Helicobacter pylori által kiváltott sejtkinetikai változások a gyomor premalignus elváltozásaiban. Unger Zsuzsa

Helicobacter pylori által kiváltott sejtkinetikai változások a gyomor premalignus elváltozásaiban

Unger Zsuzsa

Témavezeto: Dr. Prónai László Bírálók: Dr. Rácz István Prof. Dr. Papp János Szigorlati bizottság: Elnök: Prof. Dr. Schaff Zsuzsanna Tagok: Dr. Székely György Prof. Dr. Banai János

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Gasztroenterológia Budapest, 2003

Dolgozatomat Albert Karola emlékének ajánlom

2

Tartalomjegyzék

1. Összefoglalás………...………………………………………………………………5 1. 1 Magyar nyelvu összefoglaló.…………………………………………………….…5 1. 2 Angol nyelvu összefoglaló…………………………………………………………7 2. Rövidítések jegyzéke………….……………………………………………………..9 3. Bevezetés…………..…………………..……………………………………………10 3. 1 Háttér……………………………………………………………………...10 3. 1. 1 A Helicobacter pylori, mint carcinogen ágens…………………10 3. 1. 2 A gyomornyálkahártya vizsgálata………………………...……12 3. 2 Célkituzések……………………………………………………………….23 4. Beteganyag és módszerek…………………………………………………………25 4. 1 Beteganyag……………..…………………………………………………25 4. 2 A sejtproliferáció vizsgálata………………………………………………26 4. 2. 1 PCNA meghatározás……………………………………………27 4. 2. 2 A nucleolaris organizátor régiók detectálása…………………...27 4. 3 Apoptosis vizsgálata………………………………………………………28 4. 3. 1 A TUNEL reakció………………………………………………28 4. 4 EGFR kimutatás…………………………………………………………..29 4. 5 Oncoprotein expresszió vizsgálata - p53 kimutatás………………………30 4. 6 Statisztikai módszerek…………………………………………………….31 5. Eredmények…………………………………………………………………………32 5. 1 Sejtroliferáció – a PCNA és AgNOR módszerek összehasonlítása…………………………………………………………32 5. 2 Az apoptosis vizsgálatának eredményei…………………………………..37 5. 3 EGFR expresszió vizsgálatának eredményei……………………………..39 5. 4 A p53 oncoprotein expresszió vizsgálatának eredményei…………………41 5. 5 Összehasonlító elemzés..………………………………………………….42 6. Megbeszélés………………………………………………………………………..47 6. 1 Az eredmények megbeszélése…………………………………………….47 6. 2 Következtetések……………………………………………………………56

3

7. Köszönetnyilvánítás…………………………………………………………………58 8. Irodalomjegyzék…………………………………………………………………….59 8. 1 Felhasznált irodalom………………………………………………………59 8. 2 Az értekezés témájában megjelent saját közlemények……………………72 8. 3 Az értekezés témájában megjelent saját közlemények különlenyomatai……………………………………………………………74

4

1. Összefoglalás 1. 1 Magyar nyelvu összefoglaló

Helicobacter pylori általt indukált sejtkinetikai változások a gyomor premalignus elváltozásaiban Unger Zsuzsa Témavezeto: Dr. Prónai László Budapest, SOTE Doktori Iskola, Gasztroenterológia 2003

Háttér: A H. pylorit 1994-ben a gyomor carcinogenesisében betöltött szerepe miatt elsodleges carcinogen ágensnek nyilvánították. A pontos mechanizmus azonban, ami a rák kifejlodéséhez vezet, ma még nem teljesen ismert. Nem tisztázott, hogy a kórokozónak

milyen

szerepe

van

a

gyomornyálkahártya

homesostasisának

megbontásában, milyen hatása van a növekedési faktorok expressziójára, és az sem ismert, hogy hogyan befolyásolhatja az egyik leggyakoribb humán tumorokban eloforduló gén, a p53 mutációját. Bár a H. pylori eradikációja képes megfordítani a legtöbb molekuláris elváltozást, még nincs egységes álláspont arra vonatkozóan, hogy mely betegcsoportban szükséges az eradikációs kezelést elvégezni. Célkituzések: Az irodalmi adatok áttekintése után elsodleges feladat volt megvizsgálni a H. pylori fertozés szerepét a gyomornyálkahártya proliferációs és apoptoticus folyamatainak változásában. További célkituzés volt megmérni, hogy befolyásolja-e a H. pylori pozitivitás az EGF receptor expresszióját. A lehetséges genetikai instabilitás tisztázása érdekében történt a p53 expresszió vizsgálata. A vizsgálat fontos feladata volt megmérni a H. pylori eradikációs kezelésének hatását. Beteganyag és módszerek: A vizsgálatban 121 beteg vett részt (ebbol 61 no, 60 férfi, átlag életkoruk 58,5+14,3 év). Rutin gastroscopia során nyert biopsiás mintákból formalinban fixált paraffinba ágyazott metszetek készültek. A minták osztályozása négy szövettani csoportba történt: ép nyálkahártya; gyulladás, intestinalis metaplasia jelenléte nélkül; gyulladás, intestinalis metaplasiával; carcinoma. A gyulladásos esetek H. pylori hiánya vagy jelenléte alapján további alcsoportokba kerültek. A metszeteken

5

proliferációs aktivitás vizsgálata PCNA és AgNOR módszerekkel, apoptosis mérés TUNEL technikával, EGFR és p53 expresszió vizsgálata pedig immunhistochemiai módszerrel történt. Eredmények: A H. pylori nem okozott szignifikáns proliferáció változást. Intestinalis metaplasia nélküli gyulladásban H. pylori hatására az apoptosis szignifikáns mértékben gyorsult (0,013+0,001 vs. 0,029+0,012). Az EGFR expresszió az intestinalis metaplasiás csoportban H.pylori hatására szignifikánsan csökkent (48,30+23,70 vs. 32,80+30,40). A p53 index az intestinalis metaplasiás gyulladásban szignifikánsan nott az intestinalis metaplasia nélküli esetekhez képest mind a H. pylori negatív (18,33+19,65 vs. 68,50+28,96), mind a H. pylori pozitív (35,55+31,16 vs. 70,16+22,54) esetekben. Eradikációs kezelés után valamennyi paraméter a normál értékekhez közelire visszaállt. Következtetések: Az eredmények azt mutatják, hogy a H. pylori fertozéskor tapasztalható gyorsult sejtproliferációt nem a baktérium okozza, hanem a gyulladásra adott aspecifikus válasznak tekintheto. H. pylori az apoptosist csak akkor fokozza, ha intestinalis metaplasia nincs jelen. Intestinalis metaplasiában a H. pylori pozitív esetekben csökken az EGFR expresszió. A p53 mutációja korai esemény a gyomorrák carcinogenesisében. Eradikációs kezelés hatására a paraméterek a normálhoz közeli értékre visszaállhatnak, így a kezelés elvégzése indokolt az intestinalis metaplasiás betegeken.

6

2.2 Abstract

Helicobacter pylori induced cell kinetics changes in premalignant lesions of the stomach Zsuzsa Unger Consultant: László Prónai Budapest 2003

Background: Based on its possible effect in gastric carcinogenesis, H. pylori was clarified as I. class carcinogen in 1994. The exact patomechanism leading to cancer, however is still not cleared and the role in upsetting the balance of gastric epithelium is not well documented. Results are controversial about the effect of the bacterium on EGFR expression. It is not known how H. pylori influences the p53 mutation. Although the eradication of H. pylori reverses most of the molecular changes, there is still no consensus which patients need H.pylori eradication. Aims: 1) To investigate the role of H. pylori infection on gastric epithelial cell proliferation and apoptosis. 2) To evaluate the influence of H. pylori on EGFR and p53 expression. 3) To evaluate the effect of H. pylori eradication therapy on these parameters. The study also summarizes the current literature. Patients and methods: Antral biopsies were taken from 121 patients who underwent routine upper endoscopy (60 men, 61 women, mean age 58,5 years). Biopsies were fixed in formalin and embedded in paraffin. Patients were classified into four histological groups: (1) as normal epithelium, (2) gastritis, without intestinal metaplasia, (3) gastritis, with intestinal metaplasia and (4) carcinoma. Based on presence/absence of H. pylori the gastritis cases were classified into subgroups. Cell proliferation was measured by PCNA and AgNOR techniques, apoptosis was measured by TUNEL reaction and to evaluate the EGFR and p53 expression immunohistochemical method was used. Results: H. pylori did not cause significant change in cell proliferation. In gastritis cases - in the absence of intestinal metaplasia - H. pylori significantly increased apoptosis (0,013+0,001 vs. 0,029+0,012). Expression of EGFR was significantly lower in cases

7

when intestinal metaplasia was present (48,30+23,70 vs. 32,80+30,40). In the group of gastritis with intestinal metaplasia the p53 index increased both in H. pylori negative (18,33+19,65 vs. 68,50+28,96) and in H. pylori positive (35,55+31,16 vs. 70,16+22,54) cases. H.pylori eradication reversed these parameters close to the normal. Conclusions: The results suggest that the hyperproliferation in H. pylori infection is not caused by the bacterium itself, but it is rather an non-specific reaction to inflammation. H. pylori can increase the apoptosis only in the absence of intestinal metaplasia. EGRF expression during H.pylori infection is decreased only if intestinal metaplasia is present. Mutation of p53 is an early event in gastric carcinogenesis. H.pylori eradication normalises altered cell kinetics, thus it is suggested in all cases with intestinal metaplasia.

8

2. Rövidítések jegyzéke

PCNA

proliferating cell nuclear antigen

AgNOR

argyrophil nucleolaris oraganizátor régió

TUNEL

terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)- mediated deoxyuridintriphosphate-biotin (dUTP) nick end labelling

EGFR

epidermal growth factor receptor

LSD

least square deviation

PBS

phosphate buffer saline

DAB

diamino-benzidin

cagA

citotoxin-asszociált gén

vacA

vakuolizáló citotoxin

9

3. Bevezetés 3. 1 Háttér 3. 1. 1 A Helicobacter pylori, mint carcinogen ágens

Csökkeno incidenciája ellenére a gyomorrák ma még világszerte vezeto helyen áll a rákos megbetegedések okozta halálozásban. Széles köru ismeretanyag áll rendelkezésre a betegség epidemiológiájáról, pathogenesisérol, pathológiájáról, azonban kulcsfontosságú kérdések még mindig megválaszolásra várnak. Nem tisztázott, hogy hogyan alakulnak ki a rákmegelozo állapotok és ezek milyen szerepet töltenek be a carcinoma kifejlodésében. A Helicobacter pylori 1983-as újrafelfedezése óta a kutatások jelentos része új irányvonalon halad, és igyekszik tisztázni, hogy a kórokozónak milyen szerepe van a gyomorrák keletkezésében. A H. pylori jelenlétérol a gyomorban már 1893-ban beszámoltak, de csak Warren és Marschall 1983-as közleménye irányította rá a figyelmet, és azóta közlemények sokasága igazolta, hogy összefüggés van a H. pylori fertozés fennállása és egyebek mellett a gyomorrák, a fekélybetegség, a chronicus activ gastritis és a MALTlymphoma kialakulása között. A H. pylori az emberiség 50%-ában megtalálható, jelenlegi álláspont szerint a terjedés útja feco-oralis, esetleg oro-oralis, így a szeroprevalencia jelentos eltérést mutat az eltéro ökoszociális helyzetu területek között. A H. pylori spirálisan csavarodott vagy ívben enyhén meghajlított, 2-3 ? m hosszú, 0,5-1 ? m átméroju Gram- negatív baktérium. Microaerophil, spórákat nem képez, 1-7 flagellaris horoggal rendelkezo, fejvégu ostora segíti

mozgását,

tenyésztése

speciális

táptalajt

igényel.

A

kórokozót

a

gyomornyálkahártya sejtjeihez való kötodése segíti abban, hogy egy gyors, nem specifikus immunválasz ne tudja eliminálni. Nem tisztázott, hogy ebben az adherenciában transcriptio vagy protein szintézis segíti a baktériumot (106). Az adherencia a kolonizáció biztosításán túl, a direkt epithelkontaktus során bekövetkezo cytosceleton károsítása révén is károsítja a mucosát. A H. pylori kolonizációját segíti, hogy a bakteriális ureázok között egyedülálló - két alegységbol álló enzim segítségével boséges mennyiségu ureáz termelésére képes. Az ureáz az ureát ammóniára és szén-

10

dioxidra bontja, ezzel magasabb pH-jú mikrokörnyezetet képes a gyomor savas közegében teremteni, és ezáltal biztosítja a baktérium túlélését. Ráadásul feltételezheto, hogy az ammónia rediffúzió révén károsítja a nyálkahártyát. Ezt segítheti a kórokozó által termelt lipázok nyákot gyengíto hatása és proteáz termelése, ami a helyi viszkozitás csökkentésével segíti a motilitást. Chemotacticus faktorok termelése révén neutrophil és lymphocytamigrációt okoz, ezzel szabad gyökök, lysosomalis enzimek, tumor necrosis faktorok termelését is beindítja. A fertozést követo gastritis kialakításához

lokális

immunválasz

kiváltása

is

hozzájárul.

Ezt

átmeneti

hypochlorhydria után a fertozést fokozott savsecretio és hypergastrinaemia kíséri. A H. pylori törzsek rendelkeznek vacA génnel, ami a vakuolizáló citotoxintermelést kódolja. Ez egy 34 és egy 58 kD-os fragmentbol álló protein, a kórokozóknak azonban csak 60-65%-a képes termelni ezt az epithelsejtek vakuolizációját és pusztulását okozó toxint. A cagA gén a vakuolizáló citotoxin aktivitás markere, a baktériumok mintegy 60%-a hordozza, ez egy kb. 128 kD-os fehérjét kódol. A cag pathogenitási sziget magasabb arányban fordul elo azokban a betegekben, ahol gyomorrák vagy pepticus fekélybetegség alakul ki, ellentétben azokkal a betegekkel, ahol gastritis fejlodik ki (6). A cagA és vacA gének szoros összefüggése genetikai kapcsolatot feltételez. A vacA genotípusok egy része termel egy másik gyulladást kiváltó citotoxint, az iceA-t (induced by contact with epithelium). A cagI. régión belül pedig leírták a picA és picB géneket, amelyek közül a picB-nek szerepe lehet a H. pylori kiváltotta gyulladásban. In vitro tanulmányok szerint a H. pylori direkt kontaktussal, valamint enzimek és citotoxinok útján károsítja a gyomornyálkahártya sejtjeit, így a fertozött személyekben kialakuló sejtkárosodások nagy részéért felelos lehet (106, 116, 90). Bár számos tanulmány kutatja, hogy milyen szerepe van az egyed fogékonyságának, a környezeti tényezoknek a H. pylorihoz kapcsolódó gastroduodenalis betegségek pathogenesisében, kiújulásában, még mindig nem tisztázott, hogy fertozöttekben miért csak 15%-ban fejlodik ki fekély, és az sem világos, hogy mitol függ, hogy fekély vagy tumor irányába halad a betegség.

11

3. 1. 2 A gyomornyálkahártya vizsgálata

Ma már kétségtelennek tunik, hogy a H. pylori az arra fogékony betegekben képes a gyomornyálkahártya egyensúlyát felborítani. Ennek az egyensúlynak a fenntartásáért két alapveto élettani folyamat felelos, a sejtproliferáció és a programozott sejthalál, más néven apoptosis. A sejtmegújulás a gyomornyálkahártyán – csakúgy, mint az emésztotraktus más területein – gyors. A proliferatív zóna a nyálkahártya mirigyei isthmusának és nyaki régiójának megfelelon, valamint a mirigyek alapján, basalisan található (17, 2). A sejtek érésük során a nyaki régióban két irányba mozognak: a mucinosus sejtek fölfele, a foveolaris zónába, a parietális sejtek és a mucinosus sejtek kis része pedig lefele, a mirigy bázisa felé. Ezalatt a sejtek differenciálódnak, csökken a replikációs kapacitásuk, és végül elhalnak (1. ábra).

1. ábra A gyomornyálkahártya sejtjeinek kétirányú migrációja a sejtosztódás/differenciálódás folyamata során (Anti nyomán).

