Bab III Materi dan Metode A. Materi Sampel yang digunakan adalah bakteri simbion dari lamun Enhalus acoroides yang ditumbuh di perairan Teluk Awur, Jepara. Isolasi bakteri simbion di laksanakan di laboratorium mikrobiologi, marine Station, Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro, Jepara.
Seleksi
dan
kultur
bakteri
simbion
dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Laut Tropis, Laboratorium
Terpadu,
Universitas
Diponegoro,
Semarang. Ekstraksi dan analisa kandungan pigmen di
pusat
studi
karotenoid
dan
antioksidan,
Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga. Bahan kimia uang digunakan dalam proses ekstraksi dan analisis kandungan pigmen alami adalah methanol, asetonitril, gas N2 dan akuades. B. Metode 1. Persiapan Sampel Lamun Sampel lamun dari jenis Enhalus acoroides yang diambil dari laut dicuci dengan air laut steril untuk menghilangkan mikroorganisme
kotoran, epifit
pasir, yang
lumpur
menempel
dan pada
permukaan daun. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam kantong plastik hitam dan dimasukkan ke 15
dalam cool box. Sampel di bawa ke laboratorium untuk diisolasi bakteri simbionnya. 2. Pembuatan Medium Pembuatan 1000 ml medium Zobell 2216E half strength dilakukan dengan mencampurkan 2,5 gr bacto-pepton, 0,5 gr ekstrak yeast dan 15 gr bactoagar ke dalam 1000 ml air laut, panaskan dan aduk hingga homogeny. Selanjutnya medium distrilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121 0C selama 15
menit.
Medium
yang
telah
disterilkan
dituangkan ke dalam cawan petri kurang lebih sebanyak
20
ml.
Medium
tersebut
digunakan
sebagai medium untuk isolasi dan kultur bakteri simbion dari lamun. 3. Metode Isolasi Bakteri Simbion Sampel lamun E. acoroides yang diperoleh dari laut ditempatkan pada cawan petri steril kemudian dipotong dan dihaluskan menggunakan pisau steril. Proses
selanjutnya
pengenceran
adalah
terhadap
melakukan
sampel
yang
seri telah
dihaluskan. Sebanyak 1 gr sampel dimasukkan ke dalam erlemnayer yang berisi 9 ml air laut steril, diperoleh seri pengenceran 10-1. Seri pengenceran 10-1 diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml air laut steril 16
sehingga
diperoleh
Pengenceran
seri
dilakukan
pengenceran
sampai
10-2.
diperoleh
seri
pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5. Dari setiap seri pengenceran diambil 35 µl sampel dan dimasukkan ke dalam cawan pertri berisi medium Zobell 2216E, ratakan sampel menggunakan spreader. Cawan petri tersebut diinkubasi pada suhu 30 0C selama 4 x 24 jam. 4. Seleksi dan Pemurnian Isolat Seleksi bakteri dilakukan dengan cara mengambil koloni yang berbeda dari masing – masing cawan petri pada tiap seri pengenceran (Radjasa et al., 2007). Bakteri yang tumbuh dipermukaan agar diseleksi berdasarkan warna, bentuk dan tektur koloninya(Radjasa et al., 2013). Koloni bakteri yang berbeda dipisahkan menggunakan teknik goresan (streak method) kemudian dipindahkan ke medium yang
baru.
Selanjutnya
cawan
petri
tersebut
diinkubasi pada suhu 37 0C selama 3 x 24 jam dan diamati
pertumbuhannya.
Proses
pemurnian
berhasil jika bakteri sudah tumbuh dalam bentuk koloni tunggal. Apabila belum terbentuk koloni tunggal
bakteri
harus
dimurnikan
lagi
menggunakan metode goresan hingga didapatkan kultur
murni
dalam
bentuk
koloni
tunggal
(Marhaeni et al., 2011). Koloni yang sudah murni 17
diamati dan dicatat warna, bentuk dan tektur koloninya. 5. Kultur Bakteri Kultur bakteri dilakukan untuk memperbanyak jumlan
biomassa
sel
bakteri
sebelum
analisa
pigmen. Kultur bakteri yang sudah murni ditanam pada cawan petri yang berisis medium padat, kemudian inkubasi cawan petri tersebut pada suhu 35 0C selama 4 x 24 jam. Setelah sel bakteri target tumbuh memenuhi permukaan agar, sel dipanen dengan cara dikerok menggunakan Scalpel. Sel bakteri yang didapatkan siap untuk diekstraksi dan dilakukan analaisa pigmen. 6. Ekstraksi Pigmen Sel bakteri berwarna yang didapatkan diekstraksi kandungan
pigmennya
menggunakan Sampel
metanol
dididamkan
dengan
cara
(Radjasa
et
hingga
pigmen
direndam al.,
2009).
tengangkat
dengan sempurna, hingga pelet sel bakteri menjadi tidak
berwarna
atau
pucat.
