D IA GN OSZTIKAI ELJÁRÁSOK
Helicobacter pylori cagA, vacA genotípusának meghatározása real-time PCR módszerrel Ruzsovics Ágnes dr., Molnár Béla dr., Unger Zsuzsa dr., Tulassay Zsolt dr. és Prónai László dr. Semmelweis Egyetem, Budapest, Általános Orvostudományi Kar, II. Belgyógyászati Klinika (intézetvezető: Tulassay Zsolt dr.) A Helicobacter pylori (H. pylori) cagA génjének jelenléte fokozza a gyomornyálkahártya proliferációját és a baktérium virulenciájának mutatója, a vacA gén súlyos gyomornyálkahártya-gyulladást idéz elõ. E tanulmány célja a H. pylori cagA, valamint vacA genotípusának meghatározása real-time PCR-technikával, a dupla szálú DNS (dsDNS)-specifikus SYBR Green I. festéket alkalmazva. Az eredményeket két immunhisztokémiai módszerrel vetették össze. A szerzõk 43 beteg paraffinba ágyazott szövetmintáit vizsgálták szövettani, epidermális növekedési faktor-receptor (EGFR), proliferáló sejtmag antigén (PCNA) immunhisztokémiai módszerrel és real-time PCR olvadáspont-analízissel LightCyclerTM készüléken. A PCR és a szövettani diagnózis eredményei cagA esetében 57%-ban, vacA esetében 58%-ban egyeztek. Statisztikailag szignifikáns különbséget találtak a gyomornyálkahártya gyulladása és a fokozott sejtproliferáció között (p = 0,02). A szövettani diagnózis és a baktérium genotípusa közötti kapcsolat vizsgálatakor cagA jelenlétében a gastritis csoportban (p = 0,003), vacA jelenlétében az intestinalis metaplasia csoportban találtak szignifikáns különbséget az ép epithelhez viszonyítva (p = 0,045). Intestinalis metaplasia esetében a cagA jelenléte és az EGFR expressziója szignifikáns kapcsolatot mutatott (p = 0,0418). Eredményeik is alátámasztják, azt a megfigyelést, mely arra utal, hogy cagA-pozitív H. pylori törzzsel történõ fertõzés fokozott sejtproliferációt vált ki és növeli az intestinalis metaplasia kialakulásának esélyét. A vacA-pozitív H. pylori fertõzés gátolja az EGFR szignáltranszdukciós folyamatait, amelyek befolyásolják a mucosa regenerációját. Intestinalis metaplasia és gyomorrák esetében az EGFR és a H. pylori szerepe nem teljesen tisztázott. A szerzõk módszere alkalmasnak látszik a H. pylori genotípusának meghatározására.
Determination of cagA, vacA genotypes of Helicobacter pylori with real-time PCR method. Presence of cagA gene of Helicobacter pylori (H. pylori) increases proliferation of stomach mucosa and it is an index of raised virulence of the bacteria. The vacA gene of H. pylori induces a serious inflammation of stomach. The purpose of this study was to determine cagA and vacA genotypes of H. pylori using real-time polymerase chain reaction (PCR) method with the double strain DNA(dsDNA) binding SYBR Green I. dye. Results were compared with those of two immunohistochemical methods. 43 patients’ paraffin embedded biopsy tissue samples were examined by histology, epidermal growth factor receptor (EGFR), proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunohistochemistry and melting curve analysis of real-time PCR using LightCycler instrument. Results of histology and real-time PCR from gastric biopsies correlated in 57% of cag acases and in 58% of vac cases. Significant difference was detected between normal and gastritis cases in the presence of cagA gene (p = 0.003) and between normal epithel and intestinal metaplasia cases in the presence of vacA gene (p = 0.045) by investigation of association of histology and genotype of bacterium. Statisticaly significant difference (p = 0.02) was found between increased cell proliferation and the presence of gastritis. Significant correlation was found between the presence of cagA gene and EGFR expression in intestinal metaplasia cases (p = 0.0418). Results underlie the statistics that infection with cagA positive H. pylori strain increases the cell proliferation on the stomach mucosa and raises the chance of development of intestinal metaplasia. Infection with vacA positive H. pylori inhibits the signal-transduction pathway of EGFR, which influences mechanisms of mucosa repair. The role of EGFR and H. pylori infection is yet unclear in intestinal metaplasia and cancer. The authors’ method seem to be suitable for determination of genotypes of H. pylori.
