Havarijní plán PřF UP v němž se nakládá s geneticky modifikovanými organismy (GMO), zpracovaný podle §20, odst. 4 zákona č. 78/2004 Sb. pro pracoviště kateder Buněčné biologie a genetiky a Oddělení molekulární biologie katedry biochemie PřF UP
a) Název organizace: Univerzita Palackého v Olomouci Právní forma: veřejná vysoká škola Sídlo a identifikační číslo uživatele:
Olomouc, Křížkovského 8, PSČ 771 47 IČO 61989592 Jméno, příjmení a trvalý pobyt rektora: prof. RNDr. Lubomír Dvořák, CSc., Olomouc, Thomayerova 28, PSČ 772 00 Pracoviště kateder Buněčné biologie a genetiky a Biochemie PřF UP: Olomouc, Šlechtitelů 11, PSČ 783 71
Jméno, příjmení a trvalý pobyt vedoucího pracoviště katedry Buněčné biologie a genetiky: doc. RNDr. Milan Navrátil, CSc. Tel: 585 634 900 E-mail:
[email protected] Zikova 28, Olomouc 779 00, Tel.: 585 434 463 Jméno, příjmení a trvalý pobyt vedoucího pracoviště katedry Biochemie: prof. Mgr. Marek Šebela, PhD. Tel: 585 634 927 E-mail:
[email protected] Řepčínská 69, Olomouc 779 00, Tel.: 585 415 608 Odborný poradce: RNDr. Oldřich Navrátil, CSc. Trvalý pobyt: U Havlíčkových sadů 3, Praha 2, PSČ 120 00, 222511028 Kontaktní adresa: ÚEB AV ČR, v.v.i., Rozvojová 263, Praha 6 - Lysolaje, PSČ 165 02 Telefon: 225106433 Fax: 225106446 e-mail:
[email protected] Osoby odpovědné za likvidaci havárie: RNDr. Martin Fellner, Ph.D., PřF UP, tel.: 585634905,
[email protected] doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D., PřF UP, tel.: 585634923,
[email protected] d) Přesný popis pozemků nebo prostor a zařízení, kde probíhá nakládání s GMO, kde jsou skladovány a kde může nastat havárie: Prostory PřF UP, určené pro uzavřené nakládání s GMO, Olomouc, Šlechtitelů 11, GMO jsou uchovávány v uzavřených lednicích a mrazících boxech v jednotlivých laboratořích, nebo kultivovány v kultivačních místnostech a boxech Laboratorní komplexy (viz přiložený plánek):
1
Budova D: 2. podlaží:
katedra buněčné biologie a genetiky: lab. 23, 26, 34, 35 (ved. doc. Navrátil)
Budova E: 1. podlaží:
SE VL1, SE VL2, SE SL a SE TL (ved. prof. Šebela)
Kultivační místnosti a boxy: Budova D: 1. podlaží:
kultivační místnost č.1 a kultivační boxy č.1 a 2 (ved. doc. Navrátil) kultivační místnost č.6 a skleníková kóje 1 (ved. prof. Šebela)
Všechny laboratoře a kultivační místnosti vyhovují nakládání v kategorii rizika I, kromě laboratoří v Budově E (SE VL2, SE SL a SE TL), které vyhovují kategorii rizika II. c) Plán pracoviště s označením hlavních ovladačů přívodu energií a bezpečnostními prvky uzavření prostoru. Je nedílnou součástí tohoto havarijního plánu. d) Popis havárie, která může vzniknout v prostorách nebo místě, kde probíhá nakládání. Havárie je závažný neplánovaný únik GMO mimo bariery. V takovém případě je třeba neprodleně učinit opatření k likvidaci havárie. V případě nakládání s GMO kategorie rizika I a II a při úniku GMO mimo bariery nehrozí bezprostřední nebezpečí ohrožení zdraví lidí ani ohrožení životního prostředí a uniklé GMO je možno likvidovat postupem v laboratoři běžným. Za havárie ve vlastním slova smyslu se nepovažují malé úniky GMO, při nichž uniklé GMO jsou spolehlivě zlikvidovány v rámci uzavřeného prostoru. Za havárii však je nutno považovat rozšíření GMO mimo prostory budov PřF UP, určených k uzavřenému nakládání s GMO. K havárii může dojít také při přepravě materiálu mimo uzavřený prostor PřF UP pracoviště Olomouc - Holice na jiné pracoviště (z jednoho uzavřeného prostoru pro nakládání s GMO do jiného, případně při nehodě dopravního prostředku). V prostorách PřF UP pro uzavřené nakládání s GMO mohou vzniknout tyto typy havárií: 1. Při rozlití většího objemu mikrobiální GMO kultury je třeba zasažené místo s použitím ochranných rukavic vysušit, odpad inaktivovat autoklávováním a místo ošetřit v dostatečném rozsahu desinfekčním roztokem (2% Incidur).
