TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ...........................................................................……… 4 1.
B EVEZETÉS ..............................................................................................………...5
2.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS ...........................................................................................7
2.1.
A diabetes mellitus és felosztása .............................................……...…………… 7
2.1.1. Primer diabetesek .........................................................................……………..... 7 2.1.1.1 Egyes típusú diabetes mellitus ………………………………………………..…...7 2.1.1.2 Kettes típusú diabetes mellitus …………………………………...………………..8 2.1.1.3 Gesztációs diabetes mellitus (GDM) ……………………………..………………..8 2.1.2
Szekunder diabetesek (a diabetes egyéb típusai)…………………….......……….9
2.2.
A diabetes mellitus késoi szövodményei……………….......….....…......………....9
2.2.1.
Szív- és érrendszeri szövodmények ………………………..............……...............10
2.2.2.
Szemészeti szövodmények ………………………………..........………………....11
2.2.3.
Veseszövodmények ………………………………………………...…………......12
2.2.4.
Idegrendszeri szövodmények ………………………….....……….………………12
2.3.
A cukorbetegség terápiás vonatkozásai................................................................12
2.4.
Mechanizmusok a diabetes késoi szövodményeinek kialakulásában…...……..14
2.4.1.
A szénhidrát-anyagcsere egyensúly szerepe ……………………....…..…………..15
2.4.2. A poliol anyagcsere út ………………………………….....…….......…………….15 2.4.3.
A fehérjék nem enzimatikus glikációja, glükóz autoxidáció és protein karboniláció...............................................................................................................16
2.5.
Szabadgyökök, oxidatív stressz és cukorbetegség………….................……..….20
2.5.1.
Szabadgyökök az élo szervezetben ……………………………..…………………20
2.5.1.1. Reaktív oxigén speciesek................................................................………………..21 2.5.1.2. A nitrogén monoxid és a peroxinitrit anion..................……..……………………..23 2.5.2.
Redox homeosztázis és oxidatív stressz...............................................……………26
2.5.3.
Az oxidatív stressz és a szabadgyökök szerepe a diabetes szövodményeinek kialakulásában.........................................................................................………….27
2.6.
Kísérleti állatmodellek a diabetes vizsgálatában....................................……….31
3.
CÉLKITUZÉSEK ……………….…………………………………………………..33
4.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK …………………………….…………………………34
4.1.
Szabadgyökök idobeni alakulásával kapcsolatos kísérletekben alkalmazott módszerek........................................................................................………………34
4.1.1. Állatmodell....…………………………………….....……………………………...34
1
4.1.2. Elektron spin rezonancia (ESR) spektroszkópia………………………………….35 4.1.2.1. Stacioner szabadgyök koncentráció meghatározása szövetben…………………..37 4.1.2.2. Nitrogén monoxid gyök meghatározása szövetben………………………………38 4.1.2.3. Oxigén-centrumú gyökök mérése szövetben……………………………………..38 4.1.3.
Peroxinitrit anion és reakciótermékeinek kemilu mineszcenciás meghatározása…38
4.1.3.1. A peroxin itrit képzodés reakciójának modellezése számítógépes szimulációval…39 4.1.4.
Protein karboniláció mérése spektrofotometriásan……….……………………….41
4.1.5.
Szövettani vizsgálatok……………………..………………………………………42
4.2.
Az aminoguanidin és inzulin kezeléssel kapcsolatos kísérletekben alkalmazott módszerek……………..………………………………................………………. 43
4.2.1.
Állatmodell…………………......………………………………………………….43
4.2.2. A szénhidrát-anyagcserére jellemzo paraméterek meghatározása: szérum glükóz, HbA1c és fruktózamin………...………….……………………………………….43 4.2.3.
Nitrogén monoxid mérése ESR spektroszkópiával……………….……………….43
4.2.4.
Peroxinitrit anion és reakciótermékei meghatározása kemiluminométerrel …..….44
4.2.5.
Szívhipertrófia vizsgálata………………………………….………………………44
4.3.
Reagensek, vegyszerek ……………………………......…………………………..44
4.4.
Az eredmények értékelé se, statisztikai analízis …………………..………...……..45
5.
EREDMÉNYEK ……………......……………………………………………………46
5.1.
Szabadgyökök megjelenése és idobeli alakulása streptozotocin-indukált diabetes korai fázisában patkányban.......................................................……….46
5.1.1.
Szabadgyökök stacioner koncentrációja a diabeteses szervekben……..…………..46
5.1.2.
Nitrogén monoxid
képzodése és idobeni alakulása diabeteses patkány
szerveiben.................................................................................................................48 5.1.3.
Oxigén-centrumú gyökök képzodése diabetesben. A c-PROXYL spinpróbavegyülettel kapott eredmények…………………………………………………….51
5.1.4.
Peroxinitrit anion és reakciótermékeinek ex vivo meghatározása diabeteses patkányok aortájából................................................................................................55
5.1.4.1. A peroxinitrit reakcióinak kémiai modellezése, számítógépes szimuláció……...…58 5.1.5.
Protein karboniláció a diabetes korai fázisában…………………………………....59
5.1.6.
Kórszövettani eredmények…………....…………………………………………...60
5.2.
Az
aminoguanidin-
és
inzulinkezeléssel
kapcsolatos
kísérle tek
eredményei………...................................................................................................62 5.2.1.
Szénhidrát-anyagcsere paraméterek alakulása........………..………………………63
5.2.2.
Nitrogén monoxid termelodésének változása a kezelések hatására………..………64
2
5.2.3.
Aminoguanidin- és inzulinkezelés hatása a peroxinitrit termelodésére diabeteses érfalban………………….........................................................................................66
5.2.4.
Szívhipertrófia
kialakulása
diabetesben
és
az
alkalmazott
kezelések
hatása……….....................................................................................................…....67 5.2.5.
Protein karboniláció befolyásolása a kezelésekkel................……..……………….68
6.
M EGBESZÉLÉS ……………………..……………………………………………...70
6.1.
Szabadgyökök idobeli megjelenése streptozotocin-indukált diabetes korai fázisában patkányban.……………………...…….........…………………………70
6.2.
Aminoguanidin- és inzulinkezelés hatása a kísérletes diabetesben zajló oxidatív folyamatokra patkányban......................................................................................75
7.
TÉZISEK ...............................…………………………..……………………….….80
8.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ………..………………………………………………...82
9.
IRODALOMJEGYZÉK …………………......………………………………………..83
10.
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE………………………………..………………93
ÖSSZEFOGLALÓ .............................................................................................95 SUMMARY......................................................................................................96
3
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AGE – késoi glikációs végtermékek (advanced glycation end products) cGMP – ciklikus guanozin- monofoszfát c-PROXYL – 3-karbamoil-proxil DETC – dietil-ditiokarbamát DMPO – 5,5’-dimetil-1-pirrolin-N-oxid DNPH – 2,4-dinitro-fenil- hidrazin ESR – elektron spin rezonancia spektroszkópia G – Gauss, a mágneses tér erossége HbA1c – hemoglobin A1c LDL – low density lipoprotein L-NIL – L-N-(1-iminoetil)- lizin L-NMMA – NG- monometil- L-arginin Men , Men+1 – tetszoleges fémion („metal”) ?
NO – nitrogén monoxid gyök
NOS – nitrogén monoxid szintáz cNOS – konstitutív nitrogén monoxid szintáz eNOS – endothelialis nitrogén monoxid szintáz iNOS – indukálható nitrogén monoxid szintáz ONOO - – peroxinitrit anion ROS – reaktív oxigén species SOD – szuperoxid diszmutáz
4
1.
BEVEZETÉS
A cukorbetegség (diabetes mellitus) egyike azoknak a kórképeknek, amelyek napjainkban fontos egészségügyi problémának számítanak, különös tekintettel a fejlett országokra. A diabetológia fontosságát támasztják alá azok a statisztikák, melyek szerint a cukorbetegek száma világszerte emelkedik. Az emelkedés mértéke a fejlett és a fejlodo országokban azonos, a népesség megoszlásának eltérései miatt azonban a növekedés döntoen a fejlodo országokban várható. A trópusokon szinte ismeretlen betegség. Az ismert cukorbetegek számát Magyarországon ma már legalább félmillióra becsüljük: ez azt jelenti, hogy az utóbbi húsz évben a betegek száma megkétszerezodött. Ma már a betegek életminoségét és életkilátásaikat elsosorban nem maga a cukorbetegség és az orvos által esetlegesen rosszul beállított szénhidrát-anyagcsere miatt fellépo hipo-, vagy hiperglikémia veszélyezteti, hanem a hosszú évek alatt kialakuló késoi szövodmények. Ezek közé tartoznak elsosorban a különbözo szív- és érrendszeri szövodmények, pl. a szívhipertrófia, az érelmeszesedés, a mikrovaszkulatúra muködésének romlása miatt bekövetkezo retinopathia, cataracta, nephropathia, valamint az autonóm neuropathia és a gasztrointesztinális rendszer különbözo fekélyei (1). Az utóbbi évtizedben számos kísérleti eredmény utal arra, hogy a szénhidrát-anyagcsere zavara során oxidatív stressz alakul ki (2). A szervezetben fiziológiásan is állandóan muködo és fontos szerepet játszó szabadgyökös folyamatok egyensúlya, az élo szervezet gyökháztartása felborul. Napjainkban a kutatások eloterébe kerültek a különbözo patológiás állapotokban felszaporodó reaktív speciesek és a szabadgyökös reakciók. Egyre több betegségben bizonyosodik be szerepük jelentosége. Bizonyítottnak tunik részvételük a cukorbetegség progressziójában (3), de a késoi szövodmények kialakulásában szerepük a mai napig vitatott. A diabetes mellitushoz kapcsolódó szabadgyökös folyamatokat az elmúlt években sokrétuen tanulmányozták a diabetes szövodményeinek vonatkozásában mind in vitro rendszerekben, mind állatkísérletekben vagy cukorbetegekben (4,5,6). A hangsúly általában az úgynevezett reaktív oxigén speciesekre (ROS) és reakcióikra helyezodött. Furcsa módon, a nitrogén-centrumú reaktív molekulákkal, gyökökkel és magával a nitrozatív stresszel jóval kevesebb tanulmány foglalkozik, pedig a nitrogén monoxid mint az érfalban fontos élettani szereppel bíró szabadgyök, szoros kapcsolatban lehet pl. a diabetes során kialakuló
5
endothel
diszfunkcióval,
érfalkárosodással.
A
fentiek
ellenére,
bár
számos
cukorbetegben és kísérleti állatban mért adat áll rendelkezésünkre, amelyek egyértelmuen a szövodmények kialakulásának szabadgyökös folyamataira utalnak, még mindig akad megválaszolatlan, bizonytalan kérdés a tématerületen. Nem világos például, hogy a gyökök a komplikációk okozói vagy következményei. Fontos kérdés lehet a különbözo gyökök idobeni megjelenése egyes – a szövodmények által érintett – szervekben, különösen a betegség korai szakaszában, még a szövodmények kialakulása elott. Doktori munkámmal a diabetes késoi szövodményei és a szabadgyökös reakciók között valószínusített ok-okozati összefüggés feltárásához kívántam közelebb jutni és új adatokkal szolgálni. Külön hangsúlyt igyekeztem fektetni a nitrogén monoxidra és annak
szerepére,
a
szö vodményekkel
kapcsolatos
lehetséges
hatásaira
és
hatásmechanizmusára, tekintettel az úgynevezett nitrozatív stressz diabetesben még feltáratlan voltára.
6
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1. A diabetes mellitus és felosztása A diabetes mellitus olyan betegség, amelyet krónikus hiperglikémia, a szénhidrát-, a zsír-, és a fehérjeanyagcsere egyéb rendellenességei jellemeznek, s amelyet sokszor kísérnek specifikus mikrovaszkuláris szövodmények és károsodások. A cukorbetegséget
eleinte
egységes
kórformának
tartották,
bár
már
korai
megfigyelésekben is említést tesznek arról, hogy a betegek közt vannak sovány, a fiatal korosztályhoz tartozó egyének, akiknél a betegség heves tünetekkel indul, és idosebb, sokszor elhízott betegek, ahol a betegség kezdete tünetszegény. Ez az egységes elmélet az endogén inzulinmeghatározás létrejöttével megdolt, s a WHO 1979-ben megalkotta a betegség felosztását (7). A diabetes tehát nem egységes kórkép, hanem mindazon betegségek összefoglaló neve, amelyekben fennáll a hiperglikémia, és amelyeknek közös jellemzoje az abszolút vagy relatív inzulinhiány. A cukorbetegség felosztása azóta kisebb-nagyobb változtatásokon esett át, a jelenleg érvényes a következo (8).
2.1.1
Primer diabetesek A primer diabeteses esetek az összes cukorbetegek kb. 95%-át teszik ki (9).
2.1.1.1
Egyes típusú diabetes mellitus
A pankreász ? -sejtjei autoimmun folyamatok következtében elpusztulnak, ezért a folyamatot teljes inzulinhiány kialakulása jellemzi. Elsosorban fiatal korban (30 év alatt) jelentkezik, ezért fiatalkori diabetes mellitusnak is nevezik. Az inzulinkezelés ennél a típusnál elkerülhetetlen. Kialakulásában a genetikus tényezoknek és a környezeti hatásoknak fokozott szerepet tulajdonítanak. Nem egységes kórforma. Két altípusa a klasszikus (immunmediált), illetve a lassan kialakuló (idiopathias) egyes típusú diabetes, utóbbi inkább a késobbi életkorban (30-45 év között) alakul ki.
7
2.1.1.2
Kettes típusú diabetes mellitus
Az iparosodott országokban, így hazánkban is, a cukorbetegek legnagyobb része (90%) ebbe a kategóriába tartozik. E betegségcsoport közös jellemzoje, hogy az inzulinszekréció nem képes a normoglikémia fenntartására. A betegség kifejlodése során kóros éhomi vércukor, csökkent szénhidráttolerancia, majd kettes típusú cukorbetegség alakul ki. Ennek oka elsosorban periferiás inzulinrezisztencia kialakulása, melynek hátterében posztreceptor hiba, esetleg genetikailag rendellenes proinzulin, inzulin vagy inzulinreceptor mutáció áll (8,10). Fontosabb típusai:
- Típusos 2-es típusú diabetes - 2-es típusú diabetes zárt etnikai csoportokban - EOD (early onset diabetes) forma - Primer lipidémiához csatlakozó kettes típusú diabetes - Ifjúkori kettes típusú diabetes.
2.1.1.3. Gesztációs diabetes mellitus (GDM)
A terhes nok kb. 2-3? -ánál, újabb adatok szerint 10%-ánál alakul ki rendszerint a terhesség második felében (9). A legfontosabb patogenetikai tényezo, hogy a fiziológiás terhesség során is csökken a szövetek inzulin iránti érzékenysége és inzulinrezisztencia alakul ki. Az inzulinrezisztencia létrejöttében a placenta által termelt diabetogén hatású hormonoknak, foként a progeszteronnak, az ösztrogénnek és a humán placentáris laktogénnek tulajdonítanak elsodleges szerepet. Azokban alakul ki gesztációs diabetes, akiknél a fiziológiás kompenzáló hiperinzulinémia nem elegendo a szénhidrát-anyagcsere egyensúlyának fenntartásához.
2.1.2. Szekunder diabetesek (a diabetes egyéb típusai)
Az esetek kevesebb, mint 5? -a tartozik ebbe a csoportba. Különbözo inzulin szekréciót gátló folyamatok következtében alakul ki diabetes (9). Ide tartozik például a
8
gyógyszerek és a fertozések okozta, különbözo genetikai vagy egyéb szindrómákhoz társuló, vagy pl. a pankreatitisz következtében kialakuló diabetes, és az inzulinreceptorabnormalitások miatt kialakuló diabetes is (8). Említést kell tennünk még arról a tényrol, hogy a WHO felosztása a diabetes külön csoportjaiként említi meg azokat az eseteket, amikor maga a cukorbetegség még nem fejlodött ki, de kialakulásának fokozott a veszélye. Ilyenek: az IGT (impaired glucose tolerance vagy kóros glükóztolerancia), a Prev AGT (previous abnormality of glucose tolerance vagy elozetesen kóros glükóztolerancia), és a Pot AGT (potential abnormality of glucose tolerance vagy a glükóztolerancia lehetséges zavara).
2.2.
A diabetes mellitus késoi szövodményei
A cukorbetegség idotartamának növekedésével, a kor elorehaladtával számos szervben tapasztalhatunk egyre nagyobb mértéku károsodásokat és ezzel járó diszfunkciókat. Az ilyen krónikus szövodmények amellett, hogy közvetlenül is veszélyeztetik a beteg életét, az életminoség romlását is okozhatják. A szövodményeket szokás micro- és macroangiopathias szövodményekre osztani. Az 1-es típusú diabetesre elsosorban a korai microangiopathias, a 2-es típusú diabetesre elsosorban a macroangiopathias szövodmények jellemzoek (13).
Melyek tehát azok az elváltozások, amelyek a késoi szövodmények közé sorolhatóak ?
-
Szív-, és érrendszeri szövodmények (érelmeszesedés, szív-, ill. balkamra hipertrófia, magas vérnyomás)
-
Diabeteses szemészeti szövodmények (cataracta, retinopathia)
-
Nephropathia
-
Neuropathia
-
Fekélyek és borbetegségek, pl. „diabeteses láb”
-
Autoimmun vegetatív neuropathia
-
Fog- és szájtünetek
-
Izületi megbetegedések
-
Hemosztázis-zavarok
9
A fenti szövodmények közül mindenképpen hangsúlyozottan kiemelnénk a Magyarországon vezeto halálokként számontartott szív- és érrendszeri betegségeket. Népegészségügyi jelentoséget tulajdonítanak még a fenti felsorolásban a másodikötödik helyen említett szövodményeknek. A többi elváltozásról sokkal ritkábban olvashatunk. A késoi szövodmények mind 1-es típusú diabetesben, mind 2-es típusú diabetesben kialakulhatnak, de elofordulásuk, jellegük és klinikai következményeik eltérhetnek a két fo csoportban. Példaként említhetjük meg a vakságot, mely mindkét típusú cukorbetegségben elofordul, de más- más oka lehet az egyikben ill. a másikban. A kardiovaszkuláris szövodményeket szokás inkább a kettes típusú, míg a nephropathiát az egyes típusú diabetes elso helyen álló halálokaként emlegetni (9). A fontosabb szövodményekrol mindenképp érdemes néhány szót ejtenünk bovebben is. Az alábbiakban ezekre térnénk ki, különös tekintettel olyan komplikációkra, melyeket kísérleteinkben mi is vizsgáltunk.
2.2.1. Szív- és érrendszeri szövodmények
A diabetes során fellépo komplex anyagcserezavar, amely a lipid- és a fehérjemetabolizmust is érinti, felgyorsult érelmeszesedéshez vezet cukorbetegekben. Ezt a szövodményt tartják az egyik legfontosabbnak, mert cukorbetegekben a halálozási statisztikák élén az érelmeszesedés szervi megnyilvánulásai állnak. A betegség az érfal enyhe gyulladásos folyamataival indul, amit megnövekedett glükózégés és protein C aktiválódás követ. Az aspecifikus gyulladás így fennmarad és különbözo adhéziós molekulák (pl. citokinek), illetve monociták, vérlemezkék, T- limfociták tapadnak le az endothel felszínéhez, valamint szénhidráttartalmú fehérjék rakódnak le a kis- és nagyerek falában. Az extracelluláris mátrix mennyisége megno, a bazális membrán az erekben megvastagodik. No az érfal kollagéntartalma. A mono-, és a limfociták bejuthatnak a vérerek falának simaizomzatába is, így a gyulladás átterjed az endothel alá. LDL (alacsony suruségu zsírfehérjék) oxidációja és glikációja következik be, és a szubendotélben lévo monocitákban felhalmozódik a módosult LDL. A monociták makrofágokká alakulnak, majd a makrofágok habos sejtekké válnak. Simaizom- és endothelhipertrófia észlelheto. Ha a habos sejtek felhalmozódnak, zsírcsíkok képzodnek
10
a szubendotélben, melyek összegyulve lipidmagot alkotnak s az extracelluláris mátrix lévén kialakuló fibrózus „sapka” létrejöttével kialakul a plakk és a kezdeti érszukület. Funkcionális szempontból jellemzo a korai szakaszban bekövetkezo fokozott vazodilatáció, majd késobb a progresszív lumenszukület és ezzel együtt járva az elégtelen perfúzió (14).
2.2.2. Szemészeti szövodmények
A retinopathia fordul elo leggyakrabban, de ezen kívül egyéb szemészeti rendellenességek is gyakoribbak, mint nem diabetesesekben, pl. szürkehályog, homályos látás vagy esetleg zöldhályog is kialakulhat (13). A diabeteses retinopathia legsúlyosabb
stádiuma
az
ún.
proliferatív
szakasz,
amelyet
érújraképzodés
(neovaszkularizáció) jellemez. A retina kapillárisainak károsodása vérzésekhez, ödémához, új erek megjelenéséhez vezet, melyek a látás romlását, akár elvesztését is okozhatják. Az erek akár az üvegtestbe is belenohetnek. Mivel az érkapillárisok elzáródnak, ezért iszkémia alakul ki. Azt feltételezik, hogy az oxigénhiányos állapot serkenti a vaszkularizációhoz szükséges növekedési faktorok elválasztását, így eredményezi új erek, abnormális kapillárisok képzodését (9).
2.2.3. Veseszövodmények
A diabeteses nephropathia elsosorban a veseglomerulus megbetegedésének következménye.
A
szövodmény
jelentoségére
utal,
hogy
dialízist
vagy
vesetranszplantációt ma már leggyakrabban cukorbetegeken végeznek. A nephropathias szövodmények egyes és kettes típusú diabeteses betegek közti elofordulásáról megoszlanak a vélemények. A nephropathia diabetica mindig retinopathiaval társul. A mikroalbuminuriásokban enyhe, a klinikailag is már vesebetegekben elorehaladott léziókat lehet kimutatni. Súlyos állapotban a glomerulusok teljesen elzáródnak, amelyet foleg jelentos bazális membránvastagodás okoz, majd kialakul a veseelégtelenség.
11
2.2.4. Idegrendszeri szövodmények
A diabeteses neuropathia klinikai és prognosztikus jelentoségét hosszú ideig alábecsülték az orvostudományban. Megjelenési formái nagyon változatosak, az egységes diagnosztikus kritériumrendszer kidolgozása jelenleg is folyamatban van. A folyamat során az idegrostok degenerálódnak, számuk csökken, emiatt diszfunkció alakul ki. Beszélhetünk szomatikus vagy autonóm neuropátiáról, attól függoen, hogy az idegrendszer mely részét érinti a betegség. A szomatikus formát általában renyhe reflexek, csökkent vibrációérzet és a végtagokon tapasztalható érzészavar jellemzi. Az autonóm neuropathia - mely inkább hosszabb betegségtartam után mutatkozik következtében kialakulhat kardiovaszkuláris muködészavar vagy a gasztrointesztinális és az urogenitális rendszer funkcionális rendellenessége is.
2.3.
