Genetikai polimorfizmus és haplotípus vizsgálatok különböző humán modellrendszerekben Doktori értekezés Kiszel Petra Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető:
Prof. Dr. Füst György
Hivatalos bírálók:
Dr. Prechl József Dr. Vásárhelyi Barna
Szigorlati bizottság elnöke:
Prof. Dr. Kalabay László
Szigorlati bizottság tagjai:
Prof. Dr. Sármay Gabriella Dr. Treszl András Budapest 2007
TARTALOMJEGYZÉK Rövidítések jegyzéke ..................................................................................................................................4 1
Bevezetés ............................................................................................................................................6
2
Irodalmi áttekintés............................................................................................................................7 2.1 Genetikai polimorfizmusok és haplotípusok ..............................................................................7 2.1.1 Humán DNS szekvencia polimorfizmusok...........................................................................7 2.1.2 Humán genom szerkezete .....................................................................................................7 2.1.3 Haplotípusok szerepe komplex genetikai vizsgálatokban ....................................................8 2.2 Fő hisztokompatibilitási génkomplex (MHC-régió) ..................................................................9 2.2.1 Az MHC régió centrális része, az MHC III-as osztály .......................................................12 2.2.1.1 Tumor nekrózis faktor klaszter .................................................................................12 2.2.1.2 Hősokkfehérje klaszter..............................................................................................12 2.2.1.3 Komplement blokk („complotype block”) ................................................................13 2.2.1.4 RAGE (Receptor for Advanced Glycation Endproducts) .........................................15 2.2.2 Az MHC régió ún. ősi kiterjesztett haplotípusa: a 8.1 ősi haplotípus.................................15 2.3 Interleukin-6 ............................................................................................................................18 2.3.1 Interleukin-6 általános jellemzői ........................................................................................18 2.3.2 IL-6 jelenléte különböző kórfolyamatokban.......................................................................21 2.3.3 Klinikai kórképek és az IL-6 -174 G/C polimorfizmus közötti kapcsolatok ......................23 2.3.4 Az IL-6 -174 G/C polimorfizmus IL-6 fehérje expressziójában betöltött funkcionális szerepe különböző in vitro sejtes kísérletekben ................................................................................24 2.3.5 IL-6 gén kódoló és promóter régiójának haplotípusai ........................................................26 2.4 Az atherosclerosis....................................................................................................................26 2.4.1 Az atherosclerosis gyulladásos folyamatai .........................................................................26 2.4.2 Az atherosclerosis autoimmun vonatkozásai ......................................................................27 2.5
Az endotél sejtek általános jellemzői .......................................................................................31
3
Célkitűzések.....................................................................................................................................34
4
Anyagok és módszerek ...................................................................................................................36 4.1 Vizsgálatokban résztvevő személyek........................................................................................36 4.1.1 Egészséges populációk .......................................................................................................36 4.1.2 Családvizsgálat ...................................................................................................................36 4.2
Genomiális DNS szeparálási módszerek .................................................................................37
4.3 Genotipizálási módszerek........................................................................................................39 4.3.1 HLA-DQ és DR allélek genotipizálása................................................................................39 4.3.2 MHC III régió egypontos nukleotid polimorfizmusainak genotipizálása...........................39 4.3.3 RCCX modulszám meghatározása Southern blot technikával............................................41 4.3.4 IL-6 -174 G/C egypontos nukleotid polimorfizmus genotipizálása....................................42 4.3.5 IL-6 gén és promóter régióban SNP-k genotipizálása 5’ nukleáz TaqMan allélspecifikus PCR módszerrel ................................................................................................................................43 4.4
Humán 60 kDa-os hősokkfehérje elleni antitestek titerének mérése .......................................45
4.5 A humán köldökzsinór véna endotél sejtek IL-6 -174 promóter polimorfizmus szerinti IL-6 termelésének méréséhez szükséges módszerek.......................................................................................46 4.5.1 Humán köldökzsinór vénából izolált endotél sejtek (HUVEC: human umbilical cord vein endothelial cells) tenyésztése ............................................................................................................46 4.5.2 Endotél sejtek karakterizálása.............................................................................................47 4.5.3 Adhéziós molekulák detektálása sejtes ELISA (cELISA) módszerrel ...............................48 4.5.4 IL-6 termelés meghatározása HUVEC sejtek felülúszójából..............................................48
2
4.6 5
Statisztikai analízisek ..............................................................................................................49
Eredmények.....................................................................................................................................51 5.1 I. Modellrendszer ....................................................................................................................51 5.1.1 Az MHC régió valódi 8.1 ősi haplotípusának (AH 8.1) és fragmentumainak öröklődése kilenc I-es típusú diabetes mellitus kórképpel jellemzett családban. ................................................51 5.1.2 Az MHC régió 8.1 ősi haplotípusára jellemző négy marker allélgyakorisága két különböző kaukázusi populációban ....................................................................................................................53 5.1.3 Az MHC régió 8.1 ősi haplotípusának és fragmentumainak gyakorisága két kaukázusi populációban.....................................................................................................................................54 5.1.4 A HSP70-2 +1267 G allél és a többi 8.1 ősi haplotípusra jellemző markerek és fragmentumok közötti kapcsoltságok erőssége.................................................................................57 5.2 II. Modellrendszer ...................................................................................................................59 5.2.1 Hsp60 elleni autoantitest szintek összefüggése az IL-6 -174 G/C promóter polimorfizmussal ..............................................................................................................................59 5.2.2 Haplotípus blokkok keresése az IL-6 gén és promóter régiójában .....................................60 5.2.3 Az IL-6 -9316 T/C, -1363 G/T, +1753 C/G, +2954 G/C polimorfizmusok nem függtek össze a Hsp60 elleni immunválasz mértékével .................................................................................62 5.2.4 Haplotípusok összefüggése az anti-Hsp60 autoantitest szintekkel .....................................64 5.3 III. Modellrendszer..................................................................................................................66 5.3.1 IL-6 -174 G/C promóter polimorfizmus gyakorisága magyar újszülöttek körében ............66 5.3.2 HUVEC sejttenyészet endotél sejt tartamának ellenőrzése ................................................66 5.3.3 HUVEC sejtek ICAM-1 expressziója.................................................................................67 5.3.4 HUVEC sejtek IL-6 termelése............................................................................................67 5.3.5 HUVEC sejtek IL-6 termelésének összehasonlítása az IL-6 -174 G/C promóter polimorfizmus genotípusai szerint ....................................................................................................68
6
Eredmények megbeszélése .............................................................................................................71
7
Következtetések...............................................................................................................................79
8
Összefoglalás....................................................................................................................................81
9
Summary .........................................................................................................................................82
10
Irodalomjegyzék..............................................................................................................................83
11
Saját közlemények jegyzéke...........................................................................................................92
12
Köszönetnyilvánítás ........................................................................................................................93
3
Rövidítések jegyzéke β-ECGF ACTH ADCC ANOVA AP-1 BAT2 BMDC BSF-2 C/EBP C4 CAT riporter gén CI CREB CRP CYP21 D D’ EBV EDTA EGF ELISA EMSA FCS GABBR1 GM-CSF HDL HEL HERV-K HLA HLA-A,-B,-C HLA-DP,-DQ,DR HRP HSP HUVEC ICAM-1 IDDM IFN-γ IL IP-10 IQ I-TAC LD LDL LPS
β-endotélsejt növekedési faktor Adrenocorticotrop hormon Ellenanyagfüggő sejt mediált citotoxicitás Analysis of variance Activator protein-1 HLA-B associated transcript 2 Csontvelőeredetű dendritikus sejt B-sejt stimuláló faktor-2 CAAT/ enhancer binding protein C4 komplement komponens fehérje Chloramphenicol acetyltransferase reproter gene Konfidencia intervallum cAMP response element binding protein C-reaktív protein Citokróm P450 szteroid 21-hidroxiláz Kapcsoltsági egyensúlytalanság mérőeszköze Normalizált D érték Epstein-Bar vírus Etiléndiamin tetraecetsav Epidermális növekedési faktor Enzyme linked immunosorbent assay Electrophoretic mobility shift assay Fötális borjú szérum Gamma-aminobutyric acid B receptor Granulocyte macrophage – colony stimulating factor magas denzitású lipoprotein molekula Hen-egg-lizozyme Humán endogén retrovírus-K Humán leukocita antigén MHC I osztály fehérjéinek α-láncait kódoló lókuszok MHC II osztály fehérjéinek α és β láncait kódoló lókuszok Tormaperoxidáz Hősokkfehérje Humán köldökzsinór véna endotél sejt Intercelluláris adhéziós molekula-1 Inzulin-függő cukorbetegség Interferon-γ Interleukin IFN-γ inducible protein 10 Interkvartilis IFN-inducible T-cell α chemoattractant Kapcsoltsági egyensúlytalanság Alacsony denzitású lipoprotein molekula Lipopoliszacharid
LTA MCP-1 M-CSF MGB MHC MÍG MOG MRE MS50 NF-κB NK-sejtek NO NOTCH4 OD OPD OR oxLDL PAI PBS PCR PCR-RFLP PDGF PGI2 RAGE RCCX RP SAA SDS SLE Smax SNP tagSNP TAP2 TBE TF Th sejtek TNF TNX TRIM-26,-39 TxA2 VCAM-1 vWf xMHC
Limfotoxin-α Monocyte chemoattractant protein-1 Makrofág-kolónia stimuláló faktor Minor goove binder Fő hisztokompatibilitási génkomplex Monokine induced by IFN-γ Myelin oligodendrocyte glycoprotein Multiple cytokine and second messenger responsive enhancer Fél maximális stimulus Nuclear factor-κB Természetes ölősejtek Nitrogén-oxid Notch homolog 4 (Drosophila) Optkai denzitás O-feniléndiamin dihidroklorid Esélyhányados Oxidált alacsony denzitású lipoprotein Plazminogén aktivátor inhibítor Foszfát puffer sóoldat Polimeráz láncreakció Restrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus Platelet derived growth factor Prosztaciklin Receptor for Advanced Glycation Endproducts RP, CYP21, C4, TNX génekből álló modul Szerin/treonin protein kináz enzim Serum amyloid-A Nátrium dodecil szulfát, Szisztémás lupus erythematosus Maximális stimulus Egypontos nukleotid polimorfizmus Adott haplotípusról maximális információt hordozó SNP Transporter 2, ATP-binding cassette Tris-borát EDTA puffer Szöveti faktor T helper sejtek Tumor nekrózis faktor Tenaszcin-X Tripartite motif-containing 26 Tromboxán Vaszkuláris sejt adhéziós molekula-1 von Willebrand factor Kiterjesztett MHC
5
1 Bevezetés A Human Genom Project keretében, 2001-ben befejeződött az első humán genom nukleotid sorrendjének feltárása, majd 2007-ig három neves ember (James Watson, Craig Venter, George Church) haploid kromoszóma készletének nukleotid sorrendjét ismertük meg. Napjainkban a genetikusok egyik legsürgetőbb feladata, hogy populációk szintjén azonosítsák az emberi genomok közötti különbségeket (polimorfizmusokat). Leggyakoribb különbségként egypontos nukleotid cseréket (SNP), rövid nukleotid szekvencia ismétlődéseket (mikroszatelliteket), másolatszám variációkat (copy number variation: CNV), inszerciókat és deléciókat figyeltek meg. Következő előrelépést a haplotípus vizsgálatok jelentették. Itt a polimorf lókuszok adott alléljeinek együttes öröklődését vizsgálták. E polimorfizmusok és haplotípusainak eloszlás vizsgálata
nagy
segítséget
nyújthat
multifaktoriális
betegségek
genetikai
hátterének
felderítésében. A jelenleg rendelkezésre álló technológiák azonban nem teszik lehetővé az összes létező polimorfizmus genotipizálását, ezért a kutatók törekednek a funkcionálisan legfontosabb polimorfizmusok kiválasztására. Legtöbbször a kiválasztott polimorfizmusok valódi funkcionális szerepét in vitro biológiai modellrendszerekben ellenőrzik. Jelen dolgozatban a fent említett genetikai módszerek gyakorlati alkalmazásait és nehézségeit szeretném bemutatni három különböző modellrendszerben. Az első modellrendszerben a haplotípus vizsgálatok egy speciális esetét mutatjuk be. A humán 6-os kromoszóma MHC régiójában elhelyezkedő gének között rendkívül szoros kapcsoltság áll fenn, amely megnehezíti a betegségekkel asszociált kandidáns gének meghatározását. E szakaszon belül a gének közötti rekombinációs szakaszok feltárása vált elsődleges feladattá. Tanulmányunkban a 8.1 ősi haplotípus és a 8.1 ősi haplotípus variánsok eloszlását mutatjuk be két egészséges kaukázusi populációban és egy családvizsgálatban. A második modellrendszerben egyetlen gén, az IL-6 gén kódoló és promóter régiójának, haplotípus blokkjait ismertetjük egy egészséges magyar populációban. Továbbá klinikai asszociációs tanulmányok eszközeivel vizsgáljuk ezen polimorfizmusok, haplotípusok és az érelmeszesedés szempontjából egy fontos rizikó faktor (az anti-Hsp60 elleni autoantitest szintek) közötti kapcsolatot. Az előző saját vizsgálataink és más irodalmi adatok alapján is az IL-6 -174 G/C polimorfizmus kiemelkedő fontosságú SNP-nek bizonyult az IL-6 promóter régiójában. A harmadik (in vitro) modellrendszerünkben ennek a polimorfizmusnak az IL-6 termelésre gyakorolt hatását vizsgáltuk ismert genotípusú humán köldökzsinór véna endotél sejttenyészetekben.
2
Irodalmi áttekintés
2.1 Genetikai polimorfizmusok és haplotípusok 2.1.1
Humán DNS szekvencia polimorfizmusok
Bármely két ember genomját hasonlítanánk össze, azok nukleotidszekvenciájukat illetően 0.1%-ban különböznének egymástól, vagyis minden 1000. bázispárra jutna egy variáns hely. A humán genom polimorfizmusainak egyik leggyakoribb formája az egypontos nukleotid polimorfizmus (SNP: single nucleotid polymorphism), amelynek valamennyi allélje a populáción belül legalább 1% gyakorisággal fordul elő. Összességében, az egész világ humán populációinak SNP számát 10 millióra becsülik, vagyis átlagosan minden 300 bázispárra jut egy variáns hely. Az SNP-k nagy része nem okoz funkcionális változást, de közülük néhány befolyásolhatja a gén expresszióját vagy a fehérje működését. ([1],[2])
2.1.2
Humán genom szerkezete
Az egyre népszerűbb humán populációs vizsgálatok egyre pontosabb képet adnak a humán genom szerkezetéről. A genom mozaikos elrendeződésű szegmentekből áll, amelyeken belül a rekombinációk gyakorisága változó. A rekombinációs események döntő többsége rövid „hot-spot” szakaszokon belül történik. Ezek a „hot-spot” szakaszok hosszabb, rekombináció szempontjából befagyott „blokkokat” szegélyeznek. E
mintázat
leírására
bevezetett
legmegfelelőbb
mérőeszköz
a
kapcsoltsági
egyensúlytalanság (linkage disequilibrium, LD) D’ értéke [3]. Két lókusz kapcsoltsági egyensúlyban van, ha ugyanazon kromoszómán elhelyezkedő két polimorf lókusz (A/a, B/b) bizonyos alléljeinek véletlenszerű, együttes megjelenése pApB szorzattal megadható. Két lókusz nincs kapcsoltsági egyensúlyban, ha az egyik lókusz allélje a másik lókusz alléljével gyakrabban fordul elő, mint ahogy azt a véletlenszerű előfordulásukból várhatnánk. E kapcsoltsági egyensúlytól való eltérés mértéke a „linkage disequilibrium”, amelyet úgy számítanak ki, hogy a két allél pAB
tényleges gyakoriságából levonják a két allél véletlenszerű előfordulási gyakoriságát (pApB). [D=pAB-pApB]. Populációs vizsgálatokban a linkage disequilibrium pontosabb meghatározása céljából a D érték normalizált formáját (D’) használják. Ekkor a D értéket a következők szerint normalizálják. Ha D érték nagyobb, mint 0; akkor D értéket a kisebb pApb, papB gyakorisággal, míg ha D érték kisebb, mint 0; akkor D értéket a kisebb pApB, papb gyakorisággal normalizálják [4]. A blokkok átlagosan 5-200 kb hosszúak lehetnek, ahol a rekombináció csak ritkán fordul elő. Itt két marker (pl. SNP) között megjelenő LD szintek rendkívül magasak. Haplotípusoknak nevezzük a blokkokon belül előforduló, több szorosan kapcsolt genetikai markerek, adott alléljeinek együttes öröklődését. A blokkokat szegélyező hotspot régiók ezzel ellentétben csak 1-2 kb hosszúak, de crossing over szempontjából rendkívül frekventált területek. Itt a markerek közötti LD szintek alacsonyak [5].
2.1.3
Haplotípusok szerepe komplex genetikai vizsgálatokban
A modern humán genetika egyik legnehezebb kihívása a multifaktoriális betegségek genetikai hátterének felderítése. Az emberi genom egyre bővülő haplotípus térképeinek (HapMap) ismeretével azonban a kutatók remélik, hogy a komplex betegségekhez használt genotipizálási módszerek nagymértékben leegyszerűsödnek. A haplotípus térképek tulajdonképpen a humán genom LD szerkezetét, haplotípus blokkjait adják meg különböző populációkban. A betegség asszociációs vizsgálatokban a térképezéshez használt összes SNP genotipizálása már nem szükséges. Elegendő csak néhány SNP kiválasztása, amely a maximális információt fogja adni az adott haplotípusról. Ezen tagSNP-k alkalmazása megnöveli a betegséggel asszociált kandidáns gének, polimorfizmusok
azonosításainak
esélyeit
[2].
leegyszerűsített folyamatát az 1./a-c ábra mutatja be.
8
A
tagSNP-k
kiválasztásának
1./a-c ábra. SNP-k, haplotípusok és tag SNP-k kiválasztása. Az 1./a ábrán különböző emberek ugyanazon kromoszóma régiói láthatóak, amelyek DNS szekvenciái csak három bázispárnál térnek el. Az 1./b ábra olyan haplotípusokat mutat, amelyek már 20 SNP-ből állnak és 6000 bp hosszú régiót ölelnek át. A haplotípusok az 1./a ábrán szereplő 3 SNP-t is tartalmazzák, de ezek az SNP-k nem megfelelőek a négy haplotípus pontos elkülönítésére. Az 1./c ábrán láthatóak azok a tag SNP-k, amelyek már alkalmasak a haplotípusok elkülönítésére [2].
Az előbb ismertetett haplotípusvizsgálatok azonban nem minden esetben vezetnek eredményhez. A humán genom egy speciális területén (a humán MHC génkomplex régióban) a lókuszok között rendkívül szoros kapcsoltság áll fenn, amelyből kifolyólag a betegséggel asszociált kandidáns gének kiválasztása még nehezebb feladat. E régión belül a haplotípus blokkok azonosítása helyett a rekombinációs hotspot területek behatárolása tűnt hatékony módszernek. Az alábbiakban, az MHC régióban kutatócsoportunk által vizsgált géneket mutatom be.
2.2 Fő hisztokompatibilitási génkomplex (MHC-régió) Elsőként 1936-ban, egérben mutatták ki leukociták felszínén a fő hisztokompatibilitási génkomplexek (major histocompatibility complex: MHC) fehérje termékeit. Azóta a gerincesek genomjának egyik legvizsgáltabb területe, mivel alapvető szerepet játszanak a
természetes
és
adaptív
immunitás
szabályozásában,
kórfolyamataiban és a transzplantáció sikerében.
9
az
autoimmunitás
Az MHC génkomplex a 6-os kromoszóma rövid karján, 6p21.3 kromoszóma sávnál helyezkedik el. Az első szekvencia alapú MHC géntérkép, amely egy 3.6 megabázispár hosszú DNS szakaszból állt, 1999-ben készült el [6]. E DNS szakaszon belül 224 génlókuszt írtak le, és közel 60%-áról gondolták, hogy fehérjeexpresszió is folyik róluk. Később a kapcsoltsági viszonyok és konzervált szekvenciák megismerésével a klasszikus MHC régió határai kibővültek. 2003-ban, a teljes humán 6. kromoszóma géntérképének elkészülte után már kiterjesztett MHC (extended MHC, xMHC) régióról beszélnek. [7]. Ez 7.6 megabázis hosszú DNS szakasz, ahol 421 génlókusz található és ezek közül 252 az expresszált gén. Az MHC régió három szubrégióból vagy osztályból áll. A kromoszóma centromerjéhez legközelebb a II-es osztály, telomerjéhez az I-es osztály helyezkedik el, míg a két osztály között találjuk a III-as szubrégiót (2. ábra). Továbbá a kiterjesztett emberi MHC-régió jellegzetes klaszterekből épül fel, amelyek gének duplikációival jöttek létre [8]. Definíció szerint a klaszterek három vagy több paralóg génből állnak, amelyek 1Mb-on belül helyezkednek el. Szuperklasztereknek pedig azokat a géncsoportokat nevezzük, amelyek a klaszter magon kívül további géneket tartalmaznak. E gének funkcionálisan vagy fizikailag kapcsolódó fehérjéket kódolnak [9]. E definíciók alapján itt 6 gén-szuperklasztert és 6 génklasztert írtak le. Az utóbbi csoportba tartoznak a HSP, a TNF és a HLA II-es osztály génklaszterek. Az MHC I-es és II-es osztály génjeinek termékei genetikailag a legpolimorfabb fehérjékhez tartoznak, amelyek között egyes gének allélvariációinak a száma a 270-et (370 HLA-B) is elérheti [10]. Az MHC I osztályba tartozó, emberi humán leukocita antigén (HLA) fehérjék a HLA-A,-B,-C gének által kódolt polimorf α-láncból és a nem kovalensen kapcsolódó konstans β2-mikroglobulin láncból épülnek fel. A HLA-A,-B és –C lókuszok alléljei kodominánsan fejeződnek ki, így egy adott egyed maximálisan 6 eltérő HLA-I molekulát expresszálhat. Ezek az MHC I molekulák a szervezet szinte minden magvas sejtjének a felszínén megtalálható. Intracelluláris peptidkötő receptorként és sejtfelszíni antigén prezentáló molekulaként működnek. A citotoxikus CD8+ T-sejtek számára mutatják be a sejten belüli (endogén) fehérjékből képződő 8-10 aminosav hosszú peptideket. Az MHC II osztályba tartozó fehérjék polimorf α- és β-láncát a HLA-DP, -DQ, -DR régiókban az A- és B-gének kódolják. Az anyai és apai kromoszómákon eltérő A- és B-
10
gének allélvariációiról cisz és transz kombinációban is kifejeződhetnek MHC-II molekulák, amely következtében e fehérjék polimorfizmusa kétszeresére is nőhet. Az MHC II molekulák csak a hivatásos antigénprezentáló sejtek felszínén mutathatók ki, mint B-limfocitákon, makrofágokon, dendritikus sejteken. Ezek is intracelluláris peptid kötő receptorként és sejtfelszíni antigén prezentáló molekulaként funkcionálnak. A különbség az MHC I molekulákkal szemben az, hogy exogén eredetű fehérjékből származó peptideket mutatnak be segítő, CD4+ T-sejtek számára perifériás nyirokszervekben. Ezen peptidek hosszúsága 10 és 24 aminosav között változhat [11].
2. ábra. A 6. kromoszóma 6p21.31 régiójában kódolódó fontosabb gének [11].
11
2.2.1
Az MHC régió centrális része, az MHC III-as osztály
A humán genom és az xMHC régió expresszált génekben leggazdagabb szakasza a 700 kb hosszú MHC III régió, ahol 58 expresszált gén helyezkedik el [9]. Az itt jelenlevő gének túlnyomó többsége a gyulladásos folyamatokban játszik nélkülözhetetlen szerepet. Ezek közül csak néhányat szeretnék kiemelni (2. ábra).
