K-ras proto-onkogén és TP53 szuppresszor génmutációk gyakorisága és lokalizációja colorectális daganatokban és hajas sejtes leukémiában
Készítette: König András Edwin Semmelweis Egyetem – Általános Orvostudományi Kar MTA-SOTE Molekuláris Genetikai Kutató Csoport Budapest, 2001
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék
ii
A témában megjelent dolgozatok
iv
Rövidítések
v
1.
Bevezetés
1
1.1
A malignus transzformáció onkogenetikai háttere
1
1.2
A sejtciklus és szabályozása
2
1.3
Génhibák a sejtciklus szabályozási zavaraiban
4
1.4
A ras géncsalád (N-ras, H-ras, K-ras)
5
1.5
A TP53 gén
7
2.
Célkitűzések
12
3.
Irodalmi áttekintés
12
3.1
A colorectális daganatok etiológiája, epidemiológiája
12
3.2
Hajas Sejtes Leukémia (HSL), diagnosztikus jellemzők
17
4.
5.
Anyagok és módszerek
20
4.1
Mintavételezés és szövettárolás
20
4.2
DNS izolálás
21
4.3
PCR amplifikálás
21
4.4
SSCP és ezüstfestés
25
4.5
DNS szekvenálás
27
4.6
Szekvenálási adatok számítógépes kiértékelése
29
Eredmények
31
5.1
31
A colorectális daganatokban előforduló mutációk K-ras és p53 mutációk megoszlása
5.2
p53 mutációk HSL-ban
39
42 II
6.
42
Megbeszélés 6.1.
A colorectális daganatok K-ras és p53 mutációi
6.2.
p53 mutációk HSL-ban
6.3
DNS metiláció esetleges szerepe a mutációk kialakulásában
6.4
Új megállapítások
45 47 48 49
7.
Irodalomjegyzék 61
8.
Köszönetnyilvánítás
III
A témában megjelent dolgozataink: 1. Marcsek ZL, König EA (1998): Accumulating mutations of p53 in many tumours do not arise from methylation/deamination processes, but rather from nucleotide deletions and insertions. Biol.Chemistry, 379:545-547.
IF: 3 356
2. König EA, Kusser W, Day C, Porzsolt F, Glickman BW, Messer G, Schmid M, de Chatel R,Marcsek ZL, Demeter J (2000): p53 mutations in hairy cell leukemia. Leukemia 14: 706-711.
IF: 3 562
3.König EA, Köves I, Rasinariu A, Popp RA, Kusser W, Soyonki K, Kovács A., Glickman BW, Jeney A, Marcsek ZL (2001): Alterations of K-ras and p53 mutations in colorectal cancer patients in Central Europe. Journal of Toxicology and Environmental Health, 62 (5): 333-347.
IF: 0 525
IV
Rövidítések DNS
Dezoxiribonukleinsav
A,T,G,C
bázisok, (adenin, timin, guanin, citozin)
G1,S, G2, M
a sejtciklus fázisok
R pont
resztrikciós (döntési) pont a G1-ben
CRC
’Colorectal Cancer’, vastag-és végbélrák
HSL
Hajas Sejtes Leukémia
CLL
Krónikus Limfoid Leukémia
APC
Adenomatózus Polipózis Coli
FAP
Familiáris Adenomatózus Polipózis
DCC
’Deleted in Colon Cancer’ – tumor szuppresszor gén
CDK
Ciklin-Dependens Kináz
K-ras
’Kirsten’-ras proto-onkogén
Ras
Ras fehérje
TP53
p53 tumor szupresszor gén
pRB
a ’retinoblasztoma gén’ terméke, regulátor 1054 Da foszfoprotein
PCR
’Polymerase Chain Reaction’
Primer
egyszálú DNS oligonukleotid
SSCP
’Single Strand Conformational Polimorphism’ – Egyszálú DNS Konformációs Polimorfizmus
Wt
vad típusú (wild-type)
Ins
nukleotid inszerció
Del
nukleotid deléció
Tvs
transzverzió
T
tranzíció
St
’stop’-kodon
NK
’Natural Killer’
IFN
Interferon
WHO
World Health Organisation
ASR E
korspecifikus ráta, Európa
ASR W
korspecifikus ráta, Világ
CpG
C G dinukleotid
mC
5 metil citozin
Mtase
DNS metiltranszferáz
V
1.
Bevezetés
1.1
A malignus transzformáció onkogenetikai háttere Napjainkban,
széles
körben
elfogadott,
hogy a daganatos betegségeket a
kulcsfontosságú szabályozó gének szerkezeti, működési változásai idézik elő. A szabályozó gének felfedezése óta több mint 30 év telt el (Sutton, 1965), ez idő alatt tanúi lehettünk annak a jelentős és látványos haladásnak, ami a malignus folyamatok molekuláris hátterének feltárásában történt. A molekuláris biológia és a sejtbiológia fejlődése lehetővé tette, hogy megértsük e gének normális működését, megismerjük a sejtek szabályozási folyamatait. A normális működés megismerése vezetett el e szabályozó gének különböző mutációinak feltárásához, melyek a malignus átalakulás (transzformáció) kiindulópontjaként tekinthetők (Fahy és Bold, 1998). A többsejtű élőlények (ép) szöveteiben az egyedi sejtek, külső és belső tényezőknek köszönhetően, szigorú sokszintű kontroll alatt állnak a szöveti funkciók és az osztódási homeosztázis fenntartása érdekében. A malignus transzformáció folyamata során a megváltozott sejt fokozottan teret nyer, a szöveten belül ’aszociális polgárrá’ fejlődve, normális szabályzását elvesztve, szinte kontroll nélkül kezd szaporodni, terjeszkedni a körülvevő ép sejtek
rovására, sőt, később akár más szervekben is áttéteket képez
(metasztázis) (Porter Jr. és mtsai, 1998). A legtöbb malignus folyamatban a létrejött daganatos sejtek, a normális szöveti sejtektől eltérően, szabályozatlanul osztódnak, sokszor figyelmen kívül hagyva a szaporodásukat szabályozó intra- és extracelluláris növekedési jeleket. Az is egyértelművé vált, hogy a sejtállomány növekedését, a tumor kialakulását és terjedését nem csak a sejtosztódás határozza meg, hanem a sejtpusztulás, (apoptozis) csökkenése is, amely szintén kulcsfontosságú folyamat a szövetállomány tömegének fenntartásában (Evertsson és mtsai, 1999), tehát a daganattömeg növekedése a két folyamat egyidejű haladásának köszönhető.
1
1.2
A sejtciklus és szabályozása
A sejt osztódását a sejtciklus-modell írja le (1. és 2. ábra).
2
Egyre több adat áll rendelkezésünkre a sejtciklus szabályozásának legfontosabb mechanizmusairól, a különböző fázisokban lévő sejtek tovahaladásáról a mitózis felé (1.ábra), (Baserga, és mtsai, 1985, Nurse, 1994, Sherr, 1994). A jelenleg elfogadott sejtciklus-modell szerint a sejtciklus különböző fázisainak szabályozása az ú.n. (check-point) „ellenőrző pontokon” keresztül történik (Nurse, 1994). A sejtciklusban résztvevő ’főszereplők’ a ciklinek, a ciklin-dependens kinázok (CDK), a CDK-inhibitorok (CKI), az őket szabályozó fehérjék és transzkripciós faktorok. A legtöbb proto-onkogén és tumor szuppresszor gén termékei közvetlenül összefüggésben állnak és hatnak a különböző biokémiai utakra, amelyek a növekedési jelátviteli kaszkádot alkotják és így a sejtciklus progressziójának szabályozásában is aktívan részt vesznek. Több megfigyelés arra utal, hogy a pRb foszforiláció a ciklin/CDK komplexek által meghatározó esemény a sejtciklus G1 fázisának progressziójában. Ezt követően a sejtek elkötelezik magukat a sejtosztódásra, függetlenül a növekedési faktorok jelenlététől (Sherr, 1994). Ahhoz, hogy a sejt túljusson e ponton és belépjen az S fázisba, a növekedés jelátviteli kaszkádjának következményeként - amely a sejtfelülettől a nukleuszig hat - megemelkedik a D-típusú ciklinek szintje (korai G1-ben) és az E ciklineké is (késői G1-ben). Egyes tanulmányok arra is rávilágítottak, hogy a K-ras génnek is fontos szerepe van mind a pozitív mind a negatív sejtszabályozási pályákban (Fan, Bertino, 1997). Feltételezhetően a G1-es progressziót a ciklinD/CDK4/6 komplex szabályozza, miközben a G1-S tranzíció a ciklinE/CDK2 komplex által szabályozott (2. ábra). Ezzel szemben különböző CDK gátlók is fontos szerepet játszanak a sejtciklus G1-es progressziójának gátlásában (Weinberg, 1991, Cordon Cardo, 1995). Ezek közül a legfontosabbak a p15, p16, p21 és a p27. A tumor sejtpopuláció növekedésében három, a sejtciklust is érintő mechanizmus játszik szerepet: 1.) a sejtek nem hagyák el a sejtciklust az R ponton, ciklusban maradnak, 2.) a proliferáció-szabályozás mechanizmusai sérülnek, a repair nem teljes, halmozódnak a génhibák, 3.) csökken az apoptotikus sejtek száma. A legtöbb emberi daganatnál mind a három mechanizmusnak fontos szerepe van a tumor növekedésének szabályozásában, ami kritikus paraméter a tumor biológiai agresszivitásának az eldöntésében (Baserga R, 1985).
3
Mindazok a mutációk, melyeknek meghatározó szerepük van a sejt életében, a sejtciklusra is hatnak, és befolyásolják a sejtosztódást. Bár a daganatos sejtnek igen sok rendellenes tulajdonsága van, talán a legjelentősebbnek az tartható, hogy a sejt elveszíti az osztódás-szabályozó képességét és malignus transzformáción megy keresztül. 1.3
Génhibák a sejtciklus szabályozási zavaraiban A malignus folyamatok kialakulásában szerepet játszó kulcsfontosságú géneket három
fő csoportra oszthatjuk. Ezek a proto-onkogének, a szuppresszor gének és a DNS repair gének. A proto-onkogének aktiváló mutációi közül - melyeknek szerepük lehet a malignus folyamatok létrejöttében - főképp az amplifikáció, minor pontmutáciok, transzlokációk játszanak fontos szerepet. Tekintettel a proliferációt aktiváló hatásukra, az onkogének esetében általában elég, ha az egyik allél károsodik, mivel ezekben a génekben a mutációk általában dominánsak. Az ellenpólust a tumor szuppresszor gének képviselik, melyek replikácios őrként ellenőrzik a sejtciklust. Normális körülmények között, G1 fázisban leállítják a sejtosztódást, de később is, amennyiben a génállományban károsodás jött létre. Ennek a funkciónak az elvesztése – amelyhez legtöbb esetben mindkét allél inaktivációja szükséges - egyrészt genetikai instabilitáshoz vezet, másrészt, az osztódás-szabályozás felbomlásán keresztül a malignus-transzformációhoz. Mutációk szempontjából igen jellegzetesek a kis deléciók, mindkét alléljüknek sérülniük kell ahhoz, hogy funkcióvesztés jöjjön létre. A 70-es években fedezték fel a harmadik csoportba tartozó géneket, a DNS repair géneket, amelyeknek fontos szerepük van a mutációk kijavításában. Szerepük a DNS károsodás kijavításában van, funkcióvesztésük esetén, felhalmozódnak a hibák a DNS állományban, ezen belül a proto-onkogénekben és a tumor szuppresszor génekben (Gryfe, és mtsai, 1997). A malignus folyamat kiteljesedéséhez azonban nem elegendő egy-két gén károsodása, érintsen akár proto-onkogéneket, szuppresszor géneket vagy DNS repair géneket, a daganat kialakulásának folyamatában mindenképpen a többlépcsős károsodás eredménye, több genetikai változás együtthatása szükséges. E többlépcsős átalakulás részleteiben is jól tanulmányozott példája a vastagbélrák, amely szövettanilag jól elkülöníthető elváltozások fokozatain keresztül jön létre: a praemalignus állapottól, - a vastagbélhám dysplasiától – az adenomatosus polypuson át a valódi carcinoma kialakulásáig (Vogelstein, és mtsai, 1988, Shaw, és mtsai, 1991, Kristóf, Újszászy L, 1994, Ronchetto, 1998, Sebai H, és mtsai, 1998). 4
Már korábbi tanulmányokban is felfigyeltek arra a tényre, hogy a korai adenomában vannak olyan léziók, amelyekben az APC gén inaktiválódik (Norheim, és mtsai, 1999). Feltételezhetően, ezen szuppresszor gén károsodása a colorectális daganatok korai stádiumaiban már sok esetben jelen van, károsodási markerként történő kimutatása későbbi malignizálódási hajlamra utal. Ezen gén örökített mutációja található a familiáris polyposis (FAP) betegekben is. Későbbi stádiumban az adenomák több mint felében újabb gének mutációi következnek be, köztük elsőként a K-ras onkogén mutációja, ami a sejtet tovább viszi a malignus transzformáció irányába. Párhuzamosan, de egy későbbi mutációs eseményként egy igen fontos szuppresszor gén károsodása, illetve inaktiválódása is megfigyelhető, a TP53-é (Greenblatt, és mtsai, 1994), - e gén terméke - a p53 fehérje, a már jól ismert sejtciklus G1 restrikciós pont szabályozásában vesz részt. A p53 molekulának több fontos szerepe van a sejtben. Amennyiben bármilyen károsodás éri a DNS-t, azonnal leállítja a sejtciklus progresszióját a G1-S ’check-point’-nál, időt adva a sejt repair apparátusának arra, hogy megkísérelje a hiba kijavítását. Amennyiben a hiba kijavítása nem lehetséges, a p53 beindítja a programozott sejthalált (apoptózist). A colorectális daganatok mutációs kaszkádja további elemeket is tartalmaz, köztük említhető a 18-as kromoszómán található DCC (Deleted in Colon Cancer) tumor szuppresszor gén, és a DNS metiláció változása. 1.4
A Ras géncsalád (N-ras, H-ras, K-ras) A ras géncsalád N-ras, H-ras, K-ras mutációi számos tumorban megtalálhatók. Az N-
ras mutációi az idegrendszeri tumorokban és leukémiákban, a H-ras mutációk főként a hólyagrákban gyakoriak, míg a K-ras megváltozása az emésztőrendszeri daganatokban a leggyakoribb - vastagbélben, gyomorban, pancreasban - de tüdő-tumorokban sem ritkák. (Bos, 1988). 3.ábra. Ras (N-,H-,K-) gének szerepe onkogenitási folyamatokban RAS gének
Fehérjék:
N-Ras, H-Ras, KA-Ras, KB-Ras
Aktivált Formában
-sejt transzformáció -daganat növekedés -apoptózis inhibíció -angiogenezis -VEGF over-expresszió
5
Az N-ras az 1-es kromoszómán található, a H-ras gén a 11-es kromoszómán lokalizálódik, míg a K-ras a 12-es kromoszómán helyezkedik el. Mind a három gén 4 exont tartalmaz, amelyek 21 kD tömegű, szerkezetileg nagyon hasonló és funkcionálisan homológ proteineket kódolnak. A K-rasnak két különböző negyedik exonja van, melyekről külön-külön íródik át a két különböző mRNS, az ezekről létrejött fehérjék azonban csak a carboxy terminális aminosavban különböznek. A ras mutációk gyakoriságát illetően, az irodalom javarésze az egyes és ritkábban a kettes exont említi, ezen belül a 11, 12, 59, 61-es kodonok mutációs megváltozását tárgyalja, amely az érintett sejt hiperaktiváláshoz vagy szabályozhatóságának elvesztéséhez vezet. A K-ras mutációk klinikai jelentősége a vastagbél carcinomák kialakulásában valamint e mutációk prognosztikus fontossága egyértelmű (Benhattar, és mtsai, 1993, Finkelstein és mtsai, 1993, Beranek, és mtsai, 1999). A ras által kódolt protein funkcionális vizsgálata során megállapították, hogy a protein a sejtmembrán belső felületéhez kötődik, a lipid réteghez történő kitapadását a polipeptid lánc C-terminális részhez kovalens kötésben lévő palmitinsav biztosítja (Willingham MC, és mtsai, 1980; Buss JE, Sefton BM, 1986). A Ras protein nagy affinitással köti meg a GTP-t és a GDP-t (Tamanoi, és mtsai, 1984) és GTP-ase aktivitással bír (Manne V, és mtsai, 1985). A “ras géncsalád” tagjai az adott nomenklatúra szerinti kis G-proteineket kódolják, amelyek a mitotikus jeltovábbításban játszanak kulcsszerepet. A jelátviteli kaszkád a membránhoz kötött receptoroktól a MAP/MEK kinázokon keresztül a sejtmagig történik (Gilman, 1984). A ras géncsaládra jellemző aktiváló pontmutáció fokozott aktivitást eredményez. A sejtben a normális Ras fehérje jelátvivőként működik, az osztódást stimuláló jel hatására a Ras fehérje GTP nukleotid kötésével aktiválódik. Amennyiben a ras génben mutáció jön létre, megszűnik a GTP-áz aktivitás, ami azzal jár, hogy a mitotikus szignálláncot szabályozó jel folyamatosan “bekapcsolt” állapotban marad. A GTP-áz aktivitás elvesztése végső soron folyamatos proliferációt serkentő jelátvitelhez vezet, így a proto-onkogén "onkogénné" válik.