Kulcsszavak: Helicobacter pylori, genotípus, real-time PCR, immunhisztokémia
Key words: Helicobacter pylori, genotype, real-time PCR, immunohistochemistry
A H. pylori jelenléte nem jelenti törvényszerűen azt, hogy H. pylori-val asszociált betegségek is kialakulnak. Ennek több oka közül a gazdaszervezet heterogén genetikai tényezői, a betegek eltérő szociális helyzete és a különböző H. pylori genotípus jelenléte a legfontosabbak. A H. pylori különböző genotípusai napjainkban a vizsgálatok előterébe kerültek a gyomornyálkahártya-epithelsejt károsodásában betöltött fontos szerepük miatt. Számos vizsgálat mutatta, hogy a cagA gén (cytotoxin associated
gene) jelenléte a növekvő virulencia mutatója és egyben stimulálja a mucosa sejtproliferációját, amely a malignus transzformáció kialakulásának kedvez (13). A vacA gén (vakuolizáló citotoxin) súlyos gyomornyálkahártya-gyulladást okoz (13, 18). A baktérium fekélyképződést elősegítő és a fekély gyógyulását gátló hatásának mechanizmusa azonban még nem teljesen ismert. A gyomornyálkahártya védekező mechanizmusa és a folyamatos sejtmegújulás és proliferáció felelős a mucosa integritásának fenn-
Orvosi Hetilap 2001, 142 (10), 509–514.
509
tartásáért és a gyulladás, valamint a fekély gyógyulásáért. E mechanizmus legfontosabb tényezője az epidermális növekedési faktor (epidermal growth factor; EGF) és receptora (EGFR). A nyálkahártya-sérülés helyén az EGFR eloszlása megváltozik, a helyileg felszaporodó EGF fokozott EGFR-expressziót vált ki (3). Az 1980-as évek eleje óta a molekuláris biológiai eljárások robbanásszerűen fejlődtek. A nukleinsav-kimutatási módszerekben hatalmas előrelépést jelentett a szenzitív polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction; PCR) kidolgozása. A reakciótermékek specifikus detektálásán kívül napjainkban azonban felmerült a gyorsaság, egyszerűség, biztonság, kvantitativitás és reprodukálhatóság igénye is. A real-time PCR, vagy LightTM Cycler , amely a leggyorsabb thermocycler, megfelel ezeknek az elvárásoknak. A legfontosabb jellemzője ezen új, a fluoreszcencia elvén működő technológiának, hogy egyazon reakciókapillárisban történik az amplifikáció és a kiértékelés folyamata. A PCR folyamán a reakcióelegyhez adott fluoreszcens festék gerjesztővé válik és a keletkező fluoreszcens jeleket a készülékbe beépített Rodenstock fotométer real-time detektálja. A műszer által létrehozott kinetikus görbe kvantitatív értékelésre is alkalmas, egy előzetesen felvett kalibráció és a beépített software segítségével (1, 5). A készülék olvadáspont-analízisre is lehetőséget ad, azáltal, hogy a hőmérséklet lassú, denaturációig történő emelésének hatására a fluoreszcens emisszió hirtelen lecsökken annál a hőmérsékletnél (olvadási hőmérséklet; Tm), ahol a festék ledisszociál a templátról. Ezen változás negatív deriváltját ábrázolja a készülék olvadási görbeként (melting curve [12]).
Tanulmányunkban a real-time PCR olvadáspont-analízis módszerét alkalmaztuk H. pylori különböző genotípusának meghatározására paraffinba ágyazott biopsziás szövetmintából. A fluoreszcens protokollhoz dupla szálú DNS (dsDNS)-specifikus festéket (SYBR Green I) használtunk, amely a PCR során képződő DNS-kettősszálhoz kötődve válik gerjesztővé (7). Eredményeinket összevetettük az endoszkópos és szövettani diagnózissal, valamint az EGFR és az epithelsejtek proliferációs képességét bemutató proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunhisztokémiai festés eredményével.
