Maligní tumor je genetické onemocnění VZNIK NÁDOROVÉHO ONEMOCNĚNÍ z hlediska molekulové patobiochemie Jaroslav Masopust Ústav klinické biochemie a patobiochemie 2. Lékařská fakulta UK v Praze
Počet buněk
• Přechod normální tkáně do stavu invazívní nádorové choroby trvá obvykle 5 – 20 let • Ovlivňují to hereditární genetické faktory a somatické genetické změny • Progresi podporuje postupné (!) hromadění genetických změn
nekontrolovaný růst způsobený kupř.: - trvalou aktivaci signální transdukce růstového stimulu - alteraci kritických bodů buněčného cyklu - deregulaci DNA-transkripčních faktorů
Progrese
Generalizace - metastázy 1012
ORGANISMUS 109
1
BUŇKA CHROMOSOM
1.
Morfologické a laboratorní známky
Nádor „in situ“
TKÁŇ
mutace
Klinické příznaky,
NÁDOROVÉ ONEMOCNĚNÍ
Nádorový FENOTYP Maligní transformace Nádorový GENOTYP
1
2.
1 11+2
3.
11 1+2 1+2 1+2+3
Normální buňka
Nádorový potenciál
4.
1+2+3 1+2
Hromadění mutací
1
Maligní transformace
1
Potenciál agresivity Hyperplazie
Dědičná predispozice
Odezva organismu Somatické genetické změny Klonální Invazivní Metastázy dysplazie progrese Angiogeneze
aktivace onkogenů ztráta heterozygozity genetický karyotyp instability defekt v opravách DNA
NÁDOROVÝ GENOTYP výsledek nahromadění mutací (alterací)
genů pro řízení * proliferace * diferenciace * zániku
čas
BUNĚK
PO PU LA C I m ožno ro zdě lit na 4 g ene tick é O N K O D ÉM Y
PROTOONKOGE NY
(d le vz tah u vý vo je ná d oru ke ge n etic ké ne b o e n virom e ntáln í zá těži)
(kontrolují růst a diferenciaci buněk) aktivace
(1 ) ZÁ K LAD N Í - norm ální popula ce k de riziko nádorové ho onem ocnění vzniká na hrom aděním bodový ch m uta cí (2 ) E N V IR O M EN TÁ LN Í - č ást norm á lní populac e kde rizik o se zvyšuje působením ok olních podm íne k (c he m ie ,ra diac e,viry) (3 ) E N V IR O M EN TÁ LN Ě G EN E TIC K Á - čá st populac e se zvýš enou nác hylnos tí k e nvirom e ntálním k anc erogenům (4 ) G EN E TIC KÁ - čá st popula ce s ge ne tick y pře nos ným rizik em "R a kovina je genetic ká poruc ha som atick ýc h buněk : m aligní tum ory obsa hují buňk y nes oucí m utac e nebo delec e kritick ých nádorový ch genů" "M uta ce zá rode čnýc h buněk přená ší ná chylnos t k nádorovém u onem ocnění z rodič ů na dě ti"
⇓ ← mutace,translokace,amplifikace ⇓
O N K O G EN Y pro růstový pro receptory intracelul. pro transkripční pro faktor růst.faktorů kinasy faktory transdukční proteiny sis
erbB-1 src,abl c-myc,L-myc K -ras erbB-2 N-myc,E 2A H -ras fms,trk fcs,gli N-ras net,ros gip _______________________________________________________
2