2.2.1.1 Tumor nekrózis faktor klaszter A TNFα egy pleiotróp proinflammatorikus citokin, amelyet főként makrofágok és Tsejtek termelnek. Az akut fázis válasz kialakításában rendkívül fontosak. Különböző sejttípusok (limfociták, fibroblasztok, adipociták, endotél sejtek) növekedését, differenciációját és anyagcseréjét is befolyásolja. A gyulladásos válaszreakciókon kívül a programozott sejthalál aktiválásában játszik szerepet [12]. Génje a TNF génklaszterben a limfotoxin-α (TNFβ) és limfotoxin-β (LTB) gének között helyezkedik el. Ebben a szakaszban a 6 mikroszatellita polimorfizmuson kívül, még számos egypontos nukleotid polimorfizmust is leírtak. A legtöbbet a TNFA promóter régiójában, a -308-as pozícióban lévő G/A szubsztitúciót vizsgálták. In vitro és klinikai vizsgálatok eltérő eredményekről számoltak be a tekintetben, hogy a -308-as pozícióban melyik allél jelenléte okoz fokozottabb TNFα termelődést [13].
2.2.1.2 Hősokkfehérje klaszter A következő génklaszter a hősokk klaszter, ahol HSP70 családba tartozó hősokkfehérjék kódolódnak, mint a HSP70-1, a HSP70-2 és a HSP70-hom. A Hsp70 családba tartozó hősokkfehérjék segítik az újonnan szintetizált fehérjék natív szerkezetének kialakulását, a natív fehérjék sejtorganellumokba szállítását, de részt vesznek instabil fehérjék proteolítikus lebontásában is. A sejtet ért stressz indukálja a Hsp70 expresszióját (sokkal nagyobb mértékben, mint a Hsp60 vagy a Hsp90 expresszióját). A Hsp70 a cellularis stresszválasz részeként fontos szerepet játszik a sejtek védelmében, megakadályozza a fehérjék aggregációját, elősegíti az aggregálódott
12
fehérjék szerkezetének és funkciójának helyreállítását és az irreverzibilisen károsodott fehérjék transzportját a proteoszómákba. [14]. A HSP70-1 (HSPA1A) és a HSP70-2 (HSPA1B) teljesen azonos fehérjét kódol, amely a fő hőindukálható Hsp70 (72kDa). A hősokk mindkét gén átírását indukálja, de a HSP70-1–ről konstitutívan is expresszálódik alacsony szinten fehérje a sejtekben. A HSP70-hom (HSPA1L) az előző kettővel 90%-ban azonos aminosavsorrendű fehérjét kódol, de nem hőindukálható. Ezen gének közös sajátossága, hogy nem tartalmaznak intronokat [15,16]. Ebben a hősokk klaszterben a legtöbbet a HSP70-2 +1267 A/G nukleotidcserét vizsgálták, amely egy csendes mutáció, vagyis aminosav cserét nem okoz [17,18].
2.2.1.3 Komplement blokk („complotype block”) Ebben a blokkban négy különböző komplement fehérje (C2, B faktor, C4A, C4B) génjeit találjuk. E régió hossza az allélek duplikációjától vagy deléciójától függően 75 és 120 kb között változhat [19]. Ezek közül a genetikai diverzitás egyik legszokatlanabb formáját a humán C4 komplement komponens mutatja. A C4 komplement fehérje a klasszikus és lektin komplement kaszkádrendszer nélkülözhetetlen szereplője, mivel a C3 és C5 konvertáz enzimkomplexek egyik alkotója. A komplement mediált lízis elősegítésén kívül a C4 molekulák részt vesznek immunaggregátumok szolubilizálásában, célsejtek opszonizációjában. A C4 fehérjét két gén kódolhatja, C4A és C4B gén. A C4A és C4B között fő különbség az antigénekkel létesített kovalens kötések módjai. Az amino-csoportot tartalmazó antigénekkel amidkötést a C4A, míg a hidroxil-csoportot tartalmazó célmolekulákkal észter-kötést a C4B alakít ki [20]. A C4 gének egy speciális genetikai modulban, az RCCX modulban kódolódnak. Az RCCX modul a C4 génen kívül még 3 másik gént tartalmaz, amelyek az RP, a CYP21 és a TNX génjei (3. ábra).
13
3. ábra. Néhány példa bemutatása C4 gének kódolására RCCX modulban..
Az RP egy sejtmagban működő szerin/treonin protein kináz enzim. A CYP21 a citokróm P450 szteroid 21-hidroxiláz, amely glükokortikoidok, mineralokortikoidok bioszintézisében játszik fontos szerepet. A TNX (tenaszcin-X) funkciója még eddig nem ismert, de szerkezetileg az extracelluláris mátrix proteinekhez tartozik és szívben, vázizomban fejeződik ki. A 4 gén mindig együtt duplikálódik, amely egy genetikai egységet alkot. Ebből a jelenségből ered az RCCX modul elnevezés. Az RCCX modul külön az apai és külön az anyai kromoszómán 1, 2 vagy maximálisan 3 kópiaszámban fordulhat elő, amely így diploid szinten 1-6 kópiaszámok között variálódhat. A variáció fokát még az is növeli, hogy a C4 fehérjét C4A vagy C4B gén kódolja; valamint a gén 9. intronja tartalmazza-e a 6.36 kb hosszú HERV-K endogén retrovírust. A retrovírus jelenlététől függően rövid (C4S:14.6 kb) és hosszú (C4L:21kb) C4 géneket különböztetünk meg. Funkcionális szempontból lényeges különbség a gének között, hogy a C4 gén valamennyi duplikátumáról, míg az RP gén esetén csak az első, a CYP21 és a TNX gének esetén csak az utolsó RCCX modul génjeiről szintetizálódik működőképes fehérje [21,22].
14
2.2.1.4 RAGE (Receptor for Advanced Glycation Endproducts) A vércukorszint nagyságával és időtartamával arányosan nő a glükóz nem enzimatikus, posztszintetikus kapcsolódása fehérjékhez, lipidekhez. Kialakulnak az előrehaladottan glikozilált végtermékek (AGE), amelyek az immunglobulin szupercsaládba tartozó receptorukhoz (RAGE) kötődhetnek [23]. Normál fiziológiás körülmények között a receptor funkciója az AGE származékok megkötése, internalizálása, végül degradálása. Kóros folyamatokban, mint cukorbetegségben az AGE származékok nagymértékben felszaporodnak, amellyel párhuzamosan a receptorok sejtfelszíni expressziója is megnő. Ez emelkedett citokintermeléshez, prokoaguláns állapot kialakulásához vezet [24]. B.I. Hudson
és
munkatársai
2001-ben
RAGE
gén
és
promóter
régiójában
új
polimorfizmusokat kerestek, amelyeknek szerepük lehet a gén transzkripciós folyamataiban. RAGE -429T/C, 63 bp deléció (-407 és -345 között) és -374 T/A esetében írtak le jelentős emelkedést a CAT riporter gén expressziójában [24].
2.2.2
Az MHC régió ún. ősi kiterjesztett haplotípusa: a 8.1 ősi haplotípus
A fentebb már említett, genomszerte megjelenő konzervált DNS szakaszok (blokkok) 5150 kb hosszúak lehetnek, míg a humán fő hisztokompatibilitási génkomplexben a 3.2 Mb hosszúságot is elérhetik. E hosszú blokkokon belül, a lókuszok közötti szoros kapcsoltság rendkívül megnehezíti egy adott betegség és az itt jelenlévő gén, gének közötti kapcsolat felderítését. Az MHC régió blokkjaiban jelenlévő haplotípusokat „ősi vagy befagyott haplotípusoknak” is nevezik, mivel az ember evolúciója során már korán kialakultak és azóta szinte változatlanul öröklődtek tovább. Az ősi haplotípusok populáció és etnikum specifikusak, amelyek csak a befagyott blokkok közötti rekombináció
eredményeként
jöhettek
létre
[19].
Az
ősi
haplotípusokat
a
legpolimorfabb lókuszon, a HLA-B lókuszon elhelyezkedő allélek szerint nevezték el, amelyeket aztán további alcsoportokra osztottak. Pl. a HLA-B8 allélt hordozó haplotípusok egyik altípusa a 8.1 ősi haplotípus (8.1 ancestral haplotype: 8.1 AH). A 8.1 ősi haplotípust alkotó allélek a telomertől a centromer felé a következők. HLAA1, HLA-C4, HLA-B8, TNFA -308A, HSP70-2 +1267G, BfS, C4A*Q0, C4B1 (mono-S),
15
RAGE -429C, HLA-DR3, HLA-DQ2. Ez a kaukázusi populációkban a leggyakrabban (810%-ban) előforduló ősi haplotípus változat [25]. Az MHC régióról már régóta ismeretes, hogy bizonyos allélkombinációk együttes jelenléte számos betegségre, főként autoimmun betegségekre hajlamosít. A 8.1 ősi haplotípust hozták összefüggésbe a legtöbb autoimmun betegséggel, mint az inzulinfüggő diabetes mellitus, szisztémás lupus erythematosus, myasthenia gravis, IgA deficiencia,
Sjögren-szindróma,
Basedow-Graves
kór,
autoimmun
hepatitis,
dermatomyositis, Addison-kór [26]. Ezt a megfigyelést az támasztja alá, hogy a 8.1 ősi haplotípus hordozókra általánosan jellemző kóros immunfolyamatok nagyrészt autoimmun eredetűek. A Th1/Th2 T-sejtes immunválasz a Th2-es humorális immunválasz irányába tolódik, mivel a sejtes immunválaszt indukáló citokinek (IL-2, IL-5, IL-12 és IFN-γ) szintézise csökken. A makrofágok, neutrofilek, NK-sejtek csökkent aktivitása is a celluláris immunválasz romlását mutatja. A limfociták spontán apoptózisa a limfociták abszolút számának csökkenéséhez vezet, de az aktivált T-sejtek magas számban vannak jelen a vérben. Emelett vérplazmájuk még emelkedett autoantitest és emelkedett immunkomplex szinttel jellemezhető [26]. Ezen autoimmun betegségek közül, pl. az inzulin-függő diabetes mellitus kialakulásában is, egyre inkább beigazolódik a 8.1 ősi haplotípus szerepe. Kezdetben, legnagyobb genetikai hajlamosító tényezőnek a HLA II-es osztály génjeit tartották. Ezek közül a DR3/DQ2 és DR4/DQ8 allélekről bizonyosodott be, hogy lényeges rizikó faktort jelentenek. Későbbi vizsgálatokból azonban kiderült, hogy nemcsak a HLA II-es osztály génjei vesznek részt a betegség kialakításában. Különböző kaukázusi IDDM betegségcsoportokban az MHC régió teljes, ősi, kiterjesztett haplotípusainak előfordulását vizsgálták, ahol a 8.1 ősi haplotípus bizonyult a leggyakoribbnak [27]. Az MHC régió a humán genom génekben egyik legsűrűbb szakasza, amelyen belül a lókuszok között nagyon szoros kapcsoltság áll fenn. Ez rendkívül megnehezíti az adott betegség és az adott gén, gének közötti kapcsolatok felderítését. A régión belül a haplotípus blokkok meghatározása mellett, egyre inkább előtérbe kerülnek a rövid rekombinációs „hot-spot” szakaszok beazonosításai. E célból az elmúlt években több tanulmány is készült [19,28-30]. Az MHC szubrégiók között az eddigi LD mintázat vizsgálatok nagy varianciáról tanúskodnak. A kromoszóma telomer részén hosszú, jól elkülönülő blokkokat, míg a centromer részen egyöntetűen kisebb blokkokat írtak le
16
[28]. A humán genom jelenleg ismert leghosszabb blokkja is itt a kiterjesztett MHC I szubrégióban, a szagló-receptor génklaszterben található [29]. Az MHC régióban több rekombinációs szakaszt azonosítottak. Az MHC I régióban a GABBR1 és MOG gén között, a TRIM26 gén 6-os intronjában, valamint a TRIM39 gén 5’ végénél írtak le rekombinációs szakaszt. Az MHC III régióban LTA és BAT2 gén között, valamint a NOTCH4 gén közelében találtak „hotspot” szakaszt [31]. Az MHC II régióban a HLADRA és HLA-DQA2 gén között, TAP2 génen belül, valamint HLA-DMB, HLA-DMA és HLA-DOA gének között található még rekombinációs hely (4. ábra).
4. ábra. A humán MHC osztályokon belül leggyakrabban előforduló hotspot szakaszok [11].
Az MHC régió teljes LD szerkezete a sok genetikai asszociációs vizsgálat ellenére, azonban még ma sem teljesen feltárt terület. Az MHC régió pontosabb LD szerkezetének megismerésében és az MHC régióval asszociált betegségek kandidáns génjeinek azonosításában segítséget nyújthat a 8.1 ősi haplotípus és rekombinációkkal létrejött haplotípusvariánsainak eloszlás vizsgálata. Az I. modellrendszerünkben a 8.1 ősi haplotípus és kisebb fragmentumainak eloszlását vizsgáltuk két egészséges kaukázusi populációban és egy családvizsgálatban, ahol inzulin-függő cukorbetegség fordult elő.
17
Következő vizsgálatunkban a haplotípusvizsgálatok egy másik módszerét alkalmaztuk. Az előbbiekkel ellentétben nem a hotspot régiók azonosítása, hanem a haplotípus blokkok feltérképezése került előtérbe. Korábban kutatócsoportunk a szérum antiHsp60 autoantitest szintek és a citokinek családjába tartozó IL-6 gén promóter régiójában elhelyezkedő -174 G/C SNP között mutattak ki szoros asszociációt. Ezen eredményekből kiindulva az IL-6 -174 G/C SNP mellett, az IL-6 gén és promóter régióban, újabb autoantitest szintekkel asszociációban lévő SNP-k és haplotípusok azonosítása vált elsődlegessé. A citokinek kulcsfontosságú szerepet töltenek be a szervezet homeosztázisának fenntartásában,
az
immunválaszok
szabályozásában,
a
gyulladásos
reakciók
kialakulásában. A citokinek általában kis molekulatömegű glikoproteinek, amelyek a veleszületett és a szerzett immunválasz effektor fázisában termelődnek. Hatásuk pleiotróp, azaz a célsejt differenciációjának fokától és típusától, illetve a jelenlévő többi citokin minőségétől függően számos hatással rendelkeznek. Termelődésük gyorsan lezajló folyamat. Citokinek hatása mindig átmeneti jellegű, amit az is bizonyít, hogy mRNS-eik fél életideje viszonylag rövid. Egy citokint általában többféle sejt is termelhet [8].
2.3 Interleukin-6 2.3.1
Interleukin-6 általános jellemzői
Az interleukin-6 (IL-6) fehérjét először 1968-ban B-sejt stimuláló faktor-2 (BSF-2) néven írták le [32], mivel megfigyelték, hogy T-sejtek felülúszójából származó molekulák
jelentősen
serkentik
a
B-sejtek
osztódását,
valamint
a
B-sejtek
differenciálódását ellenanyag termelő plazmasejtekké [33]. Az interleukin-6 (IL-6) egy pleiotróp citokin, amely különböző célsejteken eltérő hatásokat vált ki (5. ábra).
18
5. ábra. IL-6 különböző funkciói.
Központi szerepet játszik az immunválasz, a gyulladás és a hematopoézis szabályozásában [34]. Fontos kulcsmolekula a humorális immunválasz kialakításában, mivel nélkülözhetetlen szerepe van a B-sejtek érésében, terminális differenciációjában, ellenanyag termelő plazmasejtekké válásában. T-sejtek aktivációja és proliferációja szempontjából is rendkívül lényeges ez a molekula, indukálja a T-sejtek IL-2R fokozott expresszióját, amivel elősegíti a nyugvó T-sejtek G1 fázisba kerülését. A B-sejtek felszíni immunglobulin-receptoraikon keresztül a specifikusan kötött antigéneket képesek felvenni, majd intracelluláris feldolgozásuk után MHC-II molekuláikon Thelpersejtek (Th) számára bemutatni. Ebben az immunológiai szinapszisban az IL-6 jelenléte serkenti a Thelper sejtek IL-4 citokin termelését, míg az IFNγ expressziót gátolja. Ennek következtében a Th1/Th2 egyensúly a Th2-es, humorális immunválasz irányába tolódik [35]. Interleukin-6 serkenti a legjelentősebben a hepatocitákat, ami akutfázis fehérjék: C-reaktív protein, fibrinogén, α1-antitripszin, antikimotripszin, α1-savas glikoprotein, szérum amiloid A termelését eredményezi a májban, ezzel párhuzamosan azonban
19
csökkenti az albumin és transzferrin termelődését [36]. Az IL-6 több más citokinnel (pl. IL-1) együtt pirogén hatású és részt vesz a láz kialakulásában. Interleukin-6 endokrin hatásai közé sorolhatjuk, hogy képes stimulálni a hipofízis vazopresszin és növekedési faktor szekrécióját, valamint csökkenteni a szérum lipid szinteket (koleszterin, apolipoprotein B, triglicerid) [37]. Az idegrendszer egyes sejtjei (pl. az asztroglia sejtek) IL-6 termeléssel serkentik a hipotalamusz-hipofízis ACTH (adrenocorticotrop hormon) termelését és ezen keresztül jelentősen növelik a mellékvese eredetű, immunszupresszív hatású kortikoszteroidok mennyiségét a keringésben. Ez is egy finoman szabályozott folyamat, mivel a kortikoszteroidok negatív visszacsatolással gátolják az IL-6 szekrécióját.
A
neuro-endokrin-immunrendszer
egy
másik
fontos
feladata
a
stresszválasz, vagyis a külső és a belső környezeti változáshoz történő gyors alkalmazkodás, amiben az interleukin-6 stressz hormonként vesz részt [37] (5. ábra). A humán IL-6 gén a 7. kromoszómán, 7p21 régióban helyezkedik el [38]. Az öt exonból és négy intronból álló gén előtt egy fokozottan konzervált promóter régió található. Ez a promóter szakasz számos transzkripciós faktor kötőhellyel rendelkezik, amelyet a 6. ábrán mutatunk be.
6. ábra. IL-6 gén promóter régiója és szabályozó transzkripciós faktorai
RNS átírás két helyen is megindulhat, az egyik IL-6 start kodon +1 pozíciónál, míg a másik -21 pozíciónál található [39]. Transzkripciós faktorok bekötődése alapján az egyik legfrekventáltabb régió a -173 és -145 közötti szakasz. Itt két MRE (multiple cytokine and second messenger responsive enhancer) régió található, amelyhez CREB (cAMP response element binding protein) és C/EBP (CAAT/enhancer binding protein) transzkripciós faktorok kötődhetnek [40]. IL-6 expressziót fokozó NF-κB (nuclear factor-κB) és AP-1 (activator protein-1) transzkripciós faktor kötőhelyek találhatók még a -73 és -55, valamint -280 és -274 szakaszok között [41]. Az IL-6 promóter régióban
20
több GRE (glucocorticoid receptor binding element) helyezkedik el, amelyhez a génátírást negatívan szabályozó glükokortikoid receptorok kötődhetnek [42]. IL-6 génexpresszióját indukálhatják citokinek (tumor nekrózis faktor-α [TNF-α], interleukin-1 [IL-1], platelet-derived growth factor [PDGF], interleukin-3 [IL-3], GMCSF,
interferon-γ
katekolaminok
[IFN-γ]),
(adrenalin,
bakteriális
noradrenalin),
termékek
(lipopoliszacharid
vírusfertőzések,
sérülések
[LPS]), (sebészeti
beavatkozás). Ezzel ellentétben glükokortikoidok, ösztrogének, androgének csökkentik az IL-6 expressziót. IL-6-ot nemcsak az immunrendszer sejtjei (T-sejt, B-sejt, monociták, hízósejtek) termelnek [37], hanem sok más sejttípus is, mint gliasejtek, hipofízis elülső lebenyének egyes sejtjei, fibroblasztok, keratinociták, endotél sejtek, csontvelő sejtek, simaizom sejtek és mezangiális sejtek [43]. Azonban nem minden IL-6 termelő sejttípus reagál egyformán az ingerekre. Fibroblasztok esetében a legnagyobb választ az IL-1 váltja ki, míg csontvelő sejtek esetében ez az IL-3 vagy a GM-CSF [36].
2.3.2
IL-6 jelenléte különböző kórfolyamatokban
Az IL-6 túltermelődése számos különböző eredetű kórfolyamat kialakulásához vezethet. Idetartoznak a különböző tumoros megbetegedések, mint a mieloma multiplex [44], Kaposi szarkóma, tüdő-, vesetumor [34]. Más gyulladásos betegségek esetén is, mint érelmeszesedés [45] vagy sepsis [46,47], magas szérum IL-6 koncentrációkat mutattak ki. Több kutatócsoport találta azt, hogy az emelkedett IL-6 szint összefüggésben van cardiovascularis betegségek kialakulásával [48] és lefolyásuk súlyosságával [49]. Az atherosclerotikus léziókban sikerült kimutatni az IL-6 mRNS-t [50] és az IL-6 fehérjét is [51]. Továbbá kimutatták, hogy az IL-6 serkenti az endotél sejtek aktivációját, fokozza a simaizomsejtek proliferációját [52] és a leukociták migrációját [53], amely folyamatok az érelmeszesedés kialakulása szempontjából is mind nagyon lényegesek. Az első feltételezés, hogy az IL-6 szerepet játszhat autoimmun folyamatokban is, onnan eredt, hogy a szív myxoma-ban szenvedő betegek egyharmada autoimmun tüneteket is mutatott. A tumor eltávolítása után azonban ezek a tünetek megszűntek, ami arra
21
engedett következtetni, hogy vagy maga a myxoma vagy valamilyen terméke járul hozzá az autoimmun betegség kialakulásához. Később e tumor sejttenyészet felülúszójában magas IL-6 koncentrációt, majd a tumor sejtekben magas IL-6 mRNS szinteket detektáltak [54]. Magas IL-6 szérum szinteket figyeltek meg szisztémás sclerosisban [55] rheumatoid arthritisben, inzulinfüggő cukorbetegségben (IDDM), szisztémás lupus erythematosusban (SLE), gyulladásos bélbetegségekben, mint Crohnbetegség, colitis ulcerosa [56]. Számos eredmény utal arra, hogy az IL-6 molekula valóban részt vesz az autoimmun folyamatok kialakításában. Az alábbiakban néhány példát ismertetünk ezek közül. Az IL-6 hiányos egerekben nem fejlődött ki az autoimmun
eredetű
myocarditis
[57].
A
kísérletesen
indukált
autoimmun
kórfolyamatok, mint a II. típusú kollagénnel indukált arthritis vagy a mielin fehérjével indukált encephalomyelitis kialakulása is mind IL-6 függő volt. Napjainkban már az IL6 receptor elleni humanizált monoklonális antitestet (tocilizumab) terápiás célból is sikeresen használják, mivel hatékonyan blokkolja az IL-6 jelátviteli folyamatokat. [32,34]. Ezenkívül további in vitro kísérletek mutatják be, hogyan befolyásolja az IL-6 az autoimmunitás szempontjából is fontos antigén prezentáló folyamatokat. Rágcsáló modellben, csontvelő eredetű dendritikus sejteket (BMDC) tyúk-tojás-lizozim fehérjével (HEL) stimuláltak és figyelték antigén prezentációjukat HEL peptidekre specifikus T-sejt hibridóma panel segítségével. IL-6 jelenlétében azok a T-sejt hibridómák aktiválódtak, amelyek a HEL fehérje rejtett epitópjaira voltak specifikusak. Az IL-6 kritikus hatása itt abban rejlik, hogy gátolja a korai endoszómák Na+/K+ ATPáz pumpáját, ezáltal az endoszómák pH értékét a savas tartományba tolja. A megváltozott pH hatására az endoszómális proteázok specifitása megváltozik, és felszínre kerülnek a rejtett epitópok is [56,58]. A fent említett krónikus gyulladásos, érelmeszesedéses és autoimmun betegségekben jelentkező magas IL-6 szintet előidéző folyamatok háttere még napjainkban sem tisztázott. Első lépésként a kutatók többsége a génexpressziós folyamatokat befolyásoló tényezőket vizsgálta. Az IL-6 gén expresszióját szabályozó promóter régióban több egypontos nukleotid polimorfizmus található, mint a -634 C/G, -597 G/A, -572 G/C és 174 G/C SNP. Az IL-6 -174 G/C polimorfizmus helyezkedik el a legközelebb egy jól
22
ismert forrópont régióhoz, amely a -173 és -145 nukleotid közötti szakaszt öleli át és fontos több transzkripciós faktor bekötődése szempontjából (6. ábra). A fentiekből kiindulva a legtöbb érelmeszesedéses és autoimmun betegségek területén végzett klinikai vizsgálatokban az IL-6 expresszióját az IL-6 -174 SNP függvényében vizsgálták. Az eredmények között mindkét betegség csoportnál jelentős eltérések figyelhetőek meg (1. táblázat).