A cukorbetegség terápiás vonatkozásai (11,12)
Az elmúlt évtized folyamán jelentos szemléletváltás következett be a diabetes mellitus
terápiájában
és
a
társult
kóros
állapotok
együttes
kezelésének
szükségességében. A WHO újradefiniálta a cukorbetegség diagnosztikai kritériumait is. A kórismézés során vércukormeghatározás indokolt klasszikus diabeteses tünetek (más okkal nem magyarázható fogyás, polyuria, súlyos tudatzavar vagy kóma) esetén, valamint veszélyeztetett egyéneknél (pozitív családi anamnézissel rendelkezok, elhízottak,
hiperlipidémiásak,
hipertóniásak,
kórelozményben
kardiovaszkuláris
megbetegedés, stb.). Elobbi esetekben egyetlen laboratóriumi vércukor- meghatározás eredménye is alkalmas lehet a diagnózis felállítására. Tünetmentes egyének esetén a diabetes kórisméjének kimondásához azonban legalább egy további, más alkalommal történo, ismételt vizsgálat eredménye is kóros kell, hogy legyen. A diabetes mellitus kezelésében az inzulin felfedezéséig gyakorlatilag egyetlen terápiás lehetoségként szerepelt az étrendi kezelés. A diéta mind az 1-es típusú, mind a 2-es típusú cukorbetegek kezelésében ma is elsorendu fontosságú. A 2-es típusú diabetes felléptekor elsosorban diétával kell kezelni az állapotot és csupán a diéta nem kielégíto hatása esetén szükséges kiegészíteni azt orális antidiabetikumokkal, illetve késobb inzulinnal. A diéta beállításánál fontos az étrend energiatartalma és összetétele
12
(egyéni testreszabottság szükséges), az étkezések gyakorisága és szénhidráttartalma. Kerülni kell a vércukorszintet gyorsan emelo ételek, italok fogyasztását. Inzulinra szorulnak – kevés kivételtol és néhány idoszaktól eltekintve – az 1-es típusú cukorbetegek, valamint inzulin adását kell elkezdeni minden gyermek- és fiatalkorban kezdodo cukorbajban, esetenként 2-es típusú diabetesben is. Az 1-es típusú diabeteses betegek inzulinkezelésében rövidtávú, minimális célkituzés a betegség akut tüneteinek és szövodményeinek megszüntetése és a beteg közérzetének javítása. Hosszútávú cél a normo- vagy euglikémia, az egészséges egyének vércukorszintjét leginkább megközelíto beállítás elérése és fenntartása. Ajánlott kezelési forma a közel normoglikémia fenntartására 1-es típusú cukorbetegségben a napjában többször adagolt inzulinnal végzett intenzív kezelés. Ez az 1-es típusú diabetesben ma már bizonyítottan alkalmas a cukorbetegség késoi szövodményeinek késleltetésére. A 2-es típusú diabetesben szenvedoknél elsosorban orális antidiabetikus kezelés jön szóba, amit akkor indokolt elkezdeni, ha az étrendi és életmódbeli tanácsok (diéta, fokozott fizikai aktivitás) következetes megvalósítása önmagában nem vezet eredményre. A rendelkezésre álló gyógyszerek öt hatástani csoportba sorolhatók: - biguanidok - alfa- glukozidáz-gátlók - szulfonilureák - meglitinid-vegyületek - tiazolidindionok. A választásnál különös jelentoséggel bír, hogy az adott beteg diabetesének hátterében inkább inzulinrezisztencia vagy inzulinszekréciós zavar áll. Minden olyan esetben, amikor a diéta és ketto, esetleg három orális antidiabetikum alkalmazása mellett a vércukor szintje éhgyomorra ismételten meghaladja a 7 mmol/l-t és a HbA1c szintje a 7,5%-ot, feltétlenül tovább kell lépni az inzulinkezelés irányában. A fentiek alapján mindenképpen indokolt újabb és hatásosabb terápiás rendszerek kidolgozása/beállítása, foleg az 1-es típusú diabetes hosszútávú kezelésére.
13
(Megjegyzésként szeretném említeni, hogy dolgozatomban a továbbiakban a legtöbb helyen a diabetes kifejezést használom a cukorbetegség – diabetes mellitus – rövid megjelölésére).
2.4.
Mechanizmusok a diabe tes késoi szövodményeinek kialakulásában
A diabetes késoi szövodményei kialakulásának megelozésében fontos szerepet játszhatna, ha a háttérben álló - létrejöttükhöz több-kevesebb mértékben hozzájáruló és komplex - biokémiai folyamatokat megismernénk. A komplikációk kialakulása mindig több, egymással összefüggo folyamat eredménye. A cukorbetegség korai szakaszában elsosorban a hiperglikémia okozta akut és reverzibilis intracelluláris változások kapnak szerepet a patofiziológiai eltérések létrejöttében. A nagy vércukorérték elsosorban azon szövetek metabolikus folyamataira van hatással, amelyekben a glükózfelvétel inzulinfüggetlen módon történik.
Doktori munkám szemszögébol ezen elváltozások közül a következoket emelném ki:
-
a szénhidrát-anyagcsere egyensúlyának szerepe,
-
az úgynevezett „poliol” anyagcsereút,
-
a glükóz autoxidációja és a fehérjék nem enzimatikus
glikációja, -
szabadgyökök, oxidatív stressz szerepe, amely doktori
munkám témája is, ezért egy különálló fejezetben ezt részletesen tárgyalom.
A fentieken kívül egyéb említést érdemlo tényezok lehetnek még a genetikai háttér vagy esetleges hormonális folyamatok is.
14
2.4.1. A szénhidrát-anyagcsere egyensúly szerepe
A szénhidrát-anyagcsere egyensúly kérdése, jelentosége sokat vizsgált terület. Az ún. Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) 1-es típusú diabetesben, valamint a United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS) 2-es típusú diabetesben egyértelmuen bizonyította, hogy minél inkább megközelíti a beteg vércukorértéke az élettani értéket, annál inkább csökken a valószínusége a retino-, nephro- és neuropathia kialakulásának (15,16,17).
2.4.2. A poliol anyagcsereút
A glükóz jól ismert energiaszolgáltató lebontásán, a glikolízisen kívül a szervezetben a molekula más metabolizmusa is ismert. Ilyen pl. a poliol anyagcsereút. Ennek muködése során glükózból aldóz-reduktáz enzim segítségével szorbitol keletkezik, az enzim NADPH-t használ kofaktorként (1. ábra). A rendszer akkor aktiválódik, ha a környezet hiperozmotikus. A keletkezo szorbitol egy olyan ozmotikusan aktív, töltéssel nem rendelkezo molekula, amely nehezen jut át a plazmamembránon. Élettani körülmények között is megfigyelték a poliol út muködését, de cukorbetegségben, azokban a szövetekben, ahol a glükóz felvétele inzulinfüggetlen, nagy vércukorszint esetén fokozott aktivitással muködik az aldóz-reduktáz. Ennek oka egyrészt a hiperglikémia miatti ozmotikus stressz, másrészt a túltengo szubsztrátkínálat. Így igen nagy szorbitolkoncentráció alakulhat ki intracellulárisan is, ami ozmotik us károsodást okoz (18). Mindezen felül az aktív poliol anyagcsereút valószínuleg számos más, a szövodmények szempontjából fontos folyamatot is befolyásol. Azokban a szövetekben, ahol a szorbitol NAD+ segítségével fruktózzá oxidálódik, NADH keletkezik, ezá ltal emelkedik a NADH/NAD+ arány, ami kedvez például a késobb tárgyalandó nem-enzimatikus glikációnak is.
15
H
H H C
O
H C OH
NADPH
NADP +
H C OH CH 2 OH D-glükóz
NAD+
NADH
H C OH
HO C H H C OH
H C OH HO C
aldóz-reduktáz
C O HO C
H
H C OH
H C OH
szorbitol-dehidrogenáz
H C OH CH 2 OH szorbitol
H
H C OH H C OH CH 2 OH D-fruktóz
1. ábra. A poliol anyagcsereút
2.4.3. A fehérjék nem enzimatikus glikációja, glükóz autoxidáció és protein karboniláció
A cukorbetegség késoi szövodményeinek kialakulásában mind az úgynevezett korai, mind a késoi glikációs termékeknek szerepük van (19). Elobbieket rövidítve EGP- nek (early glycation products), utóbbiakat AGE-nak (advanced glycation endproducts) hívjuk (20,21). A glükóz hajlamos könnyen és gyorsan kötodni fehérjékhez, elsosorban lizin vagy arginin aminosavak aminocsoportjához, megváltoztatva ezzel a fehérjék szerkezetét és muködését. A reakció nyomán egy Schiff – bázis szerkezetu molekula keletkezik, melyben a kémiai kötések egy lassú folyamatban átrendezodnek, ketoaminkötés alakul ki, létrehozva az ún. Amadori terméket (2. ábra).
16
H H C
H C N fehérje
O
H C OH
H C OH HO C H
H C NH
+
NH2 - fehérje
K1 K-1
H C OH
K2
HO C H H C OH
fehérje
C O
Kn
HO C H
K-2
AGE
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH
CH 2 OH
CH 2 OH
CH 2 OH
D-glükóz
Schiff-bázis
Amadori-termék
2. ábra. A nem enzimatikus glikáció és az Amadori termék képzodése. K1 , K2 ,...K n az egyes reakciók egyensúlyi állandóit jelölik.
Ez utóbbi folyamat a sebességmeghatározó lépés és akár heteket is igénybe vehet (22). Fontos, hogy ezek a folyamatok még reverzíbilisek, akkor is, ha nem rövid, hanem hosszú életideju fehérjéken alakulnak ki, de azt is hangsúlyoznunk kell, hogy jó kiindulási pontot, „táptalajt” szolgáltatnak az AGE-k kialakulásához. A legismertebb ilyen Amadori termék a glikált hemoglobin vagy HbA1c, amely jó markere a szénhidrát-anyagcsere állapotának. Minél nagyobb a glükózszint emelkedése és minél hosszabb ideig tart, annál több ilyen – hemoglobin- glükóz összetételu - korai glikációs termék
keletkezik.
A
fehérjék
glikációja
természetszeruleg
megváltoztatja
metabolizmusukat és funkciójukat, befolyásolhatja pl. az enzimek aktivitását, szállítóképesség-csökkenést okozhat vagy akár az inzulin is glikálódhat (23), veszítve ezzel biológiai aktivitásából. A kardiovaszkuláris szövodményekben kiemelt szerepe lehet a glikált LDL-nek, mert hajlamos makrofágok scavenger típusú receptoraihoz kötodni és így a habos sejtek képzodését elosegíteni (24). Szeretnénk felhívni a figyelmet arra, hogy a glikáció egészséges szervezetben fiziológiásan is végbemegy és az
ilyen
termékek
felhalmozódásának
szerepet
tulajdonítanak
a
természetes
öregedésben, gondolva itt nemcsak a szervek öregedésére, hanem pl. egészen konkrét esetet kiragadva, a ráncok kialakulására is. Hosszú életideju fehérjékben, pl. kollagénben, a keletkezett korai glikációs termékek már nem bomlanak el, a folyamat lassan tovább zajlik, az Amadori termékek igen lassú átalakulásokon mennek keresztül. Átrendezodhetnek, egymással oxidatív és nem
oxidatív
módon
összekapcsolódhatnak,
17
dehidratációt
szenvedhetnek,
keresztkötéseket hozhatnak létre és ily módon irreverzíbilisen megváltoznak, létrehozva a késoi glikációs végtermékeket, az AGE-kat (10). Ilyen jellegzetes termékek pl. az ún. „glükofluorofórok”, a karboximetil- lizin, vagy a pentozidin. Elofordulhat, hogy az Amadori termékek elhasadnak, így dialdehideket hoznak létre, glioxált, metilglioxált, stb., melyek képesek reagálni aminocsoporttal, glikációs végtermékeket szolgáltatva (25). A létrejött AGE-k igen stabilak és kumulatív jelleggel halmozódnak fel, egymással és az extracelluláris mátrix fehérjéivel kovalens módon keresztkötéseket hozva létre. A mátrix szabályos struktúrája így megváltozik. A stabil keresztkötések miatt ez az átépült mátrix a degradációnak is jobban ellenáll (14). Cukorbetegségben az erek falában, illetve a mikrovaszkulatúrában nagyon eros a plazmafehérjék akkumulációja. Azt találták, hogy ezek a fehérjék, - pl. az LDL is - sokkal szívesebben, nagyobb affinitással kötodnek pl. AGE által módosított kollagénhez vagy a mátrix AGE-ban gazdag részeihez (26). Ha egyszer egy ilyen plazmafehérje kovalensen kapcsolódott egy AGEhoz, ezzel újabb AGE kialakulására ad lehetoséget. A megváltozott, keresztkötésekkel teleszott bazális membrán pórusnagysága így növekszik, növelve a membrán permeabilitását, elosegítve ezzel újabb és újabb fehérjék érpályából való kivándorlását, kitapadását, lumenszukület létrehozását. Ha megszunik a hiperglikémia, az AGE-k már nem bomlanak el. Azt is fontos kiemelni, hogy az AGE-k viszonylag rövid diabetestartam után is kialakulhatnak (26). A keringo termékek a vesén keresztül választódnak ki és, ha a glomerulusfiltráció a cukorbetegben romlik, e termékek kiválasztása is értelemszeruen csökken, és a dialízis egyik formája sem képes ezeket a termékeket eltávolítani. Így nephropátiában jelentos szerepet tulajdonítunk az AGEknek és azt mondhatjuk, hogy a végstádiumú vesebetegek jelentos halálozási arányáért részben ezek a molekulák tehetok felelossé (27). Mindezeken felül a késoi glikációs termékek nemcsak közvetlenül, hanem sejtfelszíni receptorokhoz kötodve is kifejthetik hatásukat, számos receptornál már a hatás is ismert: fokozott citokintermelés, csökkent intracelluláris kalcium-szignál, csökkent trombomodulin-aktivitás, adhéziós molekulák megjelenése az endothelen (28,29,30,31). Azt mondhatjuk tehát, hogy a nem enzimatikus glikációt foképpen a fehérjék struktúrális
változásainak
szempontjából
tartják
fontosnak
a
cukorbetegség
szövodményei kapcsán. Van azonban még egy nagyon fontos tény ezen felül: az elmúlt
18
két évtized kutatásai rámutattak arra, hogy a glikáció ok-okozati összefüggésben áll a diabetesben kialakuló oxidatív stresszel és a szabadgyökképzodéssel (32,33). Az irodalomban számos ilyen témájú értekezést találhatunk. A glikált fehérjék molekuláris oxigénnel való reakciója során oxigén-centrumú szabadgyökök képzodnek (34), vagy az enzimes ill. nem enzimatikus glikáció során szuperoxid anion és hidrogén-peroxid keletkezik (35,36). Ezek a reakciók is elosegítik az AGE-k képzodését, így a különbözo késoi glikációs termékek szintjének emelkedését a fokozott oxidatív stressz egyik bizonyítékaként tartják számon (33). Itt érkezünk el ahhoz a ponthoz, ahol meg kell említenünk a glükóz autoxidációs reakcióit. In vitro kísérletek eredményei azt sugallják, hogy a glükóz átmeneti fémek-katalizálta reakcióban oxidálódik, eközben hidrogénperoxid, oxigén- és széncentrumú szabadgyökök, egyéb reaktív termékek képzodnek. Az autoxidációban képzodo szabadgyökök és a hidrogén-peroxid pedig fémionok jelenlétében roncsolhatja a fehérjéket, lipideket. Különösen Wolff és munkatársai foglalkoztak méyrehatóan a tématerülettel (37,38,39,40). Elméletük szerint ilyen oxidációs reakciókban egy aldóz vagy egy ketóz reaktív dikarbonillá alakul, amely képes
fehérjékkel
reakcióba
lépni,
és
az
Amadori-átrendezodéshez
hasonló,
szerkezetükben rokon, de reaktívabb termékeket létrehozni. Ez a reakció protein karboniláció néven vált közismertté (41). Láthatjuk, hogy mindezen reakciók szoros kapcsolatban állnak a szabadgyök-képzodéssel, a diabetes során fellépo oxidatív stresszel, és doktori munkám központi kérdéséhez vezetnek: milyen szerepük lehet a szabadgyökös reakcióknak a késoi szövodmények kialakulásában és pontosan mely szabadgyökökrol van szó? A cukorbetegség gyakran jár együtt oxidatív stresszel, ami feltételezhetoen nemcsak magának a cukorbetegségnek a patogenezisében, hanem a késoi szövodményeinek kialakulásában is kiemelt szerepet játszik (3,4,5,6).
19
2.5. Szabadgyökök, oxidatív stre ssz és cukorbetegség
2.5.1. Szabadgyökök az élo szervezetben
A szabadgyökök olyan atomok, molekulák, vagy molekulafragmentumok, melyek párosítatlan spinu elektront vagy elektronokat tartalmaznak. Ennél fogva adódik két alapveto tulajdonságuk: rövid életidejuek és ezzel együtt igen reakcióképesek, bár a szervezetben eloforduló gyökök reaktivitása változó (42). Általában „rossz” molekuláknak tarja oket a köztudat, pedig élettanilag is rendkívül fontos szerepük van. Részt vesznek a homeosztázis fenntartásában, különbözo jelátviteli mechanizmusokban messengerként muködhetnek, szabályozó funkciókat tölthetnek be. Az oxigén vízzé történo redukciójának is köztitermékei (ún. univalens biokémiai út), vagyis a mitokondriumban is mindig van szabadgyök-szivárgás (43). A mikroszomális vegyesfunkciójú oxidázok muködésekor, vagy pl. flavin-dehidrogenázok, xantin-oxidáz enzim hatására is keletkeznek (44). Az immunrendszer polimorfonukleáris leukocitái a betolakodó kórokozók eliminálásának segítésére szintén gyököket termelnek a NADPHoxidáz és mieloperoxidáz enzimek segítégével („oxidative burst”) (45). Általában szokás nagy csoportokra osztva oxigén-, nitrogén-, kén- és széncentrumú
gyökökrol
beszélni.
Élettani
és
kórélettani
jelentoséguek
az
oxigéncentrumúak között a: ?
Szuperoxid anion (O 2 ? - )
?
Hidroxil gyök (? OH)
?
Alkoxi-, alkilperoxi gyökök (RO ? , ROO? ).
A nitrogén-központú atomot tartalmazó gyökök közül a nitrogén monoxidnak (? NO) van a legnagyobb biológiai jelentosége. A széncentrumú gyökök pedig (pl. a metil gyök, ? CH3 ) inkább csak másodlagos reakciókban keletkeznek a szervezetben. Ha egy szabadgyök más egyéb, nem gyökös jellegu molekulával lép kölcsönhatásba, akkor láncreakciószeruen újabb gyökök keletkeznek (láncfolytató lépés, propagáció). Ha két azonos, vagy különbözo típusú gyök reagál egymással, akkor rekombinálódnak
20
(lánczáró lépés vagy letörés, termináció). A propagáció valószínusége a szervezetben nagyobb, hisz a legtöbb biomolekula nem gyökös jellegu.
2.5.1.1. Reaktív oxigén speciesek
Az oxigénbol redukcióval, gerjesztéssel keletkezo reaktív köztitermékek közül nem mindegyik szabadgyök. A nem gyök-jellegu, de nagyon reaktív termékeket összefoglaló néven, a gyökös termékekkel együtt, reaktív oxigén specieseknek (ROS) nevezzük. A gyökökön kívül ide tartozik pl. a hidrogén-peroxid (H2 O2 ), az ózon (O 3 ) vagy a szingulet oxigén (? 1 O2 vagy ? 1 O2 ) is. Az oxigén négyelektronos redukciója során víz keletkezik, azonban ha egyelektronos, univalens módon redukálódik, akkor olyan reaktív köztitermékek keletkeznek, melyek károsíthatják a biológiai rendszereket (3. ábra). Ilyenek a fent említett O2 ? - , ? OH, szingulet oxigén, ózon és a H2 O2 . ? 1 O2
? 1 O2
szigmaszingulet
deltaszingulet
oxigén
oxigén O2
molekuláris oxigén e-
hidroperoxil-
HO2 ?
O2 ? -
szuperoxid anion
e-
gyök
H2 O2 e ?
hidrogén-peroxid -
OH
hidroxil gyök e-
H2 O
víz
3.ábra. Az oxigén redukciója és gerjesztése során keletkezõ reaktív oxigén intermedierek
A szuperoxid anion keletkezhet a mitokondriumban, a kloroplasztban, a mikroszómákban zajló reakciókban, termelheti a xantin-oxidáz vagy különbözo molekulák autoxidációja. Kevésbé reakcióképes gyöknek tekintheto. Jelátvivo szerepe is ismert, illetve fontos tulajdonsága még, hogy vazokonstriktor hatású, ez lényeges
21
lehet a diabetesben a glikációs és a thrombotikus folyamatok miatt amúgy is rugalmatlanabbá váló érfalban. Ennél lényegesen agresszívebb a hidroxil gyök, és kezdetben a kutatók ezt a gyököt tartották minden baj forrásának. Késobb bebizonyosodott, hogy nagy reakciókészségébol adódó meglehetosen rövid életideje miatt egy molekula távolságnál tovább nem képes eljutni, csak a közelében lévo molekulákat tudja oxidálni, láncreakciót indítani. A legfontosabb ? OH gyököt termelo folyamat az ún. Fenton-Haber-Weiss reakció, amely újabban szintén viták tárgyát képezi (1). A reakcióhoz (4. ábra) fémion katalizáló hatása szükséges, s ilyen fémionok a szervezetben szabad állapotban ritkán – inkább szállító-, raktározófehérjékhez kötve – fordulnak elo. Meg kell azonban fontolnunk azt, hogy oxidatív stressz állapotában akár a raktározófehérjék is károsodhatnak, „elengedve” maguktól a fémiont, teret adva az említett reakciónak.
O2 ?- + Men+1
Men + O2
Men + H2 O2
Men+1 + ?OH + OH-
O2 ?- + H2 O2
O2 + ?OH + OH-
4.ábra. A Fenton és a Haber-Weiss reakció.
Az alkoxil-
és alkil-peroxil gyökök inkább szekunder módon keletkezo
termékek, és jelentoségük a lipid peroxidációnál nagy. A lipidek autoxidációja egy nagyon lassú folyamat a szervezetben, de ha pl. egy szabadgyökkel reagálva lipidgyök keletkezik belolük (R? ), akkor elindul egy láncreakció a molekuláris oxigénnel reagá lva. Ekkor különbözo alkil-peroxil (lipid-peroxil, ROO? ) gyökök képzodnek (1). Ez a folyamat a lipid peroxidáció. Az iniciátor lehet pl. hidroxil gyök. Az ilyen peroxidációra foleg a többszörösen telítetlen zsírsavak (PUFA) hajlamosak. A lipid peroxil gyökök átmenetileg stabilizálódhatnak, hidrogént felvéve lipid-hidroperoxidokat adhatnak (ROOH), amelyek spontán bomlásuk során újra hidroxil- és alkoxilgyököket szolgáltatnak. Patológiás körülmények között ez a folyamat felgyorsul és sok
22
biomolekulát károsít. Jelentosége cukorbetegségben, hogy a lipid peroxidációs folyamatok (különösen az LDL oxidációja) feltételezhetoen hozzájárulnak az érelmeszesedés kialakulásához (46). 2.5.1.2. A nitrogén monoxid (? NO) és a peroxinitrit anion (ONOO¯)
Akárcsak a szuperoxid anion, a nitrogén monoxid is a viszonylag „lassú”, a kevésbé reaktív gyökök közé tartozik. A kutatások középpontjában áll, mióta bebizonyosodott, hogy fontos élettani hatással bír a vazodilatációra (47): a korábban „endothel-derived releasing factor”-ként (EDRF) nevezett molekula maga az ? NO. Számos jótékony és kevésbé jótékony hatására derült azóta fény. A szervezetben Largininbol keletkezik a nitrogén monoxid szintáz enzimek segítségével, melyeknek mind konstitutív (cNOS), mind indukálható (iNOS vagy NOS II) formája ismert. Az enzimeket szokás még aszerint besorolni, hogy az adott izoformát hol fedezték fel eloször, vagyis endotheliális (eNOS) és neuronális (nNOS) monoxid szintázról beszélni. Az ? NO a vérerek falának simaizomzatába diffundálva aktiválja a guanilátcikláz enzimet, ami cGMP szint növekedést, ezáltal vazodilatációt okoz. Másik lehetoség, hogy a vérben methemoglobinhoz kötodik, végül a vesén át nitrát formájában ürül ki (5. ábra).
23
O2 NOS
?
L – Arg
NO + L – citrullin
diffúzió a vérben
diffúzió a simaizomban
Hgb MetHgb + NO3
?
Guanilát MetHgb reduktáz
cikláz
kiürülés a vesén át
cGMP szint no
vazodilatáció 5. ábra . A nitrogén monoxid keletkezése és útja a szervezetben.
Megszámlálhatatlanul
sok
tanulmány
foglalkozik
az
?
NO
különbözo
betegségekben betöltött lehetséges szerepével. Élettani szerepe miatt elosorban a kardiovaszkuláris megbetegedések vannak a kutatások eloterében. Másodsorban különbözo gyulladással járó betegségeket vizsgálnak, mert az indukálható NOS aktivitása gyulladásos folyamatokban megno (48,49). Szokás ezt „nitrozatív” stressznek is nevezni. Tipikusan „Janus-arcú” gyök. Az erekre gyakorolt jótékony hatása és idegrendszeri
jelátvivo
funkciója
mellett,
túltermelodésekor
pozitív
hatását
elnyomhatják káros reakciói. Ezek közül különösen fontos az, hogy szuperoxid anionnal egy nagyon gyors, szinte csak diffúziókontrollált reakcióban reagál, és peroxinitrit aniont képez (6. ábra) (50).
24
k = 6,7 * 109 1/Msec ?
NO + O 2? ?
ONOO ?
6. ábra. A peroxinitrit képzodése.