2
2. Při rozbití skleněné či jiné kultivační nádoby s kulturami in vitro, obsahující transgenní rostliny a bakterie: Postup je stejný, jako v předchozím případě. Riziko zde představují pouze bakterie, protože agarové aseptické kultury rostlin nejsou schopny okamžitého přechodu do nesterilních podmínek a hynou. Výjimku mohou tvořit rostliny nasazující semena. V těchto případech je nutná dekontaminace rostlinného materiálu podle návodu v odst. 3. 3. Při rozšíření semen nebo vegetativních částí, schopných samostatného rozmnožování (výhonů, oddenků, cibulí, hlíz) je třeba především zabránit možnosti odplavení nebo odnesení částí rostlin na obuvi, oděvu nebo nástrojích. Zemina, u níž je podezření, že by mohla obsahovat části GM rostlin, schopné samostatného rozmnožování, musí být autoklávována. Celý prostor musí být vyluxován a omyt desinfekčním roztokem. Květináče a ostatní potřeby pro kultivaci rostlin je třeba mýt v do roztoku chlornanu v plastové vaně. Po 24 hod. stání je možno roztok zlikvidovat vylitím do komunálního odpadu. V zasažené a fyzikálními barierami oddělené sekci prostoru nesmí být po dobu 1 roku pěstovány rostliny druhu, totožného s druhem, který byl příčinou havárie. Prostor musí být po tuto dobu monitorován. V případě výskytu rostlin druhu, totožného s uniklým je třeba v monitorování pokračovat po další rok. Nelze předem vyčerpávajícím způsobem uvést všechny možné typy havárií.V případech odlišných od zde popsaných, je nutno postupovat podle pokynů odborného poradce.
e) Přehled možných následků havárie na zdraví lidí, zvířat a životní prostředí a biologické rozmanitosti, včetně způsobů zjišťování těchto následků a účinné ochrany před nimi. Vědecká práce na PřF UP se provádí převážně se signálními geny GUS, GFP a genem ipt, u nichž je známo, že nemají nepříznivé následky na zdraví lidí či zvířat ani na biologickou diverzitu. Používají se selekční geny pro rezistenci k antibiotikům, které se projevují v rostlinách a nebyly prokázány jejich škodlivé účinky na zdraví lidí, zvířat ani na biologickou diverzitu či přírodní prostředí. Přesto však je nezbytné dodržovat zásady práce v infekčních laboratořích. Krajní nebezpečí představuje teoretická možnost úniku transgenních rostlin do přírody a jejich šíření, které by vedlo k obohacování přírodního prostředí transgeny, jako důsledek např. havárie dopravního prostředku, převážejícího geneticky modifikované rostliny. Vzhledem k tomu, že používané rostliny spadají do kategorie I (s minimálním rizikem škodlivého působení), budou prováděna opatření, která jsou uvedena v bodě d. Vědečtí pracovníci mají k dispozici fyzikální mapy a genové sekvence insertů, s nimiž pracují, stejně jako přístrojové vybavení a dovednosti k analýze rostlin, která umožňuje mapovat a následně eliminovat jejich rozšíření a následně tuto eliminaci zkontrolovat. V případě úniku transgenních rostlin nebo vektorů mimo hranice pro uzavřené nakládání je třeba uvedených možností využít k monitorování případného úniku transgenu a následné likvidaci transgenních rostlin, podle pokynů rektora a odborného poradce a přistoupit k asanaci kontaminovaného místa dle bodů d a g. Možnost úniku mimo uzavřený prostor je zvýšena zejména při přepravě materiálu uvnitř objektu a při jeho převážení autem. V obou případech je třeba, aby materiál byl neprodyšně uzavřen v plastových nebo plechových obalech s víkem zajištěným proti otevření. Obaly musí mít značku Biohazard. Velikost značky (která může být jak v černobílém, tak barevném provedení) je nejméně 5 cm. Každý předmět musí být opatřen nejméně dvěma značkami, na protilehlých stranách. Pokud je materiál přepravován mimo budovu, musí být v neprodyšně 3
