15/03/2010
GENOVÉ TERAPIE přístup léčby nebo prevence genově podmíněných nemocí změnou exprese genů člověka
GENOVÉ TERAPIE • zatím ve většině případů pouze v experimentálním stádiu • GENOVÁ TERAPIE SOMATICKÁ – genom nemocného je pozměněn, ale změna není přenášená do další generace • GENOVÁ TERAPIE ZÁRODEČNÁ genom je změněn přímo ve vajíčku nebo spermii a změna je přenášená do dalších generací, zatím neprobíhá u člověka a vyšších obratlovců (celosvětové moratorium)
1
15/03/2010
GENOVÉ TERAPIE a) změna v jednom genu srpkovitá anémie
— jednobodové mutace, např např..
b) multigenové poruchy — mutace ve více genech často se uplatňuje i vliv prostředí, např např.. srdeční poruchy, cukrovka, nebo rakovina c) mitochondriální poruchy — mutace v mitochondriální etá , způsobují působuj po poruchy uc y řady ady o orgánů gá ů DNA,, letální, d) chromozomální abnormality — ztráta či zmnožení celých či částí chromozomů, např. např. Downův syndrom
GENOVÉ TERAPIE In vivo
Ex vivo
2
15/03/2010
Metody Metod y doručení genu do tkáně injekce čisté DNA přímo do nádoru injekční stříkačkou genetické dělo DNA obalující zlaté partikule a vstřelená
do
epidermis – silné heliové dělo (nepoužívá se pro nádory)
lipofekce DNA obalená do lipozomů intravaskulárně, intratracheálně, perorálně)
a
dodána
do
tkáně
biologickými vektory virálního původu V současné době nejpoužívanější nejefektivnější způsob terapie
a
metod etody y doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY: virus,
oncoRETROVIRY (virus Rousova sarkomu kuřat, Moloney murine leukaemia virus ) - jsou schopny atakovat pouze y (neprochází kompaktní dělící se buňky jadernou membránou)
- napadají především T-lymfocyty
- pouze ex-vivo terapie a náhodná integrace do hostitelského genomu - maximální velikost transgenu do 7.5 kbp - retroviry nezpůsobují lyzi buňky
3
15/03/2010
metod etody y doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY:
onco RETROVIRY cis pozice: musí být přítomný na virionu LTR long terminal repeats – potřebné pro integraci do host.genomu a zároveň funguje jako promotor ψ – potřebný pro obalování genomové RNA do virionů
selekční marker
trans pozice: jsou přítomné na jiné DNA, např. již v genomu napadené buňky: gag, pol, env – obalový protein, RT, přenášeč přes sodíkovou pumpu host.buňky
5’ LTR ψ Packaging transgen Neor 3’ LTR • balicí buňka je nakažená wild-typovým virem (pomocný retrovirus) a do jejího genomu se zabudovávají geny pro infekčnost virové částice • pak je do této buňky plasmidem přenesen konstrukt nesoucí virové balící (packaging) úseky, transgen a selekční marker po integraci do genomu se vyselektují neomycinem balící buňky produkující viriony jak rekombinantního tak pomocného viru.
4
15/03/2010
metod etody y doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY:
onco RETROVIRY
PROBLÉM: pomocný virus soutěží s transgenním, což vede k poklesu účinnosti infekce sousedních hostitelských buněk pomocným virem může aktivovat protoonkogeny ŘEŠENÍ: nejdřív se vytvoří pomocné buňky, které pomocným virem, který má inaktivován balící signál ψ
jsou
infikovány
linie těchto pomocných buněk je pak napadená rekombinantním retrovirem, který má funkční balicí signál ψ PRAXE: odebereme kostní dřeň pacienta, buňky kultivujeme in vitro, provedeme jejich infekci, infekci vyselektujeme stabilní linii produkující viriony nesoucí transgen a intravenózně vneseme zpět do pacienta. NEBEZPEČÍ: infekce sousedních hostitelských buněk pomocným virem může aktivovat protoonkogen, tím že se zabuduje do jeho blízkosti a začne ho přepisovat transgenová virová DNA se zabuduje do genu pro nádorový supresor a inaktivuje ho
metod etody y doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY:
LENTIVIRY
mohou nahradit klasické retroviry, jelikož jsou schopny infikovat a integrovat svůj genom do nedělících buněk např. neurony, makrofágy, hematopoetické kmenové buňky a buňky svalů a jater • lentiviry také mohou vyvolat AIDS u člověka • delece v LTR, není schopen produkovat infekční částice ale schopen integrace • kočičí lentivirus který neúčinkuje na člověka FIV – feline immunodeficiency virus Wang, G., et al.(1999). Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. J.Clin.Invest.104:55-62.
