-krezol; benzol; DMSO; perklór-etilén; o-klórfenol; CCl4. A polimerek elválasztásában a THF univerzálisnak tekinthető oldószer, de néhány anyagot nem old: ABS, poliamid, poliakrilnitril, polietilén-oxid, PE, PP, szilikonok, poliizoprén, polikloroprén. Az első négy DMF-ben, az utolsó három toluolban vizsgálható. Szilikát (szilikagél vagy üveg) állófázis esetén polárisabb mozgófázis szükséges, például THF vagy DMF, hogy a polimer adszorpciója gátolt legyen. Toluol alkalmazásakor pár százalék THF hozzáadása szükséges az adszorpció gátlására. Detektorok A polimerek méretkizárásos vizsgálatában használt detektorok:  Differenciális refraktométer Ez a leggyakoribb típus. Tömbdetektor, nem szelektív. A jel arányos a törésmutatóváltozással a tiszta mozgófázis és a mintát tartalmazó mozgófázis között.  UV-VIS Csak az UV-VIS-elnyelő komponensek vizsgálhatók így, illetve az oldószerek a 200 nm alatti detektálást nem teszik lehetővé.  IR Polimerek és részben kopolimerek esetén is használható, egészen 200 °C-ig. A detektorok celltérfogata 5-50 µL. Van olyan típus, amelyik folyamatos mérést tesz lehetővé 2.5 és 14.5 µm hullámhossz között, más típus fix hullámhosszakon mér, és van olyan is, amelyik csak a CH-vegyértékrezgés hullámhosszán (3.4 µm) mér.  Fluorimetriás detektor

5

Csak fluoreszcens-jelölt polimerek eseteén lehet használni, ilyen esetben viszont kiváló érzékenységű.  LALLS (Low Angle LASER Light Scattering) detektor Ezt a detektort egy koncentráció-érzékeny detektorral (RI, UV-VIS vagy IR) kiegészítve a molekulatömeg meghatározására és abszolút GPC-kalibráció elvégzésére szokták használni a méretkizárásos kromatográfiában. Előnyei: gázbuborékok és egyéb szennyezők minimális jelet adnak, nincs fluoreszcencia, nem destruktív, nincs fényabszorpció.  VD (részletes tárgyalás) A viszkozimetriás detektor egy koncentráció-érzékeny detektorral információt ad a molekulatömeg-eloszlásról. Ha a Benoit-féle univerzális kalibrációt alkalmazzuk, és az [η] valódi viszkozitása a polimernek ismert, a Kuhn – Mark – Houwink konstansok meghatározása után a molekulatömeg meghatározható. A detektor azon alapszik, hogy stabil áramlási körülmények között egy kapillárisban a nyomásesés arányos a viszkozitással. (Hagen – Poiseuille-törvény) ∆p = k*η,

ahol k = (8/π)*Fc*(l/r4)

Fc az áramlási sebesség, l a kapilláris hossza, r a sugara. Állandó (ún. Poiseuille-) körülmények között k konstans, és az alábbi arányosság áll fenn:

A koncentráció-detektorral együtt a valódi viszkozitás meghatározható:

Fontos a stabil áramlási viszonyok és az állandó hőmérséklet biztosítása. Polimerek molekulatömeg-eloszlása meghatározható ugyan, de biopolimerek esetében nem elégséges az érzékenysége.

6

viszkozimetriás detektor A: rozsdamentes acél bemenet külső nyomólemeze összekötő

B: kapillár-viszkoziméter

D: nyomólemez tartógyűrűje

F: nyomáscella-kamra

H: termosztát

C:

nyomáscella

E:

Swagelock-

G: nyomás-jelátalakító

J: termosztát O-gyűrű tömítés

Optimálás Egy kromatográfiás rendszer produktivitása:

Neff : az effektív tányérszám t: egységnyi idő u: a mozgófázis lineáris áramlási sebessége H: elméleti tányérmagasság k’: visszatartási tényező,

7

A produktivitásnak k’=2-nél optimuma van.

Szilikagél és üveg állófázis esetén

.

Gél állófázisnál A szelektivitás:

V1 és V2 a retenciós térfogatok, V0 a szemcsék közötti térfogat. A szelektivitás értéke 1-től (V1 = V2) változhat végtelenig (V1 = V0). A szelektivitás jellemezhet ő az ún. S paraméterrel is:

Egy adott felbontás megvalósítható kis hatékonysággal és nagy szelektivitással, vagy nagy hatékonysággal és kis szelektivitással:

8

Univerzális kalibráció GPC-ben Benoit és társai igazolták, hogy a retenciós térfogat (V R) függése a hidrodinamikai térfogattól arányos a molekulatömeg és a valódi viszkozitás szorzatával (M[η]). Továbbá, hogy minden adott polimer-oldószer párra a V M-től való függése kiszámítható a V vs. M[η] általános kalibrációból, amit univerzális kalibrációnak neveztek.