uzavřených přepravkách v autě. Auto musí mít označení s nápisem Biohazard. V autě musí být umístěn popis přepravovaného transgenního materiálu a obecné instrukce, na kontejneru instrukce, jak postupovat s uzavřeným kontejnerem s transgenním materiálem (neotvírat, dopravit na PřF UP, pracoviště Holice Šlechtitelů 11). Mimo budovu není dovoleno přepravovat rostliny obsahující květy nebo plody se semeny. V případě, že při dopravní nehodě došlo k otevření kontejneru, musí být informováni pracovníci policie, kteří dopravní nehodu vyšetřují. Pro případ, že by při havárii došlo k otevření kontejneru, musí být v autě k dispozici igelitové pytle, do kterých se obsah kontejneru v případě nutnosti přemístí. f) Postupy detekce přítomnosti geneticky modifikovaných organismů nebo produktů: Základní metodou je amplifikace úseku transgenu, ohraničeného zvolenými oligonukleotidy. V případě pochybnosti se provádí sekvenování amplifikovaného úseku a porovnání se známou sekvencí transgenu. Návod pro detekci nejpoužívanějších transgenů, NPTII kódujícího rezistenci ke kanamycinu, GUS kódujícího β-glukuronidasu, genu ipt kódujícího isopentenylpyrofosfáttransferasu, 35S promotoru a NOS terminátoru, dále návod na detekci plastidové DNA izolovane z GMO bakterií : ___________________________________________________________________________ 1. PCR detekce transgenní DNA (gen pro rezistenci ke kanamycinu, gen pro glukuronidasu a NOS terminator) z rostlinné DNA: Izolace DNA: 1. Izolace DNA podle Edwards a kol. 1991, Nucl. Acid. Res. 19, 1349 2. Wizard® Genomic DNA Purification Kit, Promega Příprava PCR reakční směsi: oložka
Koncetrace
Pracovní
prac. roztoku
koncentrace
Pufr
10 x
MgCl2
25 mM
Pipetuj 1test
1x
2,5ul
1,5mM
1,5ul
Voda
15,25ul
dNTP
10 mM
200uM
0,5ul
f primer
20 pmol/ul
0,5uM
0,625ul
r primer
20 pmol/ul
0,5uM
0,625ul
Taq pol
1 U/ul
1U/reakce
1ul
CELKEM Objem reakce
22ul 25ul 3 ul
VZOREK
Je možné podle koncentrace templátové DNA použít objem vzorku od 2 do 8 µl na úkor objemu vody. Amplifikace genu nptII: Primery: NPT1 5'-ACG CAG GTT CTC CGG CCG CTT G-3' 4
NPT2 5'-GAA GCG GTC AGC CCA TTC GCC G-3' Amplifikovaný fragment má velikost 699 bp. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Počáteční denaturace 94oC, 3 min Denaturace 94oC, 1 min Annealing 55oC, 45 s Elongace 72oC, 1 min Kroky 2-4 opakovat 35x Koncová elongace 72oC, 10 min Chlazení 10oC
Amplifikace genu gus: Primery: DR37 5'-GGA ATT GAT CAG CGT TGG TG -3' DR48 5'-TAG ATA TCA CAC TCT GTC TG -3' Amplifikovaný fragment (včetně intronu) má velikost 770 bp. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Počáteční denaturace 94oC, 3 min Denaturace 94oC, 1 min Annealing 55oC, 45 s Elongace 72oC, 1 min Kroky 2-4 opakovat 35x Koncová elongace 72oC, 10 min Chlazení 10oC
Amplifikace NOS terminátoru: Primery: NOS A 5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG-3’ NOS D 5’-GCGGGACTCTAATCATAAAAACCC-3’ Amplifikovaný fragment má velikost 127 bp. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Počáteční denaturace 94oC, 10 min Denaturace 94oC, 1 min Annealing 63oC, 1 min Elongace 72oC, 1 min Kroky 2-4 opakovat 30x Koncová elongace 72oC, 10 min Chlazení 10oC
Stejné sady primerů lze použít i pro detekci transgenních bakterií transformovaných plasmidy pro transformaci rostlin jako jsou pH-TOP, pVKH18, pBIN-LhGR, pV-TOP, pBIN-LRLhGR, pBRACT214, pAHC25, pGREEN2, pCAMBIA , pBINHyg, kdy se jako templát použije rosuspendovaná kolonie bakterie, viz bod 3. 2. Northern blott analýza ipt genu: Celková RNA je extrahována z rostlinných pletiv podle Verwoerd a kol. (1989, Nucl. Acid. Res. 17, 2362) případně pomocí RNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen). Alikvoty 50 µg RNA jsou separovány v denaturační 1,5% agarosa/formaldehyd gelu, které jsou pak přeneseny na nylonovou membránu (Amersham Hybond N) a hybridizovány s radioaktivně značenou ipt specifickou DNA sondou vytvořenou pomocí „Random Primed DNA Labelling Kit“ (Roche,
