MBIOZ

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Ivo Frébort 5. Metody molekulární biologie II

DNA footprinting – hledání interakcí DNA s proteiny

Polymerázová řetězová reakce (Polymerase chain reaction – PCR) • Malé množství DNA slouží jako templát pro DNA polymerasu • DNA polymerasa z termofilního organismu (Thermus aquaticus – Taq polymerasa) • Komplementární primery, ve 1000 násobném přebytku • Opakovaný teplotní cyklus – termocykler – 95 oC – denaturace: ssDNA – 55-65 oC – navázání primerů (hybridizace) – 72 oC polymerace • Cyklus opakujeme 20-40 x, zmnožení cílového úseku DNA

Amplifikace DNA pomocí PCR

Použití PCR při klonování

Nadexprese proteinů

Afinitní značení proteinů

Značení proteinů v živých organismech pomocí GFP GFP z medůzy Aqueoria victoria

Trichomy Arabidopsis obsahující talin-GFP

Cílená mutageneze

Biochemistry místně 2/e - Garrett &cílená Grisham mutace

(site-directed mutagenesis) • gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba naklonovat do vhodného vektoru • navržení dvou komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, nesoucí tuto mutaci M

G

A

L

L

W

L

původní sekvence

5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3’

forward primer reverse primer

3’ TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5’ 5’ ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3’

M

G

A

L

L

S

L

• PCR s těmito primery na templátový plasmid a s Pfu polymerasou • vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick) • ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, templátový plasmid) • transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company

Stratagene

Studium protein-protein interakcí „yeast two-hybrid screen“

Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham

YEAST TWO HYBRID SYSTÉM

PRO STUDIUM PROTEIN-PROTEIN INTERAKCÍ – význam pro studium regulačních a signálních drah konstitutivní promotor

naklonovaná cDNA knihovna z libovolného euk.organismu

kvasinkový chromozom Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company

Inkorporace genů do genomu pomocí homologní rekombinace Příprava stabilní linie mutatního organismu

Transformace rostlin pomocí Agrobacterium tumefaciens

Příprava transgenních rostlin

Regenerace transgenních rostlin z kalusové kultury

Transgenní rostliny se změněným fenotypem

Transgenní zvířata

• Geny mohou být vloženy do zvířat transfekcí • Metody transfekce - Lipofekce - Transfekce pomocí retroviru - Mikroinjekce - Embryonální kmenové buňky • Všechny metody mají nízkou účinnost, max. 5% • Geny jsou vloženy náhodně, exprese variabilní • Nutná selekce

Lipofekce

Transfekce pomocí retroviru

Mikroinjekce

Transfekce pomocí embryonálních kmenových buněk

Chlupatá myš – geneticky upravené zvíře Defektní gen kódující fibroblast growth factor, negativní regulátor tvorby srsti

Biochemistry - Garrettsekvenování & Grisham genomu Nové2/emetody (High-throughput genome sequencing)

• Whole Genome Sequencing (WGS, FGS) • komparativní sekvenování – člověk 3 mld. bp • de novo sekvenování - do 50 mil. bp – mikrobiální genomy • Amplicone Sequencing – detekce mutací (SNP) • Transcriptome Sequencing – mRNA/cDNA, exprese genů • Metagenomics – studium genomů v komplexním vzorku

Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company


Full Genome Sequencing Race

2006 - Archon X Prize for Genomics - 10 mil. USD pro toho, kdo postaví přístroj, který bude schopen sekvenovat 100 lidských genomů za 10 dní s přesností 1/100 tis., pokrytím 98% a náklady do 10 tis. USD/genom Illumina, Knome, Sequenom, 454 Life Sciences, Pacific Biosciences, Complete Genomics, Intelligent Bio-Systems, Genome Corp., ION Torrent Systems, Helicos Biosciences, IBM 454 Life Sciences – 50 tis. USD Knome - 39.5 tis. USD Illumina – 19.5 tis. USD Pacific Biosciences, Complete Genomics – 5 tis. USD ??

Metodiky • Sequencing by synthesis • Nanopore technology – DNA Transistor • Fluorophore technology Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company


Pyrosekvenování – 454 Life Sciences https://www.roche-applied-science.com



Princip pyrosekvenování

1. DNA polymerasa po přidání dATP, dCTP, dGTP nebo dTTP inkorporuje pouze komplementární nukleotid, uvolní se PPi. 2. ATP sulfurylasa s adenosin 5´-phosphosulfátem převede PPi na ATP. 3. Luciferasa s ATP - přeměna luciferinu na oxyluciferin a světelné kvantum. 4. Apyrasa degraduje nevyužité dNTPs a ATP. Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company


Solexa (Illumina) princip http://www.illumina.com/

Sekvenování pomocí značeného reversibilního terminátoru 1. Inkorporace jednoho 3‘-fluorescenčně značeného nukleotidu 2. Detekce značení 3. Chemická hydrolýza/odstranění značení/terminátoru


Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham SMRT Technology (ZMW - zero-mode waveguide) www.pacificbiosciences.com

-1 molekula DNA polymerasy imobilizovaná v ZMW - 5‘-značené nukleotidy (na fosfátu), každý specifickým fluoroforem - laserem ozářené dno ZMW – excitace fluorescence poblíž polymerasy - reakce polymerasy - 10 ms fluorescence daného nukleotidu - difuse nukleotidů 1000x rychlejší, krátké signály/šum Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company

MBIOZ

Recommend Documents