Genové inženýrství a Geneticky modifikované organizmy
Definice GMO biologická Pojem GMO zahrnuje takové organizmy, jejichž genetický základ byl úmysln pozm n vnesením i vyjmutím n jakého genu (gen ).
Definice GMO legislativní GMO je organizmus, krom lov ka, jehož di ný materiál byl zm n genetickou modifikací.
Genetická modifikace = každá zm na DNA
irozená
um lá
Genetické modifikace vyvolané: - zá ením - šlecht ním - k ížením
vedou ke vzniku odr d, plemen, kultivar apod.
- p ímou a zám rnou manipulací s DNA vedou ke vzniku GMO
Genové inženýrství (GI) = techniky vedoucí k um lé tvorb geneticky pozm ných bun k nebo celých organizm zásahem do jejich DNA výsledkem
vznik nových modifikovaných genom , transgenních organizm , které by se za normálních okolností v p írod nemohly vyskytnout
Cílem jsou v podstat
dva procesy:
- vložení cizího DNA segmentu (genu, konstruktu) do DNA p íjemce - vy azení nežádoucího genu z funkce, tzv. genový knock-out
Techniky GI - identifikace a izolace gen , získání genového konstruktu
- volba p íjemce pro p enos genového konstruktu
- volba metody pro p enos genového konstruktu
Konstrukce transgenu - modifikace izolovaného genu podmínka pro úsp šnou integraci a expresi genu
Sekvence promotoru -
idána k transgenu z d vodu správné exprese genu (tzn. p eklad do proteinového produktu)
Termina ní sekvence - signalizuje bu ce zakon ení sekvence genu Marker gen - p idán z d vodu identifikace úsp šného v len ní transgenu
Tvorba rekombinantní DNA (rDNA)
rDNA je um le vytvo ená DNA. DNA z n kolika zdroj je v len na do jedné rekombinantní molekuly DNA.
Namnožení molekuly DNA Molekulární klonování získání identických kopií cílového transgenu nebo rDNA
Molekulární klonování in vitro - procesem polymerázové et zové reakce (PCR) Molekulární klonování in vivo - pomocí prokaryot (bakterie, nap . E. coli), - pomocí eukaryot (kvasinky), - pomocí bun k savc rostoucích v tká ových kulturách.
Molekulární klonování in vitro Polymerázová et zová reakce (PCR) = enzymatické namnožení (amplifikace) DNA syntézou mnoha kopiií vybrané sekvence DNA - cyklická reakce o t ech teplotních fázích: Denaturace: dvouvláknová DNA denaturována na dv
jednovláknové templátové molekuly DNA
Annealing: nasedání oligonukleotidových sond (primer ) na obou stranách cílové DNA
Elongace: syntéza nových vláken pomocí termostabilní DNA polymerázy od 5´konce ke 3´konci za ínající od primer
Schéma PCR v každém cyklu se množství DNA zdvojnásobí
exponenciální amplifikace
z každé molekuly p vodního templátu bude vytvo eno 2n kopií, kde n je po et cykl 30 cykl = 1010 násobné namnožení DNA
Molekulární klonování in vivo = namnožení ur itých fragment DNA pomocí vektor vektor = molekula, která obsahuje všechny sekvence pot ebné ke vstupu, p ežití a množení v ur ité hostitelské bu ce
klonovací vektor = slouží nejen k p enesení do bu ky, ale i k zajišt ní jejího klonování v bu ce (plazmidy, fasmidy, kosmidy, bakteriofágy…)
Klonování DNA pomocí bakteriálního plazmidu
íprava GM rostlin
íprava GM živo ich
íprava GMO = logické pokra ování klasických zp sob šlecht ní
zrychlení a zjednodušení tradi ních postup
íprava GM rostlin Schéma tvorby GM rostlin -
výb r genu( ) pro dosažení požadované vlastnosti izolace vhodného genu( ) a klonování genu v baktérii úpravy genu( ) transformace genu( ) do genomu rostliny selekce transformovaných rostlin sledování projevu transgenu testy v uzav ených prostorách laborato í a skleník vyhodnocení biologické bezpe nosti polní zkoušky transgenních rostlin hodnocení biologické bezpe nosti registra ní zkoušky GM odr dy
Metody transformace transgenu Existuje ada metod, kterými je docílena transformace transgenní DNA do rostlinných bun k. Nej ast ji využívanými: - transformace s využitím bakterií
- p ímá transformace
P íprava GM rostlin s využitím bakterií
P íprava GM rostlin p ímou transformací
Transgenní rýže
„Normální“ rýže
„Zlatá“ rýže. Tato transgenní rýže obsahuje beta-karoten, který je zdrojem vitamínu A. Tato rýže pomáhá odstranit nedostatek vitamínu A u poloviny sv tové populace – která je závislá na rýži jako hlavní potravin . V sou asnosti trpí 70% d tí stá í do p ti let v jihovýchodní Asii nedostatkem vitamínu A. Jako vektor byl užit Ti plasmid.
íprava GM zví at Cílem p enosu genového konstruktu: asné stadium vývinu embrya na úrovni 1 bu ky (zygoty) p ed splynutím prvojader linie pluripotentních bun k
íprava GM zví at metodou mikroinjekce
superovulace a oplození
izolace bun k (zygot)
mikroinjekce transgenu
transfer vají ek do náhradnic
Transformace embryonálních kmenových bun k
Výsledný jedinec je chimérou.
