ISOLASI DAN IDENTIFIKASI KAPANG ENDOFIT DALAM RIMPANG TEMU GIRING

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI KAPANG ENDOFIT DALAM RIMPANG TEMU GIRING (Curcuma heyneana Val. & van Zijp) SERTA ANALISIS SECARA KUANTITATIF TERHADAP METABOLIT SEKUNDER YANG DIHASILKAN Indriana Rahmawati1, Utami Sri Hastuti2, Sitoresmi Prabaningtyas2 1 Program Studi Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Malang 2 Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Malang Jalan Semarang 5 Malang 65145, Indonesia 1 [email protected] ABSTRACT Temu giring plant is a sort of a medicinal plant. Some of endophytic mold species lives in various species of plants’s tissues. The endophytic mold can produces the same secondary metabolite as well as that produce by its host plant. This research is done to 1) isolate and identificate endophytic mold in the temu giring rhizome, 2) observe histologically to the location of endophytic mold in temu giring rhizome tissue, and 3) analyze the secondary metabolite which is produced by endophytic mold in temu giring rhizome quantitatively. The reseach results showed that: 1) there are 5 species endophytic mold which can be isolated from temu giring rhizome, namely: F. sporotrichioides, A.versicolor, A. terreus, F. oxysporum, and C. sphaerospermum, 2) endophytic mold mycelium is located in parenchyma cells on temu giring cortex rhizome, 3) each endophytic mold species can produce secondary metabolite. The analyzed result is the alkaloid levels is in the range of 0.31-0.84 g/L, flavonoids in the range of 0.70-2.30 g/L, terpenoids in the range of 0.02-0.07 g/L, and phenols in the range of 1.97-5.75 g/L. Keywords: endophytic fungi, temu giring rhizome, secondary metabolite

PENDAHULUAN Tanaman dapat berpotensi sebagai obat karena mengandung senyawa aktif hasil metabolisme sekunder seperti alkaloid, steroid, terpenoid, flavonoid, saponin, glikosida, tanin, dan lain sebagainya (Wink, 2010). Salah satu jenis tanaman yang telah teridentifikasi dan terbukti berpotensi sebagai tanaman berkhasiat obat adalah temu giring (Curcuma heyneana Val. & van Zijp) dari genera Curcuma yang tergolong famili Zingiberaceae. Rimpang temu giring merupakan bagian tanaman temu giring yang biasanya dimanfaatkan untuk obat. Berbagai jenis tanaman khususnya dalam jaringan tanaman dapat dijumpai kapang endofit. Kapang endofit mengambil sedikit nutrisi dari tubuh inangnya, namun tidak bersifat patogen dan tidak menyebabkan kematian inangnya (Deacon, 2006). Beberapa spesies kapang endofit yang telah berhasil diisolasi dari jaringan berbagai jenis tanaman ternyata mampu menghasilkan metabolit sekunder yang dapat dimanfaatkan dalam bidang kesehatan dan pertanian (Strobel & Daisy, 2003). Ada kemungkinan bahwa di dalam jaringan rimpang temu giring juga terdapat kapang endofit penghasil senyawa-senyawa aktif yang bersifat antimikroba. Spesies-spesies kapang endofit dalam rimpang temu giring masih belum teridentifikasi sehingga perlu diteliti. Spesies-spesies kapang endofit harus ditumbuhkan pada medium cair yang bersifat spesifik agar dapat tumbuh dan menghasilkan senyawa metabolit sekunder. Fitriyah dkk (2013) menyatakan bahwa kapang endofit dapat ditumbuhkan dalam medium Czapek. Senyawa metabolit sekunder yang terdapat 1