6
1.5
A TP53 gén A TP53 tumor szuppresszor gén a humán 17-es kromoszóma rövid karján helyezkedik
el, a 17p13.1 régióban. Egyike a legátfogóbban tanulmányozott géneknek, mivel kulcsszerepet tölt be alapvető celluláris folyamatokban és mutációit sokféle daganattípusban kimutatták. A p53 a humán tumorokban egyike a leggyakrabban mutációt szenvedett géneknek és a módosító szomatikus zavarok majdnem kivétel nélkül pontmutációk. Annak ellenére, hogy a gén 11 exonból áll, a legsérülékenyebb exon az 5-ös, 7-es és a 8-as, amelyekben az úgynevezett mutációs ’hot-spotok’ találhatók.
7
4.ábra: TP 53 gén anatómiája / Forrás: Thierry Soussi, Lab. P53 Genotox-tumeurs, Inst. Curie, Paris, http://perso.curie.fr/Thierry.Soussi.
8
5.ábra. TP53 gén (393 aminosav hosszú lánc) gyakori mutációs ’hot-spot’ kodonjai. Az ábrán láthatók még az evolúció által konzervált részek (I, II, III, IV, V-tel jelölt régiók) és a nukleáris lokalizációs szignálok (NLS) (Moll és Scramm, 1998).
9
6 és 7 ábrák: p53 - 5, 7 exonok ’hot-spot’ kodonjai, mutációs gyakorisága különböző humán daganatokban
10
8 ábra: 8 -as exon ’hot-spot’ kodonjai, mutációs gyakorisága különböző humán daganatokban
Az eddigi irodalmi adatok alapján és a Vogelstein modellt is figyelembe véve, úgy tűnik, hogy a colorectális daganatok malignus progressziójában jól meghatározott sorrendben követik egymást a kulcsfontosságú gének mutációi (Vogelstein, és mtsai, 1988, Carethers, 1996). Ép (N) szövet à (metiláció-demetiláció) à APC à K-ras à DCC à p53 à carcinoma
Rendszerint a tumor szuppresszor gének mindkét alléljének károsodnia kell ahhoz, hogy a sejtnövekedés szabályozásában zavar keletkezzen vagy a későbbiekben a károsodás a fenotípusban megjelenjen. Az onkogéneknél ezzel szemben az egyik allél aktiváló mutációja is elegendő a daganatos fenotípus manifesztációjához. Azonban a vastagbél daganatoknál nem csak egyfajta tumor szuppreszor gén vagy onkogén károsodik, hanem ezek károsodása rendszerint halmozottan fordul elő (Losi, és mtsai, 1996). A p53 tumorok keletkezésben játszott szerepének genetikája eltér a legtöbb tumor szuppreszor génnél tapasztaltaktól. Míg az Rb gén esetében egyetlen mutáns allél fenotípusosan “csendes”(recesszív), klinikailag még nem manifesztálódik, a p53 mutációja már akkor is gyakran érinti a fenotípust ha az egyik allélje még normál (wild type)-ként működik. (Marshal, 1991, Michalovitz, és mtsai, 1991 Weinberg, 1991).
11
2.
Célkitűzések A colorectális daganatok magas és emelkedő előfordulása, a ’ hajas sejtes’ leukémia
ritka előfordulása és még alig elemzett molekuláris háttere indokolta számunkra, hogy: 1.) Megvizsgáljuk a K-ras és p53 gének mutációinak helyét és gyakoriságát 65 Kárpát medencei beteg, sebészileg eltávolított, colorectális carcinomájában. A vizsgálati eredményeket kívántuk összehasonlítani a nemzetközi tapasztalatokkal. 2.) Meghatározzuk a p53 gén mutációs gyakoriságát és lokalizációját 61 hajas sejtes beteg véréből nyert DNS mintákban. 3.) Megállapítsuk, hogy a metil cytozin deamnináció/metilációja, vagy pontmutáció (nukleotid deléció és inszerció) áll-e malignítások hátterében.
3.
Irodalmi áttekintés
3.1
A colorectális daganatok etiológiája, epidemiológiája A colorectális rák világszerte egyike a vezető daganatos megbetegedéseknek,
előfordulása ugrásszerűen megnövekedett az utóbbi években, a fejlett országokban is. Bár öröklött formáinak, családi halmozódásuknak igen jelentős szerepük van, a sporadikus, ’de novo’ formák egyre jelentősebb számban jelennek meg. Az öröklött formák genetikai rizikó- tényezői jelentős szerepet játszanak a colorectális daganatok kialakulásában, főként közeli rokonsági körben. A betegség kialakulása, örökletes háttér esetén, fiatalabb korban kezdődik. Ide sorolható a familiáris adenomatózus polipózis (FAP), amely az összes colorectális daganatnak kb.1%-át teszi ki, és az öröklött nempolipózisos vastagbél daganatok (HNCC), melyeknek előfordulási összgyakorisága kb. 3%. A többi vastagbél daganat kialakulásában -, mai ismereteink szerint, az esetleges további genetikai kockázati tényezők, mint pl. a carcinogéneket metabolizáló enzimek polimorfizmusa, - mellett fontos szerepet játszanak a táplálkozási és környezeti (kölcsön)hatások. A genetikai mechanizmusok ismeretében a profilaktikus és terápiás javaslatok is hatékonyabbak lesznek (Bonaiti-Pellie, 1999). Magyarországon a vastagbél daganatok okozta mortalitás a KSH adatai szerint az elmúlt 20 esztendőben emelkedett. (lásd I Táblázat) 12
I Táblázat Colorectális daganatokban elhunytak számának emelkedése 1979-1998 között Magyarország Férfiak
Nők
Halálozások Populáció
Ráta
ASR(W)
Halálozások
Populáció
Ráta
ASR(W)
1979
894
5189200
17.2
12.2
1065
5510100
19.3
10.2
1980
867
5188400
16.7
11.8
1074
5522700
19.4
9.9
1981
924
5186300
17.8
12.4
1081
5525500
19.6
9.8
1982
902
5180400
17.4
12.3
1197
5524700
21.7
11.2
1983
965
5170300
18.7
13.2
1134
5519200
20.5
10.2
1984
959
5156400
18.6
13.1
1150
5511700
20.9
10.3
1985
941
5143700
18.3
12.8
1203
5505000
21.9
10.5
1986
1035
5132400
20.2
14.3
1187
5498200
21.6
10.4
1987
1101
5121400
21.5
14.9
1279
5491300
23.3
11.2
1988
1079
5111500
21.1
14.8
1290
5485000
23.5
11.1
1989
1187
5100100
23.3
16.3
1279
5477800
23.3
10.9
1990
1195
4978500
24.0
16.4
1320
5386300
24.5
11.4
1991
1275
4966400
25.7
17.6
1356
5379700
25.2
11.7
1992
1297
4952000
26.2
17.8
1397
5371700
26.0
11.9
1993
1226
4933200
24.9
17.1
1416
5360400
26.4
11.9
1994
1321
4913300
26.9
18.1
1438
5348000
26.9
12.2
1995
1316
4893800
26.9
18.1
1425
5335200
26.7
12.2
1996
1357
4873600
27.8
18.5
1459
5319800
27.4
12.0
1997
1411
4852600
29.1
19.3
1481
5302300
27.9
12.3
1998
1413
4829700
29.3
19.4
1500
5283800
28.4
12.3
Ráta: Nyers ráta per 100, 000 ASR(W): Kor Standardizált Ráta (Világ populációban) per 100, 000
Az I. Táblázat adatai szerint, a colorectális daganatok gyakorisága az elmúlt 20 esztendőben emelkedett Magyarországon, és jelentősen meghaladja a föld többi országainak átlag eseteit (ASR-W). Mai álláspont szerint genetikai és környezeti tényezők egyaránt szerepet játszanak a vastagbél daganatok kialakulásában (Johnson, és mtsai, 1987). A genetikailag öröklött háttér igen nagy fontosságú a különböző vastagbél rendellenességek létrejöttében (Correa, Raenszel, 1978). A colondaganatra hajlamosító kórképek közül kiemelendő a Megacolon congenitum (Hirschprung-kór), amely autszomálisan, de nemhez kötötten öröklődik (a betegek kb. 80%a fiú), előfordulási gyakorisága 1: 5000 újszülöttre. Mivel e kórképben szenvedőknél a colon distális részén lévő plexus myentericus (Auerbach) hiányzik, a vastagbél ürülése csökkent. Enyhébb esetekben a kezelés lényege a bél mozgásának fokozása, míg súlyosabb esetekben a sebészi megoldás célravezető.
13
A polipózis szindrómák közül a Familiáris Adenomatózus Polipózis (FAP) bír jelentőséggel, mivel hajlamosít colon daganatokra, de előfordulása szerencsére ritka. Autoszomális domináns öröklődésű, amely a vastagbél egész hosszára kiterjedhet (Ichii, és mtsai, 1993). Előfordulhat, hogy a polipok száma, leggyakrabban a tubuláris adenóma esetében meghaladja az 1000-t. A FAP variánsai közé tartozó Gardner-szindrómában az érintett gén: az APC – (5q21-q22), amely a multiplex vastagbél és duodenális adenomatózus polipózis mellett, továbbá jóindúlatú kötőszöveti daganatokra, (pl. lipómák, fibrómák, sebaceus ciszták, oszteómákra) is hajlamosít. A Turcot-szindrómában (érintett gének: hMLH1 – 3p21.3, hMSH2 – 2p21-p22, APC – 5q21-q22) a vastagbél daganatai mellett még központi idegrendszeri daganatok is kialakulnak (astrocytoma, glioma, medulloblastoma). A ’Herediter flat adenoma szindróma’ (HFAS) kialakulásáért az 5-ös kromoszóma hosszú karján lévő HFAS lókusz felelős. Jellemzői a 10 mm körüli adenómák, melyekben gyakori a diszplázia, és a malignizálódás is előfordul. Ezekre az esetekre jellemző a daganat korai inváziója. A FAP-hoz hasonlóan, a kórképben multiplex vastagbél, illetve vékonybél daganat alakul ki. A Peutz-Jeghers-szindróma öröklődési módja autoszomális domináns A betegség kialakulásának hátterében álló gén lokalizációja az STK11 (19p13.3). Jellemző rá a vékony és vastagbél multiplex polipoid hamartómája, mely a bőr és nyálkahártyák sötét foltos (pigmentált) elváltozásával társul. Itt a polipok döntően a vékonybélben találhatók. Ezeknek a polipoknak a malignizálodási kockázata csekély, de a betegek rendszeres utóvizsgálata indokolt (Jeghers és mtsai, 1949). A másik autoszomális dominánsan öröklődő betegség a Herediter nonpolyposis colorectalis carcinoma (HNPCC), mely a vastagbél daganatok 6-15%-át alkotja. Molekuláris hátterében a DNS repair gének, hMSH2 – (2p21-p22), hMLH1 – (3p21.3), hPMS1 – (2q31q33), hPMS2 – (7p22) elvesztése, károsodása áll. Szövettanilag alacsonyan differenciált mucinosus karcinómaként jellemezhető. Formái a Lynch I, Lynch II “cancer family” szindróma, illetve variánsa, a Muir-Torre-szindróma. Míg Lynch I-ben a tumor a vastagbélre korlátozódik, Lynch II-ben primér, a bélrendszeren kívüli daganatok is megjelennek (Lynch, 1996-1999). Családon belüli halmozódásról akkor beszélhetünk (familiáris vastagbélrák), ha a vastagbél-daganatos beteg legalább egy elsőfokú rokonánál a korábbiakban e kórképet kimutatták. Ilyen betegekben, illetve családtagjaikban gyakrabban fordulnak elő adenómák. Családi halmozódás esetén 35-40 éves életkor után az ismételt szűrővizsgálatok elvégzése feltétlenül indokolt (Kristóf, Újszászy, 1994). 14
Azon esetek száma is igen jelentős, ahol a vastagbél daganat ’de novo’ jelenik meg. Érdemes röviden kitérnünk olyan elősegítő tényezőkre, amelyek szerepet játszhatnak a colorectális malignitás létrejöttében. Egyes szerzők szerint a különböző étkezési szokásoknak igen jelentős szerepe van a vastagbél daganatok kialakulásában (Jessup, és mtsai, 1996, Kampman, és mtsai, 2000). A vastagbél tumorok kialakulását elősegíti az alacsony növényirost tartalmú táplálék rendszeres fogyasztása. Ezáltal lelassul a különböző komponensek (toxinok) bélen keresztüli vándorlása, melynek következményeként “több idő jut” a bél ’toxikus expozíciójára’, a karcinogének metabolikus képződésére, felhalmozódására és a bélfal hámsejtjeivel történő reakciójára. Már korábban is felfigyeltek arra, hogy azokon a területeken, ahol jellemző a zsírban gazdag tápanyagfogyasztás, nagyobb arányban fordulnak elő vastagbél tumorok (Burkitt, 1984, DeVita Jr, és mtsai, 1982). Ennek az lehet a magyarázata, hogy a zsír metabolizmusa a bélben együtt jár különböző savak és szteroidok, illetve metabolitjaik képződésével, amelyek között a különböző karcinogén ágensek fordulhatnak elő (Kaibara és mtsai, 1984). Szintén régóta ismert, hogy a nyugat-európai táplálkozási szokások előnyben részesítik annak, a főleg anaerob baktérium flórának az elterjedését (Clostridium paraputrificum), amely képes az epesavat karcinogén hatású vegyületekké alakítani (DeVita Jr, 1982). Hatásukra az epesavak, amelyek folyamatosan jelen vannak a gastrointestinális traktusban, a vastagbél sejtekben carcinogenezis során – in vivo – tumor promoterekké válhatnak, in vitro pedig növelik a sejt transzformációs képességét (Kaibara, és mtsai, 1984). Az epesavak stimulálják a vastagbél epitélium proliferációját. Mindezen toxinok ürítése felgyorsul és a genotoxikus hatás lényegesen csökken, amennyiben a táplálék rostos elemekben gazdagabb. Újabb kutatások arra is rávilágítanak, hogy az állati fehérjében gazdag táplálék fogyasztása specifikusan képes károsítani a K-ras gén aktivátor régiót (Kampman, és mtsai, 2000). Ugyanakkor az antioxidánsok és nyomelemek hiánya is közreműködik a DNS károsodásában, illetve a létrejött hibák fennmaradásában (Ames, 1999). A colorectális carcinómák hagyományos hisztopatológiai vizsgálata során azt lehet tapasztalni, hogy gyakran az azonos patológiai stádiumú esetek kórlefolyásai eltérőek lehetnek, hátterében a daganatképzés különböző mechanizmusa tételezhető fel. A colorectális adenómák és carcinómák genetikai vizsgálata során fény derült arra, hogy mind a daganatok iniciációjáért, mind a progressziójáért különböző onkogének aktiváló mutációja és amplifikációja, illetve tumor szuppresszor gének deléciója vagy mutációs inaktivációja, és nem utolsósorban, a DNS repair gének funkció-vesztése felelős. 15
A Dukes féle osztályozást követve (Dukes, 1932) sok tanulmány irányult arra, hogy megbízható prognosztikus paramétereket találjon a colorectális daganatok vizsgálatára (Finkelstein és mtsai, 1993, Morrin és mtsai, 1994, Naoyuki és mtsai, 1995). Bár a hagyományos hisztopatológiai vizsgálatok kimutatják a szöveten belüli kóros folyamatokat, de már kevésbé alkalmasak a progresszió előrejelzésére. Az eddig alkalmazott molekuláris vizsgálatokkal fény derült sok olyan összehangolt molekuláris szabályozó működésre, amely eldönti sejtjeink sorsát (Grander, 1998). Colorectális daganatok vizsgálata során először a FAP (familiaris adenomatosus polyposis) vagy más néven az APC (adenomatous polyposis coli) gén vált ismertté az 5q21-22 kromoszóma lokuszon (Bodmer, és mtsai, 1987). A FAP gén citogenetikailag igazolható deléciója, a heterozigótaság elvesztése (LOH) az invazív colorectális carcinomák kb. 20-25%-ban mutatható ki (Bruce, 1987). Kiemeljük, hogy az 5q21-22 kromoszómán lokalizált APC gén inaktiválása az egyik legfontosabb lépés a vastagbélrák öröklött formájának kialakulásában (Lindblom, és mtsai, 1993). A karcinogenezis molekuláris folyamatában lépésről lépésre különböző onkogének aktiválódnak – a vastagbél daganatokban főképpen a ras családhoz tartozó K-ras gén a (12p12.1) majd ezt követik a tumor szuppreszorok; a 17p13 anti-proliferációs illetve proapoptotikus TP53-as gén és a 18q21.3 DCC (Deleted in Colon Cancer) gén, a kromoszómákon kialakult deléciók, allélvesztések és inaktiváló mutációk révén. Ma már jól ismert, hogy a vastagbél karcinómák 40-50%-a K-ras mutációt hordoz e gén valamelyik alléljében. A K-ras gén mutációi leggyakrabban a 12, 13, 59 és 61-es kodonokat érintik (Benhattar, és mtsai, 1993, Zhang, és mtsai, 1998, Chiang, 1998), ezen belül leggyakrabban a 12-es kodon pontmutációja, a GGT-GAT tranzíció, a 13 kodonnál pedig a GGC-GAC bázis-csere figyelhető meg. Számos tanulmány vizsgálta a ras gén mutációinak prognosztikus jelentőségét, a pontmutáció által létrejött onkogenitást. A K-ras gén 1-es exonjának a 12, 13-as kodonjai a vastag- és végbélben elhelyezkedő daganatok 50-70%-ban mutációt szenved. E tanulmányok egy része arra utal, hogy amennyiben a mutáció a 12-es kodon második bázisában jön létre, akkor a tumorsejtek invazívabbak, de ez a korreláció még nem egyértelműen bizonyított (Beranek és mtsai, 1999, Chiang, 1998, Pricolo és mtsai, 1996).