12

Ha ez az egészséges egyénekben egyensúlyban lévo folyamat felborul és a fokozott proliferáció irányába tolódik el, egyrészt teret ad a replikációs hibák számának növekedésére és a gyorsult osztódásokkal lépést tartani nem tudó repair miatt no a genetikai változások esélye, másrészt a sejtproliferáció során elonyösebb helyzetbe kerülnek a genetikai károsodást szenvedett sejtek, az ossejtek proliferációja pedig növeli a késobbi malignus transzformáció lehetoségét. Amennyiben az egyensúly a sejtpusztulás felé tolódik el, az atrophia vagy fekély kialakulásának kedvez. A kutatócsoportok egyetértenek abban, hogy a felgyorsult sejtproliferáció korai esemény a gyomorrák carcinogenesisében és így jó biomarkere a gyomorrák megnövekedett kockázatának, azonban a fokozott proliferációval párhuzamosan zajló apoptosis változásról kevés illetve ellentmondásos adat áll csak rendelkezésre. A sejtproliferáció mérésére számos technikát alkalmaznak a különbözo kutatócsoportok, de az eltéro módszerekrol csak kevés összehasonlító tanulmány készült, így nehéz eldönteni, hogy melyik módszer milyen pontossággal tükrözi a sejtosztódást (69, 70). A kórokozó proliferációs és kolonizáló képességének vizsgálatára szolgáló módszerek nagyon hatékonyak, ám nagyon idoigényesek. A haemocytometer segítségével történo direkt sejtszámlálás gyors, olcsó és kevés anyagot igényel. Sejtpopulációkban alkalmazhatóak a DNS szintézisen alapuló mérések, mint pl. a [3 H]TdR, BrdU, metabolicus aktivitáson alapul az MTT, XTT (microtiter plate, különbözo terazolium sók felhasználásával) módszer. Amennyiben nem áll rendelkezésre sejttenyészet a vizsgálatokhoz, az osztódás vizsgálható a sejtciklus asszociált antigének kimutatásával immuncytochemiai és immunhistochemiai módszerekkel, ilyenek a Ki67 és a PCNA, vagy vizsgálható a DNS szintézis kimutatásával autoradiographiaval, immuncytochemiai és immunhistochemiai módszerekkel. Ezek közül a módszerek közül a laboratóriumunkban korábban már sikeresen alkalmazott tecnikát, a PCNA-t használtuk és az így kapott eredményeket hasonlítottuk össze egy olcsóbb és gyorsabb módszer, az AgNOR tecnika eredményeivel. A PCNA, vagyis a proliferáló sejt nuclearis antigén egy sejtciklus szabályozó fehérje, a repair mechanizmusban vesz részt. A DNS polimeráz enzim ? ?kofaktora, egy 36 kD súlyú molekula, amely leginkább a késoi G1 és az S fázisban mutatható ki, gyakorlatilag azonban a sejtciklus minden szakaszában megtalálható. A G1 és az M fázisokban akkumulálódik, a mitózis végére eltunik. Az evolúció során szerkezete nagyrészt

13

megorzodött, növényekben is megtalálható, emberi borben ultraibolya sugárzás hatására megjelenik (30, 33). Az adatok azonban arra utalnak, hogy ez a módszer a DNS polimeráz hosszú fél-életideje miatt kissé túlbecsüli az osztódó sejtek arányát (23). A PCNA módszerrel a H. pylori pozitív gastritisben kialakult DNS károsodáson átesett sejtek túléloi (az úgynevezett malgun sejtek), nemcsak a proliferációs zónában, hanem a felszínen is pozitív festodést mutatnak, míg Ki67-tel csak a proliferációs zónában festodnek ezek a sejtek (58). Az AgNOR technika a nucleolaris organizátor régiókhoz kötött proteinek jelenlétét mutatja ki az interfázisban, a riboszóma szintézist reprezentálja. Méretük és számuk utal a sejtproliferáció ütemére, a transzformációra, cytometriával mért aneuploidiával korrelálva a malignus elfajulásra. Sigmabélben és rectumban vizsgálva az AgNOR-ok mérete és száma negatívan korrelál egymással, jóindulatú elváltozásokban kevés, de nagy méretu dot, carcinomában azonban kisebb, de több dot figyelheto meg (91, 126). A módszert eredményesen alkalmazták, pl. lymphomák, lágyrész tumorok, tüdo tumorok diagnosztikájában (15, 96), és számos szerzo beszámol arról, hogy az emésztorendszeri elváltozások meghatározásában is értékes segítséget jelenthet. Rüschoff az AgNOR technika értékének bizonyítására meningeomát, vese- és hólyag tumorokat vizsgált, és azt találta, hogy a módszer könnyen kivitelezheto, olcsó, jól reprodukálható, ezen felül kiválóan alkalmazható mind formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszeteken, mind pedig cytologiai mintákon. Az eredmények jól korrelálnak az osztódó sejtek arányával, és alkalmasnak tunik a tumorok osztályozására (92). Gyomorcarcinomás betegekben összefüggést találtak az AgNOR paraméterek változása és a nyirokcsomó metastasisok megjelenése között, így a módszer alkalmas a klinikai prognózis megítélésére (49, 41). Az AgNOR gyomorban is, colonban is független prognosztikai paraméternek bizonyult, ezért preoperatív vizsgálatként javasolják a tumor agresszivitásának megítélésére, az operáció kiterjesztésének és az adjuváns therapiának a kiválasztására (49, 91, 130). Számos tanulmány alátámasztja azt, hogy az AgNOR mutatók szorosan korrelálnak a többi proliferációs módszer eredményeivel (130, 30). Az irodalomban azonban fellelheto olyan adat is, miszerint az adenocarcinomás betegek prognózisa és az AgNOR szám között nincs összefüggés, és a formalinban történo fixálás zavarhatja a NORasszociált proteinek detectálását (31).

14

A homeostasis fenntartásáért a proliferáció mellett a programozott sejthalál felelos. Az apoptotizáló sejteket azonban nehéz fénymikroszkóppal vizsgálni, ráadásul a vizsgálómódszerek standardizálása is nehéz, mivel minden módszer igen érzékeny a protokoll minimális változtatására. A vizsgálatot nehezíti, ha egyidejuleg gyulladás is fennáll, azonban az apoptosist fémjelzi az endonukleázok által okozott, lépésrol- lépésre bekövetkezo DNS degradáció, minek során a kettosláncú DNS spirálból rövid fragmentumok töredeznek le. Ezek detectálására dolgozták ki a ma már széles körben elfogadott

módszert,

a

terminális

deoxynucleotidyl

[TdT]- mediált

deoxyuridinetriphosphate [dUTP] nick end labelling (TUNEL) technikát (74), amely során a feltöredezett kettosszálú DNS rövid fragmentjeinek 3’ szabad végét jelölik terminális uridin transferase segítségével. Kasagi 1994-ben eloször használta ezt a módszert gyomorcarcinoma vizsgálatára. Elotte a rutin histologiai módszerekkel a morfológiai változások rövid idotartama és a látszólag alacsony incidenciája miatt az apoptosis csak nehezen volt detectálható, így a pathológusok rendszerint csak kevés figyelmet fordítottak erre a mechanizmusra a gyomorrák vizsgálata során. TUNEL- lel azonban jól differenciált carcinomában alacsonyabb apoptosis indexet találtak, mint a rosszul differenciált carcino mában, ami magyarázhatja utóbbi lassúbb növekedési ütemét (50). A jelenlegi adatok alapján úgy tunik, hogy a H. pylori fertozés során bekövetkezo változások egyik kulcsfontosságú kérdése az apoptosis indukálása. Nem tisztázott, hogy ezt direkt mechanizmus útján képes elérni, vagy indirekt módon, a gyulladásos reakció kiváltásával. Moss eredményei a direkt mechanizmust valószínusítik, mivel nem találtak korrelációt az apoptotizáló sejtek aránya és a gastritis foka között. A H. pylori fertozésre bekövetkezett apoptosis fokozódás stimulusa lehet a kompenzatorikus hyperproliferativ és potenciálisan preneoplasticus válasznak (71). Wagner adatai alapján a H.pylori direkt mechanizmus útján fokozza az apoptosist. A fertozés hatására növekedés gátlást tapasztalt, amit kompenzatorikus DNS szintézis fokozódás kísért. Ez nagy H. pylori koncentráció mellett megszunt, mivel a kórokozó direkt gátolta a DNS szintézist (117). A 2. ábra azt szemléltei, hogy hogyan változtatja meg a H. pylori fertozés a gyomornyálkahártya homeostasisát.

15

2. ábra A gyomornyálkahártya sejtjeinek forgalma egészséges és H. pylori-asszociált betegségekben (Wagner nyomán) : gyomor nyálkahártya sejt,

: proliferáló epithel sejt,

: apoptotizáló epithel sejt

Már a H. pylori fertozésnek a gyomor carcinogenezisében betöltött szerepére irányuló kutatások sorozata elott kitunt, hogy egy soklépcsos, multifactorialis folyamatról van szó. A carcinogenezisre vonatkozó modellek közül ma a Correa által 1992-ben felállított modell a legszélesebb körben elfogadott, miszerint a többlépcsos folyamat chronicus gastritisen, atrophián, intestinalis metaplasián, dysplasián át vezet carcinomához (12). Munkánkban mi is ezt a modellt vettük alapul, és mivel úgy tunik, hogy intestinalis metaplasiában a molekuláris változások még visszafordíthatók és a H. pylori fertozés hatása is más, mint a korábbi stádiumokban, figyelmünket erre az állapotra fordítottuk. Scotiniotis azt tapasztalta, hogy a H. pylori infekció fokozta az apoptosist és a proliferációt is, azonban intestinalis metaplasiában már csak a

16

proliferáció fokozódás volt megfigyelheto, az apoptosis mértéke változatlan maradt, így feltételezi, hogy intestinalis metaplasiában ez a változás már visszafordíthatalan, így ez lehet a gyomor carcinogenesisének kulcslépése (97). A 3. ábra összefoglalja a H. pylori indukált apoptosis feltételezett szerepét a gyomor carcinogenesisében. A sejtosztódást fiziológiás és pathologiás körülmények között is számos tényezo befolyásolhatja. Ezek közé tartoznak a növekedési faktorok, amelyekrol az utóbbi évtizedekben egyre szélesebb köru ismeretanyag áll rendelkezésre. Az 1962-ben elsoként azonosított növekedési faktor, az epidermalis növekedési faktor (EGF) és a vele rokon növekedési faktorok fontos szerepet töltenek be a gyomornyálkahártya védelmében és gyógyulásában. Az EGF egy 53 aminosavból álló saválló, mitogén fehérje, gátolja a sav secretiot, védi a nyálkahártyát az akut károsodással szemben, befolyásolja annak alkalmazkodó képességét, és mind kísérleti, mind pedig klinikai körülmények közt gyorsítja a gyomorfekély gyógyulását. Képes redukálni számos külso noxát, mint pl. az aszpirin, az etanol, a taurokolát hatását, és csökkenti a stressz és az ischaemia gyomor és vékonybél károsító hatását (78, 51, 16). A gyomor valószínuleg nem szintetizál EGF-t, a benne található EGF nagy része a nyálból származik, kisebb részét a Brunner- mirigyek és egy UACL (ulcer-associated cell lineage)-nek nevezett mirigyes struktúra szekretálja (84). A legfontosabb EGF-szeru növekedési faktort, a TGF-? -t a normál gyomorban a nyaki régió mucinosus sejtjei termelik. Az EGF és TGF-? biológiai hatásai hasonlóak, bár az EGF háromszor hatékonyabbnak bizonyult. A TGF-? önmagában is képes fokozni a migrációt, a proliferációt és gátolni a sav secretiot, a TGF-? -val összhangban, pedig in vitro körülmények között a sejt transzformációban van szerepe (69, 85). Az EGF-nek nagy szerepet tulajdonítanak a fekély pathogenesisében és gyógyulási folyamatában, Calabro aktív és inaktív fekélyben is azonos mértéku expressziót mért, míg gyógyult fekélyben azt az egészséges nyálkahártyáéval megegyezo mértékunek találta (7). Ezen kívül, állatkísérletek alapján, szerepet játszhat a portalis hypertensiot követo regenerációban is (118).

17

H. pylori fertozés

H. pylori által termelt toxikus molekulák

Gyulladásos/immun válaszok és

Pl.: ureáz, polyliposacharid, phospholipázok,

szabad oxigén gyökök

VacA stb.

felszabadítása, mint pl. a nitrogén-oxid, TNF-? , IL-8, IFM-?, stb.

Atrophiás gastritis

Intestinalis metaplasia,

apoptosis

Sejt proliferáció

dysplasia

DNS károsodás

génmutáció, mint pl. p53, bcl-2, stb.

Neoplasia 3. ábra H. pylori által indukált apoptosis feltételezett szerepe a gyomor carcinogenesisében. (

) stimuláció vagy indukció, (

) gátlás vagy szuppresszió (Xia nyomán)

Az EGF és a TGF-? hatásukat egy közös specifikus receptoron fejtik ki. Az EGF receptor gén amplifikációját és fokozott expresszióját többféle tumorban leírták, mint pl. agy, emlo, oesophagus és egyéb fej-nyaki tumorokban is (105, 60, 36, 46, 25). Az EGFR amplifikáció gyomorrákban kevesebbnek bizonyult, mint egyéb humán tumorokban (34). A receptornak két típusa ismert, az I. típusú EGFR expressziója gyomorrákban ritkán, míg a II. típusú EGFR expressziója gyakran fokozott. Utóbbi homológ a c-erb-B2 protooncogennel, ami szerepet játszik az emlo carcinoma

18

pathogenesisében és korrelál a relapsussal és a túléléssel (105). Az EGF receptor egy 170 kD-os glycoprotein, áll egy sejtfelszíni ligand-köto domainból, egy egyszeru hydrophob transmembran domainbol és egy sejtplazma tirozin kináz domainbol. Az extracellularis domain köti meg a receptor-specifikus ligandokat és aktiválja a sejtplazma domaint, ami beindít egy cascade folyamatot a sejtplazmából a sejtmag fe lé, ami végül mitogenezist eredményez. Amikor létrejön a receptor- ligand kötodés, a receptor- ligand komplexek csoportosulása, dimerizációja és internalizációja következik be. Az EGFR egy aktin köto fehérje, ráadásul az EGF által triggerelt signal transductio egyéb cytoskeleton asszociált komponenseket is magában foglal, mint pl. DAG kináz, PI kináz, PLC-?? Ez a kapcsolat a cytoskeleton és az EGF triggerelt cascade között magyarázhatja az EGF indukált sejtmigráció mechanizmusát. (34, 84, 78). Mivel az EGFR foleg az enterocyták basolateralis membránján található meg, normál bélben a lokálisan termelt TGF-? hozzáférhet a receporhoz, ezzel szemben az EGF, ami csak a lumenben van jelen, nem képes hozzáférni a receptorához. Ehhez járul, hogy az EGFR eloszlás a nyálkahártya károsodása során megváltozhat, ami arra utal, hogy míg a TGF-? elsosorban a normál növekedésben és differenciálódásban vesz részt, addig az EGF a repair stimulálásában játszhat nagyobb szerepet (84). Az EGFR expresszió a nyaki régióban a proliferációs zónában az apicalis és basolateralis membránon figyelheto meg, mint a proliferáció stimuláció célpontja, valamint néhány parietalis sejten, ami a lehetséges savsecretio gátlást jelzi (1, 113). Állatkísérletek alapján az EGFR a nyálkahártya károsodás bekövetkezése után a repair mechanizmus késobbi, lassúbb fázisában vesz részt, amikor az elveszett sejtek sejtosztódás által pótlódnak és ebben az EGFR tirozin kináz aktivitása játssza a fo szerepet. Ez a reparatív képesség az öregedés folyamán csökken (61). Gyomorban az EGFR szerepét a legtöbb tanulmány a fekélygyógyulás folyamán illetve a kifejlett gyomorrák eseteiben vizsgálja. A fekélybetegségben és a gyógyulás folyamán is igen magas EGFR expresszió mérheto (a normál nyálkahártyához képest 75-szörös emelkedés), és a gyógyulás után még 1 cm-re az ép mucosaban is emelkedett értékek detectalhatók (113, 78). EGF jelenléte humán gyomorrákban több szerzo adatai alapján is egy magasabb malignitási potenciált tükröz. A fokozott EGFR expresszió rossz prognoszt ikus jel, gyorsabb nyirokcsomó áttét megjelenésével kell számolni (34, 127, 115, 39). Arról azonban, hogy hogyan változik az EGFR expresszió a carcinogenesis

19

során, vagy hogyan befolyásolja annak mértékét a H. pylori infekció, csak kevés és ellentmondásos adat áll rendelkezésre. A H. pylori fertozés kapcsán bekövetkezo változások sorozatában további tisztázásra vár az a kérdés, hogy a H. pylori fertozés hatására kialakuló sejtkinetikai változások mennyire függetlenek az egyed genetikai tulajdonságaitól. Egy esetleges genetikai instabilitás szerepét tisztázhatja a p53 oncoprotein expressziójának vizsgálata. Humán tumorokban valószínuleg a leggyakoribb mutáció a p53 gén mutációja (69). Elofordulása igen gyakori tüdo, oesophagus, hólyag, colon és szájüregi tumorokban, de leírták egyebek között pancreas, gyomor, ovarium és emlo tumorokban is (75, 108). P53 expressziót metastaticus szövetben is sikerült kimutatni (125). A p53 tumorszupresszor gén a 17-es kromoszóma rövid karján található. Szerepe a normális sejtciklus szabályozásában van, a G-S fázisba történo átmenetet gátolja (101). Fél-életideje normális sejtekben rövid, így az általa kódolt fehérje nem éri el a kimutatható mennyiséget. A mutáns p53 gén terméke esetében a fél-életido megno, így az már kimutatható mennyiségben felszaporodhat. Úgy tunik, hogy normális muködés esetén a mucosa károsodásakor a p53 gén aktiválódik, és amíg a hiba nem szunik meg, a sejtproliferáció gátlódik. Ha pedig a hiba hosszabb ideig fennáll, az apoptosis mértéke fokozódik (4, 64). A p53 oly módon képes részt venni a tumor szuppresszióban, hogy leállítja a sejtciklust és ezzel utat ad a DNS repair mechanizmusnak, vagy pedig apoptosishoz vezet (108, 132). Ellentmondásos eredmények születtek arra vonatkozóan, hogy a fokozott p53 expressziónak a carcinogenesis során melyik stádiumban van jelentosége, korai vagy késoi eseménynek tekintendo-e az elváltozás (20, 28, 48, 88, 121). A gyomor adenocarcinomájában a 17p helyen történo mutáció elofordulása 36 és 64% közötti (131). A bekövetkezett mutáció a különbözo területeken homogén eloszlást mutat (5). Csak a vad-típusú p53 képes szupprimálni a ráksejtek burjánzását, a mutáns típus nem. Ezt bizonyítja Matozaki vizsgálata, ami során gyomorrákban azt találta, hogy egy p53 gén elveszett, a megma radó allélon pedig pontmutáció volt megfigyelheto, és így elveszett a p53 gén produktuma okozta sejtnövekedés szupresszió. A pontmutációt a 173-as és a 251-es kodonokon találta, ami egyéb tumorokban igen ritkán figyelheto meg. Állatkísérletek azt bizonyítják, hogy a vad-típus segít megelozni a H. pylori indukált carcinogenesist is (69, 64).