2

dalam medium Czapek cair sebagai hasil metabolisme sekunder kapang endofit tersebut dapat di analisis secara kuantitatif untuk memastikan kandungan senyawa yang terdapat di dalamnya. Penulis membatasi penelitian ini pada senyawasenyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol. Apabila penelitian ini berhasil mengungkapkan adanya spesies kapang endofit penghasil senyawa-senyawa aktif yang hidup dalam jaringan rimpang temu giring maka diharapkan dapat membantu bidang Farmasi dalam hal penyiapan bahan alami yang langsung diperoleh melalui kultur kapang endofit penghasil senyawa aktif tersebut. Tujuan penelitian ini adalah 1) mengidentifikasi spesies-spesies kapang endofit yang terdapat dalam rimpang temu giring (Curcuma heyneana Val. & v. Zijp), 2) mengobservasi secara histologik letak kapang endofit dalam jaringan rimpang temu giring, dan 3) menganalisis secara kuantitatif metabolit sekunder yaitu alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol dalam supernatan hasil kultur cair setiap spesies kapang endofit pada rimpang temu giring. METODE PENELITIAN Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksploratif yang bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi spesies-spesies kapang endofit dalam rimpang temu giring, mengobservasi secara histologik letak kapang endofit dalam jaringan rimpang temu giring serta untuk menganalisis secara kuantitatif metabolit sekunder yaitu alkaloid, flavonoid, terpenoid dan fenol dari supernatan hasil kultur cair setiap spesies kapang endofit dalam rimpang temu giring. Populasi dan Sampel Populasi dalam penelitian ini adalah semua kapang endofit yang ditemukan dalam tanaman temu giring yang terdapat di lahan UPT Materia Medica Batu. Sampel yang digunakan adalah semua spesies kapang endofit rimpang tanaman temu giring. Waktu dan Tempat Penelitian ini dimulai pada bulan September 2014 sampai bulan April 2015, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Negeri Malang dan di Laboratorium Kimia Universitas Muhammadiyah Malang. Alat dan Bahan Alat: cawan petri, Erlenmeyer 100 mL, mikropipet 10 mL, sentrifuge, lampu spiritus, jarum inokulum, Laminar Air Flow (LAF), autoklaf, oven kering, tabung reaksi, skalpel, pinset, cover glass, object glass, inkubator, shaker, dan mikroskop cahaya. Bahan: aquades steril, kapas, kasa, komponen medium Czapek antara lain NaNO3, KCl, MgSO4, FeSO4.7H2O, K2HPO4, Saccharose, dan agar powder, aluminium foil, rimpang temu giring sehat, alkohol 70%, alkohol 95%, NaOCl 1%, kloramfenikol, tisu, Lactophenol, dan Lactophenol cotton blue.

3

Prosedur Kerja Isolasi Kapang Endofit Rimpang temu giring yang sehat dicuci bersih dengan air kemudian direndam di dalam NaOCl 1% selama 1 menit kemudian dibilas dengan aquades steril, lalu direndam di dalam alkohol 70% selama 1 menit, selanjutnya dibilas lagi dengan aquades steril (Patel dkk., 2013). Rimpang dipotong dengan ketebalan 0,5 cm. Setiap potongan diinokulasikan diatas medium lempeng Czapek agar yang mengandung kloramfenikol (100 mg/L media), kemudian diinkubasikan di dalam inkubator pada suhu 25-27oC selama kurang lebih 7x24 jam. Setelah diinkubasi, dilakukan pembuatan biakan murni kapang endofit di medium miring dan medium lempeng untuk pengamatan makroskopis koloni, meliputi: warna koloni, diameter koloni, sifat koloni, dan warna bagian dasar koloni. Pembuatan Preparat dan Identifikasi Kapang Endofit Identifikasi kapang endofit dilakukan dengan membuat preparat kapang endofit melalui metode Slide culture. Setelah preparat siap digunakan, dilakukan pengamatan ciri mikroskopis pada setiap isolat kapang endofit kemudian dirujukkan pada buku kunci identifikasi fungi. Pembuatan Kultur Cair Spesies Kapang Endofit Menurut (Sharma dan Kumar, 2013), isolat murni kapang endofit yang tumbuh di medium lempeng dipotong dengan ukuran 5 cm2 kemudian diinokulasikan ke dalam 80 mL medium Czapek cair, lalu diinkubasikan dengan pengocokan berkecepatan 120 rpm selama 7x24 jam pada suhu ruang. Hasil pengocokan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang. Supernatan hasil sentrifugasi digunakan untuk menganalisis kadar beberapa metabolit sekunder yaitu alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol. Observasi secara Histologik Letak Kapang Endofit dalam Jaringan Rimpang Temu Giring Rimpang temu giring yang sehat dan telah disterilisasikan permukaannya selanjutnya diiris setipis mungkin secara melintang kemudian hasil irisan diletakkan pada kaca benda yang ditetesi aquades steril lalu ditutup dengan kaca penutup. Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya kemudian hasil pengamatan di foto dengan menggunakan kamera digital. Analisis secara Kuantitatif Metabolit Sekunder yang Terkandung dalam Supernatan Hasil Kultur Cair Kapang Endofit Kandungan metabolit sekunder pada supernatan hasil kultur cair kapang endofit diujikan di Laboratorium Kimia, Universitas Muhammadiyah Malang dengan menggunakan metode spektrofotometer. Teknik Analisis Data Data ciri-ciri makroskopis dan mikroskopis kapang endofit yang diperoleh selanjutnya dideskripsikan kemudian dirujukkan pada buku kunci identifikasi fungi untuk menentukan nama spesies kapang endofit. Analisis letak kapang endofit dilakukan melalui pengamatan pada preparat irisan melintang rimpang temu giring. Hasil uji secara kuantitatif metabolit sekunder dianalisis secara kimia