TUMOROVÉ SUPRESOROVÉ GENY (= ANTIONKOGENY) (účastní se na přenosu signálu mezi buňkami a kontrolují programovaný zánik buněk)
inaktivace
⇓ ←mutace,amplifikace ⇓
RB p53 DCC APC MCC NF-1 WT-1 ↓ p53 protein (autoprotilátka proti p53)
GENY predisponující GENETICKOU INSTABILITU (Defekt v opravě chybné DNA pro poruchu v „opravném čtení“ při replikaci DNA) Gen na chromosomu 2
mutace
Gen pro HNPCC (Hereditární nepolymatózní kolorektální karcinom)
3
5´
OH
A C T T A G G C T A A C G T A G C G T G
T GMe A
T G
A C
Přímá obnova poškození Oprava baze vystřižením
T U C Gox A T T
premaligní buňku k proliferaci maligních dceřinných buněk Oprava nukleotidu vystřižením
G C A G C
Oprava „mis-match“ chyby (chybného párování bazí)
OO
• Genová instabilita může predisponovat
O
Oprava přerušení jednoho vlákna
• Instabilita se může projevovat na makroúrovni: (změny v karyotypu) nebo mikroúrovnI (oprava DNA-sekvence)
A C O
O
Oprava přerušení dvojvlákna
3´
Genotoxický stres UV-záření Poškození DNA
Možné cesty k maligní transformaci
• ZMĚNA SIGNALIZACE UbUb
• NEADEKVÁTNÍ EXPRESE strukturálně normálního proteinu
p53
MDM2
ARF
MDM2
p21CIP c-Myc
UbUb CyklinD1 CDK4
Degradace p53
Cyklin E CDK2
Kaskáda kaspas
P P P
c-Myc
• PORUCHA ZÁNIKU BUNĚK
Apaf-1
Bcl-2 p53
• UVOLNĚNÍ REPRESE
• GENETICKÁ NESTABILITA
Bax
p53
pRb
Apoptóza E2F
pRb E2F
Progrese cyklu
4
EGF
EGFR
Protoonkogen pro receptor delece
Růstový faktor
neu
membrána
val
receptor
SHC GRB SOS Ras P p
P
gln
P
PI-4-P P
PI3-kinasa
PI-4,5-P2
cytosol
TEP-1
p PDK P p
Onkogen pro receptor
Akt 14-3-3 P P
IKK-α p50 p65
IκB
NF-kB
BcL-XL Bad
p50
Bad
BcL-XL
p65
trvalá stimulace
Antiapoptóza
Apoptóza
Antiapoptóza
NÁDOROVÝ FENOTYP MALIGNÍ TRANSFOMACE BUŇKY • Ztráta kontroly PROLIFERACE - alterace buněčného cyklu - antiapoptóza („nesmrtelnost buňky“) - alterace v transdukci signálu
• Ztráta kontaktu buňka-buňka • Invazivita • Alterace v metabolismu (anaerobní glykolýza, „uchvacování“ dusíku, lipolýza tvorba nádorových antigenů)
• Podpora angiogeneze
5
FOSFORYLACE
(kinasy)
Promotor
GEN pro růstový faktor
„ZAPNUTÍ“ (aktivace)
Rb-protein
PROTEIN-(Tyr, Ser, Threo)
Transkripční aktivátor (blokován)
+ ATP
Cdk 4
„VYPNUTÍ“ (inaktivace)
mRNA
DEFOSFORYLACE
Transkripce zahájena
(FOSFATASY) P
Fosforylovaný Rb-protein se odpoutá od aktivátoru; ten se naváže na promotor
p15INK4b cdk4 p21Cip1/Waf1 2. cAMP a 3. Inhibice kontaktem p27Kip1 aktivita komplexu cdk/cyklin PPPPP 1. TGFσ
Růstové faktory Pos.
neg
pRb
E2F
pRb
hypofosforylovaný DP-1
E2F
negativně
PPPPP
Cdk1 (konc.)
pozitivně
DP-1 pRb DP-1
E2F
E2F locus
Začátek transkripce
TATA
DP-1
E2F
E2F locus
Začátek transkripce
Cyklin (konc.)