Ekstrak
pigmen
dipisahkan dari pelet sel, kemudian ekstrak pigmen yang didapatkan
disaring menggunakan
kertas
saring. Proses selanjutnya ektrak pigmen yang didapatkan
dievaporasi
menggunakan gas nitrogen (N2). 18
dan
dikeringkan
7. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Kandungan menggunakan
pigmen
pada
ekstrak
dianalisis
Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi
(KCKT) Shimadzu LC 20-AB dengan kolom fase terbalik ODS, C18, 250 x 4 mm, 5 µm. Fase gerak menggunakan
perbandingan
metanol:asetonitril
70:30 (v/v). 8. Uji Aktivitas Ekstrak Pigmen Uji Aktivitas Antioksidan Uji aktivitas antioksidan mengacu pada metode 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (Molyneux, 2004). Ekstrak pigmen dan β – Karoten sebagai kontrol positif dibuat dalam serial konsentrasi 100, 250, 500, 750, 1000 ppm. Setiap 1 ml ekstrak dan larutan
β – Karoten dengan berbagai konsentrasi
dikontakkan dengan 4 ml dengan konsentrasi 0,1 mM. Sampel diinkubasi pada ruang gelap selama 30 menit. Selanjutnya sampel diukur absorbasninya menggunakan
spektrofotometer
pada
panjang
gelombang 516 nm. Untuk mengetahui aktivitas antioksidan digunakan rumus :
% Peredaman =
DPPH o−[DPPH ]s
19
[DPPH ]o
x 100 %
Keterangan : [DPPH]o = Absorbansi larutan kontrol positif (DPPH 0,1 mM) [DPPH]s = Absorbasi Larutan Sampel Uji Aktivitas Antimikrobial Ekstrak pigmen yang diperoleh dibuat dalam serial konesntrasi 100, 250, 500, 750, 1000 ppm, selanjutnya ekstrak pigmen diuji potensi aktivitas antimikrobialnya. adalah
Bakteri
bakteri
Multi
Escherichia
coli
dan
sedangkan
jamur
uji
uji
Drug
yang
digunakan
Resistance
Staphylococcus yang
digunakan
jenis aureus, adalah
Aspergilus flavus dan Candida albicans. Uji potensi ekstrak
pigmen
sebagai
senyawa
antimikrobial
dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar (Radjasa et al., 2007). 100 µl kultur cair bakteri dan jamur
patogen
dengan
kepadatan
108
sel/ml
diinokulasikan ke permukaan medium agar Zobell 2216E. Enam buah paper diks (8 mm, Advantec, Toyo Roshi, Ltd, Japan) diletakkan dipermukaan medium agar. Lima buah paper disk ditetesi dengan 30 µl ekstrak pigmen dengan konsentrasi 100, 250, 500, 750, 1000 ppm dan satu paper disk ditetesi dengan metanol sebagai kontrol negatif. Hasil uji diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu ruangan. 20
Aktivitas
antimikrobial
ditunjukkan
dengan
terbentuknya zona bening disekitar paper disk. 9. Identifikasi Molekuler Bakteri Simbion Lamun E. acoroides Ekstraksi DNA Ekstraksi
DNA
dilakukan
menggunakan
Kit
Chelex 100. Sel bakteri yang telah ditumbuhkan selama 24 jam dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang berisi 100 µl aquabides, kemudian
ditambahkan
saponin
0,5%
dan
didiamkan selama 24 jam pada suhu 4 0C. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit, supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Sebanyak 1 ml Phospate Buffer Saline (PBS 1x) ditambahkan
ke
dalam
tabung
eppendorf,
kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit, supernatan hasil sentrifigasi dibuang. Selanjutnya sebanyak 100 µl akuabides dan 50 µl Chelex 100 ditambahkan ke dalam tabung. Sampel direbus selama 10 menit (sampel
divortex
pada
5
menit
pertama).
Sentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke dalam tabung eppendorf yang baru dan siap untuk proses Amplifikasi DNA. 21
Amplifikasi DNA Amplifikasi Polymerase
DNA Chain
menggunakan
Reaction
(PCR)
metode
16s
rDNA.