20

A vizsgálatok jelentos része a p53 mutációját csak tumoros elváltozásokban vizsgálja. Ezek alapján megállapítható, hogy intestinalis típusú gyomorrákban sokkal gyakoribb az elofordulása, mint a diffúz típusúban. Az intestinalis típusban észlelheto 50% feletti mutációs arány a tumor stádiumával nem változott, diffúz típusban azonban szignifikánsan magasabb exprssziós arány figyelheto meg az elorehaladott állapotban a korai carcinomához viszonyítva (64, 122). Az intestinalis típusú gyomorrák magasabb incidenciája magyarázhatja, hogy több szerzo beszámol arról, hogy nem talál összefüggést a p53 mutáció megjelenése és a tumor differenciáltsági foka között, ugyanis ezekben a tanulmányok a carcinoma típusát nem veszik figyelembe (48, 64). Több szerzo vizsgálata mutatja, hogy a p53 expresszió összefügg a túléléssel. A közepes p53 indexek jobb prognózist jelöltek, mint a negatív és magas indexek, ahol szignifikánsan alacsonyabb túlélési idot találtak (62, 98, 32). A tumorok pathologiai jellemzoi, mint a nyirokcsomó infiltráció, az invázió mélysége, a nekrózis vagy az érfal érintettség, valamint a tumor stádiuma és differenciáltsági foka azonban nem mutatott szignifikáns eltérést a p53 pozitív és p53 negatív tumorok között (32). Érdekes megfigyelés, hogy erosen dohányzó egyéneknél és vinyl- chlorid expoziciónak kitett személyeknél is magas p53 index figyelheto meg, ami hasznos lehet a tüdocarcinoma és a máj angiosarcomájának korai felismerésében (108). Ellentmondásos eredmények születtek arra vonatkozóan, hogy a carcinogenesis során melyik stádiumban jelenik meg a p53 mutáció. Normál nyálkahártyán p53 expresszió nem figyelheto meg (122, 48, 64), azonban Shiao „ép megjelenésu” nyálkahártyán 25%ban detectált p53-at, ami azt mutatja, hogy egészséges egyének mucosáján is elofordulhatnak mutáns p53 gént hordozó sejtek (99). Ellentmondó adatok találhatók a gyomor adenomájára vonatkozóan is, van, aki egyáltalán nem detectált p53 expressziót, van, aki azt már irreverzibilis elváltozásnak találta (56, 128). Néhány tanulmány beszámol arról, hogy már gyulladásban is bekövetkezik a mutáció, sot összefüggés mutatkozik a H. pylori fertozés és a p53 expresszió között (42, 73). Szignifikáns összefüggés figyelheto meg a proliferatív zóna destructioja és a p53 expresszió között is (95). Intestinalis metaplasiaban a p53 akkumuláció a generatív zónában figyelheto meg, 22 és 50% közötti elofordulási arányról számolnak be (65, 99, 73, 28, 119, 42, 128). Még dysplasiában is igen eltéro elofordulási arányokról számolnak be az egyes szerzok, Joypaul és munkacsoportja enyhe és közepes fokú dyspalsiában egyáltalán nem, csak a

21

súlyos fokú dysplasiában mutatott ki p53 expressziót, így késoi eseménynek tekinti a p53 mutációt a gyomor carcinogenesisében (48), Miracco szintén csak súlyos fokú dysplasiában talált p53 expressziót (66). Mások dysplasiában akár 67 %-os incidenciát is kimutattak, így ok korai eseménynek tartják a soklépcsos folyamatban (99, 64, 119). Wu és munkatársai pedig az intestinalis típusú carcinoma mellett megtalálható metaplasiás területeken talált p53 expressziót, a diffúz típusnál nem, így az intestinalis típusú carcinoma kialakulása során korai eseménynek, diffúz típusú carcinoma kialakulása során pedig késoi eseménynek tekinti (121). Azzal, hogy ismertté vált az összefüggés a H. pylori fertozés és a fekélybetegség illetve a gyomorrák pathogenesise között, új therapias lehetoség került elotérbe. Mivel rendelkezünk a kórokozó ellen hatékony antibiotikummal, kézen fekvonek tunt a megoldás a kezelést illetoen. Fekélybetegségben a kórokozó kiirtása sokszor végleges gyógyuláshoz vezet, gyomorrák esetében azonban ez nem jelent megoldást, és jelenleg csak akkor van esélyünk sikerre, ha a kórokozó eradikációjára irányuló therapia még abban a stádiumban történik, amikor még nem következett be irreverzibilis elváltozás. Így kulcsfontosságú annak tisztázása, hogy a carcinogenesis soklépcsos folyamatának melyik stádiumában lehet még visszafordítani a H. pylori okozta sejtkinetikai változásokat, és fontos lenne egy (vagy több) olyan mutatót találni, amely jelzi ezt a pontot. Az

eradikációs

kezelés

hatásáról

született

eddigi

eredmények

meglehetosen

ellentmondásosak. Született olyan eredmény, ahol intestinalis metaplasiában a proliferáció üteme eradikáció után már nem csökkent vissza a normális mértékure, arra utalva ezzel, hogy ebben a stádiumban a proliferáció fokozódás már a baktériumtól független (38). Leung és munkatársai ezzel szemben azt találták, hogy kezelés után a gyorsult sejtproliferáció intestinalis metaplasiaban is és nem mataplasticus szövetben is szignifikánsan csökkent, az apoptosis ütemének helyreállását azonban csak a nem metaplasticus szöveten tapasztalták, intestinalis metaplasiaban változatlan ma radt (59). Xia összefoglaló tanulmányában azt állapítja meg, hogy az eradikációs kezelés intestinalis metaplasiaban is visszacsökkentette az apoptosist (124), míg Moss sikertelen eradikációs kezelés után is a mutatók normál értékekhez való közelítését észlelte (69).

22

3. 2 Célkituzések

A H. pyori fertozés carcinogenesisben betöltött szerepével igen nagy számú tanulmány foglalkozik, eredményeik azonban sokszor kulcsfontosságú kérdésekben is ellentmondásosak. Dolgozatomban igyekeztem összegezni az irodalomban jelenleg leginkább elfogadott eredményeket és álláspontokat. Munkám egyik célja volt megvizsgálni, hogy a H. pylori fertozés milyen módon vezethet a homeostasis felborulásához. A proliferatív és apoptoticus folyamatok párhuzamos mérésével igyekeztem tisztázni, hogy a H. pylori a proliferáció fokozásán keresztül vezethet-e carcinoma kifejlodéséhez, vagy a hyperproliferáció csak a fertozésre adott nem specifikus gyulladásos válasz részjelensége, esetleg képes direkt módon apoptosist indukálni, és atrophiás gastritis kifejlodése révén fokozni a gyomorrák kockázatát. A sejtosztódás vizsgálatára két módszert is alkalmaztam. A már elfogadott, ám idoigényes és drága immnuhistochemiai technika, a PCNA mellett AgNOR technikával is mértem a sejtosztódás ütemét. Az eredmények összevetésével igyekeztem bizonyítani, hogy az AgNOR technika gyors, olcsó és megbízható módszer, így jól alkalmazható a mindennapi klinikai gyakorlatban is. A gyomor carcinogenesisében legnagyobb probléma megadni azt a pontot, ahol a preneoplasticus laesio malignussá változik. Mivel a gyomor esetében még nem sikerült egy olyan kulcsfontosságú mutációt kimutatni, mint pl. az APC oncosupressor gén mutációja a colon carinogenesie során, további célkiuzés volt megvizsgálni a H. pylori által okozott genetikus instabilitás esetleges szerepét is. Ezzel párhuzamosan megmértem, hogy hatással van-e a H. pylori fertozés az EGR expresszióra, és ez összefüggésben áll-e a sejtkinetikai paraméterek változásaival. A kutatómunka további feladata volt, hogy fényt derítsen arra, hogy a proliferációs és apoptoticus aktivitás, a p53 oncoprotein expresszió és az EGFR expresszió hogyan változik a premalignus laesioként ismert intestinalis metaplasiában. Az így kapott eredményeket összehasonlítottam a nem metaplasticus, valamint a tumoros epitheliumon mért eredményekkel.

23

Munkám célja volt ezen kívül, hogy megvizsgáljam a H. pylori eradikációs kezelésének hatását a fent említett paraméterekre, és megjelölni azt a pontot, ahol az elváltozások még reverzibilisek és a kezelés elvégzése feltétlenül szükséges.

?

24

4. Beteganyag és módszerek 4. 1 Beteganyag ? A vizsgálatban 121, a II. Belklinika Gastroenterologiai Ambulanciáján a has felso részére lokalizálódó panaszok miatt jelentkezett, és felso panendoscopos vizsgálatra került beteg vett részt. Átlagos életkoruk 58,5 + 14,3 év volt, közülük 60 férfi és 61 no. A legfiatalabb beteg 24, a legidosebb 90 éves volt. A kiválasztott betegek egyike sem volt korábban ismert fekélybeteg, nem részesült eradikációs kezelésben és nem szedett tartósan nem szteroid gyulladás gátlót sem. (1. táblázat). A vizsgálat idopontjában a betegek 6,6 %-a számolt be rendszeres, 33 %-a alkalmankénti alkohol fogyasztásról, 32,2 %-uk napi 5-15 szál cigarettát szívott.

Nemek szerinti megoszlás (ffi/no)

60/61

Átlagéletkor

58,5 + 14,3

Eradikációs kezelésben részesültek

44

Ebbol sikeres eradikáció

36

Összesen

121 eset

1. táblázat A vizsgált betegek nem és életkor szerinti eloszlása, eradikációs kezelésben részesültek száma

A betegeket a gastroscopiákat végzo szakorvos szóban és írásban tájékoztatta a vizsgálat menetérol, majd a betegek írásbeli beleegyezésüket adták. Minden betegnél rutin felso gastroscopia történt. A vizsgálatokat Olympus GIF V2 és Olympus CFQ-140 készülékekkel végezték. A vizsgálatok során biopsziás mintát vettek az antrumból, amelyet azonnal formalinban fixáltak, majd az I. sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben paraffinba ágyaztak, itt történt az esetek szövettani értékelése is, amelyet minden esetben pathológus végzett. Itt készültek a 3 ? m vastag metszetek, majd a szövettani feldolgozáshoz haematoxylin-eosin festéssel festették meg oket. Ezek értékelésekor a metszeteket négy csoportba soroltuk be, a következo képpen: ép

25

nyálkahártya, gyulladás, intestinalis metaplasia és carcinoma. Minden metszetet megvizsgáltak módosított Giemsa festéssel is, így 52 esetben volt megállapítható H. pylori pozitivitás. A 121 eset szövettani feldolgozásának eredményét a 2. táblázat foglalja össze.

Ép nyálkahártya

15

Gastritis, intestinalis metaplasia nélkül - H.pylori negatív

34

Gastritis, intestinalis metaplasia nélkül - H.pylori pozitív

40

Gastritis, intestinalis metaplasiával – H.pylori negatív

12

Gastritis, intestinalis metaplasiával – H.pylori pozitív

12

Carcinoma

8

Összesen

121 eset

2. táblázat A vizsgált esetek szövettani diagnózis szerinti eloszlása

Azokban az esetekben, ahol a szövettan H.pylori pozitivitást talált, az eradikációs kezelés lehetoségét az elso Maastrichti Consensuson tett javaslat alapján mérlegelték (63), így összesen 44 esetben történt kezelés. Ez egy hétig tartó, hármas kombinációval történt: 2 x 1g amoxycillin + 2 x 0,5g clarythromycin + 2 x 20mg omeprazole. Négy héttel a kezelés befejezése után kontroll endoscopia és biopszia vétel történt. Az eradikáció sikerességének leméréséhez elvégezték a

13

C-urea kilégzési tesztet is

(Infrared spectrophotometer, Wagner Analytic System, Germany). A kezelés 36 esetben volt elso próbálkozásra sikeres.

4. 2 A sejtproliferáció vizsgálata

A sejtproliferációt kétféle módszerrel vizsgáltuk: az egyik egy immunhistologiai módszer, a PCNA volt, amely idoigényes, de korábbi tanulmányainkban már sikeresen alkalmaztuk (111), a másik pedig az AgNOR technika volt, amely egyszeru, gyorsan kivitelezheto

és

szintén

elvégezheto

26

paraffinba

ágyazott

metszetekbol.

4. 2. 1 PCNA meghatározás A paraffinba ágyazott biopsziákból 3 ? m vastagságú metszetek készültek. A metszeteket xylolban történt deparaffinálás után leszá lló alkoholsorban rehydráltuk. Ezután 3%-os H2 O2-ban 5 percig endogén peroxidáz bénítás történt, amit kétszer 5 perces PBS-es lemosás után pH 7,5-os citrát pufferben való inkubálás követett mikrohullámon (5 percig, 75O W-on). Ezt újból kétszer 5 perces PBS-es lemosás követte, majd a nem specifikus ellenanyagokat 1%-os bovin szérum albuminnal gátoltuk szobahon, nedves kamrában 20 percig. Ezt az elsodleges antitesttel történo inkubáció követte (Monoclonal Mouse Anti PCNA Clone PC 10, DAKO), 37 fokon, 90 percig, nedves kamrában, 1:80-as higításban. Majd háromszor 5 perces PBS-es lemosás következett. Ezután a metszeteket 30 percig biotinnal jelölt másodlagos antitesttel inkubáltuk szobahon 60 percig, ismét öblítettük PBS-ben kétszer 5 percig, majd a metszeteket 37 fokon 25 percre streptavidin peroxidázba helyeztük. Újabb kétszer 5 perces PBS-es lemosás után a metszeteket chromogénnel elohívtuk, chromogénként 3amino-9-ethylcarbazolt használtunk, majd haematoxylines háttérfestést alkalmaztunk. Pozitív kontrollként ismert PCNA-pozitív metszetet használtunk, negatív kontrollként pedig az egyik metszetet elsodleges antitest helyett PBS-ben hagytuk. Az értékelésnél az elváltozást reprezentáló területrol 40-szeres nagyítás mellett 1000 sejtet számoltunk meg, a pozitívan festodött sejtek számát százalékos arányban adtuk meg. ? 4. 2. 2 A nucleolaris organizátor régiók detektálása

Az egylépcsos ezüstözési technikát Crocker után kis módosításokkal végeztük (15). A paraffinba ágyazott biopsziákból ebben az esetben is 3 ? m vastagságú metszetek készültek. A metszeteket ennél a módszernél is xylolban deparaffináltuk, majd leszálló alkoholsorban rehydráltuk. A mintákat ezután 32 percig inkubáltuk sötétkamrában, frissen eloállított ezüst kolloid használatra kész oldatában. Az optimális festési idot szigorú ellenorzés mellett elozetesen határoztuk meg. Az oldatot a következo képpen készítettük: 50 ml desztillált vízben 1 g zselatint feloldottunk, ehhez 0,8 ml hangyasavat

27

adtunk (I.oldat); 50ml desztillált vízben 25 g AgNO3 -ot feloldottunk (II.oldat); az I.oldatból 25 ml- t adtunk a II.oldat 50 ml-éhez. Háromszor 1 perces desztillált vizes lemosás és leszálló alkoholsorban történt dehydrálás, majd xylolos tisztítás után a metszeteket lefedtük. Ellenfestésre nem volt szükség. Ezt követoen 100-szoros nagyítású, immersios lencsét használva, metszetenként 200 sejtmagot megvizsgálva, abszolút AgNOR számot számoltunk a mirigyek nyaki régiójában. A NOR régiók detectálásra elozetesen kipróbáltuk az Öffner által javasolt nedves autoklávban történo elokezelést is (77), ám az elokezelt és az elokezelés nélkül egy lépcsoben festett metszetek eredményei között nem volt különbség, így azt a továbbiakban szükségtelennek láttuk alkalmazni.

4. 3 Apoptosis vizsgálata

Az apoptosis vizsgálatára számos cég kidolgozott jól alkalmazható és már bevált módszereket (pl. caspase-ok és az ezzel összefüggo reagensek, Fas ill. Fas ligand család tagjai, Bcl-2 család tagjainak vizsgálata, DNS festés permeabilizálás után ill. anélkül, stb.). Módszerünk kiválasztásánál fontos szempont volt, hogy a vizsgálatot el tudjuk végezni a már meglévo, paraffinba ágyazott biopsziákból, valamint a reagensek árát is figyelembe kellett vennünk.

4. 3. 1 A TUNEL reakció

A reakció elvégzéséhez módosításokkal a Gavrieli szerint leírt metodikát alkalmaztuk (26). A metszeteket ebben az esetben is eloször deparaffináltuk xylolban, majd rehydráltuk felszálló alkoholsorban. Desztillált vízben 5 percig mikrohullámon (370 W) antigén feltárást végeztünk. Ezután a mintákat 20 percig proteináz K-val emésztettük (20 ? g/ml) szobahomérsékleten, majd kétszer 10 perces PBS-es lemosás után endogén peroxidáz bénítás következett 3%-os H2 O2 / methanolban 30 percig szobahon. Kétszer 10 perces PBS-es lemosás után a metszeteket elokezeltük 5 percig szobahon terminális

28

transfer pufferrel (200 mmol/l kálium cacodylate, 25 mmol/l TRIS-HCl, pH 6,6, 0,2 mmol/l EDTA, 0,25 mg/ml bovin serum albumin), majd TUNEL reakció eleggyel inkubáltuk (terminális transferase puffer, 1 mmol/l CoCl, 0,01 nmol biotin 16-dUTP és 0,5 U/? l terminális transferase (Boehringer Mannheim, Germany)). A reakcióelegy fényérzékeny, így a lemezeket alufóliával takartuk a reakció ideje alatt. A reakciót nátrium klorid (300 mmol/l) és nátrium citrát oldattal (30 mmol/l) állítottuk le. Ezután inkubáció következett peroxidáz conjugált anti-digoxigenin Fab fragmentekkel 1:300 koncentrációban 100 mM TRIS-HCl, 150mM nátriumban, pH 7,6 30 percig. Háromszor 5 perces PBS-es lemosás következett. Elohíváshoz a metszeteket 3-6 percre DABoldatba

helyeztük,

háttérfestésnek

haematoxylint

alkalmaztunk,

majd

lefedés

következett. Pozitív kontrollként a TUNEL reakció elegy használata elott 10 percig DNázzal inkubált mintát használtunk (1 ? g/ml). Negatív kontrollnál pedig a TUNEL reakcióeleggyel való inkubálást kihagytuk. Minden metszeten 1000 sejtet számoltunk meg, az apoptoticus indexet a pozitívan festodött sejtek százalékos aránya adta.