5
15/03/2010
metod etody y doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY:
ADENOVIRY
• dsDNA viry • napadají všechny typy buněk g j do genomu g hostitele • virální DNA se neintegruje • exprese je silná ale pouze dočasná (max. měsíc) • způsobují silnou imunitní odpověď (exprese wild-type proteinů virové částice) • nová generace adenovektorů neobsahující přirozené geny • nejsou vhodné pro léčbu nádorových buněk protože ty na ně nemají receptory
metod etody y doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY:
Adeno Asociated viruses (AVV)
• dsDNA viry • nikdy nespojovány s lidskými nemocemi p j všechny y typy ypy buněk • napadají • virální DNA se může integrovat do genomu hostitele na specifickém místě (u člověka na konci 19tého chromozomu)
AAV
• exprese je ale slabá a vektory mají malou kapacitu 4kb • nezpůsobují silnou imunitní odpověď
Adenovirus
Retrovirus/Lentivirus
nahá DNA
6
15/03/2010
metod etody y doručení genu do tkáně vektor
kapacita
snadnost produkce
integrace do genomu
trvání exprese
transdukce nedělících se buněk
existující imunita
bezpečnost
přeno s do potom stva
nevirální
bez limitu
+++
zřídka
dočasná
++
ne
+++
ne
onkoretroviry
8 kb
++
ano
stabilní
-
ne
inserční mutagenese aktivace onkogenů
může
lentiviry
8 kb
+
ano
stabilní
++
ne
inserční mutagenese aktivace onkogenů
může
adenoviry
30 kb
+
ne
dočasná
+++
ano
hyperimunitní odpověď
ne
adeno asociated virus AAV
4.6 kb
+
možná
dlouhotrvající
++
slabá
+++
může
Herpes viry
150 kb
+
ne
dočasná
++
ano
hyperimunitní odpověď
ne
nemoci v současnosti léčené genovou terapií př. ve fázi klinického testování nemoc
defekt
těžká imunodeficience (SCID)
cílové buňky
adenin deaminasa
hemofilie
krevní faktor VIII a IX
Cystická fibrosa
transmembránový regulátor CF
deficience na alfa antitrypsin
rozedma plic
rakovina Neurologické nemoci Parkinson, Alzheimer kardiovaskulární nemoci infekční nemoci AIDS, hepatitis B
nespecifické degradace neuronů
arterosklerosa
četnost
buňky kostní dřeně T-lymfocyty játra, svaly
1/1.000.000
1/1.000.000 muži
plicní alveoly
1/2.500
plicní alveoly
1/3.500
mnoho neurony v mozku
cevní endotel
1/4 1/250
½
T-lymfocyty, makrofágové b.
7
15/03/2010
http://www.wiley.co.uk/genetherapy/ clinical/
SCID severe combined imunodeficiency těžká imunodeficience • • • • •
Jedna z forem se projevuje nedostatkem aktivního enzymu adenosine deaminasy (ADA) adenosin se nepřeměňuje p j na inosin ale vzniká deoxyadenosin, y , který ý inhibuje metabolismus deoxyribonukleotidu tato nedostatečnost způsobuje zpomalení dělení rychle se poliferujících buněk jako jsou T-lymfocyty výrazně zvýšená náchylnost k infekcím bubble boy disease
8
15/03/2010
SCID severe combined imunodeficiency těžká imunodeficience • •
•
od 80let se tato nemoc lečí transplantací kostní dřeně (neúspěšné) 1986 se začaly podávat injekce hovězí ADA stabilizované PEG intramaskulárně (nutno podstupovat každé dva týdny, ADAGEN®), často končilo hemofilií pacienta 1990 první pokus genové terapie na člověku 4leté dívce Ashanti DeSilva. Její T-lymfocyty byly upraveny ex-vivo normálním ADA pomocí vektoru odvozeného od MoMLV. (William Anderson, Michael Blaise, and Ken Culver) •nutno podstupovat každý rok, životnost transformovaných T-leukocytů (6-12 měsíců). Dívka stále žije. • u dalších pacientů, kombinovaná léčba s ADAGENem • 2002 -5 chlapců s vážnější X-vázanou SCID podstoupilo genovou terapií ex-vivo, u čtyřech se do roka stav výrazně zlepšil, u dvou z nich bohužel propukla leukémie. • pokusy pozastaveny a zdokonaluje se metodika, transgen se zabudovává do genomu T-leukocytu s oblibou do blízkosti onkogenu.