Anyagok és módszerek 43 beteg (21 férfi, 22 nő, átlagéletkor: 62,2 [25–89] év) gasztroszkópos biopsziás mintáit vizsgáltuk. A paraffinba ágyazott szövetmintákat a szövettani diagnózis alapján csoportosítottuk a következőképpen: ép gyomorepithel (n = 3), krónikus gastritis (n = 12), krónikus gastritis intestinalis metaplasiával (n = 3), H. pylori-asszociált gastritis (n = 17), H. pylori-asszociált gastritis intestinalis metaplasiával (n = 6) és gyomorcarcinoma (n = 2). A H. pylori meghatározását ureáz gyorsteszttel, valamint módosított Giemsa-festéssel történő szövettani értékeléssel végeztük.
Real-time PCR protokoll A paraffinblokkokból három, egyenként 10 µm vastagságú metszetet vágtunk és helyeztünk Eppendorf csőbe. A deparaffinálás a hagyományos xilol és abszolút alkohol segítségével történt. A nukleinsav izolálását a biopsziás mintákból a High Pure PCR Template Preparation Kittel (Roche Molecular Biochemicals, Germany) végeztük, a gyártó ajánlása alapján. Az izolálás során a bakteriális DNS feltárására lizozim enzimet (SigmaAldrich Chemie GmbH., Germany) használtunk. Így 200 µl izolált genom DNS-t nyertünk, amelyből 2 µl aliquotot adtunk a PCR-hez. A templát DNS koncentrációját 260 nm-en spektrofotometriás módszerrel határoztuk meg. A korábban már közölt primereket alaptisztítással és sómentesítve szintetizáltattuk (Amersham Pharmacia Biotech, Germany) (4, 13). A szenz 5’-ATA ATG CTA AAT TAG ACA ACT TGA GCGA-3’ és az anti-szenz 5’-TTA GAA TAA TCA ACA AAC ATC ACG CCAT-3’
510
1. ábra: cagA (297 bp) és vacA (259 bp) génszakasz kimutatása, gélelektroforézis
1: DNA Molecular Weight Marker VIII. (0,019–1,11 kbp), 2–5: cagA kimutatása (2: negatív kontroll, 3: cagA+ szövetminta, 4: 26 695 H. pylori, 5: TK 1054 H. pylori), 6–9: vacA kimutatása (6: negatív kontroll, 7: vacA- szövetminta, 8: 26 695 H. pylori, 9: TK 1054 H. pylori)
primer a 297bp molekulasúlyú lcagA génszekvencia kimutatására alkalmas, amely a cagA gén középső régiójának jelenlétét reprezentálja. A 259bp molekulasúlyú vacA gén kimutatására a vacA szenz primer: 5’-ATG GAA ATA CAA CAA ACA CAC-3’ és az anti-szenz 5’-CTG CTT GAA TGC GCC AAAC-3’ primert használtuk. Pozitív kontrollként a 26 695 és a TK 1054 cagA+, vacA+ H. pylori törzs 15 × 107 baktérium/ml (0,5 McFarland), 8,02 µg/ml DNS koncentrációjú oldatát alkalmaztuk. A negatív kontrollban a templát DNS-t PCR-vízzel helyettesítettük. A kontrollok és a primerek alkalmazhatóságát gélelektroforézissel ellenőriztük (1. ábra). A 20 µl PCR reakcióelegy a LightCycler–DNA Master SYBR Green I. Kit (Roche Molecular Biochemicals, Germany) leírásának megfelelően 2–2 µl primert (0,5 µM végkoncentrációjú), 2 µl genom DNS-t, 2,4 µl 4mM koncentrációjú MgCl2-oldatot és 2 µl SYBR Green I festékoldatot tartalmazott. A kit festékoldata magában foglalta a nukleotidokat, Taq DNA polimerázt és a reakciópuffert. A reakcióelegy 5 µl-ét üvegkapillárisba pipettáztuk (Idaho Technology, Idaho Falls, USA), majd rövid centrifugálás után a LightCycler LC 24 készülékbe helyeztük (Idaho Technology, Idaho Falls, USA). CagA-kimutatás esetén az amplifikáció 94 °C, 2 s denaturációs (46 °C, 4 s) közelítés és (72 °C, 12 s) extenziós lépésből, vacA esetén 94 °C, 0 s denaturációs (45,5 °C, 3 s) közelítés és (72 °C, 10 s) extenziós lépésből állt 40 cikluson keresztül. A fluoreszcens jelet minden ciklus extenziólépésének végén detektáltuk az F1/1 szűrőt használva. Az amplifikációt olvadáspont-analízis követte a hőmérséklet lassú (0,1 °C/s) emelésével, cagA esetén 56-tól 94 °C-ig, vacA esetében 55-től 94 °C-ig. A fluoreszcenciát folyamatosan detektáltuk (6, 8, 11). A teljes vizsgálati idő mintegy 1,5 órát vett igénybe.
