59
Lampiran 1 Media triptone soya agar (TSA)
Komposisi per liter: Pancreatic digest of casein
15,0 g
Enzymatic digest of soya bean
5.0 g
Sodium chloride
5,0 g
Agar
15,0 g
Contains papain
Cara Pembuatan: Sebanyak 20 gr TSA dilarutkan dengan 500 ml aquades dalam tabung Erlenmeyer lalu ditambahkan Bacto Agar sebanyak 10% kemudian larutan dipanaskan sampai larut sempurna. Larutan diatur tingkat keasamannya sehingga memiliki pH sebesar 7,3 dengan menambahkan NaOH. Selanjutnya larutan media disterilisasi dengan autoclave 121 ºC, selama 15 menit. Brucella selective supplement dilarutkan dengan menambahkan methanol dan aquades steril (1:1) sebanyak 10 ml ke vial secara aseptis untuk membentuk suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 15 menit. Selanjutnya suspensi Brucella selective supplement ditambahkan ke dalam 500 ml media TSA yang sudah disterilisasi. MediaTSA yang belum beku sebanyak 20 ml dituang ke cawan Petri untuk membuat agar plate sedangkan untuk membuat agar miring tabung diisi dengan 20 ml TSA selanjutnya dimiringkan sampai TSA membeku.
60
Lampiran 2 Media triptone soya broth (TSB)
Komposisi per liter: Pancreatic digest of casein
17,0 g
Papaic digest of soybean meal
3,0 g
Sodium chloride
5,0 g
Dibasic potassium phosphate
2,5 g
Glukose
2,5 g
Cara Pembuatan: Sebanyak 15 gr TSA dilarutkan dengan 500 ml aquades dalam tabung Erlenmeyer. Larutan diatur tingkat keasamannya sehingga memiliki pH sebesar 7,3 dengan menambahkan NaOH. Selanjutnya larutan media disterilisasi dengan autoclave 121 ºC, selama 15 menit. Brucella selective supplement dilarutkan dengan menambahkan methanol dan aquades steril (1:1) sebanyak 10 ml ke vial secara aseptis untuk membentuk suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 15 menit. Selanjutnya suspensi Brucella selective supplement ditambahkan ke dalam 500 ml media TSB yang sudah disterilisasi. MediaTSB yang sudah steril dimasukkan ke dalam tabung masing berisi 5 ml.
masing –
61 Lampiran 3 Media Cimon’s Citrate agar
Cara Pembuatan: Sebanyak 11,5 gr Cimon’s Citrate agar dilarutkan dengan 500 ml aquades dalam tabung Erlenmeyer kemudian larutan dipanaskan sampai larut sempurna. Selanjutnya larutan media disterilisasi dengan autoclave 121 ºC, selama 15 menit. Media Cimon’s Citrate agar yang sudah steril dimasukkan ke dalam tabung masing – masing berisi 5 ml selanjutnya dimiringkan sampai media membeku.
62
Lampiran 4 Media Urea agar base
Komposisi: Peptone
1,0 g
Glukose
1,0 g
Sodium chloride
5,0 g
Disodium phosphate
1,2 g
Potasium dihydrogen phosphate
0,8 g
Phenol red
0,012g
Agar
15,0 g
Cara Pembuatan: Sebanyak 2,4 gr Urea agar base dilarutkan dengan 95 ml aquades dalam tabung Erlenmeyer kemudian larutan dipanaskan sampai larut sempurna. Larutan diatur tingkat keasamannya sehingga memiliki pH sebesar 6,8. Selanjutnya larutan media disterilisasi dengan autoclave 121 ºC, selama 15 menit. Suspensi 5 ml urea 40% ditambahkan ke dalam 95 ml media Urea agar base yang sudah disterilisasi dan campur sampai homogen. Media Urea agar base yang sudah steril dimasukkan ke dalam tabung masing – masing berisi 2 ml selanjutnya dimiringkan sampai media membeku.
