Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Mária Majeská Čudejková 3. Proteosyntéza
Centrální dogma molekulární biologie
Rozluštění genetického kódu „in vitro“ • Marshall Nirenberg a Heinrich Matthaei zjistili, že poly-U RNA produkuje polyfenylalanin v „cell-free“ roztoku z E. coli
• Studie s nukleotidovými kopolymery, objasnily některé kodóny • Poly-A dává polylysin, poly-C polyprolin, poly-G polyglycin • V roce 1964 rozluštili Marshall Nirenberg a Philip Leder celý kód • Ukázali, že trinukleotidy navázané na ribosomy řídí vazbu specifických aminoacyl-tRNA
• Pomocí 14C značených aminokyselin se všemi možnými kombinacemi trinukleotidů přiřadili všech 64 kodónů
Technika rozluštění genetického kódu
Genetický kód je degenerovaný • 4 nukleotidy, 20 AMK (23 proteinogénních AMK) • 42 = 16 • 43 = 64 • Jedna aminokyselina může být specifikována víc než jedním kodonem
Univerzální genetický kód
Molekula tRNA •
Všechny tRNA mají délku cca 80 nukleotidů
http://www.bio.miami.edu/dana/250/250SS13_9.html
Aktivace aminokyselin pro proteosyntézu Aminoacyl-tRNA synthasa • Aminoacyl-tRNA aktivují aminokyselinu pro tvorbu peptidové vazby • Enzym aminoacyl-tRNA synthasy zajišťují správné přiřazení aminokyseliny k odpovídající tRNA • Kodóny jsou rozpoznávány aminoacyl-tRNA na základě komplementarity bazí • Párování bazí umožňuje tRNA vnést určitou aminokyselinu do ribosomu
Rozpoznávání tRNA specifickou aminoacyl-tRNA synthasou
•
u E. coli 21 aminoacyl-tRNA synthas
•
vysokoenergetická vazba mezi AMK a tRNA je později využita pro tvorbu kovalentní vazby mezi AMKs polypetidovýho řetězce
Komplex tRNA a aminoacyl-tRNA synthasy
„The Wobble Hypothesis“ – kolísavé párovaní bází (Francis Crick, 1966)
• První dvě báze kodónu tvoří normální „kanonické“ párování (vodíkové vazby A=U, G≡C) s 2 a 3 bazí antikodónu • Poslední pozice je méně striktně kontrolována a může se objevit i „nekanonické párování“
• Pravidla pro třetí bázi kodónu: A=U, C≡G, ale navíc U – A/G, G – U/C, I (vzniklý deaminací A) – U/C/A • Výhody: disociace tRNA z mRNA templátu je rychlejší a tím je rychlejší i proteosyntéza
• Pravidla jsou v souladu s genetickým kódem a nezpůsobují nesprávné přiřazení aminokyseliny !!!
Kolísavé párování bází pro G a I
Struktura ribosomů E. coli ribosom
• průměr 25 nm, 2520 kDa, 2 disociabilní podjednotky • Malá podjednotka 30S - 930 kDa, 21 proteinů a 16S rRNA • Velká podjednotka 50S - 1590 kDa, 34 proteinů, dvě rRNA - 23S a 5S • Ribosomy tvoří zhruba 2/3 RNA • 20,000 ribosomů na buňku, 20% buněčné hmoty Eukaryotní ribosomy • Mitochondriální a chloroplastové ribosomy podobné prokaryotním – předpokládaný prokaryotní původ • Cytoplasmatické ribosomy jsou větší a komplexnější, ale mají shodnou většinu strukturních a funkční vlastností
Prokaryotní a eukaryotní ribosomy
Proteosyntéza a její fáze • Proteosyntéza má vždy tři fáze: iniciaci, elongaci a terminaci • Iniciace spočívá ve vazbě mRNA a iniciační aminoacyl-tRNA na malou podjednotku ribosomu a následnou vazbu velké podjednotky • Elongace: probíhá syntéza peptidových vazeb mezi AMK, které jsou prostřednictvím tRNA navázané v akceptorovém místě (A) a peptidylovém místě (P) ribosomu
• Terminace nastává při dosažení "stop" kodónu – dochází k uvolnění peptidového řetězce a rozpadu translačního komplexu
Vazba tRNA na ribosom
Iniciace proteosyntézy u prokaryot • Iniciační tRNA přenáší N-formylovaný Met: f-Met-tRNAfMet
• Je použita pouze pro iniciaci, při elongaci působí Met-tRNAmMet (neformylovaný Met) • N-formyl Met je první aminokyselina u všech E. coli proteinů, ale zhruba u poloviny je posttranslačně odštěpen • N-formyl je přidán enzymem formyltransferasa • Iniciační tRNA je připojena k 30S za pomoci iniciačních faktorů a poté dochází k navázaní mRNA k 30S • Vazba mRNA na ribosom vyžaduje interakci pyrimidinové sekvence na 3'-konci 16S RNA s purinovou sekvencí na 5'-konci mRNA
• Vazebné místo ribosomu na 5'-konci mRNA – Shine-Delgarno sekvence
Iniciace proteosyntézy u prokaryot