Immunhisztokémia A paraffinba ágyazott biopsziás szövetmintából 4 µm vastagságú metszetek kerültek tárgylemezre. Az immunhisztokémiai festést megelőzően a metszeteket deparaffináltuk a hagyományos xilol és rehidráló alkoholsor segítségével.
EGFR Deparaffinálás után az endogén peroxidáz blokkolására 30%-os hidrogén-peroxid-metanolos kezelés történt 30 percig. Foszfátpufferes (phosphat-buffer saline; PBS) lemosást követően a mintákat kétszer 7 percig citrát-pufferbe (Antigen Retrieval Citrate, Biogenex) helyeztük. Ismételt PBS-es lemosás után a mintákat kecskeszérummal 20 percig, szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd ezt az elsődleges antitest 1:100 arányú hígításával másnapig szobahőmérsékleten folytattuk (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., USA). PBS-sel történő lemosás után 60 percig a másodlagos antitesttel inkubáltuk. A minták lemosása után 45 percig streptavidin peroxidázzal inkubáltuk (LSAB2 Kit Peroxidase, DAKO). Végső PBS-es lemosás után az EGFR antigéneket DAB-oldattal tettük láthatóvá, valamint hematoxylinnel háttérfestést végeztünk. Pozitív kontroll egy ismert EGFRpozitív pancreastumoros szövetminta volt, negatív kontroll-
ként ugyanazt az EGFR-pozitív pancreas-tumorszövetet használtuk, azonban elsődleges antitest helyett PBS-ben inkubáltuk. A minták kiértékelését a korábban már leírt módon, a mucosa 6 különböző részén 500, egymást követő sejt számlálásával végeztük, a pozitív sejtek számának százalékos aránya alapján. A kiértékelést két, egymástól független vizsgáló végezte a szövettani diagnózisok ismerete nélkül (3, 15).
PCNA A deparaffinálást követően 30%-os hidrogén-peroxid-metanol 1:100 arányú hígításával blokkoltuk az endogén peroxidáz hatását, majd a mintákat citrát-pufferben (pH 6,0) mikrohullámon inkubáltuk (750 Watt; 5 percig). PBS-es lemosás után a nem specifikus antitestek lekötését 20 percig 1%-os bovin szérumalbuminnal végeztük. Ezután a metszeteket 1:80 arányban, normál szérumban hígított anti-PCNA antitesttel (Monoclonal Mouse Anti-PCNA Clone PC 10, DAKO) 90 percig 37 °C-on inkubáltuk. A minták biotinizált másodlagos antitesttel (antinyúl és anti-egér IgG) 30 percig, majd PBS-es lemosás után streptavidin konjugált peroxidázzal 25 percig inkubáltuk (LSAB2 Kit Peroxidase, DAKO). Végső PBS-es lemosás után a metszeteket 15 percre aminoetilkarbazol (AEC)-ba helyeztük, háttérfestésnek hematoxylint használtunk. Pozitív kontroll egy ismert PCNA-pozitív metszett volt, negatív kontrollként az elsődleges antitest helyett a PBS-ben inkubált metszet szolgált. A proliferáció kiértékeléshez használt PCNA LI (labeling index) értékét a pozitív sejtek %-os aránya adta (3, 17).
Statisztikai értékelés Az eredmények kiértékeléséhez a CSS Statistica software program ANOVA módszerét, a kétmintás t-próbát, korrelációanalízist és a χ2-próbát használtuk. A nullhipotézist a p < 0,05 eredmény esetén vetettük el. További értékeléshez az LSD (least squares deviation)-tesztet alkalmaztuk.