16
3.2
Hajas Sejtes Leukémia (HSL), diagnosztikus jellemzők A leukémiás kórképen belül, a hajas sejtes leukémia (HSL) - ritkasága ellenére -
kiemelkedő fontosságú lymphoproliferatív kórkép. A mérsékelt malignitású non-Hodgkinlymphomák csoportjában az első olyan betegség, amely meglehetősen jól gyógyítható. A HSL sejtjeire jellemzők a citoplazmatikus nyúlványok, melyekről 1966-ban jellegzetes nevüket is kapták. Schrek és Donelly a kóros sejtek citoplazmatikus nyúlványait “hajas” sejtekként írták le (Schrek, Donelly, 1966). 9. ábra. ’Hajas Sejtes’ fehérvérsejtek jellenléte egy HSL-es kórképben
A hajas (szőrös) sejtes leukémiát (HSL)-t, mint önálló entitást 1958-ban “leukémiás retikuloendoteliázis” néven Bertha Bouroncle ismertette (Bouroncle, és mtsai, 1958). A betegség a mérsékelt malignitású (indolens) non-Hodgkin limfómák közé tartozik, a REAL-és a WHO felosztás szerint perifériás B-sejtes limfóma. Típusos esetben a diagnózis a szplenomegalia, pancitopenia, valamint a perifériás kenetben, a csontvelőben látható jellegzetes nyúlványos ún. szőrös vagy hajas sejtek alapján lehetséges. Jellemző a perifériás lymphadenomegalia hiánya, a granulocitopenia és a monocitopenia. Mindössze az esetek 8-10%-a jár leukémiás vérképpel. 17
10. ábra. Egy tipikus hajas fehérvérsejt elektronmikroszkópos felvétele
A HSL egy ritka limfoproliferatív betegség, előfordulása a felnőttkori leukémiák között kb. 2%. A malignus Lymphoma Referencia Centrum adata szerint az 1970-es évek végén hazánkban az össz-leukémiák 0. 7-1% tette ki (Várbíró, Kelényi, 1981). Az első hazai közlés 1978-ból származik (Bach, és mtsai, 1978). A becsült hazai incidencia évente 2 új diagnosztizált beteg egy millió lakosra. A folyamat az esetek döntő többségében B-sejtes eredetű. A típusos HSL B-sejtes eredetének legfőbb bizonyítéka az immunglobulin gén átrendeződésének kimutatása volt (Korsmeyer, és mtsai, 1983). A kóros sejtek azonban monocita-makrofág tulajdonságot is hordoznak. Ritkán, kevesebb mint 15 esetben T sejtes illetve hibrid B-T fenotípusú folyamatot is leírtak. A hajas sejtek érettségi fokukat tekintve a krónikus limfoid leukémia (CLL) és a myeloma multiplex sejtjei között foglalnak helyet. A genetikai tényezők szerepe a CLL-ben régóta ismert, HSL-ben viszont csak néhány esetben mutattak ki családi halmozódást. Típusos esetben a diagnózis splenomegalia, pancytopenia valamint a vérkenetben látható nyúlványos ún. szőrös vagy hajas sejtek (1,2 ábra) alapján lehetséges. A betegek átlagos életkora a diagnózis időpontjában 60±15 év. A férfi: nő arány 4: 1 körüli. A HSL-ben szenvedő betegek fokozott fertőzési hajlamát a monocitopénia és a granulocitopénia mellett a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek csökkent természetes ölőképességével, az ún. NK (natural killer) sejtek csökkent aktivitásával lehet magyarázni (Ruco LP, és mtsai, 1983). A HSL miatt kezelt betegek halálának oka az esetek kb. 60%-ban 18
infekció. A bakteriális fertőzések mellett gombás és atípusos mycobacteriális infekciók is előfordulhatnak. A HSL kezelésében az elmúlt évtizedben óriási fejlődést tapasztalhattunk. Korábban a szplenektómia volt a számos különböző kezelési próbálkozás közül a legeredményesebb, a műtéten átesettek túlélése a legátfogóbb tanulmányok szerint is szignifikánsan jobb volt, mint a nem műtötteké (Jansen, Hermans, 1981). A lép, amely a HSL feltételezett kiindulási helye, a hajas sejtek proliferációjának fő színhelye is. A lép eltávolítása megszünteti a perifériás vérsejtek fokozott raktározását, illetve pusztulását a lépben. Mára a kezelési stratégia is bővűlt, és tudjuk, hogy a több kezelési lehetőség közül az interferon (IFN) kezelés hatására például a kialakuló remisszió a legtöbb esetben csak részleges, és azt - esetleg csak évek múlva – progresszió követi. Már az 1990-es évek elején kiderült, hogy a citosztatikumok közül a purin-nukleozid analógok hatásossága meghaladja az interferonét. Mind a pentostatin, mind a cladribin kezelést évekig tartó komplett remisszió követi az esetek többségében. Így a HSL-ben szenvedő betegekben a szplenektómia indikációja beszűkült (Demeter, és mtsai, 1999). A kezelési lehetőségek bővülésével jelentősen javult a betegek prognózisa. A nukleozid analóg kezelés bevezetése előtt az átlagos túlélési idő kb. 50 hónap volt. Mostanra a várható túlélés meghosszabbodott, bár meg kell említeni, hogy ugyanakkor a betegek egy része még az interferon és nukleozid analóg kezelés bevezetése előtt is több mind 30 évvel élte túl a diagnózist (Bouroncle, 1994). A relapszusmentes túlélés, pentostatin kezelés után 8 évvel, 70% feletti (Flinn, 1997). Ma már egyre több genetikai vizsgálat irányul a hematológiai malignitások hátterének vizsgálatára. Ezek közül például non-Hodgkin lymphomákban kimutatták, hogy a p53 mutációk általában a kór progressziójával társulnak, vagy egy esetleges második tumor kialakulásának alapját képzik, gyakran a helytelen gyógyszerkezelésre adott válaszként jelentkezik (Greiner, és mtsai, 1996, Hernandez, és mtsai, 1996, Ichikawa és mtsai, 1997).A HSL-betegek p53 mutációs vizsgálatára ez idáig csak kevés esetben került sor (Vallinatou és mtsai, 1998). Mivel a HSL az IFN, illetve purin-nukleozid analóg kezelésre reagál jól, a betegség molekuláris jellemzőinek megismerése igen fontos.
19
4.
Anyagok és módszerek
4.1
Mintavételezés és szövettárolás A colorectális anyagok vizsgálatára a betegből sebészileg eltávolított tumorból és a
körülötte elhelyezkedő ép szövetből származó mintákat dolgoztuk fel. A mintákat, az eltávolítást követően, azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és a későbbi feldolgozásig -80oC-on mélyhűtve tároltuk. A feldolgozott colorectális szöveteket több sebészeti osztályról, a SOTE I. és II. számú. Sebészeti Klinikáiról, az Országos Onkológiai Intézet Sebészeti Osztályáról és a Kolozsvári Onkológiai Intézetből (Institutul Oncologic, Cluj-Napoca) kaptuk. Ezúttal is köszönetet kívánok mondani a fent említett intézetekből származó patológiai diagnózis és Dukes stádiumra vonatkozó adatokért, ezen adatok rendelkezésünkre bocsátásáért. A CRC minták hisztológiai vizsgálata szerint: 65 mintából 9 volt Dukes A, 44 minta volt Dukes B, 11 minta volt Dukes C és 1 minta volt Dukes D stádiumban. A hajas sejtes leukémiás minták esetében a DNS többsége az Ulmi III. Belklinikáról, frissen gyűjtött perifériás vérből származik, bár némely beteg esetében a DNS PBMNC-ből vagy a lép sejtjeiből nyertük, és -80oC-on vagy folyékony nitrogénben tartva tároltuk. Egy esetben a DNS a perifériás vérből és a lépből, míg három másik esetben a DNS csak a lépből került izolálásra. A keringő hajas sejtek aránya 41 betegnél 5% alatti, míg 7 esetben 5 és 25% közötti és 9 betegnél 25% felett volt. A K-ras és a p53 gén pontmutációinak kimutatására polimeráz láncreakción (PCR)-on alapuló vizsgálatot, az SSCP-t (Single Strand Conformation Polymorphism) alkalmaztuk. Ezt specifikusan a K-ras gén 1-es exonra terveztük, - (amely a 12, 13-as kodonokat is tartalmazza) -, megfelelő primerekkel. A módszer nem-radioaktív és viszonylag gyors eljárás. Ezzel az eljárással nagy mintaszámban többfajta tumort és normális szövetet vizsgáltunk. A PCR amplifikált DNS és az ezt követően alkalmazott SSCP vizsgálat lehetővé teszi a szomatikus sejtekben jelenlévő genetikai polimorfizmusok gyors kimutatását, valamint különböző mutációk felismerését. A PCR alkalmazása és ennek fontossága genetikai vizsgálatokban már régóta ismert (Masato, és mtsai, 1989). A K-ras allélok mutációjának kimutatása érdekében egy érzékeny és specifikus PCR alapú módszert alkalmaztunk, amely lehetővé teszi a K-ras mutáns állélek jelenlétének detektálását az 1-es exonban.
20
A módszerünkben alkalmazott PCR segítségével amplifikált DNS, és ‘nem-radioaktív SSCP’ analízisek által ugyanazon betegek kontroll és daganatos szöveteit vizsgáltuk. Ezzel az eljárással mutáns K-ras alléléket mutattunk ki különböző colon daganatokból. 4.2
DNS izolálás 65 beteg anyagából – normál és tumor szövetből - pronáz emésztést követő fenol
extrahálással izoláltunk DNS-t. Az extrakció menete a következő: 0,2-0,5 g normál és tumor szövetet cseppfolyós nitrogénben mozsárban porlasztottunk, ezt követően 5 ml lizáló pufferbe (0,2% SDS, 10mM EDTA, 25mM Tris-Cl pH 7.5-8, 50mM NaCl) kevertünk és 0.2mg/ml pronáz jelenlétében éjszakára 37oC-os termosztátba helyeztük. Másnap a mintákat háromszor extraháltuk fenollal, 1:1 arányban, lassú mozgatás, hosszú idő alatt, egyszer fenol: kloroformizoamil alkohollal, majd a DNS-t etanollal precipitáltuk. Az így kicsapódott DNS-t meghajlított steril üvegszálra feltekertük és 1 ml (10 mMTris/EDTA pH=8,0, 1mM TE-ben pH=8,0), 65 oC-on inkubáltuk 15 percig, az így feloldott DNS-t 4 o C-on tároltuk. A HSL DNS mintákat Quiagen kittel (QIAamp DNA blood kit) izoláltuk. A DNS mennyiségét és minőségét agaróz gélelektroforézissel - ethidium bromid festéssel - ellenőriztük (Maniatis és mtsai, 1982). 4.3
PCR amplifikálás Az izolált DNS mintákból két gént – a K-ras-t és a p53-t - vizsgáltunk.
K-ras A K-ras gén egy kópiában fordul elő a genomban. 1-es exonja tartalmazza a már jól ismert aktiváló mutáció, a mutációs ’hot-spot’ régiót (12, 13-as kódon). Az általunk tervezett PCR amplifikátum tartalmazza a két (forward és reverse) primerközt amplifikált kodonokat.
