Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Čtvrtek 11:30 – 13:00 1.
Struktura a replikace DNA (25.09.2014, Mgr. M. Čudejková, Ph.D)
2.
Metody molekulární biologie I (09.10.2014, Doc. Mgr. P. Galuszka, Ph.D)
3.
Metody molekulární biologie II (23.10.2014, Doc. Mgr. P. Galuszka, Ph.D)
4.
Transkripce genu a její regulace (06.11.2014, Mgr. M. Čudejková, Ph.D)
5.
Molekulární biotechnologie a transgenní organismy (20.11.2014, Doc. Mgr.
P. Galuszka, Ph.D) 6.
Translace a tvorba proteinů (04.12.2014, Mgr. M. Čudejková, Ph.D)
7.
Test (11.12.2014)
Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Mária Čudejková 1. Struktura a replikace DNA
Literatura: Alberts a kol.: Základy buněčné biologie Espero Publishing, 2000
Garrett & Grisham: Biochemistry 2nd ed., Saunders College Publishing, 1999
Nositelem genetické informace je DNA • Griffith (1928) naočkoval baktérie způsobující penumónii do myší • Směs tepelně denaturovaného virulentního typu S a nevirulentního typu R myši usmrtila • Vysvětlení: typ R byl transformován typem S!
• Avery (1944) prokázal, že transformaci způsobuje DNA!
Griffithův pokus na myších
Další důkazy • Lederberg a Tatum (1946) ukázali, že 2 kmeny E. coli lišící se autotrofií vůči aminokyselinám jsou schopny si vyměňovat geny
Další důkazy • Hershey a Chase (1952) při studiu bakteriofágů, označili jeho DNA s 32P a proteiny s 35S
• Další generace bakteriofága produkovaná po infekci baktérií obsahovala 32P (tedy DNA z původního bakteriofága), ale ne 35S (z původních proteinů)!
Základní „dogma“ molekulární biologie
Nukleové kyseliny, DNA a RNA (primární struktura)
• Polymery spojené 3' - 5' fosfodiesterovou vazbou • Základní složky nukelových kyselin (monomery) tvoří: 1. fosfát – zbytek kyseliny ortofosforečné 2. ribonukleosid (RNA) / deoxyribonukleozid (DNA): - ribóza (RNA) / deoxyribóza (DNA) - dusíkatá báze: - purínové (A, G) - pyrimidínové (T, C, U)
AMP - Adenosinmonofosfát
Základní složky nukleových kyselin
RNA vs. DNA
• Sekvence se vždy čte od 5' -konce k 3' –konci • V sekvenci genu to odpovídá od N-konce k C-konci proteinu • DNA – jeden typ, jedna úloha – uložení genetické informace • RNA - 3 základní typy a úlohy - ribosomální RNA (rRNA) – struktura a funkce ribosomu - mediátorová RNA (mRNA) – přenáší informace o genech - transferová RNA (tRNA) – přenáší aminokyseliny • Další typy RNA – snRNA, snoRNA, mikro RNA, atd.
Rozdíly mezi DNA a RNA Proč DNA obsahuje thymin? • Cytosin samovolně deaminuje a vytváří uracil • Enzymy opravující chyby v DNA jsou schopny rozpoznat tyto „mutace“ a nahrazují takovýto uracil cytosinem • Jak byl ale tyto enzymy rozpoznaly přirozený uracil od mutantního? • DNA tedy obsahuje thymin (5-methyl-uracil) namísto uracilu Proč je DNA 2'-deoxy a RNA není? • Vicinální -OH skupiny (2' a 3') v RNA způsobují její náchylnost k hydrolýze • DNA, která neobsahuje 2'-OH je stabilnější • Důvod – genetický materiál musí být stabilní • RNA je použita a poté degradována
Dvoušroubovice DNA (sekundární struktura) • Erwin Chargaff měl data o párování bazí, ale nedokázal je interpretovat (A=T, G=C, zastoupení báz se mezi různymi organismy liší)
• Rosalinda Franklinová získala difrakční X-ray data vlákna DNA • Francis Crick objevil, že je to šroubovice (helix) • James Watson odvodil princip párování bazí prostřednictvím vodíkových vazeb • Objev struktury DNA – 1953
Rentgenový difraktogram svisle orientovaného vlákna DNA.