4. 4 EGFR kimutatás

Az EGFR receptorok detectálására ismét immunhistochemiai módszert alkalmaztunk. Deparaffinálás és rehydrálás, majd kétszer 5 perces desztillált vizes lemosás után 30 percig szobahomérsékleten 30%-os H2 O2 és methanol 1:100 arányú keverékében endogén peroxidáz blokkolást végeztünk. Kétszer 5 perces PBS-es lemosás után antigén feltárás következett pH 6, 0,01 M-os citrátpufferben kétszer 7 percig, mikrohullámon (700 W). A nem specifikus ellenanyagok blokkolására anti- nyúl szérumot használtunk nedves kamrában, szobahomérsékleten, 20 percig. Ezután következett az elsodleges antitesttel történo inkubálás (EGFR (1005)-G: sc-03-G, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 90 percig nedves kamrában, 37 fokon. Ezt háromszor 5 perces PBS-es lemosás követte, majd a biotinilált másodlagos antitesttel inkubáltuk a metszeteket szobahomérsékleten, 60 percig, szintén nedves kamrában. Kétszer 5 perces PBS-es lemosás után 60 percre streptavidin peroxidázzal fedtük a metszeteket, továbbra is szobahomérsékleten, majd az ismételt lemosás után következett a DAB-bal történo elohívás, ami 10 másodpercenkénti

mikroszkópos

ellenorzés

29

mellett

2

perc

után

tunt

a

legmegfelelobbnek metszeteink esetében. Csapvizes lemosás után haematoxylines háttérfestést alkalmaztunk. Felszálló alkoholsorban történt dehydrálás után a metszeteket négyszer 1 percre helyeztük xylolba, majd DePex-szel fedtük le azokat. Pozitív kontrollként ismert EGFR pozitív chronikus pancreatitisbol származó metszeteket használtunk, negatív kontrollként pedig egy metszetet elsodleges antitesttel való inkubálás helyett PBS-ben hagytunk. A kiértékelésnél a többi módszerhez hasonlóan jártunk el: 40-szeres nagyítás mellett az elváltozást reprezentáló területrol történt 1000 sejt megszámlálása után a pozitívan festodo sejtek arányát százalékosan adtuk meg.

4. 5 Oncoprotein expresszió vizsgálata - p53 kimutatás

Az elozo vizsgálatnál leírtakhoz mindenben hasonlító immunhistochemiai módszert alkalmaztunk ebben az esetben is. A 3-5 ? m vastagságú metszeteket deparaffináltuk és rehydráltuk xylolban és leszálló alkoholsorban. Ezt endogén peroxidáz bénítás követte 3%-os H2 O2 /methanol keverékében, 30 percig. PBS-ben való lemosás után antigén feltárás következett, a metszeteket 2 x 7 percig kezeltük mikrohullámon, citrátpufferben (0,01M, pH 6). Kihulés után ismét mosás következett PBS-ben, majd a metszeteket 20 percig inkubáltuk normális nyúl szérummal nedves kamrában. Ezt a liofilizált elsodleges antitest alkalmazása követte, teljes éjszakai inkubációs idovel (Novocastra, UK). PBS-es lemosás után 30 percig inkubáltuk a metszeteket biotinilált nyúl anti-egér másodlagos antitesttel. Ismét lemosás következett, majd a metszeteket ABC-vel (avidinbiotin-complexszel) fedtük 30 percre. Chromogénként DAB-ot, háttérfestésnek haematoxylin- eosint alkalmaztunk, majd dehydrálás után fedtük a lemezeket. Pozitív kontrollként ismert p53 pozitív kissejtes tüdorákot használtunk, negatív kontrollként pedig ugyanilyen metszetet elsodleges antitest helyett PBS-be helyeztünk. A metszetek értékelése is az eddigiekhez hasonlóan történt, a kiválasztott területrol megszámlált 1000 sejtbol adtuk meg a pozitívan festodoek százalékos arányát. ?

30

4. 6 Statisztikai módszerek

Az egyes paraméterek jellemzése a középértékek és a szórások megadásával történt. Az adatok elemzésekor egyváltozós variancia anlízist (Kruskal-Wallis) és LSD (legkisebb négyzetes eltérés) tesztet alkalmaztunk. A paraméterek és a szövettani csoportok közötti összefüggéseket Pearsons- féle korrelációs koefficiens számolásával elemeztük. Az alkalmazott proliferációs módszerek összehasonlításánál kiszámítottuk a Spearman- féle rangkorrelációs együtthatót is, ami robosztusabb eredményt ad, mivel a rangsorolással kiküszöböli az adatok tényleges eloszlásának a hatását. A null hipotézist minden esetben p < 0,050 szignifikancia szint esetén vetettük el. A számítások a CSS Statistica (Statsoft, USA) software segítségével készültek.

31

5. Eredmények 5.1 A sejtproliferáció vizsgálatának eredményei

A sejtproliferációt százalékos arányban megadott PCNA festodési indexszel és az ezüstözési technika alapján számolt AgNOR számmal jellemeztük. Tapasztalatunk alapján a két módszer eredményei szoros pozitív korrelációt mutatnak (p=0,041; r=0,2519), (4. ábra).

4. ábra A PCNA és AgNOR módszerekkel mért proliferációs ráta kapcsolata

Az ábra jobb oldalát tovább vizsgálva az tapasztalható, hogy ha kiszámítjuk a Spearman- féle rangkorrelációs együtthatót, a 60 fölötti PCNA értékek esetében az együttható r=0,40-ra növekszik, amit magyarázhat a gyorsult osztódási ütem mellett csökkent sejtciklus ido, így a sejtciklus különbözo fázisait reprezentáló két módszer eredménye is közelít egymáshoz (5. ábra).

32

5. ábra Rangkorreláció a PCNA és AgNOR értékek között PCNA LI>60 eseteiben

A PCNA és az AgNOR technikával kapott eredmények közötti összefüggés nem figyelheto meg azokban a gastritises esetekben, ahol intestinalis metaplasia is jelen van. A két módszerrel a különbözo szövettani csoportokban kapott eredményeket a 3. táblázat foglalja össze.

PCNA LI

AgNOR

Ép nyálkahártya

46,4+10,7*

230,1+94,3*

Gastritis, IM nélkül

52,8+19,2

285,1+48,1*

Gastritis, IM-val

52,6+15,7

303,2+42,6*

Carcinoma

76,2+12,4*

345,0+69,3*

? 3. táblázat Proliferációs ráta meghatározása szövettani mintákban PCNA és AgNOR módszerekkel (IM: intestinalis metaplasia) * szignifikáns eltérés az ép nyálkahártyához képest, p<0,05

33

Az ép nyálkahártya proliferációs üteme felgyorsult a gyulladásos esetekben, azonban ez csak az AgNOR módszerrel mért adatok alapján volt szignifikáns mértéku (p<0,05). Carcinomás esetekben mindkét módszerrel vizsgálva statisztikailag is szignifikáns mértéku (p<0,05) proliferációs ráta növekedés figyelheto meg. A gyulladásos esetek között intestinalis metaplasia jelenléte ill. hiánya alapján különbség nem tapasztalható. Ha az eredményeket tovább elemezzük Helicobacter pylori pozitivitás alapján, az tapasztalható, hogy a baktérium jelenléte a gyulladásos esetekben nem okozott gyorsult proliferációt, azonban ott, ahol intestinális metaplasia is jelen volt, a proliferáció üteme felgyorsult PCNA-val vizsgálva (4. Táblázat, 6. ábra).

Gastritis, IM nélkül - H.p. negatív Gastritis, IM nélkül - H.p. pozitív Gastritis, IM-val - H.p. negatív Gastritis, IM-val - H.p. pozitív

PCNA LI

AgNOR

53,2+20,7

277,8+57,5

54,7+19,1

291,4+44,3

44,7+20,6

308,2+34,1

50,2+13,7

294,5+58,9

4. táblázat Helicobacter pylori okozta proliferációs ráta változás gastritisben, intestinalis metaplasia jelenléte nélkül ill. intestinalis metaplasiával

Az eredmények alapján felvetheto, hogy a gastritishez társuló megnövekedett ütemu epithelproliferáció a gyulladásra adott fiziológiás válasz része és nem specifikusan a H. pylori jelenlétéhez kötött, azonban a fertozésnek kiemelkedo jelentosége lehet ott, ahol intestinalis metaplasiás elváltozás már bekövetkezett.

34

6. a ábra H. pylori negatív gastritis, intestinalis metaplasiával

6. b ábra H. pylori pozitív gastritis, intestinalis metaplasiával Intestinalis metaplasiában a Helicobacter pylori fertozés fokozza a sejtproliferációt, PCNA festés, 200-szoros nagyítás

35

Eradikációs kezelést követoen a proliferáció üteme a normál epitheliuméhoz közeli mértékure visszaállt (n=36), míg azokban az esetekben, ahol a kezelés sikertelen volt (n=8), a proliferációs ráta gyakorlatilag nem változott (5. táblázat). ? PCNA

AgNOR

Eradikáció elott

52,0+18,9

294,5+58,9

Sikeres eradikáció után

45,8+11,1

266,3+15,9

Sikertelen eradikáció után

53,3+22,2

310,2+24,6

5. táblázat Proliferációs ráta változása eradikációs kezelés hatására

Az AgNOR vizsgálat értékelésekor csak az abszolút számot vettük figyelembe, nem elemeztük a NO régiók alakját, térfogatát. Azonban szembetuno volt, hogy az általában fekete, pontszeru, szabályos, kerek különálló vagy csoportos elhelyezkedésu NOR-ok már gyulladásban és metaplasiában is, de carcinomás elváltozásokban kifejezetten nagyobbak voltak, mind méretükben, mind alakjukban szabálytalan, heterogén megjelenést mutattak, ami összhangban áll a sejtek korlátlan osztódásával (7. ábra).

7. a ábra

36

7. b ábra AgNOR reakció a.) ép gyomornyálkahártyán és b.) H. pylori pozitív gastritisben, 400szoros nagyítás

5.2 Az apoptosis vizsgálatának eredményei

A programozott sejthalál üteme gyulladásos esetekben nem fokozódott szignifikáns mértékben az ép nyálkahártyához képest, sot, az intestinális metaplasiás esetekben az értékek a normál nyálkahártya értéke alatt maradtak. H. pylori fertozés hatására az intestinális metaplasia nélküli gyulladásos esetekben az apoptosis igen nagy fokban felgyorsult (8. ábra), míg ez a fokozott ütemu sejtpusztulás nem következik be ilyen mértékben ott, ahol az intestinális metaplasia már kialakult. Tumoros esetekben az apoptosis üteme szignifikáns mértéku növekedést mutatott. Eradikációs kezelés hatására az eredmények a normál epitheliuméhoz közeli értékeket mutattak. Az eredményeket a 6. táblázat összegzi.

37

8. a ábra

8. b ábra TUNEL reakció a.) H. pylori negatív és b.) H. pylori pozitív gastritisben, 200-szoros nagyítás

38

TUNEL Ép nyálkahártya

0,015+0,014

Gastritis, IM nélkül – H.p. negatív

0,013+0,001*

Gastritis, IM nélkül – H.p. pozitív

0,029+0,012*

Gastritis, IM-val – H.p. negatív

0,011+0,004

Gastritis, IM-val – H.p. pozitív

0,013+0,004

Carcinoma

0,038+0,003×

Sikeres eradikáció után

0,016+0,003

6. táblázat TUNEL reakcióval kapott apoptosis indexek * Szignifikáns eltérés H. pylori negatív és H. pylori pozitív esetek között, p<0,01 × Szignifikáns eltérés a normál ill. gyulladásos és a carcinomás esetek között, p<0,05 ?

5. 3 EGFR expresszió vizsgálatának eredményei

Gyulladás hatására, aspecifikus válaszként, az EGF receptor expresszió csökkenést mutatott az ép nyálkahártyához képest azokban az esetekben is amikor H. pylori fertozés nem volt igazolható. A kórokozó hatására további csökkenés következett be. Azokban az esetekben azonban, amikor intestinális metaplasia jelen volt, a fertozés hatására szignifikáns mértéku expresszió csökkenés következett be. Tumoros esetekben az EGFR index szintén jelentosen alacsonyabb az ép nyálkahártyához viszonyítva. Az eredményeket a 7. táblázat foglalja össze, az immunhistochemiai reakciót a 9. ábra szemlélteti.

Eradikációs kezelést követoen az EGFR expresszió szignifikáns növekedést mutatott és magasabbá vált az ép nyálkahártya értékeinél (53,32+19,92, p<0,050). ?

39

EGFR Ép nyálkahártya

50,30+23,7

Gastritis, IM nélkül – H.p. negatív

47,44+21,18

Gastritis, IM nélkül – H.p. pozitív

45,29+25,07

Gastritis, IM-val – H.p. negatív

48,30+23,70

Gastritis, IM-val – H.p. pozitív

32,40+30,40*

Carcinoma

38,80+28,80

7. táblázat EGF receptor expresszió átlag értékei és standard deviációi a különbözo szövettani csoprtokban *szignifikáns eltérés a normál, IM nélküli gastritis, H.p. negatív gastritis IM- val valamint a H.p. pozitív IM-val gastritises csoport között (p<0,050)

9. ábra EGFR expresszió H. pylori pozitív gastritisben, 200-szoros nagyítás

40

5.4 Oncoprotein expresszió vizsgálatának eredményei ? Egészséges nyálkahártyán p53 expressziót nem tapasztaltunk. Gyulladásos esetekben a H. pylo ri p53 expresszió fokozódást okozott abban az esetben is, ha intestinalis metaplasia nem volt jelen és abban az esetben is, ha intestinalis metaplasia megfigyelheto volt, ám ez az emelkedés nem érte el a statisztikailag szignifikáns mértéket. Azonban az intestinalis metaplasiás csoportban igen nagy fokú p53 index növekedés figyelheto meg az intestinalis metaplasia nélküli gyulladásos csoporthoz képest (p<0,020). Tumoros esetekben az oncoprotein expresszió igen jelentos mértéku csökkenést mutatott (p<0,001), az index nem érte el az intestinalis metaplasia nélküli gastritises csoport értékét sem. Sikeres eradikációt követoen p53 expresszió nem volt detectalható. Az eredményeket a 8. táblázat összegzi. ? p53 Gastritis, IM nélkül – H.p. negatív

18,33+19,65 *

Gastritis, IM nélkül – H.p. pozitív

35,55+31,16

Gastritis, IM-val – H.p. negatív

68,50+28,96 *

Gastritis, IM-val – H.p. pozitív

70,16+22,54

Carcinoma

12,33+17,82 *

8. táblázat P53 index átlag értékei és standard deviációi gyulladásban és carcinomában *Szignifikáns eltérés az intestinalis metaplasia nélküli és intestinalis metaplasiás esetek között, valamint a carcinomás esetek között, p<0,050

A p53 expressziójának mértékét -azért, hogy a többi mutatóval jól összevetheto legyenszintén százalékos arányban fejeztük ki, azonban ez nem tükrözi, hogy az esetek hány százalékában található meg az eltérés. Érdekes megfigyelés, hogy míg az intestinalis metaplasia nélküli gastritises csoportban az esetek 31%-a 10 százaléknál alacsonyabb p53 rátát mutatott, az intestinalis

41

metaplasiás csoportban minden esetben, azaz 100%-ban 10 százaléknál magasabb mértékben expresszált.

10. a ábra

10.b ábra P53 expresszió a.) H. pylori negatív és b.) H. pylori pozitív gastritisben, eredeti nagyítás x 200

42

5.5 Összehasonlító elemzés

A gyomorepithelium sejtjeinek kinetikája legjobban a sejtproliferáció és apoptózis ütemének elemzésével jellemezheto. Eredményeink azt mutatják, hogy a normál epitheliumhoz képest gyulladásban a felgyorsult ütemu sejtosztódást követi a sejtpusztulás ütemének megnövekedése, azonban ez a párhuzamos apoptosis fokozódás nem figyelhto meg akkor, ha intestinalis metaplasia is jelen van. Tumoros esetekben újra megfigyelheto a felgyorsult proliferációt követo apoptosis növekedés. H. pylori fertozés hatására, azokban az esetekben, ahol intestinalis metaplasia nem volt jelen, AgNOR technikával mérve a proliferáció és az apoptosis üteme is szignifikáns mértéku növekedést mutatott. Intestinalis metaplasiában azonban H. pylori fertozés nem váltott ki szignifikáns mértéku turnover gyorsulást. Sikeres eradikációs kezelést követoen mind a sejtosztódás, mind pedig a sejtpusztulás üteme a normál nyálkahártya értékeihez közeli értékre visszaállt, míg azokban az esetekben, amikor a kezelés sikertelennek bizonyult, a mutatók gyakorlatilag változatlanok maradtak.

Ha a proliferációs rátát az epidermális növekedési faktor receptor expressziójával hasonlítjuk össze a Pearson- féle korrelációs teszt segítségével, negatív összefüggést találunk (r= -0,3496). Ez a negatív korreláció intestinális metaplasiában H. pylori fertozés esetén szignifikáns mértékure növekszik (r= -0,89). Az összefüggést a 11. ábra mutatja be. Eradikációs kezelést követoen mindkét mutató visszatért az eredetihez közeli értékre, ez a változás EGFR esetében szignifikáns mértéku volt és az index a normál nyálkahártya értékeihez képest kissé magasabbra emelkedett. A változásokat a 12. ábra szemlélteti.

43

11. ábra Szignifikáns negatív korreláció a sejtosztódás üteme és az EGF receptor expresszió között H. pylori pozitív intestinalis metaplasiában

12. ábra PCNA és EGFR értékek változása intestinalis metaplasiás esetek eradikációs kezelését követoen Box & Whisker Plot ábrázolásban A „box” a középértéket jelöli standard deviációkkal, a „whisker” szélei a szélso értékeket ábrázolják.

44

A sejtpusztulás mértékét a p53 oncoprotein expressziójával összevetve az tapasztalható, hogy amíg az intestinalis metaplasiás gyulladásos esetekben a gyorsult proliferációt nem követte azonos mértéku apoptosis fokozódás, addig a p53 expresszió igen jelentos mértékben (p<0,010) növekedett meg. Azonban a H. pylori infekció -a többi mutatóhoz hasonlóan- itt sem okozott szignifikáns mértéku változást. A carcinomás csoportban már megfigyelheto a nagyfokú apoptosis index növekedés és ezt szignifikáns mértéku p53 expresszió csökkenés követi. Az intestinalis metaplasiás csoportban láttuk az elozoekben, hogy az EGFR expresszió szignifikáns negatív korrelációt mutat a sejtosztódás ütemével, a p53 expresszió pedig ebben a csoportban szintén szignifikáns negatív korrelációt mutat a sejtpusztulás ütemével. A TUNEL és a p53 index minden szövettani csoportban szoros negatív korrelációt mutat. Az összefüggést a 13. ábra mutatja be.