21
Szerkezeti vizsgálatunk első lépéseként PCR amplifikációt terveztünk. Az amplifikált szakaszt úgy állítottuk be, hogy tartalmazza az: exon 1
<14. .124, intron
125. .>136
Humán K-ras 1 exon hossza: 136 bp, (GenBank Accession: K01519, NID g190911) -> exon
1
AGGCCTGCTG AAAATGACTG AATATAAACT TGTGGTAGTT GGAGCTGGTG CCTGCTG AAAATGACTG AAT
51
GCGTAGGCAA GAGTGCCTTG ACGATACAGC TAATTCAGAA TCATTTTGTG GTAAAACAC
101
GACGAATATG ATCCAACAAT AGAGGTAAAT CTTGTT CTGCTTATAC TA exon <-
Az alkalmazott primerek amplifikálják a gyakorta mutáns régiókat, a ’hot-spotokat’. A primer oligonukleotidok szekvenciája a következő: a fentiekben már szemléltetett K-ras exon 1-re használt primerpár: 5’-CCT-GCT-GAA-AAT-GAC-TGA-AT-3’ (forward) 5’-ATC-ATA-TTC-GTC-CAC-AAA-ATG-3’ (reverse)
TP53 A p53 szuppreszor gén (TP53 gén: 1...2621 bp nagyságú, amelyből a kódoló régió: 252..1433 között van) 11 exonjából négyet vizsgáltunk, mivel az irodalmi adatok szerint az 5től 8-ig elhelyezkedő exonokban halmozódnak azok a hibák, melyek a daganatok kialakulásában főként szerepet játszanak. A primereket az East Port Kft.-től rendeltük meg. 5-ös exon: 13001
TATCTGTTCA CTTGTGCCCT GACTTTCAAC TCTGTCTCCT TCCTCTTCCT
13051
ACAGTACTCC CCTGCCCTCA ACAAGATGTT TTGCCAACTG GCCAAGACCT
13101
GCCCTGTGCA GCTGTGGGTT GATTCCACAC CCCCGCCCGG CACCCGCGTC
13151
CGCGCCATGG CCATCTACAA GCAGTCACAG CACATGACGG AGGTTGTGAG
13201
GCGCTGCCCC CACCATGAGC GCTGCTCAGA TAGCGATGGT GAGCAGCTGG
13251
GGCTGGAGAG ACGACAGGGC TGGTTGCCCA GGGTCCCCAG GCCTCTGATT
22
a fenti fragmens a TAC...és az...ATG között az 5-ös exont határolja be. az 5-ös exon primerpár szekvenciája: 5’-CAC-TTG-TGC-CCT-GAC-TTT-CA-3’(forward) 5’-CTG-CTC-ACC-ATC-GCT-ATC-TG-3’(reverse)
6-os exon: 13251
GGCTGGAGAG ACGACAGGGC TGGTTGCCCA GGGTCCCCAG GCCTCTGATT
13301
CCTCACTGAT TGCTCTTAGG TCTGGCCCCT CCTCAGCATC TTATCCGAGT
13351
GGAAGGAAAT TTGCGTGTGG AGTATTTGGA TGACAGAAAC ACTTTTCGAC
13401
ATAGTGTGGT GGTGCCCTAT GAGCCGCCTG AGGTCTGGTT TGCAACTGGG
13451
GTCTCTGGGA GGAGGGGTTA AGGGTGGTTG TCAGTGGCCC TCCGGGTGAG
6-os exon primerpár szkvenciája: 5’-GCC-CAG-GGT-CCC-CAG-GCC-TC-3’(forward) 5’-CCG-GAG-GGC-CAC-TGA-CAA-CC-3’(reverse)
A fenti szekvencia a p53 gén 6-os exonját fedi, amely a GTC...és ...GAG közt található. Az alábbi szekvencia a 7-es exont jelöli: 13901
GAGATTCCAT CTCAAAAAAA AAAAAAAAAG GCCTCCCCTG CTTGCCACAG
13951
GTCTCCCCAA GGCGCACTGG CCTCATCTTG GGCCTGTGTT ATCTCCTAGG
14001
TTGGCTCTGA CTGTACCACC ATCCACTACA ACTACATGTG TAACAGTTCC
14051
TGCATGGGCG GCATGAACCG GAGGCCCATC CTCACCATCA TCACACTGGA
14101
AGACTCCAGG TCAGGAGCCA CTTGCCACCC TGCACACTGG CCTGCTGTGC
14151
CCCAGCCTCT GCTTGCCGCT GACCCCTGGG CCCACCTCTT ACCGATTTCT
exon 7 primer: 5’-CTT-GCC-ACA-GGT-CTC-CCC-AA-3’(forward) 5’-AGG-GGT-CAG-CGG-CAA-GCA-GA-3’(reverse)
23
Végül a 8-as exon szekvenciája látható, amely a TGG...és ...GAG között helyezkedik el: 14301
TGTGGCTTCT CCTCCCACCT CCTGGAGCTG GAGCTTAGGC TCCAGAAAGG
14351
ACAAGGGTGG TTGGGAGTAG ATGGAGCCTG GTTTTTTAAA TGGGACAGGT
14401
AGGACCTGAT TTCCTTACTG CCTCTTGCTT CTCTTTTCCT ATCCTGAGTA
14451
GTGGTAATCT ACTGGGACGG AACAGCTTTG AGGTGCGTGT TTGTGCCTGT
14501
CCTGGGAGAG ACCGGCGCAC AGAGGAAGAG AATCTCCGCA AGAAAGGGGA
14551
GCCTCACCAC GAGCTGCCCC CAGGGAGCAC TAAGCGAGGT AAGCAAGCAG
14601
GACAAGAAGC GGTGGAGGAG ACCAAGGGTG CAGTTATGCC TCAGATTCAC
exon 8 primer: 5’-AAA-GGA-CAA-GGG-TGG-TTG-GG-3’(forward) 5’- CTG-CAC-CCT-TGG-TCT-CCT-CC-3’ (reverse)
A primereket a Primer v.0.5 (Whitehead Institute for Biomedical Research MIT, Cambridge, MA, USA) PC program segítségével terveztük és optimalizáltuk. A primerek kiválasztásában fontos szempontnak tartottuk,
hogy intronban
kezdődjenek és a vizsgálandó exont minél jobban lefedjék, de ne amplifikálódjon túl hosszú (>250 bp) szekvencia, amely az SSCP észlelését nehezítené. Az így kapott primereket teszteltük, hogy előfordulnak-e homológ szekvenciák az EMBL-GenBank adatbázisban (FASTA program). A PCR amplifikációt 35 ciklusban végeztük, csövenként 50mL reakcióelegyben: 39mL dH2O 5mL 10x puffer 1mL dNTP 1mL forward és 1mL reverse primer 2mL izolált DNS 0.5mL (0,5-1 U)Taq-polimeráz
Az általunk használt Taq-polimeráz enzim és puffer egyrészt a DynaZyme másrészt a Perkin Elmer-Cetus terméke volt.
24
4.4
SSCP és ezüstfestés A Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) vizsgálat az egyszálú DNS
bázis szekvenciától függő konformációs különbségeiből adódó gélelektroforetikus vándorlási eltéréseket teszi láthatóvá (Korn, és mtsai, 1993). Minden egyes DNS szálnak specifikus konformációja van, amelyet szekvenciája határoz meg, a DNS elsődleges szerkezete. A DNS szálon belüli konformációs különbségek a nukleotid eltérések miatt jönnek létre, amelyek egy gén egyik vagy mindkét alléljét érintik. A natív gélben a közel azonos molekulatömegű DNS szálak konformációjuktól függően eltérő sebességgel vándorolnak. Az általunk használt SSCP eljárás relatív gyors (kb. 1, 5 óra), és érzékeny a PCRamplifikált DNS mutáció vizsgálatára. Ezüstfestéssel kiküszöbölhető a radioaktív nukleotidok használata (Tadashi, és mtsai, 1993, Sugano, és mtsai, 1993). DNS előkészítés menete: A vizsgálat lényege, hogy az SSCP-re előkészített egyszálú DNS-hez - forralás és formamidos kezelés után, loading-dye-t adunk (1: 3 arányban), - ezáltal denaturáljuk, és az így előkészített mintát natív poliakrilamid-gélben (acrilamid/bisacrilamid 29:1, BioRad) 200 V-on futtatjuk (~ 1,5 hr). Ezután ezüstfestéssel folytattjuk, amely jól láthatóan festi az egyszálú DNS -t (Tadashi, és mtsai, 1993). A festés menete a következő: A) Futtatás után a gélt üvegkádba helyezzük és folyamatos enyhe mozgatás mellett kb.15 percig 50%-os alkoholban és 15%-os jégecetben fixáljuk. B) Ezután 15%-os glutáraldehidbe helyezzük a géleket, mindig úgy, hogy az oldat a gélt teljesen elfedje, és kb. 25 percig lassan rázatjuk. C) Ezt követően a gélt háromszor tíz-tíz percig bidesztillált vízben mossuk.
25
D) Közben egy üveg főzőpohárban elkészítjük az ezüstfestéshez szükséges oldatot: mágneses keverőn viszonylag gyorskevertetés mellett a következőket adjuk: DH O 27 ml 2
NaOH (1M) 3,1 ml Amonia 2,1 ml AgNO3 (1, 14M) 6 ml H O 11O ml 2
E.) A gélre öntjük az oldatot, majd folyamatosan figyelve a DNS sávok festődésének mértekét, a gélt kb. 5-10 percig hagyjuk az oldatban. F.) Ezt 2x15 percig tartó vizes mosás követi a felesleges festék eltávolítása érdekében G.) Az elkészített előhívót (víz, citromsav, formaldehid, 500 ml, 250 ml, 500 ml) a gélre öntjük, figyelve, hogy mikor optimális intenzitásúak a megjelenő sávok, majd ezt követően leállítjuk az előhívást a ‘Stop’ oldattal (500 ml víz és 5 ml jégecet). H.) A végeredményként kapott festett gél ’stop’-oldatban hőzárt zacskóban +4°C-ra téve, sötétben tárolható. Konzekvensen megfigyelhető, hogy azok a DNS szálak amelyek a nukleotid eltéréseket, (pontmutációt) tartalmazzák, a másodlagos konformációs struktúrájuk miatt különbözőképpen vándorolnak, mint a wild-type-(normál)-DNS szálak. Ily módon a különböző konformációs, strukturális variációk a sávok vándorlási különbségében jelennek meg. a 11 ábrán látható mintában.
26
11 ábra. SSCP elektroforézis képe ezüstfestés után. N: ép colon szövetből nyert DNS-ből amplifikált p53 exon7 PCR fragmens. T: ugyanazon beteg daganat mintából nyert ssDNS SSCP képe.
4.5.
DNS szekvenálás A DNS szekvenálást a University of Victoria, kanadai egyetemen, a LI-COR Biotech
Long ReadIR 4200 és SequiThermâEXCEL II szekvenáló automatán végeztem (Molecular Biology Group LI-COR, inc., Biotechnology Division, Lincoln, NE 68504, USA). A szekvenáláshóz ’Epicentre Technologies SequiTherm Excel II DNA LC’ szekvenáló kitet használtunk. Cycling PCR reakcióban forward és reverse M13-as primereket használtunk, a két primer különböző fluoreszkáló festékkel van jelölve, amely lehetővé tette mindkét DNS szál egyidejű szekvenálását.
27
A szekvenáláshoz a következő lépéseket alkalmaztuk: A.)
PCR jelölő reakció
egy PCR csőbe a következőket adtuk: 1. templát DNS (0,6 – 1,0 pmol / 7-9mL) 2. primer (4,0 pmol) 3. 10x SequiTherm Rxn puffer (2,5mL) 4. 5mM dNTP (dCTP, dGTP, dTTP) 1mL 5. dATP-’labeled dye’ (20 pmol/mL, 1,0mL) 6. 5x puffer (5,0mL) 7. SequiTherm (4U/mL) 1,5mL 8. dd víz, 20mL-ig A PCR jelölő reakció menete a következő: a.) b.) c.) d.) e.) f.) B.)
95°C, 3’ 95°C, 30’’ 58°C, 10’’ 70°C, 5’’ 10x bàd ismétlése 4°C, tárolás
Szekvenáló reakció 1.
A PCR jelölő reakció alatt elkészítettük a négy 0,2 mL csövet, mely tartalmazta a A, T, G és C-t. Minden egyes csőbe tettünk 2,0mL SequiTherm terminációs keveréket (pl. G terminációs keveréket a G csőbe, stb.).
2.
A fenti jelző reakció termékéből bepipettáztunk 5,0mL-t minden egyes 4 (A,T,G és C) csőbe. Jól összekevertük.
3.
a
csöveket
behelyeztük
a
szekvenáláshoz
használt
PCR-ba,
amely
a
következőképp lett programozva: a. b. c. d. e. f.
95°C, 3’ 95°C, 30’’ 58°C, 15’’ 70°C, 15’’ 30x bàd lépések ismétlése 4°C, tárolás
A szekvenáló reakció befejeztével, eltávolítottuk a szabadon maradt dATP-t, etánol precipitálással. Ezt követően, a terméket felvettük 5mL 50:50 ddvíz és puffer oldatba. 28
A terméket továbbá> 90°C legalább 3’-ig hevítéssel denaturáltuk. Ebből 1,0-2,0mL-t felvittünk a 66 cm-es gélre. DNS szekvenálásra kerültek mindazon minták, melyek SSCP-ben ’band shiftet’ mutattak, valamint még több, random módon kiválasztott minta is. Ezt követően a szekvenciákat egyenként, manuálisan is ellenőriztük, hogy amennyiben szükséges a software által félreértelmezett vagy nem meghatározott bázispárokat ki lehessen javítani. Ezt a LaserGene lézer hullámhossz-pásztázó összehasonlító programja tette lehetővé, a továbbiakban pedig minden értékelhető filet átvittem a SEQMAN programra, ahol egyszerre több azonos génszekvenciát lehet párhuzamosan értékelni, a bázispár eltéréseket, mutációkat kimutatni (Pricolo, és mtsai, 1996, Losi, és mtsai, 1997). 4.6
Szekvenálási adatok számítógépes kiértékelése (Trace Data File) A 12. ábrán, szemléltetésként ’Trace Data’ szekvenálási görbék láthatók, a p53 - 5-ös
exon adatai.
29
12 ábra. p53 gén 5-ös exon’Trace Data’ rész-szekvenálási görbéje (szemléltetésként)
STcCCCTG CCCTCAACAAGATGTTTTGCCAA CTGGCCAAGACCTGCCCTG TGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCC GCCCGGCACCCG 20 30 40 50 60 70 80 90 100
30
5.
Eredmények
Munkánk során a colorectális daganatok (CRC) és a hajas-sejtes leukémia (HSL) területén K-ras és p53 gének mutációs előfordulását és lokalizációját vizsgáltuk. A vizsgált Kras és p53 gének mutációi halmozottan fordulnak elő a colorectális daganatokban, míg a p53 mutációk gyakoriak a hematológiai malignításban és az általunk vizsgált HSL mintákban. Vizsgálataink során CRC normális és daganatszövetéből valamint HSL betegek véréből izolált DNS minták mutációs analízisét végeztük el. A kórképek közül a CRC igen magas előfordulási aránya indokolta az alábbi gének vizsgálatát, a HSL esetében pedig a világban is ritkaság-számba menő, hosszú évek során összegyűjtött DNS minták - adott szempontok szerint történő (p53 mutációk) elemzés - jelentett részünkre korszerű kihívást. Megállapítottuk, hogy a vizsgált colorectális daganatokban a K-ras gén 12/13 kodonján kívűl egyéb kodonok mutációi feltűnően gyakran fordulnak elő. Továbbá a p53 gén exon 7 szakaszán a töbszörös mutációk gyakorisága a malignus progresszió során fokozódik. A p53 mutációinak gyakoriságát a hajas sejtes leukémiában is magasnak találtuk, annak ellenére, hogy ez a kórfolyamat kevésbé malignus a lymphoproliferativ megbetegedések között. Az általunk tanulmányozott betegcsoport 65 egyénből állt, akik között 45 magyarországi
és
20
romániai
beteg
volt
található.
A
vizsgáltak
átlagéletkora
62.4 ± 7.52 (SD) év. A nemek megoszlása a csoporton belül közel 1:1 volt, 33 nő és 32 férfi. Dukes A stádiumban 9, Dukes B stádiumban 44, Dukes C stádiumban 11 és Dukes D stádiumban 1 beteg volt a műtét idején. 5.1
A colorectális daganatokban előforduló mutációk K-ras mutációk CRC-ben:
A szekvenálási adatok birtokában a a K-ras gén 1 exonban a következő mutációs spektrumot találtuk: -
A Dukes A-ba tartozó betegcsoportban, (9 eset, III. táblázat), nem találtunk mutációt, sem az SSCP-nél, sem pedig a találomra szekvenált anyagban (wt).