2.3.3
Klinikai kórképek és az IL-6 -174 G/C polimorfizmus közötti kapcsolatok
Egyes vizsgálatokban nem találtak összefüggést az IL-6 -174 SNP genotípusa és a plazma IL-6 szintek, valamint a koszorúér betegség és a myocardialis infarctus előfordulása között [59] [60]. Más tanulmányokban viszont populációs különbségeket figyeltek meg. Egy dél és egy észak-európai csoportot összehasonlítva, az észak-európai csoportban a -174 G/C polimorfizmus variáns C allélja fordult elő gyakrabban, ahol a C allélt hordozók kisebb eséllyel kaptak myocardialis infarctust a GG hordozókkal szemben. A dél-európai csoportban ezzel szemben nem találtak összefüggést [61]. Egy olasz populációban, koszorúér betegek körében az IL-6 -174 C allélt hordozókhoz képest a GG homozigóták rendelkeztek magasabb IL-6 szérum szinttel. Koronária bypass műtét után a GG homozigótáknál jelentkezett nagyobb arányban myocardialis infarctus, valamint műtét utáni halál [62]. Ezzel szemben egymástól független munkacsoportok azt találták, hogy a GG homozigóta személyeknek az IL-6 -174 C allélt hordozókhoz viszonyítva kisebb volt az esélye a koszorúér betegség kialakulására [63,64]. Brull DJ és munkatársai arról számoltak be, hogy a koronária artéria bypass műtét után 6 órával a C allélt hordozók körében nagyobb mértékben emelkedtek a plazma IL-6 szintek [65]. Továbbá egy ausztrál populációban az IL-6 -174 C allél függött össze megnövekedett carotis intima-media vastagsággal és carotis plakk kialakulással [66] (1. táblázat). Hasonló eltéréseket tapasztaltunk az autoimmun betegségek és az IL-6 -174 SNP összefüggéseiben is (1. táblázat). Rheumatoid arthritis esetében a C allélt hordozóknál mutattak ki alacsonyabb IL-6 plazma szintket és enyhébb lefolyású RA-s tüneteket [67,68]. Sclerosis multiplex esetében nem találtak összefüggést e polimorfizmussal [69].
23
1. táblázat. Különböző klinikai vizsgálatokban az IL-6 -174 SNP és az IL-6 fehérjetermelés, valamint a betegség kialakulása közötti összefüggések.
IL-6 -174 SNP
IL-6 plazma szint
Munkacsoport
myocardialis infarctus, koszorúér betegség
nincs összefüggés
M. Nauck (2002) Mark P.S. Sie (2006) D. Kelberman (2004)
myocardialis infarctus, koszorúér betegség
nincs összefüggés, alacsonyabb
D. Kelberman (2004) F. Basso (2002)
koronária bypass műtét után
magasabb
F. Burzotta (2001)
Betegség
A) Érelmeszesedéses betegségcsoport nincs összefüggés C allél hordozóknak kisebb az esélye GG genotípusúak hosszabb kórházi kezelése
carotis intima-media falvastagsága nagyobb GG cardiovascularis genotípusúaknak halálozás, kisebb az esélye koszorúér betegség B) Autoimmun betegségcsoport C allél hordozóknak rheumatoid arthritis enyébb tünetek nincs sclerosis multiplex összefüggés rheumatoid arthritis C allél hordozók
2.3.4
C. Chapman (2003) nincs összefüggés
K.G. Jones (2001) S.E.Humphries(2001)
alacsonyabb
D. Fishman (1998) A. Pawlik (2005) M. Fedetz (2001) M. Pascual (2000)
Az IL-6 -174 G/C polimorfizmus IL-6 fehérje expressziójában betöltött funkcionális szerepe különböző in vitro sejtes kísérletekben
Az in vitro kísérletek is a klinikai tanulmányokhoz hasonlóan eltérő eredményekről számoltak be (2. táblázat). Az első in vitro kísérletet D. Fishman és munkacsoportja végezte el. HeLa sejteket transzfektáltak egy IL-6 promóter régiót tartalmazó luciferáz riporter plazmiddal, ahol a transzkripciós válasz, β-galaktozidáz expresszió, IL-6 promóter polimorfizmus függőnek bizonyult. IL-1β és LPS stimuláció után az IL-6 -174 G allélt (haplotípusban -313 pozíciónál a 8A/12T alléllal) hordozó plazmid mutatott emelkedett expressziót, míg kezelést követően az IL-6 -174 C allélt hordozó plazmid expressziója nem változott a nem-stimulált csoporthoz képest [67]. S. Kilpinen és kutatócsoportja újszülöttekből származó mononukleáris sejteket vizsgált és azt találta,
24
hogy a CC genotípusú sejtek termeltek LPS kezelést követően, szignifikánsan nagyobb mennyiségű IL-6 fehérjét. Ugyanezt a kísérlet sorozatot megismételték felnőttekből származó mononukleáris sejtekkel, ahol nem találtak különbséget a termelt IL-6 szintek között IL-6 -174 SNP függvényében [70]. Következő vizsgálatban szignifikáns kapcsolatot mutattak ki IL-6 -174 SNP és különböző életkorú személyekből származó adherens
perifériás
mononukleáris
sejtek
között,
amelyek
gazdagok
voltak
makrofágokban. IL-6 -174 pozícióban GG genotípusú mononukleáris sejtek felülúszója magasabb IL-6 szinttel rendelkezett, mint a C allélt hordozók felülúszója [71]. M. Müller-Steinhardt és kollégái 100 egészséges donor monocitáinak és T-limfocitáinak IL-6 szekrécióját vizsgálták LPS stimuláció hatására. IL-6 -597G/-572G/-174G homozigóta genotípust hordozók alacsonyabb IL-6 szekréciót mutattak, mint bármelyik más genotípus variáció [72]. Ezzel ellentétben egy másik munkacsoport azt találta, hogy ugyanúgy LPS kezelést követően, felnőttekből származó IL-6 -597G/-572G/-174G homozigóta genotípussal rendelkező leukociták termelték legnagyobb mennyiségben az IL-6 fehérjét [73]. Végül EBV immortalizált B-limfociták esetén azt mutatták ki, hogy a B-limfociták IL-6 termelése sem fiatal, sem idősödő korcsoportban nem különbözött egymástól IL-6 -174 genotípus szerint [74]. 2. táblázat. Különböző in vitro kísérletekben az IL-6 -174 SNP és az IL-6 fehérjetermelés közötti összefüggések.
IL-6 -174 SNP
Sejttípus
Fehérjeexpresszió
Munkacsoport
G allél
HeLa sejtek: IL-6 promóter luciferáz riporter plazmiddal
magasabb β-galaktozidáz expresszió
D. Fishman et al. (1998)
CC genotípus
Mononukleáris sejtek
magasabb IL-6 expresszió
S. Kilpinen et al. (2001)
GG genotípus
Adherens perifériás mononukleáris sejtek
magasabb IL-6 expresszió
F. Olivieri et al. (2002)
GG genotípus
Monocita, T-limfocita
alacsonyabb IL-6 expresszió
M. MüllerSteinhardt (2007)
GG genotípus
Leukociták
magasabb IL-6 expresszió
F.A. Rivera-Chavez (2003)
EBV immortalizált B-sejtek
nincs különbség
F. Olivieri et al. (2003)
25
2.3.5
IL-6 gén kódoló és promóter régiójának haplotípusai
A fenti látszólag ellentmondó eredményeknek több okai is lehetnek. Egyrészt az IL-6 expressziót nemcsak egyetlen nukleotid polimorfizmus befolyásolhatja, hanem az IL-6 gén és promóter régiójában elhelyezkedő több SNP együttes előfordulása, egy speciális haplotípus jelenléte határozhatja meg [75]. Másrészt az IL-6 expresszió szabályozása lehet sejt és szövet specifikus, amely a különböző betegségekben eltérő módon juthat érvényre. Az IL-6 gén és promóter régiójára vonatkozóan is végeztek haplotípus vizsgálatokat. Első megközelítésben szoros kapcsoltságot mutattak ki az IL-6 promóter régiójában, 174 és -597 SNP között [76] [77]. Következő asszociációs vizsgálatokban a -597 és 174 SNP közötti promóter régiót további polimorfizmusokkal bővítették ki. MS Fife és munkatársai szorosabb összefüggést kaptak -174G/-572G/-597G/-1363G/-1480CT haplotípus és a szisztémásan jelentkező fiatalkori arthritis között, mintha csak egyetlen SNP-t (IL-6 -174) vizsgáltak volna [78]. AM Sutherland és kutatócsoportja egy krónikus gyulladásos betegség, a szepszis és IL-6 haplotípusok között keresték a kapcsolatot. Azt állapították meg, hogy a betegek körében a -174/+1753/+2954 SNPkből álló haplotípusok közül a CCG, GGG és GCC haplotípusok fordultak elő nagyobb számban [79]. D Acalovschi és kollégái azt találták, hogy ischemiás stroke után alacsonyabb IL-6 szintekkel rendelkeztek a leggyakrabban előforduló -597A/-572G/373(8A/12T)/-174C haplotípust hordozók [80].
2.4 Az atherosclerosis 2.4.1
Az atherosclerosis gyulladásos folyamatai
Első lépésben a rizikófaktorok (a plazma emelkedett LDL, csökkent HDL szintje; oxidált LDL felhalmozódása a szubendoteliális térben, a cigaretta füstből származó szabad gyökök jelenléte, a magas vérnyomás és bizonyos fertőzések) jelenléte az erek falát belülről borító endotél sejtek funkciózavarát okozza, amely után gyulladásos folyamatok lépnek fel és amelyek felgyorsítják az atherogenezis folyamatát [81,82].
26
Az endotél sejtek funkciózavarából adódóan nő az endotélium permeabilitása és az adhéziós molekulák sejtfelszíni expressziója. Leukociták endotél sejtekhez történő tapadásában kulcsfontosságú molekulák, a VCAM-1, ICAM-1, PCAM-1, P-szelektin, E-szelektin
expressziója
simaizomsejtek
és
ugrásszerűen
makrofágok
megnő.
citokineket,
Továbbá
kemokineket
az
endotélsejtek,
termelnek,
amelyek
expressziója szintén megkönnyíti a leukociták átjutását az érfal intima rétegébe és hozzájárul az atherosclerotikus léziók kialakulásához. Citokinként legnagyobb mennyiségben IL-1, IL-8, TNF-α molekulák találhatóak meg [83], de IL-6 jelenlétét is leírták [50,51]. Kemokinek közül a legjobban a monocita kemoattraktáns protein-1 (MCP-1) kóros szerepe ismert. Ezen kívül hízósejtek vonzásáért felelős eotaxin, és Tlimfociták vonzásáért felelős, IFN-γ-val indukálható, CXC kemokinek családjába tartozó molekulák (IP-10, Mig és I-TAC) jelenlétét írták le aterómákban [84]. Növekedési faktorok közül a makrofág kolónia stimuláló faktor (M-CSF) játszik fontos szerepet a monociták habos sejtekké alakulásában. A plakkokban nagy számban mutathatóak ki antigénprezentáló sejtek, mint makrofágok, dendritikus sejtek; míg a Bsejtek és granulociták száma meglepő módon alacsony [83]. Az aterómákban valamennyi T-sejt alpopuláció kimutatható [85], amelyek közül a leggyakoribbak a CD4+, Th1 sejtek [86]. Továbbá a T-sejtek döntő többsége α/β T-sejt receptorral rendelkezik, de γ/δ T-sejt receptorúak is számottevő arányban (10-15%-ban) jelen vannak [87].
2.4.2
Az atherosclerosis autoimmun vonatkozásai
Az atherosclerosis kórfolyamataiban eddig három autoantigén részvételét írták le, ezek az oxidált LDL, a β2-glikoprotein, és a 60 kDa-os hősokk fehérje[88]. A továbbiakban a Hsp60 ellen kialakuló autoimmun válasz jelentőségét ismertetem (7. ábra). A hősokkfehérjék a sejtek legfontosabb fehérjéi közé tartoznak. Filogenetikailag, funkcionális
és
immunológiai
szempontból
rendkívül
konzervált
molekulák.
Aminosavsorrendjük az élővilág egyik legváltozatlanabbul továbböröklődő struktúrája, miszerint egyes tagjai több mint 50%-os aminosav szekvencia homológiát mutatnak a különböző fajok között. Megtalálhatóak baktériumokban, növényi és állati sejtekben. Fiziológiás körülmények között a hősokkfehérjék a polipeptidláncok szintetizálódásától
27
egészen a komplex fehérjék összerendeződéséig jelen vannak és ezért is nevezik őket dajkafehérjéknek (chaperonoknak)[89] [90]. Ennél még fontosabb feladatuk az, hogy mind normál körülmények között, mind a sejtet ért ártalom hatására denaturálódott vagy rosszul feltekeredett fehérjéket segítsék abban, hogy visszanyerjék eredeti, natív struktúrájukat
[91].
Részt
vesznek
számos
sejtregulációs
folyamatban,
mint
sejtcikluskontrollban, fehérjék transzlokációjában, szteroid- és D-vitamin receptor feldolgozásban, antigén-prezentációban. Molekulatömegük alapján a stresszfehérjék családokra oszthatók, melyek közül az egyik legkorábban megismert család a 60 kD-os hősokkfehérje család volt. Idetartozik a humán Hsp60, valamint baktériumokban expresszálódó homológjai a GroEL Escherichia coli-ban, mycobacterialis Hsp65 Mycobacterium bovis-ban. A Hsp60 ellenes autoimmun reakciók kialakulásának különböző okai lehetnek. Az egyik legfontosabb kiváltó tényező, hogy a Hsp60 molekula család tagjai is filogenetikailag rendkívül konzerváltak. Mikrobiális fertőzések során, a patogén Hsp60 molekulák ellen kialakuló specifikus ellenanyagok keresztreagálhatnak a saját Hsp60 molekulákkal [92]. Továbbá immunogénné válhatnak azáltal, hogy a Hsp60 fehérje poszttranszlációsan módosul (pl. oxidálódik), idegen és más saját antigénnel komplexet alkot (tumor elleni vakcinák alapját adja ez a folyamat [93]) valamint fiziológiás, intracelluláris formájától eltérően (vérplazmában, sejtek felszínén) is megjelenik [92]. Habár a Hsp60 pontos hatása még tisztázatlan, számos eredmény utal jelenlétükre az atherogenesis folyamatában. A humán Hsp60 molekula tulajdonképpen egy mitokondriális fehérje, amely vészjel hatására a citoplazmába transzlokálódhat, sőt az erek falát alkotó endotél [94] és simaizomsejtek membránjában fokozottan expresszálódhat atherosclerotikus léziók területén [95]. Napjainkban folynak aktív kutatások arról, hogyan kerülhetnek ki ezek a molekulák az extracelluláris térbe. Az egyik elmélet szerint sejtek nekrózisával ürülhetnek ki a környezetbe [93], míg kezd beigazolódni egy másik feltevés is, miszerint a stresszfehérjék fiziológiás körülmények között, egy nem-klasszikus fehérje szekréciós útvonalon, exoszómákon keresztül is szekretálódhatnak. Továbbá a plakkokban mindkét sejttípusnál (endotélsejt, simaizomsejt) kimutatták az MHCII molekulák expresszióját, amely antigén-prezentáló tulajdonságaikat erősíti meg [96,97].
28
A szérum szolubilis Hsp60 emelkedett szintje szoros összefüggést mutatott a megnövekedett intima-média vastagsággal és a korai atherosclerosis megjelenésével [98,99]. Több kutató csoport számolt be Hsp60 elleni humorális immunválasz megjelenéséről, vagyis a Hsp60 elleni ellenanyagok magas szintjéről koszorúér betegségben és perifériás érbetegségben [90] [100]. Xu és munkatársai in vivo kísérletekben normál koleszterin szintű nyulakat Hsp60/65-tel immunizáltak, amely meggyorsította a zsíros csíkok kialakulását [101,102]. Humorális immunválasz mellett celluláris, T-sejt mediált immunreakciók is megjelennek. Az atherosclerotikus plakkokban olyan T-sejt vonalakat találtak, amelyek Hsp60 ellenes reaktivitást mutattak [85] [102].
7. ábra. Hsp60 és IL-6 molekula szerepe az atherosclerosis autoimmun kórfolyamataiban.
A Hsp60 elleni antitestek az endotél sejtek felszínen megjelenő Hsp60-hoz kötődnek, ahol komplement mediált sejtlízist, ellenanyag mediált sejtlízist (ADCC) és/vagy T-sejt mediált celluláris immunválaszokat indukálhatnak. Az endotéliumnak ez a sérülése korai léziók kialakulásához vezethet. A betegség korai stádiumában az ellenanyagok a
29
makrofágok/habos sejtek és simaizomsejtek felszínén expresszált Hsp60-hoz is kötődhetnek, amely folyamat a sejtek líziséhez és az előrehaladott léziók nekrotikus magjának kialakulásához vezethet [103] (7. ábra). Más betegségben, mint az autoimmun eredetű szisztémás lupus erythematosusban, klinikai és in vivo kísérletekben szoros összefüggést írtak le emelkedett 90 kDa-os hősokkfehérje, valamint emelkedett IL-6 és anti-Hsp90 autoantitest szintek között [104,105]. A magas IL-6 szint indukálhatja az anti-Hsp autoantitestek fokozott termelődését. Ezen eredményeket és az érelmeszesedés kórfolyamatait alapul véve, II. modellrendszerünkben az IL-6 -174 G/C polimorfizmus és az anti-Hsp60 autoantitestek közötti kapcsolatot vizsgáltuk. Vizsgálatunkat az IL-6 gén és promóter régiójában elhelyezkedő több egypontos nukleotid polimorfizmussal bővítettük ki.
30
Az IL-6 gén kódoló és promóter régiójában végzett asszociációs vizsgálataink bíztató eredményeket
mutattak.
A III.
modellrendszerünkben
az
IL-6 -174 G/C
polimorfizmus funkcionális, fehérjeexpressziót befolyásoló hatását vizsgáltuk in vitro körülmények között. A vizsgálathoz az érelmeszesedés kialakulásának szempontjából egyik legfontosabb sejttípust választottuk. Ezenkívül figyelembe vettük, hogy a választott sejttípus olyan transzkripciós faktorral rendelkezzen, amelynek DNS-hez kötődését az IL-6 -174 G/C polimorfizmus befolyásolhatja.
2.5 Az endotél sejtek általános jellemzői Az endotél sejtek nemcsak barriert képeznek a vér és a szövetek között, hanem részt vesznek számos fiziológiás folyamat szabályozásában, ez alatt értendő a vaszkuláris tónus és hemosztázis szabályozása, a megfelelő immunválasz és az érszerveződés (8. ábra) [106]. Az emberi szervezetben az erek falát borító endotélium összfelületét 100-350 m2-re , míg tömegét a teljes testtömeg 1%-ára becsülik. Az endotél sejtek vazodilatátor és vazokonstriktor mediátorok termelésével képesek az endotélium alatt fekvő simaizomsejtek tónusát megváltoztatni, ezáltal a vérnyomást és a véreloszlást befolyásolni. Endotél sejtek által termelt vazodilatátorok, a nitrogén-oxid (NO) és a prosztaciklin elernyesztik, míg a vazokonstriktorok, az endotelin (ET) és a tromboxán (TxA2) összehúzzák az erek simaizomsejtjeit [107,108]. Az
endotél
sejtek
következő
fontos
funkciója
a
véralvadás
bonyolult
kaszkádrendszereinek egyensúlyban tartása. Fiziológiás körülmények között a sejtek felszíne antitrombotikus. A NO és a prosztaciklin (PGI2) a vérlemezkék aktivációjának és aggregációjának gátlását biztosítja. A sejtek felszínén található trombomodulin a trombin megkötésével aktiválja a protein C-t. A protein-C, a protein-S jelenlétében hasítja és inaktiválja az Va és VIIIa faktorokat, mely faktorok a véralvadási kaszkád működéséhez nélkülözhetetlenek. A fibrinolitikus rendszer beindításához az endotél sejtek szöveti plazminogén aktivátort és urokináz-típusú plazminogén aktivátort termelnek, míg e molekulák hatásait plazminogén aktivátor inhibitorral tudják ellensúlyozni. Sérülés után ez az antitrombotikus expressziós mintázat megváltozik.
31
Megindul a plazminogén aktivátor inhibitorok (PAI-1, PAI-2), a szöveti faktorok (TF) termelése, valamint a von Willebrand faktor gyors szekréciója a Weibel-Palade testekből, amelyek protrombotikus / prokoaguláns környezetet biztosítanak [109]. Az endotél sejtek aktívan részt vesznek a gyulladásos reakciók irányításában. Legfontosabb feladatuk a leukociták homing folyamatainak irányítása. A leukociták odavonzásáért kemokinek (pl. MCP-1, eotaxin-3, IL-8) felelősek. Továbbá különböző adhéziós molekulák expressziójával teszik lehetővé az adott érszakaszon a leukociták megtapadását és transzmigrációját [109]. Az endotélium az érszerveződés folyamatát is befolyásolja. Angiogenetikus faktorok (pl.: VEGF, vascular endothelial growth factor) hatására az endotél sejtek proteázokat és plazminogén aktivátorokat termelnek, melyek lebontják az endotélium alatt elhelyezkedő alaphártyát. A sejtek ekkor már szabadon képesek vándorolni, osztódni és az új ér lumenjét kialakítani. Ezt követően az új ér bazális membránja kialakul, majd az endotél sejtek növekedési faktorokat, mint PDGF-et termelnek, amelyek odavonzzák a támasztó funkciójú pericita sejteket és serkentik az érfalat alkotó simaizomsejtek proliferációját [110].
8. ábra. Endotél sejtek által termelt molekulák részvétele különböző fiziológiás folyamatokban
Az érelmeszesedés kialakulásában egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak az endotél diszfunkciónak, mivel az endotél sejtek fontos szerepet játszanak az erek homeosztázisának fenntartásában [111]. 1989-ben L.T. May és munkatársai mutatták be
32
elsőként a HUVEC sejtek IL-6 termelését [112]. Az IL-6 -174 G/C promóter polimorfizmust C[G/C]ATGC szekvencia veszi körül. M. Merika és kutatócsoportja EMSA kísérletek segítségével kimutatta, hogy a humán GATA-2 transzkripciós faktor közepes affinitással kötődhet CGATGC szekvenciához [113]. A humán GATA-2 transzkripciós faktor endotél sejtekben is szintetizálódik és fontos szerepet játszik pl. az endotelin-1 expressziójában [114].