Bebizonyosodott az is, hogy nem a hidroxilgyök, hanem elsosorban a peroxinitrit anion teheto felelossé a fehérjék, lipidek, nukleinsavak károsodásáért, mert anionként messzebre eljuthat, mint egy szabadgyök, és pl. aminosav-oldalláncokat vagy eloszeretettel tirozint nitrálhat (51), károsíthatja az LDL-t (52), illetve gátolhatja a kalcium- függo káliumcsatornák muködését (53), míg pl. a szuperoxid gyök erre nem képes. A peroxinitrit fiziológiás pH-n nem túl stabil, protonálódik, majd végül nitrit és nitrát formájában távozik. A NOS enzimek muködésében fontos kofaktor a tetrahidrobiopterin (röviden BH4 ), melynek hiányában, bizonyos patológiás esetekben a NOS enzimek is szuperoxid aniont termelhetnek (54). A NOS enzim izoformái gátolhatók akár együttesen, nem specifikusan, akár specifikusan, így különbözo patológiás elváltozásokban is meghatározható, hogy elsosorban melyik enzim játssza a foszerepet az ? NO termelésében. A legáltalánosabban használható tesztvegyület a metilénkék (55,56). Az indukálható NOS-t viszonylag nagy specificitással gátolja az L-N-monometil-arginin (L-NMMA), vagy az L-N6-(1iminoetil)- lizin (L-NIL) (1), közepesen szelektív gátlóként pedig nagyon gyakran alkalmazott és kedvelt az aminoguanidin (57,58), amivel kutatómunkámban én is foglalkoztam. Az enzim konstitutív formái (eNOS és nNOS) kalciumfüggoek, míg az iNOS nem, ezért ez utóbbi Ca2+-kelátorokkal, pl. EGTA-val szelektíven gátolható, míg Ca2+-ionofórok alkalmazásával valamelyest stimulálható (59). Mind az ? NO, mind az ONOO¯ biológiai rendszerekbol származó mintákban is viszonylag jól mérheto, közvetlenül a szövetbol is. Munkámban az
?
NO meghatározására elektron spin
rezonancia (ESR) spektroszkópiát, az ONOO¯ mérésére egy kemilumineszcenciás technikát használtam.
25
2.5.2. Redox homeosztázis és oxidatív stressz
Élettani esetben egyensúly áll fenn a szabadgyökök keletkezése és az antioxidáns rendszer között, vagyis a szervezet redox homeosztázisa biztosított. A szabadgyökös reakciókat enzimes és nem enzimatikus antioxidáns védekezorendszerek tartják kordában. Elobbiekhez tartoznak a zsír-, illetve vízoldékony vitaminok (különösen az E és C vitamin, melyek szinergikus hatása ismert), a táplálkozással felvett antioxidáns jellegu anyagok (flavonoidok, polifenolok, stb.) és az intracelluláris térben a legfontosabb vízoldható rendszer, a redukált/oxidált glutation (GSH/GSSG), valamint a hozzá kapcsolódó enzimek. Az enzimes védekezorendszer egyéb fontos elemei a szuperoxid-diszmutáz (SOD), a kataláz és a peroxidáz család enzimei. A SOD a szuperoxid aniont, a kataláz csak a hidrogén-peroxidot (H2 O2 ), a peroxidázok pedig más egyéb peroxil, alkoxilgyököket képesek semlegesíteni (7. ábra).
SOD:
O2? ? + 2 H+
H2O2 + O2
kataláz:
2 H2O2
2 H2O + O2
peroxidáz: H2O2 + RH2
2 H2O + R
7. ábra. Oxidatív folyamatok elleni enzimes védekezorendszer a szervezetben. R egy tetszoleges oldalláncot jelképez.
Az
antioxidáns
enzimek
általában
indukálhatóak,
tehát
aktivitásuk
a
szabadgyökös reakciók növekedésével bizonyos határokig fokozható. Oxidatív stresszrol akkor beszélünk, ha az egyensúly a szabadgyökös reakciók irányában tolódik el, s a szabályzó- és védekezorendszerek nem képesek már kordában tartani a szabadgyökös folyamatokat (60). A képzodo reaktív gyökök reakcióba lépnek a környezetükben lévo egyéb molekulákkal, pl. lipidekkel, fehérjékkel, nukleinsavakkal, a kötoszövet makromolekuláival, és így rendellenes muködést, patológiás elváltozásokat, esetleg apoptózist okoznak, pl. diabetes mellitus esetén is (8. ábra).
26
ENZIMATIKUS REAKCIÓK Elektron transzport Oxidázok Oxigenázok
Lipidek
Oxidáció
Fehérjék
Fragmen-
O2H2 O2
OH Nukleinsavak
AUTOXIDÁCIÓ átmeneti fém katalízis
ROOH
táció Károsodás
8. ábra Az oxidatív stressz kialakulása és hatásai (forrás: 34).
A diabeteses betegek fokozott oxidatív stressznek vannak kitéve, ez pedig számos enzimes és nem enzimes reakció, foként a glükóz autoxidáció, protein glikáció és karboniláció következménye (61,62). Ez utóbbi két folyamat elsosorban a nagy vércukorkoncentráció miatt gyorsul fel. Glikáció során a glükóz kapcsolódik egy fehérjéhez enzimes vagy nem-enzimes úton. Karboniláció esetén pedig a glükózból autoxidációs mechanizmusokon keresztül képzodött reaktív dikarbonil termékek támadják meg a fehérjéket. Számos kísérleti adat ellenére sem tisztázott azonban az okokozati összefüggés a szabadgyökös reakciók és a szövodmények kialakulása között.
2.5.3. Az oxidatív stressz és a szabadgyökök szerepe a diabetes szövodményeinek kialakulásában
A szabadgyökös mechanizmusok és az oxidatív stressz szerepe a cukorbetegség patogenezisében és szövodményeinek kialakulásában az utóbbi idoben nagyon sokat és rendkívül intenzíven kutatott terület mind in vitro kísérletekben, mind in vivo állatmodellekbol és betegekbol nyert mintákban (4,5,6). Ahogy említettük, az egyik legfontosabb eredménye ezeknek a kutatásoknak, hogy bebizonyosodott a ROS-ok keletkezése által képzodo glikált fehérjék molekuláris oxigénnel történo reakciója (6), illetve az, hogy a nem enzimatikus glikációt kíséro, s végül AGE-k képzodéséhez vezeto biokémiai folyamatok azok, melyek a gyökök fo forrásai diabetesben (61,62). Több kutatócsoport kezdetben különféle, antioxidáns státuszt jellemzo biokémiai paraméterek vizsgálatát tuzte ki célul diabetesben (1,63,64). Megerosítést nyert az, hogy
27
a különbözo szövetekben az antioxidáns enzimek – SOD, kataláz, glutation-reduktáz, glutation-peroxidáz, stb. – aktivitása megváltozik diabeteses állatmodellekben. Egymásnak ellentmondó eredmények születtek: egyaránt beszámoltak aktivitás növekedésrol és csökkenésrol. A vizsgálatok során rájöttek arra, hogy az ellentmondások oka a kísérleti körülmények sokfélesége: attól függoen, hogy melyik szövetrol vagy enzimrol volt szó, milyen hosszú volt a diabetes és milyen modellt használtak, a kutatók más–más eredményre jutottak. Hosszútávú inzulinkezelés egyértelmuen kivédte ezeket a változásokat (65). Kakkar és csoportja számos olyan munkát közölt, ahol idoben követték a diabetes alakulását és az antioxidáns védekezorendszer
muködését
cukorbeteg
patkányok
szöveteiben
(66,67).
A
tiobarbitursav reaktív anyagok (TBARS) mennyiségét – mely a lipidperoxidáció jellemzo markere – , valamint az antioxidáns enzimek aktivitását mérték a diabeteses vesében, májban, szívben és hasnyálmirigyben, korai fázisban (1-7 héttel a diabetes kialakulása után). 3 hét eltelte után szignifikáns változásokat találtak, ami jelezte, hogy az oxidatív stressz már a betegség korai szakaszában jelentkezik Ezek az ún. „ujjlenyomat” (fingerprint) módszerek jó támpontokat nyújtottak, de nem oldották meg a szabadgyökök és a szövodmények ok-okozati problémáját. Született egy szabadgyökös teória, azonban ez csak a diabetesben fellépo érelmeszesedéssel kapcsolatban volt érvényes (68). Lényege, hogy a gyökös reakciók gátolják a szérumelasztáz- inhibitort és a prosztaciklin-szintáz aktivitást. Az érfal szöveti elasztázai aktiválódnak, az elasztinban lévo keresztkötések elhasadnak, és az erek falában lévo lizin oldalláncok reakcióba lépnek a lipid peroxidáció termékeivel, így okozva károsodást. A prosztaciklin szintézis csökken vagy meg is szunik, ez pedig fokozza a trombociták adhézióját az érfalhoz, az általuk termelt ROS-ok pedig tovább fokozzák a károsodást. Ez az elmélet tulajdonképpen egységes teóriává alakítja az ateroszklerózis trombogén- és lipidteóriáját. Direkt szabadgyök mérések azokban a szervekben, melyek a szövodmények kialakulásában érintettek lehetnek és szövettani vizsgálatok együttesen azonban nem készültek. A nitrogén monoxidnak felfedezése óta fontos szerepet tulajdonítanak cukorbetegségben is, különösen ha az endothelfüggo relaxációban játszott szerepére gondolunk - kardiovaszkuláris területen, a vese- és a retina mikrovaszkulatúrájában (69,70,71). Itt is nagyon sok ellentmondásosnak tuno eredmény születetett: változatlan,
28
megnövekedett és csökkent ? NO-mediált endothelfüggo relaxiációt is leírtak. Késobb kiderült, hogy a mért eredmény jelentosen függ a diabetes idotartamától, a használt állatmodelltol, illetve, humán esetben a betegek diabetesének típusától (72). Patkányokban
figyelték
meg
azt,
hogy
a
cukorbetegség
nemcsak
endothel
diszfunkcióhoz és megnövekedett vaszkuláris O2 ? – termelodéshez vezetett, de csökkentette az ? NO biológiai hozzáférhetoségét, annak ellenére, hogy az endotheliális NOS enzim expressziója nott (69), ami egyértelmu ellentmondás és magyarázatra szorul. A vese mikrokapillárisaiban az eNOS emelkedett termelodését (up-regulációját) figyelték meg (70). Korai diabetesben leírtak konstitutív NOS enzim szint növekedést is a retinában, ez pl. a retina ereinek diszfunkciójával járt együtt (71). A szuperoxid anion és az ? NO reakciójából származó peroxinitrit amellett, hogy nitrálja a tirozint vagy más fontos molekulákat (73), cukorbetegségben vérlemezke károsodást is okoz (74). Úgy tunik tehát, hogy a nitrogén monoxidnak is fontos szerepe lehet akár a nagyobb, akár a kapilláris erek károsodásában, a cukorbetegséghez társuló endothel diszfunkcióban, vagy a kardiovaszkuláris elváltozásokban. Az is lehetséges, hogy az emelkedett ? NO szint egyfajta védohatást fejt ki a diabetesben merevebbé váló érfalra. Ám, ha oxidatív stressz is fennáll, a mérleg könnyen átbillenhet az ? NO káros reakciói felé. Számos eredmény született különbözo NOS enzim gátlók alkalmazásával, ahol így próbálták kivédeni a patológiásan magas (pl. gyulladásos folyamatokban iNOS-ból származó) ? NO szintet és a káros peroxinitrit képzodést. Az egyik ilyen, iNOS enzimre közepesen
szelektív
aminoguanidin.
Az
és
állatkísérletekben
irodalomban
sokszor
szívesen
alkalmazott
inhibitor
az
szelektív
inhibítornak
nevezik
az
aminoguanidint (75,76), de ez nyilvánvalóan félrevezeto, mivel még senki nem talált igazán szelektív gátlószert egyik NOS izoenzimre sem (77). Szélesköru népszeruségét annak köszönheti, hogy NOS gátló hatása mellett a glikációs folyamatokban képes blokkolni az AGE-k képzodését (78,79). Így diabetes vizsgálatában, ahol elorehaladott glikáció zajlik, különösen elonyös lehet. Hátránya, hogy a máj B6 vitamin tartalmát csökkenti, illetve fokozza a májban a GOT, GPT enzimek aktivitását is (80). Ennek kivédésére újabban piridoxállal konjugálják az aminoguanidint, mely kombináció új perspektívákat nyithat a diabeteses komplikációk kezelésében (81,82). Az, hogy mikor melyik mechanizmusa – NOS-gátló vagy AGE képzodés-blokkoló hatása – kerül inkább elotérbe, még nem tisztázott és valószínuleg függ a szövodménytol, az adott szervtol és
29
az alkalmazott diabetes modelltol. Legfontosabb eddig bizonyított hatásai a következoek. Védi a retinát diabeteses állatmodellben, bár itt az AGE-k termelodése a normálisnál magasabb maradt (83). Hosszabb terminusú diabetesben képes volt helyreállítani a retina abnormális anyagcseréjét patkányokban és kutyákban (84). A vesefunkciót javítja diabeteses állatmodellekben (85), itt hatását elsosorban a glikáció blokkolásáva l fejti ki. Érdekes módon, ezzel szemben, nem volt képes az aminoguanidin gátolni az AGE-k, a pentozidin, a karboximetillizin képzodést a diabeteses bor kollagénjében (86). A perifériás idegrendszer funkcióján, valamint az endothel sérülést jelzo trombomodulin expresszióján az aminoguanidin csak kismértékben segített (87). Pozitív hatású volt az aminoguanidin különbözo antioxidáns enzimek aktivitására (SOD, kataláz) és csökkentette a lipid peroxidáció jellemzo markereinek (TBARS, malondialdehid) koncentrációját diabeteses eritrocitákban és a vesében (88,89). Ihm és munkacsoportja bemutatta, hogy a plazma lipid hidroperoxidjainak mennyiségét és az eritrociták membránjának TBARS tartalmát az aminoguanidin kezelés csökkenti (90). Kevésbé vizsgálták hatását a kardiovaszkuláris szövodményekben. Megállapították, hogy csökkenti a vaszkuláris hipertrófiát az AGE képzodés gátlásán keresztül (91,92), és diabeteses patkány aortában helyreállítja az acetilkolinra adott csökkent relaxációs választ (93). Szintén megelozte az érfal öregedéssel járó kötoszövetvastagodását és a szívhipertrófia kialakulását (94). Az utóbbi adatok foleg nem diabeteses esetekre vonatkoznak. A fentiekbol kitunik, hogy sok esetben nem vizsgálták vagy vitatott az, hogy az aminoguanidin melyik mechanizmuson keresztül hat (azaz NOS-, vagy AGE-gátló hatása van), hogyan befolyásolja a peroxinitrit termelodést és milyen eredményt ad hagyományos inzulinkezeléssel összevetve, akár a szövodmények, akár az anyagcsere paraméterek tekintetében.
30
2.6. Kísérleti állatmodellek a diabetes vizsgálatában
A cukorbetegség vizsgálatában in vivo kísérletekhez nélkülözhetetlenek a diabeteses állatok, különösen, ha szervekben, szövetekben közvetlenül kívánunk meghatározni különbözo biokémiai paramétereket, szabadgyököket, amiket betegek esetében szinte kizárólag csak vérbol, vizeletbol tehetünk csak meg. A cukorbetegség állatokban (kutya, macska) természetes körülmények között is elofordul, a humán diabetes modellezésére mégis inkább kísérleti modelleket használnak. Ezek a modellek a humán diabetes mellitus számos jegyét magukon hordozzák. A betegség létrehozásának három lehetosége van állatokban: - a Langerhans-szigetek ? -sejtjeit szelektíven roncsoló vegyületek használata (kémiailag indukált cukorbetegség), ilyen vegyületek a streptozotocin és az alloxán, - spontán autoimmun diabeteses modellek – ezek az ún. BB patkány és a nem kövér diabeteses (NOD – non-obese diabetic) egér, illetve - transzgén állatok létrehozása.
A felsoroltak közül a kémiailag indukált diabetest emelnénk ki, mivel munkánkban mi is ezt a kísérletes modellt alkalmaztuk. Nagyon közkedvelt és egyszeruen kivitelezheto a citotoxikus anyagokkal kémiailag indukált diabetes. A streptozotocin és az alloxán diabetogén hatása több évtizede ismert, pontos hatásmechanizmusuk
azonban
még
nem
teljesen
tisztázott
terület.
A
hatásmechanizmusuk hasonló abban, hogy valószínuleg a ? -sejtekbe bejutva szabadgyökös mechanizmusok révén fejtik ki citotoxikus hatásukat. Az alloxánnál inkább hidroxil gyökökrol, míg a streptozotocinnál ? NO-ról van szó (95,96).
31
OHCH2 HO
O OH
HO NH
N NO
O
9.ábra. A streptozotocin szerkezete
A streptozotocinnál kis dózist alkalmazva csak enyhe hiperglikémia alakul ki, míg nagyobb dózisban ennek mértéke jóval súlyosabb (97). Megfelelo dózis (60-65 mg/kg) esetén szelektíven károsítja a ? -sejteket, s bár szabadgyökös reakciókat és az antioxidáns enzimek aktivitásának változását okozza, 48 óra alatt kiürül, tehát a diabetes késobbi vizsgálata során ezek a korai változások már nem zavaróak (98). Az ilyen cukorbeteg állatok exogén inzulinkezelés nélkül is életben maradnak jelentos hiperglikémia vagy ketoacidózis esetében is, tehát az ilyen modell feltételezhetoen az egyes és a kettes típusú diabetes „kevert” modelljének vagy az inzulinhiányos diabetes modelljének tekintheto (99).
32
3. CÉLKITUZÉSEK
1. Munkánkban különbözo szabadgyökök szintjének idobeni változását kívántuk követni streptozotocin- indukált diabeteses patkány szerveiben, foként közvetlen mérési módszerekkel, a betegség kialakulása után az ido elorehaladtával különbözo, korai idopontokban. Kérdéses volt, hogy mely szervekben változik a szabadgyökös egyensúly és a gyökök megjelenése idoben hogyan viszonyul egymáshoz. Különös figyelmet szenteltünk a nitrogén oxidnak, melynek szerepe diabetesben nem világos, és az oxidatív stressz során belole képzodo reaktív peroxinitrit anionnak. 2. Szövettani vizsgálatokkal szerettük volna eldönteni azt, hogy a makroszkópikus hisztopatológiai elváltozások a szabadgyökös változásokhoz képest idoben mikor jelentkeznek, ezáltal lehetnek-e a szabadgyökök akár okozói is a késoi szövodményeknek. 3. Vizsgálni kívántuk azt, hogy specifikus vegyületekkel, pl. a nitrogén monoxidot termelo NOS enzimek (foleg az iNOS) inhibitorával, aminoguanidinnel való kezelés hogyan hat a diabetes anyagcsere- és oxidatív stressz paramétereire. Kérdés volt, hogy az esetlegesen kialakuló szövodmények visszaszorításában pozitív hatású lehet-e egy ilyen szer és ha igen, milyen mechanizmuson keresztül hathat. A kezelést a szokványos inzulinkezelés hatásaival kívántuk összehasonlítani. 4. A
kísérleti
adatokra
támaszkodva
elméleti
számításokkal,
számítógépes
szimulációval is szerettük volna ellenorizni azt, hogy diabetesben – különös tekintettel a kardiovaszkuláris rendszerre – oxidatív stressz fennállásakor lejátszódhat-e valóban a rendkívül reaktív peroxinitritet képzo reakció és ez milyen mechanizmussal történhet meg.
33
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Szabadgyökök idobeni alakulásával kapcsolatos kísérletekben alkalmazott módszerek
4.1.1. Állatmodell
Kísérleteinket streptozotocin- indukálta diabeteses patkánymodellen végeztük. Vizsgálatainkhoz hím, albíno, átlagosan 100-120 g testtömegu Wistar patkányokat használtunk (ToxiCoop Kft.). Az állatokat standard körülmények között tartottuk, 12 órás sötét/világos ciklusban. Táplálásuk ad libitum történt vízzel és preformulázott rágcsálótáppal (R/M-Z+H 15 mm, Ssniff Spezialdiaten Gmbh., Németország). A kísérletekhez az állatokat random módon osztottuk be diabeteses, illetve korban egyeztetett kontroll csoportokba - minden csoportba 6-8 állat került. A kezelt csoport egyedei egy adagban (60 mg/tskg) pH = 7.4-es citrát pufferben felvett streptozotocint kaptak pentobarbitál narkózisban a vena femoralisba. Késobbi kísérleteinkben ezt az eljárást annyiban egyszerusítettük, hogy a streptozotocint az állatok farokvénájába adtuk be, ez technikailag lényegesen könnyebb volt, ugyanolyan jó eredményt adva. A cukorürítést, vagyis a diabetes meglétét 3 nappal késobb a vizeletben tesztcsíkkal ellenoriztük (Medi-Test Glucose). Az állatok súlygyarapodását heti 3 mérés átlagából a kísérletek végéig követtük. Egy, ketto, három ill. hét hét diabetes után az állatokat pentobarbitál narkózisban (50 mg/kg, i.p. injekcióban) dekapitáltuk, vizsgálatra kerülo szerveiket – máj, vese, érfal, szem, agy - azonnal cseppfolyós nitrogénben lefagyasztottuk. Ez egy különösen fontos pontja a kísérleteknek a szabadgyökök késobbi meghatározása szempontjából. Korábban elvégzett ellenorzo mérések szerint 45 percen belüli lefagyasztás nem befolyásolta szignifikánsan a mérheto szabadgyökök szintjét. A kísérleteket az MTA Kémiai Kutatóközpont Állatkísérleti Etikai Kódexe szerint, a Munkahelyi Állatkísérleti Bizottság engedélyével végeztük.
34
4.1.2. Elektron spin rezonancia spektroszkópia
Az elektron spin rezonancia (ESR) vagy másképpen elektron paramágneses rezonancia (EPR) spektroszkópia minden olyan anyag vizsgálatát lehetové teszi, amely paramágneses tulajdonságú, párosítatlan spinu elektronnal rendelkezik. Ilyenek például a fémionok, de ilyen atomok, molekulák a szabadgyökök is. Napjaink korszeru ESR spektroszkópjai sokrétu módszereket kínálnak, akár in vitro kémiai, akár biológiai rendszerekben in vivo és ex vivo mérésekhez is. Nagy elonyként írható fel, hogy a készülékkel lehetové válik akár szövetekben is direkt, közvetlen szabadgyök meghatározás, vagyis nem valamilyen reakcióterméket, úgynevezett „ujjlenyomat” (fingerprint) markert detektálunk, hanem a keletkezo primer és szekunder gyököket mérjük. Az általunk használt ESR spektroszkópot mutatom be a 10. ábrán, melynek segítségével a mérés elve is röviden összefoglalható.