PG1
Cystická fibróza • mutace v iontovém přenašeči CFTR transmembrane conductance regulator • nejvíce postihuje plicní alveoly, střevní epitel a pankreas – zvýšena produkce hlenu, citlivost k plicním infekcím. • výhodou h d pro terapii je že stačí pouze několik k l k molekul l k l proteinu na buňku aby se jí vrátila normální funkčnost. • úspěšné pokusy v kulturách a na myších transformovaných pomocí liposomů • u lidí se zavedla jako pomocná léčba sprejování adenoviru nesoucího transgen CFTR do nosu, účinné v plicích, nepůsobí na slinivku
9
Snímek 18 PG1
he CFTR is found in the epithelial cells of many organs including the lung, liver, pancreas, digestive tract, reproductive tract, and skin. Normally, the protein moves chloride ions (with a negative charge) out of an epithelial cell to the covering mucus. This results in an electrical gradient being formed and in the movement of (positively charged) sodium ions in the same direction as the chloride via a paracellular pathway. Due to this movement, the water potential of the mucus is reduced, resulting in the movement of water here by osmosis and a more fluid mucus. Petr Galuszka; 29/04/2009
15/03/2010
nemoci v současnosti léčené genovou terapií 2003 – asi 330 povolených protokolů (přes 6.OOO pacientů)
Dědičné monogenické nemoci ADA deficience, Alpha-1 antitrypsin deficience, OTC deficience, chronic granulomatous disease, hemofilie, cystická fibróza, vrozená hypercholesterolemie, Fanconiho anemie, Gaucherova choroba, Hunterův syndrom, Parkinsonova nemoc infekční nemoci HIV získané nemoci artritida ostatní rakovina 70% všech protokolů kardiovaskulární nemoci
rizika 1999 první případ zbytečného úmrtí po genové terapii
geneticky podmíněná nemoc: deficience ornitin transkarbamylasy močovinový cyklus: odbourávání amoniaku klasická léčba: dieta na proteiny s nízkým obsahem aminokyselin bohatých na dusík + dodatečně podávaný citrulin mortalita 50% pacienti se dožívají pokročilého věku k 19-letý pacient zemřel po genové terapii provedené adenovirovým vektorem
10
15/03/2010
PG2
Alzheimerova choroba • 2001 jako transgen použit NGF – nerve growth factor z myši (zvyšuje vitalitu neuronů) • z pacientů byly odebrány fibroblasty, ex vivo infikovány AAV nesoucí NGF • fibroblasty z pokožky lze snadno transformovat a nemají tendenci se nekontrolovatelně množit v systému neuronů, kde mají nedostatek místa • neurochirurgicky pak byly voperovány do buněk cholinergického systému (jeho buňky produkují acetylcholin – neurotransmiter) • u pacientů demence zpomalena o 50%, jeden zemřel při pokusu provést operaci bez narkózy • efekt není dlouhotrvající, připravuje se virem zprostředkovaná dk terapie i
Dr. Mark Tuszynski
Alzheimerova choroba příčiny: Dr. Karen Asheo (2006) •nadměrná aktivita genu APP amyloid precursor protein •transgenní myši s tímto lidským genem – výrazně zhoršená paměť již ve středním tř d í věku ěk •produktem enzymu APP je beta-amyloid (peptid cca 40 ak) •nadměrná aktivita genu APP již kolem 30 roku věku člověka vytváří shluky beta amyloidů (dodekamery), které se hromadí mezi neuronovými spoji (synapse) •projevuje p j j se jjako vynecháy vání paměti, v pokročilém věku Alzheimerova choroba
11
Snímek 21 PG2
v roce 2008 přimá in vivo injekce AAV with NGF do mozku Petr Galuszka; 29/04/2009
15/03/2010