Eredmények H. pylori cagA és vacA genotípusának meghatározását végeztük fluoreszcens monitorozással a real-time PCR–DNS amplifikációs és olvadáspont-analízis módszerével, dupla szálú DNS-specifikus SYBR Green I. festéket alkalmazva. Az amplifikáció 40 ciklusát kísértük figyelemmel, a minták genom DNS-ét templátmentes kontrollt használva. A fluoreszcens jelet az amplifikáció minden egyes ciklusának extenziós fázisa végén mértük, amely exponenciálisan növekedett azon ciklusnál, amelynél a keresett termék felhalmozódott (16). A fluoreszcencia cagA esetében a 28. ciklusnál, míg vacA meghatározásánál a 30–32. ciklusnál mutatott növekvő tendenciát, amint a SYBR Green I. kötődött a dupla szálú amplikonokhoz. Ez a fluoreszcencia-növekedés a DNS-mentes kontrollnál elmaradt. Az amplifikált termék olvadási hőmérsékletének meghatározása közvetlenül követte a PCR utolsó ciklusát. A minta lassú melegítésének hatására a fluoreszcencia gyorsan csökkent, amint a festék levált a szétváló dsDNS szálakról. Az olvadási hőmérsékletnél a fluoreszcencia kinetikája hirtelen megváltozott. E markáns változás amplikon-függő, általában a 70–90 °C-os tartományba esik. A detektált fluoreszcens jel negatív deriváltját a készülék software olvadási görbeként ábrázolja. Az olvadási hőmérséklet vizsgálata alapján elkülöníthetők a specifikus és nem specifikus reakciótermékek. A nem specifikus termékek olvadási görbéje széles, hiányzik a határozott fluoreszcenciaátmenet és az alacsonyabb hőmérsékleti tartományba esik. Ezzel szemben a specifikus PCR-termékek olvadási görbéje a Tm-nél éles átmenetet mutat és a fluoreszcencia hirtelen a háttér-
2. ábra: H. pylori cagA genotípusának meghatározása real-time PCR olvadáspont-analízis módszerével Felsõ grafikon a fluoreszcenciát ábrázolja a hõmérséklet függvényében, az alsó grafikon ennek negatív deriváltját mutatja, amely az amplikonra jellegzetes olvadási görbét adja. 70–78 °C tartományban a nem specifikus termékek széles olvadási görbéje látható.
szintre esik (10, 12). A cagA olvadási hőmérsékletét 80,2 °C-nak, vacA Tm-jét 87,1 °C-nak találtuk. A negatív kontroll minden esetben széles olvadási csúcsot mutatott az alacsonyabb hőmérsékleti tartományban (2. és 3. ábra). CagA és vacA primereket használva PCR amplifikációs termék csak a H. pylori templát DNS esetén volt kimutatható, más baktériumok (E. coli, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Streptococcus A és Streptococcus B) nem adtak pozitív eredményt (4. ábra). A minták genotípusának meghatározása a real-time készüléket használva, 1,5 óra alatt teljesül, szemben a hagyományos PCR 6 órás protokolljával. Hisztológia, real-time PCR és immunhisztokémiai festés összehasonlítását végeztük el biopsziás mintákból. LightCycler-rel végzett vizsgálattal 23 minta volt cagApozitív és 9 minta vacA-pozitív, 4 esetben mindkét gén kimutatható volt. A hisztológia és a real-time PCR eredménye egyezett a cagA meghatározásánál az esetek 57%ában (14 pozitív és 11 negatív), vacA vizsgálatakor az esetek 58%-ában (7 pozitív, 18 negatív). Mindkét gén kimutatásánál 18 esetben adódott eltérés a PCR eredménye és a baktérium szövettani kimutatása között (1. táblázat). Szignifikáns összefüggést a baktérium genotípusa és a hisztológiai baktérium kimutatása között sem cagA (p = 0,90), sem vacA (p = 0,10) esetében nem találtunk. A szövettani diagnózis és a baktérium genotípusa közötti kapcsolat vizsgálatakor cagA jelenlétében a gastritis-csoportban (p = 0,003), vacA jelenlétében az intestinalis metaplasiás 511
3. ábra: H. pylori vacA genotípusának meghatározása real-time PCR olvadáspont-analízis módszerével Felsõ grafikon: fluoreszcencia a hõmérséklet függvényében, alsó grafikon: ennek negatív deriváltja.
gastritis esetén találtunk szignifikáns különbséget az ép epithelhez viszonyítva (p = 0,045) (2. táblázat). A fokozott sejtproliferáció és a nyálkahártya-gyulladás jelenléte között szignifikáns kapcsolatot találtunk (p = 0,02), cagA jelenlétében a kapcsolat p = 0,05-nek adódott. A vacA jelenléte és az EGFR expressziója között szoros, de nem szignifikáns negatív korrelációt találtunk (p = -0,06). Intestinalis metaplasiás minták esetében a cagA jelenléte és az EGFR expressziója között szignifikáns különbség volt kimutatható (p = 0,0418) (3. táblázat).
