III.
MATERI DAN METODE
A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September sampai dengan Desember 2015. Proses isolasi DNA, simplex-PCR dan duplex-PCR dilaksanakan di Sub Laboratorium Biologi, UPT. Laboratorium Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA) Terpadu, Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Visualisasi elektroforesis agarose gel dan analisis hasil elektroforesis dengan menggunakan gel documentation dilaksanakan di Sub Laboratorium Biologi 3 dan 4 Laboratorium MIPA Terpadu, Fakultas MIPA, Universitas Sebelas Maret Surakarta Jalan Ir. Sutami No. 36 A Kentingan, Jebres, Surakarta. B. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat Penelitian Alat yang digunakan pada penelitian adalah mesin PCR (GeneAmp® PCR System 9700, Singapore), micropipet 2-20 µl, 10µ-100µ, 20-200 µl, 100-1000 µl (Gilson, France), yellow tip, blue tip, PCR tip, tabung 1,5 ml dan 0,2 ml, falcon tube, microsentrifuse (Hettich Zentrifugen Mikro 22R, Germany), gel documentation (Vilber Lourmat Infinity 1100126M, France), seperangkat computer, waterbath, micropestle, tabung koleksi, PCR box, rak yellow tip, rak blue tip, sprayer, rak PCR tip, kolom GD, beaker glass, autoclaft, microwave (Sharp R-298-H, Jepang), pisau, pinset, gunting, vortex (VM 300, Gemmy Industrial Corp, Taiwan), timbangan analitik (Mettler Toledo AG204, Switzerland), elektroforesis tray, chamber elektroforesis dan comb elektroforesis (Thermo Scientific, Owl Easycast B1 EC300XL2, Malaysia), power supply (Thermo Scientific EC 300 XL, Malaysia). 2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan pada penelitian adalah sampel daging babi segar dan daging sapi giling. Genomic DNA Mini Kit untuk jaringan hewan (Geneaid Biotech Ltd., Taiwan), KAPA2G Fast Multiplex Mix PCR Kit (Kapa Biosystems, Inc., USA), tissue, kertas label, sealing plastic,
11
12
allumunium foil, alcohol 70%, alcohol 95% (absolute ethanol), agarose gel, flourosafe, marker DNA ladder 100 bp dan 1 kb, forward primers, reverse primers, loading dye, aquabidest, aquadest, Tris Asetate Ethylen Diamine Tetraacetic Acid (TAE) 10X. C. Metode Penelitian 1. Koleksi Sampel Sampel daging babi yang digunakan dikoleksi dari Rumah Pemotongan Babi (RPB) Jagalan Kota Surakarta dan sampel daging sapi segar yang digunakan berasal dari daging sapi giling yang dikoleksi dari Supermarket di Kota Surakarta, masing-masing sampel daging dimasukkan ke dalam plastik dan diberi label spesies daging. Sebanyak 6 sampel dibuat dengan cara mencampur daging sapi dengan daging babi segar sebanyak 1.000 mg pada tabung 1,5 ml yang dimaksudkan untuk mempermudah dalam homogenisasi sampel, menggunakan perbandingan sesuai level kontaminasi yaitu kombinasi daging sapi dan babi dengan rasio: 100% sapi (S), 75%:25% (S1), 90%:10% (S2), 95%:5% (S3), 99:1% (S4) dan 100% babi segar (B). Kemudian, sampel dihaluskan, dan dihomogenkan dengan micropestle, serta sebanyak 30 mg sampel dipindahkan ke tabung 1,5 ml yang baru. 2. Isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan sesuai dengan protokol yang diberikan oleh Genomic DNA Mini Kit untuk jaringan hewan (Geneaid Biotech Ltd., Taiwan). Sampel daging yang telah dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml disiapkan, ditambahkan 200 µl GT buffer pada tabung dan dihomogenkan dengan sampel daging yang telah dihaluskan. Selanjutnya, 20 µl proteinase K ditambahkan pada tabung 1,5 ml, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 60oC selama 30 menit (selama proses inkubasi, setiap 5 menit dihomogenkan menggunakan vortex). Kemudian, 200 µl GBT buffer ditambahkan pada tabung, dihomogenkan menggunakan vortex selama 5 detik, dan campuran diinkubasi kembali pada suhu 60oC selama 20 menit (apabila jaringan tadi tidak lisis dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 2 menit).