4

dengan metode spektrofotometer untuk menentukan kadar metabolit sekunder alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol yang dihasilkan oleh setiap spesies kapang endofit yang ditemukan. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi dan Identifikasi Kapang Endofit dalam Rimpang Temu Giring Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat lima spesies kapang endofit yang berhasil diisolasi dari rimpang temu giring yaitu Fusarium sporotrichioides, Aspergillus versicolor, Aspergillus terreus, Fusarium oxysporum, dan Cladosporium sphaerospermum (lihat Gambar 1).

Gambar 1. Ciri Mikroskopis Isolat Kapang Endofit dari Rimpang Temu Giring Keterangan: a. Fusarium sporotrichioides, b. Aspergillus versicolor, c. Aspergillus terreus, d. Fusarium oxysporum, dan e. Cladosporium sphaerospermum

Spesies-spesies kapang yang berhasil diidentifikasi dalam penelitian ini adalah spesies-spesies kapang endofit pada rimpang temu giring yang tidak dapat menyebabkan kerugian atau penyakit bagi tanaman temu giring. Adapun Doolotkeldieva dan Bobusheva (2014) menyatakan berdasarkan hasil penelitiannya bahwa Fusarium, Aspergillus, dan Cladosporium merupakan genusgenus kapang yang sering ditemukan sebagai endofit dalam jaringan sistem perakaran tanaman inang. Berdasarkan beberapa laporan hasil penelitian sebelumnya, spesies-spesies kapang endofit yang ditemukan dalam rimpang temu giring dalam penelitian ini ternyata juga ditemukan sebagai kapang endofit pada tanaman lainnya. Beberapa hasil penelitian menyebutkan bahwa spesies kapang Fusarium sporotrichioides diantaranya ditemukan sebagai kapang endofit daun Dioscorea pentaphylla (Shankar & Shashikala, 2010). Aspergillus versicolor ditemukan sebagai kapang endofit diantaranya pada daun Ocimum sanctum,dan akar tanaman tomat (Sharma & Kumar, 2013; Chadha dkk.,2015). Aspergillus terreus juga

5

ditemukan sebagai kapang endofit pada daun dan akar tumbuhan Jatropha curcas, dan daun Ocimum sanctum (Singh, 2013; Sharma & Kumar, 2013). F.oxysporum ditemukan pada daun dan ranting tanaman obat Antidesma madagascariense (Jeewon dkk., 2013). Cladosporium sphaerospermum telah ditemukan sebagai kapang endofit pada akar tanaman kedelai kultivar Daemangkong (Hamayun dkk.,2009) dan akar tanaman Dendrobium crumenatum (Mangunwardoyo dkk., 2012). Berdasarkan informasi mengenai spesies-spesies kapang endofit yang juga ditemukan pada beberapa jenis tanaman lainnya tersebut maka hasil penelitian ini memperkuat pembuktian tentang adanya beberapa spesies kapang endofit yang terdapat juga dalam rimpang temu giring. Hasil Observasi Histologik Letak Kapang Endofit dalam Jaringan Rimpang Temu Giring Hasil pengamatan histologik mengenai letak kapang endofit dalam jaringan rimpang temu giring menunjukkan bahwa miselium kapang endofit terletak diruang antar sel pada jaringan korteks (lihat Gambar 2a). Miselium kapang endofit tidak dijumpai dalam jaringan vaskular, namun kadang-kadang miselium kapang endofit dapat menembus dinding sel parenkim pada jaringan korteks (lihat Gambar 2b).