33
3 Célkitűzések 1. Modellrendszer Több gént átfogó ősi haplotípusok és haplotípusvariánsok gyakorisága több kaukázusi populációban. A 6-os kromoszóma MHC régiója a humán genom egyik betegségasszociáció szempontjából legnehezebben vizsgálható szakasza, mivel a gének között rendkívül szoros kapcsoltság áll fenn. Az elmúlt években több, nagyobb tanulmány számolt be arról, hogy a humán MHC régió konzervált haplotípusai mellett haplotípusvariánsok is léteznek, amelyek csak rekombináció útján jöhettek létre [19]. Jelenleg kevés ismeret áll rendelkezésünkre arra vonatkozóan, hogy ezek a haplotípusvariánsok különböző populációkban milyen gyakorisággal fordulnak elő. Vizsgálatunk fő célja, hogy a 8.1 ősi haplotípus és haplotípusvariánsainak gyakoriságát határozzuk meg és hasonlítsuk össze két különböző kaukázusi populációban és egy családvizsgálatban. 2. Modellrendszer Egyetlen gén egypontos nukleotid polimorfizmusokból álló haplotípusainak kapcsolata episztatikus fehérjeszintézissel. Egy korábbi vizsgálatunkban egészséges finn férfiakban szoros összefüggést találtunk az IL-6 -174 egypontos nukleotid polimorfizmus és az anti-Hsp60 autoantitestek között. IL-6 -174 pozícióban CC genotípust hordozóknak szignifikánsan alacsonyabb autoantitest szintjük volt, mint a G allélt hordozóknak [115]. Jelenlegi tanulmányunkban az IL-6 -174 polimorfizmus és az anti-Hsp60 autoantitestek kapcsolatát egy független, egészséges magyar populációban vizsgáltuk meg. Az analízist az IL-6 gén kódoló és promóter régiójában elhelyezkedő több új polimorfizmussal bővítettük ki, és ezen haplotípusok kapcsolatát vizsgáltuk az autoantitest szintekkel. 3. Modellrendszer
Egyetlen, promóter régióban elhelyezkedő, egypontos nukleotid polimorfizmus hatásának vizsgálata in vitro körülmények között az adott gén fehérjeexpressziójára. Egypontos nukleotid polimorfizmusok és betegségek között jelentkező asszociációk esetén mindig felmerül az a kérdés, hogy a vizsgált genetikai variáció és az adott gén funkciója között fennáll-e közvetlen biológiai kapcsolat. Fontosnak tartottuk, hogy az általunk vizsgált IL-6 -174 G/C SNP funkcionalitását egy direkt biológiai modellrendszerben is megfigyeljük. Proinflammatorikus stimulációt követően humán köldökzsinór véna endotél sejtek (HUVEC) IL-6 termelését vizsgáltuk az IL-6 -174 G/C SNP genotípusának függvényében.
35
4 Anyagok és módszerek 4.1 Vizsgálatokban résztvevő személyek 4.1.1
Egészséges populációk
A 6. kromoszóma MHC régió 8.1 ősi haplotípusának vizsgálatához két egészséges kaukázusi csoportot választottunk. Az egyik csoport egy 127 budapesti lakosból (36 magyar férfi, 91 magyar nő) álló magyar populáció volt, amelynek résztvevői foglalkozás-egészségügyi szűrővizsgálaton estek át. Átlag életkor 44.1 (szórás: 10.25; tartomány: 20-73) volt. A másik kaukázusi csoportunk 101 egészséges ohioi nőből állt, amelyek DNS mintáit Prof. Dr. C. Yung Yu (The Ohio State University, Columbus, Ohio, USA) bocsátotta rendelkezésünkre. Mindkét csoportban meghatároztuk az RCCX modul kópiaszám polimorfizmusát, valamint a RAGE -429 T/C, TNFA -308 G/A és a HSP70-2 +1267 A/G egypontos nukleotid polimorfizmusok genotípusát. A 7. kromoszómán elhelyezkedő IL-6 haplotípus vizsgálatainkhoz 313 magyar egészséges budapesti lakost (196 magyar nő, 117 magyar férfi) vontunk be, akik szintén foglalkozás-egészségügyi szűrővizsgálaton vettek részt. A magyar populáció átlag életkora 43.3 (szórás: 11.2; tartomány: 22-79) év volt. 399 finn egészséges véradó mintáját (182 finn nő, 217 finn férfi) a Tamperei Finn Vöröskereszt Vértranszfúziós Központjától kaptuk, Prof. Dr. Mikko Hurme (Tampere University Hospital, Tampere, Finland) segítségével. A finn populáció átlag életkora 44.3 (szórás: 11.1; tartomány: 19-65) év volt. Budapesten egészséges, természetes úton világrajött 33 magyar újszülöttől köldökzsinór mintát gyűjtöttünk, amelyekből genomiális DNS-t és a köldökzsinór vénákból endotél sejteket szeparáltunk.
4.1.2
Családvizsgálat
Családvizsgálatunkba kilenc olyan magyar családot vontunk be, ahol legalább egy gyermek I. típusú cukorbetegségben szenvedett. Összességében 16 gyermek (8 fiú, 8 lány) és 18 szülő genotipizálását végeztük el. Az MHC-II régióban a HLA-DQ,-DR
gének allélvariánsait, míg az MHC-III régióban az RCCX modul kópiaszámát, valamint a HSP70-2 1267 A/G és a TNFA -308 G/A egypontos nukleotid polimorfizmusok genotípusát határoztuk meg. A 16 utód közül 8 gyermek volt egészséges és 8 gyermeknél jelentkezett az I. típusú cukorbetegség. A 9 család közül egy családban csak az egészséges gyermek DNS mintája állt rendelkezésünkre, a beteg gyermeké nem. Munkánkat a Semmelweis Egyetem, Egészségügyi Tudományos Tanács Regionális Tudományos Kutatásetikai Bizottsága engedélyezte.
4.2 Genomiális DNS szeparálási módszerek Molekuláris
genetikai
vizsgálataink
során
különböző
szövetekből
különböző
módszerekkel izoláltunk genomiális DNS-t. Egészséges finn populáció esetében a teljes genomiális DNS kinyerése Qiagen DNA Blood Mini kit (Qiagen GmbH, Germany, Hilden) segítségével Prof. Dr. Mikko Hurme laborjában történt. Egészséges ohioi nők perifériás vérmintáiból a genomiális DNS kinyerését Prof. Dr. C. Yung Yu laboratóriumában, Puregene DNA isolation kit (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) alkalmazásával végezték el. Egészséges magyar populáció esetében a teljes genomiális DNS-t Miller-féle kisózási módszerrel, perifériás vérből származó mononukleáris sejtekből a következő protokoll szerint nyertük ki. 500 μl EDTA-val (Merck & Co, Whitehouse Station, NJ, USA) vagy heparinnal alvadásgátolt vérhez 1 ml vörösvértest lízis puffert (0.32 M Sucrose, 1%-os Triton X-100, 5 mM MgCl2, 12 mM Tris-HCl) adtunk. A mintákat fél percig kevergettük, hogy a vörösvértestek szétessenek, majd maximális fordulatszámmal a mintákat lecentrifugáltuk. A fehérvérsejtek a cső alján pellet formájában, míg a szétesett vörösvértestek fragmentumai a felülúszóban találhatóak. A felülúszó leöntése után a fehérvérsejteket a még az oldatban maradt vörösvértestek fragmentumaitól kétszeri 1 ml desztillált vízzel történő mosással tisztítottuk meg. Ezután a fehérvérsejteket 0.75 mg/ml proteináz-K (Fermentas International Inc, Ontario, Canada) enzimet és 1% SDSt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tartalmazó proteináz-K pufferrel (0.075 M NaCl, 0.024 M EDTA, lizáltuk és emésztettük tovább rázó vízfürdőben 55 °C-on 30 percig. A proteináz-K puffer 1 %-os SDS tartalma azt a célt szolgálta, hogy erős
37
detergensként szétroncsolja a sejtmembránokat és denaturálja a fehérjéket. A keletkezett sejtlizátumban proteináz-K, fehérjebontó enzim segítségével a fehérjék egy részét le tudtuk bontani. Az alkalmazott viszonylag alacsony 1%-os SDS koncentrációra a proteináz-K még nem érzékeny, így hatékonyan tudja hidrolizálni az SDS által denaturált fehérjéket. Ezzel egyidőben nagyon fontos volt, hogy a feltárt sejtekből kiszabaduló DN-áz enzimek aktivitását gátolni tudjuk. Minden DN-áz Mg2+ ionokat igényel a működéséhez, ezért DNS tisztításkor a kétértékű kationokat megkötő EDTA általánosan alkalmazott gátlószer. Sejtlizálás és fehérjeemésztés után a mintákat szobahőmérsékletre lehűtöttük, majd 200μl telített NaCl oldat hozzáadással és intenzív kevergetéssel precipitáltuk a fehérjéket. Centrifugálás után a kicsapódott fehérjék a cső alján, míg a DNS molekulák a felülúszóban helyezkedtek el. A felülúszókat tiszta Eppendorf csövekbe pipettáztuk át és 500 μl izopropanol hozzáadásával 2 percig hagytuk, hogy a DNS precipitálódjon. Centrifugálás után a DNS csapadékot tovább tisztítottuk 70 %-os, majd 100 %-os alkohollal. Végezetül 50-100 μl desztillált vízben feloldottuk a DNS-t. Köldökzsinór mintáinkból módosított Miller-féle kisózási módszerrel nyertünk ki genomiális DNS-t. Az apró darabokra felvágott kb.100 mg köldökzsinór szövetet 3.5 mg/ml proteináz-K enzimmel emésztettünk 4 M-os urea oldatban (Sigma) egy teljes éjszakán át 65 °C-on. Következő napon a mintákat maximális fordulatszámon lecentrifugáztuk és a felülúszót izopropanolt tartalmazó, tiszta csövekbe helyeztük át. A DNS precipitátumot 70%-os alkohollal tisztítottuk tovább. Utolsó lépésként a genomiális DNS-t 100 μl desztillált vízben oldottuk fel. A különböző módszerekkel preparált DNS minták minőségéről spektrofotométer segítségével győződtünk meg. A DNS tisztaságát és koncentrációját 260 és 280 nm-en mért optikai denzitások leolvasásával határoztuk meg. Csak olyan DNS mintákkal dolgoztunk, ahol az OD260/OD280 arány 1.8 és 2.0 között volt.
38
4.3 Genotipizálási módszerek 4.3.1
HLA-DQ és DR allélek genotipizálása
Az inzulin-függő diabetes mellitus családvizsgálatunkban a családtagok HLA-DQ és DR alléljeinek genotípusát HLA-DRB1 és HLA-DQB1 kit (Olerup SSP AB, Saltsjöbaden, Sweden) segítségével, Dr. Rajczy Katalin laborjában határozták meg. 4.3.2
MHC III régió egypontos nukleotid polimorfizmusainak genotipizálása
Az összes polimeráz láncreakciót, amelyet az MHCIII régióban egypontos nukleotid polimorfizmusokra (single nucleotid polymorphism: SNP) terveztünk, az AB GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) PCR készülékben végeztük el. A TNFA -308 G/A (rs1800629), HSP70-2 +1267 A/G (rs1061581), RAGE -429 T/C (rs1800625) SNP-k kimutatására restrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism: PCR-RFLP) analízist használtunk (3. táblázat). Ez a módszer a restrikciós enzimek azon tulajdonságát használja ki, hogy ezek az enzimek a DNS molekulát specifikus, palindróm szekvenciák mellett hasítják fel. Egypontos nukleotid polimorfizmus könnyen detektálhatóvá válik, amikor pozíciója egybeesik egy restrikciós enzim hasítási helyével. Ekkor az egyik allél jelenlétében hasítási hely alakulhat ki vagy éppen ellenkezőleg, szűnhet meg. A hasítási termékeket hagyományos gélelektroforézis segítségével 1X TBE pufferben (0.09M Tris, 0.09M bórsav, 0.002M EDTA, pH=8.0) választottuk szét, amelyhez 1 μg/ml etidium-bromidot tartalmazó, megfelelő tömegszázalékú agaróz gélt használtunk fel. Végül a szétválasztott DNS-EtBr fragmentumokat UV-fénnyel megvilágítva, Syngene Chemigenious2 (Cambridge, UK) géldokumentációs eszközzel detektáltuk.
39
3. táblázat. TNFA -308 G/A, HSP70-2 +1267 A/G és RAGE -429 T/C SNP-k kimutatására szolgáló PCR-RFLP körülmények.. SNP
TNFA -308 G/A
HSP70-2 +1267 A/G
RAGE -429 T/C
Szekvencia specifikus
5’-ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3’
5`-CATCGACTTCTACACGTCCA-3`
5’-GGGGGCAGTTCTCTCCTC-3’
primerek
5’-AATAGGTTTTGAGGGCCATG-3’
5`-CAAAGTCCTTGAGTCCCAAC-3`
5’-TCAGAGCCCCCGATCCTATTT-3’
20 ng/μl DNS templát, 200 μM dNTP, 1.5
20 ng/μl DNS templát, 200 μM dNTP, 1.5
2-10 ng/μl DNS templát, 200 μM dNTP, 1
PCR elegy
μM primer, 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 10
μM primer, 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 10
μM primer, 2mM MgCl2, 20 mM Tris/HCl,
összetétele
mM Tris/HCl, 0.025 U/μl HotStart Taq
mM Tris/HCl, 0.02 U/ μl Taq DNS
50 mM KCl, 0.02 U/μl Taq DNS polimeráz
DNS polimeráz (Qiagen)
polimeráz (Fermentas)
(Promega Corp.,Madison, WI, USA)
I. denaturáció 94ºC-on 15 perc
I. denaturáció 95ºC-on 3 perc
I. 35 ciklus
II. 35 ciklus
II. 35 ciklus
1. denaturáció 94ºC-on 1 perc
Polimeráz
1. denaturáció 95ºC-on 10 mp
4. denaturáció 95ºC-on 20 mp
2. primer bekötődés 56 ºC-on 1 perc
láncreakció
2. primer bekötődés 57 ºC-on 30 mp
5. primer bekötődés 60 ºC-on 20 mp
3. lánchosszabbítás 72 ºC-on 2 perc
3. lánchosszabbítás 72 ºC-on 30 mp
6. lánchosszabbítás 72 ºC-on 20 mp
Restrikciós endonukleáz enzim Restrikciós fragmentumok
II. végső lánchosszabbítás 72 ºC-on 10 perc
III. végső lánchosszabbítás 72 ºC-on 5 perc
III. végső lánchosszabbítás 72 ºC-on 6 perc
NcoI (Fermentas) inkubáció 37 ºC-on
PstI (Fermentas) inkubáció
AluI (Fermentas) inkubáció 37 ºC-on 6 óra
hasító helye: 5’-C^CATGG-3’
hasító helye: 5’-CTGCA^G-3’
hasító helye: 5’-AG^CT-3’
G allél: 220 bp
A allél: 1117 bp
T allél: 350 bp
A allél: 202+18 bp
G allél: 936+181 bp
C allél: 200+150 bp
40
4.3.3
RCCX modulszám meghatározása Southern blot technikával
A TaqI restrikciós emésztéssel képesek voltunk meghatározni az összes C4 gén számát, azon belül is a hosszú, rövid C4 gének arányát (9. ábra).
9. ábra. RCCX modulok meghatározása Southern blot kép alapján.
Első lépésként 5 μg mennyiségű genomiális DNS-t emésztettünk TaqI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) restrikciós enzimmel 65 ºC-on, egy egész éjszakán át. A DNS fragmentumokat 0.8%-os agaróz gélen választottuk szét. Az egy éjszakán át tartó gélelektroforézis után a gélt 2 percig UV-illuminátoron hagytuk, hogy széttöredezzenek a DNS fragmentumok. Következő lépésben a DNS szálakat 1.5 M NaCl és 0.5 M NaOH oldattal denaturáltuk, majd 7.4 pH-n 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl oldattal neutralizáltuk. Az agaróz gélből mintáinkat vákuum blot készülék (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA) segítségével helyeztük át egy Hybond N+ nylon hibridizációs membránra (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK), amelyhez
41
20X-os SSC oldatot (3M NaCl és 0.3M Na-citrát) használtunk. Blottolás végén a DNS molekulákat a hibridizációs membránhoz UV-fénnyel keresztkötöttük, majd 42 ºC-os előmelegített 0.1 %-os SDS oldattal (150 mM NaCl, 50 mM Tris [pH=7.5], 5mM EDTA, 0.1% SDS) 30 percig mostuk a membránt. Ezután következett a membrán előhibridizálása lazac spermium DNS-sel. Az előzőleg felforralt lazac spermium DNS-t 200μg/ml végkoncentrációban, prehibridizációs folyadékban (10% dextrán-szulfát, 50% formamid, 0.5M NaCl, 1% SDS) adtuk hozzá a membránhoz, amelyet 16 órán keresztül, 42 ºC-on forgó hibridizációs kamrában inkubáltunk. A következő napon Prof. Dr. C. Yung Yu-tól kapott C4 génre specifikus DNS próbákat [α-32P]dCTP-vel jelöltünk és ezzel folytattuk a hibridizációt még 16 órán keresztül. A hibridizáció befejeztével a membránt 0.1%-os SDS-2X SSC, majd 65 ºC-on 0.5%-os SDS-0.1X SSC oldatokkal mostuk. Végül a β-emissziós radioaktív jeleket autoradiográfia előhívó technikát alkalmazva tettük láthatóvá.
4.3.4
IL-6 -174 G/C egypontos nukleotid polimorfizmus genotipizálása
Az IL-6 gén promóter régiójában elhelyezkedő -174 G/C egypontos nukleotid polimorfizmus detektálásához PCR-RFLP módszert alkalmaztunk. Primerként 5’TGACTTCAGCTTTACTCTTTG-3’
és
5’-CTGATTGGAAACCTTATTAAG-
3’oligonukleotidokat használtuk (rs1800795). A reakcióelegy összetétele a következő volt, 20 ng/μl DNS templát, 1μM primer, 10mM Tris/HCl, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 200 μM dNTP, 0.02 U/μl DyNazyme II DNS polimeráz (Finnzymes oy, Espoo, Finland). A polimeráz láncreakció során a mintákat először 6 ciklusban 9 percig 94°C-on, 1 percig 52°C-on és 3 percig 72°C-on, majd ezt követően 31 ciklusban 1 percig 95°C-on, 1 percig 52°C-on, 1 percig 72°C-on, végezetül 10 percig 72°C-on tartottuk. A PCR termékeket 37°C-on 5 egység (U=unit) NlaIII restrikciós enzimmel (New England Biolabs) 24 órán keresztül emésztettük. NlaIII restrikciós enzim 5’-CATG-3’ palindróm szekvenciát ismeri fel és a 3’ végen a G nukleotid mellett hasít. Az NlaIII restrikciós enzim IL-6 -174 C allél esetén hasítja a PCR terméket, minek során egy 119 és egy 49 bp hosszú fragment képződik, míg G allél esetén megmarad az eredeti 168 bp hosszúságú PCR termék. Inkubáció után a mintákat etídium-bromiddal festett 3 %-os agaróz gélelektroforézis segítségével
42
értékeltük
ki.
A
gél
képeket
Syngene
Chemigenious2
(Cambridge,
UK)
géldokumentációs eszközzel értékeltük ki. Prof. Dr. Mikko Hurme laborjában alkalmazott, fent ismertetett IL-6 -174 (G/C) SNP kimutatására tervezett PCR reakción laboratóriumunkban a következő egyszerűsítéseket végeztük el. Az új PCR program szerint 15 percig 95°C-on, ezt követően 30 ciklusban 30 mp-ig 95°C-on, 30 mp-ig 55°C-on, 30 mp-ig 72°C-on, legvégül 7 percig 72°C-on inkubáltuk a mintákat. A reakcióelegy a következő összetevőkből állt, 20 ng/μl DNS templát, 1μM primer, 10mM Tris/HCl, 2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 200 μM dNTP, 0.025 U/μl Taq DNS polimeráz (Fermentas). A PCR termékeket 5 egység Hin1II (Fermentas) restrikciós enzimmel 2 órán keresztül 37°C-on emésztettük.
4.3.5
IL-6 gén és promóter régióban SNP-k genotipizálása 5’ nukleáz TaqMan allélspecifikus PCR módszerrel
Az IL-6 promóter és gén régiójában az IL-6 -9316 T/C (rs1546762), -7164 C/A (rs1880243), -1363 G/T (rs2069827), -597 G/A (rs1800797), +1753 C/G (rs2069840), +2954 G/C (rs1548216) egypontos nukleotid polimorfizmusokat 5’ nukleáz (TaqMan) allélspecifikus PCR módszerrel határoztuk meg. A pontmutációkra specifikus primereket,
próbákat
ABI
Assay-by-Design
szolgálat
segítségével
terveztük
(http://www.appliedbiosystems.com) és a TaqMan PCR reakciókhoz szükséges összes komponenst az Applied Biosystems-től vásároltuk. A TaqMan allélspecifikus PCR mix az adott pontmutációt körülölelő két hagyományos PCR primeren kívül még a pontmutációra allélspecifikusan különböző fluoreszcens festékkel (VIC/FAM) jelölt hibridizációs próbákat is tartalmaz. A TaqMan próbák 5’ végén egy fluoreszcens riporter, míg 3’ végén egy nem fluoreszcens, kioltó (quencher) festék és egy kisárok kötő (MGB: minor groove binder) molekula található. A kisárok kötő molekula funkciója, hogy stabilizálja a duplaszálú próba szerkezetét, minek következtében a próba olvadáspontja (Tm) nő és pontosabb lesz az allél meghatározás. Az intakt, hibridizált próba nem ad jelet, azonban a PCR termék amplifikációja során a próba 5’ végével találkozó AmpliTaq Gold DNS polimeráz 5’ exonukleáz aktivitásának
43
köszönhetően bázisról bázisra lebontja a próbát. Ekkor a riporter a kioltó festéktől térben eltávolodik, és a fluoreszcens festék emissziója detektálhatóvá válik (10. ábra).
10. ábra. Specifikus próba kötődése és primerek extenziója TaqMan SNP genotipizáló assayben. Allél diszkrimináció allél specifikus próbákkal [116].
A reakcióelegy kb. 5-50 ng genomiális DNS mintát, 200 nM TaqMan próbát, 900 nM forward és reverse primer párt, 1x végkoncentrációban PCR „master mixet” (AmpliTaq Gold DNS polimerázt, AmpErase UNG enzimet, dNTP-t [dATP+dCTP+dGTP+dUTP] és a reakcióhoz szükséges puffert) tartalmaz. AmpErase uracil-N-glikoziláz enzim azt gátolja meg, hogy az előző PCR reakciókból származó, szennyező PCR termékekről újbóli amplifikátumok képződjenek. Az összes TaqMan PCR reakcióelegy dTTP helyett dUTP-t tartalmaz, minek következtében a képződő PCR termékek uracil tartalmú duplaszálú DNS molekulák lesznek. Az AmpErase UNG enzim feladata, hogy minden egyes PCR reakció előtt minden olyan duplaszálú DNS molekulát lebont, amely uracilt tartalmaz. Ezzel biztosítja, hogy a soron következő PCR reakcióban csak a genomiális DNS-ről fog amplifikátum képződni. A termociklus egy 2 percig tartó 50°C-os inkubációval kezdődik, amely arra szolgál, hogy az AmpErase UNG enzim aktiválódjon. Ezt a lépést egy 10 perces 95°C-os elődenaturálás követi, melynek során a DNS-polimeráz aktiválódik, a genomiális DNS pedig denaturálódik. A következő 40
44
PCR ciklus 2 szakaszból áll, 15 másodperces 95°C-os denaturálásból és egy perces 60 °C-os közös anneálás (primerek bekötődése), extenzió (lánchosszabbítás) lépésből.