Perlakuan temperatur yang digunakan pada proses Amplifikasi DNA adalah : denaturasi awal pada 95 0C
selama 3 menit, kemudian 30 siklus (denaturasi
pada suhu 95 0C selama 1 menit, annealing pada suhu 55 0C selama 1 menit dan ekstensi pada suhu 72
0C
selama 1 menit), kemudian ekstensi pada
suhu 72 0C selama 7 menit dan terakhir 4 0C ~ (Lee, 2006). Primer yang digunakan untuk PCR 16S rDNA adalah primer universal untuk bakteri 27F (5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') dan primer spesifik eubacteria
1492R
(5'-
TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') (Isnansetyo dan Kamei,
2003).
Campuran
bahan-bahan
yang
digunakan yaitu kit Promega (25 µl) primer 27 F (2,0 µl), primer 1492 R (2,0 µl), DNA template (2,5 µl) dan aquabides (18,5 µl) sehingga total volume 50 µl. Bahan-bahan tersebut dicampur dalam tabung PCR. Visualisasi Hasil Amplifikasi DNA Visualisasi
hasil
amplifikasi
DNA
dilakukan
melalui elektroforesis dengan cara memasukkan 5 22
μl produk PCR ke dalam sumur gel agarose 1 %. Pembuatan gel agarose
1 % dilakukan dengan
melarutkan 1 gram agarose dalam 100 ml larutan TAE buffer 1x, lalu dipanaskan menggunakan oven sampai
homogen
(jernih).
Sebanyak
5,33
µl
Ethidium Bromide dimasukkan ke dalam larutan gel, kemudian digoyang – goyang supaya homogen. Larutan gel dituang dalam cetakan dengan sisir cetakan yang dipasang dengan posisi tegak hingga melewati
sisir
sesuai
dengan
ketebalan
yang
diinginkan. Gel dibiarkan beberapa saat sampai mengeras. Langkah selanjutnya gel direndam dalam larutan buffer TAE 1x, gel kemudian dielektroforesis dengan voltase sebesar 100 V selama ± 30 menit. Terakhir, band DNA hasil amplifikasi dapat dilihat dengan menggunakan alat Gel Documentation.
Purifikasi Hasil Amplifikasi DNA Purifikasi dilakukan untuk mendapatkan DNA murni hasil amplifikasi PCR 16S rDNA. Metode yang digunakan adalah metode konvensional. Langkah pertama, hasil PCR disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 7 menit. Supernatan dibuang dengan menggunakan micropipet, pastikan DNA benar – benar murni (tidak ada primer yang 23
tertinggal).
Sebanyak
50
µl
akuabides
steril
ditambahkan pada pelet DNA, diamkan selama 5 menit. Hasil DNA murni dapat disekuensing untuk mengetahui urutan basa DNAnya. Sekuensing DNA Sekuensing
dilakukan
menurut
siklus
PCR
sekuensing menggunakan Big Dye Terminator v.3.1. Formula untuk reaksi PCR sekuensing yaitu: 2 μl big dye, 2 μl buffer 10x, 4 μl templet DNA, 1 μl primer dengan konsentrasi 3,2 pmol, ddH2O hingga volume akhir 10 μl. Amplifikasi DNA dilakukan dengan siklus sebagai berikut: denaturasi awal (96 °C selama 2 menit), kemudian denaturasi (96 °C selama 10 detik); annealing (50 °C selama 5 detik); dan ekstensi (60 °C selama 4 menit) sebanyak 25 siklus.
Hasil
PCR
dipurifikasi
dan
disekuen
menggunakan primer 27F. Sekuen dianalisis secara otomatis (ABI 3130XL, Applied Biosystem). BLAST Homologi Analisis
sekuen
DNA
isolat
bakteri
terbaik
kemudian dibandingkan dengan sekuen DNA pada basis data (database) DNA. Penelusuran dilakukan dengan menggunakan internet melalui program pelacakan database Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) pada National Center for Biotechnology 24
Information,
National
Institute
for
Health,
USA
(www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., 1997). Analisa Filogenetik Analisa
filogenetik bakteri dilakukan
dengan
membandingkan sekuen 20 bakteri terdekat dengan haisl sekuensing bakteri EAEJ 1 pada database Gen Bank. Hasil sekuen bakteri EAEJ 1 dan sekuen 20 bakteri
terdekat
diambil
lalu
diolah
dengan
menggunakan program Bioedit dan Mega 5. Dari hasil analisis akan didapatkan pohon filogenetik dari
bakteri
EAEJ
1
yang
kekerabatan dari bakteri tersebut.
25
menggambarkan