genetický základ rakoviny PROTOONKOGEN – strukturní gen kódující protein podílející se na dělení buňky (značka: c-onc) typy: geny kódující růstové faktory (např. cytokiny) (c-sis) geny g y kódující j receptory p y růstových ý faktorů ((c-erbB-1)) geny kódující G-proteiny (přenašeče extracelulárních signálů, c-ras) geny kódující proteinové kinasy (c-src, onkogen Rousova sarkomu) geny kódující transkripční faktory (c-fos, c-jun) aktivace na ONKOGENY: mutací p ) zmnožením ((zesílení exprese) translokací (nejčastěji mezi chromozomy 8 a 14) retrovirální transdukce (přenesením z virového genomu) onkogeny nejsou dědičné, s výjimkou jednoho RET –onkogen, odpovědný za medulární karcinom štítné žlázy
genetický základ rakoviny NÁDOROVÉ SUPRESOROVÉ GENY (antionkogeny) • kódují proteiny, které v somatických buňkách potlačují jejích proliferaci a udržují je v G0 fázi. • nejznámější p53 protein kódovaný TP53 genem, aktivuje inhibitor CDK • přirozeně se v buňkách výrazně zvyšuje jeho exprese po radiaci či působení dalších karcinogenních látek, nazýván také jako „strážce genomu“ • mutací ztrácí aktivitu a buňky se začnou dělit i během UV radiace a genom mutuje. • mutované supresorové geny se většinou dědí, jejich projev je recesivní, u potomku nesoucí jednu zmutovanou alelu je daleko větší pravděpodobnost že jim zmutuje i druhá a p53 přestane být funkční. Mutantní formy supresorových genů vznikají v zárodečných buňkách. (tzv.PREDISPOZICE K RAKOVINĚ) • mutace TP53 genu je zodpovědná za 70% všech nádorů tlustého střeva, 50% nádorů plic a 40% nádorů prsu.
12
15/03/2010
genetický základ rakoviny NÁDOROVÉ SUPRESOROVÉ GENY (antionkogeny) • 2002 připravená myš overexprimující p53 protein (předpokládalo se že myš bude odolná vůči rakovině)
+ myš byla čtyřikrát odolnější k rakovině než kontrola -
zkrácený životní cyklus o 20% měknutí kostí, rozpad orgánů, zvýšená náchylnost k psychickému stresu, vypadávaní srsti
předpoklad: hyperaktivita p53 „vysaje“ z těla všechny kmenové buňky dříve než u kontrolní myši
PG3
genetický základ rakoviny NÁDOROVÉ SUPRESOROVÉ GENY (antionkogeny) • kódují j p proteiny, y, které v somatických ý buňkách p potlačují j jjejích j proliferaci a p udržují je v G0 fázi. • pRB protein – pojmenován podle toho že byl objeven v souvislosti s dětským retinoblastomem • blokuje buněčný cyklus tím, že inhibuje transkripční faktor E2F • E2F aktivuje všechny geny, které jsou aktivní v S-fázi • mutace v pRB proteinu byla prokázána u 4O% typů nádoru u člověka
13
Snímek 26 PG3
roteiny patřící do p16 rodiny inhibují především aktivitu komplexů cdk4 a cdk6 s cykliny D, které se podílejí na fosforylaci nádorového supresoru Rb (protein retinoblastomu). Fosforylace proteinu Rb je kritickým krokem při regulaci jeho antionkogenního účinku a buňky, které jsou zablokovány v G1 fázi buněčného cyklu, se vyznačují přítomností hypofosforylované formy tohoto proteinu. Tato forma proteinu Rb tvoří komplexy s celou řadou pozitivních transkripčních faktorů jako jsou proteiny rodiny E2F, kontroluje jejich funkci, brání transkripci DNA a tím vyvolává zastavení buněčného cyklu v G1/S kontrolním bodě. Je-li protein Rb hyperfosforylován, jsou transkripční faktory E2F z tohoto komplexu uvolněny a je umožněno započetí transkripce a další průběh buněčného cyklu Petr Galuszka; 29/04/2009
15/03/2010