13. ábra A p53 értékek és az apoptosis index negatív korrelációt mutatnak, p<0,050

A sejtosztódás üteme és a p53 expresszió között statisztikai összefüggés nem volt kimutatható.

45

A sejtpusztulás ütemét az EGFR expressziójával összevetve pozitív összefüggés található (r=0,61; p<0,050), azonban ez a különbözo szövettani csoportokban eltérést nem mutatott és nem volt igazolható az összefüggés a megváltozott sejtkinetikával (proliferáció-apoptosis változás) sem. Eredményeinket összegezve elmondható, hogy a gyulladásban tapasztalható gyorsult proliferáció és az ezzel párhuzamos apoptosis növekedés aspecifkus válasz a H. pylori fertozésre, mert nem volt statisztikailag szignifikáns különbség a H. pylori pozitív illetve negatív csoport között. Intestinalis metaplasiában a H. pylori fertozés hatása eltér az intestinalis metaplasia nélküli gyulladásos csoporthoz képest, itt nem következett be a párhuzamos apoptosis fokozódás és a sejtkinetika a proliferáció felé tolódott el. A H.pylori fertozés intestinalis metaplasia esetén eltéro hatással volt az EGFR expresszióra: szignifikáns csökkenést okozott. Ugyanebben a csoportban a p53 expresszió pedig igen jelentos fokú növekedést mutat. Eredményeink az intestinalis metaplasia jelenléte mellett fennálló H. pylori fertozésre tereli a figyelmet, mert ezekben az esetekben eradikációs kezelést követoen a paraméterek még vissza tudtak térni a normál epitheliumra jellemzo értékekre.

46

6. Megbeszélés 6. 1 Az eredmények megbeszélése

A

H.

pylori

1983-as

„újrafelfedezése”

óta

végzett

számos

kutatás

eredményeként, mind histopathologiai (10, 80), mind pedig epidemiológiai (11, 81, 114) tanulmányok alapján 1994-ben az IARC a H. pylorit elsodleges carcinogén ágensnek nyilvánította (37). Bizonyítottnak látszik az is, hogy a H. pylori chronicus kolonizációja a gyomorban gyomorrák kifejlodéséhez vezethet (54). Az IARC következtetését azonban többen elhamarkodottnak tartják, megkérdojelezik. Ennek egyik oka, hogy ellentmondás áll fenn a nyugati országokban a H. pylori prevalenciája és a gyomorrák csökkeno incidenciája között. Ezen kívül ellentmondásos az is, hogy míg a H. pylori fertozés elofordulása nokben és férfiakban azonos prevalenciájú, addig az inestinalis típusú gyomorrák férfiakban gyakoribb. A harmadik ellenérv, pedig az úgynevezett „afrikai rejtély”, miszerint számos magas H. pylori prevalenciájú fejlodo országban alacsony a gyomorrák incidenciája (8). Az azonban tény, hogy a gyomorrák kockázata 3,8-szorosára növekszik a H. pylori pozitív betegekben a H. pylori negatív betegekhez képest, és a kockázat 8,7-szeresre emelkedik, ha a fertozés 15 évnél hosszabb ideig fennáll (22). A gyomorrák sem morfológiailag, sem epidemiológiailag nem tekintheto homogén betegségcsoportnak. Nakamura differenciált és nem differnciált típusú carcinomát különböztet meg (72). A precancerosus elváltozások és a glanduláris megjelenés alapján osztályozva a tumorok intestinalis és diffúz csoportba sorolhatók (57). A Lauren- féle osztályozás szerinti intestinalis típusú gyomorrák megegyezik a WHO osztályozásában a tubularis, papillaris és muc inosus típussal, míg a diffúz típusú gyomorrák a pecsétgyuru sejtes és differenciálatlan gyomorráknak felel meg. A Japánban elfogadott osztályozás szerint, pedig megkülönböztetnek papillaris, tubularis és alacsonyan differenciált adenocarcinomát (128). Az intestinalis típusú carcinoma mirigy struktúrája a colon carcinomáéhoz hasonlatos, diffúz típusban egyes sejtek vagy kisebb sejtcsoportok infiltrálják a környezetet anélkül, hogy jól definiált szerkezetet alakítanának ki (9). Az intestinalis típusú gyomorrák atrophias nyálkahártyán fejlodik ki, elofordulása idosebb férfiakban gyakoribb és incidenciájában csökkeno tendencia

47

mutatkozik. A díffúz típusú rák kifejlodését nem elozi meg nyálkahártya atrophia, gyakrabban fordul elo fiatal nokön és A vércsoportú betegekben, incidenciája nem csökken (122, 104, 24). A kifejlett gyomorrák ennyi féle osztályozása arra enged következtetni, hogy feltehetoen nem egységes út vezet az elváltozáshoz, hanem részt vesz benne több féle mechanizmus, több féle átkapcsolási hellyel. E pontok meghatározása megvilágíthatja a pathomechanizmus egyes lépéseit. Correa többlépcsos modelljében a dysplasia már minden fajta gyomorrák tekintetében precancerosus elváltozásnak tekintheto, így ennél korábbi stádium tisztázása szükséges. Az intestinalis metaplasia fogalmát már a XIX. század óta használják, és a XX. század közepe óta számos tanulmány vizsgálja a tulajdonságait. Intestinalis metaplasia eloször a corpusantrum átmenetben jelenik meg, innen halad distal felé (109). Többféle osztályozás ismert, pl. enzim produkció, nyák tartalom vagy Paneth sejtek jelenléte alapján. Az egyik besorolás 3 típust különböztet meg. Az I. típusú intestinalis metaplasia szerkezete a normális intestinalis nyálkahártyához hasonló, a II. típusú inkomplett és szialomucint expresszál, míg a III. típusban szulfomucin termelés is igazolható. Wu a III. típust tekinti a premalignitás legspecifikusabb markerének (123). Dolgozatomban a gyomorrákot és az intestinalis metaplasiát is külön-külön egységes betegség csoportként

kezeltem,

feltételezve

azt,

hogy

a

gyomor

carcinogenesise során olyan kulcsfontosságú változások következnek be, ami független a kifejlodött betegség szövettani megjelenésétol. A vizsgálat során két alapveto, a gyomornyálkahártya barrier funkciójához nélkülözhetetlen fiziológiás folyamat, a proliferáció és az apoptosis változásait mértem meg. A proliferatív állapot megítélésére két módszert is alkalmaztam. Ezek közül az egyik egy immunhistochemiai módszer volt, a PCNA, amit munkacsoportunk már korábban is használt, és pontosságát összevetve a TV cytometriával mért DNS tartalom eredményeivel, szoros korrelációt talált (111). Másik módszerként az AgNOR technikát alkalmaztam, amely a PCNA-nál lényegesen gyorsabb és olcsóbb, kivitelezése egyszerubb. Az eredmények azt mutatják, hogy jól jellemzi a gyomornyálkahártya proliferációs aktivitását és korrelál az immunhistochemiai módszer eredményeivel. Ezek alapján a mindennapi klinikai gyakorlatban hasznos kiegészíto diagnosztikai módszerré válhat.

48

Ez összhangban áll számos más szerzo véleményével. Van, aki az AgNOR technikát alkalmasnak tartja tumoros elváltozás korai detectálására és annak az éppel való határának megítélésére, van, aki szerint használható tumor malignitási potenciáljának jellemzésére, a lefolyás elorejelzésére, ezen kívül alkalmasnak mutatkozik szövettani egységek elkülönítésére, valamint a három fo funkcionális sejttípus, a statikus, a feltételesen megújuló és a folyamatosan megújuló sejtek megkülönböztetésére. Míg a PCNA „minden vagy semmi” fenomé n alapján jellemzi a sejtproliferációt, addig az AgNOR számlálás minoségi eloszlást nyújt. Rosszindulatú sejtburjánzásban sok, de kicsi, jóindulatú sejtosztódásnál, kevés, de nagy NO régió detectálható (76, 103, 68, 33, 30, 126, 27). Irasutza és munkatársai eredményei alapján önmagában sem a PCNA, sem az AgNOR módszer nem alkalmas a különbözo szövettani

csoportok

osztályozására.

A

különbözo

proliferációs

paraméterek

kombinálásával azonban el tudták különíteni a gyomornyálkahártya elváltozásait. Így a két módszer eredményeit független paramétereknek tartják, amelyek alkalmasak nemcsak az abszolút osztódási arány, hanem a sejtciklus jellemzésére is, és a két módszer eredményei között tapasztalható korrelációt muterméknek ítélik (43). A vizsgálatunk során kapott eredmények alapján a két módszer között fennáll a korreláció, azonban azt egy robosztusabb korreláció analízissel elemezve kitunik, hogy ez a korreláció a nagyobb értékek mellett szorosabb. Ez arra enged következtetni, hogy gyorsabb osztódási ütem mellett csökken a két módszerbol adódó különbség, tehát valóban jellemzik a módszerek a sejtciklus változásait és az összefüggés nem tekintheto muterméknek. Mindkét módszerrel gyorsult sejtproliferáció volt mérheto gyulladásban az ép nyálkahártyához képest és carcinomában a gyulladásos esetekhez képest. Intestinalis metaplasiában azonban csak AgNOR technikával volt kimutatható a proliferáció növekedés, PCNA-val kisfokú csökkenést mértünk, amit a fent leírt „mindent vagy semmit” fenomén magyarázhat. H. pylori fertozés hatására nem következett be szignifikáns mértéku változás. Az apoptosis vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy carcinomában a sejtpusztulás üteme jelentosen növekszik, míg intestinalis metaplasiában az értékek kissé az ép nyálkahártya értékei alatt maradtak. Gyulladásos esetekben H. pylori fertozés hatására szignifikáns mértéku apoptosis növekedés volt észlelheto.

49

Eredményeink az irodalomban szereplo adatokkal csak részben állnak összhangban, nem sikerült igazolni H. pylori fertozésben szignifikáns mértéku proliferáció fokozódást, ami alapján a kórokozó nem elsodlegesen a sejtosztódás fokozása révén vesz részt a carcinogenesisben. Azonban több szerzo is beszámol arról, hogy H. pylori fertozéskor a proliferáció jelentosen gyorsul, (94). Beszámolnak arról is, hogy a gastritis súlyossági foka és a proliferációs ráta növekedési üteme között összefüggés áll fenn (69). Misra és munkatársai eredményei szerint AgNOR technikával vizsgálva a proliferációt, növekvo tendencia mérheto a gastritis különbözo stádiumaiban, intestinalis metaplasiában, dysplasiában és különbözo differenciáltsági fokú carcinomában, és H. pylori pozitivitásban mindig magasabb AgNOR szám található (67). A H. pylori infekcióval társult gyorsult sejtproliferáció in vitro körülmények között nem figyelheto meg, ami közremuködhet fekély kialakulásában és a fekélygyógyulás késleltetésében. A H. pylori direkt kontaktus során gátolja a proliferációt, ami alátámasztja, hogy in vivo H. pylori gastritisben a gyorsult proliferáció reflexes válasz a sejtkárosodásra és azt nem a közvetlen H. pylorival való kontaktus okozza. Az in vitro tapasztalható osztódás csökkenés valószínuleg növekedést gátló fehérjék termelésén keresztül következik be. Az in vivo észlelt proliferáció fokozódás, pedig egy hosszú távú kompenzatorikus válasz a H. pylori indukált apoptosisra és a növekedés gátlására, de fennáll annak is a lehetosége, hogy gastritisben a gyulladásos válasz direkt stimulálja a proliferációt (107, 69). Vizsgálatunk során azt tapasztaltuk, hogy gyulladásban a H. pylori igen jelentos apoptosis fokozódást okozott, míg intestinalis metaplasiában ilyen hatás gyakorlatilag nem figyelheto meg. Ez arra enged következtetni, hogy gyulladás fennállásakor a kórokozó

atrophia

kialakulását

segíti,

és

így

promoterként

szerepelhet

a

carcinogenesisben. Carcinomában szignifikáns mértéku TUNEL- index növekedés tapasztalható, ami magyarázható fokozott DNS károsodással, és ezzel, DNS károsodás indukálása révén a H. pylori initialó hatása is feltételezheto. Yoshimura és munkatársai igazolták, hogy az apoptosis index korrelál a mirigy atrophia mértékével. Az apoptosis mérésére vonatkozó egyéb adataik is összhangban állnak az általunk mértekkel, azonban ok carcinomában proliferáció fokozódást nem igazoltak, így az elégtelen sejtproliferációnak tulajdonítják a gyomornyálkahártya homeostasisának felborulását (129).

50

Jól differenciált carcinomában szignifikánsan gyorsabb proliferáció és apoptosis mérheto, mint a rosszul differenciált tumorokban, és a proliferáció a tumor progressziójának megfeleloen no, míg apoptosis változás nem figyelheto meg a „minute”, a korai és a kifejlett carcinomák között (40). Több kutatócsoport megerosíti, hogy jól differenciált carcinomában gyakrabban tapasztalható apoptosis fokozódás, mint rosszul differenciált carcinomában, azonban születtek ezzel ellentétes eredmények is (44, 100, 50). Több adat is alátámasztja a H. pylori apoptosis indukáló képességét, és ez feltehetoen korai esemény az elváltozások láncolatában (86, 71). Vannak bizonyítékok arra, hogy a H. pylori képes apoptosis rezisztenciához vezetni és meggátolja más apoptosis indukáló ágensek (mint pl. egyes chemotherapiás szerek, baktériumok vagy besugárzás) hatását (102). Vizsgálatunkban eradikációs kezelés hatására mind a proliferációs index, mind pedig az apoptosis index a normál nyálkahártya értékeihez közelire visszatért, ami azt mutatja, hogy nemcsak gyulladáskor, hanem intestinalis metaplasia mellett is visszaállítható a gyomornyálkahártya homeostasisa. Az eradikációs kezelés hatékonyságát több szerzo is alátámasztja (47, 13, 69, 124, 40). Van, aki sikertelen kezelés után is tapasztalt apoptosis index csökkenést (71), azonban található olyan eredmény is, ami szerint intestinalis metaplasiában a csökkent apoptoticus aktivitás eredikációs kezelést követoen is változatlan maradt (59). Az EGF és a vele rokon növekedési faktorok (mint. Pl a TGF? , az AR (amphiregulin), a HB-EGF (heparin-binding EGF- like growth factor) fontos szerepet töltenek be a gyomornyálkahártya védelmében és gyógyulásában. Ezek az EGF-szeru polypeptidek közös sejtfelszíni receptoron fejtik ki hasonló biológiai hatásukat, a sejtmigráció és proliferáció stimulálását. A H. pylori az AR és a Hb-EGF mRNS expresszióját is megnöveli, míg TGF? esetén ez nem tapasztalható, és ez a változás csak a H. pylori esetében figyelheto meg, E. coli fertozésnél nem. A H. pylori gátolja az AR és a HB-EGF által indukált sejtosztódást, és ez a hatás független az EGF receptor protein szintjétol, kötési affinitásától és a kötési helyek számától (89, 16). Eredményeink szerint a proliferációs index változása és az EGFR expresszió között szoros negatív korreláció tapasztalható. Megfigyelheto az EGFR csökkenés gyulladásban, valamint szignifikáns mértékben carcinomában az ép nyálkahártyához

51

képest, azonban a legjelentosebb változás intestinalis metaplasiában tapasztalható. Itt H. pylori fertozés hatására igen jelentos mértékben csökkent az EGFR expresszió, míg intestinalis metaplasia nélküli esetekben a kórokozó ilyen változást nem okoz. Az kétségtelennek tunik, hogy a H. pylori beavatkozik az EGF-aktivált szignál transzdukció útjaiba a gyomornyálkahártya sejtjein, azonban az erre vonatkozó eredmények ellentmondásosak. Többen tapasztaltak H. pylori hatására EGFR expresszió növekedést (14, 120, 39), Playford és munkatársai a H. pylori által termelt cytotoxint teszik felelossé az EGF triggerelt EGFR növekedés csökkentéséért (84). Felmerül a gyomorcarcinoma egy új therapiás lehetosége is, mivel az EGFR elleni monoklonális antitest gátolni képes a tumor növekedését (115). Az irodalomban található adatok jelentos része olyan vizsgálatokból származik, ami az EGFR-nek a fekélygyógyulásban betöltött szerepére irányul, vagy a különbözo típusú carcinomákban megfigyelheto EGFR expresszió változást méri. Csak kevés adat áll rendelkezésre a H. pylori infekció okozta, és a carcinogenesis különbözo fázisaiban bekövetkezo EGFR expresszió változásról. Granelli vizsgálati eredményei nem igazoltak összefüggést az EGFR expresszió és intestinalis metaplasia jelenléte, illetve H. pylori pozitivitás között (29). Vizsgálatunkban a H. pylori eradikációja szignifikáns mértéku EGFR növekedést okozott, és az érték kissé a normál nyálkahártya értéke fölé emelkedett. Ez összhangban áll azzal az eredménnyel, miszerint H. pylori pozitív fekélyek eradikációs kezelése után is magas EGFR értékek mérhetok (52). Konturek eradikációs kezelést követoen azt tapasztalta, hogy míg a gastritis aktivitása szinte azonnal csökkent, a magas TGF? és EGF szint még 4 héttel a kezelés után is tovább perzisztált, és csak 2 évvel késobb tért vissza a normál szintre (53). A p53 oncoprotein vizsgálata során az irodalomban megtalálható adatoknál lényegesen magasabb mérési eredményeket kaptunk, azonban ez összhangban áll egy másik magyar munkacsoport eredményeivel, akik intestinalis típusú carcinomában 84%-os p53 expressziót mértek. Ezt az eredményt a Magyarországra jellemzo táplálkozási szokásokkal magyarázták (79). Ma már elfogadott tény, hogy a friss gyümölcsök, zöldségek hiányos bevitele és a fogyasztott élelmiszerek magas só és nitrit tartalma fokozza az intestinalis metaplasia kialakulásának kockázatát.