Megbeszélés A H. pylori-fertőzés késlelteti a fekély gyógyulását és lehetőséget teremt a fekély kiújulására. Számos vizsgálat fokozott sejtproliferációt igazolt H. pylori-asszociált gastritisben, azonban ez inkább a gazdaszervezet következményes válasza a sejtkárosodásra, mintsem a baktérium közvetlen hatása (17). A baktérium toxikus hatása közvetlenül gátolja az epithelsejtek proliferációs képességét, ezzel kedvez a fekélyképződésnek és késlelteti annak gyógyulását (15, 17). A fertőzött gyomornyálkahártyán fokozódik az EGFR-expresszió, ez azonban nem tudja ellensúlyozni a H. pylori hatását, mivel a baktérium csökkenti a gyomorepithel EGF-stimulálta sejtproliferációját, az EGF specifikus kötődését a receptorához, valamint gátolja az EGF szabályozta szignáltranszdukciós reakció-utat. Ezeket a hatásokat különösen a vacA genotípushoz tartozó H. pylori törzsek esetén mutatták ki (18). A H. pylori szerepe a fekélybetegség kialakulásában további kérdéseket is 512
4. ábra: cagA és vacA gén kimutatása különbözõ baktériumokból real-time PCR olvadáspont-analízis módszerével
Felsõ grafikonok: vacA-kimutatás, alsó grafikonok: cagA-kimutatás. (1. H. pylori, 2. H. pylori, 3. E. coli, 4. Campylobacter coli, 5. Campylobacter jejuni, 6. Streptococcus A, 7. Streptococcus B)
felvet, mivel a fekélyképződés folyamatát a nem szteroid gyulladásgátlók (NSAID) szedése is jelentősen befolyásolja (4). Mivel a baktérium fekélyképződésben betöltött
1. táblázat: Szövettani vizsgálattal megállapított H. pylori-status és PCR cagA-, vacA-meghatározás eredményeinek összehasonlítása
Szövettan H. pylori
összesen
pozitív
negatív
PCR vacA pozitív vacA negatív Összesen
7 16 23
2 18 20
9 34 43
PCR cagA-pozitív cagA-negatív Összesen
14 9 23
9 11 20
23 20 43
2. táblázat: A H. pylori genotípusai és a szövettani csoportok 2 közötti kapcsolat, χ -próba
CagA 1. ép epithel
Szövettan 1. ép epithel 2. gastritis 3. gastritis intestinalis metaplasiával 4. carcinoma
VacA 1. ép epithel
– – p = 0,0036 N.S. p = 0,1824 N.S. p = 0,6831 N.S. p = 0,0455 P = 0,6717 N.S. p = 0,4795 N.S.
szignifikáns különbség: <0,05 N.S.=nem szignifikáns 3. táblázat: Intestinalis metaplasiás és gastritises minták H.pylori-genotípusa és az immunhisztokémiai festések átlag- és szórásértékei
PCNA átlag és szórás
EGFR átlag és szórás
Intestinalis metaplasia cagA-negatív 49,33 ± 27,54 cagA-pozitív 50,84 ± 12,22 vacA-negatív 46,86 ± 21,68 vacA-pozitív 7,115 ± 0,0
27,80 ± 31,60* 56,33 ± 26,65* 43,85 ± 29,81 1,0 ± 0,0
Gastritis cagA-negatív cagA-pozitív vacA-negatív vacA-pozitív
41,60 ± 24,08 45,88 ± 19,79 44,32 ± 21,84 44,40 ± 20,59
52,74 ± 22,01 52,37 ± 21,19 46,80 ± 19,29 62,77 ± 20,81
*szignifikáns különbség: p<0,05
szerepe részleteiben még nem ismert, a figyelem a H. pylori különböző genotípusainak megismerése felé terelődött. A számos vizsgálómódszer mellett a real-time PCR a vizsgálatok új távlatait nyitotta meg. Munkánkban a H. pylori cagA és vacA genotípusának meghatározását végeztük, LightCycler készülék olvadáspont-kimutatás módszerével, amely egyszerű termék-megkülönböztetési protokollt kínál. A kapott eredményeknek a hisztológiával és az immunhisztokémiai módszerek eredményeivel való összevetése szignifikáns negatív korrelációt mutatott az EGFR expressziója és a vacA gén jelenléte esetén. Intestinalis metaplasiás minták vizsgálatakor a cagA jelenléte és az EGFR expressziója között szignifikáns különbséget találtunk. Szoros kapcsolat volt