10. ábra Elektron spin rezonancia (ESR) spektroszkóp berendezés
A készülék két viszonylag nagy mé retu, vízzel hutött elektromágnesbol, egy mikrohullámú tápegységbol és egy szoftver egységbol áll. A két mágnes között foglal
35
helyet az üreg, ahová a mérendo mintát kell helyeznünk, illetve a rezonátor. Ha egy olyan
anyagot
helyezünk
az
üregbe,
amely
paramágneses
molekulákat,
pl.
szabadgyököket tartalmaz, akkor az eros mágneses térben az elektronok spinjei a tér egy irányába rendezodnek. Ha erre az üregre viszonylag magas, kb. 9,5 GHz-es mikrohullámú frekvenciát bocsájtunk, és a mágneses tér erosségét változtatjuk, akkor a mintában lévo spinek oszcillálni kezdenek és anyagi minoségüktol függoen a mágneses tér adott pontján a mikrohullámból valamennyit elnyelnek. Ezt az energiaelnyelést detektáljuk és kapjuk meg spektrumként. A spektrum helye a mágneses térben, alakja, a csúcsok felhasadása, ill. az egyes csúcsok közötti távolság, az úgynevezett csatolási állandó (’a’) a gyökök anyagi minoségére jellemzo, a spektrum amplitúdója pedig a gyökök mennyiségét jellemzi. A készülékünk érzékenysége kb. 10-6 spin M. A legtöbbször nagyon rövid életideju, gyakran csak milli-, nanoszekundumokig létezo gyökök (kevés kivételtol eltekintve, mint pl. az aszkorbil gyök) önmagukban biológiai mintákban nem mérhetoek. Az ilyen gyökök stabil, közvetlen és megfelelo érzékenységu mérésére két alapveto lehetoség kínálkozik az ESR spektroszkópián belül. Az egyik a minta folyékony nitrogénben vagy héliumban történo fagyasztása (freeze trapping), a másik a mérést viszonylag specifikussá tevo spincsapdák (spin trap) vagy spinpróba-vegyüle tek (spin probe) használata. A freeze trapping használatával a fagyasztás pillanatában keletkezett és jelenlévo gyökök mennyiségének mérése lehetséges. Ez a módszer átfogó képet ad a mintában lévo szabadgyökök mennyiségérol, és elsosorban már csak szekunder gyökök meghatározását teszi lehetové (protein tiolok, lipid peroxid-, alkoxil gyökök, stb.), de minoségi megkülönböztetést nem nyújt. Sokkal több információ nyerheto az ún. spincsapdák használatával. Ezek olyan vegyületek, melyek hosszabb életu és stabil adduktokat képeznek a mérni kívánt szabadgyökkel, ezért akár szobahomérsékleten, akár fagyasztva jól mérhetové teszik azt. A spincsapda jellegét attól függoen választhatjuk meg, hogy milyen gyököt kívánunk meghatározni, ezek a vegyületek többé-kevésbé specifikusak egy adott gyökre vagy gyökcsaládra. A spinpróba-vegyületek ettol kissé eltéroen muködnek: stabilis szabadgyök vegyületek, melyek a szervezetben in situ reagálnak az ott keletkezo gyökökkel, ezért beadásukat követoen mennyiségük fogy. ESR spektroszkópiával tehát a stabilis szabadgyök (vagyis a spinpróba- vegyület) jelének csökkenése követheto (100,101). A jelcsökkenés mértékét idoben követve egy kinetikai görbét kapunk, melynek lineráis szakaszából egy kinetikai
36
sebességi együttható (k) számolható. Ezeket a ’k’ értékeket hasonlíthatjuk össze pl. az egészséges és a beteg állatokban: minél nagyobb ez a sebességi állandó, annál több gyök keletkezett az adott szervben. Munkámban
mindkét
módszert
alkalmaztam
különbözo
szabadgyökök
detektálására. Az ESR méréseket a 10. ábrán látható X-sávos, számítógépes szoftverrel modulált elektron spin rezonancia spektroszkóppal végeztem kb. 100 mg szövetbol, folyékony nitrogénben egy kvarc Dewar edényben (102). A kiértékelést a jelek kétszeri integrálásával és egy Mn/MnO standard jeléhez való viszonyításával végeztem, ill. segítségemre volt még egy hazai fejlesztésu „ESR” szimulációs program is (103). A mért eredményeket minden esetben integrált terület egységben (önkényes egység) adtam meg. A jellemzo muszerbeállítások a következoek voltak: 334 mT térközép, 100 kHz
modulációs
frekvencia,
0,7050
mT
modulációs
amplitúdó,
18
mW
mikrohullámerosség, 20.63 vagy 10.69 mT mezoszélesség. Egy spektrum felvételének ideje 1 perc volt.
4.1.2.1. Stacioner szabadgyök koncentráció meghatározása szövetben
Azok az állatok, melyekbol egy átlagos „steady state” (stacioner) gyökszintet kívántunk meghatározni, nem kaptak sem spincsapdát, sem spinpróba- vegyületet. Szerveiket a boncoláskor folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd a méréseket a fentebb leírt módon végeztük el. A mintavétel és a meghatározás idopontja között eltelt ido közömbös, mivel a folyékony nitrogénben tárolt szövetek gyöktartalma akár évekig sem változik.
4.1.2.2. Nitrogén monoxid gyök meghatározása szövetben
A nitrogén monoxid termelodésének meghatározásához az állatok fél órával leölés elott spincsapdaként nátrium-dietil-ditiokarbamát spincsapdát (DETC, 400 mg/tskg) kaptak intraperitoneálisan, ill. vas-citrátot szubkután (vas-szulfát 40 mg/tskg + nátrium-citrát 200 mg/tskg) (104,105). A spincsapda komplex (Fe(II)-DETC) vízben nem oldódik, ezért a két komponenst külön kellett beadnunk, hogy a komplex így magában az adott szervben képzodhessen in vivo. Minden oldatot frissen készítettünk
37
desztillált vízben, a spincsapdát PBS pufferben, melyeket elozoleg oxigénmentesítés céljából 20 percig nitrogénnel átbuborékoltattunk. A kontroll és a diabeteses állatok szerveit szintén cseppfolyós nitrogénben fagyasztottuk és a 4.1.2. pontban leírtak szerint mértük. Az ? NO-ból és a spincsapdából képzodo mononitrozil- vas(II)-DETC komplex addukt jellegzetes triplet spektrumot ad, a három csúcs közötti csatolási állandó aN = 12.5 G alapján könnyen azonosítható.
4.1.2.3. Oxigén-centrumú gyökök mérése szövetben
Az oxigén-centrumú gyökök képzodésének meghatározásához a háromhetes csoportba tartozó állatok leölés elott öt, tíz, ill. tizenöt perccel spinpróba- vegyületként 3-karbamoil-proxilt (c-PROXYL, 56 mg/kg) kaptak i.p., 300 egység SOD enzim i.v. adásával együtt vagy anélkül (100,101). A SOD adásával ellenoriztük a c-PROXYL oxigén-centrumú gyökökre való specifikusságát. A mérési körülmények megegyeztek az elozoekben leírtakkal.
4.1.3.
Peroxinitrit
anion
és
reakciótermékeinek
kemilumineszcenciás
meghatározása
A peroxinitrit ex vivo mérése egy luminol- függo kemilumineszcenciás módszerrel történt, Zweier és Brovkovych leírásaira támaszkodva (106,107). Zweier és kollegái módszerét Brovkovych ültette át és használta ONOO¯ kemilumineszcenciás detektálására patkány aortában. A mérés elve, hogy a szabadgyökös reakciók során felszabaduló energia fény formájában is megjelenik (kémiai energia fényenergiává alakul). Ezt a fényt a luminol nevu vegyület, mint jelsokszorozó felerosíti, s így detektálhatóvá teszi. A készülékhez csatlakozó szoftver a mérés során eltelt ido függvényében jeleníti meg a mért beütésszámot, vagyis egy kinetikai görbét látunk, melybol egészen pontosan a gyökös reakciók sebességére következtethetünk. A mérés során 8-10 mg patkány aortát, vesét vagy szívet helyeztünk 2 ml Hank’s pufferbe (pH=7.4) egy lumineszcenciás edényben, majd 1 ml lúgos karbonátpufferben felvett (pH=10.0) luminol oldatot adtunk az elegyhez (végkoncentrációk: luminol 400 µM, karbonát 50 mM). Ezt a kemilumineszcenciás küvettát helyeztük egy, a laboratóriumban
38
házilag felépített luminométerbe. A lezajló gyökös reakciókból származó fényt mértük mintegy fél-egy órán keresztül. A muszerhez kapcsolódó szoftver segítségével egy kinetikai görbét kaptunk eredményül, ebbol következtettünk a keletkezo ONOO¯ mennyiségére. Ilyen lúgos pH- n mérve Zweier szerint már csak az ONOO¯ és reakciótermékei reagálnak a luminollal. Ezt kísérleteinkben mi is ellenoriztük, és többféle módon igazoltuk. Egy hasonlóan kivitelezett mérés során a pH-t 7.4-re csökkentettük, amelyen a peroxinitrit már nem stabil, ezért nem mérheto. Egy másikban pedig 1 mM L-NMMA-t (N G-monometil- L-arginin), egy nitrogén oxid szintáz gátlószert,
50
mM
DMPO-t (5,5’-dimetil-1-pirrolin-N-oxid), egy oxigén-
és
széncentrumú szabadgyökökre általános spincsapdát, illetve egy specifikus ONOO¯fogót, 100 mM urátot adtunk a rendszerhez. Eredményeinket beütésszám/másodperc (cps) egységben adtuk meg.
4.1.3.1. A peroxinitrit képzodés reakciójának modellezése számítógépes szimulációval
Annak igazolására, hogy a fenti módszer valóban az ONOO¯-t méri, a lehetséges reakciók felírása és a már rendelkezésre álló mérési adatok alapján számítógépes szimulációt is végeztünk a KINAL program segítségével (108). A matematikai modell megépítéséhez szükséges volt legalább az ? NO és az oxigé ncentrumú gyökök adduktjainak steady state-ben mérheto stacioner koncentrációjának megbecsülésére a kísérleti adatokból. Ehhez a korábban ESR spektroszkópiával aortában kapott spektrumok csúcs alatti integrált területegységeit kalibrálnunk kellett. Egy ismert stabilis szabadgyök vegyület, a 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oxil (TEMPO) különbözo koncentrációjú lefagyasztott oldataival végeztük a kalibrációt 77 Kelvin fokon ESR spektroszkópiával, azonos körülmények közt, mint a szervmintáknál tettük. Modellünk felállításához kvázi stacioner állapotot feltételeztünk az érfalban, s így az ún. tökéletesen kevert nyitott rendszer modell tunt alkalmasnak a szimulálásra. Ezt a rendszert nemcsak komplex kémiai rendszerekben (109,110), hanem pl. a biológiában iszkémia/reperfúziós kísérletek modellezésére is alkalmazták sikerrel (111). Szükség volt még a modell felállításához egy komplex reakciómechanizmusra, melyet a kísérleti tapasztalatok (pl. c-PROXYL-lal történt, illetve kemilumineszcenciás mérések) és irodalmi adatok alapján tételeztünk fel. Az alábbi reakciók kerültek a modellrendszerbe.
39
?
pK
O2 ?? + H+
a) HO2 ?
k2
b) O2 ?? + O 2 ?? ? O2 + O22? k3
c) HO 2 ? + HO 2 ? ? H2O2 +O2 k4
d) O2 ?? + HO2 ?? ? O2 + HO2 ? k5
e) ?NO+ O2 ?? ? ONOO? k6 ?
f) ONOO? ?
NO + O 2??
g) ONOO? + H+ ? k8 ?
h) ONOOH ?
ONOOH
NO2 + ?OH
i) ?NO2 + ?OH ? ONOOH k
j) NO2 + ?OH ?10 H+ +NO3 ?? ? k) ONOO? ?
?
?
NO2 + O??
k12
l) ?NO2 + O???? ONOO ? k13
m) ?NO2 + ?NO2 ? N2 O4 n) N2 O4 ? ?NO2 + ?NO2 o) N2 O4 + H2 O? NO2 ? + NO3 ? +2H? p) ?OH + ?OH ? H2 O2 k17
q) O?? + O2 ? O3 ?? k
r) O3 ?? ?18 O?? + O2 k19
s) O3 ?? + ?NO ? NO2? + O2 t) ?NO + ?NO2 ? N2O3 k21
u) N2 O3 ?
?
NO + ?NO2
k22 v) N2 O3 + 2OH ? 2NO2 ? + H2 O ?
w) ONOOH ? H+ +NO3? x) ONOO? + ONOOH ? ADDUCT? k25
y) ADDUCT? ? ONOO? + ONOOH k26
z) ADDUCT? ? 2NO2 ? + O2 + H+
40
zi) ONOO? + CO 2 ? ONOOCO2 ? ?? k28
zii) ONOOCO2 ? ?? NO2 + CO 3?? k29
ziii) ONOOCO 2? ?? NO3 ? + CO2 .
Ezen reakciók alapján két alternatív mechanizmus lehetséges, az egyik az (a- v és zi- ziii) reakciókból, a másik az (a-g és w-ziii) reakciókból álló, gyökös ill. ionos mechanizmus. A differenciálegyenlet-rendszert a KINAL (108) programmal oldottuk meg.
4.1.4. Protein karboniláció mérése spektrofotometriásan
Az ESR spektroszkópiától függetlenül, de az oxidatív stressz meglétének további igazolására igyekeztünk választani egy másik, jellemzo markert, melyet a diabetes
idobeni
lefolyása
során
figyelemmel
kísérhettünk.
Az
oxidatív
fehérjekárosodás markerét, a fehérje karbonil mennyiségét a szövetekben Levine és mtsai (41) módszerével határoztuk meg. A mérés elve az, hogy a 2,4-dinitrofenilhidrazin (DNPH) nevu festék reagál a karbonilokkal, a mintából a felesleges festék kimosása után a sárga színu reakciótermék mérheto spektrofotometriásan. A boncolás során nyert szövetmintákból 1:10 arányú homogenizátumot készítettünk jéghideg desztillált vízben, Potter csiszolatos kézi homogenizáló segítségével. A protein karbonil meghatározáshoz 1 térfogatrész mintához 4 térfogatrész 10 mM-os DNPH oldatot adtunk (2.5 M HCl- ben oldva). Minden mintához saját vak szükséges, itt 1 térfogatrész mintához 4 térfogatrész 2.5 M HCl- t adtunk. Az inkubálás 1 órán keresztül 25 ºC-on történt, rázatással. Inkubálás után 5 térf. rész 20 % triklórecetsavat adtunk a csövekbe, majd 10 perc jégen történo inkubálás után centrifugáltunk 5000 g–n 5 percig. A protein karbonilok a pelletben találhatóak, amit ezek után egyszer 10 % triklórecetsavval, majd háromszor etanol:etil-acetát 1:1 keverékével mostunk és minden mosás után hasonlóan centrifugáltuk, mint elobb. Végül a pelletet 2 kiindulási térfogatnyi, 6 M-os guanídium- hidroklorid oldatban felvettük (az oldás 10 percen át történt 37 ºC-os vízfürdoben), majd centrifugálás után a felülúszót
mértük.
A
spektrum
felvétele
egy
Hewlett-Packard
UV-VIS
spektrofotométerrel történt 355 – 390 nm között. A mérésnél a vak a DNPH kezelés
41
nélküli, de hasonló elokészítésen átesett minta volt. A számításoknál alkalmazott extinkciós koefficiens e = 22 000 1/Mcm. A DNPH 40-50 %-a nedvesség, ezt a kimérésénél figyelembe vettük, a 6 M guanídium- hidrokloridot pedig 20 mM káliumfoszfát pufferben oldottuk be (pH = 2.3). Eredményeinket nmol/mg nedves szövet egységben fejeztük ki.
4.1.5. Szövettani vizsgálatok
A szövettani vizsgálatok elvégzése az esetleges szövodmények meglétének vagy hiányának igazolására dönto fontosságú volt. A szövettani festésekhez 6 diabeteses patkány máj, vese, agy és aorta szövetmintáit 8 %-os pufferolt formaldehid oldatban illetve 96 %-os etanolban fixáltuk. Fixálás után paraffinba ágyazva vagy fagyasztva metszeteket készítettünk. A következo eljárásokat használtuk: standard hematoxylineosin festés, Schiff (PAS) festés, Sudan Red Oil-Red-O festés, ill. neurofibrillumimpregnálás (112-117).
4.2. Az aminoguanidin- és inzulinkezeléssel kapcsolatos kísérletekben alkalmazott módszerek
4.2.1. Állatmodell
Ezeket
a
kísérleteket
szintén
streptozotocin- indukálta
diabeteses
patkánymodellen végeztük. Az állatok, tartásuk és a diabetes indukálása a 4.1.1. pontban leírtak szerint történt. Az állatokat itt a következo csoportokba soroltuk.
a) kontroll, kezeletlen, b) kontroll aminoguanidin kezeléssel (1 g/l koncentrációban az ivóvízben 3 héten keresztül), c) diabeteses, nem kezelt, d) diabeteses, napi egyszeri inzulinnal kezelt (vércukor koncentrációtól függoen 2-8 egység Humulin U inzulinnal szubkután), e) diabeteses, aminoguanidinnel kezelt (1 g/l koncentrációban az ivóvízben).
42
Minden csoportb a 6-8 állat került. A vércukorszinteket naponta mértük és a kezelt csoportnál a mért értékek alapján állítottuk be a szükséges inzulin mennyiséget. Az állatok súlyának alakulását minden csoportban legalább hetente, az inzulinnal kezelt csoportban két- három naponta ellenoriztük. Három hét diabetes után az állatokat pentobarbitál narkózisban dekapitáltuk, vizsgálatra kerülo szerveiket – máj, vese, érfal, szív, agy – azonnal cseppfolyós nitrogénben lefagyasztottuk.
4.2.2. A szénhidrát-anyagcserére jellemzo paraméterek meghatározása: szérum glükóz, HbA1c és fruktózamin
Kérdéses volt kísérleteinkben, hogy az oxidatív stresszre, a különbözo szabadgyökök szintjére gyakorolt hatások mellett a kezelések milyen befolyással vannak a diabeteses állatok szénhidrát anyagcseréjére. Ezért vizsgáltunk néhány, szénhidrát metabolizmusra jellemzo markert, így a szérum glükóz szintet, a teljes vér glikált hemoglobin szintjét (HbA1c), és a szérum fruktózamint. A HbA1c szintje egy hosszabb távú mutató, embereknél a megelozo 6-8 hét szénhidrát-anyagcserekontrolljára jellemzo, míg a fruktózamin inkább rövidebb idoszakot, a megelozo három hét szénhidrát-anyagcseréjének minoségét mutatja. A vércukor szinteket OneTouch II készülékkel (Lifescan Inc. J & J, USA) mértük, míg a glikált hemoglobint Randox HA3830 standard kittel (Randox Laboratories, Ardmore, Anglia). A fruktózamin meghatározása nitrokék-tetrazolium redukciós próbával történt (118) szérumból, melyet a véralvadásgátlóval nem kezelt patkányvér egyszeru centrifugálásával nyertünk.
4.2.3. Nitrogén monoxid mérése ESR spektroszkópiával ?
Az NO szintek meghatározása a 4.1.2. pontban leírtak alapján történt ezekben a kísérletekben is, vagyis: az állatok fél órával leölés elott spincsapdaként nátrium-dietilditiokarbamátot (DETC, 400 mg/tskg) kaptak i.p., ill. vas-citrátot s.c. (vas-szulfát 40 mg/tskg + nátrium-citrát 200 mg/tskg). Az ESR mérések és a kiértékelés itt is hasonlóan zajlott, mint az elozo kísérletekben.
43
4.2.4. Peroxinitrit anion és reakciótermékei meghatározása kemiluminométerrel
A peroxinitrit ex vivo mérése itt is minden csoportban a 4.1.3. fejezetben ismertetett luminol- függo kemilumineszcenciás módszerrel történt.
4.2.5. Szívhipertrófia vizsgálata
A streptozotocin- indukálta diabetesben kialakuló szívhipertrófia mértékére a boncolás után vértelenített, analitikai mérlegen mért nedves szívsúlyok testsúlyra vonatkoztatott csoportonkénti összehasonlításából következtettünk. Az eredményeket mg/100 g testsúly egységben adtuk meg. Természetesen a szívhipertrófia megállapítása egyszeru súlyméréssel óvatosságot igényel, az állatok boncolása során ezért igyekeztünk a szív kimetszését mindig ugyanolyan körülmények között és ugyanazon a helyen végezni: az egész szívet kiemeltük, az aortát az aortagyöknél elmetszettük, a szívet kettévágtuk, majd a kamrákat és pitvarokat is gondosan vértelenítettük.
4.3. Reagensek, ve gyszerek
Mindkét kísérletsorozatban a kereskedelemben kapható leheto legmagasabb analitikai tisztasági fokú reagenseket és vegyszereket használtuk, melyeket a Sigmától (Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Taufkirchen, Németország), vagy a Flukától (Fluka Ag., Buchs, Svájc) szereztünk be. A Humulin U inzulint a Lilly Hungary Kft. (Budapest) biztosította. A Medi-Test glükóz tesztcsíkokat a Reanal Kft.-tol (Budapest) vásároltuk. Az SPF minosítésu (csíramentes) hím albínó patkányokat kísérleteinkhez a Toxi-Coop Kft. (Budapest) szállította
44
4.4. Az eredmények értékelése, statisztikai analízis
A mért adatok értékelése minden kísérletben a STATISTICA programcsomaggal történt
(Statsoft,
normalitásvizsgálatot
Oklahoma, végeztünk
USA). a
Adatainkra
minden
esetben
eloször
Kolmogorov –
Smirnov
teszttel.
Ha
az
eloszlásfüggvény normál (Gauss) eloszlást közelített, akkor a paraméteres párosítatlan Student- féle t-tesztet, ha nem normális eloszlású volt, akkor a nem-paraméteres MannWhitney U-tesztet használtuk értékelésre. Ha 95 %-os szignifikanciaszinten különbség mutatkozott az összehasonlított csoportok között, akkor az eltérést statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.
45
5.
EREDMÉNYEK
5.1. Szabadgyökök megjelenése és idobeni alakulása streptozotocin-indukált diabetes korai fázisában patkányban
Doktori munkám során végzett kísérleteimben elsoként arra kerestük a választ, milyen szabadgyökös elváltozások mutathatók ki a streptozotocin- indukálta diabetes korai fázisában, különbözo idopontokat vizsgálva a betegség elorehaladtával. Vizsgáltam, hogy melyek azok a szabadgyökök, amelyek termelodése emelkedik, mennyi ido elteltével mérhetoek ezek a változások, egymáshoz képest mikor jelentkeznek és így képezhetnek-e együtt valamilyen reaktív terméket. Kérdés volt, hogy kimutathatóak-e ezek valamilyen szövettani változás megléte elott, hisz ekkor okokozati szerepük is tisztázódhat. Hangsúlyt kívántunk fektetni munkánkban a nitrogéncentrumú reaktív molekulákra, a nitrogén monoxidra és a peroxinitritre. A vizsgálati idopontokat korábbi irodalmi adatok alapján választottuk ki, különös tekintettel Kakkar és mtsai. (66,67) eredményeire, akik már a diabetes korai szakaszában találtak elváltozásokat az oxidatív stresszre jellemzo antioxidáns enzimek aktivitásában. Ezen adatok alapján választottuk az egy-, ketto-, három-, és hét hetes idopontokat a diabetes kialakulásától számítva. Azokat a diabeteses állatokat, amelyeknek szérum glükóz koncentrációja 10 mM- nál alacsonyabb volt, kizártuk a kísérletekbol. A cukorbetegséget a súlygyarapodás csökkenésével is megerosítettük, a cukorbeteg állatok testsúlya ugyanis mintegy 40-50 %-a volt az egészséges, egyezo korú kontrollokénak három hét diabetes eltelte után.
5.1.1. Szabadgyökök stacioner koncentrációja a diabeteses szervekben
Azokból az állatokból, amelyek nem kaptak spincsapdát, ESR spektroszkópiával egy átlagos, natív stacioner gyökszintet mérhetünk. A spektrum ilyenkor egy nagy, széles csúcsból áll, mely fo leg másodlagos – az „Anyagok és módszerek” fejezetben említett - szerves gyökök burkológörbéje, azok fagyasztás pillanatában lévo stacioner koncentrációját mutatja (119).
46
Egy ilyen jellemzo, patkánymájban 77 Kelvin fokon mért spektrumot mutat a 11. ábra.
10 G
11. ábra. Natív szabadgyökök ESR spektruma cseppfolyós nitrogénben mérve patkánymájban, spincsapdák használata nélkül. A nyilak a Mn/MnO belso standardet mutatják, amely az értékelésben viszonyítási alapul szolgál. G: a mágneses térero mértékegysége, Gauss.
A mérések eredményeit az 1. táblázat foglalja össze, integrált terület egységben, kontroll %-ban kifejezve az adatokat. Szignifikáns változást ebben az esetben csak a diabeteses májban tapasztaltunk három héttel a diabetes kialakulása után. A különbség hosszabb távon, hét hét cukorbetegség után is megmaradt.
47
1. táblázat. Szabadgyökök stacioner koncentrációja kontroll és STZ-indukált diabeteses patkányok szerveiben, egy, három és hét héttel a betegség kezdete után. Az eredmények átlag ± standard deviancia alakban vannak feltüntetve. * p < 0.005, n = 6-8.
1 hét
3 hét
7 hét
szerv kontroll
diabetes
kontroll
diabetes
kontroll
diabetes
máj
100?26.1
114.6?19
100?16.1
154?19.3*
100?11.6
155?19.1*
vese
100?11.1
91.16?12.7
100?9.8
111.1?20.5
100?17.8
109.6?16.4
aorta
100?35.8
78.94?44.6
100?35.3
113.6?29.8
100?35.9
89?27.1
szem
100?14.4
118.7?30.6
100?44.9
86.8?50.5
100?33.7
90.9?39.4
agy
100?39.6
79.2?30.3
100?12.3
95?22
100?11.5
114.8?11
5.1.2. Nitrogén monoxid (? NO) képzodése és idobeni alakulása diabeteses patkány szerveiben
Bár az
?
NO egy viszonylag „lassú” gyök, specifikus meghatározásához
spincsapda technikát kellett alkalmaznunk, a szervek fagyasztásával kombinálva. Az ezzel a technikával kapott spektrum, amely a 12. ábrán látható, egy jellegzetes tripletet mutat, amely jól használható az ? NO azonosítására. A spektrumok kiértékelésével kapott eredményeinket pedig a 13. ábra foglalja össze. Azt tapasztaltuk, hogy viszonylag korán, már két hét diabetes után me gnövekszik az ? NO termelodése a diabeteses állatok vizsgált szervei közül a májban és a vesében. Ezek a változások három illetve hét hét diabetes után is megmaradtak.