Forrás: Modern liquid chromatography of macromolecules – B.G. Belenkii és L.Z. Vilenchik

9

II. Vizes méretkizárásos kromatográfia Vizes méretkizárásos kromatográfiában használt állófázisok Az állófázisként használt vagy használható anyagok a következők:  gél képzésre alkalmas természetes polimerek: keményítő, agar, dextrán (1. ábra), cellulóz  porózus üveg  módosított szilikagélek  szintetikus polimerek: akrilát alapúak, poli(vinil-alkohol) gél, polisztirol és poliakrilamid alapúak

1. ábra: Az agaróz és a dextrán polimer szerkezete A természetes polimer alapú állófázisok használata viszonylag egyszerű, ám mechanikai terhelhetőségük kicsi, ezért csak alacsony nyomást és alacsony lineáris áramlási sebességet

alkalmazhatunk.

Előállításukkoráltalában

kisméretű

keresztkötő

molekulákat használnak – például epiklórhidrint,divinilszulfont (2. ábra) vagy 2,3dibrómpropanolt -, hogy növeljék a kapott anyag merevségét, és hogy stabilizálják a gél makroretikuláris (makropórusos1) szerkezetét. Ezek az anyagok a hagyományos SEC állófázisai: a csúcsok szélesebbek, kisebb hatékonyság és alacsonyabb felbontás érhető el velük.

2. ábra: Keresztkötő reagensek: epiklórhidrin és divinilszulfon

1

A IUPAC nómenklatúra a 200-500 Ǻ pórusokat mezopórusoknak, az 500Ǻ-nél nagyobb átmérőjű pórusokat makropórusnak nevezi. [1]

10

A porózus üveg olyan kovasav alapú anyag, melyben úgy hoznak létre pórusokat, hogy erős sav segítségével kioldják az üveg bórvegyületekben gazdag fázisát. Ez a technika nagyon egységes pórusméretet eredményez. Mivel a vizes SEC segítségével biopolimereket vizsgálunk, a hagyományos szilikagél nem tudna eleget tenni annak a követelménynek, hogy ne lépjen fel kölcsönhatás az állófázis és a kérdéses molekula között, ezért módosított szilikagéleket alkalmaznak. Ezek merevebbek (rigidebbek) – 1000 barig nagy mechanikai stabilitással bír, ezért ezek a nagy teljesítményű (HP-) SEC kolonnák töltetei - a természetes polimer alapú állófázisoknál. Az alkalmazhatóságnak a pH szab határt, általában 2-8 között stabil az állófázis. 2-es pH alatt a felületre szilanizálással felvitt csoportok hidrolízisének sebessége nő meg, míg 8-as pH felett a szilikagél alapját képező polikovasav oldódik fel. Mivel az elválasztást a pórusok mérete szabja meg, fontos ezek jellemzése, hiszen minél nagyobb a pórustérfogat, annál kisebb a munkagörbe meredeksége, így annál nagyobb a

szelektivitás.

Pásztázó

elektronmikroszkóp

által

(ScanningElectronMicroscopy=SEM) a pórusok szerkezete jól láthatóvá válik. Higany porozimetriával a pórusméret eloszlás adható meg, míg nitrogén gáz adszorpcióval a fajlagos felület mérhető. Vizes méretkizárásos kromatográfiában használt mozgófázisok Az eluens rendszer megválasztásánál két fontos szempontot kell figyelembe venni. Az első, hogy a mozgófázisnak meg kell akadályoznia a biopolimer és az állófázis között lehetséges ionos vagy hidrofób kölcsönhatás létrejöttét. A második, hogy a vizes SECkel vizsgált makromolekulák – főleg a fehérjék – szerkezete jelentős mértékben változhat az eluens minőségének köszönhetően, ugyanis az oldószer polaritása, a hozzáadott só koncentrációja, az ionerősség, módosító szer (detergens) jelenléte és a pH nagyban befolyásolja a molekulák konformációját. A fehérjék szerkezete kb. 5-8 közötti pH értéken stabil. Ennek biztosítására puffereket használunk. A leggyakrabban használt ún. nem denaturáló puffer a TRIS – trisz(hidroximetil)aminometán (3. ábra) - és a különböző foszfátok. Az előbbi pKa értéke 8 körül van, így maximális pufferkapacitása pH=8,3±1, míg a foszfátoknak 7,2±1. A hagyományos SEC-ben mindegyik alkalmazható, a nagy teljesítményű SECben használt szilikagél alapú állófázisok esetében azonban csak a foszfát pufferek. Bár ezek is a töltet tönkremenetelét eredményezik, a folyamat nem olyan gyors, mintha 8as vagy afölötti pH-n működtetnénk a kolonnát. A pufferek ionerősségét 0,1-0,5M 11

értékre kell beállítani. Ezzel kiküszöböljük a fehérje adszorpcióját az állófázison, illetve megszüntetjük a savas jellegű fehérjék ionkizáródásának lehetőségét.Módosító szerre a hidrofób kölcsönhatás eliminálása céljából van szükség. Erre példa a nem denaturáló nátrium-deoxikolát (3. ábra) és a denaturáló nátrium-dodecilszulfát (SDS) vagy a guanidin-hidroklorid (3. ábra). A fehérjék denaturációja a pontos molekulatömeg meghatározásánál jelent előnyt.