5
USA). Hybridizace probíhá v QuickHyb (Stratagene) roztoku podle návodu výrobce. Nejlepšího promytí lze dosáhnout pomocí 0,1xSSC, 0,1% SDS při 60 °C. Jako kontrolu lze provést hybridizaci např. se specifickým fragmentem 25S rDNA o 450 bp z Cucurbita maxima L. 3. Detekce transgenů v transformovaných buňkách E. coli klonovacími vektory pGEM®-T, pBSII® SK+, pCR® 2.1-TOPO, pBR322, pUC119, drive, pCR, pCR Blunt II TOPO, pCR T7NT TOPO, pTYB, pET16, pET15b, pET32b pET101/D-TOPO, PQ30, PYES2, pDR197. Transformované buňky je možno detekovat přímou cestou pomocí PCR pomocí univerzálních primerů M13Forward a M13 Reverse. Do 0,6 ml PCR zkumavek připravíme reakční směs podle následujícího rozpisu a jednotlivé kolonie resuspendujeme v reakční směsi. Reakční směs: 10X PCR pufr 5 µl dNTP směs 0.5 µl Kontrolní PCR Primery (0.1 µg/µl each) 1 µl Sterilní voda 41.5 µl Taq Polymeráza (1 unit/µl) 1 µl Celkový objem 50 µl Primery:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
M13 Forward M13 Reverse
5´-GTAAAACGACGGCCAG-3´ 5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´
Počáteční denaturace 94oC, 10 min, za účelem lýze buněk a inaktivace nukleáz. Denaturace 94oC, 1 min Annealing 55oC, 1 min Elongace 72oC, 1 min Kroky 2-4 opakovat 25x Koncová elongace 72oC, 10 min Chlazení 10oC
Pozitivním výsledkem je amplifikovaný DNA segment o velikosti inzertu zvětšeného o segmenty použitého vektoru vymezené univerzálními primery M13. Identita transgenu je ověřitelná sekvenační analýzou. 4. Detekce transgenů v transformovaných buňkách E. coli a Pichia klonovacími vektory pPICZ a pGAPZ Transformované buňky těmito vektory je možno detekovat přímou cestou pomocí PCR pomocí specifických primerů syntetizovaných na základě komplementarity s pravou a levou stranou sekvence klonovaní kazety. Do 0,6 ml PCR zkumavek připravíme reakční směs podle následujícího rozpisu a jednotlivé kolonie resuspendujeme v reakční směsi.
6
Reakční směs: 10X PCR pufr 5 µl dNTP směs 0.5 µl Kontrolní PCR Primery (0.1 µg/µl each) 1 µl Sterilní voda 41.5 µl Taq Polymeráza (1 unit/µl) 1 µl Celkový objem 50 µl Primery:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
PPICZ_fw PPICZ_rev
5´-CTGGTTCCAATTGACAAGC-3´ 5´-GTCTTCTCGTAAGTGCCCAAC-3´
Počáteční denaturace 94oC, 10 min, za účelem lýze buněk a inaktivace nukleáz. Denaturace 94oC, 1 min Annealing 55oC, 1 min Elongace 72oC, 1 min Kroky 2-4 opakovat 25x Koncová elongace 72oC, 10 min Chlazení 10oC
Pozitivním výsledkem je amplifikovaný DNA segment o velikosti inzertu 5. Detekce transgenů v transformovaných buňkách E. coli a Agrobacterium klonovacími vektory pCAMBIA, pBIN-Hyg-Tx, pGREEN Transformované buňky těmito vektory je možno detekovat přímou cestou pomocí PCR pomocí specifických primerů proti 35S promotoru. Amplifikace 35S promotoru: Primery: CaMV1 5’-GAAGGTGGCTCCTACAAATGCC-3’ CaMV2 5’-GTGGGATTGTGCGTCATCCC-3’ Amplifikovaný fragment má velikost 199 bp. 1. Počáteční denaturace 94oC, 10 min 2. Denaturace 94oC, 1 min 3. Annealing 63oC, 1 min 4. Elongace 72oC, 1 min 5. Kroky 2-4 opakovat 30x 6. Koncová elongace 72oC, 10 min 7. Chlazení 10oC ___________________________________________________________________________
7
g) Validované metody a postupy, použitelné k likvidaci geneticky modifikovaných organismů a dekontaminaci uzavřeného prostoru. Únik bakterií E. coli nebo A. tumefaciens za hranice prostoru pro uzavřené nakládání je třeba inaktivovat desinfekčními prostředky chlornanem sodným (nebo chloraminem) a Ajatinem nebo Incidurem. Zasažené místo je nutno monitorovat mikrobiologickou kultivací a detekcí přítomnosti či nepřítomnosti vektorových plasmidů. V případě detekce vektorových plasmidů je nutno desinfekci provádět na větší ploše alternativním desinfekčním prostředkem. Monitoring asanovaných prostor bude