63
Lampiran 5 Media Thionin (Acetate) C14H13N3O2S Cara Pembuatan: Sebanyak 0,1 gr Thionin dilarutkan dengan 100 ml aquades dalam tabung Erlenmeyer. Thionin 0,1% tersebut digunakan sebagai larutan stok. Untuk membuat beberapa konsentrasi Thionin dengan cara: -
TSA Thionin 1 : 25.000 dengan melarutkan 1000 ml TSA ditambahkan 40 ml Thionin 0,1%
-
TSA Thionin 1 : 50.000 dengan melarutkan 1000 ml TSA ditambahkan 20 ml Thionin 0,1%
-
TSA Thionin 1 : 100.000 dengan melarutkan 1000 ml TSA ditambahkan 10 ml Thionin 0,1% Selanjutnya masing – masing larutan media disterilisasi dengan autoclave
121 ºC, selama 15 menit. Media Thionin yang belum beku dituang ke cawan Petri sebanyak 20 ml.
64
Lampiran 6 Media Fuchin C20H20CIN3 Cara Pembuatan: Sebanyak 0,1 gr Fuchin dilarutkan dengan 100 ml aquades dalam tabung Erlenmeyer. Fuchin 0,1% tersebut digunakan sebagai larutan stok. Untuk membuat beberapa konsentrasi Fuchin dengan cara: -
TSA Fuchin 1 : 50.000 dengan melarutkan 1000 ml TSA ditambahkan 20 ml Fuchin 0,1%
-
TSA Fuchin 1 : 100.000 dengan melarutkan 1000 ml TSA ditambahkan 10 ml Fuchin 0,1% Selanjutnya masing – masing larutan media disterilisasi dengan autoclave
121 ºC, selama 15 menit. Media Fuchin yang belum beku dituang ke cawan Petri sebanyak 20 ml.
65
Lampiran 7 Pembuatan antigen Milk Ring Test (MRT)
a.
Media biakan bakteri di botol Roux 1. Sebanyak 40 g TSA dilarutkan dengan 1000 ml aquades lalu ditambahkan Bacto Agar sebanyak 5 – 6 gram/liter dan yeast ekstrak 1 - 2 g kemudian larutan dipanaskan sampai larut sempurna, pH 7,3 2. Larutan media disterilisasi dengan autoclave 121ºC, selama 15 menit. 3. Sebanyak 150 ml dimasukkan ke dalam botol Roux untuk siap digunakan.
b.
Antigen MRT 1. Isolat B. abortus S99 murni diinokulasikan pada media TSA miring, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 hari. 2. Setelah 3 hari, bakteri dari media TSA miring dipanen dengan menambahkan 5 ml larutan saline. Selanjutnya bakteri diinokulasikan pada media TSA di botol Roux. Botol Roux diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 hari. Bakteri B. abortus S99 dari botol Roux dipanen dengan memasukkan 25 ml larutan saline dan glass parel ke botol tersebut. Botol digoyang sehingga bakteri yang tumbuh pada permukaan media TSA terlepas. Suspensi bakteri yang diperoleh kemudian diinaktivasi dalam waterbath pada suhu 90°C selama 1 jam. 3. Selanjutnya suspensi disentrifugasi dengan sentrifuse pada kecepatan 4500 rpm selama 1 jam. 4. Supernatan dibuang dan pelet ditimbang. Pelet ditambah Hematoxillin sebanyak 25 kali bobot pelet sehingga terbentuk suspensi bakteri yang berwarna biru kemudian pH ditetapkan dengan pH meter sehingga pH 3,0. 5. Suspensi bakteri yang berwarna tersebut dipanaskan dalam waterbath pada suhu 70°C selama 10 menit kemudian didiamkan pada suhu kamar selama 2 hari. 6. Suspensi disentrifugasi dengan sentrifuse pada kecepatan 4500 rpm selama 1 jam. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan larutan pencuci. Ulangi sebanyak 2 kali. 7. Pelet yang diperoleh ditimbang kemudian ditambahkan 25 ml phenol 0,5% kali bobot pelet.
66
c.