-
A Dukes B csoportba 44 beteget soroltak. Itt 9 esetben találtunk K-ras mutációt. Két esetben a mutációk a 12-es kodon ’hot spot’-ra estek, 4 esetben a 15-ös kodonra, 4 esetben a 21-es kodonban lokalizálódtak, néhány esetben pedig más kodonokban.
-
Dukes C-be 11 beteg tartozott, közülük 6 esetben találtunk mutációt – egy esetben a 13-as kodonban, míg további 5 esetben más helyeken. 31
-
Dukes D-ben egy beteget tudtunk megvizsgálni, itt szintén találtunk egy mutáciot a 12-es kodonban. Az általunk vizsgált beteganyagban is megfigyelhető volt, hogy a mutációs gyakoriság
fokozatosan emelkedett a Dukes A → Dukes D malignus progresszió során. A K-ras gén 1 exonban az SSCP által bár nagyobb mutációs gyakoriságot találtunk (37%-ot) a szekvenálást követően összesen 16 esetben igazoltunk tényleges mutációt (II. táblázat) (König és mtsai, 2001). P53-as mutációk CRC-ben:
A p53 - 5, 6, 7 és 8-as exonok esetében, a Dukes A osztályozás szerinti betegeknél nem tudtunk mutációt kimutatni (wt). A Dukes B betegeknél a p53 gén 5-ös exonjában 5 esetben igazoltunk mutációt, a 6-os exonban 2 esetben, a 7-es exonban 6 esetben, míg a 8-as exonban 2 esetben találtunk mutációt. A vizsgált betegekből, akik Dukes C besoroláshoz tartoztak, a következő mutációs megoszlást találtuk: az 5-ös exonban 5 esetben, a 6-os exonban 2 esetben, a 7-es exonban 9 esetben és a 8-as exonban 3 esetben voltak jelen a mutációk. Csak egy betegünk volt a Dukes D stádiumban, akinél az 5-ös 6-os exonokban nem találtunk mutációt (wt), míg a 7-es és 8-as exonokban egy-egy mutáció volt. Adataink szerint a mutációk előfordulása és gyakorisága növekedett a Dukes B, C, és D betegeknél. Az egyik esetben (a II. táblázatban az 53-as számmal jelölt beteg) két, egymástól független, de közel elhelyezkedő sigma lokalizációjú tumort kaptunk. A molekuláris vizsgálat kimutatta, hogy a terjedelmesebb, korábban képződött és gyorsabban növekedett tumorban jóval több mutáció fordul elő, - (K-ras-ban 4 mutáció: V8V, V9V, G10V és G15G; a p53 5 exonban: V147E, a 7-es exonban: T253N és a 8-as exonban: R282L, R283R, N288N, L289L, K291N, G293G és H296Q) - mint a mellette lévő kisebb és valószínűleg később keletkezett daganatban: K-ras G12D, p53 7-es exonban: R249G és a 8-as exonban D281-del. A CRC tanulmányunkban 65 esetből 10 esetben tudtuk a betegek állapotát nyomon követni, mivel a betegek többsége, adott időig, nem jelentkezett felülvizsgálatra. A 10 betegből, mint ahogy az a 2-es táblázatból is kiderül, az 5-ös, 25-ös, 47-es, 52-es és 63-as számmal jelölt betegek tumormentesnek bizonyultak, míg 2 esetben – a 30-as és az 58-as betegeknél visszaesés következett be. Egy esetben, a 65-ös betegnél, a halálozást a metasztázis okozta, míg két további esetben – 35-ös és 60-as betegeknél a halálozás más jellegű problémák miatt következett be. 32
Azok a betegek, akik a Dukes A-hoz tartoztak, a mi vizsgálataink szerint sem hordoztak K-ras vagy p53 mutációt. Párhuzamban azon esetekkel, ahol a felülvizsgálatok szerint a betegek felépültek, a mi adatainkban sem található K-ras vagy p53-as mutáció. Az 5ös, 25-ös és 52-es betegek mindkét génre nézve vad-típusúak (’wild type’). A 47-es betegben K-ras mutációt a 21-es kodonban találtunk (I21V), de ez az aktiváló régión kívül esett, valin aminosavcserét eredményezett, aminek nemigen lehet szerepe a Ras fehérje működésének megváltoztatásában. A 63-as betegnél 4, egymáshoz közeli K-ras mutációt találtunk, a mutációk itt sem az aktiváló régióban helyezkedtek el, és hasonló aminosavak cseréjét okozták: V8V, G10V, T20A, I24V; egy “néma” három hidrofób aminosav hidrofób aminosavra cserélődött, így jelentős fehérjeszerkezet változás nem várható. A 30-as betegben (visszaeső) - aki a Dukes B osztályozáshoz tartozott – “néma” mutációt találtunk a p53-as gén 7-es exonjában, a 241-es kodonban (S241S). A 35-ös betegben csak egy mutációt találtunk a p53 gén 7-es exonjában (G244G). A másik visszaeső betegben (58as), mindkét tanulmányozott génben több (2 mutációt a K-ras génben, amelyből az egyik deléciós –G15del -, egy-egy mutációt a p53 gén 6-os (P190P) és 8-as (E286L) exonjaiban és 6 mutációt a 7-es exonban – N231T, C238G, C242W, P250A, L252V, L257L). A 60-as betegben a p53 gén 5-ös (P151del) és 7-es (S227C, Y236H, M237del, E258D) exonjaiban voltak mutációk míg a 65-ös betegben (Dukes D), az egyik mutáció a K-ras gén aktiváló régiójába került (12-es codon –G12D), és a p53 gén 7-es (N239T és R249del) és 8-as (E286K) exonokba (lásd, II. táblázat).
33
II táblázat
K-Ras és p53 DNA szekvencia analízis 65 CRC betegből
No.
Nem
Dukes A 1 F
K-ras exon1
Kor
P53 exon5
P53 exon6
P53 exon7
P53 exon8
63
wt
wt
Wt
wt
wt
2
M
66
wt
wt
Wt
wt
wt
3
F
60
wt
wt
Wt
wt
wt
4
M
57
wt
wt
Wt
wt
wt
5
M
68
wt
wt
Wt
wt
wt
6
M
64
wt
wt
Wt
wt
wt
7
F
62
wt
wt
Wt
wt
wt
8
F
57
wt
wt
Wt
wt
wt
9
M
55
wt
wt
Wt
wt
wt
Dukes B 10 M
67
wt
wt
Wt
wt
wt
66
wt
132aag(K)-atg(M)
Wt
wt
wt
11
F
144 cag(Q)-cac(H)
12
M
73
wt
wt
wt
wt
wt
13
F
59
wt
wt
wt
wt
wt
14
M
69
wt
wt
wt
237atg(M)~acc(T)
wt
15
F
62
wt
wt
wt
wt
wt
16
M
58
wt
wt
wt
wt
wt
17
M
73
wt
wt
wt
wt
wt
18
F
63
12ggt(G)~gcg(A)
wt
wt
wt
wt
wt
wt
wt
wt
15 ggc(G)~gga(G)
19
F
71
17agt(S)~agc(S) 26aat(N)~act(T)
20
M
68
wt
wt
wt
wt
wt
21
M
68
wt
160atg(M)~ctg(L)
wt
237atg(M)~att(I)
wt
34
No.
22
Nem
F
K-ras exon1
Kor
60
wt
P53 exon5
P53 exon6
wt
190 cct(P)~ccc (P)
P53 exon7
P53 exon8
wt
wt
192 cag(Q)~cat (H) 193 cat(H)~tat (Y)
23
F
69
15 ggc(G)~ggg(G)
wt
wt
wt
wt
24
F
52
wt
wt
wt
wt
wt
25
M
66
wt
wt
wt
wt
wt
26
M
65
wt
wt
wt
wt
wt
27
F
67
15 ggc(G)~gcg(A)
wt
wt
wt
wt
28
F
61
wt
wt
wt
wt
wt
29
F
62
21 ata(I)~- ta
wt
wt
wt
wt
30
M
59
wt
wt
wt
241 tcc(S)~tcg(S)
wt
31
M
49
wt
wt
wt
wt
wt
32
M
65
wt
wt
wt
wt
wt
33
F
64
wt
wt
wt
wt
wt
34
F
65
wt
wt
wt
wt
wt
35
M
74
wt
wt
wt
244 ggc(G)~ggt(G)
wt
36
M
75
wt
147gtt(V)~gaa(E)
wt
wt
wt
148gat(D)~tag(st)
37
F
67
wt
wt
wt
wt
wt
38
M
69
wt
wt
wt
wt
wt
39
F
53
wt
wt
wt
wt
wt
40
F
60
wt
wt
wt
wt
wt
41
M
49
wt
wt
wt
wt
wt
42
F
67
wt
wt
wt
wt
wt
43
M
74
21 ata(I)~-ta
152ccg(P)~c-g
218gtg(V)~ctg(L)
229 tgt(C)~tgc(C)
278cct(P)~-ct
153ccc(P)~tcc(S)
237atg(M)~agg(R)
165cag(Q)~gag(E)
248cgg(R)~ttg(L)
286gaa(E)~aga(R)
171gag(E)~ggg(G)
44
F
75
wt
wt
wt
wt
wt
45
F
59
wt
wt
wt
wt
wt
46
F
61
wt
wt
wt
wt
wt
35
No.
Nem
K-ras exon1
Kor
P53 exon5
P53 exon6
P53 exon7
P53 exon8
47
M
70
21ata(I)~gta(V)
48
M
59
wt
wt
wt
wt
wt
49
F
69
wt
wt
wt
wt
wt
50
M
58
21 ata(I)~gta(v)
wt
wt
wt
wt
51
F
68
wt
wt
wt
wt
wt
52
M
66
wt
wt
wt
wt
wt
53
F
59
8 gta(V)~gtg(V)
147 gtt(V)~gaa(E)
wt
253 acc(T)~aac(N)
282 cgg(R)~ctc(L)
(T1)
wt
wt
wt
wt
9 gtt(V)~gta(V)
283 cgc(R)~cgg(R)
10 gga(G)~gtc(V)
288 aat(N)~aac(N)
15ggc(G)~ggg(G)
289 ctc(L)~cta(L) 291 aag(K)~aac(N) 293ggg(G)~gcc(G) 296 cac(H)~cagQ)
53
F
59
12 ggt(G)~gat(D)
wt
wt
249 agg(R)~ggg(G)
g-c del
(T2) Dukes C 54 M
281 gac(D)~
59
wt
wt
wt
241 tcc(S)-gcc(A)
wt
247 aac(N)-gac(D) 259 gac(D)-ggt(G)
55C2 F
35
10 gga(G)~gca(A)
180 gag(E)~gtg(V) wt
228 gac(D)~ccc(P)
wt
241 tcc(S)~gcc(A) 249 agg(R)~-gg
56C1 F
60
wt
wt
wt
229 tgt(C)~tct(S)
wt
238 tgt(C)~ggt(G) 239 aac(N)~aag(K) 242 tgc(C)~tgg(W) 257 ctg(L)~cag(Q)
57C1 M
54
wt
wt
wt
36
235 aac(N)~gac(D)
288 aat(N)~aac(N)
242 tgc(C)~tcc(S)
289 ctc(L)~ttc(F)
250 ccc(P)~cc- del
291 aag(K)~aac(N)
No.
Nem
K-ras exon1
Kor
15 ggc(G)~gg-
58 C2 F 56
P53 exon5
P53 exon6
wt
190cct(P)~ccg(P)
18gcc(A)~gct(A)
P53 exon7 231 acc(N)~aca(T)
P53 exon8 286 gaa(E)~tta(L)
238 tgt(C)~ggt(G) 242 tgc(C)~tgg(W) 250 ccc(P)~gcc(A) 252 ctc(L)~gtc(V) 257 ctg(L)~cta(L)
59
F
54
10gga(G)~gca(A)
147gtt(V)~gaa(E)
wt
250 ccc(P)~gcc(A)
wt
259 gac(D)~ggt(G)
60C2 M
45
wt
151 ccc(P)~c-g del
wt
227 tct(S)~tgt(C)
wt
236 tac(Y)~cac(H) 237 atg(M)~at- del 258 gaa(E)~gat(D)
61 C1. F 62 C2 M
58 55
wt 26 aat(N)~gat(D)
151 ccc(P)~ccg(P)
wt
236 tac(Y)~cac(H)
wt
153 ccc(P)~gcc(A)
249 agg(R)~acc(T)
146 tgg(W)~tg- del 192 cag(Q)~ccc(P)
wt
wt
152 ccg(P)~c-g del 208 gac(D)~gat(D) 159gcc(A)~ggc(G)
63 C1 M
64
8 gta(V)~gtg(V)
wt
wt
wt
wt
wt
wt
240 agt(S)~act(T)
26o agt(S)~att(I)
10 gga(G)~gta(V) 20 acg(T)~gcg(A) 24 att(I)~gtt(V)
64
M
61
13 ggc(G)~gac(D)
259 gac(D)~tac(Y)
273cgt(R)~tgt (C) 286gaa(E)~taa (Sp) 302ggg(G)~ggt(G)
Dukes D 65 F
72
12 ggt(G)~gat(D)
wt
wt
239 aac(N)~acc(T) 249 agg(R)~-gg del
37
286 gaa(E)~aaa(K)
III. táblázat K-ras
és
p53
mutációinak
előfordulása
a
colorectális
daganatok
progressziójának Dukes szerinti egyes stádiumaiban
Dukes
K-ras exon 1
P53 exon 5
exon 6
exon 7
exon 8
P53 össz mutációk
A – 9 eset
0
0
0
0
0
0/9
B – 44 eset
9/44
5/44
2/44
6/44
2/44
15/44
C – 11 eset
6/11
5/11
2/11
9/11
3/11
19/11
D - 1 eset
1/1
0/1
0/1
1/1
1/1
2/1
10
4
16
6
36/65
Össz mutáció 16/65
38
5.2.
p53 mutációk HSL-ban Összesen 61 HSL-es beteg esetében vizsgáltuk a p53 génben előforduló mutációkat. A
vizsgált betegeknél 17 esetben találtunk mutációt, ami a beteganyag 28%-át teszi ki. Négy esetben a mutáció a p53, 5-ös exonjára lokalizálódott, egy betegnél mutációt találtunk a 6-os exonban a 3’ vég határában, öt esetben a mutációk a 7-es exonban voltak, míg 7 esetben a mutációk a 8-as exont érintették.(V. táblázat, König és mtsai, 2000). A következő mutációkat találtuk: 5 esetben missense mutációk (egy esetben deléciót és négy esetben inszerciót) és egy deléciót, amely a leolvasási keret eltolódását (frameshift) eredményezte. A bázis szubsztitúciók közül 3 tranzíciós volt melyből kettő ’silent’ típusú. Három esetben találtunk egyszerű transzverziót, (egyikük ’silent’ maradt) és további 7 kettős tranzverziót. A kettős tranzverzió, amely a 275-ös és 276-os kodonban jött létre, egyrészt egy poláros aminosavat, a ciszteint egy apolárosra, a fenilalaninra cserélte, másrészt, egy apoláros aminosav, az alanin cseréjét eredményezte a poláros szerinre. Bár az így kimutatott mutációk a 275 és 276-os kodonokban nem szükségszerűen vezetnek a protein szerkezetében változáshoz, az a tény, hogy a mutáció a fehérje DNS-kötő régiójában található – a 275-ös helyzetű cisztein hiányában – a p53 DNS-kötő aktivitása csökkenhet. Ily módon, a 275 és 276-os kodonokban létrejött transzverzióknak szerepük lehet a fehérje esetleges kóros működésében. Hat beteg esetében egy mutációt találtunk, tíz betegnél kettőt, míg egy betegnél (1-es beteg) három különböző mutációt tudtunk kimutatni. Ezeket a mutációkat három fő kategóriába oszthatjuk: strukturális (n=9), inaktiváló (n=6) és neutrális (n=2). 41 betegnél a keringő hajas sejtek aránya 5% alatt volt, mutációkat 13 esetben tudtunk kimutatni. Kiemeljük, hogy mind a 7 eset, melyben kettős transzverzió fordult elő, ebbe a betegcsoportba tartozott. Abban a csoportban, ahol a hajas sejtek aránya a perifériás vérben 5-25% között volt, 7-ből 1 betegben volt kimutatható mutáció. Nyolcból két betegben, akiknek perifériás vérében a HSL keringő sejtek aránya 25%-nál nagyobb volt, p53 mutációt szintén ki lehetett mutatni.
