Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku Pavla Balínová
Důležité informace Kroužkový asistent: RNDr. Pavla Balínová e-mailová adresa:
[email protected] •
•
•
místnost: 410
studijní materiály jsou dostupné v aplikaci Výuka: http://vyuka.lf3.cuni.cz/
Osnova semináře •
organizace praktik
•
pravidla bezpečnosti práce v laboratoři
•
laboratorní vybavení
•
práce s automatickou pipetou
•
informace k jednotlivým úlohám praktik
•
rozdělení studentů do pracovních skupinek a přidělení praktické úlohy na první týden praktik
Organizace praktik (lab. kolečko B1 – B4) 4 úlohy / 4 týdny / 8 pracovních stolů - rozdělení kroužku do 8 pracovních skupin •
SPEKTROFOTOMETRIE - B1 (stanovení koncentrace kreatininu v moči)
•
CHROMATOGRAFIE - B2 (TLC lipofilních barviv)
•
TITRACE - B3 (stanovení acidity žaludeční šťávy)
•
POTENCIOMETRIE - B4 (měření pH fosfátového pufru)
Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři jsou dostupná v aplikaci Výuka: http://vyuka.lf3.cuni.cz/
Laboratorní vybavení, práce s automatickou pipetou
Informace k jednotlivým úlohám praktik SPEKTROFOTOMETRIE (stanovení koncentrace kreatininu v moči) •
analyzovaný vzorek: vlastní moč
1. bezbarvý kreatinin je převeden na barevný produkt chemickou reakcí v alkalickém prostředí (Jaffého reakce) 2. měření absorbance standardních roztoků kreatininu a vzorku moče pomocí spektrofotometru ve viditelné oblasti
3. koncentrace kreatininu ve vzorku se zjišťuje z naměřené absorbance pomocí kalibrační křivky
Spektrofotometrie – výpočty v praktiku •
příprava kalibračních roztoků ze zásobního
standardního roztoku kreatininu (ředění) •
naředění vzorku moči
•
přepočet hmotnostní koncentrace na molární
Zjištění koncentrace: 1. Lambert-Beerův zákon 2. Kalibrační křivka 3. Výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních roztoků
Spektrofotometrie Lambert-Beerův zákon
A=exlxc
nebo
T = 10 -(e
x
l x c)
A = absorbance (A = -log T) T = transmitance (T = 10 -A)
e = molární absorpční („extinkční“) koeficient l = tloušťka kyvety (v cm)
c = molární koncentrace
Spektrofotometrie – kalibrační křivka 3 a více standardů
zpracovaných stejnou metodou
lineární kalibrační křivka A=exlxc
y = kx + q
Spektrofotometrie - výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních roztoků stand. roztok zkoumané látky
vzorek zkoumané látky
Ast = cst x l x e
Avz = cvz x l x e
Ast / cst = l x e
Avz / cvz = l x e
lxe=lxe Ast / cst = Avz / cvz
cvz = Avz x (cst / Ast)
cvz = Avz f x
f = průměr všech (cst / Ast) použitých při experimentu
Spektrofotometrie - příklady 1) standard: A = 0,600, c = 15,0 mM vzorek: A = 0,200, c = ? 2) standard: T = 0,30 vzorek: T = 0,60 Je cvz nižší nebo vyšší než cst? 3) c1 = 0,1 mM c2 = 0,01 mM Kolikrát byl vzorek naředěn? 4) vzorek o c = 0,2 mM byl naředěn 100x Jaká je jeho koncentrace po naředění?
CHROMATOGRAFIE (TLC lipofilních barviv) = adsorpční planární kapalinová chromatografie •
mobilní fáze: toluen (nepolární)
•
stacionární fáze: destička se silikagelem (polární)
•
standardy barviv → porovnání Rf
•
neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva
Chromatografie – vyhodnocení chromatogramu planární chromatografie (př. TLC)
Porovnání skvrn se standardy
Rf = a/b Rf = retardační faktor a = vzdálenost start – střed skvrny b = vzdálenost start – čelo mobilní fáze Obrázek převzat z http://sms.kaist.ac.kr/~jhkwak/gc/catofp/chromato/tlc/tlc.htm (listopad 2006)
TITRACE (ODMĚRNÁ ANALÝZA) (stanovení acidity žaludeční šťávy) •
reaguje HCl ze žaludeční šťávy
•
odměrný roztok: NaOH → neutralizační titrace
•
indikátor: fenolftalein (bezbarvý → fialový)
•
z koncentrace HCl se vypočítá pH žaludeční šťávy
•
zjišťuje se pH před a po stimulaci (= na lačno a „po jídle“)
Titrace - výpočet koncentrace vzorku •
založen na znalosti stechiometrie chemické reakce aA+bB→cC+dD
a, b, c, d = stechiometrické koeficienty = látkové množství (n) A = „odměrný roztok“, B = analyzovaná látka
a / b = n(A) / n(B) c=n/V→n=cxV
c = molární koncentrace (mol/l), n = látkové množství (mol), V = objem roztoku, a, b = stechiometrické koeficienty a x n(B) = b x n(A) a x cB x VB = b x cA x VA
POTENCIOMETRIE (měření pH fosfátového pufru) •
elektrochemická metoda založená na měření napětí elektrochemického článku za bezproudého stavu
•
dvě elektrody:
•
indikační (měřící) elektroda
•
referentní (srovnávací) elektroda
•
v praktiku stanovení pH pomocí pH-metru (= upravený potenciometr)
Potenciometrie •
roztoky fosfátového pufru o různém složení
•
kalibrace přístroje pomocí standardů
•
skleněná kombinovaná elektroda („dvojče“)
Potenciometrie - pufry •
roztoky schopné vyrovnávat výkyvy pH: po přidání silné kyseliny nebo zásady změní své pH jen nepatrně
•
používají se k udržování stabilní hodnoty pH
•
složení pufrů:
„konjugovaný pár: kyselina / zásada“
* slabá kyselina + její sůl např. octanový pufr * slabá zásada + její sůl např. amonný pufr
* 2 různé soli vícesytné kyseliny např. fosfátový pufr * amfoterní látky např. proteiny
Potenciometrie – výpočet pH pufrů Henderson-Hasselbalchova rovnice •
pH = pKa + log (cs / ca) (pro kyselý pufr)
•
pOH = pKb + log (cs / cb ) (pro bazický pufr)
•
pH = 14 – pOH
•
pK = disociační konstanta slabé kyseliny (pKa) nebo báze (pKb)
•
cs = aktuální koncentrace soli v pufru
•
ca = aktuální koncentrace slabé kyseliny v pufru
•
cb = aktuální koncentrace slabé báze v pufru
Potenciometrie – výpočet pH fosfátového pufru •
výpočet pH všech připravených roztoků
pH = pK(H2PO4-) + log c(HPO42-) / c(H2PO4-)
Výsledná hodnota pH pufru je závislá nejen na koncentraci složek, ale i na poměru složek pufru po smíchání tj. poměru objemů obou složek pufru pH = pKa + log n(HPO42-) / n(H2PO4-) pH = pKa + log (cs x Vs) / (ca x Va)