TATA
S Represe transkripce
M
S
M-fáze
Cdk1 aktivita
Aktivace transkripce
6
G0
Kontrolní body cyklin B/ Cdk1G0
G2
M
S
ATM P
Restrikční bod
M
/cyklin D1 Cdk4/cyklin D2 Cdk6/cyklin D3
CDK4 P53P cyklinD2
pro
P21
CDK1 Cyklin A
cyklin A/ cdk1
CDK1 cyklin B2-P CDK2 Cyklin A
p21
G2 cyklin E/ Cdk2
cyklin A/ Cdk2
„NESMRTELNOST BUŇKY“ Normální somatická buňka má omezenou kapacitu proliferace danou určitým počtem možných dělení a řízenou opakovanou sekvencí konce DNA
CDK1 Cyklin A
CDK1 cyklin B2-P P Cdc2 5C
CDK1 cyklinA
cdc 25C 14-3-3 P P P chk1 chk2 P P
p53 P
cdc2 5C-P 14-3-3
G1
E2F RB-P
CDK2 CDK7 CDK2 cyklinE P Cyklin H Maf 1 Cyklin A P P RB P P E2F CDK4 DD1 Cyklin D1
CDK1 Cyklin B2-P
G1
radiace
P
ATM radiace
P
CDK2 Cyklin A P E2F RB-P
CDK2 Cyklin E P
E2F DP1
CDK7 Cyklin H Maf 1
RB-P P
CDK4 Cyklin D1-P
CDK1 Cyklin B1
S CDK1 Cyklin B2
Přenos signálu z vnějšku do jádra buňky (Transdukce signálu) SIGNÁL
membr. Transdukční Transkrip . Transkripce receptor proteiny faktory genu
- TTAGGG tzv. telomery 1 cyklus = zkrácení o 1 telomer mRNA
Nové nastavení umožňuje
TELOMERASA
Zvýšená aktivita telomerasy u nádorových buněk
PROTEIN (činnost)
7
Kategorie členů signálních drah
Růstové faktory
Receptory růstových faktorů (II)
(I) Receptory non-tyr. kinas: c-mas
Membr. nerecept. tyrosin-kinasy c-sec, c-lok, c-fgr c-yes
(III) G-protein c-ras, c-gsp, c-gip
Receptory růst. f. tyrosin-kinasy
Růstové fakt. PDGF (c-sis) FGF-like (c-int2)
Intracelulární oblast (tyrosinová protein-kinasa) Intracel. transducery
Druhý posel (fosforyl. protein)
Intracel.receptor
(II)
Protein-kinasy c-raf, c-mos, c-pim 1
c-erbβ, c-fms, c-ret
Transkripční faktory (IV)
c-ros, c-kit, c-nue
DNA transkripce
Regulátory nukl. traskr. proteinů
RNA
Proteiny kontroly buněčného cyklu (V)
c-myc, c-myb, c-jun c-rel, c-erbA, c-fos mRNA
PROTEIN
WNT Frizzled Dishvelled GSK3β X APC
X
DRÁHY KANCEROGENEZE
X
β−katenin TGFβ TCF
Rovnovážný stav počtu buněk v tkáních Replikační životnost
MYC
X
SMADs
RB
INK4B
X
X
INK4A Cyk-CDK4
GRB2-SOS
E2Fs
Buněčný cyklus
TERT
CykE-CDK2
RAS
GPCR
ARF RAF
X
RTK
PI3K
ALT BAX
Změny genové exprese
MAPK
G-protein
Růstový faktor
p53
MDM2
MEK
PP2A
Proliferace
-
Zánik
onkogeny x antionkogeny
PRO apoptotické geny
ANTI
APOPTÓZA RSK
PTEN
X X X
=
X
X X
Cytokiny
Počet buněk
Mobilizace zdrojů
X elF4E TOR
AKT
8
PROTINÁDOROVÁ IMUNITNÍ OBRANA (efektorové buňky) Cytotoxický T-ly CTL
Y Y Y
Onkoproteiny
Specifické protilátky
produkce IL-12
APC-aktivace
cytokiny
zvýšení produkce kostimulačních molekul
IFNγ
produkce IL-2
aktivace a proliferace tumor-reaktivních buněk CD4+ a CD8+
Přirozený zabiječ
podpora odpovědi Th1-buněk
NK LAK Aktiv. makrofág Lymfokiny akt. zabiječ
Renezance Burnetovy a Thomasovy teorie protinádorového imunologického dohledu
Onkoprotein
(„cancer immunoediting“)
1. Fáze eliminace: NK, NKT, γδT rozpoznávají antigeny nádorových buněk produkce INFγ kaskáda přirozené imunity (angiostatické chemokiny, stimulace NK a dendrit.bb a IL 12) drť tumorových bb. fagocytována do uzlin; odtud difer. T-bb CD4+ a CD8+ putují k nádoru, rozpoznávají a ničí tumorové bb. (IFNγ, IL 12, TNF, perforin)
apoptóza
NFκB
proliferace inhibice diferenciace angiogeneze metastázy
2. Fáze ekvilibrace: selekční tlak nové klony nádorových bb.: tvorba a ničení v rovnováze