39
IV. táblázat. Klinikai és laboratóriumi leletek a 17 HSL betegről és a HSL variáns (5-ös beteg) P53 mutációiról Eset/nem
Életkor diagnózis
a
WBC
% hajas
9
sejtek a
(hónapokban)
keringő
a diagnózist
vérben
követően
(x10 /l)
Idejében
1/M
60
9.5
35.0
Kezelés
Előkezelés
Túlélés
83
(tisztított T-sejtek) 2/F
68
23.8
58.0
Előkezelés
23+
3/M
73
1.9
2.0
Előkezelés
22+
4/M
38
1.9
0
2CDA követően
88+
5/M
57
100.0
99.0
Előkezelés
Nincs adat
6/M
50
2.5
13.0
IFN -a alatt
30
7/F
53
12.9
52.0
Előkezelés
2+
8/F
50
3.1
1.0
Előkezelés
128+
9/M
36
2.1
14.0
Előkezelés
115+
10/M
68
3.1
8.0
Előkezelés
170+
11/M
63
3.6
2.0
IFN -a alatt
204+
12/M
41
2.9
1.0
IFN -a után
69+
13/M
39
2.8
No data
IFN -a után
166+
14/M
53
1.4
4.0
2CDA után
59+
15/M
56
5.6
6.0
Előkezelés
45+
16/F
39
3.1
1.0
Splenectomiát
85
követően 17/M
71
2.1
0
Előkezelés
40
102+
V. táblázat TP53 gén 5, 6, 7 és 8-as exonok mutációi 17 HSL betegnél Betegek
% hajas sejtek
Exon
1 (izolált T sejtek)
<5%
5
Codon
Nucleotid
Mutáció hatására létrejött aminosavcsere
151
CCC-CCA
Pro-Pro
(Tvs.)
156
CGC-ACG
Arg-Thr (stop)
(Ins.)
185
AGC-TGC
Ser-Cys
(Tvs.) ( Ts.)
2
58%
177
CCC-CTC
Pro-Leu
3
70%
186
GAT-TGA
Asp-Stop
(Ins.)
4
<5%
184
GAT-GTA
Asp-Val (stop)
(Ins.)
5
>95%
6
187
GGT-GTG
Gly-Val
( Ins.)
6
13%
7
241
TCC—CC
Ser-Pro (stop)
( Del.)
7
52%
238
TGT-TGC
Cys-Cys
(Tvs.)
240
AGT-AGA
Ser-Arg
(Tvs.)
234
TAC-TAT
Tyr-Tyr
(Tvs.)
252
CTC-CT-
Leu-Leu
(Del.)
8
<5%
9
<5%
235
AAC-AacC
Asn-Asn (stop)
(Ins.)
10
<5%
240
AGT-AGA
Ser-Arg
(Tvs.)
241
TCC-ACC
Ser-Thr
(Tvs.)
275
TGT-TTT
Cys-Phe
(Tvs.)
276
GCC-TCC
Ala-Ser
(Tvs.)
275
TGT-TTT
Cys-Phe
(Tvs.)
276
GCC-TCC
Ala-Ser
(Tvs.)
275
TGT-TTT
Cys-Phe
(Tvs.)
276
GCC-TCC
Ala-Ser
(Tvs.)
275
TGT-TTT
Cys-Phe
(Tvs.)
276
GCC-TCC
Ala-Ser
(Tvs.)
275
TGT-TTT
Cys-Phe
(Tvs.)
276
GCC-TCC
Ala-Ser
(Tvs.)
275
TGT-TTT
Cys-Phe
(Tvs.)
276
GCC-TCC
Ala-Ser
(Tvs.)
275
TGT-TTT
Cys-Phe
(Tvs.)
276
GCC-TCC
Ala-Ser
(Tvs.)
11
12
13
14
15
16
17
<5%
<5%
<5%
<5%
<5%
<5%
<5%
8
41
6.
Megbeszélés A minták kiválasztásnál fontos szempont volt, hogy rendelkezzünk minden lehetséges
háttér-információval (Dukes, nem, kor, esetenként follow-up), amely a vizsgált daganat agresszivitására és nem utolsósorban a kórkép kimenetelére utal. A colorectális (CRC) mintákat műtéti anyagból gyűjtöttük. A hajas sejtes leukémiás (HSL) betegekből izolált DNShez – a több mint 15 éves múltra visszatekintő német-magyar kollaboráció eredményeként az Ulmi Egyetem III. Belklinikája segítségével jutottunk. 6.1
A colorectális daganatok K-ras és p53 mutációi A DNS mintákból PCR amplifikációt végeztünk a K-ras gén 1-es exonjára és a p53-as
gén 5, 6, 7 és 8 exonjaira. Vizsgálatainkat SSCP elektroforézissel folytattuk és az eltérést mutató mintákat szekvenáltuk. A szekvenálásnál azt is figyelembe vettük, hogy bár egyes minták nem mutattak SSCP eltérést, a Dukes féle hisztopatológiai osztályozás szerint (B, C, vagy D) indokoltnak látszott azon minták vizsgálata is. Az összes betegek közül a K-ras génben 24/65 míg a p53 gén 5, 6, 7 és 8-as exonjaiban 39/65 esetben volt SSCP ’band shift’ jellegű eltérés kimutatható (VI. táblázat). Fals eredmények elkerülése végett, SSCP negatív vizsgálatra is sor került. Az SSCP eredmények mértékadóak voltak az elkövetkezendő szekvenáláshoz. Továbbá kontrollként véletlenszerű mintákat is – a fent említett beteganyagból - megszekvenáltunk, de minden egyes mintát, amely az SSCP adatai szerint ’wild type’-nak bizonyultak, nem állt módunkban megszekvenálni.
VI táblázat. SSCP vs. Szekvenálás során megfigyelt összmutációk gyakorisága Mutációk
K-ras
P53
Eset/betegszám Eset/betegszám SSCP vizsgálat alapján
24/65
39/65
16/65
20/65
Szekvenálás vizsgálat alapján
42
Jelen munkánkban a PCR amplifikálást K-ras és p53 génekben intronból kiinduló primerekkel végeztük (lásd: K-ras és p53 szekvenciák). Mi úgy terveztük a K-ras gén primerpárt, hogy a teljes exont amplifikálja, így az általunk nyert szekvencia adatok a K-ras 1-es exonon, adott esetben minden mutációját tartalmazza. A szekvenálás során talált mutációkat a II-es táblázatban mutatjuk be (König és mtsai, 2001). Mivel a szekvenálandó minták kiválasztásakor az SSCP volt az irányadó, az SSCP eltéréseket (band shift-eket) mutató mintákat minden esetben megszekvenáltuk. A párhuzamosan vizsgált normál (kontroll) DNS-ekben SSCP eltérés nem volt kimutatható. A 65 betegből 16 esetben, a szekvenálást követően találtunk K-ras mutációt. A p53 gén össz-beteg mutációs vizsgálatának tükrében, a legtöbb mutációt az 5, 7 és 8-as exonokban találtuk, ez a megfigyelés összhangban van más kutatók által leírt hasonló adatokkal (Kikuchi T, 1993, Yamamura Y, 1994, Froggatt, és mtsai, 1995). A szekvenálási adatok szerint a vizsgált 65 betegnél 28 esetben (43%-ban) találtunk valamilyen mutációt, egyes esetekben halmozottan, mind a K-ras mind a p53 génben. A mutációk jelentős része a mutáns protein szerkezetének - és így funkcionalitásának – komoly megváltozását eredményezi (II táblázat). Az általunk vizsgált betegeknél a szekvenálási eredmények mindkét génnél igazolták, hogy a mutációk megemelkedtek a Dukes B, C és D stádiumokban. A legtöbb mutációt a p53as gén 5-ös, 7-es és 8-as exonjaiban találtuk, ami átlagát tekintve megfelel az eddigi irodalmi adatoknak is (6, 7 és 8 ábrák, Thierry Soussi, Lab. P53 Genotox tumeurs, Inst. Curie, Paris, http://perso.curie.fr/Thierry.Soussi/). Mind a K-ras génnél, mind pedig a p-53-nál az SSCP-nél a mutációk kizárólag csak a ’T’ vagyis a tumort tartalmazó mintákban voltak jelen, a hozzájuk társuló normál szövetmintákból mutáció nem volt kimutatható. A K-ras és a p53 gén mutációi nem mindig a’hot-spotokon’ belül helyezkednek el. Ott, ahol a mobilitásbeli eltérések már az SSCP-ben is megjelentek, indokoltá tette a továbbiakban a szekvenálást. Az általunk talált K-ras ’hot-spot’-on kívüli mutációkról elképzelhető, hogy valamiféle regionális Kárpát-medencei specificitást mutatnak, de ahhoz, hogy ezt egyértelműen állíthassuk, szerteágazóbb vizsgálatok elvégezése szükséges. Eredményeink tükrében az is igaz lehet, hogy a ’hot-spot’-on (12, 13-as kodonok) kívül eső mutációknak gyakran nincs ’aktivátor’ szerepe, így kevésbé vagy egyáltalán nem vesznek részt a malignus folyamatokban.
43
Előző tanulmányok rávilágítottak, hogy a különböző földrajzi viszonyok, valamint a különböző populációk különböző genetikai összetétele és táplálkozási szokásaik fontos szerepet játszanak a colorectális daganatok létrejöttében. Vizsgálatainkkal e tények ismeretében, egy közép-európai populáció mutációs polimorfizmusát kíséreltük meg feltérképezni. A mi vizsgálataink is ezt a vonalat követték, és így egy közép-európai mutációs polymorphizmus jellegeit igyekeztünk nyomon követni. (Urosevic, és mtsai, 1993, Pauly, és mtsai, 1997, Fahy, Bold, 1998, König és mtsai, 2001). A p53-as génnél az SSCP 65 beteganyagból 39 esetben mutatott elektroforetikus vándorlási eltérést az 5-8 exonokban, ami 60%-os mutációs gyakoriságot eredményezett. Ebben az esetben is, akár a K-ras génnél, az SSCP-vel talált mutációk nem bizonyultak minden esetben valósnak a szekvenálás után, ( a K-ras gén esetében 24/16 míg a p53 génnél 39/20 esetben bizonyultak valos mutációknak) így a végleges mutációs gyakoriság szekvenálás után itt is csökkent a kiindulásihoz képest (VI táblázat). A K-ras génnél az SSCP 24 esetben (37%-ban) ’igazolt’ mutációt, a szekvenálást követően viszont 16 esetben találtunk tényleges mutációt, amely egy 24,6%-os mutációs gyakoriságnak felel meg. A p53-as gén esetében 20, valamiféle mutációt hordozó betegből 10 esetben találtunk mutációt az 5-ös exonban, 4-nél a 6-os exonban, 16 betegnél a 7-es exonban és 6-nál a 8-as exonban, amely az összmutációra nézve 55,39%-os átlagnak felel meg, és nagyjából összhangban van a más irodalmak közzétett adataival (Kikuchi és mtsai, 1992, Yuka és mtsai, 1994). Összefoglalva, a vizsgálataink során alkalmazott SSCP eljárás valamint a komputerizált szekvencia analízisek hasznos eljárásnak bizonyultak a normális és daganatos szövetekben létrejött genetikai eltérések kimutatásában. Egyes tanulmányok, amelyek célzottan a K-ras gén 12, 13 és 61-es kodonjait vizsgálták, magasabb mutációs gyakoriságot találtak, (Benhattar és mtsai, 1993, Pajkos és mtsai, 1999) bár a nemzetközi irodalom szerint a K-ras mutációk megoszlása igen változó (20 és 50% közt lehet). Általában a mutációs ráta 50%-nál nem magasabb, amely egyben egy más lehetséges mutációs útvonalat is feltételez (Elnatan és mtsai, 1996). Igazoltnak látszik az is, hogy térségünkben a gastrointestinális daganatokban szenvedő betegekben a K-ras és p53 mutációk gyakorisága esetenként halmozottabb és változatosabb mutációs spektrummal bír (Kristóf és Újszászy, 1994, Tadashi és mtsai, 1995, König és mtsai, 2001).
44
Ennek számos összetevője lehet, létrejöttének hátterében mind genetikai, mind pedig társadalmi tényezők állhatnak. Ezt alátámasztani látszik vizsgálataink eredménye is a megemelkedett K-ras és p53-as mutációs gyakoriság-megoszlással, ami részben emelkedett értékeket mutat a már világszerte leírt adatokhoz (Onda, és mtsai, 1997), vagy éppen közelít az európai mutációs átlaghoz (Urosevic, és mtsai, 1993, Tadashi, és mtsai, 1995, Levi, és mtsai, 1995, Petmitr és mtsai, 1998). Az ok–okozat pontosabb megismeréséhez további szerteágazóbb vizsgálatok szükségesek. 6.2
p53 mutációk HSL-ban A HSL specifikus klinikai tulajdonságai miatt egyedülálló az alacsony fokú non-
Hodgkin limfómák között. A legtöbb esetben a betegség klinikai lefolyása indolens, a betegek nagyobbik része jól reagál a splenektómiára, az interferon-alpha és a purin-nukleozid analóggal való kezelésre (IV táblázat). A HSL malignizálódásának progressziója rendkívül ritka (Diez-Martin, 1987, Nazeer, és mtsai, 1997). A betegek többségénél a halál okát a különböző fertőzések létrejöttében kell keresni. Ennek megfelelően arra számítottunk, hogy az általunk talált p53 mutációk gyakorisága alacsony lesz. Az eredmények nem igazolták a várakozást, ugyanis a betegeknél a mutációs arány meglehetősen magas volt, meghaladta a 28%-ot. Annak valószínűsége, hogy ezt az emelkedett mutációs arányt az Amplitaq polimeráznak lehet tulajdonítani, meglehetősen elenyésző (Eckert KA, 1991). A p53 mutációs frekvencia a CLL-es betegek mintáival hasonlítható össze, ami a leírt 10-15%-os gyakoriságot jelenti. (Fenaux P, és mtsai, 1992, El-Rouby S, és mtsai, 1993, Cordone I, és mtsai, 1998). A mi esetünkben p53-as mutációkat nem csak akkor találtunk, ha a beteg rezisztens volt az interferon vagy nukleozid analóg kezelésekre, de akkor is, ha a beteg jól reagált a terápiára. Míg az optimális szekvenálási adatok megbízhatósága maximálisnak számítható, addig az SSCP érzékenysége ez esetben kb. 70%-os. Így az olyan mutációkról, amelyek a leukémiás sejtek kevesebb mind a 20%-át érintik, feltételezhető, hogy SSCP vizsgálattal nem mutathatók ki. Mivel a HSL betegek legnagyobb része aleukémiás volt, a hajas sejtek gyakorisága a perifériás vérben 5% alatti. Így arra következtetünk, hogy egy öröklött mutáció egy allélen belül destabilizálja a gént és szerepet játszhat a második allél elvesztésében. További vizsgálatok szükségesek annak megállapításához, hogy a talált mutációk károsítják-e vagy sem a p53-as fehérjét.