48
Bár érdekes módon az ? NO szinte kimutatási határ alatt mozgott a diabetes elso két hetében mind a kontroll, mind a cukorbeteg állatok aortájában, a harmadik hétre ugyancsak szignifikánsan megnövekedett a diabeteses patkány aortában és ez a különbség fennállt a hetedik héten is. Érdekes és mindenképpen említésre méltó az is, hogy a kor eloreha ladtával az egészséges állatok érfalában is az ? NO termelodés növekedését figyeltük meg. Nem volt különbség az egészséges és diabeteses állatok ?
NO termelése közt a szívben és az agyban, a szemben pedig nem tudtunk ezzel a
technikával ? NO-t detektálni egyik esetben sem.
aN
20 G
12. ábra. Vas(II)-DETC spincsapdával in vivo csapdázott nitrogén-monoxid ESR spektruma 77 K-en mérve, diabeteses patkánymájban. A nyilak a mononitrozil-Fe(II)-DETC komplex karakterisztikus tripletjét mutatják, aN = 12.5 G.
Érdemes megemlítenünk még a spektrumok kiértékelésének egy speciális módját. Néhány esetben az ? NO spektrumának értékelése nehézségekbe ütközött. Olyan szervekben, melyekben viszonylag magas volt a réz koncentrációja, (pl. az agy és a máj esetében tapasztaltunk ilyet), a mononitrozil-Fe(II)-DETC komplex karakterisztikus tripletje átlapolt egy zavaró háttér spektrummal, melyrol kiderült, hogy az
?
NO
csapdázásához alkalmazott DETC-Cu(II) komplexbol származik, annak paramágneses tulajdonságából adódik (120). Ez a jel, ahol jelentkezett, szinte lehetetlenné tette a spektrumok pontos kiértékelését. A mego ldást az ’ESR’ szimulációs program kínálta: a
49
háttérjelet adó Cu(II)-DETC spektrumot a program segítségével szimuláltuk. A belso Mn/MnO standardot használva a mért spektrumokhoz igazítva ezek után a program képes volt egy úgynevezett aktív kivonást használva ezt a zavaró jelet eltávolítani a mononitrozil-Fe(II)-DETC spektrumról, így lehetové téve a pontos kiértékelést és a termelodo ? NO mennyiségének megbecsülését.
1400
1 hét
400
300
VESE
200
1200
AGY
SZíV AORTA
100
K
cC
D
K
D
MÁJ
AGY
800 600
SZíV
VESE
400
K
D
K
D
K
AORTA
0
D
K
1400
*
d
3 hét
400
VESE
AORTA
SZíV
K
D
K
D
K
D
7 hét
MÁJ
AGY
800 VESE 600
AORTA
SZíV
400
*
200
1000
D
*
ESR jelintenzitás (int.t.e.)
600
K
D
1200
AGY
D
*
MÁJ
*
ESR jelintenzitás (int.t.e.)
1000
200
0
800
2 hét
*
ESR jelintenzitás (int.t.e.)
ESR jelintenzitás (int.t.e.)
MÁJ 500
1000
bB
A
*
600
200
0
0
K
D
K
D
K
D
K
D
K
D
K
D
K
D
K
D
K
D
13. ábra. Nitrogén oxid relatív koncentrációja kontroll és STZ-indukált diabeteses patkányok szerveiben, (A) egy, (B) ketto, (C) három ill. (D) hét héttel a betegség kezdete után. K: kontroll, D: diabeteses csoport. Int.t.e.: integrált terület egység. Az eredményeket átlag ? standard deviancia alakban adtuk meg (n=6-7).
50
K
D
5.1.3. Oxigén-centrumú gyökök képzodése diabetesben. A c-PROXYL spinpróbavegyülettel kapott eredmények.
Az oxigén-centrumú gyökök in vivo képzodését a háromhetes csoportban határoztuk meg, mivel a nitrogén monoxid szintben itt találtuk a legmarkánsabb változásokat. Az ilyen gyökök meghatározásához az ún. spinpróba technikát használtuk. Egy ilyen technikával mért tipikus spektrumot mutat be a 14. ábra. Utsumi és mtsai élo egér farokvénájában mérték ezeket a sebességi állandókat streptozotocin- indukálta diabetesben (101). Az o munkájuk alapján mi elsoként, szervenként specifikusan határoztuk meg az oxigén-centrumú gyökök szintjének alakulását. Elozetes kísérleteket végeztünk
annak
meghatározására,
hogy
a
c-PROXYL
szervekben
történo
akkumulációját és a szabadgyökös reakciók miatti kioltódásának idejét kimérjük. Ehhez öt, tíz, tizenöt és harminc perccel leölés elott kapták az állatok a c-PROXYLT, a 4.1.2.3. fejezetben leírtak szerint.
10 G
14. ábra. c-PROXYL spinpróba-vegyület adduktjainak jellegzetes ESR spektruma cseppfolyós nitrogén homérsékleten, patkánymájban.
Az ESR jelintenzitások idobeni féllogaritmikus ábrázolásával nyertünk egy kinetikai görbét, mely 10 és 15 perc között mindig lineáris volt. A kísérleteink során a kinetikai görbe ezen két idopont közötti lineáris szakaszának meredekségébol nyertük a ’k’ sebességi együtthatókat (spin clearance), melybol a képzodött oxigén-centrumú
51
gyökök
relatív
mennyiségére
patkányszövetekben
kapott
következtettünk.
kinetikai
görbék
A
kontroll
lineáris
és
szakaszát
diabeteses mutatja
be
féllogaritmikus ábrázolásban a 15. ábra.
9.00
7.9
agy
máj 7.7 ln (ESR jelintenzitás)
ln (ESR jelintenzitás)
8.75
8.50
8.25
8.00
7.5 7.3 7.1 6.9
7.75
6.7
7.50 9
10
11
12
13
14
15
16
9
10
11
12
Idõ (min)
11.0
14
15
16
vese
10.5
aorta
10.5
10.0
10.0
ln (ESR jelintenzitás)
ln (ESR jelintenzitás)
13
Idõ (min)
9.5 9.0 8.5 8.0
9.5 9.0 8.5 8.0 7.5
7.5 9
10
11
12
13
14
15
16
7.0
9
10
11
12
Idõ (min)
13
14
15
Idõ (min) 9.4
szem
ln (ESR jelintenzitás)
9.3 9.2 9.1 9.0 8.9 8.8 8.7
9
10
11
12
13
14
15
16
Idõ (min)
15. ábra. c-PROXYL ESR jelintenzitás csökkenésének idobeli változása féllogaritmikus ábrázolásban, kontroll (kék —? —, teli vonal) és diabeteses (zöld —? —, teli vonal) patkány szövetekben. A szaggatott vonalak megegyezo kísérleteket mutatnak, 1 mM ferricianid adása után (kontroll: ? , diabeteses: ? ).
52
16
Röviddel az állatba történo beadása után a c-PROXYL, ami egy stabil nitroxil gyök, reagál a szövetekben lévo más, natív szabadgyökökkel, foleg oxigéncentrumúakkal. A reakció eredményeképpen a spinpróba-vegyület átalakul nitron származékká, elveszíti paramágnesességét, és így már nem ad ESR jelet (15. ábra folytonos kék, ill. zöld vonalai). Emellett azonban a szövetekben jelenlévo redukáló anyagok (pl. ilyen az aszkorbát) is reagálhatnak vele, hidroxilamin származékká alakíthatják, mely szintén „néma” az ESR készülékben, így intenzitáscsökkenésként észlelhetjük ezt a reakciót is. Ezért annak bizonyítására, hogy valóban szabadgyökös reakciók történtek, egy csoport állatnak a kísérletek során 1 mM kálium- ferricianidot adtunk szubkután a spinpróba- vegyület mellé. A ferricianid képes visszaoxidálni ESR jelet-adó nitroxiddá a spinpróba-vegyületbol gyökös mechanizmussal képzodött termékeket,
így
bizonyítván
azt,
hogy
a
mért
intenzitáscsökkenés
valóban
túlnyomórészt gyök- gyök reakcióból származik. A 15. ábra szaggatott vonalai mutatják az így kapott egyeneseket, látható, hogy itt a jelintenzitás alig csökken, a spinpróbavegyület redukáló anyagok miatti átalakulása tehát elhanyagolhatóan kicsi. Összefoglalva: a spinpróba- vegyület oxigén-centrumú gyökökkel való reakciója folytán az ESR jelintenzitás az idoben elorehaladva csökken (121,122). Két-két párhuzamos kísérletsorozatot állítottunk be hasonló körülményekkel, 300 egység SOD i.v. adásával vagy anélkül, általában 7-7 állatot használva minden idopontban. A kinetikai együtthatókat a kapott görbék meredékségeinek átlagolásából kaptuk, a standard devianciát a hibaterjedési törvény alapján számítottuk ki. A kapott eredményeket, a sebességi együtthatókat a 2. táblázat mutatja be.
53
2. táblázat. c-PROXYL átlagos sebességi együtthatói (1/min) 3-hetes streptozotocin-indukálta diabeteses és kontroll patkányokban. * Szignifikáns különbség a megfelelo kontrollhoz képest, p < 0.05.
kontroll + 300 U
diabetes + 300 U
szerv
kontroll
diabetes
SOD
SOD
máj
0.075 ? 0.041
0.048 ? 0.035
0.089 ? 0.022
0.051 ? 0.032
vese
0.192 ? 0.050
0.107 ? 0.078
0.068 ? 0.041 *
0.033 ? 0.030
aorta
0.201 ? 0.025
0.109 ? 0.079 *
0.095 ? 0.041 *
0.086 ? 0.028
agy
0.140 ? 0.046
0.183 ? 0.097
0.099 ? 0.045
0.096 ? 0.066
szem
0.043 ? 0.039
0.056 ? 0.023
0.081 ? 0.041
0.02 ? 0.051
Az oxigén-centrumú gyökök c-PROXYL spinpróba-vegyülettel történo mérése során szokatlan jelenséget figyeltünk meg. A reaktív oxigén speciesek szintje változatlan volt a diabeteses agyban, a májban, és a vesében, de a várakozással ellentétben, csökkenést tapasztaltunk a beteg állatok aortájában (2. táblázat). A „spin clearance” csökkenése azt sugallná, hogy kevesebb oxigén-centrumú gyök reagált a spinpróba-vegyülettel ezekben a szervekben. 300 egység SOD adására a sebességi együtthatók tovább csökkentek mintegy 50%-al az említett szövetekben, bizonyítva azt, hogy a c-PROXYL- lal detektált speciesek legalább fele biztosan szuperoxid anion volt (2. táblázat). SOD jelenlétében a diabeteses állatok szerveiben is hasonló tendenciát figyeltünk meg, de szignifikáns különbség nélkül. Mindezek az eredmények arra utaltak, hogy a látszóla g csökkent reaktív oxigén ?
gyök szint egy – feltehetoleg NO és szuperoxid anion közt végbemeno - rendkívül gyors reakció következménye (16. ábra, ’a’ egyenlet), ami kompetitív a spinpróbavegyület és a szuperoxid anion reakciójával (16. ábra, ’b’ egyenlet).
54
(a) (b)
?
NO + O2 ? ?
ONOO ?
c-PROXYL? + O2 ? ?
c-PROXYL-OH addukt
16. ábra. Szuperoxid anion reakciója ?NO-val, és reakciója a spinpróba-vegyülettel.
Az (a) reakció diffúziókontrollált és egy újabb reaktív terméket, peroxinitrit aniont (ONOO? ) eredményez. Ezt a feltevésünket erosítette az a tény is, hogy éppen azokban a szervekben, ahol látszólagos reaktív oxigén gyök csökkenést tapasztaltunk, ott ?
emelkedést figyeltünk meg az NO szintjében. Ezért további lépésként, elsosorban a kontroll és diabeteses aortákból, ahol mind a c-PROXYL- lal mért sebességi együtthatók ?
közötti különbség, mind az NO termelodésben tapasztalt eltérés szignifikáns volt, peroxinitrit anion képzodést határoztunk meg ex vivo kemilumineszcenciás módszerrel, minden idopontban.
5.1.4. Peroxinitrit anion és reakciótermékeinek ex vivo meghatározása diabeteses patkányok aortájából Az ONOO?
keletkezését az
?
NO szintekhez hasonlóan minden idopontban
meghatároztuk diabeteses és egészséges állatok aortájából. A cukorbeteg patkányok érfalában drámaian megnövekedett az ONOO? és reakciótermékeinek termelodése ?
három hét diabetes után. A kontroll állatok peroxinitrit szintje – hasonlóan az NO mérésekhez – a kor elorehaladtával itt is emelkedést mutatott, hét hét elteltével. Az eredményeket a 17. ábra oszlopdiagramja mutatja be. A 18 A. ábra pedig a jellemzo kemilumineszcenicás görbéket ábrázolja a háromhetes kontroll és diabeteses csoportból. Azt, hogy valóban ONOO? -t detektáltunk, többféle módon is megerosítettük. Egy közismert NOS inhibítort, L-NMMA-t (1 mM) adtunk a reakcióelegybe (18 B. ábra), melyre a kemilumineszcenciás jel növekedni kezdett.
55
10000 7 HÉT
3 HÉT
Kemilumineszcenciás intenzitás (cps)
8000
*
6000
4000
2 HÉT
1 HÉT 2000
0 K
D
K
D
K
D
K
D
17. ábra. Peroxinitrit és származékainak keletkezése kontroll és diabeteses patkány aortában, a betegség különbözo idopontjaiban. K=kontoll, D=diabetes. Adatok: átlag±szórás. (n=7). * Szignifikáns különbség a korban megegyezo kontrolltól, p<0.05.
Ez csak úgy magyarázható, hogy ? NO hiányában nem képzodik ONOO? , ezért a luminol gyorsan elreagál egyéb más speciesekkel. Ennek a feltevésnek az alátámasztására egy általános spincsapdát, DMPO-t (50 mM) adtunk a rendszerünkhöz. A lumineszcencia az alapértékre esett vissza. Ez az eredeti protokollban közölthöz hasonló (106) procedúra megerosíti azt a hipotézist, ho gy mind ? NO, mind egyéb más, oxigén-centrumú reaktív gyökök keletkeznek az aortában, melyek egymással reagálva peroxinitritet és hasonló termékeket adnak. Egy másik kísérletben a közeg pH-ját csökkentettük lúgosról pH=7.4-re. Itt a peroxinitrit erosen instabil, nagyon gyorsan protonálódik. Ebben az esetben nem kaptunk kemilumineszcenciás jelet (pontosabban szólva csak az alapvonalat mértük, 18 C. ábra). Végül egy széles körben használt peroxinitrit- fogót, 100 mM nátrium- urátot adtunk a közegbe egy harmadik kísérletben az érfalak mérése során, pH=10.0-en. A kemilumineszcenciás jel ismét az alapértékre esett vissza (18 C. ábra), tovább bizonyítva, hogy az ex vivo keletkezett ONOO? -t és termékeit mértük az aortában. Említésre méltónak tartjuk azt is, hogy megk íséreltünk mérni peroxinitritet hasonló technikával szívben és vesében is, de ott, ahol nem tapasztaltuk az ? NO termelodés növekedését (szív), vagy ott, ahol az oxigéncentrumú gyökök keletkezésében nem volt számottevo változás (vese), nem tudtunk
56
ONOO? -t detektálni sem az egészséges, sem a cukorbeteg állatokban, a diabetes indukciója után egyik mért idopontban sem.
Kemilumineszcenciás intenzitás (cps)
9000
A Diabetes
7000
5000
3000
Kontroll
1000
-1000 -500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Kemilumineszcenciás intenzitás (cps)
Idõ (sec) 50 mM DMPO
7000
B
6000 5000 1mM L-NMMA
4000 3000 2000 1000 0 0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Idõ (sec)
Kemilumineszcenciás intenzitás (cps)
3500
pH=7.4
C
pH=10.0
100 mM urát
2800
2100
1400
700
0 -100
400
900
1400
1900
2400
2900
3400
Idõ (sec)
18. ábra. A) Peroxinitrit és termékei jellemzo kemilumineszcenciája patkány aortában luminol jelenlétében. Kísérletek az ONOO? mérésének bizonyítására. B) L-NMMA és DMPO hatása a jelintenzitásra. C) ONOO? - fogó urát ill. a pH változásának hatása a kemilumineszcenciára.
57
5.1.4.1.A peroxinitrit reakcióinak kémiai modellezése, számítógépes szimuláció A számítógépes szimuláció segítségével megállapítottuk az ONOO? , HONOO, NO2? és NO 3? koncentrációprofiljait, mind az ionos, mind a gyökös mechanizmust alkalmazva.
Mindkét
mechanizmussal
hasonló
eredményt
kaptunk.
Ebben
a
modellrendszerben ez a két mechanizmus tehát ekvivalens egymással. Az ONOO? stacioner koncentrációja 8? 10-6 M-nak
adódott,
ami
viszonylag
magas,
de
nagyságrendileg így is közel áll más szerzok által, pl. makrofágokban mért adatokhoz (123,124). Ez lehet akár a diabetes következménye is, vagy lehetséges, hogy bizonyos reakciók elhanyagolása miatt az ONOO? koncentrációját túlbecsültük. Fontos, hogy a modell igazolta feltevésünket az oxigén-centrumú gyökök mérésénél tapasztalt látszólagos csökkenéssel kapcsolatban.
0.002
2.6e-9 1. periódus
2. periódus
0.001
2.2e-9
0.001
1.8e-9
1e-9
.
O2.-,M
1.4e-9 8e-4
NO, M
0.001
6e-4 6e-10
4e-4
2e-10
2e-4 0 0
50
100
150
200
250
300
350
-2e-10 400
Idõ (sec)
19. ábra. Szuperoxid anion koncentrációja ? NO termelodés hiányában (1. periódus) és ?
NO jelenlétében (2. periódus).
Ha a modellezés elso felében kihagytuk az ? NO keletkezését a rendszerbol (19. ábra), a termelodo szuperoxid anion koncentrációja rövid idon belül állandó értéket mutatott: 1. periódus.. A stacioner állapot beállta után ismét betettük a modellbe az ?
NO-val kapcsolatos reakciókat (e- z reakciók a 4.1.3.1. fejezetben), ekkor a szuperoxid
koncentráció nagyon gyorsan csökkenni kezdett: 2. periódus. A modellezés eredménye is jól mutatja, hogy ? NO jelenlétében miért mértünk a vártnál sokkal alacsonyabb ROS
58
termelodést az aortában. Szintén megvizsgáltuk a pH hatását. A modell érzékeny volt a pH változásra (nem bemutatott eredmény), négy nagyságrenddel magasabb volt a stacioner ONOO? koncentráció pH=10 esetén, mint fiziológiás pH- n, igazolván a méréseinknél tapasztaltakat. Az ONOO? és ONOOH közötti izomerizáció és a CO2 -vel való reakció miatti peroxinitrit bomlás pH=10-en elhanyagolható, míg fiziológiás pH-n ezek a reakciók elotérbe kerülnek, melyek közül foleg a CO2 -vel való reakciók a meghatározóak.
5.1.5. Protein karboniláció a diabetes korai fázisában
A fehérjék karbonilációját viszonylag késoi oxidatív stressz markernek tartja az irodalom (41). Ezért nem meglepo, hogy az elso változásokat három héttel a diabetes kialakulása után tapasztaltuk, ott is csak a vesében volt szignifikánsan több a karbonilált fehérjék mennyisége a kontroll állatokhoz viszonyítva. Késobbi idopontban, hét héttel a cukorbetegség kezdete után már az aortában is magasabb protein karbonil szinteket mértünk (20. ábra). Fontos kiemelnünk még, hogy csak késobbi kísérletekben, az aminoguanidin kezelés során figyeltünk fel arra, hogy a protein karboniláció jeleit észlelhetjük három hét diabetes után a szívben is. Erre a tényre az aminoguanidines kísérleteket tárgyaló fejezetben kitérek, mert a szívhipertrófiához kapcsolódóan jelentosége kiemelkedo.
59
700
700
B
Kontroll Diabetes
600 500 400 300 200 100
protein karbonil (nmol/mg nedves szövet)
protein karbonil (nmol/mg nedves szövet)
A
0
*
600
Kontroll Diabetes
500 400 300 200 100 0
máj
vese
aorta
máj
vese
aorta
700 Kontroll
protein karbonil (nmol/mg nedves szövet)
C
Diabetes
600
*
500
*
400 300 200 100 0 máj
vese
aorta
20. ábra. Protein karboniláció diabeteses patkány szervekben A) ketto, B) három, C) hét héttel a betegség streptozotocinnal való indukálása után. * p <0.05, n = 8.
5.1.6. Kórszövettani eredmények
A fénymikroszkópos hisztopatológiai vizsgálatok nem mutattak ki késoi szövodményt egyik olyan szervben sem a vizsgált perióduson belül, ahol szabadgyökös változások akkorra már felléptek. Korai elváltozásokat találtunk azonban, melyek pl. a diabetesre jellemzo megváltozott szénhidrát- metabolizmusból adódhatnak. Ilyenek voltak elsosorban: súlyos mértéku zsíros májelfajulás, egyúttal a glikogén megfogyása a májsejtek citoplazmájában, egyes egyedekben a glikogén megjelenése a májsejtek magjában, valamint az aorta falának fellazulása. Ezeket foglaltuk össze a 3. táblázatban illetve néhány jellemzo szövettani képen a 21. ábrán.
60
3.
táblázat.
Hisztopatológiai
változások
streptozotocin-indukálta
diabeteses
szöveteiben. A + a patológiai elváltozás fokát jelzi.
Patológiai elváltozás VESE - lokális bovéruség - érfal hialinizáció - gyulladás a glomerulusokban/tubulusban - glikogén/zsír lerakódás a tubulus hámsejtekben (vakuolizáció) - glomerulonephrosis - bazális membran megvastagodása - szubkapszulárisan + veloállományban mészlerakódás - intersticiális mononukleáris sejtes (plazmasejtes) gyulladás MÁJ - zsíros elfajulás - glikogénmegfogyás (periportális kiindulással) - glikogén lerakódás a nukleuszban - májsejt nekrózis + regeneráció - gyulladás (gócos) - epeút érproliferáció, kolangitisz ÉRFAL - egy esetben kezdodo szklerotizálódás (endothel, makrofág) - aortafal fellazulás (vakuolizáció) - tüdoartéria falának hipertrófiája (simaizomban)
61
Eredmény
+ - ++ ++ (+) -
++ - +++ + - ++ + ++ + --+
+/ -
patkány
b
d
c
21. ábra. a) Schiff-festés (PAS), b) szudánvörös festés diabeteses májban, 200x nagyítással. Az a) képen a nyilak a májsejtekben a kioldódott zsírcseppeket jelzik. Glikogénszemcséket ugyanakkor nem tartalmaznak. A b) képen a májban rozsdabarna lipidcseppek láthatók. A nyilak zsíros elfajulást mutatnak. c) Hematoxilin-eozin festés diabeteses aortában 400x nagyítással, d) ugyanez a kép a jobb láthatóság kedvéért szurovel. Az aortafal fellazulását mutatják a nyilak.
5.2. Az aminoguanidin- és inzulinkezeléssel kapcsolatos kísérletek eredményei
Munkám második részében az eddigi mérések eredményei alapján terveztük meg a
NOS
inhibítorként
ismert
aminoguanidin
illetve
az
inzulin
alkalmazását
streptozotocin- indukált diabeteses patkányok kezelésére és vizsgáltuk hatásaikat az oxidatív stresszre. Ezek a vizsgálatok már túlnyomórészt csak azokra a szervekre terjedtek ki, ahol markánsabb elváltozásokat láttunk az ? NO gyök és az ONOO? anion termelésében, így különös hangsúlyt kapott ezekben a kísérletekben az aorta és a szív. Mint az elozo eredményeink is mutatják, diabetesben meglehetosen korán elindulnak az oxidatív, nitrozatív stresszre jellemzo folyamatok, melyek foleg a vaszkulatúrát érintik és hozzájárulhatnak az endothel funkció felborulásához.
62
5.2.1. Szénhidrát-anyagcsere paraméterek alakulása
A 4. táblázat mutatja az egyes csoportok átlagos testsúlyát, valamint a szérum glükóz, glikált fehérje (HbA1c) és fruktózamin szinteket.