4.4 Humán 60 kDa-os hősokkfehérje elleni antitestek titerének mérése A 60 kDa-os hősokkfehérje elleni IgG típusú autoantitestek szintjének meghatározására egy szilárd fázisú ELISA módszert fejlesztettünk ki. Az Enzy-Plate lemezeket (Propilen Kft., Pécs, Magyarország) bikarbonát pufferben (pH=9.6) 0.5 μg/ml koncentrációjú humán rekombináns Hsp60 antigénekkel (Lionex GmbH, Braunschweig, Germany) fedtünk 4°C-on, egy éjszakán át. Az első lépést követően az ELISA lemezeket mindig PBS-Tween20 (0.05%) oldattal (Sigma) mostuk, majd a különböző inkubációs lépéseket 1 órán keresztül, szobahőmérsékleten végeztük el. 0.05 %-os Tween20-t és 0.5%-os zselatint tartalmazó PBS oldattal (pH=7,2) történő blokkolás után a szérum mintákat 100-szoros hígításban adtuk a lemezhez. Az antiHsp60 IgG típusú autoantitestek kötődését torma-peroxidázzal jelzett γ-lánc specifikus nyúl anti-humán IgG-vel (Dako, Glostrup, Dánia) mutattuk ki, amelynek peroxidáz aktivitását 1 mg/ml-es o-feniléndiamin dihidrokloridot (OPD, Sigma,) és 1:1000 hígításban hidrogén-peroxidot tartalmazó citrát pufferben (pH=5.6) hívtuk elő. Az optikai denzitást (OD) ELISA leolvasóval (Metertech S960 ELISA Reader) 490 nm-en mértük meg, 600 nm referencia mellett. Az OD-értékeket ugyanazon lemez fedetlen részén
mért
OD-k
kivonásával
korrigáltuk,
az
egyes
szérumokat
AU/ml
mértékegységben adtuk meg, melyet anti-Hsp60 antitesteket magas koncentrációban tartalmazó humán szérum hígítási sorából készített standard görbe alapján számoltunk ki.
45
4.5 A humán köldökzsinór véna endotél sejtek IL-6 -174 promóter polimorfizmus szerinti IL-6 termelésének méréséhez szükséges módszerek
11. ábra. Különböző genotípusú HUVEC sejtek IL-6 fehérje termelésének méréséhez szükséges metodikai lépések.
4.5.1
Humán köldökzsinór vénából izolált endotél sejtek (HUVEC: human umbilical cord vein endothelial cells) tenyésztése
Komplikációmentes terhességekből származó 33 friss köldökzsinór mintát gyűjtöttünk Budapesten a helyi Etikai Bizottság engedélyével. Az endotél sejtek szeparálásáig a köldökzsinór darabokat steril fiziológiás sóoldatban 4°C-on tároltuk. Első lépésben a köldökzsinórt steril fiziológiás sóoldatban mostuk, 70%-os etanolban fertőtlenítettük, majd ismét fiziológiás sóoldattal öblítettük. A köldökzsinór vénát mindkét végen kanüláltuk, steril PBS oldattal (Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY) átmostuk. Ezt követően az eret 1 mg/ml kollagenáz (Gibco/Invitrogen) oldattal feltöltöttük és 37°C-on 20 percig inkubáltuk. A vénából a már endotél sejteket is tartalmazó kollagenáz oldatot komplett K2 médiummal (M199 (Gibco/Invitrogen) médium, 10%-os FCS (Sigma), penicillin-streptomycin (Sigma)) mostuk ki, majd kétszer 1200 rpm-n 8 percig centrifugáltuk. Az előzőleg 15 percig 0,5%-os zselatinnal (Sigma) fedett sejttenyésztő flaskában (Corning, NY, USA), a H2.1 médiumban tenyésztettük tovább a sejteket.
46
H2.1 sejttenyésztő médium M199 (Gibco/Invitrogen) médiumból állt, amelyet 10%-os fötális borjú szérummal (FCS: Sigma), penicillin-streptomycinnel (Sigma), 2 ng/ml humán rekombináns epidermális növekedési faktorral (EGF) (Biosource, Camarillo, CA), 250 pg/ml humán rekombináns β-endotélsejt növekedési faktorral (β-ECGF) (R&D Systems, Minneapolis, MN) valamint 7,5 U/ml heparinnal (Sigma) egészítettünk ki. Végül 500 ng/ml fibronektint (Sigma) adtunk a sejtkultúrához, hogy elősegítsük az endotél sejtek letapadását.
4.5.2
Endotél sejtek karakterizálása
Az endotél sejteket fenotípusos („kockakő“ mintázat) megjelenésük és von Willebrand faktor (vWf) pozitivitásuk alapján karakterizáltuk. Az intracelluláris és sejtfelszíni vWf immunhisztokémiai festése során a sejteket először -20 ºC-os 1:1 aceton-metanol oldatkeverékben 5 percig fixáltuk, majd ugyanennyi ideig ECP oldatban (fiziológiás sóoldat, 1% FCS, 10mM Tris-Cl (pH=7,4), 2mM CaCl2) rehidráltuk. Ezután következtek a 30 perces inkubációk először a primer nyúl antihumán vWf ellenanyaggal (1:2000 hígítás, SouthernBiotech, Birmingham, AL), majd az Alexa-568 fluoreszcens festékkel jelölt, szekunder kecske anti-nyúl IgG ellenanyaggal (1:1000, SouthernBiotech). Utolsó lépésként a fluoreszcens festékkel jelölt sejteket 1:1 Prolong Antifade : glicerin ECP eleggyel fedtük, amely a fluoreszcens festék detektálhatósági időtartamát növelte. Az endotél sejtek vWf expresszióját IX81 Olympus inverz mikroszkópban ellenőriztük. A sejtkultúrákat rendszeres megfigyelés alatt tartottuk és a sejttenyésztő flaskában addig tenyésztettük, amíg a sejtréteg konfluens nem lett. Ekkor a sejteket háromszoros alapterületű flaskába vagy 96 lyukú sejttenyésztő lemezre passzáltuk át. Passzálás során eltávolítottuk a sejtekről a sejttenyésztő (H2.1) médiumot, steril PBS oldattal átöblítettük a flaskát. Tripszin-EDTA (Gibco/Invitrogen) hozzáadásával megszüntettük a sejtek közötti, valamint a sejtek és a flaska közötti szoros tapadást, minek következtében a sejtek feljöttek a flaska aljáról. A reakciót tízszeres térfogatú K2 médiummal állítottuk le. Az endotél sejteket a sejttörmelékektől kétszeri 1200 rpm-en 8
47
percig tartó centrifugálással tisztítottuk meg, majd szélesztettük őket. Kísérleteinkben a 2. és 3. „passzázs“-ban lévő sejteket használtuk fel.
4.5.3
Adhéziós molekulák detektálása sejtes ELISA (cELISA) módszerrel
A HUVEC sejteket 10000 sejt/lyuk konfluens koncentrációban 96-lyukú sejttenyésztő lemezen H2.1 médiumban tenyésztettük. Egy nap elteltével a sejteket három párhuzamosban, 2.5 hígítási sorban LPS-sel (800 ng/ml – 84 pg/ml) és IL-1β-val (50 ng/ml – 5.3 pg/ml) kezeltük. 24 óra után a sejtek felülúszóját későbbi IL-6 citokin mérés céljából -70 ºC-ra lefagyasztottuk, míg a sejtek ICAM-1 expresszióját azonnal detektáltuk. A stimulált sejteket 10 percig metanol-aceton (1:1) eleggyel fixáltuk, majd a fixált sejteket ugyanennyi ideig ECP oldattal rehidráltuk. Rehidrálás után a sejteket 1 órán keresztül monoklonális egér anti-humán ICAM-1 ellenanyaggal (1:1000, Bender MedSystems GmbH, Bécs, Ausztria), majd ismét 1 órán keresztül torma-peroxidázzal jelölt kecske anti-egér IgG ellenanyaggal (1:2000, SouthernBiotech,) kezeltük. Az inkubációkat valamint az inkubációk közötti mosási lépéseket mindig ECP oldatban végeztük el. E sejtes ELISA lemezek detektálását is az anti-Hsp60 ELISA előhívó eljárásához hasonlóan (OPD oldatban) Chameleon Multilabel Platereader (Hidex, Turku, Finland) leolvasó segítségével végeztük el. 4.5.4
IL-6 termelés meghatározása HUVEC sejtek felülúszójából
Az LPS és IL-1β-val kezelt sejtek felülúszóját (amelyeket előzőleg sejtes ELISA segítségével ICAM-1 expresszióra teszteltünk) -70°C-on tároltuk felhasználásig. A HUVEC sejtek IL-6 termelését két párhuzamosban szendvics ELISA módszerrel, egy kereskedelmi ELISA kitet alapul véve (D6050, R&D Systems) határoztuk meg. Nátrium-bikarbonát pufferben (pH=9,6) 2 μg/ml-es koncentrációjú monoklonális antihumán IL-6 ellenanyaggal (MAB206, R&D Systems) 4°C-on egy éjszakán keresztül fedtünk egy 96-lyukú lemezt (Nunc MaxiSorp, eBioscience, San Diego, CA, USA). Az inkubációk között a lemezt TBS-Tween-nel mostuk. IL-1β-val kezelt sejtek felülúszóját 3-szoros hígításban, míg LPS-sel kezelt sejtek felülúszóját 4-szeres hígításban vittük fel a lemezre és 1 órán keresztül szobahőmérsékleten tartottuk. Mosást követően 200 ng/ml
48
koncentrációjú biotinilált poliklonális anti-humán IL-6 ellenanyaggal (BAF206, R&D Systems) 1 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk a lemezt. Végül 40 percig 1:1000 hígításban streptavidin-HRP-vel (Dako) jelöltük a lemezhez kötődött biotinilált ellenanyagokat, amelyet OPD oldattal hívtunk elő.
4.6 Statisztikai analízisek Populációs vizsgálataink esetében az adatokat STATISTICA szoftver (ver. 6.0, StatSoft Inc., Tulsa, Okla, USA) segítségével analizáltuk. Az anti-Hsp60 autoantitest szintek nem mutattak normál eloszlást (Kolmogorov-Smirnov teszt, p<0.01), ezért az ellenanyag szintek és genotípusok közötti asszociációt nemparaméteres tesztekkel (Mann-Whitney teszt, Kruskal-Wallis variancia analízis, Dunn’s post teszt) határoztuk meg. Minden egyes polimorfizmus esetében a Hardy-Weinberg eloszlás meglétét χ2próbával teszteltük. A különböző populációk allél-, genotípus- és haplotípusfrekvenciáit is χ2-próbával hasonlítottuk össze. Ha a p érték kisebb volt, mint 0.05, az eltérést
szignifikánsnak
(http://anthro.unige.ch/arlequin)
tekintettük.
Arlequin
2.000
szoftver
vagy
Haploview
3.2
szoftver
(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview) használatával határoztuk meg a páronkénti kapcsoltságokat és a haplotípusokat. Kapcsoltsági blokkok meghatározásakor Gabriel S.B. blokk definicióját vettük alapul, ahol a felső konfidencia intervallum határ 0.98, míg az alsó konfidencia intervallum 0.7 volt [3]. A különböző HUVEC sejtvonalak IL-6 termeléseinek összehasonlítását GraphPad Prism 4.02 (San Diego, USA) szoftver segítségével elemeztük és ábrázoltuk. Az összehasonlításhoz 2 paramétert használtunk, amelyeket dózisfüggő görbékre nemlineáris regresszió model alapján illesztett hiperbolákból számítottunk ki. Maximális IL6 termelést maximális stimulusnak neveztük el (Smax). Azokat az IL-1β és LPS koncentrációkat, amelyek a maximális IL-6 termelés felét váltják ki, fél maximális stimulusnak (MS50) jelöltük. Az MS50 érték megegyezik az egyoldalú hiperbola Kd (disszociációs konstans) értékével, amely sokkal megbízhatóbban jellemzi az IL-1β, LPS hatását a HUVEC sejtek IL-6 termelésére, mint az Smax. MS50 és Smax értékek normál eloszlást (Kolmogorov-Smirnov teszt, p>0.1) mutattak, ezért adatainkat a
49
csoportok számától és típusától függően párosítatlan vagy párosított t-teszttel, egy szempontos varianciaanalízissel vagy χ2-próbával hasonlítottuk össze. Ha a p érték kisebb volt, mint 0.05, az eltérést szignifikánsnak tekintettük. Kísérleteinkhez elegendő számú HUVEC sejtvonalak eléréséhez power analízist STATISTICA 7.0 szoftverrel végeztünk. Korábbi tanulmányok alapján, IL-6 koncentrációk esetében 10 ng/ml különbségek már biológiailag szignifikáns különbségeket jelentettek. Az első 10 mérést követően 0.05 α szint mellett 0.9 power eléréséhez 30 minta gyűjtését terveztük.
50
5 Eredmények 5.1 I. Modellrendszer 5.1.1
Az MHC régió valódi 8.1 ősi haplotípusának (AH 8.1) és fragmentumainak öröklődése kilenc I-es típusú diabetes mellitus kórképpel jellemzett családban. Az AH8.1 ősi haplotípus jellegzetes markereinek előfordulását (II-es osztályú HLA
gének (DQ, DR) alléljei, RCCX modulszám, HSP70-2 +1267 A/G, TNFA -308 G/A SNP,) kilenc magyar családban vizsgáltuk meg, ahol legalább egy utódnál I-es típusú diabetes mellitus betegség jelentkezett. A 4. táblázatban foglaltuk össze a kilenc családban előforduló 36 apai és anyai haplotípust. 4. táblázat. Az I-es típusú diabetes mellitus betegséggel jellemzett kilenc magyar családban szereplő szülők HLA II-es és III-as osztály régióját átölelő haplotípusai.
Kaukázusi 8.1 ősi MHC haplotípus és variánsai A B
C
D
Valódi 8.1 ősi haplotípus DQ2-DR17-S-G-A Variáns 8.1 ősi haplotípusok 2-4 jellegzetes markerrel DQ2-DR17-L-G-A DQ2-DR17-S-G-G DQ2-DR17-L-G-G DQ2-DR17-L-A-G DQ2-DR7-L-G-G DQ5-DR1-S-G-G Variáns 8.1 ősi haplotípusok 1 jellegzetes markerrel DQ5-DR1-L-G-G DQ8-DR4-L-G-G DQ7-DR13-L-G-G DQ6-DR13-L-A-A DQ5-DR10-L-A-A DQ9-DR7-S-A-G Haplotípusok 8.1 ősi haplotípus markerek nélkül DQ5-DR1-L-A-G DQ5-DR16-L-A-G DQ6-DR15-L-A-G DQ7-DR11-L-A-G DQ8-DR4-L-A-G
Előfordulási szám (gyakoriság) 7 (0.194) 1 (0.028) 1 (0.028) 1 (0.028) 1 (0.028) 2 (0.056) 1 (0.028) 2 (0.056) 2 (0.056) 1 (0.028) 1 (0.028) 1 (0.028) 1 (0.028) 4 (0.111) 2 (0.056) 1 (0.028) 4 (0.111) 3 (0.083)
A HLA II-es és III-as osztály génjeit átfogó régióban 18 különböző MHC haplotípust találtunk, ahol a leggyakoribb haplotípus a [DQ2 - DR17 - S - G - A] allélkombináció volt. Ez az allélkombináció egyben a 8.1 ősi haplotípus része, ahol a DQ2-DR17 HLA allélek mellett egy rövid mono-S RCCX modul, valamint HSP70-2 +1267 pozíciónál G allél és TNFA -308 pozíciónál A allél van jelen. A kilenc családban a valódi 8.1 ősi haplotípus mellett 7 szülőnél hat rekombináns változatot figyeltünk meg, ahol a valódi alkotóelemek közül 2-4 jellegzetes allél fordult elő. Továbbá 8 szülőben találtunk hat olyan haplotípust, ahol a 8.1 ősi haplotípus markerei közül csak egy volt jelen. 14 szülőnél figyeltünk meg 5 különböző 8.1 ősi haplotípustól teljesen eltérő MHC haplotípusokat. Ezek a haplotípusok DQ, DR allélek tekintetében különböztek egymástól, míg egyöntetűen nem volt mono-S RCCX moduljuk és HSP70-2 +1267 pozíciónál A allélt, TNFA -308 pozíciónál pedig G allélt hordoztak. A 12. ábrán követhetjük nyomon külön-külön az egyes családok MHC haplotípus öröklődését. Nyolc I-es típusú diabetes mellitus kórképpel jellemzett gyermek közül 1 gyermek mindkét kromoszómáján (12.ábra/8. család), 4 gyermek csak az egyik kromoszómáján hordozta az ősi 8.1 haplotípust (12.ábra/2.-5. család). Egy beteg gyermek hordozott az apai kromoszómáján 8.1 valódi haplotípust, míg az anyai kromoszómáján egy rekombináns változatot (DQ2-DR17-L-G-G) (12.ábra/6. család). Egy beteg utódra volt jellemző, hogy csak az egyik kromoszómáján viselt 8.1 rekombináns haplotípus változatot (DQ2-DR17-S-G-G) (12.ábra/9. család). Végül 1 beteg gyermek esetében figyeltük azt meg, hogy egyik kromoszómáján sem hordozta a valódi 8.1 ősi vagy rekombináns haplotípus változatot (DQ8-DR4-L-A-G / DQ8-DR4L-A-G) (12.ábra/7. család). Összességében elmondható, hogy két gyermek kivételével az összes diabeteses gyermek örökölt valódi 8.1 ősi haplotípust. Érdekes megemlíteni, hogy a vizsgált családokban a DQ2-DR17-S-G-A haplotípus mellett a DQ5-DR1-L-A/G-G haplotípus jelent meg a leggyakrabban (0.167). A HSP70-2 +1267 pozíciónál A allélt hordozó DQ5-DR1-L-A-G haplotípust 4 szülőben találtunk (12.ábra/3., 5.-6., és 9. család). Ez a haplotípus három alkalommal öröklődött tovább az utódokba, amelyek közül két gyermek szenvedett I-es típusú diabetes mellitus betegségben. A másik DQ5-DR1-L-G-G haplotípust 2 szülő hordozta (12. ábra/ 3. és 6.
52
család), amely haplotípus csak egy alkalommal öröklődött tovább és az utód egészséges maradt.
12. ábra. A HLA II-es és III-as régió génjeinek (DQ-DR-C4(S/L)-HSP70(+1267G/A)-TNFA (308A/G)) öröklődése 9 inzulin-függő cukorbetegséggel jellemzett családban.
5.1.2
Az MHC régió 8.1 ősi haplotípusára jellemző négy marker allélgyakorisága két különböző kaukázusi populációban
127 egészséges magyar személyben, valamint 101 egészséges ohioi nőben határoztuk meg a TNFA -308 G/A, HSP70-2 +1267 A/G és RAGE -429 T/C egypontos nukleotid polimorfizmusok
allélgyakoriságát.
Mono-S
RCCX
modul
jelenlétét
a
fenti
csoportokban 117 magyar és 80 ohioi személy esetében tudtuk megvizsgálni (5. táblázat). Valamennyi megfigyelt allélgyakoriság Hardy-Weinberg eloszlást mutatott. A két csoport allél frekvenciák tekintetében nagyon hasonlított egymásra. Mindkét populációban a HSP70-2 +1267G allél kétszer olyan gyakran fordult elő, mint a TNFA 308 A allél. A RAGE -429 C allél a magyar populációban 1.8-szer, az ohioi nők
53
esetében 2.4-szer gyakrabban jelent meg, mint a mono-S RCCX modul. Amikor a HSP70-2 +1267G allélt a mono-S RCCX modulhoz hasonlítottuk, a G allél előfordulása 3.5-4-szer volt gyakoribb. 5. táblázat. Két kaukázusi populációban a 8.1 ősi haplotípus markereinek allélgyakorisága.
Egészséges magyar személyek (n=127)
Egészséges ohioi nők (n=101)
HSP70-2 +1267 G
0.390
0.366
TNFA -308 A
0.185
0.188
Mono-S RCCX
0.089
0.106
RAGE -429C
0.175
0.182
Allélgyakoriság
5.1.3
Az MHC régió 8.1 ősi haplotípusának és fragmentumainak gyakorisága két kaukázusi populációban
A magyar populációban és az ohioi nőkből álló csoportban a [TNFA -308 G/A − HSP70-2 +1267 A/G − RCCX modul − RAGE -429 T/C] 8.1 ősi haplotípus markerekből álló összes előforduló haplotípust a 6. táblázatban foglaltuk össze. A haplotípusokat aszerint osztályoztuk, hogy az adott haplotípus az általunk vizsgált, 8.1 ősi haplotípusra jellemző markerek közül hányat hordozott. A két kaukázusi csoport a haplotípus eloszlásokat tekintve is hasonló volt. Mindkét csoportnál a résztvevők egy ötöde legalább az egyik kromoszómáján hordozta a valódi 8.1 ősi haplotípust [A-G-S-C] (0.179/0.180). Továbbá a résztvevők több mint felénél (0.527/0.585) találtunk variáns 8.1 ősi haplotípusokat, amelyek 1-3 jellegzetes markerrel rendelkeztek. A 8.1 ősi haplotípus markert nem hordozó, összes többi haplotípus is közel egyforma előfordulási gyakoriságokat (0.292/0.250) mutatott a két kaukázusi csoportban.
54
6. táblázat. A valódi és a variáns 8.1 ősi haplotípus hordozók eloszlása két kaukázusi populációban.
TNFA HSP70-2 C4 (A) (G) Mono-S A) Valódi 8.1 ősi haplotípus +
+
RAGE (C)
magyar populáció
ohioi nők
+
0.179
0.180
+
B) Variáns 8.1 ősi haplotípusok 2- 3 jellegzetes markerrel −
+
+
+
0.000
0.014
+
−
+
+
0.000
0.000
+
+
−
+
0.019
0.028
+
+
+
−
0.000
0.028
+
+
−
−
0.075
0.056
−
+
+
−
0.000
0.000
−
−
+
+
0.009
0.000
+
−
+
−
0.000
0.014
+
−
−
+
0.000
0.014
−
+
−
+
0.066
0.042
C) Variáns 8.1 ősi haplotípusok 1 jellegzetes markerrel +
−
−
−
0.047
0.028
−
+
−
−
0.283
0.278
−
−
+
−
0.000
0.000
−
−
−
+
0.028
0.083
0.292
0.250
D) Haplotípusok 8.1 ősi haplotípus markerek nélkül −
−
−
−
A 6. táblázat alapján kördiagramok (13. ábra) segítségével szemléltettük, hogy egy adott 8.1 ősi haplotípus markerre pozitív személyek hány százaléka hordozott egyidejűleg valódi 8.1 ősi haplotípust, hány százaléka hordozott variáns 8.1 ősi haplotípusokat, valamint hány százalékuk hordozta a vizsgált markert egyetlen 8.1 markerrel rendelkező haplotípusban. A diagramokból kitűnik, hogy az összes vizsgált marker közül a HSP70-2 +1267 G allél fordult elő a legnagyobb gyakorisággal (45-44%) egyetlen 8.1 markeres haplotípusban.
55
13. ábra. Egy adott 8.1 AH markert (TNFA -308 A, HSP70-2 +1267 G, RAGE -429 C, vagy C4 Mono-S) hordozók valódi, variáns és egy markeres 8.1 haplotípus eloszlásainak aránya.
56
5.1.4
A HSP70-2 +1267 G allél és a többi 8.1 ősi haplotípusra jellemző markerek és fragmentumok közötti kapcsoltságok erőssége
Arlequin 2.0 szoftver segítségével határoztuk meg a magyar és az ohioi csoportban a HSP70-2 +1267 G allél és a többi 8.1 marker, valamint a 8.1 ősi haplotípus fragmentumok közötti kapcsoltsági koefficiens D’ értékeket, esélyhányadosukat (odds ratio: OR) és 95%-os megbízhatósági tartományukat (konfidencia intervallum: CI) (7. táblázat). A HSP70-2 +1267 G allélt külön-külön vizsgálva az egyes 8.1 markerekkel, a D’ kapcsoltsági koefficiens értékek alacsonyak voltak. A magyar populációban a HSP70-2 +1267 G allél és TNFA -308 A allél közötti D’ érték esélyhányadosa (OR [95% CI]=2.32 [0.88-6.14]) nem volt szignifikáns. Az ohioi csoport esetében a HSP70-2 +1267 G allél és RAGE -429 C allél közötti D’ érték esélyhányadosa sem volt szignifikáns (OR [95% CI]=2.74 [0.94-7.98]). A továbbiakban a HSP70-2 +1267 G allél és a 8.1 ősi markereket tartalmazó fragmentumok között vizsgáltuk meg a kapcsoltságokat, ahol magas és szignifikáns D’ és esélyhányados értékeket kaptunk.