prováděn postupy specifikovanými v bodě f tohoto havarijního plánu. h) Metody pro izolaci prostor a zařízení zasažených havárií, včetně metod kontroly účinnosti izolace. V případě úniku geneticky modifikovaných mikroorganismů bude zasažený prostor ošetřen desinfekčním roztokem. Jednotlivé drobné předměty, které byly únikem zasaženy, budou autoklávovány. Nepřítomnost geneticky modifikovaných mikroorganismů bude dokumentována odebráním vzorů bakterií z původně zasaženého místa a průkazem (pomocí PCR nebo Northern blot) nepřítomnosti některého z uvedených transgenů. i) Popis a nákres uložení asanačních prostředků použitelných k likvidaci geneticky modifikovaných organismů a dekontaminaci zasaženého prostoru. Asanační prostředky: roztok chloraminu, chlornanu sodného, Ajatinu nebo Inciduru. Umístění: v označených kontejnerech umístěných v prostorách pro práci s GMO (viz Příloha HP 1). j) Postupy na ochranu zdraví člověka, zvířat, životního prostředí a biologické rozmanitosti v případě nežádoucího ovlivnění vzniklou havárií, případně metody na zneškodnění nebo sanaci rostlin a zvířat, které se nacházely v oblasti v době havárie, v souladu se zvláštními právními předpisy. Jak vyplývá z hodnocení rizika (příloha 1) a z charakteru experimentální práce s GMO, nepředpokládáme, že by tyto organismy nežádoucím způsobem ovlivnily člověka, zvířata a životní prostředí. Transgenní rostliny, které by unikly mimo vymezené bariery, budou ručně vytrhány a autoklávovány v pytlích. Tento prostor bude ošetřen totálním herbicidem a v následujícím roce monitorován na výskyt případného potomstva uniklých transgenních rostlin. V pozitivním případě bude postup opakován. k) Popis postupu zajištění následného monitoringu prostor a pozemků po ukončení asanace Pouze v případě havárie při převozu transgenního materiálu (rostliny) bude postupováno, jak je uvedeno v bodu e. l) Obce, případně osoby, kterým je havarijní plán předkládán podle § 20 odst. 3 zákona. Kopie havarijního plánu bude předána odboru životního prostředí Městského úřadu v Olomouci a hasičskému záchrannému sboru. m) Způsob vyrozumění správních orgánů uvedených v § 27 zákona v případě havárie, jakož i způsob varování občanů, v závislosti na místě havárie a jejich možných následcích. V případě havárie budou informovány tyto instituce státní správy: Ministerstvo životního prostředí, Ministerstvo zdravotnictví a Ministerstvo zemědělství, Česká inspekce životního prostředí a Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, poslední jen pokud se bude jednat
8
o druh kulturní rostliny. Vyrozumění se bude dít e-mailem s následným písemným potvrzením. Vzhledem k tomu, že se pracuje s transgenními rostlinami, určenými k vědeckým účelům, jejichž případné rozšíření nemá škodlivý vliv na lidskou populaci, varování občanů nebude prováděno. V případě havárie, při níž by došlo k úniku GMO kategorie rizika II, budou občané varováni prostřednictvím oboru životního prostředí Městského úřadu v Olomouci. K takové havárii může dojít při převozu GMO spadajících do kategorie rizika II, při němž by došlo k havárii vozidla, k rozbití ochranných obalů a úniku GMO. Vzhledem k tomu, že přepravy GMO kategorie rizika II (expresní kmeny E. coli) nejsou plánovány, je tato situace pouze teoretická. n) Vyjádření odborného poradce, jeho podpis a datum podpisu Havarijní plán obsahuje zákonem předepsané náležitosti a údaje, podle kterých lze postupovat v případě neočekávané kontaminace pracovního prostoru používanými GMO.
V Praze dne 1.11.2007
RNDr. Oldřich Navrátil, CSc. odborný poradce
V Olomouci 1.11.2007
prof. RNDr. Lubomír Dvořák, CSc. rektor UP
9
Přílohy: HP1. Plán pracovišť s označením hlavních ovládačů přívodů energií a bezpečnostními prvky uzavření prostorů zařazených do kategorie I a II (viz Příloha 7 e,g,h).
10
11
12