NFκB
3. Fáze vymanění:
selekční tlak vytvoří varianty unikající rozpoznání, ničící cytotox. T-bb. (apoptoza Fas-lig)
9
PODPORA ANGIOGENEZE
VGF VGFR
METASTATICKÝ (invazivní) FENOTYP • Zvýšení motility (invazivita) (průnik do stromatu a přes cévní stěnu)
PLCγ
FAK
• Vytváření embolů v cirkulaci
Ras DAG
IP3
PKC
Ca++
• Adherence ke stěně cévy
paxillin
MAPK
Proliferace endotelií
Změna cytoskeletu Migrace endotélií
Proliferace endotelií Permeabilita cévy
NOS
NO
Motilita Invazivita
Emboly v cirkulaci
Adherence k endotelu
Extravazace do parenchymu
Metastázy metastáz
• Vytvoření metastázy (proliferace v místě, angiogeneze, odpověď na mikroprostředí) • Metastázy metastáz • Nádorová generalizace
ANGIOGENEZE
Maligní transformace, angiogeneze
• Průnik do parenchymu
Odpověď na mikroprostředí
Proliferace angiogeneze
METASTÁZA
10
GENETICKÉ ZMĚNY při rozvoji KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Chromosom 5q 18q Mutace delece delece APC K-ras β−katenin Normální epitel
adenom
17p delece BAT-26
8p delece
10-letí
• Mutace APC, K-ras, p53 genů….u většiny
• Aneuploidie s delecí raménka chromosomu 1p, 5q, 8p, 18q, 17p u 85 %
pozdní adenom
časný karcinom
pozdní karcinom Období gestace
Možnosti detekce rizika
2 – 5 let
2 - 5 let
• Diploidie (15 %) s mutací BAT-26 …. u 95 % • „Dlouhá“ DNA (nepodléhá apoptóze) .. až u 90 % Kolorektální karcinom je klinicky, fenotypově a genotypově hetorogenní:
Multikomponentní stanovení
Rozlišení nádorové DNA 5-fluorouracil
Souprava pro detekci tumoru: BAT-26 v stolici
Irreversibilní blokáda
(PreGen 26)
5-fluorodeoxyuridylát
pozitivní u > 90% HPNC
thymidylátsynthasa dUMP
dTMP
N5,N10-methylentetrahydrofolát
11
REZISTENCE vůči CHEMOTERAPII Genová amplifikace dihydrofolátreduktasy (DHFR): Je navozena jejím inhibitorem – methotrexátem (přežívající nádorové buňky amplifikují gen DHFR až 1000násobné kopie – nikoliv buňky normální)
Je to transmembránový fosfoprotein (ATP-pumpa): vytlačuje hydrofobní toxické látky z buňky ven (Je normálně v hepatocytech, enterocytech, renálních tubulech – součást ABC-transporterů ATP-binding casette transporter)
Vývoj molekulových markerů urothelkarcinomu 9qDel Ta
RAS
Ta
Méně dobrá T2-4
Normální urothel
TP53 RB
N+/M+ Tis
Diferenciace primitivního neuroblastu na zralou gangliovou buňku nervovým růstovým faktorem (NGF) (také jako TrkA-receptor)
Neuroblastom
ganglioneurom (benignější)
Insulinový růstový faktor 2 (IGF-2) (nezralejší)
neu (ErB-2) onkoprotein (nezralejší)
CHEMOPREVENCE
Dobrá prognóza
9pDel (INK4A)
T1
Rezistence vůči chemoterapii - multidrug-resistence protein (MRP) - LRP, glutathion-S-transferasa - topoisomerasa, thymidylátsynthasa, metalothionein - zvýšená exprese bcl-2
Amplifikace genu multidrug-transport protein neboli P170
Superficiální tumor
Molekulárně genetické vyšetření při léčení neuroblastomu
VITAMINY: folát, vitamin E, D (membránové receptory) MINERÁLY: Ca, Se (selenomethionin) Látky z rostlin: diallylsulfid (setrvání v G-fázi), kurkumin, genistein (ze sóje: potlačuje ca-prostaty), indol-3-karbinol; isoflavonony, lykopen, polyfenon E …. Syntetické látky: raloxifen, 9-cis-retinová kys., (selektivní inhibitory estrogenních receptorů), inhibitory COX 2 ….