57
7. táblázat. A HSP70-2 +1267G allél és a 8.1 ősi haplotípus markerek, fragmentumok közötti kapcsoltságok erőssége két különböző kaukázusi populációban.
magyar populáció (n=125) HSP70-2 +1267 (G)
ohioi nők (n=101)
8.1 ősi markerek és fragmentumok
D’-érték (p)
OR (95% CI) (p)
D’-érték (p)
OR (95% CI) (p)
TNFA (A)
0.674 (<0.0001)
2.32 (0.119)
(0.88-6.14)
0.668 (<0.0001)
4.86 (1.61-14.67) (0.0048)
C4 Mono-S (S)
1.000 (<0.0001)
3.90 (0.023)
(1.34-11.4)
0.910 (<0.0001)
6.87 (1.84-25.69) (0.0049)
RAGE (C)
0.822 (0.0011)
5.43 (0.0008)
(1.99-14.8)
0.515 (<0.0001)
2.74 (0.087)
TNFA (A) − RAGE (C)
1.000 (<0.0001)
5.87 (2.09-16.49) 0.928 (<0.0001) (0.0011)
6.95 (2.21-21.88) (0.0012)
TNFA (A) − C4 Mono-S (S)
0.919 (<0.0001)
4.28 (1.45-11.62) 0.668 (<0.0001) (0.0103)
4.86 (1.611-14.67) (0.0048)
RAGE (C) − C4 Mono-S (S)
1.000 (<0.0001)
4.11 (1.39-12.14) 1.000 (<0.0001) (0.0218)
10.60 (2.63-42.67) (0.0011)
TNFA (A) − C4 Mono-S (S) − RAGE 1.000 (<0.0001) (C)
4.55 (1.52-13.60) 1.000 (<0.0001) (0.0084)
12.60 (3.03-52.37) (0.0006)
(0.94-7.98)
5.2 II. Modellrendszer
5.2.1
Hsp60 elleni autoantitest szintek összefüggése az IL-6 -174 G/C promóter polimorfizmussal
Korábbi vizsgálatainkban, egészséges finn férfiak esetében erős összefüggést találtunk az IL-6 -174 promóter polimorfizmus és az anti-Hsp60 autoantitest szintek között [115]. Jelenlegi tanulmányunkban korábbi megfigyeléseinket egy új független magyar populációban szerettük volna megismételni, valamint az IL-6 gén és promóter régiójában újabb polimorfizmusokat találni, amelyek az anti-Hsp60 ellenanyag szintekkel asszociációt mutatnak és haplotípusban vannak az IL-6 -174 G/C polimorfizmussal. Először összehasonlítottuk a finn és magyar populáció genotípus és allél frekvenciáit. Az egészséges finn véradóknál a C allél gyakorisága 0.550 (nőknél 0.514, férfiaknál 0.581), míg a magyar populációban a C allél gyakorisága 0.433 (nőknél 0.423, férfiaknál 0.449) volt. Mind a genotípus (p<0.0001), mind az allél (p<0.0012) gyakoriságokat illetően a populációk között szignifikáns különbségeket találtunk. Ezek a különbségek szignifikánsak maradtak, ha a genotípus gyakoriságokat külön vizsgáltuk nőkben (p=0.016) illetve férfiakban (p=0.0012). Allélgyakoriságok közötti különbségek a két populációban nőknél (p=0.0639), és férfiaknál (p=0.0438) a szignifikancia határán voltak. A következő analízisünkben az IL-6 -174 polimorfizmus genotípusai szerint az antiHsp60 autoantitest szinteket csoportokra osztottuk. Az anti-Hsp60 autoantitest szintek nem-normál eloszlást mutattak, ezért a genotípusok és autoantitest szintek közötti összefüggések
megállapításához
nem-paraméteres
teszteket
(Kruskal-Wallis
varianciaanalízis, Mann-Whitney U teszt) használtunk. (8. táblázat) Az IL-6 –174 promóter polimorfizmus összefüggött a Hsp60 elleni antitest szintekkel. Homozigóta C allélt hordozó személyeknél mértük a legalacsonyabb Hsp60 elleni autoantitest szinteket [31.70 (19.88-50.04) AU/ml], míg a GC genotípusú [46.15 (29.7277.13) AU/ml] és GG genotípusú [40.80 (23.14-76.20) AU/ml] személyek egyöntetűen
magasabb ellenanyag szintekkel rendelkeztek (varianciaanalízis p=0.0076). A csoportok közötti összehasonlítást szolgáló Dunn’s post teszt szignifikáns különbséget mutatott GC és CC genotípusú személyek között. 8. táblázat. Az IL-6 -174 G/C polimorfizmus és az anti-Hsp60 IgG autoantitest szintek közötti kapcsolat magyar populációban.
Magyar egészséges populáció, n=313 Genotípus
anti-Hsp60 medián (IQ range)
IL-6 -174 GG
40.80 (23.14-76.20)
IL-6 -174 GC
46.15 (29.72-77.13)
IL-6 -174 CC
31.70 (19.88-50.04)
IL-6 -174 G allél 44.14 (27.62-76.86) hordozók
5.2.2
Kruskal-Wallis teszt / Mann-Whitney U teszt,
p érték
Dunn’s post-teszt, p érték GG vs GC > 0.05
0.0076
GG vs CC > 0.05 GC vs CC < 0.01
0.0052
Haplotípus blokkok keresése az IL-6 gén és promóter régiójában
Az IL-6 gén és promóter régió haplotípus blokkjainak pontos meghatározása céljából, 12 kb hosszú szakaszt érintő 7 SNP-t (IL-6 -9316, -7164, -1363, -597, -174, +1753, +2954) vontunk be a vizsgálatba. A fenti 7 polimorfizmus közötti kapcsoltságot (linkage disequilibrium) a jól ismert D’ értékek megadásával határoztuk meg, amelyet Haploview 3.2 szoftver segítségével számoltunk ki. Haploview 3.2 szoftver a haplotípus blokkokat a D’ értékek konfidencia határai alapján határozta meg. Két polimorfizmus között szoros kapcsoltság áll fenn és egy blokkban találhatóak, ha a D’ érték felső 95%-os konfidencia határa > 0.98, míg az alsó konfidencia határa > 0.7. Rekombináció áll fenn, ha a D’ érték felső konfidencia határa < 0.9. A 7 egypontos nukleotid polimorfizmust 113 magyar egészséges személyben detektáltuk. Ebben a 12 kb hosszú, 7 SNP-ből álló szakaszban két 2000 bp hosszú haplotípus blokkot találtunk. Az első blokk IL-6 -9316 és -7164 polimorfizmus között helyezkedett el, míg a második blokk IL-6 -597, -174 és +1753 régiót ölelte át (14. ábra).
60
14. ábra. 113 egészséges magyar személy genotípusai alapján, az IL-6 gén promóter és kódoló régiójában (7 SNP-t vizsgálva) két haplotípus blokk jelent meg.
Következő vizsgálatunkban a teljes magyar populációban, már 313 mintaszámmal dolgoztunk. Ekkor az IL-6 gén és promóter régiójában 5 egypontos nukleotid polimorfizmus (IL-6 -9316, -1363, -174, +1753, +2954) között vizsgáltuk a kapcsoltságot. A legszorosabb kapcsoltságot és egyben haplotípus blokkot IL-6 -174 és +1753 SNP-k között tudtunk kimutatni[D’=0,98]. Az allélek közötti távolság növekedésével a kapcsoltság mértéke fokozatosan csökkent (15. ábra).
15. ábra. 313 egészséges magyar személy genotípusai alapján, az IL-6 gén promóter és kódoló régiójában (5 SNP-t vizsgálva) egy haplotípus blokk jelent meg.
61
A teljes magyar populáció (n=313) haplotípus vizsgálatánál genotipizált (az IL-6 -174 polimorfizmuson kívüli) négy SNP (IL-6 -9316, -1363, +1753, +2954) és az anti-Hsp60 autoantitest szintek közötti kapcsolatot először külön-külön vizsgáltuk meg.
5.2.3
Az IL-6 -9316 T/C, -1363 G/T, +1753 C/G, +2954 G/C polimorfizmusok nem függtek össze a Hsp60 elleni immunválasz mértékével
Az IL-6 -174 G/C polimorfizmuson kívül az IL-6 promóter régiójában két egypontos nukleotid polimorfizmust (IL-6 -9316 T/C, IL-6 -1363 G/T) valamint az IL-6 gén régiójában még két SNP-t (IL-6 +1753 C/G, IL-6 +2954 G/C) vizsgáltunk meg ugyanabban a magyar egészséges populációban. Mind a négy SNP genotípus eloszlása Hardy-Weinberg egyensúlyt mutatott, miszerint az allélfrekvenciák a következők voltak: T-9316C (0.508/0.492), G-1363T (0.901/0.099), C+1753G (0.701/0.299) és G+2954C (0.982/0.018). Egyenként vizsgálva a polimorfizmusokat egyik esetben sem találtunk összefüggést a Hsp60 elleni autoantitest szintekkel. A különböző genotípusú személyekben mérhető Hsp60 elleni antitest szinteket, továbbá az egyes csoportok összehasonlítását a 9. táblázat mutatja be.
62
9. táblázat. Az IL-6 polimorfizmusok és az anti-Hsp60 IgG ellenanyag szintek közötti kapcsolat egészséges magyar populációban.
Egészséges magyar populáció (n=313) IL-6 (-9316) genotípus
Anti-Hsp60 ellenanyag medián (IQ tartomány)
IL-6 (-1363) genotípus
Anti-Hsp60 ellenanyag medián (IQ tartomány)
IL-6 (+1753) genotípus
Anti-Hsp60 ellenanyag medián (IQ tartomány)
IL-6 (+2954) genotípus
Anti-Hsp60 ellenanyag medián (IQ tartomány)
TT
41.9 (27.63-82.1)
GG
42.97 (27.32-74.17)
CC
41.42 (24.37-61.02)
GG
41.87 (26.14-71.04)
TC
44.15 (25.07-75.80)
GT
33.04 (19.97-64.28)
CG
44.98 (28.70-87.60)
GC
49.06 (23.91-110.0)
CC
36.93 (25.42-55.22)
TT
42.49 (16.32193.66)
GG
44.40 (29.61112.94)
CC
-
Kruskal-W. teszt / MannW. U teszt
0.3060
p érték
0.2949
0.1247
0.5955
5.2.4
Haplotípusok összefüggése az anti-Hsp60 autoantitest szintekkel
Az eddig egyenként analizált, IL-6 gén és promóter régióban elhelyezkedő öt különböző SNP kapcsolatát az anti-Hsp60 autoantitestekkel, most egyszerre adott haplotípusokban vizsgáltuk. Populációnkban megbecsültük az 5 SNP-ből álló összes haplotípus kombinációt is. Nyolc különböző haplotípus variációt találtunk, amely közül a leggyakoribb a -9316C/1363G/-174C/+1753C/+2954G (CGCCG, gyakoriság: 0.314) haplotípus volt (10. táblázat). Egy adott haplotípust homozigótaként hordozók autoantitest szintjeit hasonlítottuk össze a populáció összes többi tagjának autoantitest szintjével, akik az adott haplotípust nem vagy csak egy kópiában hordozták (11. táblázat). A leggyakrabban előforduló haplotípust homozigótaként (CGCCG/CGCCG) hordozó személyek esetében mértünk szignifikánsan alacsonyabb ellenanyag szinteket a populáció összes többi tagjához viszonyítva (Mann-Whitney teszt p=0.026). A CGCCG haplotípust homozigótaként hordozó személyeknek 55%-kal nagyobb volt az esélyük, hogy alacsony (a teljes populáció 33%-os percentilisénél kisebb) anti-Hsp60 autoantitest szintjük legyen, összehasonlítva a más haplotípus kombinációkat hordozó személyekkel [odds ratio 0.45(95% CI 0.22-0.93), p=0.0363, korra és nemre adjusztálva]. Ha az IL-6 -174 SNP hatását külön analizáltuk logisztikus regresszióval, azt kaptuk, hogy a G allélt nem hordozóknak 56 %-kal nagyobb az esélyük, hogy alacsony autoantitest szintjük legyen [odds ratio 0.44(95% CI 0.25-0.78) p=0.00822, korra és nemre adjusztálva]. Fontos megjegyezni, hogy az alacsony autoantitestekkel asszociált CGCCG haplotípus -174 pozíciónál C allélt hordoz, míg a többi gyakori haplotípusok, amelyek G allélt hordoztak -174 pozícióban, magas autoantitest szintekkel rendelkeztek.
10. táblázat. Az IL-6 haplotípus gyakoriságok egészséges magyar populációban. A négy leggyakoribb haplotípust homozigótaként hordozó személyek anti-Hsp60 autoantitest szintjei.
Várható gyakoriságok -9316C/-1363G/-174C/+1753C/+2954G (CGCCG) -9316T/-1363G/-174G/+1753G/+2954G (TGGGG) -9316T/-1363G/-174G/+1753C/+2954G (TGGCG) -9316C/-1363T/-174C/+1753C/+2954G (CTCCG) -9316C/-1363G/-174G/+1753C/+2954G (CGGCG) -9316T/-1363G/-174C/+1753C/+2954G (TGCCG) -9316C/-1363G/-174G/+1753G/+2954G (CGGGG) -9316T/-1363G/-174G/+1753C/+2954C (TGGCC)
Megfigyelt homozigóta hordozók adott haplotípusra
Megfigyelt nem-homozigóta hordozók adott haplotípusra
Előfordulá si szám
Anti-Hsp60 Anti-Hsp60 Előfordulási ellenanyag, medián ellenanyag, medián szám (IQ tartomámy) (IQ tartomány)
0.314
35
29.68 (18.91-46.79)
278
42.55 (27.31-74.17)
0.277
24
48.05 (34.27-97.52)
289
41.85 (25.35-69.61)
0.191
12
43.05 (31.92-68.59)
301
41.93 (25.64-71.04)
0.094
3
42.49
310
41.91 (26.14-71.04)
0.062
0
0.023
0
0.021
0
0.018
0
5.3 III. Modellrendszer 5.3.1
IL-6 -174 G/C promóter polimorfizmus gyakorisága magyar újszülöttek körében
HUVEC sejtek tenyésztése céljából gyűjtött 33 egészséges magyar újszülött köldökzsinór mintáját IL-6 -174 G/C promóter polimorfizmusra genotipizáltuk, amelyek genotípus eloszlása Hardy-Weinberg egyensúlyt mutatott (p=0.587). A genotípus gyakoriságok IL-6 -174 pozíciónál a következők voltak: GG 36%, GC 52%, CC 12%. A C allél gyakorisága (37.9%) az előző egészséges magyar populáció vizsgálatunkhoz statisztikailag hasonló volt (χ2 teszt p=0.6473). 5.3.2
HUVEC sejttenyészet endotél sejt tartamának ellenőrzése
A köldökzsinór vénából kinyert sejtek valódi endotél sejt fenotípusát kétféleképpen teszteltük. Először morfológiailag, fénymikroszkópban ellenőriztük a nyugvó endotél sejtek „kockakő” alakját, majd második lépésben az endotél sejtek egyik legmegbízhatóbb markerét, a von Willebrand faktor (vWf) jelenlétét vizsgáltuk. A vWf főként a keringési rendszer vénás ereinek endotél sejtjein expresszálódik [117]. Sejttenyészetünk 100 %-os endotél sejt tartalmát a vWf immunhisztokémiai festésével igazoltuk (16. ábra).
16. ábra. HUVEC sejtek sejtfelszíni és intracelluláris vWF immunhisztokémiai festése (Hoechst magfestés, Alexa568 vWF festés)
5.3.3
HUVEC sejtek ICAM-1 expressziója
Az ICAM-1 adhéziós molekula az endotél sejtek egy jól ismert aktivációs markere. Kísérletsorozatainkban detektálásuk fontos minőségbiztosítási pontot jelentett. Az ICAM-1 expresszió mérése tette számunkra lehetővé, hogy megbizonyosodjunk, az endotél sejtek megfelelően válaszoltak a kísérletekben használt proinflammatorikus molekulákra. Csak azoknál a sejtvonalaknál folytattuk tovább a felülúszók IL-6 koncentrációjának mérését, ahol a sejtek dózisfüggő módon aktiválódtak (17.ábra). A fenti követelmények miatt LPS kezeléseknél kettőt, míg IL-1β kezeléseknél három sejtvonalat kellett kizárni.
17. ábra. HUVEC sejtek ICAM-1 expressziója IL-1β és LPS stimulusokat követő 24 órával. Ez az ábra egy reprezentatív mintát mutat be a 33 köldökzsinór minta közül..
5.3.4
HUVEC sejtek IL-6 termelése
HUVEC sejtek IL-6 termelésének pontos meghatározása érdekében a sejteket LPS (800 ng/ml - 84 pg/ml) és IL-1β (50 ng/ml - 5.3 pg/ml) hígítási soraival kezeltük. Kezelést követő egy nap után mértük meg a jól ismert aktivációs marker, az ICAM-1 adhéziós molekula expresszióját, míg ezzel egyidejűleg a felülúszókat az IL-6 citokin méréshez 70 ºC-ra fagyasztottuk le. A felülúszók IL-6 citokin mérését egy hónapon belül végeztük el. Valamennyi sejtvonalban egyöntetűen azt figyeltük meg, hogy az IL-1β (Smax=21703±9553 pg/ml) stimuláció hatására az endotél sejtek szignifikánsan
67
magasabb maximális IL-6 termeléssel válaszolnak, mint LPS kezelés hatására (Smax =4512±1840 pg/ml) (p < 0.0001) (18. ábra).
18. ábra. HUVEC sejtek IL-6 termelése különböző koncentrációjú IL-1β és LPS stimulusokat követően. Ez az ábra egy reprezentatív mintát mutat be a 33 köldökzsinór minta közül.
5.3.5
HUVEC sejtek IL-6 termelésének összehasonlítása az IL-6 -174 G/C promóter polimorfizmus genotípusai szerint
Először az IL-6 -174 C allélt hordozó és nem-hordozó HUVEC sejtvonalak között hasonlítottuk össze az IL-1β és LPS indukálta IL-6 termelést. IL-1β stimulációt követően, a maximális IL-6 válasz felénél (MS50) kapott IL-1β koncentrációk nem különböztek a C allélt hordozók (1415±1227 pg/ml IL-1β) és nem-hordozók (1547±1548 pg/ml IL-1β) között (p=0.800) (19./a ábra). LPS kezelést követően is hasonló eredményeket kaptunk a maximális IL-6 válasz felénél (MS50), a C allélt hordozók (12.19±6.57 ng/ml LPS) és nem-hordozók (11.46±6.54 ng/ml LPS) között az LPS koncentrációk nem különböztek (p=0.770) (19./b ábra).
19. ábra. Az IL-6 -174 C allélt hordozó és nem-hordozó HUVEC sejtek maximális IL-6 válasz felénél (MS50) kapott IL-1β és LPS koncentrációk összehasonlítása.
68
Továbbiakban mintáinkat IL-6 -174 pozíciónál előforduló három genotípus csoportra (GG,GC,CC) osztottuk és vizsgáltuk, hogy van-e különbség a csoportok között az IL-6 termelés tekintetében (11. táblázat). 11. táblázat. HUVEC sejtek IL-6 termelésének összehasonlítása IL-6 -174 pozíciónál található (GG, GC, CC) három különböző genotípus szerint. (Az értékek átlagát és szórását tüntettük fel)
IL-1β stimuláció IL-6 -174 G/C SNP IL-1β koncentráció a maximális IL-6 válasz felénél (MS50) [pg/ml IL-1β] Maximális IL-6 válasz (Smax) [pg/ml IL-6]
GG genotípus hordozók (n=12) 1547 ± 1548
21,721 9727
GC genotípus hordozók (n=14)
CC genotípus hordozók (n=4)
Egyváltozós varianciaanalízi s (ANOVA)
1525 ± 1314
1030 ± 898.5
0.793
± 21,386 10,246
± 23,667 5024
±
0.915
LPS stimuláció
IL-6 -174 G/C SNP
GG genotípus hordozók (n=11)
LPS koncentráció a maximális IL-6 válasz felénél (MS50) [ng/ml LPS] Maximális IL-6 válasz (Smax) [pg/ml IL-6]
GC genotípus hordozók (n=17)
CC genotípus Egyváltozós hordozók varianciaanalízis (n=3) (ANOVA)
11.46 ± 6.54
12.37 ± 6.71
11.18 ± 6.99
0.921
4572 ± 1997
4217 ± 1851
5494 ± 2137
0.563
GG genotípus csoportnál 1547±1548 pg/ml, GC genotípus csoportnál 1525±1314 pg/ml és CC genotípus csoportnál 1030±898.5 pg/ml IL-1β kezelés idézte elő a fél maximális IL-6 termelődést. A csoportok között szignifikáns különbséget nem találtunk (p=0.7930, egyszempontos ANOVA). LPS kezelések hatására sem tudtunk kimutatni különbséget a genotípus csoportok között. GG genotípusnál 11.46±6.54 ng/ml, GC genotípusnál 12.37±6.71 ng/ml és CC genotípusnál 11.18±6.99 ng/ml LPS kezelés okozta a fél maximális IL-6 választ
69
(p=0.9205, egyszempontos ANOVA). A maximális IL-6 válaszokat (Smax) is összehasonlítottuk a GG, GC és CC genotípusok között. Hasonlóan az MS50 eredményekhez nem találtunk genotípusfüggő különbségeket az IL-6 termelés tekintetében (11. táblázat).
70
6 Eredmények megbeszélése Vizsgálataink fő célja az volt, hogy különböző modellrendszerek segítségével a haplotípus vizsgálatok gyakorlati alkalmazásainak nehézségeit több szemszögből is bemutassuk. Első tanulmányunkban egy hosszú kromoszóma szakaszt vizsgáltunk, ahol a gének közötti szoros kapcsoltság miatt a haplotípus blokkokon belüli LD töréspontok azonosítása
került
előtérbe.