4. táblázat. Testsúlyok, és a szénhidrát-anyagcsere paramétereinek alakulása 3 hét streptozotoc in-indukálta diabetes után patkányokban, aminoguanidin és inzulin kezeléssel vagy anélkül. Az eredmények mindenütt átlag ? S.D. alakban vannak feltüntetve (n=8-10).
Testsúly
Vércukor
Fruktózamin
HbA1c
Csoportok
(g)
(mM)
(µM)
(%)
Kontroll
317.3 ? 14.0
9.22 ? 1.09
170 ? 30
3.09 ? 0.14
Kontroll + aminoguanidin
304.1 ? 21.9
7.82 ? 1.04
155.2 ? 33.5
3.21 ? 0.36
Diabetes
149.5 ? 57.9 *
22.27 ? 8.30 *
384.7 ? 100.2 *
8.51 ? 1.4 *
Diabetes + aminoguanidin
173.25 ? 65.6 *
16.88 ? 3.42 *
540.05 ? 211.5 *
9.29 ? 2.9 *
Diabetes + inzulin
240 ? 28.6 * #
11.1 ? 3.1#
570.33 ? 171.7 *
6.58 ? 0.97 * #
* Szignifikáns eltérés a kontrollhoz képest, p<0.05. #
Szignifikáns eltérés a kezeletlen diabeteses csoporthoz képest, p<0.05.
Mindegyik diabeteses csoport állatainak szignifikánsan kisebb volt az átlagos testsúlya, illetve magasabb a HbA1c szintje, mint a megfelelo kontroll csoporté. Az inzulinkezelés azonban pozitív hatással bírt: a kezelt állatok testsúlya szignifikánsan nagyobb, HbA1c értékei pedig kisebbek voltak, mint a kezeletlen cukorbetegeké. A HbA1c mért értékei az ún. jó metabolikus kontroll tartományba (< 7.5 – 8%) estek (125). A szénhidrátmetabolizmus egyensúlyának rövidebb távú mutatója, a fruktózamin, szignifikánsan nagyobb koncentrációban volt a diabetesben szenvedo állatokban, mint az egészségesekben, és ezen a kezelések sem javítottak. Az aminoguanidin kezelés nem volt hatással a fent említett paraméterekre sem a kontroll, sem a cukorbeteg állatokban.
63
5.2.2. Nitrogén monoxid termelodésének változása a kezelések hatására Az ? NO meghatározása ugyanúgy történt, mint a megelozo kísérletekben. Ahol zavaró Cu(II)-DETC szignált is kaptunk, ott ismét a szimulációs programot hívtuk segítségül a háttérjel eltávolítására. A 22. ábrán látható egy ebben a kísérletsorozatban mért ? NO -Fe(II)-DETC spektrum diabeteses májból (A), egy olyan spektrum, melyet inzulinkezelt állat májából kaptunk (B), valamint egy olyan spektrum, melyet aminoguanidinnel kezelt állat májának vizsgálatakor vettünk fel (C).
A 23. ábra mutatja be a három hét inzulin-, ill. aminoguanidin kezeléssel kapott eredményeinket a vizsgált szervekben. Az
?
NO szintje a kontrollhoz képest
szignifikánsan nagyobb volt a cukorbeteg állatok veséjében és aortájában. Az ?
inzulinkezelés csökkentette az NO termelodését a májban, vesében és agyban, de az aortában nem. Az aminoguanidin kezelés viszont szinte minden vizsgált szervben ?
szignifikánsan csökkentette az NO szinteket, ez alól csak a szív volt kivétel. (A szívben már az elso – kezelések nélküli – kísérletsorozat alatt sem sikerült jelentosebb mennyiségu ? NO-t kimutatnunk és ezen a kezelések sem változtattak). Az egészséges, aminoguanidinnel kezelt állatok szerveiben is csökkent az ? NO termelodése, szintén a szív kivételével.
64
A
B
C
20 G
22. ábra. Vas(II)-DETC spincsapdával in vivo csapdázott nitrogén monoxid ESR spektruma 77 K-en mérve, diabeteses patkánymájban (A) kezelés nélkül, (B) ultratard inzulinkezeléssel, (C) 1 g/l aminoguanidin kezeléssel. A szaggatott vonalak jelzik az ? NO addukt tripletjének helyét.
65
*
1000 Kontroll Kontroll+aminog. Diabetes Diabetes+inzulin Diabetes+aminog.
600
* 400
##
200
##
*
*
*
*
ESR jelintenzitás (int.t.e.)
800
##
*
#
0 máj
vese
aorta
szív
agy
23. ábra. Nitrogén monoxid relatív képzodése kontroll és STZ-indukált diabeteses patkányok szerveiben három héttel a betegség kezdete után, inzulin ill. aminoguanidin kezeléssel vagy anélkül. A mérések ESR spektroszkópiával történtek, specifikus nitrogén monoxid spincsapdát használva. Átlag ? S.D., (n = 8). * Szignifikáns különbség a kontrollhoz képest, p< 0.05. # Szignifikáns különbség a kezeletlen diabeteses csoporthoz képest, p < 0.05.
5.2.3. Aminoguanidin- és inzulinkezelés hatása a peroxinitrit termelodésére diabeteses érfalban
A
már
ismertetett
kemilumineszcenciás
technikát
alkalmaztuk
annak
vizsgálatára, hogy a korábbi kísérleteink során a diabeteses érfalban tapasztalt eros ONOO? termelodést hogyan befolyásolják a kezeléseink. Eredményeinket a 24. ábra kemilumineszcenciás görbéi foglalják össze. Érzékeltetésül itt ismét bemutatjuk a korábban már látott, kontrollhoz képest eros ONOO? termelodést a diabeteses aorta gyuruben, valamint két másik görbét, melyeket az inzulinnal ill. aminoguanidinnel kezelt állatok aortájában mértünk. Egyértelmuen látható, hogy mindkét kezelés az alapértékre csökkentette a káros ONOO? anion produkcióját az érfalban.
66
Kemilumineszcenciás intenzitás (cps)
9000
Diabetes
7000
5000
Diabetes+Aminog. 3000
Diabetes+Inzulin 1000
-1000 -500
Kontroll
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Idõ (sec)
24. ábra. Aminoguanidin és inzulin kezelések hatása a reaktív peroxinitrit termelodésére 3 hét STZ-indukálta diabetes után patkány aortában. Jellemzo kemilumineszcenciás görbék.
5.2.4. Szívhipertrófia kialakulása diabetesben és az alkalmazott kezelések hatása
Rubler és mtsai voltak azok, akik eloször beszéltek az irodalomban diabeteses cardiomyopathiaról, melybe a szív (bal kamra) hipertrófiája is beletartozik (126). Három hét streptozotocin- indukált cukorbetegség után patkányainkban spontán alakult ki diabeteses szívhipertrófia, melyet egyszeru módon, a boncolás után mért szívsúlyok testsúlyra vonatkoztatott arányainak összehasonlításával igazoltunk. Ez az eredmény és a kezelések hatása látható a 25. ábrán: míg az inzulinkezelést kapott állatokban szintén kialakult a szívhipertrófia, addig a NOS enzim inhibeálására és a glikációs folyamatok gátlására képes aminoguanidin kivédte a hipertrófia kialakulását.
67
500
*
szívsúly/100 g testsúly
* * 400
300
200 Kontroll
Diabetes Kontroll+aminog.
Diabetes+aminog. Diabetes+inzulin
25. ábra. Szívhipertrófia STZ-indukálta diabeteses patkányban. Inzulin és aminoguanidin kezelés hatása a hipertrófia kialakulására. Átlag ± S.D. * Szignifikáns eltérés a jelzett csoporthoz viszonyítva, p < 0.05 (n = 8).
5.2.5. Protein karboniláció befolyásolása a kezelésekkel
A 4.1.5. fejezetben leírtakon felül az újabb kísérleteink során bebizonyosodott, hogy három hét diabetes után nemcsak a vesében, hanem a szívben is felerosödött protein karbonilációs folyamatok zajlanak. A kezelések során az eredmény hasonlóan alakult, mint a hipertrófiánál: az inzulinkezelés nem védte ki a protein karbonilációt a szívizomban, míg az aminoguanidin kezelés hatékony volt. A vesében egyik kezelés sem volt képes kivédeni az oxidatív fehérjekárosodást. A megbeszélés szempontjából fontos lesz még az, hogy ellentétben az ? NO és ONOO
?
mérésénél látottakkal, az
aortában jelen esetben a karbonilációban változás nem történt. Az egészséges, de aminoguanidint kapott patkányok szerveiben nem volt szignifikáns változás a protein karbonilációban (nem bemutatott adat). Az eredményeket a 26. ábra oszlopdiagramja szemlélteti.
68
protein karbonil (nmol/mg nedves szövet)
1000 Kontroll Diabetes
*
Diab.+inzulin
800
Diab.+aminog.
* 600
* 400
*
#
200
0 máj
vese
aorta
szív
agy
26. ábra. Fehérje karboniláció szintje 3 hét streptozotocin-diabetes után patkányokban, kezelés nélkül ill. aminoguanidin- vagy inzulinkezelés hatására. A fehérje karbonil szintjét Levine módszerével mértük. Átlag ± S.D., (n = 8). * Szignifikáns különbség a kontrollhoz képest, p< 0.05. # Szignifikáns különbség a kezeletlen diabeteses csoporthoz képest, p< 0.05.
69
6.
MEGBESZÉLÉS
6.1. Szabadgyökök idobeni megjelenése streptozotocin-indukált diabetes korai fázisában patkányban
Számos közleményt találhatunk az irodalomban, melyekben leírták, hogy a cukorbetegség kialakulását és a kóros szénhidrát anyagcserét fokozott oxidatív stressz kíséri (2,3,4). Kevés azonban az az információ, amely objektivizálná a diabetesben kialakuló szövetkárosodás (a diabetes késoi szövodményei) és a szabadgyökök kapcsolatát. Doktori munkám elso felében ezért a reaktív szabadgyökök lehetséges szerepét vizsgáltuk a diabetes késoi szövodményeinek kialakulási helyein, de még a korai fázisban, a szövodmények klinikai megjelenése elott, foképpen direkt mérési módszereket alkalmazva. Emelkedett natív szabadgyök szintet találtunk a májban három ill. hét héttel a betegség indukciója után (1. táblázat). Mivel a máj a legfontosabb detoxifikáló szerv és számos oxidatív folyamat, szabadgyökös reakció színhelye (127), így sok betegségben a különbözo biomarkereinek változása már korai szakaszban utalhat oxidatív stresszre. A fagyasztott szervek vizsgálatakor kapott ESR spektrum foleg másodlagos gyököket pl. protein-tiol gyököket, lipid peroxidokat, stb. tartalmaz (119), melyek az elsodlegesen keletkezett szabadgyökök által más biomolekulákkal indított reakciókban keletkeztek. Az ilyen típusú gyökök meghatározása jó általános mutatója a fokozott oxidatív károsodásnak, de csak szemi-kvantitatív információt nyújt egy szövet szabadgyök szintjérol. Spincsapdákat alkalmazva azonban sokkal pontosabb információkat nyerhetünk: közvetlenül a szövetekben lehetségessé válik ? NO vagy oxigén-centrumú gyökök kimutatása. Specifikus Fe(II)-DETC spincsapdát alkalmazva a diabeteses állatok májában ?
szignifikánsan emelkedett NO szintet mértünk már nagyon korai idopontban, két héttel ?
a betegség kezdete után. Ez az emelkedett NO szint végig megmaradt a kísérlet során három, ill. a máj esetén hét hét elteltével is (2.ábra), míg az oxigén-centrumú gyökök mennyisége nem változott szignifikánsan ezalatt a diabeteses májban. Az eredményeink azt sugallják, hogy az ? NO szintjének emelkedése így hozzájárulhat ahhoz, hogy a májban különbözo másodlagos gyökös reakciók lezajlása miatt emelkedhessen a
70
stacioner szabadgyök szint. Mege melkedett az ? NO termelodés a diabeteses vesében is két héttel a cukorbetegség indukálása után. Ez a különbség az egészséges állatokhoz képest a kísérletek végéig, tehát hét hétig megmaradt. Ezek az eredmények jó egyezést mutatnak korábban leírtakkal, pl. De Vriese és mtsai. munkájával (70), akik a STZindukálta diabetes korai fázisában az endotheliális NOS (eNOS) up-regulációját figyelték meg a renális mikrovaszkulatúrában s felhívták a figyelmet arra, hogy ennek szerepe
lehet
a
cukorbetegséggel
kapcsolatos
mikrovaszkuláris
diszfunkció
kialakulásában is. A legérdekesebb és legfigyelemreméltóbb változások az aortában történtek az ? NO termelodésében. Csak nagyon kevés NO-t sikerült kimutatnunk a betegség elso két hetében, majd a harmadik héten szignifikánsan megugrott a mennyisége a diabeteses állatok aortájában, és magasabb is maradt az ? NO produkciója hét hét után is, mint a korban megfelelo kontrolloké. Felfigyeltünk arra, hogy a kontroll állatok ? NO szintje is követte az idoben növekvo tendenciát, mintegy egy hónapos késéssel. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy nemcsak a diabetes hanem a szövetek ?
természetes öregedési folyamatai is felelosek a magasabb NO szintért. Hasonló következtetésre jutott Cernadas ill. Goettsch és mtsai. is (128,129), akik élettani öregedési folyamatokban vizsgálták a nitrogén monoxid szintáz enzimek expresszióját normotenzív állatokban, s mind a vesében, mind az érfalban a kor elorehaladtával nagyobb NOS expressziót mutattak ki, legyen szó akár a konstitutív, akár az indukálható izoformáról. A vaszkulatúrában található
?
NO szintázok aktiválódása
fontos faktornak tunik az öregedéssel kapcsolatos betegségek struktúrális és funkcionális károsodások kifejlodésében (130) – ilyen betegség pl. a diabeteshez gyakran kapcsolódó érelmeszesedés is! Védo szerepnek és az ? NO jótékony hatásának tunik az, hogy az
?
NO emelkedés értágító hatásával mintegy ellensúlyozni akarja az
érfal öregedés folyamán kialakuló merevségét. Azonban, ha oxidatív stressz is fennáll, akkor a nagyobb mennyiségben keletkezett ? NO és oxigén-centrumú gyökök jelenléte miatt megno az esélye a bevezetoben is már említett, gyors, peroxinitritet képzo reakciónak, ami fölöttébb káros lehet számos biomolekulára. Károsító hatása jóval erosebb lehet egy közvetlen szabadgyökös támadásnál. Az elobbiek alapján a kísérleteinkben mért megnövekedett
?
NO termelodés alátámasztja azt a feltételezést,
hogy egyfajta korai öregedésre utaló folyamat zajlik a diabetes elorehaladtával a vesében, de foképp az érfalban, ami hozzájárulhat pl. az érelmeszesedés kialakulásához.
71
Másik oldalról érdekesnek találtuk, hogy a c-PROXYL spinpróba-vegyülettel mérheto oxigén-centrumú gyökök keletkezésének rátája meglepo módon, a várakozással ellentétben látszólagos csökkenést mutatott a diabeteses aortában három hét után. Ez utóbbi esetben a különbség szignifikánsnak bizonyult, míg szintjük változatlan volt a diabeteses agyban és szemben. Ez ellent mond pl. Kakkar és munkatársai munkáinak (66,67), akik magas ROS termelodést mutattak ki közvetetten ezekben a szervekben, vagy Utsumi és munkacsoportja eredményeinek (101), akik a c-PROXYL spinpróbavegyület „spin clearance”-nek növekedését figyelték meg intakt diabeteses állatokon mérve. A probléma megoldására – ahogyan azt az „Eredmények” fejezetben a 16. ábrán bemutattuk –, a szuperoxid anion egy gyors, szinte csak diffúziókontrollált reakcióját feltételeztük a diabeteses aortában, mely reakció versenyezhet a spinpróba-vegyülettel. Az ? NO egyrészt azért volt jó partnerjelölt erre, mert a peroxinitritet eredményezo reakciójának sebességi állandója a 109 1/Msec tartományba esik, míg a szuperoxid és a c-PROXYL reakciójának állandója ~ 103 – 104 1/Msec körüli, azaz jónéhány nagyságrenddel kisebb. Másrészt ugyanazon a helyen - épp az aortában, ahol a spinpróba-vegyülettel mért sebességi együttható látszólag csökkent a beteg állatokban mértünk hirtelen megugró ? NO keletkezést három hét diabetes után. Ezért a kontroll és a diabeteses aortákból peroxinitrit anion képzodést határoztunk meg ex vivo kemilumineszcenciás módszerrel, minden idopontban. Három héttel a betegség kezdete után, a diabeteses aortában kifejezetten eros, impresszív ONOO? képzodést tapasztaltunk. Ez csakis úgy lehetséges, ha ezekben az állatokban valóban oxidatív stresszre jellemzo folyamatok zajlanak, ame lyeket azonban az említett gyors ONOO? -képzo reakció miatt nem sikerült spinpróbával kimutatnunk. A betegség ?
késobbi szakaszában, hét hét után – hasonló módon az NO gyökök termelodésében tapasztaltakhoz – a kontroll állatok érfala is növekvo ONOO? termelést mutatott, ismételten arra utalva, hogy hasonló folyamatok zajlanak a diabeteses aortában, mint a kontroll állatok természetes öregedése során, csak sokkal korábban. Így egyfajta korai ?
elöregedésrol lehet szó. Az NO és az ONOO? változását a kontroll és a diabeteses patkány érfalban, a tendencia szemléltetésére, együttesen mutatja be a 27. ábra.
72
400
10000
ONOO–
NO
ESR jelintenzitás
300
7 HÉT
3 HÉT 200
100
0
*
1 HÉT
2 HÉT
Kemilumineszcenciás intenzitás (cps)
•
7 HÉT
3 HÉT
8000
*
6000
4000
1 HÉT
2 HÉT
2000
0
K
D
K
D
K
D
K
K
D
D
K
D
K
D
K
D
27. ábra. Nitrogén monoxid és peroxinitrit idobeni alakulása kontroll és diabeteses patkány aortában, a betegség különbözo idopontjaiban. K=kontoll, D=diabetes. Adatok: átlag ± S.D. (n=8-10). * Szignifikáns különbség a korban megegyezo kontrolltól, p<0.05.
Egy közleményben Matz és mtsai már utaltak arra, hogy az endothelium felgyorsult öregedési folyamataiban (nem diabeteses állatokban is) jelentos szerepe van a nitrogén monoxid szuperoxid anionnal való reakciójának, ami
?
NO hiányt
eredményezhet (131). A peroxinitrit termelodés fokozódása sokkal érzékenyebben jelezte tehát a redox egyensúly megbomlását, mint a különbözo szabadgyökök szintje külön-külön vizsgálva, melyekben nem mindig, vagy látszólag nem tapasztaltunk olyan számottevo változást, amely oxidatív stresszre, lehetséges károsodásra utalt volna. A peroxinitrittel kapcsolatos méréseinket és a feltételezett reakciók helytállóságát egy számítógépes szimulációval is igazoltuk. A szimulációval felállított modellrendszer bizonyította, hogy az ? NO termelodés fokozódása, a felesleges ? NO jelenléte gyorsan eliminálja az oxigén-centrumú gyököket az ONOO? képzésén keresztül. Az ONOO? lúgos pH- n stabil, kemilumineszcenciásan jól mérheto, fiziológiás pH-n viszont protonálódik ill. CO2 -vel reagálva bomlik, ezért nem mérheto. Nem találtunk változásokat sem a stacioner szabadgyök koncentrációban, sem az ?
NO vagy oxigén-centrumú gyökök szintjében a diabeteses agyban és szemben egyik
idopontban sem, ami azt jelzi, hogy a betegség korai fázisban ezekben a szervekben a szabadgyökös egyensúly még nem borult fel. A retinát szokás kiemelni, - a
73
rethinopathia miatt - mint oxidatív stresszben esetleg érintett he lyet a szervezetben. Így pl. Takeda és munkacsoportja megfigyelte azt, hogy a konstitutív NOS expressziója fokozódik a diabeteses patkány retinájában (71). Ez a tény kapcsolatban állhat a retina mikrovaszkuláris diszfunkciójával. Mi a módszereinkkel azonban nem találtunk szabadgyökös
elváltozásokat
a
szemben
(külön
a
retinát
nem
vizsgáltuk).
Valószínusítjük azt, hogy ez az eredmény adódhatott az általunk használt Fe(II)-DETC spincsapda hidrofób jellegébol is. Ez a spincsapda nagyon jól használható
?
NO
csapdázására azokban a szövetekben, melyekbe lipofil jellegénél fogva a csapda bejuthat, ugyanakkor valószínunek tartjuk, hogy pl. a szemben, annak magas víztartalma miatt, érzékeny ? NO meghatározásra nem felel meg. A
fehérje
karboniláció
mérési
eredményei
tovább
erosítik
az
ESR
spektroszkópiával követett oxidatív stressz meglétét a diabeteses patkányokban. A vesében a legkifejezettebb változásokat mutató háromhetes idopontban már protein karboniláció jeleit találtuk. Idobeli elcsúszás mutatkozott az aortában az
?
NO és
ONOO? szintekhez képest, itt csak hét hét diabetes után jelentkezett karboniláció. Ezek az adatok azt jelzik, hogy a reaktív speciesek szintje párhuzamosan, de inkább korábban jelentkezik diabetesben, mint a detektálható fehérjekárosodás, vagyis ez utóbbi lehet akár a cukorbetegségben felfokozódó szabadgyökös reakciók következménye is. Késobbi kísérleteink során derült csak ki, hogy hasonlóan igaz ez a szívre is, ahol a fehérje
karbonilációnak
és
az
ezáltal
létrejövo
fehérje-kollagén
mátrix
keresztkötéseknek számottevo szerepük lehetett a hipertrófia kialakulásában. A kórszövettani eredmények alapján – ahogyan az várható volt – ennyi ido alatt (7 hét) még nem alakult ki késoi szövodmény egyik olyan szervben sem, ahol már megindultak különbözo szabadgyökös folyamatok, inkább csak olyan elváltozásokat találtunk (3. táblázat), melyek a felborult szénhidrát-anyagcserére jellemzoek. Ezen felül egy-egy esetben gyulladásra jellemzo makrofág infiltrációt tapasztaltunk. A szívben hipertrófia alakult ki, itt viszont nem volt változás az ? NO termelodésében egy esetben sem. Elektronmikroszkópos vizsgálatokkal talán ki tudtunk volna mutatni finomabb
morfológiai
változásokat
is,
de
ilyen
vizsgálatok
nem
történtek.
Módszerünkkel csak azt szerettük volna bizonyítani, hogy a szabadgyökök túltermelodése megelozheti a látványos, fénymikroszkóppal is detektálható elváltozások megjelenését.
74
A leírt eredmények egy lépéssel elobbre visznek minket a szabadgyökök és a diabeteses
szövodmények
közötti
ok-okozati
összefüggések
feltárása
felé.
Kísérleteinkkel igyekeztünk rámutatni arra, hogy a szabadgyökös elváltozások, az úgynevezett nitrozatív stressz, a káros peroxinitrit túltermelodése, a fehérjék károsodása már a fénymikroszkópos, hisztopatológiailag kimutatható késoi elváltozások elott jelentkeznek egyes szervekben, így lehetnek azok egyik okozói is a késobbiekben. Felgyorsult oxidatív folyamatokra jellemzo változásokat és a szabadgyökös egyensúly megbomlását mutattuk ki a streptozotocin- indukálta diabetes korai fázisában. A megemelkedett ? NO szintek, az oxigén-centrumú gyökök megváltozott termelodése és a felerosödött peroxinitrit termelés, különösen a diabeteses aortában, vesében és a májban, arra utal, hogy ezekben a szervekben már a betegség korai szakaszában megindulnak a szabadgyökös reakciók. A legmarkánsabb változásokat három héttel a betegség kezdete után tapasztaltuk, ami jó egyezést mutat más, korábbi munkákkal (66,67), ahol a szerzok antioxidáns enzimek aktivitásának változását kísérték figyelemmel diabetesben. Különös tekintettel kell lennünk az érfalra, ahol egyfajta felgyorsult öregedési folyamatot mutattunk ki.