13
Selanjutnya, supernatan dipindahkan pada tabung 1,5 ml yang baru, 200 µl absolute ethanol ditambahkan pada tabung 1,5 ml, dan untuk melisiskan dihomogenkan dengan menggunakan vortex selama 10 detik (jika terjadi presipitasi, diambil dengan menggunakan pipet). Setelah itu, kolom GD disiapkan, ditempatkan pada tabung koleksi 2 ml, campuran (termasuk gumpalan DNA) dipindahkan pada kolom GD, dan disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 2 menit. Kemudian, kolom GD dipindahkan pada tabung koleksi 2 ml yang baru, 400 µl W1 buffer ditambahkan pada kolom GD, dan disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 1,5 menit untuk mendapatkan DNA yang murni. Cairan yang tercecer dibuang dan hasil saringan dikembalikan ke tabung koleksi. Setelah itu, 600 µl wash buffer ditambahkan pada kolom GD dan disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 1,5 menit. Selanjutnya, kolom GD dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml yang baru, dibuang cairannya, dan disentrifugasi selama 3 menit. Setelah itu, 50 µl elution buffer (yang telah dipanaskan pada suhu 60oC) ditambahkan pada kolom GD, tunggu selama 5 menit pada suhu kamar untuk memastikan elution buffer terserap sepenuhnya, dan campuran disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 1,5 menit. Kemudian, ditambahkan kembali 50 µl elution buffer, ditunggu selama 5 menit, dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 14.000 rpm selama 1,5 menit. Hasil isolasi DNA siap dilakukan analisis dengan menggunakan elektroforesis agarose gel 1% (Cara pembuatan pada Lampiran 1). Proses isolasi genom secara singkat dapat dilihat pada Gambar 2.
14
Sampel ditimbang dan dihaluskan dengan menggunakan micropestle.
Sampel+200µl GT buffer+20µl proteinase K, inkubasi suhu 60oC 30 menit.
Sampel + GBT buffer, inkubasi suhu 60oC 20 menit dan sentrifugasi 14.000 rpm 2 menit.
Supernatan + 200µl absolute ethanol sentrifugasi 14.000 rpm 2 menit.
Sampel + 400µl W1 buffer sentrifugasi 14.000 rpm 1,5 menit.
Sampel + 600µl wash buffer,sentrifugasi 14.000 rpm 1,5 menit.
Sampel + 100µl elution buffer, sentrifugasi 14.000 rpm 3 menit. Gambar 2. Diagram Alir Proses Isolasi Genom
15
3. Simplex-PCR Teknik PCR diamplifikasi dari fragmen DNA mitokndria gen cytochrome b dan rancangan primer menggunakan sekuen primer yang telah dipublikasikan oleh Matsunaga et al. (1999) seperti pada Tabel 2. Tabel 2. Primer yang digunakan dalam penelitian Spesies Babi (Sus scrofa) Sapi (Bos taurus/ Bos indicus)
Sekuen Primer F: GACCTCCCAGCTCCATC AAACATCTCATCTTGATGAAA R:GCTGATAGTAGATTTG T GATGACCGTA F:GACCTCCCAGCTCCATA AACATCTCATCTTGATGAAA R:CTAGAAAAGTGTAAGCC CGTAATATAAG
Ukuran Produk PCR
Suhu Annealing
398 bp
60oC
274 bp
60oC
Sumber: Matsunaga et al. (1999) Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan mesin PCR (GeneAmp® PCR System 9700, Singapore). Proses PCR berjalan sesuai dengan protokol KAPA2G Fast Multiplex Mix PCR Kit (Kapa Biosystems, Inc., USA). Program PCR berjalan pada volume 25 µl yang terdiri dari campuran 12,5 µl 2X KAPA2G Fast Multiplex Mix PCR Kit (Kapa Biosystems, Inc., USA), masing-masing 0,5 µl forward primers dan reverse primers, sampel DNA 1 µl. 10,5 aquabidest yang dimasukkan ke dalam tabung 0,2 ml. Setelah itu, tabung dimasukkan ke dalam mesin PCR (GeneAmp® PCR System 9700, Singapore). Program PCR diikuti oleh 35 siklus PCR yaitu: Inisial denaturasi pada suhu 95°C selama 3 menit, denaturasi 95°C selama 15 detik, annealing pada suhu 60°C selama 30 detik, extension pada suhu 72°C selama 30 detik dan final extension pada suhu 72°C selama 3 menit. Setelah DNA diamplifikasi, 5 µL produk PCR diambil untuk dilakukan elektroforesis menggunakan agarose gel 1,5% (Cara pembuatan pada Lampiran 2). Data yang diperoleh disimpan dan dicetak menggunakan gel documentation (Vilber Lourmat Infinity 1100126M, France).