Shine-Delgarno sequence
Iniciace u eukaryot
• Zásadním iniciačním signálem je struktura mRNA s 5'methyl-GTP a poly A koncem • Komplexní interakce iniciačních faktorů (nejméně 11) • Iniciační tRNA je specifická – přenáší Met a působí pouze při iniciaci - tRNAiMet , není formylována • Met nacházející se uvnitř peptidového řetězce je přenášen jinou tRNA
Iniciace proteosyntézy u eukaryot
Elongační cyklus • Elongační faktory jsou nezbytné pro funkci buňky, vysoký obsah (EF-Tu tvoří 5% celkových proteinů E. coli) • EF-Tu váže aminoacyl-tRNA a GTP • Aminoacyl-tRNA se váže do A místa ribosomu jako komplex s EF-Tu a GTP • GTP je pak hydrolyzováno a EF-Tu:GDP disociuje • EF-Ts recykluje EF-Tu výměnou GTP za GDP • Nezbytné konformační změny jsou řízeny energií získanou hydrolýzou GTP
Elongace
Terminace proteosyntézy
• Proteiny nazývané terminační faktory rozpoznávají stop kodón v A místě ribosomu • Vazba terminačního faktoru transformuje peptidyltransferasu na hydrolasu, která odštěpí peptidový řetězec z tRNA • Terminační faktor způsobuje rozpad elongačního komplexu
Terminace
Recyklace ribosomů v buňce
„Polyribosom“
Shrnutí Produkce proteinů eukaryotní buňkou
Skládání proteinů „Protein Folding“ • Proteiny jsou skládány do aktivní formy molekulárními chaperony a chaperoniny • Chaperony E. coli Hsp70, rozpoznávají nesložené hydrofobní části peptidového řetězce • Vážou se na tyto části a ochraňují je dokud nedojde ke správnému složení
• GroES-GroEL komplex – hlavní chaperonin u E. coli • GroEL 2 kruhy, každý 7 x 60 kDa podjednotek (Hsp60) • Nesložený protein se váže dovnitř komplexu a jeho skládání je řízeno energií získanou hydrolýzou ATP (stovky ATP/ molekulu)
Chaperony a chaperoniny
Struktura komplexu GroES-GroEL u E. coli
Degradace proteinů • Některé proteinové degradace jsou nespecifické, náhodně rozštěpené nebo poškozené proteiny jsou rychle degradovány
• Existuje ovšem také selektivní degradační dráha využívající energie ATP a hydrolýzy v proteasomu – ubiquitinová degradační dráha • Ubiquitin je malý protein s vysoce konzervovanou sekvencí v eukaryotech, 76 aminokyselin (8.5 kDa) • Proteiny určené k degradaci jsou označeny ubiquitinovým řetězcem • Aaron Ciechanover, Avram Hershko, Irwin Rose – Nobelova cena za chemii 2004
Značení proteinů ubiquitinem a jejich degradace v proteasomu
Příklad chyby při skládání proteinů – PrP a PrP* priony
Translokace proteinů Nutný proces pro membránové a sekreční proteiny • Tyto proteiny jsou syntetizovány se "signální sekvencí" cca 1626 aminokyselin na N-konci • Signální sekvence má bazický N-konec, centrální doménu 7-13 hydrofobních residuí a nehelikální C-konec • Signální sekvence směruje nově syntetizovaný protein do jeho správné destinace Všechny proteiny mimo cytoplasmu musí být translokovány • Signální sekvence zabraňuje samovolnému skládání proteinu, takže molekulární chaperony s ním mohou interagovat • Signální peptid slouží také pro rozpoznání translokačním aparátem buňky • Signální peptidasa odštěpí signální peptid poté co je zajištěno správné složení a cílení proteinu
Třídění proteinů v eukaryotní buňce Eukaryotní buňka obsahuje řadu kompartmentů oddělených membránami • Většina (ale ne všechny) signálních sekvencí je tvořena odštěpitelným signálním peptidem na N-konci proteinu • Některé sekvence jsou u C-konce nebo uvnitř proteinové sekvence (signální kotvy) • Rozpoznání signální sekvence je založeno na rozložení náboje, polaritě a sekundární struktuře, ne na specifické sekvenci aminokyselin • Syntéza sekrečních a membránových proteinů je spojena s translokací přes membránu endoplasmatického retikula
Translokace proteinů do endoplasmatického retikula
https://www.dnalc.org/view/15501-Translation-RNA-to-protein3D-animation-with-basic-narration.html http://vcell.ndsu.nodak.edu/animations/translation/movieflash.htm
http://highered.mheducation.com/sites/0072507470/student_vie w0/chapter3/animation__protein_synthesis__quiz_3_.html
http://vcell.ndsu.nodak.edu/animations/mito-pt/movie-flash.htm