Ezt
a
problémát
ősi
haplotípusvariánsok
eloszlásvizsgálatával közelítettük meg. Következő tanulmányunkban a humán genom egy rövidebb szakaszát néztük, ahol egyetlen gén promóter és kódoló régiójában előforduló haplotípus blokkok megjelenését vizsgáltuk. E szakaszban előforduló haplotípusokat és a haplotípusokat felépítő SNP-ket külön-külön is analizáltuk episztatikus fehérjeszintézis függvényében, majd a haplotípus blokkokból egy SNP-t kiválasztva in vitro körülmények között vizsgáltuk az SNP funkcionális szerepét. Haplotípus vizsgálatok szempontjából a 6. kromoszóma rövid karján található fő hisztokompatibilitási génkomplex egy különleges régiónak számít. Az MHC régión belül a gének között olyan szoros kapcsoltság áll fenn, amely betegségasszociációs vizsgálatokban rendkívül megnehezíti a kandidáns gén-gének kiválasztását. Az MHC régió legtöbb autoimmun betegséggel kapcsolatba hozott haplotípusa a 8.1 ősi haplotípus, amelynek szerepét kutatócsoportunk is számos tanulmányban vizsgálta. Egy 2004-es tanulmányban azt találtuk, hogy csak a teljes 8.1 AH-t hordozó nők voltak kitéve annak a veszélynek, hogy rendszeres dohányosokká váljanak. A 8.1 ősi haplotípus marker allélek külön-külön csak kisebb asszociációt mutattak a dohányzási szokásokkal [118]. Továbbá a teljes 8.1 ősi haplotípust hordozók körében a colorectalis carcinoma betegség megjelenésére is nagyobb volt az esély [119]. Más vizsgálataink azonban arra mutattak rá, hogy nemcsak a teljes 8.1 ősi haplotípust, hanem a haplotípus rekombináns változatait is érdemes figyelemmel kísérni a különböző asszociációs vizsgálatokban. Pl. egy inzulin-függő diabetes mellitus klinikai vizsgálatban a magas hemoglobinA1C koncentráció a 8.1 ősi haplotípus csak egy fragmentumával, a RAGE 429C és a HLA-DQ2 közötti szakasszal mutatott szoros összefüggést, míg a teljes ősi haplotípussal nem [120]. Abban az esetben, amikor a 8.1 ősi haplotípus alléljei közül csak egy marker mutat asszociációt az adott betegséggel, akkor ez egyértelműen kizárja
a 8.1 ősi haplotípus szerepét. Ezt tapasztaltuk a TNFA -308 A allél esetében is, amikor a 8.1 ősi markerek közül csak a TNFA -308A allélt hordozóknak volt kisebb esélye a lacunaris stroke kialakulására [121]. Sokféle MHC haplotípus létezik, amelyek nem kiterjesztett ősi haplotípusok, de rekombináció útján hosszabb-rövidebb ősi haplotípus elemeket,
fragmentumokat
tartalmaznak.
A
fenti
asszociációs
vizsgálatok
eredményeiből kiindulva azt feltételeztük, hogy különböző populációk 8.1 ősi haplotípus és haplotípusvariánsainak eloszlásvizsgálatából hasznos információkat kaphatunk. Jelen tanulmányban két egészséges kaukázusi populációban és egy családvizsgálatban határoztuk meg a teljes 8.1 ősi haplotípust hordozók, illetve a 8.1 ősi haplotípusnak csak fragmentumait hordozók százalékos előfordulását. A 8.1 ősi haplotípus jelenlétét az MHC II és MHC III régióban kódolódó gének jellegzetes alléljeinek együttes jelenléte alapján határoztuk meg. Ezek az MHC II régióban a HLA-DQ2 és HLA-DR3(17) allélek, míg az MHC III régióban a monomoduláris rövid C4B allél, a HSP70-2 +1267G allél és a TNFA -308 A allél volt. Az
irodalmi
adatokkal
megegyezően
a
két
kaukázusi
populációban
és
a
családvizsgálatban is 18 %-os gyakorisággal jelentek meg a 8.1 ősi haplotípust hordozók [122,123]. A 8.1 AH-t alkotó markerek allélgyakoriságait külön-külön vizsgálva jelentős eltéréseket tapasztaltunk. A kaukázusi populációkban a HSP70-2 +1267 G allél kétszer gyakrabban fordult elő, mint a TNFA -308 A allél és négyszer gyakrabban, mint a C4 monoS allél. Amikor egy adott marker allél mellett a 8.1 ősi haplotípus vagy haplotípus fragmentumok egyidejű jelenlétét vizsgáltuk, jelentős különbségeket kaptunk. Az összes HSP70-2 +1267 G allélt hordozók kevesebb, mint egyharmada hordozta egyidejűleg a teljes 8.1 AH-t, míg a G allélt hordozók majdnem fele egyedüli 8.1 AH markerként jelent meg. Ezzel ellentétben a C4 mono-S genotípust hordozók egyedüli 8.1 AH markerként nem fordultak elő, míg a C4 mono-S genotípust hordozók 76-96%-ánál jelent meg egyszerre az összes általunk vizsgált 8.1 ősi haplotípus marker. További két vizsgált 8.1 AH marker esetében (TNFA -308 A allélt vagy RAGE -429 C allélt hordozók) a hordozók 50 %-ánál fordult elő a teljes 8.1 ősi haplotípus, míg a hordozók 10 és 20%-a ezeket az alléleket csak egyedüli 8.1 markerként hordozták. A fenti százalékos arányokból látható, hogy a HSP70-2 +1267 G allél fordult elő legnagyobb arányban egyedül, az összes 8.1 AH markertől függetlenül.
72
Ebből valószínűsíthető, hogy a HSP70-2 gén körül lehetnek a legfrekventáltabb hot-spot régiók, amelyek lehetővé tették rekombináns haplotípusok létrejöttét. Az I-es típusú diabetes mellitus-szal jellemzett családvizsgálat is bemutatja a rekombinációval létrejött MHC haplotípus variánsokat. Ebben a családvizsgálatban 18-féle haplotípus jelent meg, amelyek közül 12 haplotípus variáns 8.1 ősi haplotípusnak számított. Összegezve, tanulmányunk a variáns 8.1 ősi haplotípusok (ősi 8.1 fragmentumok) jelenlétét mutatta be több populációs vizsgálatban. E variáns 8.1 ősi haplotípusok további vizsgálata betegségasszociációs tanulmányokban megkönnyítheti a kandidáns gének kiválasztását. Eloszlásvizsgálataink alapján a HSP70-2 +1267 G allélt hordozók viszonylag kis százaléka hordozott egyidejűleg 8.1 ősi haplotípust. Számos tanulmány mutatott ki asszociációt a HSP70-2 +1267 G allél és különböző betegségek között, mint pl. a gyulladás megjelenése asztmában [124]; a szeptikus sokk [125], atópiás keratoconjunctivitis [126], kísérletes osteoarthritis [127] kialakulása. Ezek az eredmények mind arra világítanak rá, hogy a HSP70-2 +1267 G allél a 8.1 ősi haplotípustól függetlenül, önállóan is részt vehet bizonyos betegségek kialakulásában. Kutatócsoportunk egy korábbi 2002-es tanulmányában szoros összefüggést mutatott ki az IL-6 -174 CC genotípus és az alacsony anti-Hsp60 ellenanyag szintek között [115]. A genetikai
asszociációs
vizsgálatok
megbízhatóságát
leggyakrabban
a
vizsgált
populációk eredete és nagysága korlátozza. Jelen vizsgálatunk első célja az volt, hogy az előző finn férfiakon végzett megfigyelésünket egy új, független egészséges populációban ismételjük meg. Ez a populáció 313 magyar egészséges személyből állt. Ezen személyek IL-6 -174 SNP genotípusát és plazma mintáiknak anti-Hsp60 ellenanyag szintjét határoztuk meg. A korábbi finn véradók körében végzett vizsgálatban csak férfiak mintái szerepeltek. Jelen tanulmányban, hogy a finn és a magyar populáció IL-6 -174 G/C polimorfizmus allélfrekvenciáit össze tudjuk hasonlítani, szükségünk volt finn nők DNS mintáira is. Egy új 399 személyből álló finn populáció (182 finn nő, 217 finn férfi) adatait (többek között az IL-6 -174 G/C SNP genotípusát is) Prof. Mikko Hurme bocsátotta rendelkezésünkre. A két populáció között, allélfrekvenciák tekintetében szignifikáns különbség mutatkozott. Egészséges magyar népesség körében a vad G allél, míg a finn populációban a C allél előfordulása volt a gyakoribb.
73
A korábbi finn férfiakon és jelenleg a magyar populációban végzett vizsgálatban mind azt figyeltük meg, hogy az IL-6 -174 pozícióban C allélt hordozók alacsony anti-Hsp60 autoantitest szintekkel rendelkeztek. Az asszociációt a Kruskal-Wallis variancia analízisből kapott p értékek is mutatják, miszerint finn férfiak esetében p=0.008, míg a magyar populációban p=0.0076 volt. 2007-ben Christine M. Hegedus és munkatársai is ugyanezt az összefüggést találták San Francisco lakosai között, miszerint az IL-6 -174 pozícióban G allélt hordozók szignifikánsan magasabb anti-Hsp60 autoantitest szintekkel rendelkeztek. Az IL-6 szérum szintekkel nem mutatott összefüggést ez a polimorfizmus [128]. Habár az általunk vizsgált két populációban az IL-6 -174 pozícióban C vagy G allélt homozigóta formában hordozó személyek autoantitest szintje teljesen megegyezett, lényeges különbség volt megfigyelhető a heterozigóta csoportnál. A finn csoportban a heterozigóta személyeknek a CC homozigóta hordozókhoz hasonlóan alacsony autoantitest szintjük volt, míg a magyar populáció heterozigóta személyei a GG homozigóta hordozókhoz hasonlóan magas autoantitest szintekkel rendelkeztek. E különbségek is azt igazolják, hogy mennyire fontos ugyanazon polimorfizmus tulajdonságait több különböző populációban is megvizsgálni. Jelen tanulmány további célja az volt, hogy az IL-6 gén és promóter régiójában az IL-6 174 G/C polimorfizmussal egy haplotípusban újabb SNP-ket találjunk, amelyek kapcsolatban lehetnek az autoantitest szintekkel. Haploview 3.2 szoftver segítségével határoztuk meg az IL-6 gén és promóter régiójában az IL-6 haplotípus blokkok határait. Előzetes vizsgálatként, a magyar populációból 113 személyt választottunk ki véletlenszerűen. Ebben a csoportban összesen 7 IL-6 gén és promóter SNP genotípusát határoztuk meg (-9316, -7164, -1363, -597, -174, +1753, +2954 pozíciókban). Mind a 7 SNP allélfrekvenciái Hardy-Weinberg eloszlást mutatott. A 7 SNP által átölelt szakaszban két 2000 bp hosszú haplotípus blokkot sikerült behatárolni. Az első blokk -9316 T/C és -7164 C/A polimorfizmusok között helyezkedik el, míg a második blokk -597 G/A, -174 G/C és +1753 C/G polimorfizmusokat fogja közre. Itt a magyar populációban is sikerült kimutatnunk a 597 G/A és -174 G/C polimorfizmus közötti szoros kapcsoltságot, amit már más kutatócsoportok in vivo és klinikai vizsgálatokban bebizonyítottak [73,77].
74
Kezdeti vizsgálatunkban 113 magyar személy genotípusa alapján meghatároztuk az IL-6 gén és promóter régiójában elhelyezkedő haplotípus blokkokat, amelyhez 7 SNP genotipizálását
végeztük
el.
Kibővített,
teljes
magyar
populáció
(n=313)
haplotípusainak vizsgálatakor a blokkokat alkotó összes SNP genotipizálása már nem szükséges, mivel az egy blokkban elhelyezkedő SNP-k új információt nem hordoznak. Ez okból kifolyólag IL-6 -7164 C/A és -597 G/A polimorfizmusok genotipizálását nem folytattuk tovább. A haplotípus blokk meghatározások pontosságának ellenőrzése céljából a +1753 C/G polimorfizmust, mint belső kontrollt használtuk. Ha a haplotípus blokk meghatározásaink helyesek voltak, akkor az 5 SNP-ből álló haplotípus vizsgálatnál a -9316/-7164 blokk eltűnik, mivel hiányzik a blokk egyik határoló polimorfizmusa (IL-6 -7164 SNP), míg a -597/-174/+1753 blokk -174/+1753 maradvány blokként jelenik meg. Mivel a fentiek alapján várt haplotípus blokk mintázatokat kaptuk, bebizonyítottuk, hogy blokk meghatározásaink pontosak voltak. 313
magyar
egészséges
személyből
álló
populációban
az IL-6 -174
G/C
polimorfizmuson kívül, tehát még négy SNP (IL-6 -9316 T/C, -1363 G/T, +1753 C/G, +2954 G/C) genotípusát határoztuk meg. Először külön-külön vizsgáltuk a négy új SNP és az autoantitest szintek közötti kapcsolatot, de egyik polimorfizmus esetében sem találtunk összefüggést az anti-Hsp60 ellenanyag szintekkel. Következő lépésként a fenti öt polimorfizmusból álló IL-6 haplotípusok és ellenanyag szintek között kerestünk asszociációt. A leggyakoribb haplotípust homozigótaként hordozó személyeknek szignifikánsan alacsonyabb autoantitest szintjük volt, mint a populáció összes többi tagjának. E leggyakrabban előforduló haplotípus IL-6 -174 pozícióban C allélt hordozott. Tudomásunk szerint ez volt az első olyan tanulmány, ahol egy IL-6 haplotípus (-9316C/-1363G/-174C/+1753C/+2954G) és autoantitest szint között sikerült kapcsolatot kimutatni. Az IL-6 gén polimorfizmusai, haplotípusai és az autoantitest szintek között jelentkező asszociációk hátterében több tényező állhat. Egyrészt a 7-es kromoszómán elhelyezkedő IL-6 génnel kapcsoltságban lévő még ismeretlen gének indirekt módon befolyásolhatják az autoantitest szinteket. Másrészt több kutatócsoport számolt be arról, hogy magas IL-6 szintek magas autoantitest szinteket idéznek elő. Az IL-6 egy fontos differenciációs és növekedési faktor a B-sejtek számára. Az IL-6 molekula receptorán keresztül olyan jelátviteli
75
folyamatokat indíthat be a B-sejteken, amelyek során a B-sejtek ellenanyag termelő plazmasejtekké válnak. Az IL-6 receptorból kiinduló JAK-STAT útvonal STAT-3 transzkripciós faktora gátolja a sejtek apoptózisát és serkenti a sejtek G1-S fázis átmenetét [129,130]. In vitro kísérletben mutatták ki, hogy asztrocita sejttenyészetben az IL-6 a Hsp60 fehérje expresszióját is képes fokozni [131]. Több független vizsgálat is bemutatta, hogy gyulladásos és autoimmun betegségben szenvedők Hsp60 szérum szintje emelkedett [82]. Elképzelhető, hogy az IL-6 stimulációra kialakult emelkedett Hsp60 szint járul hozzá az anti-Hsp60 autoantitestek fokozott termeléséhez. Ezt az elképzelést támasztják alá az anti-Hsp90 autoantitestek vonatkozásában kapott eredmények is. SLEben szenvedő betegek magas Hsp90 szérum szintjei korreláltak a magas IL-6 és antiHsp90 autoantitestek szérum szintjeivel [104]. Proinflammatorikus stimulusok hatására jelentkező IL-6 fehérjeexpressziók közötti jelentős eltérésekért speciális IL-6 haplotípusok, funkcionális SNP-k tehetők felelőssé. Az előbb ismertett tanulmányunk egy indirekt vizsgálat volt. Itt azt feltételeztük, hogy a magas autoantitest szintek termelésért magas IL-6 szintek felelősek. Következő tanulmányunkban már egy in vitro modellrendszert állítottunk fel, ahol közvetlenül vizsgálhattuk a proinflammatorikus stimulusokra adott IL-6 fehérjeexpressziók közötti különbségeket egy általunk kiválasztott SNP függvényében. A vizsgálathoz az érelmeszesedés kórfolyamataiban fontos szerepet játszó sejttípust választottunk. Az endotélsejtek az érelmeszesedés kezdeti és későbbi kórfolyamataiban is részt vesznek [132]. Továbbá GATA-2 transzkripciós faktort expresszálnak, amelynek DNShez való kötődésében az IL-6 -174 G/C polimorfizmus szerepet játszhat [114]. Legjobb tudomásunk szerint HUVEC sejtek IL-6 termelését IL-6 -174 G/C polimorfizmus függvényében még nem vizsgálták. A mérési eredmények megbízhatósága és ismételhetősége érdekében a HUVEC sejteket szigorú körülmények között tenyésztettük, a sejtvonalakat 2. vagy 3. „passzázs”-ig használtuk fel. Az endotél sejteket morfológiájuk és vWf pozitivitásuk alapján karakterizáltuk. Csak azon sejtvonalak IL-6 termelésének mérését végeztük el, amelyek előzőleg normál funkcionális képességet mutattak. A normál funkcionális képességet ICAM-1 expresszió segítségével teszteltük. A biológiai variabilitás zavaró hatásait azzal
76
próbáltuk kikerülni, hogy a különböző genotípusú csoportokban viszonylag nagyszámú HUVEC sejtvonalakkal dolgoztunk. Az endotél sejteket a stimuláló anyagok (IL-1β, LPS) hígítási soraival kezeltük, majd a stimulusokra adott IL-6 válaszokat két paraméter segítségével analizáltuk. E két paraméter a maximális stimulus (Smax) és a fél maximális stimulus volt (MS50). Az Smax a maximális IL-6 termelésnél kapott IL-6 koncentrációkat, míg az MS50 a maximális IL6 termelés felénél kapott IL-1β, LPS koncentrációkat adja. Elméletileg a fél-maximális IL-6 válasznál kapott IL-1β és LPS koncentrációk meghatározása sokkal megbízhatóbb mérőeszköz, mivel az MS50 értéke kevésbé függ a kísérleti körülményektől. Habár az Smax paraméter használata sem elhanyagolható, mivel IL-1β és LPS stimulusok hatásait csak e mérőeszköz segítségével lehet összehasonlítani. IL-1β és LPS kezeléseket követően mért IL-6 válaszokban nem kaptunk szignifikáns különbséget az IL-6 -174 C allélt hordozók és nem-hordozók között. A kapott IL-6 válaszokat a három különböző genotípus csoportban (IL-6 -174 GG, GC, CC) is összehasonlítottuk, de itt sem találtunk különbséget. A vizsgálat elején elvégzett power analízis szerint mintaszámunk megfelelő, hogy a csoportok között biológiailag szignifikáns különbségeket kimutassunk. A csoportok hasonló IL-6 termelésének ellenére, azonban nagy csoportokon belüli varianciát figyeltünk meg. Ez a variancia az IL-6 termelést befolyásoló jelátviteli pályákban szereplő fehérjék eddig még nem ismert génpolimorfizmusaiból eredhet. M. MüllerSteinhardt és munkatársai is hasonló magas, csoportokon belüli varianciáról számoltak be, amikor perifériás mononukleáris sejtek alap és LPS stimulációra adott IL-6 mRNS és fehérje expresszióját vizsgálták [72]. Továbbá a maximális IL-6 válaszokat stimuláció szerint összehasonlítva azt állapítottuk meg, hogy az IL-1β stimuláció ötször magasabb IL-6 termelést idéz elő, mint az LPS. Humán Müller sejteken végzett kísérletek alapján hasonló eredményekről számoltak be IL-6 mRNS szintjén [133]. Habár az LPS és az IL-1β receptorai egy szupercsaládba tartoznak (TIR) és a MyD88/IRAK/Tollip jelátviteli útvonalakat egyaránt aktiválják [134], a jelátviteli mechanizmusban mégis valamilyen különbségeket feltételezhetünk a fenti megfigyelések alapján. A bevezetőben már részletezett in vitro és klinikai vizsgálatok (2.-3. táblázat) eltérő eredményekről számolnak be az IL-6 -174 G/C promóter polimorfizmus IL-6 gén
77
szabályozásában betöltött szerepéről. Ezek az eltérő eredmények onnan is eredhetnek, hogy az IL-6 fehérjét különböző sejttípusok (endotél sejtek, monociták, T-limfociták) termelik. A különböző sejttípusokban, stimulációt követően eltérő transzkripiós faktor fehérjék aktiválódhatnak, amelyek eltérő módon kötődhetnek az IL-6 -174 pozíciót tartalmazó IL-6 gén promóter régióhoz. Jelen tanulmány tervezésekor elsődlegesen az IL-6 -174 pozícióban C allélt hordozók és nem-hordozók közötti különbségeket szerettük volna kimutatni egy kaukázusi populációban. Az IL-6 termelés biológiailag szignifikáns különbségeinek kimutatásához szükséges mintaszámot power analízis segítségével határoztuk meg. Az analízis szerint 30 minta gyűjtése bizonyult elegendőnek (power=0.9, α=0.05). Az IL-6 -174 pozícióban C allélt hordozó és nem-hordozó HUVEC sejtek IL-6 expressziója között nem találtunk szignifikáns különbséget. Az egészséges magyar populáció C allél gyakorisága 0.433 volt, a 30 mintából álló populációban a CC genotípusú minták csak kis számban fordultak elő. A három genotípus csoport között végzett statisztikai kiértékelés erősségét a CC genotípus alacsony mintaszáma korlátozhatja. A különböző genotípusú csoportok maximális IL-6 válaszainak felénél kapott IL-1β koncentrációk (MS50) között jelentkező szignifikáns különbségek kimutatásához, α=0.05 szintjén már csoportonként 3 mintaszám is elegendő volt a 100%-os power eléréséhez. LPS kezelések hatására azonban az MS50 értékek közötti szignifikáns különbségek kimutatásához csoportonként 20 mintaszám lett volna elegendő. Az IL-6 termelést az IL-6 -174 pozíció három genotípusa alapján (CC és a többi GG, GC genotípus csoportok között) összehasonlítottuk, ahol szintén nem találtunk különbséget sem IL-1β, sem LPS kezelések hatására. A fenti eredményekből feltételezhető, hogy az IL-1β és LPS stimulációt követő jelátviteli folyamatokban szereplő transzkripciós faktorok DNS-kötő kapacitása nem függ az IL-6 -174 SNP genotípusától. Ezen következtetéseket azonban csak a HUVEC (humán köldökzsinór véna endotél) sejtek esetében állíthatjuk, mivel a különböző szerv és szövet eredetű endotél sejtek között is már szignifikáns különbségek jelentkezhetnek. W.C. Aird egy 2007-es összefoglaló tanulmányában mutatta be a különböző eredetű endotél sejtek között fellépő lényeges szerkezeti és funkcionális különbségeket [117].
78
7 Következtetések •
Meghatároztuk a 8.1 ősi haplotípus és haplotípusvariánsok gyakoriságát nyolc egészséges és nyolc diabetes mellitusban szenvedő gyermek szüleinél (36 kromoszóma), összesen kilenc családban.
•
A 8.1 ősi haplotípust alkotó markerek előfordulási gyakorisága között lényeges különbségeket találtunk mind magyar, mind ohioi kaukázusi populációban.
•
A magyar és az ohioi populációban a valódi 8.1 ősi haplotípus gyakoriságok megegyeztek.
•
A 8.1 ősi haplotípus markerek közül a HSP70-2 +1267 G allél fordult elő legnagyobb gyakorisággal variáns egy markeres 8.1 ősi haplotípusban.
•
A HSP70-2 +1267 G allél és a 8.1 ősi haplotípus markerek között külön-külön alacsony, míg a HSP70-2 +1267 G allél és a 8.1 ősi haplotípus fragmentunok között szoros kapcsoltság állt fenn.
•
A fenti eredményekből arra következtethetünk, hogy a HSP70-2 gén körül helyezkedhetnek el a legfrekventáltabb rekombinációs hot-spot szakaszok.
•
Korábban, finn populációban kapott eredményeinket sikerült megismételni egy új független, magyar egészséges populációban, miszerint az IL-6 -174 G allélt hordozók magas anti-Hsp60 ellenanyag szintekkel rendelkeztek.
•
Az IL-6 gén és promóter régióban hat új egypontos nukleotid polimorfizmust genotipizáltunk a magyar populáció egy kisebb csoportjában, amelyet randomszerűen választottunk ki. Összesen 7 SNP segítségével két 2000 bp hosszú haplotípusblokkot találtunk -9316 és -7164 pozíciók között, valamint 597, -174 és +1753 pozíciók között.
•
A teljes magyar populációban már csak 5 SNP-t (-9316T/C, -1363G/T, -174G/C, +1753C/G, +2954G/C) genotipizáltunk tovább, mivel a haplotípusblokkok
ismerete feleslegessé tette az összes SNP genotípusának meghatározását. Az IL-6 -174 G/C polimorfizmuson kívül egyik SNP sem mutatott összefüggést az antiHsp60 autoantitest szintekkel. •
A
leggyakrabban
előforduló
(-9316C/-1363G/-174C/+1753C/+2954G)
haplotípust, homozigótaként hordozók alacsonyabb anti-Hsp60 autoantitest szintekkel rendelkeztek, mint a populáció összes többi tagja. •
A fenti eredmények hátterében állhat az, hogy a magas autoantitest szintekért magas IL-6 szintek felelősek, valamint az, hogy az IL-6 gén polimorfizmusai a 7es kromoszómán más génekkel is kapcsoltságban lehetnek, amelyek indirekt módon befolyásolják az autoantitest termelést.