kimutatható a cagA gén jelenléte és a fokozott sejtproliferáció között, amely szignifikáns emelkedést mutatott gyomornyálkahártya-gyulladás esetén. Szignifikáns különbséget találtunk gastritis és peptikus fekélybetegség kialakulása között vacA jelenlétében. Eredményeink egyeznek azzal a megfigyeléssel, amely szerint a cagA-pozitív H. pylori törzzsel történő fertőzés fokozottabb sejtproliferációt okoz egyéb, olyan károsító tényezőkkel társulva, mint a fokozott szöveti szabadgyök-termelés vagy a csökkent intragasztrikus aszkorbinsav-szint (13). A cagA fehérje legfontosabb tulajdonsága az IL-8 epithelialis kiválasztását fokozó képessége, amely súlyos epithelkárosodáshoz vezet (14). Ismeretes, hogy a H. pylori-fertőzés szerepet játszhat az intestinalis metaplasia kialakulásában, annak ellenére, hogy a baktérium ritkán mutatható ki a metaplasticus gyomornyálkahártyában. Az intestinalis metaplasia területén a megváltozott milliő, a szekretoros IgA felszaporodása, valamint a csökkent aciditás magyarázhatja a H. pylori kolonizációjának csökkenését. A szekretoros IgA felszaporodása a gyomornedvben fontos lehet a baktérium epithelfelszínhez történő adhéziójának gátlásában, a csökkent aciditás pedig gátolja a proliferációt. A H. pylori-szeropozitivitás (anti-H. pylori IgG) azonban igen gyakori intestinalis metaplasiás betegekben, holott az organizmus hisztológiai módszerrel nem mutatható ki a gyomornyálkahártyából (9). Ismert a dysplasia és/vagy intestinalis metaplasia és a fokozott EGF-expresszió szoros kapcsolata, valamint az EGFR sejtproliferációt stimuláló hatása, amely leginkább a protoonkogén c-fos és c-myc indukcióján keresztül valósul meg. Intestinalis metaplasia és gyomorrák esetében az EGFR és a H. pylori-fertőzés szerepe és kapcsolata nem teljesen ismert, feltételezhetően a károsodott, metaplasticus szövet elveszti kontrollját a sejtnövekedés és proliferáció szabályozása felett, ami daganat kialakulásának kedvez. Lehetséges, hogy a H. pylori-fertőzés növeli a mucosa érzékenységét más mutagén és karcinogén tényezőkkel szemben (2). Leírták a vacA gén sejtproliferációt gátló képességét, azonban lényegesen jelentősebb az EGF receptorához történő kötődése és az EGFR foszforilációját gátló hatása, amely gátolja a mucosalis repair mechanizmust (3, 15). A real-time PCR vizsgálatunk eredményének eltérése a hisztológiai vizsgálattal megállapított H. pylori-statustól feltehetően a szövettani értékelés nem megfelelő érzékenységéből adódik. A real-time PCRvizsgálat érzékenysége és kvantitatív analízis módszere további értékes információkkal szolgálhat a H. pylori jelenlétéről és szerepéről. Az összetett H. pylori törzsekkel fertőzöttek arányát azonban még PCR-technikával is nehéz felbecsülni, mivel: 1. csak egy biopsziás mintát vizsgálunk, amely nem informál a gyomor más részén megtelepedett baktérium-törzsekről, 2. a cagA-pozitív és cagA-negatív H. pylori-törzsek szimultán kolonizációra is képesek és a nagyobb denzitású „benövi” a kisebb sűrűségű baktériumkolóniát, amely befolyásolja a PCR eredményét (13). Eredményeink igazolják, hogy a H. pylori genotípusainak meghatározása LightCycler készüléken szenzitív és igen gyors módszer, amelynek számos előnye van a hagyományos PCR-technikával szemben. Zárt kapilláris rendszere miatt jelentősen csökken a PCR-termékek kontaminációja, gyorsasága és olvadáspont-analízis módszere egyszerű termékmegkülönböztetést tesz lehetővé. 513