6.2. Aminoguanidin- és inzulinkezelés hatása a kísérletes diabetesben zajló oxidatív folyamatokra patkányban
Munkám második részében egy nitrogén monoxid szintáz inhibitor és glikációgátlószer, az aminoguanidin, valamint az ultratard inzulinkezelés hatását vizsgáltuk külön-külön a streptozotocin- indukálta diabetesben kialakuló oxidatív stresszre, a szénhidrát anyagcserére, ill. az esetlegesen fellépo komplikációkra. Hangsúlyosan foglalkoztunk az aortával és a szívvel, tekintettel a cukorbetegséghez társuló kardiovaszkuláris megbetegedések fontosságára. Patkányainkat a cukorbetegség kialakulása után közvetlenül, három héten keresztül aminoguanidinnal kezeltük és a mért eredményeket összevetettük az inzulinkezelésben részesült állatokéval. A 4. táblázat alapján elmondhatjuk, hogy a vérben vizsgált, a diabeteses állatok metabolizmusát általánosan jellemzo paramétereken csak az inzulinkezelés javított, az sem minden esetben. Bár a vér HbA1c szintje alapján a kezelt állatok viszonylag jó metabolikus kontroll alatt voltak, 3 hét kezelés nem volt elegendo arra, hogy a rövidtávú
75
markerként használatos szérum fruktózamin szinteket csökkentse. Hozzá kell tennünk, hogy valószínuleg a patkányok gyors anyagcseréje miatt lehetséges az, hogy 3 hét inzulinkezelés már látható változást okoz a HbA1c szintben, holott e paraméter változása emberben lassú folyamat. A fruktózamin magas szintje arra utal, hogy igazán jó anyagcsere kontrollt inzulin pumpa használata nélkül gyakorlatilag nem lehet elérni ezen az állatmodellen, még napi többszöri inzulin s.c. adásával sem. Az aminoguanidin nem volt hatással az említett markerekre, ami arra enged következtetni, hogy kísérletes modellünkben ez a szer nem a szénhidrát-anyagcserén keresztül fejti ki hatását. A HbA1c egy plazmában található korai glikációs termék, rövid élettartamú fehérje, a hemoglobin és a glükóz kapcsolódásából alakul ki. Minél több a glükóz a vérben, annál több hemoglobin glikálódik. A HbA1c kialakulására az aminoguanidin nem hat. Ennek oka valószínuleg kettos. Részben az aminoguanidin a plazmában valamilyen szállítómolekulához (pl. albuminhoz) kapcsolt, ezért hatását lokálisan nem tudja kifejteni, részben nincs hatással a szénhidrátanyagcserére, így nem gátolja a vércukor emelkedését. Korszeru ESR spektroszkópiával az elso kísérletsorozathoz hasonlóan a kezelt állatokból is meghatároztuk az ? NO termelodését. Az aminoguanidinnel vagy inzulinnal ?
kezelt állatok NO termelése jelentosen csökkent minden vizsgált szövetben, ezalól kivétel az aorta volt, ahol csak az aminoguanidinnek volt szignifikáns hatása. Ez az eredmény különösen fontos a diabetes vaszkuláris szövodményei szempontjából. Az ?
aminoguanidin pozitív hatása megerosíti azt a feltételezést, hogy a fokozott NO termelodés a vaszkuláris, foleg az indukálható NOS enzimek aktiválódásának következtében zajlik az érfalban. Az ilyen, gyulladásban indukálódó enzimek felfokozott muködése káros hatással van a diabeteses érfal muködésére, még inzulin kezelés alatt is. Hozzá kell tennünk, hogy a kontroll, aminoguanidinnel kezelt állatok legtöbb szervében is valamelyest csökkent az ? NO termelodés. Ez az eredmény is jelzi, hogy az egészséges állatokban az iNOS kevésbé aktív, mint a cukorbeteg állatokban. Ismert az oxigén-centrumú gyökök, különösen a szuperoxid anion fokozott termelodése a diabetes késoi szövodményeiben és az azokhoz kapcsolódó gyulladásos ?
folyamatokban (5,132). Ha ez a fokozott termelodés és a magas NO produkció együttesen fennáll, akkor oxigén jelenlétében peroxinitrit anion keletkezik. A már korábban ismertetett hipotézis alapján ex vivo kemilumineszcenciás mérésekkel
76
peroxinitritet határoztunk meg az állatok érfalában. A cukorbeteg állatok érfala eros ONOO? túltermelést mutatott a kontrollokéhoz viszonyítva. Mindkét kezelés – az inzulin és az aminoguanidin is – eredményesnek bizonyult, mert az emelkedett ONOO? értékeket a kontroll szintre szorította vissza. Az inzulinkezelés az általános szénhidrát anyagcserét javítja diabetes mellitusban, közvetve csökkenti az oxidatív stresszt, ezáltal csökkenti a ROS termelodését (az inzulin ? NO-fogó aktivitásáról nincs tudomásunk). Ha a szabadgyökök termelodése csökken, csökken a peroxinitrit keletkezésének esélye is. Alátámasztja ezt az a tény is, hogy az aortában az inzulinkezelés nem csökkentette az ?
NO szintjét, de a peroxinitritét igen. Az aminoguanidin, mivel NOS inhibítor, ezért az
?
NO keletkezésének gátlásán keresztül hatott a diabeteses aortában a káros ONOO?
termelodés leszorításában is. Szívhipertrófia és protein karboniláció alakult ki a kezeletlen diabeteses állatok szívizmában három héttel a betegség kezdete után, valamint protein karbonilokat találtunk a vesében is. Az inzulinkezelés nem volt képes sem csökkenteni a karbonilok mennyiségét, sem kivédeni a szívmegnagyobbodást. Az aminoguanidin ellenben megelozte a szívhipertrófia kialakulását, kivédte a fehérjekárosodást a szívben (a vesében érdekes módon erre nem volt képes). Az, hogy az aminoguanidinnél melyik szövetben melyik mechanizmus lép elotérbe és miért, az az irodalomban is nagyon vitatott és nem tisztázott. Eredményeink azt mutatják, hogy a szívben szinte alig volt NOS aktivitás a protein karboniláció mellett, a vesében viszont magas ? NO szinteket is tapasztaltunk, nemcsak fehérjekárosodást. Lehetségesnek tartjuk ezért, hogy ha magas iNOS enzimaktivitás van, akkor az aminoguanidin nagyobb affinitással hat az enzim gátlásán, mintsem a karboniláció kivédésén keresztül. Ahol nincs magas iNOS aktivitás, ott az aminoguanidin képes arra, hogy a protein karboniláció helyszínén használódjon fel és gátolja azt, pl. jelen esetben a szívben errol lehet szó. Az egyik legfontosabb eredménynek azt tartjuk, hogy kimutattuk az aminoguanidin kezelés korai diabeteses szívhipertrófia kialakulását megelozo hatását, amely a kezeletlen és az inzulinnal kezelt diabeteses csoportban is jelen volt. Ismert, hogy az aminoguanidin kivédi a vaszkuláris hipertrófiát diabetesben (91), de cukorbetegek szívében még nem mutattak ki hasonlót. Ez az eredmény megerosíteni látszik azt, hogy az aminoguanidin a szívben nem NOS gátláson keresztül hat, hanem valamilyen más útvonalon, hisz egyik diabeteses csoport szívében sem tapasztaltunk
77
?
NO szint változást. Ugyanennek a feltételezésnek további megerosítését jelenti, hogy a
fehérje karbonilok mennyisége emelkedett a kezeletlen cukorbeteg állatok szívében és veséjében, amely a diabetesben kialakuló fehérje glikáció, lipid peroxidációs vagy aldehid jellegu glikációs termékek kovalens kapcsolódásának következménye lehet (133). A progresszív glikáció keresztkötések létrejöttét eredményezi a kötoszövetben, így pl. a szövet megvastagodását okozhatja, így járulva hozzá a hipertrófiához (134). Az, hogy az
aminoguanidin kezelés képes volt megelozni a karbonilációt és a
hipertrófia kifejlodését együttesen a szívben, arra utal, hogy ebben a szervben ez a szer a késoi glikációs termékek és a protein keresztkötések létrejöttének gátlásán keresztül fejti ki hatását. Másfelol, ahogyan említettük, az aortában ugyanakkor úgy tunik, hogy az aminoguanidin egy NOS enzimet gátol, így csökkentve a peroxinitrit keletkezésének esélyét. Az eredmények hasonlóságot mutatnak az irodalomban más szövodményekben leírtakkal (83,84,85,93) és alátámasztják azt a hipotézist, hogy az aminoguanidin preventív hatású a diabetesben fellépo kardiovaszkuláris szövodményekkel szemben. Hatását pedig mind a nem-enzimatikus glikáció, mind a NOS enzimek gátlásán keresztül kifejtheti, bár úgy véljük, kardiovaszkuláris szövodményekben elsosorban az elobbi mechanizmus dominál. A második kísérletsorozat eredményeinek összegzéseképpen elmondhatjuk, hogy bizonyítottnak látjuk az aminoguanidin szívhipertrófiát megelozo hatását streptozotocin- indukálta diabetesben. Irodalmi adatok alapján az feltételezheto, hogy a hatás a késoi glikációs termékek keletkezéséért felelos reakciók gátlásán alapszik. Az inzulinkezelés szintén csökkentette az ? NO szinteket a legtöbb vizsgált szervben, de ez a kezelés nem tudta kivédeni sem a protein karbonilációt, sem a szívhipertrófiát. Az állatok szénhidrát-anyagcseréjének paraméterei viszont javultak. Az eredmények arra utalnak, hogy az oxidatív stressz miatt fellépo fehérjekárosodás és a reaktív nitrogén termékek felgyorsult termelodése egy jellemzo és korán jelentkezo folyamat a streptozotocin- indukálta diabetes kardiovaszkuláris szövodményeinek kialakulása során. Ha az aminoguanidint inzulinkezeléssel kombinálnánk, valószínuleg nemcsak javulnának cukorbetegekben a metabolikus paraméterek, de erosen csökkenne a korai kardiovaszkuláris károsodások kialakulása is.
78
Nem toxikus aminoguanidin származékok kifejlesztése, mint pl. a piridoxállal konjugált aminoguanidiné (81,82) akár új terápiás lehetoségeket is nyithat a diabeteses betegek szív- és érrendszeri szövodményeinek kivédésére.
79
7.
TÉZISEK
1. Felgyorsult oxidatív folyamatokra jellemzo markerek (protein karboniláció, korai glikációs termékek) változását és a szabadgyökös egyensúly megbomlását mutattuk ki patkányokban a streptozotocin- indukálta diabetes korai fázisában, legalább két héttel a betegség indukciója után. A legmarkánsabb változásokat három héttel a betegség kezdete után figyeltük meg a diabeteses májban, vesében és érfalban, ahol különösen az ? NO termelodés fokozódását igazoltuk. 2. Megállapítottuk, hogy az együttesen indukálódott magas ? NO szint és a fokozott oxidatív stressz miatt nagy mennyiségu peroxinitrit anion képzodik a diabeteses aortában. 3. Munkánkban elsoként mutattuk ki direkt mérési módszerekkel a nitrogén monoxid és a reaktív peroxinitrit idobeni változását experimentális patkány diabetesben a hasonló korú kontrollokhoz viszonyítva. Igazoltuk, hogy az egészséges állatok aortájában idosebb korban szitén megnövekszik az ? NO és a peroxinitrit termelés. Ez arra utal, hogy kóros szénhidrát-anyagcserében felgyorsul az öregedési folyamat. 4. Megállapítottuk, hogy a fokozott szabadgyök-termelodés és az oxidatív stresszre jellemzo biokémiai reakciók megelozték a fénymikroszkópos módszerrel igazolható, késoi szövodményekre jellemzo szövettani elváltozásokat. Bár ez nem bizonyítja, de továbbra sem zárható ki, hogy a szabadgyökös folyamatok szerepet játszanak a késoi szövodmények kialakulásában. 5. Kimutattuk, hogy három hét diabetes után azokban a szervekben, ahol magas ?
NO illetve peroxinitrit szint vo lt igazolható, mind az ultratard inzulinnal, mind
az aminoguanidinnel történo kezelés sikeresen csökkenti a reaktív nitrogén termékek szintjét, de feltehetoleg más- más mechanizmuson keresztül. (Kivételt képez a szív, ahol nincs változás az ? NO szintjében). 6. Megállapítottuk, hogy az aminoguanidin kezelés kivédi a diabetesben jelentkezo szívhipertrófiát, míg az inzulinkezelés nem. A protektív hatás mechanizmusa valószínuleg a protein karboniláció és a glikáció gátlásán keresztül történik, hisz míg az aminoguanidin csökkentette a szívben a fehérjekarbonilációt, addig az inzulin nem.
80
7. Megállapítottuk, hogy míg az inzulin a diabeteses patkányok szénhidrátanyagcsere paraméterein javít, addig az aminoguanidin (és feltehetoleg a nem toxikus származékai is) a glikációs termékek kialakulását gátolják, így kombinált használatuk akár új terápiás lehetoséget is jelenthet a diabetes késoi szövodményeinek megelozésében.
81
8.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Ezúton is szeretném kifejezni köszönetemet mindazoknak, akik az elmúlt években nélkülözhetetlen segítséget nyújtottak akár hasznos tanácsaikkal, akár támogatásukkal és türelmükkel abban, hogy kutatásaimat elvégezhessem és doktori munkám megszülessen. Köszönöm tehát:
Témavezetoimnek, Dr. Jakus Juditnak és Dr. Somogyi Anikónak
Programvezetomnek, Prof. Dr. Fehér Jánosnak
Az MTA KK Farmakobiokémiai osztály vezetojének, Dr. Vereczkey Lászlónak
Az MTA Kémiai Kutatóközpont Igazgatóságának
Az MTA KK Biooxidációs csoport és a Semmelweis Egyetem II. Sz. Belgyógyászati Klinika Anyagcsere Munkacsoportja minden tagjának
Dr. Bencsura Ákosnak, Dr. Rockenbauer Antalnak és Dr. Korecz Lászlónak
Dr. Gaál Tibornak, Dr. von Bölcsházy Gábornak, Dr. Sasváry Máriának és Dr. Vér Ágotának
Prof. Dr. Simon Györgynek, Dr. Szarka András barátomnak és Prof. Dr. Anatoly Vaninnak
Szüleimnek, családomnak, barátaimnak és Melindának.
82
9.
IRODALOMJEGYZÉK
1. Halliwell B, Gutteridge JMC. Free Radicals in Biology and Medicine (3rd edition). Oxford, UK: University Press, 1999. 2. Oberley LW. Free radicals and diabetes. Free Radic.Biol. Med. 5: 113-124, 1988. 3. Baynes JW. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes 40: 405-412; 1991. 4. Dandona P, Thusu K, Cook S, Snyder B, Makowski J, Armstrong D, Nicotera T. Oxidative damage to DNA in diabetes mellitus. Lancet 347: 444-445, 1996. 5. Gillery P, Monboisse JC, Maquart FX, Borel JP. Does oxygen free radical increased formation explain long term complications of diabetes mellitus? Med. Hypotheses 29: 4750, 1989. 6. Mohamed AK, Bierhaus A, Schiekofer S, Tritschler H, Ziegler R, Nawroth PP. The role of oxidative stress and NF-kappaB activation in late diabetic complications. Biofactors 10: 157-167, 1999. 7. National Diabetes Data Group. Classification and diagnosis of diabetes mellitus and other categories of glucose intolerance. Diabetes 28: 1039-1057, 1979. 8. The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care 27 (Suppl 1): S5-S10, 2004. 9. McPhee SJ, Lingappa VR, Ganong WF, Lange JD. Patophysiology of diseases. An introduction to clinical medicine (1st edition), Appleton and Lange, 1995. 10. Halmos T, Jermendy G. Diabetes mellitus. A cukorbetegség klinikai vonatkozásai. 2. kiadás, Medicina, Budapest, 1997. 11. Fövényi J, Hidvégi T, Jermendy G, Kempler P, Pados G, Pogátsa G. A diabetes mellitus kórismézése, a cukorbetegek kezelése és gondozása a felnottkorban. (Módszertani levél), 2002. 12. American Diabetes Association. Standards of medical care for patients with diabetes mellitus. Diabetes Care 25 (Suppl 1): S33-S40, 2002. 13. Somogyi A., Korányi L. Anyagcsere- és ásványi anyagcsere betegségek a gyakorlatban. Medicina, Budapest, 1998. 14. Hosszúfalusi N. A hyperglykaemia szerepe a diabetes mellitus késoi szövodményeinek kialakulásában. Lege Artis Medicinae 10: 40-48, 2000.
83
15. DCCT Research Group: The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N. Eng. J. Med. 329: 977-986, 1993. 16. Strowig SM, Raskin P. Glycemic control and the complications of diabetes. Diabetes Reviews 3: 237-256, 1995. 17. UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes. Lancet 352: 837-853, 1998. 18. Greene DA, Lattimer SA, Sima AAF. Sorbitol, phosphoinositides, and sodium potassiumATPase in the pathogenesis of diabetic complications. N. Eng. J. Med. 316: 599-606, 1987. 19. Mullarkey CJ, Edelstein D, Brownlee M. Free radical generation by early glycation products: a mechanism for accelerated atherogenesis in diabetes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 173: 932-939, 1990. 20. Kennedy L, Baynes JW. Non-enzymatic glycosylation and the chronic complications of diabetes: an overview. Diabetologia 26: 93-98, 1984. 21. Brownlee M, Vlassara H, Cerami A. Nonenzymatic glycosylation and the pathogenesis of diabetic complications. Ann. Intern. Med. 101: 527-537, 1984. 22. Baynes JW, Watkins NG, Fisher CI. The Amadori product on protein: structure and reactions. Prog. Clin. Biol. Res. (United States) 304: 43-67, 1989. 23. Abdel-Wahab YM, O`Harte FP, Boyd AC, Barnett CR, Flatt PR. Glycation of insulin results in reduced biological activity in mice. Acta Diabetol. 34: 265-270, 1997. 24. Lyons TJ. Lipoprotein glycation and its metabolic consequences. Diabetes 41(Suppl2): 6773, 1992. 25. Elgawish A, Glomb M, Friedlander M. Involvement of hydrogen peroxide in collagen cross-linking by high glucose in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 271: 12964-12971, 1996. 26. Brownlee M, Cerami A, Vlassara H. Advanced glycosylation end products in tissue and the biochemical basis of diabetic complications. N. Eng. J. Med. 318: 1315-1321, 1988. 27. Friedman EA. Advanced glycosylated end products and hyperglycemia in the pathogenesis of diabetic complications. Diab. Care 22: B65-B71, 1999. 28. Pickup JC, Williams G. Chronic Complications of Diabetes. Oxford, Blackwell Scientific Publications. 1994. 29. Pugliese G, Pricci F, Romeo, Pugliese F, Mene P, Giannini S, Cresci B, Galli G, Rotella CM, Vlassara H, Di Mario U. Upregulation of mesangial growth factor and extracellular matrix synthesis by advanced glycation end products via a receptor-mediated mechanism. Diabetes 46:1881-1887, 1997.
84
30. Vlassara H, Esposito C, Gerlach H, Stern D. Receptor-mediated binding of glycosylated albumin to endothelium induces tissue necrosis factor and acts synergistically with TNF procoagulant activity. Diabetes 38 (Suppl 2):32A, 1989. 31. Mene P, Pascale C, Teti A, Bernardini S, Cinotti GA, Pugliese F. Effects of advanced glycation end products on cytosolic Ca signaling of cultured human mesangial cells. J. Am. Soc. Nephrol.10: 1478-1486, 1999. 32. Wittmann I, Wagner Z, Pótó L, Wagner L, Mozár I, Nagy J. Karbonil stressz-metabolitok kimutatása diabetes mellitusban szenvedo betegek vizeletében. Orv. Hetil. 140: 1841-1845, 1999. 33. Kennedy L, Baynes, JW. Non-enzymatic glycosylation and the chronic complications of diabetes: an overview. Diabetologia 26: 93-98, 1984. 34. Monboisse JC, Gillery P, Maquart FX, Borel JP. Production of superoxide anion by glycated proteins: involvement in complications of diabetes mellitus. Adv. Exp. Med. Biol. (United States) 264: 551-554, 1990. 35. Jiang Z-Y, Woollard ACS, Wolff SP. Hydrogen peroxide production during experimental protein glycation. FEBS Lett. 268: 69-71, 1990. 36. Sakurai T, Tsuchiya S. Superoxide production from nonenzymatically glycated protein. FEBS Lett. 236: 406-410, 1988. 37. Hunt JV, Dean RT, Wolff SP. Hydroxyl radical production and autoxidative glycosylation. Biochem. J. 256: 205-212, 1988. 38. Wolff SP, Dean RT. Glucose autoxidation and protein modification. The potential role of ‘autoxidative glycosylation’ in diabetes. Biochem. J. 245: 243-250, 1987. 39. Wolff SP, Crabbe MJC, Thornalley PJ. The autoxidation of glyceraldehyde and other simple monosacharides. Experientia 40: 244-246, 1984. 40. Wolff SP. Diabetes mellitus and free radicals. Free radicals, transition metals and oxidative stress in the aetiology of diabetes mellitus and complications. Br. Med. Bull. 49: 642-652, 1993. 41. Levine RL, Williams JA, Stadtman ER, Shacter E. Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins. Methods Enzymol. 233: 346-357, 1994. 42. Halliwell B. Free radicals, antioxidants and human disease: curiosity, cause, or consequence? Lancet 344: 721-724, 1994. 43. Turrens JF. Superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Biosci. Rep. 17: 3-8, 1997. 44. De Groot H, Littauer A. Hypoxia, reactive oxygen and cell injury. Free Radic. Biol. Med. 6: 541-551, 1989.
85
45. Babior, BM. Superoxide: a two-edged sword. Brazil. J. Med. Biol. Res. 30: 141-155, 1997. 46. Esterbauer, H, Gebicki J, Puhl H, Jurgens G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic. Biol. Med. 13: 341-390, 1992. 47. Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. The discovery of nitric oxide as the endogenous nitrovasodilator. Hypertension 12: 365-372, 1988. 48. Ohshima H, Bartsch H. Chronic infections and inflammatory processes as cancer risk factors: possible role of NO in carcinogenesis. Mutat. Res. 305: 253-264,1994. 49. Lundberg JO, Lundberg JM, Alving K, Weitzberg E. NO and inflammation: the answer is blowing in the wind. Nature Med. 3: 30-31, 1997. 50. Blough NV, Zafiriou OC. Reaction of superoxide with nitric oxide to form peroxynitrite in alkaline aqueous solution. Inorg. Chem. 24: 3504-3505, 1985. 51. van der Vliet A, Eiserich JP, Kaur H, Cross CE, Halliwell B. Nitrotyrosine as biomarker for reactive nitrogen species. Methods Enzymol. (United States) 269: 175-184, 1996. 52. Violi F, Marino R, Milite MT, Loffredo L. Nitric oxide and its role in lipid peroxidation. Diabetes Metab. Res. Rev. 15: 283-288, 1999. 53. Brzezinska AK, Gebremedhin D, Chilian WM, Kalyanaraman B, Elliott SJ. Peroxynitrite reversibly inhibits Ca2+ -activated K+ channels in rat cerebral artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 278: H1883-H1890, 2000. 54. Knowles RG, Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals. Biochem. J. 298: 249-258, 1994. 55. Mayer B, Brunner F, Schmidt . Inhibition of nitric oxide synthesis by methylene blue. Biochem. Pharmacol. 45: 367-374, 1993. 56. Shimizu S, Yamamoto T, Momose K. Inhibition by methylene blue of the L-arginine metabolism to L-citrulline coupled with nitric oxide synthesis in cultured endothelial cells. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 82: 35-48, 1993. 57. Wolff DJ, Lubeskie A. Aminoguanidine is an isoform selective, mechanism-based inactivator of nitric oxide synthase. Arch. Biochem. Biophys. 316: 290-301, 1995. 58. Misko TP, Moore WM, Kasten TP, Nickols GA, Corbett JA, Tilton RG, McDaniel ML, Williamson JR, Currie MG. Selective inhibition of the inducible nitric oxide synthase by aminoguanidine. Eur. J. Pharmacol. 233: 119-125, 1993. 59. Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J. 6: 3051-3064, 1992. 60. Dominguez C, Ruiz E, Gussinye M, Caracosa A. Oxidative stress at onset and in early stages of type I diabetes in children and adolescents. Diab. Care 21: 1736-1742, 1998.