Standarisasi antigen Antigen MRT dimasukkan ke dalam 4 tabung Hopkins masing-masing sebanyak 2 ml dan ditambahkan 8 ml aquades. Tabung disentrifugasi dengan sentrifuse pada kecepatan 4500 rpm selama 1 jam. Hasil dibaca menggunakan skala yang tertera pada tabung Hopkins.
d.
Uji kepekaan Sebanyak 0,03 ml antigen MRT dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah diisi susu dan bakteri B. abortus dan tabung reaksi diisi susu tanpa bakteri B. abortus. Tabung reaksi divortex agar homogeny, kemudian inkubasi di incubator pada suhu 37°C, 1 jam.
67
Lampiran 8 Pembuatan antigen Rose Bengal Test (RBT)
1. Isolat B. abortus S99 murni diinokulasikan pada media TSA miring, kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 3 hari. 2. Setelah 3 hari, bakteri dari media TSA miring dipanen dengan menambahkan 5 ml larutan saline. Selanjutnya bakteri diinokulasikan pada media TSA di botol Roux. Botol Roux diinkubasi pada suhu 37 °C selama 3 hari. Bakteri B. abortus S99 dari botol Roux dipanen dengan memasukkan 25 ml larutan saline dan glass parel ke botol tersebut. Botol digoyang sehingga bakteri yang tumbuh pada permukaan media TSA terlepas. Suspensi bakteri yang diperoleh kemudian diinaktivasi dalam waterbath pada suhu 90 °C selama 1 jam. 3. Selanjutnya suspensi disentrifugasi dengan sentrifuse pada kecepatan 4500 rpm selama 1 jam. 4. Supernatan dibuang dan pelet ditimbang. Setiap 1 g pelet ditambah 22,5 ml phenol saline dan zat warna Rose Bengal kemudian distirer selama 2 jam pada suhu 4 °C. 5. Suspensi tersebut disentrifugasi dengan sentrifuse pada kecepatan 4500 rpm selama 1 jam. 6. Supernatan dibuang dan pelet ditimbang kemudian ditambahkan pelarut Brucella Buffered Antigen (BBA). Setiap 1 g pelet diatambahkan 12 ml BBA. 7. Standarisasi dengan tabung Hopkins. Antigen RBT dimasukkan ke dalam 4 tabung Hopkins masing-masing diisi dengan 1 ml antigen dan ditambahkan 4 ml aquades. Selanjutnya tabung disentrifugasi dengan sentrifuse pada kecepatan 4500 rpm selama 1 jam. Hasil dibaca menggunakan skala yang tertera pada tabung Hopkins. 8. Uji kepekaan dilakukan dengan membandingkan antigen dengan antigen standar ANQAP Australia (uji aglutinasi serum). 9. Setelah diuji aglutinasi, antigen yang diperoleh kemudian dikemas dalam botol.
68
Lampiran 9 Pembuatan antigen Complement Fixation Test (CFT)
1. Isolat B. abortus S99 murni diinokulasikan pada media TSA miring, kemudiaan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 3 hari. 2. Setelah 3 hari, bakteri dari media TSA miring dipanen dengan menambahkan 5 ml larutan saline. Selanjutnya bakteri diinokulasikan pada media TSA di botol Roux. Botol Roux diinkubasi pada suhu 37 °C selama 3 hari. Bakteri B. abortus S99 dari botol Roux dipanen dengan memasukkan 25 ml larutan saline dan glass parel ke botol tersebut. Botol digoyang sehingga bakteri yang tumbuh pada permukaan media TSA terlepas. Suspensi bakteri yang diperoleh kemudian diinaktivasi dalam waterbath pada suhu 90 °C selama 1 jam. 3. Selanjutnya suspensi disentrifugasi dengan sentrifuse pada kecepatan 4500 rpm selama 1 jam. 4. Supernatan dibuang dan pelet ditimbang. Satu gram pelet ditambahkan 22,5 ml/g phenol saline. 5. Hasil antigen diuji dengan Serum agglutination test (SAT) 1 : 20 yang setara dengan 1 : 200 pada uji CFT. 6.
Antigen yang diperoleh kemudian dikemas dalam botol.