Špatná prognóza
Infiltrující tumor T1 5qDel, 3pDel
T2-4 6qDel, 11pDel, 18qDel
12
Anti-iniciace * alterace metabolismu kancerogenu * podpora detoxikace kancerogenu
Anti-promoce, anti-proliferace
Mechanismus CHEMOPREVENCE
* odstranění reaktivních forem kyslíku * ovlivnění genové exprese * potlačování zánětlivé reakce
preneoplastické buňky iniciovaná buňka
nádorové buňky
* podpora opravy DNA * odstranění elektrofilních látek a reaktivních forem kyslíku
HERCEPTIN (trastuzumab) Humanizovaná monoklonlní protilátka proti proteinu 2 receptoru epidermálního růstového faktoru - Her-2/neu (c-erbB2) nadměrně exprimovaného (nádorová amplifikace genu) u některých epitelových nádorů (25 % karcinom prsu) Možné úspěšné léčení metastazujících karcinomů prsu (neopovídajících na antiestrogenovou terapii) Nutno dříve prokázat přítomnost HER-2 při biopsii nádoru a pak aplikovat Heceptin
* potlačení proliferace * indukce diferenciace * navození apoptózy * podpora imunity * omezení angiogeneze
Mechanismus účinku Herceptinu Signální dráha epidermálního růstového faktoru HER2/neu redukuje hladinu p27Kip1 navozením jeho degradace ubikvitinací; to navozuje uvolnění Cdk2 (cyklin-dependentní kinasy2) a aktivaci cyklu buněčného dělení (=nádorová proliferace při nadměrné expresi) Trastuzumab (Herceptin) působením na receptor (HER2/neu-R) zvyšuje hladinu inhibitoru p27Kip1 podporuje jeho asociaci s cyklindependentní kinasou CdK2, čímž inhibuje aktivitu této kinasy a způsobuje zástavu cyklu v G-1 fázi (a brání tak nádorové proliferaci). Pozdější rezistence nádorových buněk na Heceptin se vysvětluje nadměrnou expresí Skp2 (= ubikvitin-ligasa), (která je nutná pro průběh ubikvitinace p27/Kip1 ) adaptovanými nádorovými buňkami; neodstraněný p27Kip1 pak neblokuje aktivitu Cdk2 a nádorové buňky se mohou dále dělit (Podpořeno experimentem in vitro pomocí IGF-1, který má účinek „anti-trastumuzabový“) Signální dráha realizující účinek HER2/neu i IGF-1 se děje prostřednictvím signalizace PI3K (fosfoinositid-3-kinasy); amplifikace genu PI3K nebo delece genu pro PTEN (specifická fosfatasa), nalézané u řady karcinomů, způsobují deregukaci buněčného cyklu
Mechanismus účinku trastuzumabu a rezistence vůči němu IGF-IR IGF-IR
IRS
HERCEPTIN
p85
p85
IGF-1 PI3K
PI3K
IGFBP-3 Následná signalizace
Zrušeni zástavy cyklu v G-1 fázi
Skp2
p27Kip1
Uvolnění blokády Cdk2
p27Kip1 - degradace
13
LÉKY ve zkoušení (na bazi molekulové patologie) LymphoRad-131:
humanizovaná monoklonální protilátka nesoucí radionuklid (Jod-131) blokuje receptor stimulátoru B-lymfocytů (nepůsobí na prekurzory B-buněk) – inhibuje myelom
TRAIL-1 R Mab:
humaniz. monokl. protilátka ; tumory s tímto receptorem zanikají na apoptózu
ZDRAVÍ je CENA, kterou platíme za ŽIVOT „Na samém začátku vzniku života jedince je progrese buněčného dělení nutným předpokladem vývoje jedince, později může být příčinou jeho záhuby“
Inhibitory Bcl-2 a Bcl-X: podporují apoptózu nádorových buněk (non-Hodgkinský lymfom)
„Osobní vakcína“: vůči proteinu tepl. šoku (HSP70)
Molekulová patobiochemie dává možnost tento proces ovlivnit
+ imanitib mesylát působí jako „fingerprint“ tumorových buněk pacienta – chronické myeloidní leukemie
14