86
61. Thorpe SR, Baynes JW. Role of the Maillard reaction in diabetes mellitus and diseases of aging. Drugs Aging 9: 69-73, 1996. 62. Hunt JV. Ascorbic acid and diabetes mellitus. In: Subcellular Biochemistry, Vol.25.: Ascorbic acid: Biochemistry and Biomedical Cell Biology. Plenum Press, New York, 1995. 63. Bravenboer B, Kappelle AC, Hamers FP, van Buren T, Erkelens DW, Gispen WH. Potential use of glutathione for the prevention and treatment of diabetic neuropathy in the streptozotocin-induced diabetic rat. Diabetologia 35: 813-817, 1992. 64. Leinonen J, Lehtimaki T, Toyokuni S, Okada K, Tanaka T, Hiai H, Ochi H, Laippala P, Rantalaiho V, Wirta O, Pasternack A, Alho H. New biomarker evidence of oxidative DNA damage in patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus. FEBS Lett. 417: 150152,1997. 65. Wohaieb SA, Godin DV. Alterations in free radical tissue-defense mechanisms in streptozotocin-induced diabetes in rat. Effects of insulin treatment. Diabetes 36: 1014-1018, 1987. 66. Kakkar R, Mantha SV, Radhi J, Prasad K, Kalra J. Increased oxidative stress in rat liver and pancreas during progression of streptozotocin-induced diabetes. Clin. Sci. (Colch) 94: 623632, 1998. 67. Kakkar R, Mantha SV, Radhi J, Prasad K, Kalra J. Antioxidant defense system in diabetic kidney: a time course study. Life Sci. 60: 667-679, 1997. 68. Fehér J., Vereckei A. Szabadgyök-reakciók jelentosége az orvostudományban. Biotéka, Biogal Gyógyszergyár, 1985. 69. Hink U, Li H, Mollnau H, Oelze M, Matheis E, Hartmann M, Skatchkov M, Thaiss F, Stahl RA, Warnholtz A, Meinertz T, Griendling K, Harrison DG, Forstermann U, Munzel T. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ. Res. 88: E14-22, 2001. 70. De Vriese AS, Stoenoiu MS, Elger M, Devuyst O, Vanholder R, Kriz W, Lameire NH. Diabetes-induced microvascular dysfunction in the hydronephrotic kidney: role of nitric oxide. Kidney Int. 60: 202-210, 2001. 71. Takeda M, Mori F, Yoshida A, Takamiya A, Nakagomi S, Sato E, Kiyama H. Constitutive nitric oxide synthase is associated with retinal vascular permeability in early diabetic rats. Diabetologia 44: 1043-1050, 2001. 72. Pieper GM. Enhanced, unaltered and impaired nitric oxide-mediated endothelium-dependent relaxation in experimental diabetes mellitus: importance of disease duration. Diabetologia 42: 204-213, 1999.
87
73. Beckman JS, Koppenol WH. NO, O2- and ONOO - : the good, the bad and the ugly. Am. J. Physiol. 271: C1424, 1996. 74. Tannous M, Rabini RA, Vignini A, Moretti N, Fumelli P, Zielinski B, Mazzanti L, Mutus B. Evidence for iNOS-dependent peroxynitrite production in diabetic platelets. Diabetologia 42: 539-544, 1999. 75. Corbett JA, McDaniel ML. The use of aminoguanidine, a selective iNOS inhibitor, to evaluate the role of nitric oxide in the development of autoimmune diabetes. Methods 10: 21-30, 1996. 76. Bryk R, Wolff DJ. Mechanism of inducible nitric oxide synthase inactivation by aminoguanidine and L-N6-(1-iminoethyl)lysine. Biochemistry 37: 4844-4852, 1998. 77. Babu BR, Griffith OW. Design of isoform-selective inhibitors of nitric oxide synthase. Curr. Op. Chem. Biol. 2: 491-500, 1998. 78. Edelstein D, Brownlee M. Mechanistic studies of advanced glycosylation end product inhibition by aminoguanidine. Diabetes 41: 26-29,1992. 79. van Dam PS. Oxidative stress and diabetic neuropathy: pathophysiological mechanisms and treatment perspectives. Diabetes Metab. Res. Rev. 18: 176-184, 2002. 80. Taguchi T, Sugiura M, Hamada Y, Miwa I. In vivo formation of a Schiff base of aminoguanidine with pyridoxal phosphate. Biochem. Pharmacol. 55: 1667-1671, 1998. 81. Miyoshi H, Taguchi T, Sugiura M, Takeuchi M, Yanagisawa K, Watanabe Y, Miwa I, Makita Z, Koike T. Aminoguanidine pyridoxal adduct is superior to aminoguanidine for preventing diabetic nephropathy in mice. Horm. Metab. Res. 34: 371-377, 2002. 82. Chen AS, Taguchi T, Aoyama S et al. Antioxidant activity of a Schiff base of pyridoxal and aminoguanidine. Free Radic. Biol. Med. 35: 1392-1403, 2003. 83. Kern TS, Engerman RL. Pharmacological
inhibition
of
diabetic
retinopathy:
aminoguanidine and aspirin. Diabetes 50: 1636-1642, 2001. 84. Kowluru RA, Engerman RL, Kern TS. Abnormalities of retinal metabolism in diabetes or experimental galactosemia VIII. Prevention by aminoguanidine. Curr. Eye Res. 21: 814819, 2001. 85. Soulis T, Cooper ME, Sastra S, Thallas V, Panagiotopoulos S, Bjerrum OJ, Jerums G. Relative contributions of advanced glycation and nitric oxide synthase inhibition to aminoguanidine-mediated renoprotection in diabetic rats. Diabetologia 40: 1141-1151, 1997. 86. Degenhardt TP, Fu MX, Voss E, Reiff K, Neidlein R, Strein K, Thorpe SR, Baynes JW, Reiter R. Aminoguanidine inhibits albuminuria, but not the formation of advanced glycation end-products in skin collagen of diabetic rats. Diabetes Res. Clin. Pract. 43: 81-89, 1999.
88
87. Wada R, Sugo M, Nakano M, Yagihashi S. Only limited effects of aminoguanidine treatment on peripheral nerve function, (Na+,K+)-ATPase activity and thrombomodulin expression in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetologia 42: 743-747, 1999. 88. Kedziora-Kornatowska KZ, Luciak M. Effect of aminoguanidine on lipid peroxidation and activities of antioxidant enzymes in the diabetic kidney. Biochem. Mol. Biol. Int. 46: 577583, 1998. 89. Kedziora-Kornatowska KZ, Luciak M, Blaszczyk J, Pawlak W. Effect of aminoguanidine on erythrocyte lipid peroxidation and activities of antioxidant enzymes in experimental diabetes. Clin. Chem. Lab. Med. 36: 771-775, 1998. 90. Ihm SH, Yoo HJ, Park SW, Ihm J. Effect of aminoguanidine on lipid peroxidation in streptozotocin-induced diabetic rats. Metabolism 48: 1141-1145, 1999. 91. Rumble JR, Cooper ME, Soulis T, Cox A, Wu L, Youssef S, Jasik M, Jerums G, Gilbert RE. Vascular hypertrophy in experimental diabetes. Role of advanced glycation end products. J. Clin. Invest. 99: 1016-1027, 1997. 92. Soulis T, Sastra S, Thallas V, Mortensen SB, Wilken M, Clausen JT, Bjerrum OJ, Petersen H, Lau J, Jerums G, Boel E, Cooper ME. A novel inhibitor of advanced glycation endproduct formation inhibits mesenteric vascular hypertrophy in experimental diabetes. Diabetologia 42: 472-479, 1999. 93. Ozyazgan S, Unlucerci Y, Bekpinar S, Akkan AG. Impaired relaxation in aorta from streptozotocin-diabetic rats: effect of aminoguanidine (AMNG) treatment. Int. J. Exp. Diabetes Res. 1:145-153, 2000. 94. Corman B, Duriez M, Poitevin P, Heudes D, Bruneval P, Tedgui A, Levy BI. Aminoguanidine prevents age-related arterial stiffening and cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1301-1306, 1998. 95. Alberti KGMM, Krall LP. (Ed.) The diabetes Annual/6, 1991. 96. Tsuji A, Sakurai H. Generation of nitric oxide from streptozotocin in the presence of copper (II) plus ascorbate: Implication for the development of streptozotocin-induced diabetes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 245: 11-16, 1998. 97. Arison RN, Claccio EI, Glitzer MS, Cassaro JA, Pruss MP, Rahway BS. Light and electron microscopy of lesions in rats rendered diabetic with streptozotocin. Diabetes 16: 51-56, 1967. 98. Matkovics B, Kotorman M, Varga SzI, Quy Hai D, Varga Cs. Oxidative stress in experimental diabetes induced by streptozotocin. Acta Ph ysiol. Hung. 85: 183-192, 1997/98.
89
99. Portha B, Blondel O, Serradas P. The rat models of non-insulin dependent diabetes induced by neonatal streptozotocin. Diabetes Metab. 15: 61-75, 1989. 100. Sano T, Umeda F, Hashimoto T, Nawata H, Utsumi H. Oxidative stress measurement by in vivo electron spin resonance spectroscopy in rats with streptozotocin-induced diabetes. Diabetologia 41: 1355-1360, 1998. 101. Utsumi H, Muto E, Masuda S, Hamada A. In vivo ESR measurement of free radicals in whole mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 1342-1348, 1990. 102. Jakus J, Kriska T, Vanyur R. Effect of multivitamins in an effervescent preparation on the respiratory burst of peritoneal macrophages in mice. Brit. J. Nutr. 87: 501-508; 2002. 103. Rockenbauer A, Korecz L. Automatic computer simulation of ESR spectra. Appl. Magn. Resonance 10: 29-43, 1996. 104. Kubrina LN, Mikoyan VD, Mordvintcev PI, Vanin AF.
Iron potentiates bacterial
lipopolysaccharide-induced nitric oxide formation in animal organs. Biochim. Biophys. Acta 1176: 240-244, 1993. 105. Komarov AM, Kramer JH, Tong Mak I, Weglicki WB. EPR detection of endogenous nitric oxide in postischemic heart using lipid and aqueous-soluble dithiocarbamate-iron complexes. Mol. Cell. Biochem. 175: 91-97, 1997. 106. Wang P, Zweier JL. Measurement of nitric oxide and peroxynitrite generation in the postischemic heart. J. Biol. Chem. 271: 29223-29230, 1996. 107. Brovkovych V, Patton S, Brovkovych S, Kiechle F, Huk I, Malinski T.
In situ
measurement of nitric oxide, superoxide and peroxynitrite during endotoxemia. J. Physiol Pharmacol. 48: 633-644, 1997. 108. Turányi T. Software note: KINAL a program package for kinetic analysis of reaction mechanisms. Computers Chem. 14: 253-254, 1990. 109. Denbigh KG. Velocities and yield in continuous reaction systems. Trans. Faraday Soc. 40: 352-373, 1944. 110. Denbigh KG. Continuous reactions: Part II. The kinetics of steady state polymerisation. Trans. Faraday Soc. 43: 649-660, 1947. 111. Blasig IE, Shuter S, Garlick P, Slater T. Relative time profiles for free radical trapping, coronary flow, enzyme leakage, arrhitmias and function during myocardial reperfusion. Free Radic. Biol. Med. 16: 35-41, 1994. 112. Krutsay M. Patológiai technika (pathological techniques). Budapest: Medicina, 1999. 113. McManus JFA. Histological and histochemical uses of periodic acid. Stain Techn. 23: 99108, 1948.
90
114. Spicer SS. Diamine methods for differentiating mucosubstances histochemically. J. Histochem. Cytochem. 13: 211-234, 1965. 115. Krutsay, M. A lipidek szövettani festésérol. Labor. Diagn. 18: 58-60, 1991. 116. Fischer, B. Über die Fettfärbung mit Sudan III und Scharlach Rot. Cbl. Allg. Path. 13: 943946, 1902. 117. Bielschowsky, M. Die Silberimpregnation der Neurofibrillen. J. Psychol. Neurol. 3: 169189, 1904. 118. Johnson RN, Metcalf PA, Baker JR. Fructosamine: a new approach to the estimation of serum glycosylprotein. An index of diabetic control. Clin Chim Acta. 127: 87-95, 1983. 119. Reynolds ES, Moslen MT. Free Radicals in Biology: Vol. IV, W. A. Pryor (Ed.), Academic Press Inc., 1980: 49-94. 120. Suzuki Y, Fujii S, Tominaga T, Yoshimoto T, Yoshimura T, Kamada H. The origin of an EPR signal observed in dithiocarbamate-loaded tissues. Copper(II)-dithiocarbamate complexes account for the narrow hyperfine lines. Biochem. Biophys. Acta 1335: 242-245, 1997. 121. Finkelstein E, Rosen GM, Rauckman EJ. Superoxide-dependent reduction of nitroxides by thiols. Biochim. Biophys. Acta 802: 90-98, 1984. 122. Samuni A, Krishna CM, Riesz P, Finkelstein E, Russo A. Superoxide reaction with nitroxide spin-adducts. Free Radic. Biol. Med. 6: 141-148, 1989. 123. Chen B, Deen WM. Analysis of the effects of cell spacing and liquid depth on nitric oxide and its oxidation products in cell cultures. Chem. Res. Toxicol. 14: 135-147, 2001. 124. Nalwaya N, Deen MW. Analysis of cellular exposure to peroxynitrite in suspension cultures. Chem. Res. Toxicol. 16: 920-932, 2003. 125. Rodriguez-Manas L, Angulo J, Peiro C, Llergo JL, Sanchez-Ferrer A, Lopez-Doriga P, Sanchez-Ferrer CF. Endothelial dysfunction and metabolic control in streptozotocininduced diabetic rats. Br. J. Pharmacol. 123: 1495-1502, 1998. 126. Rubler S, Dlugash J, Yuceoglu YZ, Kumral T, Branwood AW, Grishman A. New type of cardiomyopathy associated with diabetic glo merulosclerosis. Am. J. Cardiol. 30: 595–602, 1972. 127. Fehér J, Vereckei A, Lengyel G. Role of free radical reactions in liver diseases. Acta Physiol. Hung. 80: 351-361, 1992. 128. Cernadas MR, Sanchez de Miguel L, Garcia -Duran M, Gonzalez-Fernandez F, Millas I, Monton M, Rodrigo J, Rico L, Fernandez P, de Frutos T, Rodriguez-Feo JA, Guerra J, Caramelo C, Casado S, Lopez-Farre. Expression of constitutive and inducible nitric oxide synthases in the vascular wall of young and aging rats. Circ. Res. 83: 279-286, 1998.
91
129. Goettsch W, Lattmann T, Amann K, Szibor M, Morawietz H, Munter K, Muller SP, Shaw S, Barton M. Increased expression of endothelin-1 and inducible nitric oxide synthase isoform II in aging arteries in vivo: implications for atherosclerosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 280: 908-913, 2001. 130. Zieman SJ, Gerstenblith G, Lakatta EG, Rosas GO, Vandegaer K, Ricker KM, Hare JM. Upregulation of the nitric oxide-cGMP pathway in aged myocardium: physiological response to L-arginine. Circ. Res. 88: 97-102, 2001. 131. Matz RL, Schott C, Stoclet JC, Andriantsitohaina R. Age-related endothelial dysfunction with
respect
to
nitric
oxide,
endothelium-derived
hyperpolarizing
factor
and
cyclooxygenase products. Physiol. Res. 49: 11-18, 2000. 132. Salvemini D, Ischiropoulos H, Cuzzocrea S. Roles of nitric oxide and superoxide in inflammation. Methods Mol. Biol. 225: 291-303, 2003. 133. Martin-Gallan P, Carrascosa A, Gussinye M, Dominguez C. Biomarkers of diabetesassociated oxidative stress and antioxidant status in young diabetic patients with or without subclinical complications. Free Radic. Biol. Med. 34: 1563-1574, 2003. 134. Baynes JW, Thorpe SR. Role of oxidative stress in diabetic complications. A new perspective on an old paradigm. Diabetes 48: 1-9, 1999.
92
10.
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
Az értekezés témájában megjelent tudományos közlemények. 1. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, von Bölcsházy G, Jakus J. Increased nitric oxide levels as an early sign of premature aging in diabetes. Free Radic. Biol. Med. 35: 1240-1251, 2003. (IF: 5,533) 2. Stadler K, Jenei V, von Bölcsházy G, Somogyi A, Jakus J. Szabadgyökök és reaktív nitrogén speciesek szerepe a diabetesz késoi szövodményeinek kialakulásában patkányban. Orv. Hetil. 141(21): 1135-1140, 2004. 3. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Beneficial effects of aminoguanidine on the cardiovascular system of diabetic rats. Diabetes Metab. Res. Rev.,2004 (közlésre elfogadva) (IF: 2,472). 4. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Aminoguanidin kezelés pozitív hatása a peroxinitrit termelodésre és szívhipertrófiára streptozotocin-indukálta diabeteses patkányokban. Orv.Hetil., 2004 (közlésre elfogadva) 5. A Németh, K Stadler, J Jakus. Computational and experimental studies on ex vivo peroxynitrite formation in dia betic rat aorta. Chem. Res. Toxicol. 2004. (közlésre benyújtva) Az értekezés témájában megjelent idézheto eloadáskivonatok. 1. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Possible role of nitric oxide and peroxynitrite in early diabetic tissue damage: a time-course study. Free Radic. Biol. Med. 31 (S1): S73, 2001. 2. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Aminoguanidine prevents cardiac hypertrophy and peroxynitrite production in diabetic rats. Free Radic. Biol. Med. 36 (S1): S111, 2004. Egyéb tudományos közleménye k. 1. Szarka A, Stadler K, Jenei V, Margittai É, Csala M, Jakus J, Mandl J, Bánhegyi G. Ascorbyl free radical and dehydroascorbate formation on rat liver endoplasmic reticulum. J. Bioenerg. Biomembr. 34(4): 317-323, 2002. (IF: 2,920) 2. Balogh K, Stadler K, Mézes M, Erdélyi M, Weber M. (2004): Effect of selenium overdose on free radical level and glutathione redox system in chicken. In: Cser MA, Sziklai LI, Étienne JC, Maymard Y, Centeno J, Khassanova L, Collery P. (eds.) (2004): Metal Ions in Biology and Medicine 8: 343-347. John Libbey Eurotext, Paris. Összes impakt faktor: 10,925.
93
Az értekezés témájában tartott fontosabb eloadások, poszterek. 1. K Stadler, V Jenei, G Simon, J Jakus. Use of DETC complexes in measurements of nitrosyl radical and copper(II) in diabetic tissues. 6th International Symposium on Spin Trapping, 2000. augusztus 27-31, Marseille, Franciaország. 2. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Diabetes szövodményeinek korai szabadgyökös markerei. Magyar Szabadgyök Kutató Társaság I. Kongresszusa, 2001. április 5-7, Pécs. 3. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Nitrogén-oxid feltételezett szerepe korai szövetkárosodásban diabetes mellitusban. Magyar Szabadgyök Kutató Társaság munkaértekezlete, 2001. október 24, MSD Centrum, Budapest. 4. K Stadler, V Jenei, A Somogyi, J Jakus. Possible role of nitric oxide in early diabetic tissue damage: a time course study. 8th Annual Meeting of the Oxygen Society, 2001. november 15-19, Research Triangle Park, North Carolina, USA. 5. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Nitrogén oxid és peroxinitrit szerepe korai szövetkárosodásban
diabetes
mellitusban.
Magyar
Diabetes
Társaság
XVI.
Kongresszusa, 2002. május 30 – június 2, Debrecen. 6. K Stadler, V Jenei, A Rockenbauer, J Jakus. Use of dithiocarbamate-NO complexes in animal tissues. 7th International Symposium on Spin Trapping, 2002. július 7-11, Chapel Hill, North Carolina, USA. 7. K Stadler, V Jenei, J Jakus. iNOS inhibitor counteracts cardiac hypertrophy and peroxynitrate overproduction in diabetic rats. Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health. 2003. szeptember 21-26, Szmolenszk, Oroszország. 8. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Az aminoguanidin kezelés kivédheti a szívhipertrófiát és a vaszkuláris peroxinitrit túltermelodést diabeteses patkányokban. Magyar Diabetes Társaság XVII. Kongresszusa, 2004. április 22-25, Tihany. 9. K Stadler, V Jenei, A Somogyi, J Jakus. Aminoguanidine prevents cardiac hypertrophy and peroxynitrite production in diabetic rats. SFRR XII. International Meeting, 2004. május 5-9., Buenos Aires, Argentína. 10. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Aminoguanidin kezelés hatása a peroxinitrit termelodésre és szívhipertrófiára streptozotocin-indukálta diabeteses patkányokban.
Magyar Szabadgyök Kutató Társaság munkaértekezlete, 2004. május 21., MSD Centrum, Budapest.
94
ÖSSZEFOGLALÓ
A cukorbetegség (diabetes mellitus) egyike azoknak a kórképeknek, amelyek napjainkban fontos egészségügyi problémának számítanak. Ma már a betegek életminoségét és életkilátásaikat elsosorban nem maga a cukorbetegség miatt fellépo hipo- vagy hiperglikémia veszélyezteti, hanem a hosszú évek alatt kialakuló késoi szövodmények. Az utóbbi évtizedben számos kísérleti eredmény utal arra, hogy a szénhidrát-anyagcsere zavara során oxidatív stressz alakul ki. Bizonyítottnak tunik a szabadgyökök részvétele a cukorbetegség progressziójában, de a késoi szövodmények kialakulásában szerepük a mai napig nem tisztázott. Doktori munkámmal a diabetes késoi szövodményei és a szabadgyökös reakciók között valószínusített ok-okozati összefüggés feltárásához kívántam közelebb jutni és új adatokkal szolgálni. Legfontosabb eredményeink a következok: 1. Felgyorsult oxidatív folyamatokra jellemzo markerek változását és a szabadgyökös egyensúly megbomlását mutattuk ki patkányokban a streptozotocin- indukálta diabetes korai fázisában, különös tekintettel a nitrogén monoxid termelodésére. 2. Megállapítottuk, hogy az együttesen indukálódott magas nitrogén monoxid szint és a fokozott oxidatív stressz miatt nagy mennyiségu peroxinitrit anion képzodik a diabeteses aortában. 3. Igazoltuk, hogy az egészséges állatok aortájában idosebb korban szitén megnövekszik az nitrogén monoxid és a peroxinitrit termelés. Ez arra utal, hogy kóros szénhidrát-anyagcserében felgyorsul az öregedési folyamat patkányokban. 4. Megállapítottuk, hogy a fokozott szabadgyöktermelodés és az oxidatív stresszre jellemzo biokémiai reakciók megelozték a fénymikroszkópos módszerrel igazolható, késoi szövodményekre jellemzo szövettani elváltozásokat. Nem zárható ki tehát, ho gy a szabadgyökös folyamatok szerepet játszanak a késoi szövodmények kialakulásában. 5. Kimutattuk, hogy mind az ultratard inzulinnal, mind a NOS gátló aminoguanidinnel történo kezelés sikeresen csökkenti a reaktív nitrogén termékek szintjét, de feltehetoleg más- más mechanizmuson keresztül. 6. Megállapítottuk, hogy az aminoguanidin kezelés kivédi a diabetesben jelentkezo szívhipertrófiát, míg az inzulinkezelés nem. 7. Míg az inzulin a diabeteses patkányok szénhidrát-anyagcsere paraméterein javított, addig az aminoguanidin a glikációs termékek kialakulását gátolta, így kombinált használatuk akár új terápiás lehetoségét is jelentheti a diabetes egyes késoi szövodményeinek.
95
SUMMARY
Diabetes mellitus is a chronic disease and one of the most important health problems in the world. Nowadays, life quality of diabetic patients is mainly determined by the development of late complications: not by hypo- or hyperglycemia. Several studies have discussed that oxidative stress is developed during malfunctions of the carbohydrate metabolism. Free radical mechanisms and the possible sources of oxidative stress in the pathogenesis of diabetes have been extensively studied, but the relationship between free radical formation and the complications of diabetes is still controversial. This work tries to contribute new data to answering the question whether free radical production is related to the appearance of diabetic complications. Our most important theses are as follows: 1. Accelerated oxidative processes and altered free radical status were found at an early stage of streptozotocin- induced diabetes, especially regarding nitric oxide overproduction was. 2. It has been concluded that high nitric oxide levels and oxidative stress lead to the formation of high amounts of peroxynitrite in the diabetic aorta. 3. We determined that nitric oxide and peroxynitrite generation in healthy aorta of older rats showed a similar increase as in diabetic aorta, but with a timeshift, suggesting a kind of premature aging of the vasculature in case of carbohydrate metabolism disorder. 4. Increased free radical production and other oxidative stress-related biochemical processes developed before the evolution of any histopathological signs of late complications detected by light microscopy. It is possible therefore, that free radical processes could play a decisive role in the development of late complications. 5. We have determined that both aminoguanidine, a NOS inhibitor, and ultratard insulin treatment suppressed reactive nitrogen species overproduction, but probably their mechanism of action is different. 6. It has been concluded that only aminoguanidine was able to prevent cardiac hypertrophy in diabetes, while insulin treatment was not. 7. Insulin treatment was able to improve most of the carbohydrate metabolism parameters in diabetic rats, while aminoguanidine moderated oxidative stress through inhibition of glycation. Its combination with insulin treatment, therefore, may offer new therapeutic options in the prevention of certain complications in diabetes.
96