Gambar 2. Pengamatan Mikroskopis Letak Kapang Endofit dalam Jaringan Rimpang Temu Giring Keterangan: a. Bagian yang di tunjuk adalah miselium kapang endofit yang terletak di ruang antar sel parenkim pada jaringan korteks, b. Bagian yang ditunjuk adalah miselium kapang endofit menembus dinding sel parenkim

Jaringan korteks yang digunakan sebagai tempat hidup miselium kapang endofit berisi sel-sel parenkima berdinding tipis yang mempunyai ruang antar sel yang berisi udara dan air. Miselium kapang endofit yang dapat menembus dinding sel parenkim akan berada dalam sitoplasma sel yang berisi air (85-90%), garam, karbohidrat, protein, dan lemak (Setjo dkk., 2004). Adanya kandungan air, substansi organik dan anorganik yang tersedia dalam jaringan rimpang temu giring dapat menjadi sumber nutrisi yang dibutuhkan oleh kapang untuk menjaga kelangsungan hidupnya. Hal tersebut merupakan manfaat yang diperoleh oleh kapang endofit dalam bersimbiosis dengan tanaman inangnya. Kapang endofit hanya mengambil sedikit nutrisi sehingga tidak sampai menyebabkan kematian

6

inangnya (Deacon, 2006). Adapun tanaman inang yang ditempati oleh kapang endofit juga mendapat manfaat, misalnya; perlindungan dari serangan mikroba patogen dan serangga predator melalui beberapa macam senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit. Hal ini menunjukkan adanya hubungan simbiosis mutualisme antara kapang endofit dengan tanaman inangnya. Analisis secara Kuantitatif Metabolit Sekunder dari Supernatan Hasil Kultur Cair Kapang Endofit Setiap spesies kapang endofit rimpang temu giring mampu menghasilkan metabolit sekunder yang diujikan yaitu alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol. Kadar kandungan metabolit sekunder pada supernatan hasil kultur cair setiap spesies kapang endofit dalam rimpang temu giring dapat dilihat pada Tabel 1 Tabel 1 Hasil Analisis secara Kuantitatif Metabolit Sekunder pada Supernatan Hasil Kultur Cair Kapang Endofit Rimpang Temu Giring Kode Isolat A B C D E

Nama spesies kapang Fusarium sporotrichioides Aspergillus versicolor Aspergillus terreus Fusarium oxysporum Cladosporium sphaerospermum

Alkaloid 0,52 0,39 0,84 0,34 0,31

Metabolit sekunder (g/L) Flavonoid Terpenoid 1,34 0,04 0,94 0,03 2,30 0,07 0,79 0,03 0,70 0,02

Fenol 3,76 2,37 5,75 2,19 1,97

Berdasarkan data uji kuantitatif metabolit sekunder dapat diketahui bahwa kapang endofit rimpang temu giring A.terreus paling berpotensi dalam menghasilkan senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol dengan kadar yang lebih tinggi dibandingkan senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol yang dihasilkan oleh kapang endofit rimpang temu giring F.sporotrichioides, A.versicolor, F.oxysporum, dan C.sphaerospermum. Kapang endofit A.terreus mampu menghasilkan fenol dengan kadar 5,75 g/L dan flavonoid dengan kadar 2,30 g/L. Hasil tersebut lebih tinggi daripada hasil yang diperoleh dari penelitian Sharma dan Kumar (2013) yang melaporkan bahwa ekstrak etil asetat miselium kapang endofit A.terreus yang diisolasi dari daun Ocimum sanctum menghasilkan fenol dengan kadar 0,01 g/100 mL dan flavonoid dengan kadar 0,002 g/100mL. Adanya kemampuan tertinggi dari A.terreus dalam menghasilkan senyawasenyawa metabolit sekunder yaitu alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol mengindikasikan bahwa spesies kapang tersebut mempunyai peranan yang lebih tinggi dalam hal perlindungan terhadap mikroorganisme yang menyebabkan peyakit pada rimpang temu giring dibandingkan dengan keempat spesies kapang endofit lainnya. Hasil penelitian ini menjelaskan bahwa spesies-spesies kapang endofit yang berhasil diidentifikasi dari rimpang temu giring berpotensi sebagai sumber penghasil keempat senyawa metabolit sekunder yang di deteksi. Senyawasenyawa tersebut sangat dibutuhkan dalam bidang farmasi maupun pertanian, khususnya sebagai senyawa-senyawa yang bersifat antimikroba. Hasil penelitian ini dapat menjadi dasar atas saran dalam hal penyediaan senyawa-senyawa metabolit sekunder melalui pembiakkan spesies-spesies kapang penghasilnya, selain dengan mengekstraksi rimpang temu giring sebagai tanaman penghasil seyawa berkhasiat obat. Penelitian ini juga dapat digunakan sebagai dasar atas