genetický základ rakoviny obecně lze tvrdit, že většina rakoviny je způsobená poruchou funkce protein kinas podílejících se na regulaci buněčného cyklu inhibitory různých typu kinas jsou nejčastěji používaná kancerostatika • • • • •
látky extrahované ze sójí genistein a daidzein kurkumin tokoferol sukcinát (vitamín E) beta-karoten antioxidanty y – selen, resveratrol ze zeleného čaje j inhibují j oxidanty, y které aktivují regulační centra protein kinas typu C
genetický základ rakoviny ONKOGENNÍ VIRY inzerční aktivace protoonkogenu (pouze u zvířat) DNA přepsaná z retroviru se začlení před protoonkogen a začne jej svým silným promotorem přepisovat transdukce akutně transformujícími retroviry (pouze u zvířat) • virový genom se integruje do blízkosti protoonkogenu • integrovaný genom se přepisuje do primárního transkriptu ohraničeného LTR sekvenci, může však vznikat i delší primární transkript nesoucí exony protoonkogenu • oba transkripty se sbalí do stejného virionu g rekombinaci během RT p při napadení p host.buňky y • dochází k nelegitimní LTR
gag
pol
env
LTR
LTR
gag
pol
env
LTR
LTR
gag
v-onc
pol
v-onc
LTR
14
15/03/2010
genetický základ rakoviny ONKOGENNÍ VIRY • tento nově vzniklý rekombinatní virus je defektní v replikaci, je schopen infikovat další hostitelské buňky pouze v přítomnosti pomocného viru • protoonkogen prodělává během replikace viru spoustu mutací až zmutuje v onkogen př. virus Rousova sarkomu kuřat (RSV) virus ptačí myeloblastózy (AMV) Moloneyův virus myší leukemie (MVML) karcinogeneze navozena virovými geny (adenoviry) • některé DNA viry obsahují geny jejíchž produkty narušují regulaci buněčného dělení - aktivace S fáze • proteiny většinou zesilují funkci transkripčních faktorů nebo vytěsňují regulační proteiny buněčného cyklu • SV40 opičí virus • nebylo prokázáno vyvolání rakoviny těmito typy virů u člověka
PG2 PG1
genetický základ rakoviny
viry způsobující rakovinu u lidí nesou informaci pro onkogen asi 20% veškerých karcinogenních onemocnění je způsobeno viry T-leukémie (HTLV virus – onco retrovirus) • infekce probíhá během porodu nebo kojení • mezii dospělými d ělý i se přenáší ř áší sex.stykem t k z muže ž na žženu • virus potřebuje dlouhé latentní období (30 let) • největší výskyt Japonsko, Karibská oblast a střední Východ (asi každý 500 člověk infikován) • nemoc propuká pouze u 1% infikovaných • v Evropě kolem 10 infikovaných jedinců na 100.000 obyvatel • retrovirus, kromě pol gag a env genů nese informaci pro proteiny p40tax a p21rex, ty mohou transaktivovat protoonkogeny, nebo některé ěkt é d další lší regulační l č í proteiny t i čl člověka ěk virus hepatitidy B (HBV) - hepadnavir - způsobuje akutní infekce - v chronické podobě mohou přecházet v nádor jater (hepatom) spojený s cirhózou - na světě v současné době napadeno cca čtvrt miliardy lidí endemické oblasti – hlavní příčina úmrtnosti (1/4 miliónu ročně)
15
Snímek 30 PG1
Včasné očkování proti hepatitidě B může zabránit rakovině jater. Chronická žloutenka typu B je totiž v 60-82 % případů příčinou jejího vzniku. Jako ochranu před rakovinou ho doporučují odborní lékaři i nový Evropský kodex proti rakovině, kde je zahrnuto mezi deset nejdůležitějších bodů preventivní ochrany. galuszka; 30/04/2009
PG2