Egy jemeni

tanulmány szerint a H. pylori fertozés nem fokozta sem carcinoma, sem intestinalis

52

metaplasia kialakulásának kockázatát, feltehetoen azért, mert nem kombinálódott a káros táplálkozási szokásokból adódó egyéb kockázati tényezokkel (19). A táplálkozási szokások szerepét támasztja alá az a tény is, hogy ecetes zöldségek, szárított sós halak gyakran tartalmaznak N-nitrózaminokat, ami G:C A:T bázis szubsztitúciót okoz, és ez gyakran található meg az alacsonyan differenciált carcinomákbban. P53 mérési eredményeim ismételten az intestinalis metaplasiára terelték a figyelmet. Itt ugyanis extrém magas p53 expresszió volt mérheto, és míg az intestinalis metaplasia nélküli esetekben a H. pylori jelentos expresszió fokozódást okozott, addig intestinalis metaplasiában ez a változás már nem következett be. Ez összhangban áll azzal a méréssel, miszerint p53 mutáció gyakrabban tapasztalható H. pylori negatív carcinomában, mint H. pylori pozitívban (35), azonban gyakoribb megfigyelés az, hogy intestinalis típusú gyomorrák fokozottabban expresszál p53-at, mint a diffúz típus (122, 48). Az, hogy az elváltozás korai vagy késoi eseménynek tekintheto-e a carcinogenesis folyamá n, ma még nem eldöntött kérdés. Szintén ellentmondásos,

hogy

bekövetkezik-e

a

mutáció

a

gyomor

precancerosus

elváltozásaiban, és az sem tisztázott még, hogy befolyásolja-e a H. pylori ezt a folyamatot. Jones gyerekeken azt tapasztalta, hogy a H. pylori minden esetben p53 expresszió fokozódáshoz vezetett, és mivel nem talált összefüggést a gastritis foka és a megváltozott sejtmegújulás között, úgy véli, hogy nem a gyulladás játszik dönto szerepet az apoptosis és a proliferáció indukálásában, hanem a p53 indukálhatja az apoptosist H. pylori infekció során (47). Születtek olyan vizsgálati eredmények is, ami alapján a H. pylori nem játszik szerepet a genetikai változásokban a gyomor carcinogenesise során, az apoptosis fokozódás pedig p53 géntol független úton következik be (122, 40). Ishida eredményei összhangban állnak az általunk kapott eredményekkel, ezek alapján a fokozott p53 expressziónak szerepe van az apoptosis indukcióban, de abban valószínuleg más tényezok is közre játszanak (45). Vizsgálatunk azt mutatja, hogy a p53 apoptosis indukáló szerepe intestinalis metaplasiában már nem érvényesül. Ott, ahol intestinalis metaplasia még nem alakult ki, a H. pylori pozitív esetekben p53 exprsesszió fokozódás és ezzel paralel apoptosis fokozódás figyelheto meg, ami arra utal, hogy a H. pylori által kiváltott apoptosis fokozódásban a p53 gén szerepet játszik.

53

Az irodalmi adatok szerint a H. pylori önmagában nem képes cytotoxicitást indukálni, de proliferációt, olyan esetben, ha p53 mutáció bekövetkezett, igen, ugyanis Kato III sejtvonalon, ahol p53 deléció van, proliferációt indukál, míg ez nem tapasztalható MKN 45-ös sejtvonalon, ahol vad típusú p53 van jelen (112). Nardone vizsgálati eredményei alapján arra a következtetésre jutott, hogy a H. pylori intestinalis metaplasiában és dysplasiában is felelos a genetikai instabilitásért, és így annak kiirtása már chronicus gastritis fennállása esetén indokolt (73). Antonioli ezzel szemben úgy gondolja, hogy bár több állapot is, mint pl. a gastritis, atrophia, intestinalis metaplasia, társulhat fokozott kockázattal az intestinalis típusú gyomorrák kialakulására, valódi pozitív jósló értéke malignitás szempontjából csak a dysplasiának van (3). Életünk során feltehetoen több nem ismert precancerosus laesioval is rendelkezünk, ez azonban gyorsan eliminálódhat pl. a sejtproliferáció kontrollja révén, vagy az immunrendszer gyors reakciója révén. Intestinalis metaplasiában olyan elváltozások alakulnak ki, amelyeknek legalább egy része még visszafordítható. A metaplasiában bekövetkezo változásokkal több vizsgálat is foglalkozik, Saegusa és munkatársai egy anti-apoptoticus protein, a bcl-2 aberráns megjelenését írták le, Sung és mnkatársai pedig COX-2 túlprodukciót tapasztaltak, ami alapján intestinalis metaplasiában felmerül az autonóm apoptosis szabályozás lehetosége, ami független a gyulladástól vagy H. pylori jelenlététol (59, 93, 110). Eredményeim alapján az intestinalis metaplasia olyan premalignus elváltozásnak tekintheto, amely tulajdonságai alapján már jelentosen eltér a gastritistol, és az észlelheto elváltozások a tumor kifejlodésének irányába mutatnak. A H. pylori által okozott elváltozások gastritisben még jól kontrolálható mechanizmusok útján következnek be, intestinalis metaplasiában azonban a kórokozó eltéro módon viselkedik, amiben már egyéb faktoroknak is feltehetoen jelentos szerepe van. Kuniyasu, áttekintve intestinalis típusú gyomorrákban a közös epigenetikus és genetikus változásokat, új fogalom bevezetését javasolja: a metaplasticus dysplasiát, amely a csírája lenne az intestinalis típusú gyomorráknak (55). Az elvégzett vizsgálatok alapján azonban egy korábbi stádium tunik a kulcspontnak, és az intestinalis metaplasia kifejlodése elotti viszonyok tisztázását teszi szükségessé. A vizsgálat során a H. pylori fertozés tényét vettük alapul, a H. pylori törzsek tipizálása nem történt meg. A kórokozó heterogenitása feloldhatja az irodalomban

54

található, látszólag ellentmondásos mérési eredményeket. A CagA pozitív törzsek súlyosabb sejtkárosodást képesek okozni, nagyobb carcinoma kockázattal társulnak és a kialakult betegség lefolyása is súlyosabb (6, 21, 82). A CagA törzs fokozott sejtproliferációt okoz, de nem társul az apoptosis indukció növelésével (82). Rokkas és munkatársai AgNOR technikával mért proliferáció vizsgálata során azt tapasztalták, hogy CagA pozitív esetekben szignifikánsan magasabb a proliferációs index, mint CagA negatívakban, vagy a H. pylori negatív esetekben, és nem mutatható ki különbség a fertozés nélküli estekben és a CagA negatív törzzsel történt fertozéskor mért adatok között, ami alapján a CagA pozitív H. pylori törzseket tartja a carcinogenesis promoterének (88). In vitro körülmények között a H. pylori csökkenti a gyomornyálkahártya sejtjeinek életképességét. Ez E. coli, S. flexneri vagy C. jejuni esetében nem figyelheto meg. Egyes adatok szerint a CagA potitív és negatív törzsek is apoptosist indukálnak, de CagA pozitív törzsek nagyobb mértékut. Feltehetoen a H. pylori által indukált sejtciklus progresszió és apoptosis nem p53 által mediált, ehhez a VacA és picB termékek is hozzájárulnak (83). VacA pozitív törzsek a sejtproliferációt kifejezetten gátolják, míg a migrációra nincsenek hatással (87). Található az irodalomban olyan eredmény is, ami alapján a CagA pozitív esetekben tapasztalható fokozott proliferáció egy kompenzatorikus válasz a baktérium sejtciklusra kifejtett kezdeti gátló hatására, és a sejtciklus befolyásolásáért más gének is felelossé tehetok, a cagA gén önmagában nem képes azt megváltoztatni (101). Születtek azonban olyan eredmé nyek is, ami alapján nincs különbség a CagA pozitív és CagA negatív törzsek okozta elváltozásokban, CagA, VacA pozitivitástól független a proliferáció gyorsulása (107, 117). Yoshimura és munkatársai adatai szerint Japánban a vacA s1a/m1, cagA pozitív genotípusú H. pylori által okozott fertozés nem kapcsolódik gyomorrák kialakulásához, így feltehetoen egyéb faktorok is felelosek a betegségért (129). Az irodalomban található eltéro adatokat sokféle tényezo eredményezheti. A szerzok a következtetéseket gyakran meglehetosen kis esetszámú tanulmány alapján vonják le. Gyakran jelentos methodikai eltérések észlelhetok. Ehhez járulhat az is, hogy a különbözo kutatócsoportok által végzett vizsgálatokban a normál kontrol megválasztása sem egységes. Van, aki egészséges egyénekbol származó mintát használ, van, aki a tumoros, dysplasiás vagy intestinalis metaplasiás terület mellol származó

55

szövetet használja, és így nem lehet meghatározni, hogy mekkora szerepe lehet az egyed fogékonyságának, genetikai adottságának a betegség kifejlodésében. Ebert összefoglaló tanulmányában megállapítja, hogy számos molekuláris változás található meg a gyomorrákban, amelyek közül néhány a korai precancerosus stádiumokban is jelen van már. Azonban arra a megállapításra jut, hogy a legtöbb genetikus és molekuláris változás független a H. pylori fertozéstol, ami alapján feltételezheto, hogy a H. pylori infekciónak elsosorban a chronicus gyulladás kiváltásában van szerepe, ami proliferáció és apoptosis indukálásához vezet (18).

6. 2 Következtetések

Összegzésképpen megállapítható, hogy az AgNOR technika a proliferáció mérésére alkalmas, gyors, könnyen kivitelezheto, olcsó módszer, amely a mindennapi klinikai gyakorlatban is jól alkalmazható gyomornyálkahártyán a proliferációs aktivitás felmérésére. Az eredmények alapján feltételezheto, hogy gyulladáskor a H. pylori csak akkor képes direkt módon apoptosist indukálni, ha intestinalis metaplasia egyidejuleg nincs jelen. Mivel a proliferációs index nem mutat különbséget az intestinalis metaplasiás és az intestinalis metaplasia nélküli esetek között, feltételezheto, hogy a H. pylori fertozéskor észlelheto proliferáció fokozódás nem kompenzatorikus válasz a fokozott apoptosisra, ahogy azt sokan feltételezik, hanem egy aspecifikus válasz, ami a kiváltott gyulladásos reakció kíséroje. Intestinalis metaplasiában a H. pylori másképp viselkedik, mint gyulladásban, a fertozés hatására nem következik be a gyorsult proliferációval párhuzamos apoptosis fokozódás, ami felborítja a gyomornyálkahártya egyensúlyá t, és utat enged a malignus elfajulásnak. Az eredmények azt mutatják, hogy H. pylori fertozés az apoptoticus folyamatok gyorsulásához vezet, és ebben szerepet játszik a p53 mutációja. Intestinalis metaplasiában azonban a fiziológiás sejtpusztulás üteme csökken, és ezekben az esetekben már megtalálható a p53 fokozott expressziója, ami alapján a p53 mutációja korai eseménynek tekintheto a gyomor carcinogenesisében.

56

Intestinalis metaplasiában H. pylori fertozés hatására jelentosen csökken az EGFR expresszió. A fent leírt változások alapján elmondható, hogy a H. pylori önmagában nem teheto felelossé a gyomorrák kifejlodéséért. Nem sikerült még bizonyítani, hogy a kórokozó direkt carcinogen vagy mutagen hatással bírna. Az, hogy a kórokozót elsodleges carcinogen ágensnek nyilvánították, a kutatások jelentos részét ebbe az irányba fordította, aminek következtében ma már számos eredmény támasztja alá, hogy ez a megállapítás csak igen szigorú feltételek mellett állja meg a helyét, és a H. pylori a gyomorrák pathogenesisében csak kofaktornak tekintheto. Az általunk vizsgált paraméterek közül önmagában egyik sem tekintheto olyan megbízható markernek, ami a gyomorrák megnövekedett kockázatát jelezné. Az elváltozások többsége már intestinalis metaplasiában kialakul, de az, hogy az intestinalis metaplasiát mi hozza létre, továbbra is kérdéses maradt. Az a tény, hogy eradikációs kezeléssel a bekövetkezett sejtkinetikai változások visszafordíthatók voltak, indokolttá teszi, hogy az intestinalis metaplasiás betegekben a H. pylori eradikációs kezelése megtörténjen, és indokolt az ilyen betegek további szoros követése. Továbbra is kérdéses, hogy azokban a személyekben, ahol a H. pylori chronicusan kolonizál, mitol függ, hogy fekélybetegség fejlodik-e ki, vagy gyomorrákra prediszponáltak, vagy egész életükön át tünetmentes hordozók maradnak. Az áttekintett irodalmi adatok alapján megállapítható, hogy noha a carcinogenesis fobb lépéseiben egyet értenek a különbözo kutatócsoportok, számos ponton ellentmondásos mérési eredmények, ennek következtében néhol jelentosen eltéro theoriák születtek. Az ellentmondások eloszlatása érdekében további in vivo tanulmány szükséges a kórokozó kolonizáló képességének tisztázására, valamint a virulencia faktorok direkt hatásának tisztázására, beleértve a cag pathogenitási szigetet is. Ezen kívül a pontos mechanizmus megértéséhez átfogó vizsgálatok szükségesek a különbözo szövettani altípusok figyelembevétele mellett.

57

7. Köszönetnyilvánítás

Köszönettel tartozom Tulassay Zsolt professzor úrnak, amiért Klinikáján lehetoséget biztosított a kutatómunka elvégzésére. Köszönöm a publikációk javításakor nyújtott segítségét. Professzor úr módot adott arra, hogy egy külföldi kutatócsoport munkáját is megismerhessem, új módszereket tanulhassak. Köszönet a támogatásért, hogy külföldi és magyar kongresszusokon eloadással és poszterrel egyaránt megmérethettem munkám értékét. Köszönettel tartozom Dr. Molnár Bélának, aki „befogadott” a laboratóriumba, és kezdettol mindvégig segítségemre volt, megmutatta, hogyan egészíti ki a klinikai vizsgálatokat a laboratóriumi munka, eligazított a cikkírás és prezentáció-készítés útvesztoiben, és megtanított arra, hogyan értékeljem a megfeleloen feltett kérdésekre kapott válaszokat. Köszönet Dr. Prónai Lászlónak, aki témavezetoként egyengette utamat, és megtanított a tudományos munka menedzselésének fortélyaira. Ez úton is köszönöm Dr. Peter Malferthainernek és a magdeburgi Gasztroenterológiai Labornak, hogy lehetoséget biztosítottak az EGFR vizsgálatok elvégzésére és munkájuk megismerésére. Köszönet a II. Belklinika Endoscopos Laboratóriumának és az I. sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetnek a szövettani minták feldolgozásáért. Köszönöm a Szent János Kórház Pathológiai osztályának az AgNOR festés elvégzésénél nyúj tott segítségét. Köszönet Dr. Ruzsovics Áginak az EGFR expresszió vizsgálatnál végzett közös munkáért, és az eloadások alkalmával nyújtott segítségéért. Köszönöm Dr. Sipos Ferinek a képek elkészítésénél nyújtott nélkülözhetetlen munkáját. A legnagyobb há lával Édesanyámnak tartozom, aki mindig és mindenben mellettem állt és támogatott. ?

58

8. Irodalomjegyzék ? 8.1 Felhasznált irodalom 2.

Abe, S., Sasano, H., Katoh, K., Ohara, S., Arikawa, T., Noguchi, T., Asaki, S., Yasui, W., Tahara, E., Nagura, H., Toyota, T.: Immunohistochemiacal Studies on EGF Family Growth Factors in Normal and Ulcerated Human Gastric Mucosa. Dig. Dis. Sci. 1997; 42: 1199-1209.

3.

Anti, M., Armuzzi, A., Gasbarrini, A., Gasbarrini, G.: Importance of changes in epithelial cell turnover during Helicobacter pylori infection in gastric carcinogenesis. Gut. 1998; 43(S1): S27-S32.

? 4.

Antonioli, D. A.: Precursors of gastric carcinoma: a critical review a brief description of early (curable) gastric cancer. Hum. Pathol. 1994; 25 (10): 994-1005.

5.

Ádám, R., Kásler, M., Ember, I., Kopper, L., Thurzó, L.: Az onkológia alapjai. Medicina, Budapest, 1997.

6.

Bae, S. I., Park, J. G., Kim, Y. I., Kim, W. H.: Genetic alterations in gastric cancer cell lines and their original tissues. Int. J. Cancer. 2000; 87: 512-516.

7.

Blaser, M.J.: Role of vacA and the cagA locus of Helicobacter pylori in human disease. Aliment. Pharmacol. Ther. 1996; 39:10(S1): 73-77.

8.

Calabro, A., Orsini, B., Brocchi, A., Falchini, M., Fedi, P., Surrenti, C.: Gastric juice immunoreactive epidermal growth factor levels in patients with peptic ulcer disease. Am. J. Gastroenterol. 1990; 85(4): 404-407.

9.

Cats, A., Meuwissen, S. G. M., Forman, D., Craanen, M. E., Kuipers, E. J.: Helicobcter pylori: a true carcinogen? Eu. J. Gastroenterol. 1998; 10: 447-450.

10. Chung, Y. J., Kim, K. M., Choi, J. R., Choi, S. W., Rhyu, M. G.: Relationship between intratumor histological heterogenity and genetic abnormalities in gastric carcinoma with microsatellite instability. Int. J. Cancer. 1999; 82: 782-788.

11. Correa, P., Haenszel, W., Cuello, C., Zavala, D., Fontham, E., Zarama, G., Tannenbaum, S., Collazos, T., Ruiz.: Gastric precancerous process in a high risk population cohort follow-up. Cancer Res. 1990; 50: 4737-4740.

59

12. Correa, P., Fox, J., Fontham, E., Ruiz, B., Lin, Y. P., Zavala, D, Taylor, N., Mackinley, D., deLima, E., Portikka, H.: Helicobacter pylori and gastric carcinoma: serum antibody prevalence in populations with contrasting cancer risks. Cancer. 1990; 66: 2569-2574.