3. ábra: TRIS,Na-deoxikolát és guanidin-hidroklorid Vizes SEC alkalmazási területei, a vizsgált anyagok Elsősorban

a

bioanalitikában

alkalmazzák:

például

fehérjék

eltérő

tömegű

komponenseinek meghatározására, peptid keverékek, poli- és oligoszacharidok elválasztására, DNS fragmensek és nukleinsavak vizsgálatára. Olyan szintetikus polimerek jellemzésére is használható, melyek vízben oldódnak, például poli(vinilamin), poli(etilén-oxid), polietilénimin. A vizes SEC-ben használt detektorok Elterjedten alkalmazzák a SEC-LALLS (LowAngleLaserLightScattering = kis szögű lézer fényszórás detektor) technikát, s újabban az MS-sel való detektálást. E részben most csak

az

ELSD

(EvaporativeLightScatteringDetector)

működését

tárgyaljuk

részletesebben. Az elpárologtatással egybekötött fényszórás elvén működő detektor készülékének vázlatát mutatja a 4. ábra. Ennek az univerzális detektornak a működési elve a következő: a kolonnáról érkező folyadékot nagy sebességű nitrogén vagy hélium gáz segítségével porlasztjuk. Az aeroszol előállítása után az oldószereket fűtés hatására elpárologtatjuk, csak a nem illékony vizsgálandó részecskék maradnak vissza. Ezeket a kiülepedő anyagokat lézer vagy wolfram lámpával világítják meg, s mérik a részecske szemcséken létrejövő fényszórást. A szórt fényt fotométerrel érzékelik, mely a részecske méretével és koncentrációjával arányos. A mért jel és a koncentráció közti összefüggés nem lineáris, mely részint a polimerek méret szerinti eloszlásának 12

köszönhető. Nagy előnye (az RI detektorral szemben) a gradiens elúciós technika alkalmazhatósága.

4. ábra: ELSD készülék vázlata A vizes SEC-kel kapcsolatos problémák tárgyalása A hagyományos SEC mérések viszonylag lassúak, akár több tíz percet is igénybe vehetnek, ezért vizsgálni kell a gyors SEC alkalmazhatóságának lehetőségét. A mérés idejének csökkentésére alapvetően három lehetőségünk van:  A kolonna paramétereinek csökkentése: ekkor a kolonna kapacitása is csökken, ami előnyt jelenthet akkor, ha kevés minta áll rendelkezésünkre. A gyors SEC-ben alkalmazott kolonnák hossza változó, de belső átmérőjük rendszerint 4,6 mm.  A hőmérséklet emelése: a hőmérséklet felső határát a vizsgálandó anyagok szabják meg, maximum 40°C-ig emelhető, mert efelett a fehérjék koagulálódhatnak és/vagy denaturálódhatnak, vagyis tönkretehetik a kolonnát.  Az áramlási sebesség, térfogatáram növelése:Ez a kisebb molekulák esetében alig, a nagyobb makromolekuláknál azonban jelentősen megnövelheti a HETP-t, vagyis rontja a hatékonyságot. Ezért maximum 3 ml/min térfogatáramot alkalmaznak. A méretkizárásos kromatográfiában is fontos, hogy ne terheljük túl a kolonnát. Hogy megállapítsák, mekkora a maximálisan vizsgálható minta mennyisége, a HETP-t vizsgálták az injektált térfogat és a minta tömegének függvényében. Ezek olyan olyan görbéket adtak, melyeken egy küszöbértékig konstans HETP, de utána nagyon gyorsan kezd nőni. Ezek alapján legfeljebb 0,2 ml mintaoldatot injektálhatunk, s benne a minta tömege nem lehet nagyobb 1mg-nál.

Források: Dr. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata

13

Journal of chromatographylibrary – volume 40: Aqueoussize-exclusionchromatography, editedbyP.L.Dubin Az Analitikai kémia II és műszerezés című tárgy Fehérjeanalitika előadásainak anyaga: http://oktatas.ch.bme.hu/oktatas/konyvek/anal/MSc_AnalKem%28II+muszerezes%29_Gyogyszer anal/Feherje-analitika%201%20-%202012-FSz.pdf

14