45
Az általunk talált mutációk legnagyobb része (28-ból 25 esetben) az úgynevezett ’hot spotokban’ helyezkedett el, de nem kizárólag a 175, 248 vagy 273 kodonokban, amelyek mutációi gyakran fordulnak elő más onkohematológiai betegségekben. Három mutáció a mutációs ’hot-spot’ kodonon kívül helyezkedett el, mind a három mutáció ugyanabban a DNS mintában volt kimutatható. Ezeket a mutációkat tisztított T sejtekből izolált DNS-ben találtuk annál a betegnél, aki a betegség aleukémiás formáját mutatta. A kettős transzverzió, amelyet a 8-as exonban találtuk 7 aleukémiás betegnél, igen érdekes. Véleményünk szerint alátámasztja azt a hipotézist, hogy a T sejtek kulcsfontosságúak a HSL pathogenezisében. Továbbá a hajas sejtes leukémiás betegeknél megtalálható egy bizonyos fajta kromoszomális aberráció, amely nem jellemző a B-sejtes leukémiákra. Haglund (Haglund és mtsai, 1997) rámutattak, hogy az 5-ös kromoszóma érintett azokban a clonális aberrációkban, amelyek megtalálhatóak voltak 30-ból 12 HSL-es betegnél (40%-nál) és a leggyakrabban triszómiaként fordultak elő, de emellett a pericentrikus inverzió és az intersticiális deléciók is jelen voltak, amelyek az 5q13-as régiót érintették. Hasonló jelegű vizsgálatokat folytattak más kutatócsoportok is (Brito-Babapulle V. és mtsai, 1994, Wu X. és mtsai, 1997, Wu X, és mtsai, 1999). A p53 allél-vesztésének fontos jelentősége van a HSL-es betegek klinikai kórlefolyásában. A hematológiai malignitásokban a p53-as pontmutációkhoz társulhat a másik p53-as allél 17p13.1 deléció által történő elvesztése (Wu X és mtsai, 1999). A mi munkánk nem irányult az allélvesztés direkt felmérésére, de az általunk kapott szekvencia adatok arra utalnak, hogy a másik allél is deletálódott. Van azonban egy lényeges különbség, ami a HSL és a többi hematológiai malignitás mutációs mechanizmusát illeti: a mi HSL mintáinkban egy tranzíciós mutáció sem volt kimutatható a CpG dinukleotidoknál. Ezzel ellentétben, a legtöbb hematológiai malignitásnál a tranzíciók általában a CpG dinukleotidoknál jönnek létre, amely arra utal, hogy DNS metiláció által indukált citozin deamnináció jön létre (Ichikawa A, és mtsai, 1997). Mi 7 esetben találtunk dupla transzverziót a 8-as exonban, ami meglehetősen konzekvens, új adat, és nem mondható jellemzőnek a többi leukémiás betegségben. Összefoglalva, 61 betegből 17 esetben találtunk p53 mutációt. Ez a mutációs gyakoriság, amit tanulmányunkban találtunk ebben a HSL vizsgálati anyagban nagyobb, mint a többi B-sejtes lymphoproliferatív malignításokban, (Fenaux és mtsai, 1992, Greiner és mtsai, 1996, Ichikawa és mtsai, 1997). A három tranzíció egyike sem CpG dinukleotidoknál jött létre, ami szintén eltérő mutációs mechanizmusra utal, összehasonlítva más hematológiai malignitásokban kezelt betegekkel.
46
A 8-as exonban talált gyakori dupla transzverziós mutációk jelenléte az aleukémiás esetekben arra utal, hogy ismét meg kell vizsgálni a T sejtek kölcsönhatásait a HSL-ben. Szintén további vizsgálat szükséges annak eldöntésére, hogy a relatív magas p53 mutációs ráta, amit a HSL betegekben találtunk, befolyásolja-e közvetlen módon az interferon-alfa és a nukleozid analógos kezelést, és az ezekkel szemben tanúsított esetleges gyógyszerrezisztenciát. 6.3
DNS metiláció szerepe mutációk kialakulásában A DNS épségének megőrzésében, a replikácios mechanizmus integritásának
biztosításában a DNS metilációnak fontos szerepe van (Schroeder M, Mass MJ, 1997, Toyota M, és mtsai, 2000, Yang L, Sasaki MS, 2000). Korábbi metilációs tanulmányunkban rámutattunk, hogy a p53-as gén mutációi vastagbél tumorokban és hematológiai malignításokban nem kimondottan a metilációt követő deaminálás, hanem a molekuláris szinten létrejött nukleotid deléciók és inzerciók hozzák létre. Az általunk kapott szekvenálási adatokból látszik, hogy a mutációk többsége nem CàT tranzíció jellegű, amely 5-metilcitozin (5mC) deaminációt jelezhet (Marcsek és König, 1998). A humán genomon belül a DNS citozin (C) metilációja a leggyakoribb megfigyelt DNS modifikáló esemény. Amennyiben a DNS metiltranszferáz (DNA Mtase) hoz létre mutációt a kódoló régióban, strukturális génváltozás jöhet létre, és ez a későbbiekben a protein funkciójának megváltozásához vezethet. A ’CàT’ tranzíciók a CpG régióknál a leggyakoribb mutációk egyike, amelyet már korábban is megfigyeltek a p53 génnél, a vastagbél daganatok kialakulásában és a germinális vonalon, egyaránt (Li-Fraumeni kórkép). Az össz-mutáns ’hot-spot’-ok 5-metilcitozinra metilálódnak és feltehetően ezen mutációk többségét a spontán hidrolitikus deamináció hozza létre, amely e bázist tyminre cseréli (Schmutte és mtsai, 1996). A mi vizsgálataink során a CàT tranzíciók a szekvenált p53 5, 6, 7 és 8-as exonokban nem a CpG régióba estek. Mivel hogy a 5mC gyakorisága a nem-CpG régiókban meglehetősen alacsony (Grigg és Clark, 1994), ez meglehetősen valószínűtlenné teszi, hogy bármely észlelt tranzíció - amely a leggyakrabban érintett p53 kódoló régiójában jött létre - a DNS Mtase – által létrehozott 5mC enzimatikus deaminációnak lenne a következménye. Így a mutációk molekuláris mivoltát, a kodonokon belül létrejött pontmutációkban kell keresni.
47
Új megállapítások A célkitűzésben felvetett kérdésekben, az alábbi megállapításokra jutottunk: 1.
Igazoltnak látszik, hogy térségünkben a colorectális daganatokban a K-ras és p53
mutációk gyakorisága esetenként halmozottabb és változatosabb mutációs spektrummal bír, amely nem csak a ’hot-spot’ kodonokat érinti. Az általunk alkalmazott primerek lehetőséget nyújtottak a K-ras kodon 12, 13 (hot-spot) kívüli egyébb kodonok mutációinak a megfigyelésére. Figyelemree méltó megfigyelés továbbá, hogy: ·
a mutációk gyakorisága a malignus progresszióval emelkedik. Dukes C-ben magasabb, mint Dukes B-ben.
·
a p53 gén exon 7 szakaszán a többszörös mutációk a Dukes C stádiumú tumor mintáiban gyakoribbak, mint Dukes B-ben.
2.
Mivel a HSL malignizálódásának progressziója rendkívül ritka, arra számítottunk,
hogy az általunk talált p53 mutációk gyakorisága alacsony lesz. Az eredmények nem ezt igazolták, ugyanis a betegeknél a mutációs arány meglehetősen magas volt, meghaladta a 28%-ot. Ez a mutációs gyakoriság, amit a HSL tanulmányunkban találtunk, ebben a vizsgálati anyagban nagyobb, mint a többi B-sejtes lymphoproliferatív malignitásokban. 3.
Az általunk végzett DNS metilációs vizsgálatok arra utalnak, hogy a mutációk
molekuláris mivolta nem a metiláció / 5mC de-aminacióban rejlik, hanem azt, a vizsgált p53 gén, kodonjain belül létrejött pontmutációkban (nukleotid deléció és inszerció) kell keresni.
48
7.
Irodalomjegyzék
Ames BN (1999): Micronutrient deficiencies. A major cause of DNA damage. Ann N Y Acad Sci; 889: 87-106. Bach I., Szemenyei K., Kelemen E (1978).: “Hairy Cell” leukemia. Orv. Hetilap, 119: 14831486. Baserga R (1985). The biology of Cell Reproduction. Cambridge: Harvard University Press. Benhattar J. Losi L., Chaubert P., Givel J.C., Costa J. (1993) Prognostic significance of KRas mutations in colorectal carcinoma. Gastroenterology 104: 1044-1048. Beranek M, Bures J, Palicka V, Jandik P, Langr F. & Nejedla E. (1999): A relationship between K-ras gene mutations and some clinical and histologic variables in patients with primary colorectal carcinoma Clin Chem Lab Med., 37:723-727 Bodmer, WF, Bailey C, Bodmer J, et all (1987): Localisation of the gene for familial adenomatous polyposis on chromosome 5. Nature, 328: 614-616. Bonaiti-Pellie C. (1999): Genetic risk factors in colorectal cancer. Eur.J. Cancer Prev., 1: S27-32. Bos J. L (1988): The Ras gene family and human carcinogenesis. Mutation Research, 195: 255-271. Bouroncle BA, Wiseman BK, Doan CA (1958): Leukemic reticuloendotheliosis. Blood. 13: 609-630. Bouroncle BA (1994): Thirty-five years in the progress of hairy cell leukemia. Leuk., Lymphoma 14:1.
49
Braun D (2000): Cytokeratin in bone morrow as a predictor for micro-metastasis in breast cancer after chemotherapy. L. Maximilian Press, München. Brito-Babapulle V, Matutes E, Oscier D, Mould S, Catovsky D (1994): Chromosome abnormalities in hairy cell leukemia variant. Genes, Chromosomes and Cancer; 10: 197-202. Bruce, WR (1987): Recent hypotheses for the origin of colon cancer. Cancer Res., 47:42374242. Burkitt, DP (1984): Etiology and prevention of colorectal cancer. Hosp. Pract. 67-77. Buss JE, Sefton BM (1986): Direct identification of palmitic acid as the lipid attached to p21ras. Mol Cell Biol., 6:116-122. Carethers JM (1996): The cellular and molecular pathogenesis of colorectal cancer. Gastroenterol Clin North Am., 25:737-754. Chiang JM (1998): Role of K-ras mutations in colorectal carcinoma. Cancer Lett., 126:179185. Cordon-Cardo C (1995): Mutation of Cell Cycle Regulators: biological and clinical implications for human neoplasia. Am J Pathol, 147: 545. Cordone I, Masi S, Mauro FR, Soddu S, Morsilli O, Valentini T, Vegna ML, Guglielmi C, Mancini F, Giuliacci S, Sacchi A, Mandelli F, Foa R (1998): p53 expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia: a marker of disease progression and poor prognosis. Blood; 91: 4342-4349. Correa P, Raenszel W (1978): Epidemiology of the large bowl. Adv.Cancer Res., 26:1-141. DeVita Jr. V.T., Hellmann S, Rosenberg SA (1982): Principles and the practice of Oncology. J.B. Lippincott Company, Philadelphia, Toronto.
50
Diez-Martin JL, Li CY, Banks PM (1987): Blastic variant of hairy-cell leukemia. Am J Clin. Pathol; 87: 576-583. Demeter J., Kenéz A., Varga F., Lehoczky D. (1999): A hajas sejtes leukémia (HSL) hazai előfordulása az 1974-1998 közti periódusban. A betegség diagnosztikája és kezelése. Magyar Belorvosi Archivum. 52: 141-146. Dukes C.E (1932): The classification of cancer of the rectum. J. Path. Bact., 35:323-332 Eckert KA, Kunkel TA (1991): DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. PCR-Methods and Applications.; 1:17-24. Elnatan J, Goh HS, Smith DR (1996): C-KI-Ras activation and the biological behaviour of proximal and distal colonic adenocarcinomas. European Journal of Cancer. Vol. 32A, No3, 491-497. El-Rouby S, Thomas A, Costin D, Rosenberg CR, Potmesil M, Silber R, Newcomb, E.W (1993): p53 gene mutation in B-cell chronic leukemia is associated with drug resistance and is independent of MDR1-MDR3 gene expression. Blood; 82: 34523459. Evertsson S, Bartik Z, Zhang H, Jansson A, Sun XF (1999): Apoptosis in relation to proliferating cell nuclear antigen and Dukes' stage in colorectal adenocarcinoma. Int J Oncol., 15:53-58. Fahy B, Bold RJ (1998): Epidemiology and molecular genetics of colorectal cancer. Surg Oncol., 7:115-123. Fan J, Bertino JR (1997): K-ras modulates the cell cycle via both positive and negative regulatory pathways. Oncogene. 14: 2595-2607.
51
Fenaux P, Preudhomme C, Lai JL, QuiQuandon I, Jonveaux PH, Vanrumbeke M, LoucheuxLefebvre MH, Bauters F, Berger R, Kerckaert K (1992): Mutations of the p53 gene in B-cell chronic lymphocytic leukemia: a report on 39 cases with cytogenetic analysis. Leukemia; 6: 246-250. Finkelstein SD, Sayegh R, Christensen S, Swalsky PA (1993): Genotypic classification of colorectal adenocarcinoma. Cancer 12: 3827-38 Flinn I.W., Kopecky K.J., Foucar M.K., Head D., Bennett J.M., Hutchinson R.E., Corbett W.E.N., Cassileth P.A., Habermann T., Golomb H., Rai K., Eisenhauer E., Appelbaum F.B., Cheson B.D. and Grever M. (1997): Long-term results in hairy cell leukemia (HCL) treated with pentostatin. Blood 90. 2575a. Froggatt N. J., Leveson St. H., Garner R. C.(1995): Low frequency and late occurrence of p53 and dcc aberrations in colorectal tumors. J Cancer Clin Oncol., 121:7-15. Gilman AG (1984): G proteins and dual control of adenylate cyclase. Cell 36: 577-579. Grander D.(1998): How do mutated oncogenes and tumor supressor genes cause cancer? Medical Oncology 15: 20-26. Greenblatt, M.S., Bennett, W.P., Hollstein, M. and Harris, C.C (1994).: Mutations in the p53 tumor suppresser gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Research, 54: 4855-4878. GreinerTC, Moynihan MJ, ChanWC, Lytle DM, PedersenA, Anderson JR. Weisenburger DD (1996): p53 mutations in mantle cell lymphoma are associated with variant cytology and predict a poor prognosis. Blood, 87: 4302-4310. Grigg G, Clark S (1994): Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays 6: 431-436 Gryfe R, Swallow C, Bapat B, Redston M, Gallinger S, Couture J (1997): Molecular biology of colorectal cancer. Curr Probl Cancer. 21: 233-300. 52
Haglund U, Stellan B, Juliusson G, Gahrton G (1997): Increased frequency of chromosome abnormalities in fibroblasts from hairy cell leukemia patients. Leukemia 12: 21052110 Hernandez L, Fest T, Cazorla M, Teruya-Feldstein J, Bosch F, Peinado MA, 0Piris MA, Montserrat E, Cardesa A, Jaffe ES, Campo E, Raffeld, M (1996): p53 gene mutations and protein overexpression are associated with aggressive variants of mantle cell lymphomas. Blood, 87: 3351-3359. Ichii-S; Takeda-S; Horii-A; Nakatsuru-S; Miyoshi-Y; Emi-M; Fujiwara-Y; Koyama-K; Furuyama-J; Utsunomiya-J; et-al (1993): Detailed analysis of genetic alterations in colorectal tumors from patients with and without familial adenomatous polyposis (FAP). Oncogene. 9: 2399-2405 Ichikawa A, Kinoshita T, Watanabe T, Kato H, Nagai H, Tsushita K, Saito H, Hotta T. (1997): Mutations of the p53 gene as a prognostic factor in aggressive B-cell lymphoma. N Engl J Med., 337:529-534. Jansen J, Hermans J (1981): Splenectomy in hairy cell leukemia: a retrospective multicenter analysis. Cancer 47: 2066-2076. Jeghers H, McKusick VA, Katz KH (1949): Generalized intestinal polyposis and melanin spots of the oral mucosa, Lips and Digits. I. N Engl J Med; 241: 993-1005. Jessup JM, McGinnis LS, Steele GD et all (1996): The National Cancer Data Base Report on Colon Cancer. Cancer., 78:918-926. Johnson LR, Christensen J, Jackson MJ, Jacobson ED, Walsh JM (1987): Physiology of the gastrointestinal tract. Raven Press, N.Y. Kaibara N, Yurugi E, Koya S (1984): Promoting effect of bile acids on the chemical transformation of C3H/10T1/2 fibroblasts in vitro. Cancer Res., 44:5482-85.