Köszönetnyilvánítás: Köszönettel tartozunk Szentmihályi Anna dr.-nak (Országos Közegészségügyi Intézet) és Hiroyuki Yamaguchi dr.-nak (Dept. of Microbiology Kyorin University School of Medicine Tokyo, Japan) munkánkhoz nyújtott segítségükért. IRODALOM: 1. Costa, J. M., Ernault, P., Bretagne, S.: Rapid and quantitative detection of Toxoplasma gondii by PCR. Biochemica, 1999, 3, 6–8. – 2. Granelli, P., Fichera, G., Zennaro, F. és mtsai: Expression of the Epidermal Growth Factor receptor gene in human intestinal metaplasia: a preliminary report. Scand. J. Gastroenterol., 1997, 32, 485–489. – 3. Konturek, P. C., Bobrzynski, A., Konturek, S. J. és mtsai: Epidermal growth factor and transforming growth factor alpha in duodenal ulcer and non-ulcer dyspepsia patients before and after Helicobacter pylori eradication. Scand. J. Gastroenterol., 1998, 33, 143–151. – 4. Li, L., Kelly, L. K., Ayub, K. és mtsai: Genotypes of Helicobacter pylori obtained from gastric ulcer patients taking or not taking NSAIDs. Am. J. Gastroenterol., 1999, 94, 1502–1507. – 5. Morrison, T. B., Ma, Y., Weis, J. H. és mtsa: Rapid and sensitive quantification of Borrelia burgdorferi-infected mouse tissues by continuous fluorescent monitoring of PCR. J. Clin. Microbiol., 1999, 37, 987–992. – 6. Munoz, C., Jane, M., Gonzalez-Cuevas és mtsai: Evaluation of a simple rapid polymerase chain reaction (PCR) technique for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in childhood. Enferm Infec. Microbiol. Clin., 1999, 17, 119–125. – 7. Nath, K., Sarosy, J. W., Hahn, J. és mtsa: Effects of ethidium bromide and SYBR Green I on different polymerase chain reaction system. J. Biochem. Biophys. Meth., 2000, 42, 15–29. – 8. Nauck, M. S., Gierens, H., Nauck, M. A. és mtsai: Rapid genotyping of human plateled antigen 1 (HPA-1) with fluorophore labelled hybridization probes on the LightCycler. Br. J. Hematol., 1999,
514
105, 803–810. – 9. Osawa, H., Inoue, F., Yoshida, Y.: Inverse relation of serum Helicobacter pylori antibody titres and extent of intestinal metaplasia. J. Clin. Pathol., 1996, 49, 112–115. – 10. Rasmussen, R., Morrison, T., Herrmann, M. és mtsa: Quantitative PCR by continuous fluorescence monitoring of a double strand DNA specific binding dye. Biochem, 1998, 2, 8–11. – 11. Reischl, U., Leppmeier, B., Heep, M. és mtsai: Rapid and specific detection of Helicobacter pylori by LightCycler PCR. Springer, 2000. – 12. Ririel, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T.: Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal. Biochem., 1997, 245, 154–160. – 13. Rudi, J., Rudy, A., Maiwald, M. és mtsai: Direct determination of Helicobacter pylori vacA genotypes and cagA gene in gastric biopsies and relationship to gastrointestinal diseases. Am. J. Gastroenterol., 1999, 94, 1525–1531. – 14. Segal, E. D., Lange, C., Covacci, A. és mtsai: Induction of host signal transduction pathways by Helicobacter pylori. Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 7595–7599. – 15. Seto, K., Hayashi-Kuwabara, Y., Yoneta, T. és mtsai: Vacuolation induced by cytotoxin from Helicobacter pylori is mediated by the epidermal growth factor receptor in HeLa cells. FEBS Letters, 1998, 431, 347–350. – 16. Shaw, J. J., McCleskey, F. K., Beninga, K. K. és mtsai: Rapid detection of Tularemia with real-time PCR. Inf. Med., 1998, 15, 326–330. – 17. Smoot, D. T., Wynn, Z., Elliott, T. B. és mtsai: Effects of Helicobacter pylori on proliferation of gastric epithelial cells in vitro. Am. J. Gastroenterol., 1999, 94, 1508–1511. – 18. Yamaoka, Y., Kodama, T., Guiterrez, O. és mtsai: Relationship between Helicobacter pylori iceA, cagA, and vacA status and clinical outcome: studies in four different countries. J. Clin. Microbiol., 1999, 37, 2274–2279. (Ruzsovics Ágnes dr., Budapest, Szentkirályi út 46. 1088)