Antiparalelní dvoušroubovice • Existuje několik konformací DNA – Watson-Crickovská pravotočivá B-DNA, pravotočivá A-DNA, pravotočivá C-DNA, a levotočivá Z-DNA …
http://biostudia.blogspot.cz/20 13/08/konformacni-rodinydna.html
Struktura DNA a párování bazí
• E. coli - průměr vlákna 2 nm, délka 1.6 x 106 nm, složená struktura (buňka E. coli má délku 2000 nm) • Lidská DNA ~2 metry, jádro buňky 5 µm, DNA uložena ve formě chromatinu, histony
Struktura dvoušroubovice DNA
Terciární struktura DNA • Prostorové uspořádání dvoušroubovice • Nadšroubovicové vinutí - superhelix DNA (a nebo např. dvoušroubovice uzavřená do kruhu, nebo lineární dvoušroubovice připevněná o podklad) • Terciární strukturu zabezpečují enzymy - topoisomerasy
http://www.cliffsnotes.com/sciences/biology/biochemistryii/dna-structure-replication-and-repair/dna-and-rna-structures
Buňka obsahuje kompletní genetickou informaci o organismu
Strom života
Bacteria, Archaea ~ 1.000-4.000 genes, Eukaryotes ~ 6.000-30.000 genes
Prokaryota
Struktura eukaryotní buňky
Chromosomy u člověka
Velikost genomů (bp – base pairs) Amoeba dubia
~ 670.000.000.000
Homo sapiens
~ 3.000.000.000
Paradox hodnoty C (velikost genomu není v souladu s komplexitou organismu)
Velikost genomu
Velikost genomu
Porovnání velikostí různých genomů
Replikace DNA Semikonzervativní model
• Prokázali Matthew Meselson a Franklin Stahl (1958) pomocí izotopového značení • Replikace DNA vede k vytvoření dvou DNA molekul, ve kterých je jedno vlákno z původní a druhé zcela nové
Replikace DNA • Syntéza DNA začína v replikačních počátcích (typická sekvence, bohatá na AT, bakterie – jeden rep. počátek, eukaryota – více rep. počátků, iniciační proteiny) • Syntéza DNA probíhá v tzv. replikačních vidličkách
http://biochemhelp.com/dna-replication-in-prokaryotes.html
Vlastnosti replikace DNA Nejlépe prozkoumány u E. coli, mnohé vlastnosti obecné • Replikace je obousměrná - probíhá ve dvou replikačních vidličkách, které se pohybují v opačných směrech • Dvoušroubovice musí být rozvinuta - helikasy
• Překroucení (supercoiling) musí být kompenzován - DNA gyrasa (topoisomerasa typu II) • SSB proteiny (single strand binding) ochraňují jednovláknovou DNA před znovuspárováním
• DNA replikace je semidiskontinuální: Vedoucí vlákno se replikuje průběžně Druhé vlákno se replikuje v protisměru prostřednictvím Okazakiho fragmentů, které musí být poté spojeny (Tuneko and Reiji Okazaki)
Replikační vidlička
• DNA-dependentní DNA-polymerázy syntetizují komplementární vlákno DNA jen jedním, a to 5´ - 3´ směrem! • DNA-polymeráza nedokáže začít syntetizovat nové vlákno – enzym primáza syntetizuje k DNA komplementární RNA primer, který pak DNA-polymeráza využije pro syntézu nového vlákna DNA • RNA-primery jsou odstraněny a DNA je dosyntetizována opravnou DNA-polymerázou • Okazakiho fragmenty jsou spojeny dohromady DNA-ligázou
Replikační vidlička a replikační aparát
http://bnzm.wordpress.com/what-are-retroviruses/
Důkaz obousměrné replikace DNA
Enzymologie replikace DNA DNA polymerasa I (opravná DNA polymerasa) • U baktérie E. coli Arthur Kornberg (1957) prokázal existenci DNA polymerasy I
• DNA pol I vyžaduje všechny 4 nukleotidy, templát a primer, který se páruje s templátem a vytváří krátký úsek dvoušroubovice • Replikace probíhá od 5' k 3' - konci, nukleotidy jsou připojovány od 3'-konce vlákna
• DNA pol I katalyzuje kolem 20 cyklů polymerizace než se nové vlákno oddělí od templátu • Pol I z E. coli je monomer, 928 aminokyselin (109 kDa) • Kromě 5'-3' polymerásové aktivity, enzym má také 3'-5' a 5'-3' exonukleasové aktivity
3´ - 5´ exonukleasová funkce (odstraňuje chybný/nepárový nukleotid)
5´ - 3´ exonukleasová funkce (vyštepuje primery RNA)
E. coli DNA Polymerasa I
DNA Polymerasa III
„Hlavní" polymerasa u E. coli = DNA-replikasa • Deset rozdílných podjednotek • „Jádro" enzymu má 3 podjednotky – - polymerasa – - 3´ - 5´ exonukleasa – - neznámá funkce
• β – podjednotka vytváří prstenec kolem DNA • Procesivita - 5 millionů bazí!