Testace potomstva na ítomnost vloženého genu.
Pá ení heterozygotních jedinc s cílem získat homozygotní transgenní linii.
Klonování organizm - technika používaná k vytvo ení identických organizm Reproduk ní klonování - vytvo ení duplikátu( ) existujícího jedince
Terapeutické klonování - strategie bun né terapie
Reproduk ní klonování
- dv techniky: enos jádra zárode né bu ky
enos jádra somatické bu ky
Cíle živo
išného reproduk ního klonování:
- produkce hospodá ských zví at (zlepšení kvality zví at i jejich produkt ) - produkce GM laboratorních zví at (studium lidských chorob, testace nových lék ) - produkce GM hospodá ských zví at (produkce vysoce terapeutických protein ) - pokus záchrany ohrožených i vyhynulých druh - zlepšení klonovaných domácích zví at - produkce živo ich vhodných pro xenotransplantace
Schéma enosu jádra zárode né bu ky
Ovce Dolly - í 5. ervence 1996 - † 14. února 2003 utracena z d vodu plicní infekce - vyvinuta kolektivem vedeným Ianem Wilmutem (Roslin Institute, Skotsko) reproduk ním klonováním
jádro oocytu nahrazeno jádrem somatické bu ky s dosp lé ovce
⇓ vytvo ena genetická kopie p vodní dosp lé dárkyn
Vytvo ení ovce Dolly
Transgenní myš
V roce 1982 Ralph Brinster a Richard Palmiter vytvo ili „transgenní“ myši – do myších embryí byl vložen krysí gen pro r stový hormon. Myš, nesoucí tento cizí gen (na obr. vlevo) produkovala velké množství stového hormonu a vyrostla do dvojnásobné velikosti ve srovnání se svými sourozenci (vpravo) Brinster, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania
Terapeutické klonování - využívá schopnosti embryonálních kmenových bun k regenerovat orgány i tkán - strategie bun né terapie - postup: vodní genetický materiál kmenových bun k nahrazen genetickým materiálem pacienta
spušt na jejich diferenciace ve specifické t lní bu ky
transplantace do místa poškozené tkán bez spušt ní imunitní reakce
Schéma terapeutického klonování
Diagnostika GMO v potravinách kvalitativní (pr kaz p ítomnosti GMO)
PCR ítomnost transgenní DNA v potravin Imunochemické metody ELISA ítomnost transgenního proteinu v potravin
kvantitativní (pr kaz množství GMO)
Real-Time PCR na p ístroji Lightcycler ⇓ > 1% GMO v potravin ⇒ povinnost jejího ozna ení vyplývající ze zákona
Význam GMO • farmacie a medicína: - výroba lé iv (inzulín, lidský r stový hormon, srážlivý faktor atd.) - studium chorob a vývoj lék • zem
lství zem
lsko-potraviná ská odv tví:
- zlepšení technologických vlastností (odolnost herbicid m, houbovým a virovým chorobám, šk dc m, zvýšení nutri ní hodnoty)
- produkce farmaceuticky využitelných látek (obsah a kvalita lipid a škrobu)
• pr mysl: - kvasný, textilní - výroba aminokyselin, bílkovin, škrobu - pr myslové aplikace a zpracování surovin (produkce enzym pro potraviná ský a papírenský pr mysl, produkce biodegradovatelných polymer )
• životní prost edí: - likvidace ropných havárií
a další ....
íklady GMO - efekt • • • •
plodiny plodiny plodiny plodiny
s rezistencí v i herbicid m (sója, epka, kuku ice, bavlník) produkující bakteriální insekticidní toxiny (brambory,kuku ice) s upraveným metabolismem cukru (brambory) s prodlouženou trvanlivostí (raj ata)
• • • • •
plodiny produkující biodegradabilní polyestery, bioocel plodiny s upraveným pom rem látek (raj ata, epka) bavlník s p írodn zabarveným vláknem raj ata, cukrovka s vysokým obsahem fruktanu eviny se sníženým obsahem ligninu pro výrobu papíru
• • • •
plodiny se zvýšenou odolností v i stresu chladem i suchem plodiny se schopností asimilace vzdušného dusíku rýže produkující betakaroten peckoviny s odolností k viru šarky
• škodlivý hmyz enášející gen zp sobující neplodnost potomstva • živo ichové s rychlým r stem (losos)
Možnosti rizik GMO · zdraví lidí a zví at (toxicita a kvalita/bezpe nost potravin, alergie, rezistence k lé iv m)
· životní prost edí (tvorba genu, transgenu nebo transgenních produkt , náchylnost necílových organizm , rostoucí množství použití chemikálií v zem lství, nep edpokládaná exprese genu a nestabilita transgenu)
· zem
lství (rezistence/tolerance cílových organizm , superplevele, zm na nutri ní hodnoty, snížení po tu odr d a ztráta biodiverzity)
· horizontální p enos gen (genetické zne išt ní pomocí pylu nebo rozptylováním semen, rozptylování transgen nebo promotor , p enos cizorodých gen do mikroorganizm nebo vznik nových vir rekombinací)
· všeobecné rizika (ztráta p íslušnosti v systému, vyšší náklady v zem neplánování polních pokus p i odhadu rizika)
lství,