Genom HBV patří mezi nejmenší DNA viry (obsahuje zhruba 3200 párů bazí) s cirkulární dsDNA. Díky omezené genetické výbavě kóduje jen několik proteinů: Nukleokapsidový protein (HBsAg), který je nezbytný pro sestavování virionu a tvoří složku nukleokapsidy. Dále je kódován rozpustný antigen HbeAg, který je uvolňován z buňky a koluje ve vysokém titru v séru. Tento antigen potlačuje imunitní reakci vůči viru. Genom viru umožňuje vytvářet rovněž tři obalové proteiny, všechny glykosylované. Jsou podstatou povrchového antigenu HBsAg a označují se S, M a L protein. Z proteinů S a M jsou tvořeny malé kulovité a vláknité částice, kterých je v infikované buňce stokrát více než kompletních virionů a které ve významném množství kolují v krvi. M a L proteiny jsou významné pro přilnutí virionu k hepatocytu. Nestrukturální proteiny HBV jsou dva: Pol protein (virová polymerasa) a HBx protein vyvolávající transkripci v buňěčném jádře a replikaci HBV. Antigenní struktura Povrchový protein S nese tři antigenní determinanty: antigen „a“, další se vyskytuje ve specifitě „d“ nebo „y“ a poslední „w“ nebo „r“. Kombinací těchto determinant můžeme dostat devět subtypů HBV. Určitý subtyp je typický pro narkomany, jiný pro homosexuály. Množení viru Replikace HBV začíná vazbou virionu na receptor hepatocytu. Uvolní se DNA viru a ta se dostává k jádru buňky, působí jako virový minichromosom. Ten je přepisován do čtyř sad různě velkých molekul RNA, z nich pak translací vznikají virové proteiny. Největší z těchto molekul je pregenomová RNA (pg RNA), slouží jako matrice pro reversní transkripci virového genomu. Virus tedy sice patří mezi DNA viry, ale ale replikuje svůj genom reversní transkripcií pgRNA. Na rozdíl od retrovirů se ale pro vznik produktivní infekce nemusí integrovat do buněčného genomu. Protože se tedy při replikaci HBV přepisuje virová DNA do RNA a ta zpět do DNA, vznikají tak logicky mutace s větší pravděpodobností. Známý je tzv. precore mutant, který má potlačenou tvorbu HbeAg a je podstatně virulentnější, protože je rezistentní k interferinu. Často odpovídá za fulminantní průběh infekce. Mutací může být rovněž postižena „a“ determinanta. Rezistentní mutanty vznikají při terapii lamivudinem. Onkogenita HBV Chronická infekce HBV vede k jaterní cirhóze a následně k hepatocelulárnímu karcinomu. Většina nádorů obsahuje virovou DNA, přičemž integrace HBV DNA předchází nádorovému množení buněk. Pravděpodobně proteiny HBV nemají onkogenní účinek. Riziko spíše představuje situace, kdy regenerují hepatocyty po infekci a to zvyšuje riziko vzniku nádorové buňky. galuszka; 30/04/2009
15/03/2010
principy genové terapie rakoviny využití onkoretrovirálních vektorů
doručení nemutovaného supresorového genu p53
doručení konstruktu zajišťující zastavení exprese onkogenu (antisense konstrukt)
principy genové terapie rakoviny doručení sebevražedného genu přeměňující pro-drug na toxin
16
15/03/2010
principy genové terapie rakoviny SEBEVRAŽEDNÉ GENY
principy genové terapie rakoviny SEBEVRAŽEDNÉ GENY gangcyklovir ------------hsv-tk---------→ gangcyklovir trifosfát (analog dTTP blokuje syntézu DNA)
17
15/03/2010
principy genové terapie rakoviny DALŠÍ SEBEVRAŽEDNÉ GENY transgen kóduje pro-drug
jed
mechanismus
cytosin deaminasa
5-fluorocytosin
5-fluorouracyl
antagonista pyrimidinu, blokuje RNA a DNA syntézu
nitroreduktasa
nitrobenzyloxykar bonylantracyklin
antracyklin
DNA crosslinker
karboxyl esterasa
CPT-11
SN38
inhibitor topoisomerasy
cytochrom P450
cyklofosfoamid
fosfoamid
DNA alkylační činidlo
linamarasa
amygdalin
kyanid
blokátor dýchacího řetězce