13. Correa, P.: Human gastric carcinogenesis: a multistep and multifactorial process. First American Cancer Society Award Lecture on Cancer Epidemiology and Prevention. Cancer Res. 1992; 52: 6735-6740.

14. Correa, P., Ruiz, B., Shi, T. Y., Janney, A., Sobhan, M., Torrado, J., Hunter, F.: Helicobacter pylori and Nucleolar Organizer Regions in the gastric antral mucosa. Anat. Path. 1994; 101: 656-660.

15. Coyle, W. J., Sedlack, R. E., Nemec, R., Peterson, R., Duntemann, T., Murphy, M., Lawson, J. M.: Eradication of Helicobacter pylori Normalizes Elevated Mucosal Levels of Epoidermal Growth Factor and Its Receptor. Am. J. Gastroenterol. 1999; 94: 2885-2889.

16. Crocker, J., Nar, P.: Nucleolar organizer regions in lymphomas. J. .Pathol. 1987; 152: 111-118.

17. Dignass, A. U., Podolski, D. K.: Cytokine modulation of intestinal epithel cell restitution: central role of transforming growth factor beta. Gastroenterology. 1993; 105: 1323-1332.

18. Eastwood, G. L.: A Review of Gasrointestinal Epithelial Renewal and Its Relevance to the Development of Adenocarcinomas of the Gastrointestinal Tract. J. Clin. Gastroenterol. 1995; 21(S1): S1-S11.

19. Ebert, M. P. A., Schandl, L., Malfertheiner, P.: Helicobacter pylori infection and molecular changes in gastric carcinogenesis. J. Gastroenterol. 2002; 37(SXIII): 45-49.

20. El-Guineid, A., El-Sherif, A. M., Murray-Lyon, I. M., Zureikat, N., Shousa, S.: Effect of chewing Qat on mucosal histology and prevalence of Helicobacter pylori in the oesophagus, stomach, and duodenum of Yemeni patients. Histopathology. 1991; 19: 437-443.

21. Endoh, Y., Sakata, K., Tamura, G., Ohmura, K., Ajioka, Y., Watanabe, H., Motoyama, T.: Cellular phenotypes of differentiated-type adenocarcinomas and precancerous lesions of the stomach are dependent on the genetic pathways. J. Pathol. 2000; 191: 257-263.

22. Ernst, P.: Review article: the role of inflammation in the pathogenesis of gastric cancer. Aliment. Pharmacol. Ther. 1999; 13(S1): 13-18.

23. Forman, D., Webb, P., Parsonnet, J.: H. pylori and gastric cancer. Lancet. 1994; 343: 243-244.

60

24. Fraser, A.G., Sim, R., Sankey, E.A. : Effect of eradication of Helicobacter pylori on gastric epithelial cell proliferatin. Aliment. Pharmacol. Ther. 1994, 8, 167-73.

25. Fuchs, C. S., Mayer, R. J.: Gastric carcinoma. N. Engl. J. Med. 1995; 333: 32-41.

26. Furuta, Y., Takasu, T., Asai, T., Yoshimura, S., Tokuchi, F., Shinohara, T., Nagashima, K., Inuyama, Y.: Clinical significance of the epidermal growth factor receptor gene in squamous cell carcinomas of the nasal cavities and paranasal sinuses. Cancer. 1992; 69: 358- 362.

27. Gavrieli, Y., Sherma, Y., Ben-Sasson, S.A.: Identification of programmed cell death via specific labelling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 1992; 119: 493-501.

28. Giuffre, G., Caruso, R. A., Barresi, G., Tuccari, G.: Prognostic significance of standardized AgNOR analysis in early and advanced gastric carcinomas. Virchows Arch. 1998; 433: 261-266.

29. Gomyo, Y., Osaki, M., Kaibara, N., Ito, H.: Numerical aberration and point mutation of p53 gene in human gastric intestinal metaplasia and well-differentiated adenocarcinoma: analysis by fluorescence in situ hybridization (FISH) and PCR-SSCP. Int. J. Cancer. 1996; 66: 594-6.

30. Granelli, P., Fichera, G., Zennaro, F., Siardi, F., De Ruberto, F., Fregoni, F., Appierto, V., Buffa, R., Ferrero, S., Biunno, I.: Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Human Intestinal Metaplasia: a Preliminary Report. Scand. J. Gastroenterol. 1997; 32(5): 485-489.

31. Gray, M.R., Darnton, S.J., Hunt, J.A.: Accelerated gastric epithelial proliferation. Gut. 1995; 36: 52227.

32. Griffiths, A. P., Butler, C. W., Roberts, P., Dixon, M. F., Quirke, P.: Silver-stained structures (AgNORs), their dependence on tissue fixation and absence of prognostic relevance in rectal adenocarcinoma. J. Pathol. 1989; 159: 121-127.

33. Gürel, S., Dolar, E., Yerci, Ö., Samli, B., Öztürk, H., Nak, S. G., Gülten, M., Memik, F.: Expression of p53 Protein and Prognosis in Gastric Carcinoma. J. Int. Med. Res. 1999; 27: 85-89.

34. Hall, P. A., Levison, D. A.: Review: Assesment of cell proliferation in histological material. J. Clin. Pathol. 1990; 43: 184-192.

35. Hirono, Y., Tsugawa, K., Fushida, S., Ninomiya, I., Yonemura, Y., Miyazaki, I, Endou, Y., Tanaka, M., Sasaki, T.: Amplification of Epidermal Growth Factor Receptor Gene and Its Relationship to

61

Survival in Human Gastric Cancer. Oncology. 1995; 52: 182-188.

36. Hongyo, T., Buzard, G. S., Palli, D., Weghorst, C. M., Amorosi, A., Galli, M., Caporaso, N. E., Fraumeni, J. F. Jr., Rice, J. M.: Mutations of the K-ras and p53 genes in gastric adenocarcinoma from a high incidence region around Florence, Italy. Cancer Res. 1995; 55: 2665-2672.

37. Houldsworth, J., Copldon-Cardo, C., Ladányi, M., Kelsen, D. P., Chaganti, R. S. K.: Gene amplification in gastric and oesophageal adenocarcinomas. Cancer Res. 1990; 50: 6417- 6422.

38. IARC: Schistosomes, Liver Flukes and Helicobacter pylori. Monographs on the evaluation carcinogenic risks to humans. IARC Sci. Publ. 1994; 61: 1-241.

39. Ierardi, E., Francavilla, A., Balzano, T., Traversa, A., Principi, M., Monno, R. A., Amoruso, A., Ingrosso, M., Pisani, A., Panella, C.: Effect of Helicobacter pylori eradication on gastric epithelial proliferation. Relationship with ras oncogene p21 expression. Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. 1997; 29: 214-219.

40. Iida, A., Hirose, K., Arai, M., Yamaguchi, A., Nakagawara, G.: Relationship among the Expression of Epidermal Growth Factor Receptor, Proliferating Cell Nuclear Antigen Labeling Index, and Lymph Node Metastasis in Gastric Cancer. Oncology. 1995; 52: 189-195.

41. Ikeda, M., Shomori, K., Endo, K., Makino, T., Matsuura, T., Ito, H.: Frequent occurrence of apoptosis is an early event in the oncogenesis of human gastric carcinoma. Virchows Arch. 1998; 432: 43-47.

42. Ikeguchi, M., Katano, K., Oka, A., Tsujitani, S., Maeta, M., Kaibara, N.: The proliferative activity of cancer cells at the invasive margin of a tumor is a good indicator of the prognosis of patients with gastric cancer with serosal invasion. Int. Surg. 1996; 81: 122-125.

43. Imatani, A., Sasano, H., Yabuki, N., Kato, K., Ohara, S., Asaki, S., Toyota, T., Nagura, H.: In situ analysis of tissue dynamics and p53 expression in human gastric mucosa. J. Pathol. 1996; 179: 39-42.

44. Irazusta, S. P., Vassallo, J., Magna, L. A., Metze, K., Trevisan, M.: The value of PCNA and AgNOR staining in endoscopic biopsies of gastric mucosa. Pathol. Res. Pract. 1998; 194: 33-39.

45. Ishida, M., Gomyo, Y., Tatebe, S., Ohfuji, S., Ito, H.: Apoptosis in human gastric mucosa, chronic gastritis, dysplasia and carcinoma: analysis by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labelling. Virchows. Arch. 1996; 428: 229-5.

62

46. Ishida, M., Gomyo, Y., Tatebe, S., Ohfuji, S., Ikeda, M., Kawasaki, H., Ito, H.: Evidence that Expression of a Mutated p53 Gene Attenuates Apoptotic Cell Death in Human Gastric Intestinal-type Carcinomas in vivo. Jpn. J. Cancer Res. 1997; 88: 468-475.

47. Ishitoya, J., Toriyama, M., Oguci, N., Kitamura, K., Ohshima, M., Aasano, K., Yamamoto, T.: Gene amplification and overexpression of EGF receptor in squamous cell carcinomas of the head and neck. Br. J. Cancer.1989; 59: 559-562. ? 48. Jones, N. L., Shannon, P. T., Cutz, E., Yeger, H., S. P. M.: Increase in proliferation and apoptosis of gastric epithelial cells early in the natural history of Helicobacter pylori infection. Am. J. Pathol. 1997; 151: 1695-1703.

49. Joypaul, B.V., Newman, E.L., Hopwood, D., Grant, A., Quershi, S., Lane, D.P., Cuschieri, A.: Expression of p53 protein in normal, dysplastic, and malignant gastric mucosa: an immunohistochemical study. J. of Pathol. 1993; 170: 279-83.

50. Kakeji, Y., Maehara, Y., Orita, H., Emi, Y., Ichiyoshi, Y., Korenaga, D., Sugimachi, K.: Argyrophilic nucleolar organizer region in endoscopically obtained biopsy tissue: a useful predictor of nodal metastasis and prognosis carcinoma of the stomach. J.Am. Coll. Surg. 1996; 182: 482-487.

51. Kasagi, N., Gomyo, Y., Shirai, H., Tsujitani, S., Ito, H.: Apoptotic cell death in human gastric carcinoma: analysis by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labelling. Jpn. J. Cancer. Res. 1994; 85: 939-45.

52. Konturek, S. J., Brzozowski, T., Majka, J., Dembinski, A., Slomiany. A., Slomiany, B. L.: Transforming growth factor alpha and epidermal growth factor in protection and healing of gastric mucosal injury. Scand. J. Gastroenterol. 1992; 27: 649-655.

53. Konturek, P. Ch.; Ernst, H., Konturek, S. J., Bobrzynski, A. J., Faller, G., Klingler, C., Hahn E. G.: Mucosal expression and luminal release of epidermal and transforming growth factors in patients with duodenal ulcer before and after eradication of Helicobacter pylori. Gut. 1997; 40: 463-469.

54. Konturek, P. Ch.; Bobrzynski, A., Konturek, S. J., Bielanski, W., Faller, G., Kirchner, T., Hahn E. G.: Epidermal Growth Factor and Transforming Growth Factor Alpha in Duodenal Ulcer and NonUlcer Dyspepsia Patients before and after Helicobacter pylori Eradication. Scand. J. Gastroenterol. 1998; 33(2): 143- 151.

55. Kuipers, E. J.: Relationship between Helicobacter pylori, atrophic gastritis and gastric cancer. Aliment. Pharmacol. Ther. 1998; 12(S1): 25-36.

63

56. Kuniyasu, H., Yasui, W., Yokozaki, H., Tahara, E.: Helicobacter pylori infection and carcinogenesis of the stomach. Lan. Arch. Surg. 2000; 385: 69-74.

57. Kyokane, K., Ito, M., Sato, Y., Ina, K., Ando, T., Kusugami, K.: Expression of Bcl-2 and p53 correlates with the morphology of gastric neoplasia. J. Pathol. 1998; 184: 382-389.

58. Lauren, P.: The two histological main types of gastric carcinoma diffuse and so-called intestinal type carcinoma. Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1965; 64: 31-49.

59. Lee, H., Jaejung, J., Kim, Y., Ahn, S., Gong, M., Coi, E., Lee, I.: „Malgun” (clear) cell change of gastric epithelium in chronic Helicobacter pylori gastritis. Pathol. Res. Pract. 2000; 196: 541-551.

60. Leung, W.K., Yu, J., To, K. F., Go, M. Y. Y., Ma, P. K., Chan, F. K. L., Sung, J. J., Y.: Apoptosis and proliferation in Helicobacter pylori-associated gastric intestinal metaplasia. Aliment. Pharmacol. Ther. 2001; 15: 1467-1472.

61. Libermann, T. A., Nusbaum, H. R., Razon, N., Kris, R., Lax, I., Soreq H., Whittle, N., Waterfield, M. D., Ullrich, A., Schlessinger, J.: Amp lification, enhanced expression and possible rearrangement of EGF receptor gene in primary human brain tumours of glial origin. Nature. 1985; 313: 144-147.

62. Liu, L., Turner, J. R., Yu, Y., Khan, A. J., Jaszewski, R., Fligiel, S. E. G., Majumdar, A. P. N.: Differential expression of EGFR during early reparative phase of the gasrtic mucosa between young and aged rats. Am. J. Physiol. 1998; 275(5Pt1): G943-950.

63. Maehara, Y., Kabashima, A., Koga, T., Tokunaga, E., Hideya, T., Kakeji, Y., Sugimachi, K.: Vascular invasion and potential for tumor angiogenesis and metastasis in gastric carcinoma. Surgery. 2000; 128: 408-416.

64. Malfertheiner, P., Mégraud, F., O’Morain, C., Bell, D., Bianchi Porro, G., Deltenre, M., Forman, D., Gasbarrini, G., Jaup, B., Misiewicz, J..J., Pajares, J., Quina, M., Rauws, E.: Current European concepts in the management of Helicobacter pylori infection – the Maastricht Consensus Report. The European Helicobacter Pylori Study Group (EHPSG). Eur.J. Gastroenterol. 1997; 9: 1-2.

65. Matozaki, T., Sakamoto, C., Suzuki, T., Matsuda, K., Uchida, T., Nakano, O., Wada, K., Nishisaki, H., Konda, Y., Nagao, M., Kasuga, M.: P53 gene mutations in human gastric cancer: wild -type p53 but not mutant p53 supresses growth of human gastric cancer cells. Cancer Res. 1992; 52: 4335-41.

64

66. Matsuzaki, H., Shimada, S., Uno, K., Tsuruta, J., Ogawa, M.: Novel subtyping of intestinal metaplasia in the human stomach. Am. J. C.lin Pathol. 1998; 109: 181-189.

67. Miracco, C., Spina, D., Vindigni, C., Filipe, M. I., Tosi, P.: Cell proliferation patterns and p53 expression in gastric dysplasia. Int. J. Cancer. 1995; 62: 149-154.

68. Misra, V., Bisht, D., Misra, S. P., Dwivedi, M., Bhatia, R.: Argyrophilic nucleolar organizer regions in Helicobacter pylori-associated gastric lesions. APMIS. 2000; 108: 448-452.

69. Morais, M., Dockery, P., White, F. H.: A quantitative study of silver-stained NORs in different segments of the normal human colorectal crypt. J. Anat. 1996; 188: 521-527.

70. Moss, S. F.: Review article:cellular markers in the gastric precancerous process. Aliment. Pharmacol. Ther. 1998; 12 (Suppl. 1): 91-109.

71. Moss, S. F., Valle, J., Abdalla, A. M., Wang, S., Siurala, M., Sipponen, P.: Gastric cellular turnover and development of atrophy after 31 years os follow-up: a case control study. Am. J. Gastroenterol. 1999; 94: 2109-2114.

72. Moss, S. F., Calam, J., Agarwal, B., Wang, S., Holt, P. R.: Induction of gastric epithelial apoptosis by Helicobacter pylori. Gut. 1996; 38: 498-501.

73. Nakamura, K., Sugano, H., Takagi, K.: Carcinoma of the stomach in incipient phase: its histogenesis and histological appearances. GANN. 1968; 59: 251-258.

74. Nardone, G., Staibano, S., Rocco, A., Mezza, E., D’Armiento, F. P., Insabato, L., Coppola, A., Salvatore, G., Lucariello, A., Figura, N., De Rosa, G., Budillon, G.: Effect of Helicobacter pylori infection and its eradication on cell proliferation, DNA status, and oncogene expression in patients with chronic gastritis. Gut. 1999; 44: 789-799.

75. Negoescu, A., Guillermet, Ch., Lorimier, Ph., Robert, C., Lantuejoul, S., Brambilla, E., LabatMoleur, F.: TUNEL Apoptotic Cell Detection in Archieved Paraffin-embedded Tissues. Biochem. 1998; 3, 36-41.

76. Nigro, J. M., Baker, S. J., Preisinger, A. C., Jessup, J. M., Hostetter, R., Cleary, K., Bigner, S. H., Davidson, N., Baylin, S., Devilee, P., Glover, T., Collins, F. S., Weston, A., Modali, R., Harris, C. C., Vogelstein, B.: Mutation in the p53 gene occur in diverse humon tumor types. Nature. 1989; 342: 491-494.

65

77. Nyska, A., Zusman, I., Klein, T., Sheila, N., Weis, O., Madar, Z., Klein, B.: Assesment of the Nucleolar Organizer Regions by Automated Image Analysis in benign and malignant colonic tumours and adjacent tissues in rats. J. Comp. Path. 1995; 113: 45-50.

78. Öffner, D., Bánkfalvi, Á., Riehemann, K., Bier, B., Böcker, W., Schmid, W.: Wet autoclave pretreatment improves the visualization of silver-stained nucleolar organizer-region-associated proteins in routinely forma lin-fixed and paraffin-embedded tissues. Mod. Path. 1994; 7: 946-950.

79. Pai, R., Tarnawski, A.: Signal Transduction Cascades Triggered by EGF Receptor Activation. Relevance to gastric Injury Repair and Ulcer Healing. Dig. Dis. Sci. 1998; 43(S): 14-22.

80. Pálka, I., Tiszlavicz, L.: A p53 onkoprotein elofordulásánal sajátosságai gyomorrákos betegekben. Orvosi Hetilap. 1999; 140: 1165-1168.