7

saran untuk penelitian lebih lanjut yang bertujuan untuk mengeksplorasi spesiesspesies kapang endofit yang berasal dari berbagai jenis tanaman khususnya tanaman berkhasiat obat. Penelitian lain juga dapat dilakukan misalnya penelitian terapan yang bertujuan untuk menguji efektivitas senyawa-senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit terhadap serangga hama pada tanaman, sehingga dapat membantu dalam upaya pengendalian hayati serangga hama. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan dalam penelitian ini ialah 1) kapang endofit yang berhasil diisolasi dari rimpang temu giring yaitu Fusarium sporotrichioides, Aspergillus versicolor, Aspergillus terreus, Fusarium oxysporum, dan Cladosporium sphaerospermum, 2) kapang endofit dalam jaringan rimpang temu giring terletak di sel-sel parenkim pada jaringan korteks dan terdapat juga di ruang antar sel parenkim, dan 3) spesies- spesies kapang endofit dalam rimpang temu giring mampu menghasilkan alkaloid dengan kadar yang berkisar antara 0,31-0,84 g/L, flavonoid berkisar antara 0,70 – 2,30 g/L, terpenoid berkisar antara 0,02 - 0,07 g/L, dan fenol berkisar antara 1,97 – 5,75 g/L. Saran yang dapat diberikan ialah 1) perlu dilakukan penelitian sejenis yang bertujuan untuk mengeksplorasi spesiesspesies kapang endofit yang berasal dari berbagai jenis tanaman berkhasiat obat, 2) perlu dilakukan penelitian terapan yang bertujuan untuk menguji efektivitas senyawa-senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit terhadap serangga hama pada tanaman sebagai upaya pengendalian hayati serangga hama. DAFTAR RUJUKAN Chadha, N., Prasad, R.,& Varma, A. 2015. Plant Promoting Activities of Fungal Endophyte Associated with Tomato Roots From Central Himalaya, India, and Their Interaction with Piriformospora indica. Indternational Journal of Pharma and Bio Sciences.6(1):333-343. Deacon, J.W. 2006. Fungal Biologi 4th Edition. Australia : Blackwell Publishing. Doolotkeldieva, T & Bobusheva, S. 2014. Endophytic Fungi Diversity of Wild Terrestrial Plants in Kyrgyzstan.Global Advanced Research Journal of Microbiology 3(9):163-176. Fitriyah, D., Christine, & Saryono.2013. Skrining Aktivitas Antimikroba dan Uji Fitokimia dari Kapang Endofit Tanaman Dahlia (Dahlia variabilis). Journal Indonesian Chemistry Acta 3 (2) : 50-55. Hamayun, M., Khan, SA., Ahmad, N., Sheng Tang, D., Mo kang, S., In Na, C., Young Sohn, E., Hyun Hwang, Y., Hyun Shin, D., Hyun Lee, B., Guk Kim, J., & Jung Lee, In. 2009. Cladosporium sphaerospermum as a new plant growth promoting endophyte from the roots of glycine max (L.)Merr.World Journal Microbiology Biotechnology Springer 25:627632. Jeewon, R., Itto, J., Mahadeb, D., Jaufeerally, Y., Kai Wang, H., & Rong Liu, A. 2013. DNA Based Identification and Phylogenetic Characterisation of

8

Endophytic and Saprobic Fungi From Antidesma madagascariense, a Medicinal Plant in Mauritius. Journal of Mycology : 1-10. Mangunwardoyo, W., Suciatmih, & Gandjar, I. 2012. Frequency of Endophytic Fungi Isolated From Dendrobium crumenatum (Pigeon Orchid) and Antimicrobial Activity. Biodiversitas 13(1):34-39. Patel, C., Yadav, S., Rahi, S & Dave, A. 2013.Studies on Biodiversity of Fungal Endophytes of Indigenous Monocotaceous and Dicotaceous Plants and Evaluation of their Enzymatic Potentialities.International Journal of Scientific and Research Publications 3(7): 1-5. Setjo,S., Kartini, E., Saptasari, M. &Sulisetijono. 2004. AnatomiTumbuhan. Malang :Jica. Shankar, NB & Shashikala, J. 2010.Diversity and Structure of Fungal Endophyte in some Climbers and Grass Species of Malnand Region, Western Ghats, Southern India. Mycosphere 1(4):265-274 Sharma, R & Kumar, V. 2013. Isolation Characterization and Antioxidant Potential of Endophytic Fungi of Ocimum sanctum Linn. Lamiaceae. Indian Journal of Applied Research 3(7):5-10. Strobel, G & Daisy, B. 2003.Bioprospecting for Microbial Endophyte and Their Natural Products. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67(4): 491-502. Wink, M. 2010. Biochemistry of Plant Secondary Metabolism. USA: John Wiley & Sons.