kondiční exprese sebevražedného genu pod specifickým promotorem aktivním pouze v rychle se dělících nádorových buňkách (např. promotor erbB-3 genu způsobující ptačí erytroblastózu)
principy genové terapie rakoviny ONKOLYTICKÉ VIRY
18
15/03/2010
principy genové terapie rakoviny ONKOLYTICKÉ VIRY • nádorové buňky jsou cíleně ničeny lytickými viry • 1956 bylo pozorováno že nádor ustupuje po virové infekci • první klinicky testovaný virus byl defektní herpesvirus G207, který měl d f k í vlastní defektní l í ribonukleotid ib kl id reduktasu d k a mohl hl se tudíž díž replikovat lik pouze v dělících se buňkách, měl deleci také v genu způsobující virulenci ICP35.4 a tím byl oslaben a proto bezpečný • proběhla I a II fáze klinického testování • adenoviry aby se mohli množit v buňkách potřebují blokovat p53 protein (ten je nepřítomný v nádorových buňkách) • adenovirus ONYX-015 má deletovaný gen pro protein, který blokuje p53 • tento adenovirus proto nemůže atakovat zdravé buňky ale pouze nádorové • v klinických testech zatím ne moc účinné HLAVNÍ PROBLÉM: imunitní systém člověka okamžitě virus ničí, proto málo účinné
principy genové terapie rakoviny HIV může sloužit pro léčbu rakoviny (2005) • HIV virus byl mutován byl mu odebrán gen způsobující propuknutí AIDS • do genomu HIV byl naklonován sebevražedný gen (např. hsvTK) • gen pro plášťový protein HIV byl nahrazen genem pro plášťový protein Sindbis viru (hmyzí virus), který specificky rozpoznává P-glykoproteiny na povrchu buněk • většina nádorových buněk obsahuje na povrchu právě Pglykoproteiny • dál přidali gen pro luciferasu aby mohli infekci sledovat • testování á í na myši ši napadené d é buňkami metastázujícího melanomu, které byly naklonovány tak aby nesly na povrchu lidské Pglykoproteiny.
19
15/03/2010
genová terapie rakoviny plic a vaječníku • •
•
•
první klinické testy (1999) – 19 pacientů v pokročilém stádiu intratumorálně dostávali injekci nemutovaného genu pro p53 v adenovirálním vektoru (3 dávky během měsíce), současně byla prováděna terapie ozařováním výsledek: 2 pacienti zemřeli během pokusu u 10 pacientů nemoc postoupila do pokročilejšího stádia 1 zůstal ve stejném stavu u 4 došlo k mírnému zlepšení u 2 došlo k výraznému zlepšení totéž u 25 pacientek v pokročilém stádiu rakoviny vaječníku (2001), (2001) 7 přežilo terapii
genová terapie AIDS HIV virus – lentivirus ze skupiny retrovirů ssRNA – 9.8 kbp gag, pol, env – proteiny společné pro všechny retroviry tat, rev, vpu, vif, nef, vpr – specifické regulační proteiny HIV viru
20
15/03/2010
genová terapie AIDS existuje několik postupů genové terapie, které jsou v první fázi klinického testování 1.antisense RNA proti genu CRR5 receptoru, který váže HIV virus a 1.antisense umožňuje mu vstup do buňky T T-lymfocytu. lymfocytu. Byly vytvořeny CD4 CD4+ (typ T Tlymfocytu) odolné vůči infekci HIV, kterým byl vnesen antisense konstrukt pomocí lentiviru – 5 dobrovolníkům v pokročilém stadiu AIDS byly vstřiknuty tyto buňky
genová terapie AIDS 2. terapie pomocí ribozymu RIBOZYM – je malá molekula RNA s katalytickou funkcí byl vytvořen ribozym specifický vůči tat genu HIV viru • vzhledem k velmi rychlým a častým mutacím mezi jednotlivými variantami HIV viru musí být vybrána velmi konservativní sekvence • pro doručení byl použit MoMVL retrovirální systém • I fáze klinického testování 2003-4
21