53
Kampman E, Voskuil DW, van Kraats AA, Balder HF, van Muijen GN, Goldbohm RA, van't Veer P (2000): Animal products and K-ras codon 12 and 13 mutations in colon carcinomas. Carcinogenesis. 21: 307-309. Kampman E, Slattery ML, Caan B, Potter JD (2000): Calcium, vitamin D, sunshine exposure, dairy products and colon cancer risk. Cancer Causes and Control 11 : 459-466. Kikuchi Y.R., Konishi M., Ito S., Seki M., Tanaka K., Maeda Y., Iino H., Fukayama M., Koike M., Mori T., Sakuraba H., Fukunari H., Iwama T., Miyaki M (1992): Genetic changes of both p53 alleles associated with the conversion from colorectal adenoma to early carcinoma in familial adenomatous polyposis and non-familial adenomatous polyposis patients. Cancer Res., 52: 3965-3971. König EA, Kusser WC, Day C, Porzsolt F, Glickman BW, Messer G, Schmid M, de Chatel R, Marcsek ZL, Demeter J (2000): p53 mutations in hairy cell leukemia. Leukemia 706 -711 König EA, Köves I, Rasinariu A, Popp RA, Kusser WC, Soyonki K, Kovács A., Glickman BW, Jeney A, Marcsek ZL (2001): Alterations of K-ras and p53 mutations in colorectal cancer patients in Central Europe. Journal of Toxicology and Environmental Health, PartA, megjelenik 2001. Márciusban Korn SH; Moerkerk PT; de-Goeij AF (1993): K-ras point mutations in routinely processed tissues: non-radioactive screening by single strand conformational polymorphism (SSCP) analysis. J-Clin-Pathol., 46:621-623. Korsmeyer SJ, Greene WC, Cossman J, Hsu SM, Jensen JP, Neckers LM, Marshall SL, Bakhshi A, Depper JM, Leonard WL, Jaffe ES, Waldmann TA (1983): Rearrangement and expression of immunoglobulin genes and expression of Tac antigen in hairy cell leukemia. Proc. Natl Acad. Sci., USA, 80: 4522-4526. Kristóf T, Újszászy L (1994): Öröklődés és a vastagbélrák. In: Újszászy L, Simon L, (eds) Colorectalis carcinoma. Magyar Gasztroenterológiai Társaság-Medicom, Glaxo, Budapest, 49-67.
54
Levi F., La Vecchia C., Lucchini F. et all (1995).: Cancer mortality in Europe 1990-1992. Eur.J.Cancer Prev., 5:389-417. Lynch HT, de la Chapelle A.( 1999): Genetic susceptibility to non-polyposis colorectal cancer. J Med Genet; 36: 801-818. Lynch HT, Smyrk T.(1996): Colorectal cancer, survival advantage, and hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma. Gastroenterology; 110: 943-947. Lynch HT, Smyrk T. (1996): Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) An updated review. Cancer.; 78:1149-1167. Lynch HT, Smyrk TC.(1998): Identifying hereditary nonpolyposis colorectal cancer. N Engl J Med; 338: 1537-1538. Lynch HT, Watson P.(1998): Multiple HNPCC tumours: ask the family!. Gut.; 43:596-597. Lindblom A., Tannergard P, Werelius B, et all (1993): Genetic mapping of a second locus predisposing to hereditary non-polyposis colorectal cancer. Nat. Genet., 5:279-282. Losi L., Roncucci L., Di Gregorio C., Ponz de Leon M., Benhattar J. (1996): K-Ras and p53 mutations in human colorectal aberrant crypt foci. J. of Pathology, 178: 259-263. Losi L, Ponz de Leon M, Jiricny J, Di Gregorio C, Benatti P, Percesepe A, Fante R, Roncucci L, Pedroni M, Benhattar J (1997): K-ras and p53 mutations in hereditary nonpolyposis colorectal cancers. Int J Cancer. 74: 94-96. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1982): Molecular Cloning. Cold Spring Harbour Laboratory. Manne V, Bekesi E, Kung HF (1985): Ha-ras proteins exhibit GTPase activity: point mutations that activate Ha-ras gene products result in decreased GTPase activity. Proc Natl Acad Sci U S A, 82:376-380.
55
Marcsek Z.L., König EA (1998): Accumulating mutations of p53 in many tumours do not arise from methylation/deamination processes, but rather from nucleotide deletions and insertions. Biol.Chemistry, 379:545-547. Marshall C.J.(1991): Tumor suppressor genes. Cell. 64: 313. Masato O., Youichi S., Takao S. and Kenshi H.(1989): Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphism using the polymerase chain reaction Genomics, 5: 874-879. Michalovitz D., Halevy O., Oren M (1991): p53 mutations: gains or losses. J. Cell Biochem. 45: 22. Moll UM, Schramm LM. (1998): p53 – an acrobat in tumorigenesis. Crit.Rev.Oral Biol. Med. 1: 23-37 Morrin M, Kelly M, Barrett N, Delaney P (1994): Mutations of Ki-ras and p53 genes in colorectal cancer and their prognostic significance. Gut, 35: 1627-1631 Naoyuki Y., Toshinari M., Atsushi O., Masahiko O. (1995): Frequent and characterisitc K-ras activation and absence of p53 protein accumulation in aberrant crypt foci of the colon. Gatroenterology, 108: 434-440. Nazeer T, Burkart P, Dunn H, Jennings TA, Wolf B (1997): Blastic transformation of hairy cell leukemia. Arch Pathol Lab Med; 121: 707-713. Norheim Andersen S, Lovig T, Fausa O, Rognum TO (1999): Germline and somatic mutations in exon 15 of the APC gene and K-ras mutations in duodenal adenomas in patients with familial adenomatous polyposis. Scand J Gastroenterol., 34:611-617. Nurse P (1994): Ordering S phase and M phase in the cell cycle. Cell, 79: 547. Oncogene 8: 2399-2405.
56
Onda M, Abe R, Tsuchiya A, Fukushima T, Ando Y, Yoshida T (1997): K-ras and p53 gene mutations in colorectal cancer in 57 Japanese patients. Fukushima J Med Sci., 43: 2939. Pajkos G, Kiss I, Sándor J, Ember I, Kisházi P (1999): A K-ras onkogén 12, 13 és 61 kodonjai mutációjának prognosztikus értéke colorectalis carcinomában. Orvosi Hetilap, 140, 1673-1679. Pauly M., Schmitz M., Kayser I., Türeci Ö., Lagoda P., Seitz G., Dicato M. (1997): Ki-ras Oncogene and p53 tumour supressor gene mutations in colorectal carcinomas from the European Saar-Luxembourg region are less fequent than predicted by the classic adenoma-carcinoma sequence model. Eur J. Cancer. 33: 2265-2272. Petmitr S, Pinlaor S, Thousungnoen A, Karalak A, Migasena P (1998): K-ras oncogene and p53 gene mutations in cholangiocarcinoma from Thai patients. Southeast Asian J Trop Med Public Health. Mar; 29 (1): 71-5. Portera CA Jr, Berman RS, Ellis LM (1998): Molecular determinants of colon cancer metastasis. Surg Oncol., 7:183-95 Pricolo VE, Finkelstein SD, Wu TT, Keller G, Bakker A, Swalsky PA, Bland KI (1996): Prognostic value of TP53 and K-ras-2 mutational analysis in stage III carcinoma of the colon. Am J Surg., 171:41-46. Ronchetto F (1998): Genetic alterations and molecular mechanisms underlying colorectal tumorigenesis. Minerva Med., 89:163-168. Ruco LP, Procopio A, Maccallini V, Calogero A, Uccini S, Annino L, Mandelli F, Baroni CD (1983): Severe deficiency of natural killer activity in the peripheral blood of patients with hairy cell leukemia. Blood 61: 1132-1137. Sebai H, Ged C, Bonichon F, de Verneuil H, Longy M (1998): Genetic alterations in colorectal cancer, comparative analysis of deletion events, and point mutations. Cancer Genet. Cytogenet. 104: 32-38. 57
Shaw-P; Tardy-S; Benito-E; Obrador-A; Costa-J (1991):
Occurrence of Ki-ras and p53
mutations in primary colorectal tumors. Oncogene. Nov., 6: 2121-2128. Sherr CJ (1994): G1 phase progression: cycling on cue. Cell, 73: 551. Shivapurkar N, Huang L, Ruggeri B, Swalsky PA, Bakker A, Finkelstein S, Frost A, Silverberg S (1997): K-ras and p53 mutations in aberrant crypt foci and colonic tumors from colon cancer patients. Cancer Lett., 115:39-46. Schmutte C, Yang AS, Nguyen TT, Beart RW, Jones PA (1996): Mechanisms for the involvement of DNA methylation in colon carcinogenesis. Cancer Res.10: 23752381 Schrek R., Donelly W.J. (1966): “Hairy” cells in blood in lymphoreticular neoplastic disease and “flagellated” cells of normal lymph nodes. Blood. 27: 199-211. Schroeder M, Mass MJ (1997): CpG methylation inactivates the transcriptional activity of the promoter of the human p53 tumor suppressor gene. Biochem Biophys Res Commun 235: 403-406 Sugano-K; Kyogoku-A; Fukayama-N; Ohkura-H; Shimosato-Y; Sekiya-T; Hayashi-K (1993): Methods in laboratory investigation. Rapid and simple detection of c-Ki-ras2 gene codon
12
mutations
by
nonradioisotopic
single-strand
conformation
polymorphism(SSCP)analysis. Lab-Invest., 68:361-366. Sutton HE (1965): Quantitative gene action in man. Ann.Genet., 8: 87-88 Tadashi Hongyo, Gregory S. Buzard, Richard J. Calvert and Christopher M. Weghorst (1993): Cold SSCP: a simple, rapid and non-radioactive method for optimized single strand conformation polymorphism analyses. Nucleic Acid Research, 21: 3637-3642. Tadashi H., Gregory S. Buzard, Domenico Palli, Christopher M.Weghorst, Andrea Amorosi, Monica Galli, Neil E. Caporaso, Joseph F. Fraumeni, Jr., and Jerry M. Rice (1995):: Mutations of the K-ras and p53 genes in gastric adenocarcinomas from a highincidence region around Florence, Italy. Cancer Research 55: 2665-2672. 58
Tamanoi F, Walsh M, Kataoka T, Wigler M (1984): A product of yeast RAS2 gene is a guanine nucleotide binding protein. Proc Natl Acad Sci U S A, 81:6924-6928. Toyota M, Issa JP (2000): The role of DNA hypermethylation in human neoplasia. Electrophoresis. 21: 329-333. Urosevic-N; Krtolica-K; Skaro-Milic-A; Knezevic-Usaj-S; Dujic-A (1993): Prevalence of Gto-T transversions among K-ras oncogene mutations in human colorectal tumors in Yugoslavia. Int-J-Cancer. 54: 249-254. Vallinatou K, Brito-Babapulle V, Matutes E, Atkinson S, Catovsky D (1998): P53 allele deletion and trisomy 12 in hairy cell leukaemia (HCL) and hairy cell leukaemia variant (HCL-V). Clinicopathologic correlations. Blood; 92: 266:272. Várbíró M, Kelényi G (1981): Amalignus Lymphoma Referencia Centrum 3 éve.Orv. Hetilap, 122: 2125. Vogelstein B., Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, Preisinger AC, Leppert M. Nakamura Y., White R., Smits AMM, Bos JL (1988): Genetic alterations during colorectal tumor gevelopment. N. Engl. J. Med., 319:525-532. Weinberg R.A. (1991): Tumor suppressor genes. Science, 254: 1138. Willingham MC et al (1980): Localization of the src gene product of the Harvey strain of MSV to plasma membrane of transformed cells by electron microscopic immunocytochemistry. Cell. 19: 1005-1014. Wu X, Merup M, Juliusson G, Jansson M, Stellan B, Grander D, Zabarovsky E, Liu Y, Pasokoukotskaja T, Gahrton G, Einhorn S,(1997): Characterization of a hairy cell leukemia-associated 5q13.3 inversion breakpoint. Genes Chromosomes Cancer. 20: 337-346.
59
Wu X, Ivanova G, Merup M, Jansson M, Stellan B, Grander D, Zabarovsky E, Gahrton G, Einhorn S,(1999): Molecular analysis of the human chromosome 5q13.3 region in patients with hairy cell leukemia and identification of tumor suppressor gene candidates. Genomics. 60: 161-171. Yang L, Sasaki MS (2000): Trans-regulated silencing and reactivation of TP53 tumor suppressor gene in malignant transformation and its reversion. Jpn J Cancer Res. 11: 1111-1118 Yuka Y.I., Kazuhiro S., Takahiro F., Sakan M., Tsutomu C (1994).: p53 mutations in flat and polypoid type colorectal tumors detected by temperature gradient gel electrophoresis. Digestive diseases and Sciences, Vol. 39, pp: 2043-2048.
Zhang H, Nordenskjold B, Dufmats M, Soderkvist P, Sun XF (1998): K-ras mutations in colorectal adenocarcinomas and neighbouring transitional mucosa. Eur J Cancer. 34: 2053-2057.
60
8.
Köszönetnyilvánítás
Doktori munkámat részben az MTA-SOTE Molekuláris Genetikai Kutatócsoportban, részben a kanadai University of Victoria, Centre for Environmental Health (CEH), Dept. of Molecular Biology Egyetemen végeztem. Külön köszönettel tartozom Dr. Marcsek Zoltánnak, az MTA-SOTE Molekuláris Genetikai Kutatócsoport vezetőjének, akinél a munkám legnagyobb részét végeztem és ez nagyban hozzájárult szakmai fejlődésemhez. Köszönettel tartozom Dr. Jeney András professzor úrnak, a SOTE I-es számú Patológia és Kísérletes Rákkutató Intézet doktori programvezetőjének. Köszönöm Dr. Demeter Juditnak, a Semmelweis Egyetem ÁOK I-es Belklinika docensének, hogy nagy segítségemre volt mind a HSL minták klinikai elemzésében, mind a különböző klinikai kérdések tisztázásában. Kanadai részről köszönettel tartozom Dr. Wolfgang Kusser, molekuláris genetikusnak és Dr. Barry W. Glickman professzor úrnak, az University of Victoria, CEH molekuláris biológia osztály vezetőjének - aki kétszer is befogadott munkacsoportjába kísérleteim kivitelezéséhez mindazért, hogy szakmai, baráti irányításukkal lehetővé tették doktori munkám. Továbbá köszönettel tartozom mindazoknak, akik hosszú évek során a különböző laboratóriumokban és baráti körben háttért biztosítottak munkám elvégzéséhez.
61