81. Parsonnet, J., Vandersteen, D., Goates, J., Sibley, R. K., Pritkin, J., Chan, Y.: Helicobacter pylori and intestinal- and diffuse-type gastric adenocarcinoma. J. Natl. Cancer Inst. 1991; 83: 640-643.

82. Parsonnet, J., Friedman, G. D., Vandersteen, D. P., Chang, Y., Vogelman, J. H., Orentreich, N., Sibley, R. K.: Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N. Engl. J. Med. 1991; 325: 1127-1131.

83. Peek, R. M., Moss, S. F., Tham, K. T., Perez-Perez, G. I., Wang, S., Miller, G. G., Atherton, J. C., Holt, P. R., Blaser, M. J.: Helicobacter pylori cagA+ strains and dissociation of gastric epithelial cell proliferation from apoptosis. J. Natl. Cancer Inst. 1997; 89: 863-868.

84. Peek, R. M., Blaser, M. J., Mays, D. J., Forsyth, M. H., Cover, T. L., Song, S. Y., Krishna, U., Pietenpol, J. A.: Helicobacter pylori Strain-specific Genotypes and Modulation of the Gastric Epithelial Cell Cycle. Cancer Res. 1999; 59: 6124-6131.

85. Playford, R. J., Boulton, R., Ghatei, M. A., Bloom, S. R., Wright, N. A., Goodlad, R. A.: Comparison of the Effects of Transforming Growth Factor ? and Epidermal Growth Factor on Gastrointestinal Proliferation and Hormone Release. Digestion. 1996; 57: 362-367.

86. Polk, W. H., Dempsey, P. J., Russell, W. E., Brown, P. I., Beauchamp, R. D., Barnard, J. A., Coffey, R. J.: Increased production of transforming growth factor alpha following acute gastric injury. Gastroenterology. 1992; 102(5): 1467-14474.

87. Reinacher-Schick, A., Petrasch, S., Burger, A., Suerbaum, S., Kunstmann, E., Schmiegel, W.: Helicobacter pylori induces apoptosis in mucosal lymphocytes in patients with gastritis. Z.

66

Gastroenterol. 1998; 36: 1021-1026.

88. Ricci, V., Ciacci, C., Zarrilli, R., Sommi, P., Tummuru, M. K. R., Del Vecchio Blanco, C., Bruni, C. B., Cover, T. L., Blaser, M. J., Romano, M.: Effect of Helicobacter pylori on gastric epithelial cell migration and proliferation in vitro: role of vacA and cagA. Infect. Immun. 1996; 64: 2829-2833.

89. Rokkas, T., Ladas, S., Liatsos, C., Petridou, E., Papatheodorou, G., Theocharis S., Karameris, A., Raptis, S.: Relationship of Helicobacter pylori CagA Status to Gastric Cell Proliferation and Apoptosis. Dig. Dis. Sci. 1999; 44: 487-93.

90. Romano, M., Ricci, V., Di Popolo, A., Sommi, P., Del Vecchio Blanco, C., Bruni, B. C., Ventura, U., Cover, L. T., Blaser, M. J., Coffey, R. J., Zarrilli R.: Helicobacter pylori Upregulates Expression of Epidermal Growth Factor related Peptides, but Inhibits Their Proliferative Effect in MKN 28 Gastric Mucosal Cells. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1604-1613.

91. Ruzsovics, Á., Molnár, B., Tulassay, Zs.: A Helicobacter pylori molekuláris biológiai jellemzoi. Orvosi Hetilap. 2000; 141: 2535-2540.

92. Rüschoff, J., Bittinger, A., Neumann, K., Schmitz-Moormann, P.: Prognostic significance of Nucleolar Organizing Regions (NORs) in carcinomas of the sigmoid colon and rectum. Path. Res. Pract. 1990; 186: 85-91.

93. Rüschoff, J., Plate, K., Bittinger, A., Thomas, C.: Nucleolar Organizer Regions (NORs). Basic concepts and practical application in tumor pathology. Path. Res. 1989; 185: 878-885.

94. Saegusa, M., Takano, Y., Okayasu, I.: Bcl-2 expression and its association with cell kinetics in human gastric carcinomas and intestinal metaplasia. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1995;121:357-363. 95. Safatle-Ribeiro, A. V., Ribeiro, U., Clarke, M. R., Sakai, P., Ishioka, S., Garrido, A. B., Gama Rodrigues, J., Safatle, N. F., Reynolds, J. C.: Relationship Between Persistence of Helicobacter pylori and Dysplasia, Intestinal Metaplasia, Atrophy, Inflammation, and Cell Proliferation Following Partial Gastrectomy. Dig. Dis. Sci. 1999, 44, 243-52.

96. Sasaki, I., Yao, T., Nawata, H., Tsuneyoshi, M.: Minute gastric carcinoma of differentiated type with special reference to the significance of intestinal metaplasia, proliferative zone, and p53 protein during tumor development. Cancer. 1999; 85: 1719-1729.

97. Sápi, Z., Bodó, M., Sugár, J.: Nucleolar organizer regions in soft tissue tumours. A. Morph. Hun. 1991; 39: 59-70.

67

98. Scotiniotis, I. A., Rokkas, T., Furth, E. E., Rigas, B., Shiff, S. J.: Altered gastric epithelial cell kinetics in Helicobacter pylori-associated intestinal metaplasia: implications for gastric carcinogenesis. Int. J. Caner. 2000; 85: 192-200.

99. Setala, L., Kosma, V. M., Lipponen, P., Naukkarinen, A., Nordling, S., Hollmén, S., Eskelinen, M., Syrjanen, K., Alhava, E.: Clinical relevance of p53 index and expression of proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 in gastric cancer. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1998; 124: 497-502.

100. Shiao, Y.H., Rugge, M., Correa, P., Lehmann, H.P., Scheer, W.D.: P53 alteration in gastric precancerous lesions. Am. J. Pathology. 1994; 144: 511-7.

101. Shinohara, T., Ohshima, K., Murayama, H., Kikuchi, M., Yamashita, Y., Shirakusa, T.: Apoptosis and proliferation in gastric carcinoma: the association with histological type. Histopathology. 1996; 29: 123-9.

102. Shirin, H., Sordillo, E.M., Oh, S.H., Yamamoto, H., Delohery, T., Weinstein, B., Moss, S.F.: Helicobacter pylori inhibits the G1 to S transition in AGS gastric epithelial cells. Cancer Res. 1999; 59: 2277-81.

103. Shirin, H., Sordillo, E.M., Kolevska, T. K., Hibshoosh, H., Kawabata, Y., Oh, S.H., Kuebler, J., Delohery, T., Weghorst, C., Weinstein, B., Moss, S.F.: Chronic Helicobacter pylori infection induces an apoptosis -resistant phenotype associated with decreased expressin of p27kip1 . Infect. Immun. 2000; 68: 5321-5328.

104. Sinn, H. P., Lehnert, Th., Kandetzki, C., Waldherr, R.: Nucleolar organizer regions in myogenic stromal tumours of the stomach. Virchows Arch. 1989; 415: 317-321.

105. Sipponen, P., Hyvarinen, H., Seppalat, K., Blaser, M. J.: Revie w article: pathogenesis of the transformation from gastritis to malignancy. Aliment. Pharmacol. Ther. 1998; 12 (S1): 61-71.

106. Slamon, D. J., Clark, G. M., Wong, S. G., Levin, W. J., Ullrich, A., McGuire, W. L.: Human breast cancer: Correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987; 235: 177-182. ? 107. Smoot, D.T.: How does Helicobacter pylori cause mucosal damage? Direct mechanisms. Gastroenterology. 1997; 113: S31-S34.

108. Smoot, D. T., Wynn, Z., Elliott, T. B., Allen, C. R., Mekasha, G., Naab, T., Ashktorab, H.: Effects of

68

Helicobacter pylori on proliferation of gastric epithelial cells in vitro. Am. J. Gastroenterol. 1999;94: 1508-1511.

109. Soussi, T.: P53 Antibodies in the Sera of Patients with Various Types of Cancer: A Review. Cancer Res. 2000; 60: 1777-1788.

110. Stemmermann, G. N.: Intestinal metaplasia of the stomach: a status report. Cancer. 1994;74: 556564.

111. Sung, J. J. Y., Leung, W. K., Go, M. Y. Y., To, K. F., Cheng, A. S., Ng, E. K., Cha, F.K.: Cyclooxygenase-2 expression in Helicobacter pylori-associated premalignant and malignant gastric lesions. Am. J. Pathol. 2000; 157: 729- 735.

112. Szaleczky, E., Prónai, L., Molnár, B., Berczi, L., Fehér, J., Tulassay, Z.: Increased cell proliferation in chronic Helicobacter pylori positive gastritis and gastric carcinoma – correlation between histochemistry and Tv image cytometry. Anal. Cell. Pathol. 2000; 20 (2-3): 131-9.

113. Takagi, A., Watanabe, S., Igarashi, M., Koike, J., Hasumi, K., Deguchi, R., Koga, Y., Miwa, T.: The effect of Helicobacter pylori on cell proliferation and apoptosis in gastric epithelia l cell lines. Aliment. Pharmacol. Ther. 2000; 14(S1): 188-192.

114. Tarnawski, A., Stachura, J., Durbin, T., Sarfeh, I. J., Gergely, H.: Increased Expression of Epidermal Growth Factor Receptor During Gastric Ulcer Healing in Rats. Gastroenterology. 1992; 102: 695698.

115. The Eurogast Study Group: An international assosiation between Helicobacter pylori infection and gastric cancer. Lancet. 1993; 341: 1359-1362.

116. Tokunaga, A., Onda, M., Okuda, T., Teramoto, T., Fujita, I., Mizutani, T., Kiyama, T., Yoshiyuki, T., Nishi, K., Matsukura, N.: Clinical Significance of Epidermal Growth Factor (EGF), EGF Receptor, and c-erb-2 in Human Gastric Cancer. Cancer. 1995; 75(S): 1418-1425.

117. Varró, V.: Gasztroenterológia. Medicina Könyvkiadó, Budapest; 1997.

118. Wagner, S., Beil, W., Westermann, J., Logan, R. P. H., Bock, C. T., Trautwein, C, Bleck, J. S., Manns, M. P.: Regulation of gastric epithelial cell growth by Helicobacter pylori: evidence for a major role of apoptosis. Gastroenterology. 1997; 113: 1836-1847.

69

119. Wang, J. Y., Hsieh, J. S., Huang, T. J.: The Effect of Portal Hypertension on Transforming Growth Factor-? and Epidermal Growth Factor Receptor in the Gastric Mucosa of Rats. Int. Surg. 1998; 83: 220-223.

120. Wang, J., Chi, D. S., Kalin, G. B., Sosinski, c., Miller, L. E., Burja, I., Thomas, E.: Helicobacter pylori infection and oncogene expression in gastric carcinoma and its precursor lesions. Dig. Dis. Sci. 2002; 47: 107-113.

121. Wong, B. C. Y., Wang, W. P., So, W. H. L., Shin, V. Y., Wong, W. M., Fung, F. M. Y., Liu, E. S. L., Hiu, W. M., Lam, S. K., Cho, C. H.: Epidermal growth factor and its receptor in chronic active gastritis and gastroduodenal ulcer before and after Helicobacter pylori eradication. Aliment. Pharmacol. Ther. 2001; 15: 1459-1465.

122. Wu, M.S., Shun, C.T., Chen, C.J., Wang,H.P., Lee, W.J., Sheu, J.C., Lin, J.T.: Overexpression of p53 in different subtypes of intestinal metaplasia and gastric cancer. British J. of Cancer. 1998; 78(7), 971-3.

123. Wu, M. S., Shun, C. T., Wang, H. P., Sheu, J. C., Lee, W. J.,Wang, T. H., Lin, J. T.: Relation to histological subtypes, tumor stage, and Helicobacter pylori. Gastroenterology. 1997; 112: 1457-1465.

124. Wu, M. S., Shun, C. T., Lee, W. C.,Chen, C. J., Wang, H. P., Lee, W. J., Sheu, J. C., Lin, J. T.: Gastric cancer risk in relation to Helicobacter pylori infection and subtypes of intestinal metaplasia. Brit. J. Cancer. 1998; 78 (1): 125-128.

125. Xia, H. H. X., Talley, N.: Apoptosis in gastric epithelium induced by Helicobacter pylori infection: implications in gastric carcinogenesis. Am. J. Gastroenterol. 2001; 96: 16-26.

126. Yamada, Y., Yoshida,, T., Hayashi, K., Hayashi, K., Sekiya, T., Yokota, J., Hirohashi, S., Nakatani, K., Nakano, H., Sugimura, T., Tereda, M.: P53 gene mutations in gastric cancer metastases and in gastric cancer cell lines derived from metastases. Canecr Res. 1991; 51: 5800-5805.

127. Yang, P., Huang, G. S., Zhu, X. S.: Role of nucleolar organiser regions in differentiating malignant from benign tumours of the colon. J. Clin. Pathol. 1990; 43: 235-238.

128. Yasui, W., Sumiyoshi, H., Hata, J., Kameda, T., Ochiai, A., Ito, H., Tahara, E.: Expression of epidermal growth factor receptor in human gastric and colonic carcinomas. Cancer Res. 1988; 48: 137-141.

129. Yokozaki, H., Yasui, W., Tahara, E.: Genetic and Epigenetic Changes in Stomach Cancer.

70

International Review of Cytology. 2001; 204: 49-95.

130. Yoshimura, T., Shimoyama, T., Tanaka, Msasaki, Y., Fukuda, S., Munakata, A.: Gastric mucosal inflammation and epithelial cell turnover are associated with gastric cancer in patients with Helicobacter pylori infection. J. Clin. Pathol. 2000; 53: 532-536.

131. Yu, C.C.W., Fletcher, C.D.M., Newman, P.L.: A comparison of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunostaining, nucleolar organizer region (AgNOR) staining, and histological grading in gastrointestinal stromal tunours. J. Path. 1992; 166: 147-52.

132. Yustein, A. S., Harper, J. C., Petroni, G. R., Cummings, O. W., Moskaluk, C. A., Powell, S. M.: Allotype of gastric adenocarcinoma. Cancer Res. 1999; 59: 1437-1441.

133. Zhu, G. H., Wong, B. C. Y., Eggo, M. C., Yuen, S. T., Lai, K. C., Lam, S. K.: Pharmacological inhibition of protein kinase C activity could induce apoptosis in gastric cancer cells by differential regulation of apoptosis -related genes. Dig. Dis. Sci. 1999; 44: 2020-2026.

71

8. 2 Az értekezés témájában megjelent saját közlemények

I. Unger Zs., Szaleczky E., Molnár B., Prónai L., Zágoni T., Tulassay Zs.:A H. pylori fertozés és az eradikáció hatása a gyomornyálkahártya proliferációjának kinetikájára. Orvosi Hetilap. 2000; 141(50):2695-2700.

II. Unger Zs., Molnár B., Prónai L., Szaleczky E., Zágoni T., Tulassay Zs.: A Helicobacter pylori fertozés hatása a p53 onkoprotein expresszió és az apoptotikus aktivitás megváltozására gyomornyálkahártyán. Magyar Belorv. Arch. 2000; 53:362366.

III. Zs. Unger, B. Molnár, E. Szaleczky, E. Törgyekes, F. Müller, T. Zágoni, Zs. Tulassay, L. Prónai: Effect of Helicobacter pylori infection and eradication on gastric epithelial cell proliferation and apoptosis. J. Physiol. Paris. 2001; 95(1-6):355-60.

IV. Zs., Unger, B., Molnár, L., Prónai, E., Szaleczky, T., Zágoni T., Z., Tulassay: Mutant p53 expression and apoptotic activity of H. pylori positive and negative gastritis in correlation to the presence of intestinal metaplasia. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2003; 15(4): 389-394.

V. Á., Ruzsovics,

Zs., Unger, B., Molnár, L., Prónai, Z., Tulassay: Effect of

Helicobacter pylori infection on epidermal growth factor receptor (EGFR) expression and cell proliferation on gastric epithelial mucosa: correlation to macro and microscopic diagnosis. Int. J. Exp. Pathol. 2002; 83(5): 257-63.

VI. Ruzsovics Á., Molnár B., Unger Zs., Tulassay Z., Prónai L.: Helicobacter pylori cagA, vacA genotípusának meghatározása real-time PCR módszerrel. Orv. Hetil. 2001; 142(10):509-14.

72

VII. Á., Ruzsovics, B., Molnár, Zs., Unger, Z., Tulassay, L., Prónai: Determination of Helicobacter pylori cagA, vacA genotypes with real-time PCR melting curve analysis. J.Physiol. Paris. 2001; 95(1-6):369-77.

Referált folyóiratban megjelent eloadás-összefoglalók:

I. Mechanical cell separation and flow cytometry for quantitative DNA analysis of colonoscopic biopsies. Zs. Unger, J. Kármán, A. Németh, B. Molnár, L. Prónai, T. Zágoni, Z. Tulassay. Z. Gastroenterol.1999; 37: 453, A199.

II. Nitric oxide synthesis is decreases in gastric cancer. L. Prónai, E. Szaleczky, Zs. Unger, B. Molnár, H. Nakazawa, Z. Tulassay. Z. Gastroenterol. 1999; 37: 441, A149.

III. Effect of Helicobacter pylori infection and eradication on gastric cell proliferation and apoptosis. Zs. Unger, B. Molnár, L. Prónai, Z. Tulassay. Z. Gastroenterol. 2000; 38: 429, A125.

IV. Different effect of H. pylori on p53 oncoprotein expression and apoptosis of gastric epithelium in presence and absence of intestinal metaplasia. Zs. Unger, L. Prónai, B. Molnár, Á. Ruzsovics, L. Schandl, Z. Tulassay. Z. Gastroenterol. 2001; 39: 428, A193.

V. Determination of H. pylori vac-a, cag-a and urease genes with real-time PCR analysis and its correlation with immunohostochemistry. Á. Ruzsovics, B. Molnár, L. Prónai, Zs. Unger, Z. Tulassay. Z. Gastroenterol. 2001; 39: 417, A149.

73

8. 3 Az értekezés témájában megjelent közlemények különlenyomatai

74