E. coli DNA Polymerasa III
DNA replikace u eukaryot Stejný princip jako u E. coli, ale komplexnější • Lidská buňka: kopírování 6 miliard bp • Mnoho počátků replikace: 1 na 3 - 300 kbp • Známo několik DNA polymeras • DNA-polymerasa α - 4 podjednotky - polymerasová aktivita (procesivita = 200) - primasová aktivita - ne 3´ - 5´-exonukleasová aktivita
Buněčný cyklus
Jiný způsob vzniku DNA RNA-řízená DNA polymerasa • Howard Temin (1964) pozoroval, že inhibitory DNA syntézy zabraňují infekci buněk v kultuře RNA viry – DNA tedy zprostředkovává replikaci viru.
• Temin a Baltimore (1964) nezávisle objevují RNA řízenou DNA polymerasu – „reverzní transkriptasu“
Opravy poškozené DNA Základní rozdíl oproti RNA, proteinům, lipidům, atd. • Všechny ostatní složky mohou být nahrazeny, ale DNA musí být zachována
• DNA v buňkách podléhá kontinuálnímu poškozování • Buňky potřebují nástroje pro opravy chybějících, pozměněných nebo nesprávných bazí, opravy insercí a delecí, poškození UV zářením – pyrimidinové dimery, přerušení vlákna, cross-link • Existují dva základní mechanismy oprav: oprava chyb v párování bazí (mismatch repair) a opravy chemického poškození
Mutace odpovědná za vznik genetické choroby – srpkové anémie
Opravy chyb v párování bazí (Mismatch repair)
• Opravné enzymové systémy kontrolují dvoušroubovici DNA a identifikují nesprávně párované báze, poté vyříznou chybný usek a nahradí jej. • Příkladem je methylační dráha u E. coli. • Methylace DNA probíhá po replikaci, takže tento systém identifikuje methylovaný řetězec jako původní a opraví nesprávně párovanou bázi na druhém řetězci.
Restrikční endonukleasy • Baktérie dokážou zabránit ("restrict„) možnosti útoku cizí DNA pomocí restrikčních enzymů • Restrikční enzymy Typu II a III štěpí řetězce DNA na místech specifické sekvence • Tyto enzymy rozpoznávají sekvence 4, 6 nebo více bazí a štěpí je. •
• Názvy těchto enzymů používají 3-písmenný kód (psaný kurzívou): 1. písmeno označuje rod, 2. a 3. písmeno druh organismu • Např. EcoRI je první restrikční enzym nalezený v kmeni R baktérie Escherichia coli.
Opravy chemického poškození DNA Tvorba pyrimidinových dimerů působením UV záření
Pyrimidinové dimery mohou být přímo opraveny enzymem fotolyasou
Opravy chemického poškození DNA • Vystřihnutí a oprava: DNA glykosylasy odstraní poškozenou bázi a vytvoří AP místo.
• AP (Apurinic/apyrimidinic) endonukleasa rozštěpí poškozený řetězec, endonukleasa odstraní několik residuí okolo a mezera je vyplněna pomocí DNA polymerasy a DNA ligasy.
Oprava poškozené báze v DNA
Mechanismus genové rekombinace (rekombinační oprava) • Obecná rekombinace: výměna homologních segmentů mezi dvěma molekulami DNA (crossing-over během meiozy) • Robin Holliday (1964) navrhl model využívající jednovláknového naštípnutí v homologních místech. • Dochází k rozvinutí dvoušroubovice a propojení (ligaci) dvou naštípnutých homologních řetězců – vzniká Hollidayovo spojení (Holliday junction)
Holliday junction
https://www.shef.ac.uk/mbb/ruva/ruva-020
http://www.learnerstv.com/animation/animat ion.php?ani=169&cat=Biology