16
4. Duplex-PCR Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan mesin PCR (GeneAmp® PCR System 9700, Singapore). Proses PCR berjalan sesuai dengan protokol KAPA2G Fast Multiplex Mix PCR Kit (Kapa Biosystems, Inc., USA). Program PCR berjalan pada volume 25 µl yang terdiri dari campuran 12,5 µl 2X KAPA2G Fast Multiplex Mix PCR Kit (Kapa Biosystems, Inc., USA) masing-masing 0,5 µl untuk dua pasang forward primers dan reverse primers, sampel DNA 1 µl. 10,5 aquabidest, seluruh campuran dimasukkan ke dalam tabung 0,2 ml. Setelah itu, tabung dimasukkan ke dalam mesin PCR (GeneAmp® PCR System 9700, Singapore). Program PCR diikuti oleh 35 siklus PCR yaitu: Inisial denaturasi pada suhu 95°C selama 3 menit., denaturasi 95°C selama 15 detik, annealing pada suhu 60°C selama 30 detik, extension pada suhu 72oC selama 30 detik final extension pada suhu 72°C selama 3 menit. Setelah DNA diamplifikasi, 5 µl produk PCR diambil untuk dilakukan elektroforesis menggunakan agarose gel 1,5% (Cara pembuatan pada Lampiran 2). Data yang diperoleh, disimpan dan dicetak menggunakan gel documentation (Vilber Lourmat Infinity 1100126M, France). 5. Analisis sekuen gen cytochrome b Sekuen nukleotida primer yang diperoleh dari penelitian Matsunaga et al. (1999) dianalisa secara in silico dengan cara BLAST berdasarkan informasi database National Center for Biotechnology Information (NCBI) melalui laman http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Pada laman BLAST, klik menu “Nucleotide Blast” Setelah itu, masukkan sekuen nukleotida yang akan diajukan di kolom “Enter Query Sequence”. Pisahkan antar sekuen nukleotida selanjutnya, klik BLAST dan tunggu beberapa saat. Muncul ditampilan berupa data yang berisikan daftar spesies yang memiliki kemiripan dengan data yang diujikan. Setelah itu data yang dihasilkan disimpan dan dilakukan analisis. Analisa selanjutnya adalah mengkonfirmasi keberadaan sekuen nukleotida primer yang digunakan. Langkah pertama yang dilakukan adalah mengakses laman database NCBI, pada menu dropdown dipilih menu
17
“nucleotide”, kode fragmen “Cytb” dan nama spesies babi dan sapi diketik pada kolom yang tersedia. Tampilan selanjutnya adalah pilihan dari beberapa unggahan sekuen nukleotida, sekuen nukleotida dipilih. Pilihan “FASTA” dipilih untuk selanjutnya urutan nukleotida disalin ke dalam software pengolah kata. Salin forward primer untuk dicari pada urutan nukleotida yang sudah disalin ke dalam software pengolah kata, pewarnaan diberikan pada urutan nukleotida yang sesuai dengan forward primer tujuannya adalah sebagai pembeda, selanjutnya reverse primer disalin pada software reverse complement yang dapat diakses pada laman http://reversecomplement.com/ dan diberikan pewarnaan yang berbeda dari warna forward primer. Setelah didapatkan sekuen nukleotida dari primer gen cytochrome b spesifik dari kedua spesies, forward dan reverse primer yang telah diperoleh disalin pada software
clustalW
yang
dapat
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
diakses laman
ini
pada berfungsi
laman sebagai
alignment marker. Kedua sekuen primer gen cytochrome b hasil dari masingmasing spesies disalin ke dalam kolom input sequences. Kemudian, tekan pilihan submit dan setelah input berhasil dilakukan maka secara otomatis lama situs akan menampilkan alignment yang diinginkan dan dapat dilakukan analisis. D. Rancangan Penelitian dan Analisis Data 1. Rancangan Penelitian Penelitian ini dilakukan secara eksperimental dengan desain penelitian perbandingan level kontaminasi berdasarkan presentase kontaminasi antara daging sapi dengan daging babi segar. Jumlah sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 6 sampel. Adapun sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah: S : 100% daging sapi segar + 0% daging babi segar S1 : 75% daging sapi segar + 25% daging babi segar S2 : 90% daging sapi segar + 10% daging babi segar S3 : 95% daging sapi segar + 5% daging babi segar
18
S4 : 99% daging sapi segar + 1% daging babi segar B : 0% daging sapi segar + 100% daging babi segar. Daging babi 100% dan daging sapi 100% (Sampel S dan B) digunakan sebagai kontrol negatif untuk mengetahui apakah primer yang digunakan spesifik atau tidak. 2. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analisis deskriptif kualitatif. Menurut Sugiyono (2008) metode analisis deskriptif kualitatif merupakan metode yang dilakukan secara intensif yaitu: peneliti ikut berpartisipasi selama dilapangan, mencatat secara hati-hati apa yang terjadi, melakukan analisis terhadap berbagai dokumen yang ditemukan dilapangan dan membuat laporan penelitian secara mendetail. Metode penelitian secara singkat dapat dilihat pada Gambar 3.
Koleksi Sampel
Isolasi Genom
Elektroforesis Agarose Gel 1%
Simplex- dan duplex- PCR
Elektroforesis Agarose Gel 1,5%
Analisis Sekuen Gen Cytochrome b Gambar 3. Diagram Alur Metode Penelitian (Matsunaga et al, 1999 Termodifikasi)