•
Az IL-6 -174 G/C genotípustól függetlenül, a HUVEC sejtek IL-1β stimuláció hatására szignifikánsan magasabb IL-6 expresszióval válaszoltak, mint LPS stimuláció hatására.
•
Az LPS és az IL-1β receptorai egy szupercsaládba tartoznak (TIR) és a MyD88/IRAK/Tollip jelátviteli útvonalakat egyaránt aktiválják [134], a jelátviteli mechanizmusban mégis valamilyen különbségeket feltételezhetünk.
•
Az IL-6 -174 G/C pozícióban különböző genotípusú HUVEC sejtek IL-6 termelésében nem volt szignifikáns különbség sem IL-1β, sem LPS stimulust követően.
•
Ezt csak a HUVEC sejtek esetében állíthatjuk, mivel a különböző szerv és szövet eredetű endotél sejtek között is már szignifikáns különbségek jelentkezhetnek.
80
8 Összefoglalás Napjainkban az egypontos nukleotid polimorfizmusok (SNP) és haplotípusainak eloszlás vizsgálata nagy segítséget nyújt multifaktoriális betegségek genetikai hátterének felderítésében. A legtöbb esetben a betegségekkel asszociálódó SNP-k valódi funkcionalitását in vitro modellrendszerekben bizonyítják be. Munkám során e genetikai módszerek gyakorlati alkalmazásait és nehézségeit három különböző humán modellrendszerben mutatom be. A 6-os kromoszóma rövid karján elhelyezkedő kiterjesztett MHC régióban a lókuszok között rendkívül szoros kapcsoltság áll fenn. Munkánk során az MHC régiót átölelő 8.1 ősi haplotípus (8.1 AH) és a rekombinációval létrejött 8.1 ősi haplotípusvariánsok eloszlását vizsgáltuk három kaukázusi csoportban. Az általunk vizsgált 8.1 AH markerek közül a HSP70-2 +1267 G allél fordult elő legnagyobb arányban egymarkeres 8.1 ősi haplotípusvariánsként. Ebből arra következtethetünk, hogy a HSP70-2 gén körül helyezkedhetnek el a legfrekventáltabb rekombinációs hot-spot szakaszok. Korábbi vizsgálataink folytatásaként az IL-6 -174 G/C polimorfizmus és az anti-Hsp60 autoantitest szintek közötti kapcsolatot vizsgáltuk egészséges magyar populációban. Az IL-6 -174 G allélt hordozók szignifikánsan magasabb autoantitest szintekkel rendelkeztek, mint a CC genotípust hordozók. Az IL-6 gén promóter és kódoló régiójában további hat SNP genotipizálásával az IL-6 gén haplotípus blokkjait határoztuk meg. Két 2000 bp hosszú haplotípus blokkot sikerült azonosítanunk. A leggyakrabban előforduló haplotípus, amely IL-6 -174 pozícióban C allélt hordozott, alacsony anti-Hsp60 autoantitest szintekkel rendelkezett. A fenti eredmények hátterében állhat az, hogy a magas autoantitest szintekért magas IL-6 szintek felelősek, valamint az, hogy az IL-6 gén polimorfizmusai a 7-es kromoszómán más génekkel is kapcsoltságban lehetnek, amelyek indirekt módon befolyásolják az autoantitest termelést. Fontosnak tartottuk, hogy az IL-6 -174 G/C polimorfizmus funkcionalitását in vitro modellrendszerben is vizsgáljuk. HUVEC sejtek IL-6 termelését hasonlítottuk össze különböző proinflammatorikus stimulusok hatására. Nem kaptunk szignifikáns különbséget a különböző IL-6 -174 G/C genotípusú HUVEC sejtek IL-6 fehérje expressziója között. Ez az eredmény nem zárja ki azt a lehetőséget, hogy más sejttípusokban az IL-6 -174 SNP genotípusa szignifikáns különbséget okoz az IL-6 fehérje expressziójában.
81
9 Summary Single nucleotid polymorphism (SNP)- and haplotype-based methods offer a powerful approach to catch candidate genes for multifactorial diseases. Furthermore in vitro model systems are used to examine the effect of maximally informative SNP-s in haplotype blocks. In our studies, we showed the practical applications and difficulties of these haplotype-based methods in three different human model systems. The human MHC region is located in the short arm of chromosome 6, where the linkage disequilibrium is very high among the locuses. In this region the 8.1 ancestral haplotype (8.1 AH) was the most frequent in Caucasian populations. We examined the frequency of 8.1 AH and its recombinated variants in three Caucasian populations. Out of the examined 8.1 AH markers, HSP70-2 +1267 G allele occured most frequently in a recombinated 8.1 AH variant, which carried only one 8.1 AH marker. Therefore, we can conclude that hot-spot regions may be located around HSP70-2 gene. In the next studies the associations were examined between IL-6 -174 G/C SNP and anti-HSP60 autoantibody levels in healthy Hungarian population. The IL-6 -174 G allele carriers have significantly higher autoantibody levels than subjects with CC genotype. The haplotype blocks were determined in the promoter and coding regions of IL-6 gene with genotyping of 7 SNP-s. Two 2000 bp long haplotype blocks were found. The most frequent haplotype (CGCCG), which carried C allele at -174 position, had low autoantibody levels. These results can be explained in several ways. High IL-6 levels can cause high autoantibody levels or other genes, which are in linkage disequilibrium with IL-6 gene on the chromosome 7, may have indirect effect on the production of autoantibodies. In our third study we examined the functional effect of IL-6 -174 G/C polymorphism in in vitro model system. No significant differences were observed between IL-6 expression of HUVEC cells with different IL-6 -174 G/C genotypes. IL-6 production of HUVECs did not depend on different genotypes at IL-6 -174 position. However, we can not exclude that the IL-6 production can be influenced by IL-6 -174 SNP in endothelial cells with different origins.
82
10 Irodalomjegyzék 1. 2. 3.
4. 5. 6. 7.
8. 9.
Kruglyak L, Nickerson DA: Variation is the spice of life. Nat Genet 2001;27:234-236. The International HapMap Project. Nature 2003;426:789-796. Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, Moore JM, Roy J, Blumenstiel B, Higgins J, DeFelice M, Lochner A, Faggart M, Liu-Cordero SN, Rotimi C, Adeyemo A, Cooper R, Ward R, Lander ES, Daly MJ, Altshuler D: The structure of haplotype blocks in the human genome. Science 2002;296:2225-2229. Reich DE, Cargill M, Bolk S, Ireland J, Sabeti PC, Richter DJ, Lavery T, Kouyoumjian R, Farhadian SF, Ward R, Lander ES: Linkage disequilibrium in the human genome. Nature 2001;411:199-204. Stumpf MP: Haplotype diversity and the block structure of linkage disequilibrium. Trends Genet 2002;18:226-228. Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex. The MHC sequencing consortium. Nature 1999;401:921-923. Mungall AJ, Palmer SA, Sims SK, Edwards CA, Ashurst JL, Wilming L, Jones MC, Horton R, Hunt SE, Scott CE, Gilbert JG, Clamp ME, Bethel G, Milne S, Ainscough R, Almeida JP, Ambrose KD, Andrews TD, Ashwell RI, Babbage AK, Bagguley CL, Bailey J, Banerjee R, Barker DJ, Barlow KF, Bates K, Beare DM, Beasley H, Beasley O, Bird CP, Blakey S, Bray-Allen S, Brook J, Brown AJ, Brown JY, Burford DC, Burrill W, Burton J, Carder C, Carter NP, Chapman JC, Clark SY, Clark G, Clee CM, Clegg S, Cobley V, Collier RE, Collins JE, Colman LK, Corby NR, Coville GJ, Culley KM, Dhami P, Davies J, Dunn M, Earthrowl ME, Ellington AE, Evans KA, Faulkner L, Francis MD, Frankish A, Frankland J, French L, Garner P, Garnett J, Ghori MJ, Gilby LM, Gillson CJ, Glithero RJ, Grafham DV, Grant M, Gribble S, Griffiths C, Griffiths M, Hall R, Halls KS, Hammond S, Harley JL, Hart EA, Heath PD, Heathcott R, Holmes SJ, Howden PJ, Howe KL, Howell GR, Huckle E, Humphray SJ, Humphries MD, Hunt AR, Johnson CM, Joy AA, Kay M, Keenan SJ, Kimberley AM, King A, Laird GK, Langford C, Lawlor S, Leongamornlert DA, Leversha M, Lloyd CR, Lloyd DM, Loveland JE, Lovell J, Martin S, Mashreghi-Mohammadi M, Maslen GL, Matthews L, McCann OT, McLaren SJ, McLay K, McMurray A, Moore MJ, Mullikin JC, Niblett D, Nickerson T, Novik KL, Oliver K, Overton-Larty EK, Parker A, Patel R, Pearce AV, Peck AI, Phillimore B, Phillips S, Plumb RW, Porter KM, Ramsey Y, Ranby SA, Rice CM, Ross MT, Searle SM, Sehra HK, Sheridan E, Skuce CD, Smith S, Smith M, Spraggon L, Squares SL, Steward CA, Sycamore N, Tamlyn-Hall G, Tester J, Theaker AJ, Thomas DW, Thorpe A, Tracey A, Tromans A, Tubby B, Wall M, Wallis JM, West AP, White SS, Whitehead SL, Whittaker H, Wild A, Willey DJ, Wilmer TE, Wood JM, Wray PW, Wyatt JC, Young L, Younger RM, Bentley DR, Coulson A, Durbin R, Hubbard T, Sulston JE, Dunham I, Rogers J, Beck S: The DNA sequence and analysis of human chromosome 6. Nature 2003;425:805-811. Falus A: Az immunológia alapjai. Budapest, Semmelweis Kiadó, 2007. Horton R, Wilming L, Rand V, Lovering RC, Bruford EA, Khodiyar VK, Lush MJ, Povey S, Talbot CC, Jr., Wright MW, Wain HM, Trowsdale J, Ziegler A,
83
10.
11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.
18. 19.
20. 21.
22.
23. 24. 25.
Beck S: Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet 2004;5:889899. Schreuder GM, Hurley CK, Marsh SG, Lau M, Maiers M, Kollman C, Noreen HJ: The HLA Dictionary 2001: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, DR and -DQ antigens. Tissue Antigens 2001;58:109-140. Klein J, Sato A: The HLA system. First of two parts. N Engl J Med 2000;343:702-709. Schottelius AJ, Moldawer LL, Dinarello CA, Asadullah K, Sterry W, Edwards CK, 3rd: Biology of tumor necrosis factor-alpha- implications for psoriasis. Exp Dermatol 2004;13:193-222. Hajeer AH, Hutchinson IV: Influence of TNFalpha gene polymorphisms on TNFalpha production and disease. Hum Immunol 2001;62:1191-1199. Kiang JG, Tsokos GC: Heat shock protein 70 kDa: molecular biology, biochemistry, and physiology. Pharmacol Ther 1998;80:183-201. Milner CM, Campbell RD: Structure and expression of the three MHC-linked HSP70 genes. Immunogenetics 1990;32:242-251. Milner CM, Campbell RD: Polymorphic analysis of the three MHC-linked HSP70 genes. Immunogenetics 1992;36:357-362. Favatier F, Bornman L, Hightower LE, Gunther E, Polla BS: Variation in hsp gene expression and Hsp polymorphism: do they contribute to differential disease susceptibility and stress tolerance? Cell Stress Chaperones 1997;2:141155. Temple SE, Cheong KY, Ardlie KG, Sayer D, Waterer GW: The septic shock associated HSPA1B1267 polymorphism influences production of HSPA1A and HSPA1B. Intensive Care Med 2004;30:1761-1767. Yunis EJ, Larsen CE, Fernandez-Vina M, Awdeh ZL, Romero T, Hansen JA, Alper CA: Inheritable variable sizes of DNA stretches in the human MHC: conserved extended haplotypes and their fragments or blocks. Tissue Antigens 2003;62:1-20. Noel R Rose RGH, Barbara Detrick: Manual of Clinical Laboratory Immunology. Washington, American Society for Microbiology Press, 2002. Chung EK, Yang Y, Rupert KL, Jones KN, Rennebohm RM, Blanchong CA, Yu CY: Determining the one, two, three, or four long and short loci of human complement C4 in a major histocompatibility complex haplotype encoding C4A or C4B proteins. Am J Hum Genet 2002;71:810-822. Chung EK, Yang Y, Rennebohm RM, Lokki ML, Higgins GC, Jones KN, Zhou B, Blanchong CA, Yu CY: Genetic sophistication of human complement components C4A and C4B and RP-C4-CYP21-TNX (RCCX) modules in the major histocompatibility complex. Am J Hum Genet 2002;71:823-837. Szollár L: Kórélettan. Budapest, Semmelweis Kiadó, 2005. Hudson BI, Stickland MH, Grant PJ: Identification of polymorphisms in the receptor for advanced glycation end products (RAGE) gene: prevalence in type 2 diabetes and ethnic groups. Diabetes 1998;47:1155-1157. Alper CA, Larsen CE, Dubey DP, Awdeh ZL, Fici DA, Yunis EJ: The haplotype structure of the human major histocompatibility complex. Hum Immunol 2006;67:73-84.
84
26. 27. 28. 29.
30.
31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43.
Candore G, Lio D, Colonna Romano G, Caruso C: Pathogenesis of autoimmune diseases associated with 8.1 ancestral haplotype: effect of multiple gene interactions. Autoimmun Rev 2002;1:29-35. Cheong KY, Allcock RJ, Eerligh P, Witt CS, Christiansen FT, McCann V, Price P: Localization of central MHC genes influencing type I diabetes. Hum Immunol 2001;62:1363-1370. Stenzel A, Lu T, Koch WA, Hampe J, Guenther SM, De La Vega FM, Krawczak M, Schreiber S: Patterns of linkage disequilibrium in the MHC region on human chromosome 6p. Hum Genet 2004;114:377-385. Miretti MM, Walsh EC, Ke X, Delgado M, Griffiths M, Hunt S, Morrison J, Whittaker P, Lander ES, Cardon LR, Bentley DR, Rioux JD, Beck S, Deloukas P: A high-resolution linkage-disequilibrium map of the human major histocompatibility complex and first generation of tag single-nucleotide polymorphisms. Am J Hum Genet 2005;76:634-646. de Bakker PI, McVean G, Sabeti PC, Miretti MM, Green T, Marchini J, Ke X, Monsuur AJ, Whittaker P, Delgado M, Morrison J, Richardson A, Walsh EC, Gao X, Galver L, Hart J, Hafler DA, Pericak-Vance M, Todd JA, Daly MJ, Trowsdale J, Wijmenga C, Vyse TJ, Beck S, Murray SS, Carrington M, Gregory S, Deloukas P, Rioux JD: A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC. Nat Genet 2006;38:1166-1172. Cullen M, Perfetto SP, Klitz W, Nelson G, Carrington M: High-resolution patterns of meiotic recombination across the human major histocompatibility complex. Am J Hum Genet 2002;71:759-776. Kishimoto T: Interleukin-6: discovery of a pleiotropic cytokine. Arthritis Res Ther 2006;8 Suppl 2:S2. Takatsu K: Cytokines involved in B-cell differentiation and their sites of action. Proc Soc Exp Biol Med 1997;215:121-133. Nishimoto N, Kishimoto T: Interleukin 6: from bench to bedside. Nat Clin Pract Rheumatol 2006;2:619-626. Diehl S, Rincon M: The two faces of IL-6 on Th1/Th2 differentiation. Mol Immunol 2002;39:531-536. Van Snick J: Interleukin-6: an overview. Annu Rev Immunol 1990;8:253-278. Papanicolaou DA, Wilder RL, Manolagas SC, Chrousos GP: The pathophysiologic roles of interleukin-6 in human disease. Ann Intern Med 1998;128:127-137. Sehgal PB: Regulation of IL6 gene expression. Res Immunol 1992;143:724-734. Sehgal PB, Wang L, Rayanade R, Pan H, Margulies L: Interleukin-6-type cytokines. Ann N Y Acad Sci 1995;762:1-14. Krueger J, Ray A, Tamm I, Sehgal PB: Expression and function of interleukin-6 in epithelial cells. J Cell Biochem 1991;45:327-334. Libermann TA, Baltimore D: Activation of interleukin-6 gene expression through the NF-kappa B transcription factor. Mol Cell Biol 1990;10:2327-2334. Ray A, LaForge KS, Sehgal PB: On the mechanism for efficient repression of the interleukin-6 promoter by glucocorticoids: enhancer, TATA box, and RNA start site (Inr motif) occlusion. Mol Cell Biol 1990;10:5736-5746. Sehgal PB: Interleukin-6: a regulator of plasma protein gene expression in hepatic and non-hepatic tissues. Mol Biol Med 1990;7:117-130.
85
44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53.
54.
55. 56. 57. 58.
59.
Gado K, Domjan G, Hegyesi H, Falus A: Role of INTERLEUKIN-6 in the pathogenesis of multiple myeloma. Cell Biol Int 2000;24:195-209. Biasucci LM, Vitelli A, Liuzzo G, Altamura S, Caligiuri G, Monaco C, Rebuzzi AG, Ciliberto G, Maseri A: Elevated levels of interleukin-6 in unstable angina. Circulation 1996;94:874-877. Hack CE, De Groot ER, Felt-Bersma RJ, Nuijens JH, Strack Van Schijndel RJ, Eerenberg-Belmer AJ, Thijs LG, Aarden LA: Increased plasma levels of interleukin-6 in sepsis. Blood 1989;74:1704-1710. Blackwell TS, Christman JW: Sepsis and cytokines: current status. Br J Anaesth 1996;77:110-117. Ridker PM, Rifai N, Stampfer MJ, Hennekens CH: Plasma concentration of interleukin-6 and the risk of future myocardial infarction among apparently healthy men. Circulation 2000;101:1767-1772. Crea F, Biasucci LM, Buffon A, Liuzzo G, Monaco C, Caligiuri G, Kol A, Sperti G, Cianflone D, Maseri A: Role of inflammation in the pathogenesis of unstable coronary artery disease. Am J Cardiol 1997;80:10E-16E. Seino Y, Ikeda U, Ikeda M, Yamamoto K, Misawa Y, Hasegawa T, Kano S, Shimada K: Interleukin 6 gene transcripts are expressed in human atherosclerotic lesions. Cytokine 1994;6:87-91. Rus HG, Vlaicu R, Niculescu F: Interleukin-6 and interleukin-8 protein and gene expression in human arterial atherosclerotic wall. Atherosclerosis 1996;127:263271. Nabata T, Morimoto S, Koh E, Shiraishi T, Ogihara T: Interleukin-6 stimulates c-myc expression and proliferation of cultured vascular smooth muscle cells. Biochem Int 1990;20:445-453. Romano M, Sironi M, Toniatti C, Polentarutti N, Fruscella P, Ghezzi P, Faggioni R, Luini W, van Hinsbergh V, Sozzani S, Bussolino F, Poli V, Ciliberto G, Mantovani A: Role of IL-6 and its soluble receptor in induction of chemokines and leukocyte recruitment. Immunity 1997;6:315-325. Hirano T, Taga T, Yasukawa K, Nakajima K, Nakano N, Takatsuki F, Shimizu M, Murashima A, Tsunasawa S, Sakiyama F, et al.: Human B-cell differentiation factor defined by an anti-peptide antibody and its possible role in autoantibody production. Proc Natl Acad Sci U S A 1987;84:228-231. Hasegawa M, Fujimoto M, Takehara K, Sato S: Pathogenesis of systemic sclerosis: altered B cell function is the key linking systemic autoimmunity and tissue fibrosis. J Dermatol Sci 2005;39:1-7. Ishihara K, Hirano T: IL-6 in autoimmune disease and chronic inflammatory proliferative disease. Cytokine Growth Factor Rev 2002;13:357-368. Kurrer MO, Kopf M, Penninger JM, Eriksson U: Cytokines that regulate autoimmune myocarditis. Swiss Med Wkly 2002;132:408-413. Drakesmith H, O'Neil D, Schneider SC, Binks M, Medd P, Sercarz E, Beverley P, Chain B: In vivo priming of T cells against cryptic determinants by dendritic cells exposed to interleukin 6 and native antigen. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:14903-14908. Nauck M, Winkelmann BR, Hoffmann MM, Bohm BO, Wieland H, Marz W: The interleukin-6 G(-174)C promoter polymorphism in the LURIC cohort: no association with plasma interleukin-6, coronary artery disease, and myocardial infarction. J Mol Med 2002;80:507-513.
86
60.
61.
62.
63. 64. 65.
66.
67.
68. 69. 70. 71.
Sie MP, Sayed-Tabatabaei FA, Oei HH, Uitterlinden AG, Pols HA, Hofman A, van Duijn CM, Witteman JC: Interleukin 6 -174 g/c promoter polymorphism and risk of coronary heart disease: results from the rotterdam study and a metaanalysis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006;26:212-217. Kelberman D, Hawe E, Luong LA, Mohamed-Ali V, Lundman P, Tornvall P, Aillaud MF, Juhan-Vague I, Yudkin JS, Margaglione M, di Minno G, Tremoli E, Humphries SE: Effect of Interleukin-6 promoter polymorphisms in survivors of myocardial infarction and matched controls in the North and South of Europe. The HIFMECH Study. Thromb Haemost 2004;92:1122-1128. Burzotta F, Iacoviello L, Di Castelnuovo A, Glieca F, Luciani N, Zamparelli R, Schiavello R, Donati MB, Maseri A, Possati G, Andreotti F: Relation of the -174 G/C polymorphism of interleukin-6 to interleukin-6 plasma levels and to length of hospitalization after surgical coronary revascularization. Am J Cardiol 2001;88:1125-1128. Jones KG, Brull DJ, Brown LC, Sian M, Greenhalgh RM, Humphries SE, Powell JT: Interleukin-6 (IL-6) and the prognosis of abdominal aortic aneurysms. Circulation 2001;103:2260-2265. Humphries SE, Luong LA, Ogg MS, Hawe E, Miller GJ: The interleukin-6 -174 G/C promoter polymorphism is associated with risk of coronary heart disease and systolic blood pressure in healthy men. Eur Heart J 2001;22:2243-2252. Brull DJ, Montgomery HE, Sanders J, Dhamrait S, Luong L, Rumley A, Lowe GD, Humphries SE: Interleukin-6 gene -174g>c and -572g>c promoter polymorphisms are strong predictors of plasma interleukin-6 levels after coronary artery bypass surgery. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001;21:14581463. Chapman CM, Beilby JP, Humphries SE, Palmer LJ, Thompson PL, Hung J: Association of an allelic variant of interleukin-6 with subclinical carotid atherosclerosis in an Australian community population. Eur Heart J 2003;24:1494-1499. Fishman D, Faulds G, Jeffery R, Mohamed-Ali V, Yudkin JS, Humphries S, Woo P: The effect of novel polymorphisms in the interleukin-6 (IL-6) gene on IL-6 transcription and plasma IL-6 levels, and an association with systemiconset juvenile chronic arthritis. J Clin Invest 1998;102:1369-1376. Pawlik A, Wrzesniewska J, Florczak M, Gawronska-Szklarz B, Herczynska M: IL-6 promoter polymorphism in patients with rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatol 2005;34:109-113. Fedetz M, Matesanz F, Pascual M, Martin J, Fernandez O, Guerrero M, Alcina A: The -174/-597 promoter polymorphisms in the interleukin-6 gene are not associated with susceptibility to multiple sclerosis. J Neurol Sci 2001;190:69-72. Kilpinen S, Hulkkonen J, Wang XY, Hurme M: The promoter polymorphism of the interleukin-6 gene regulates interleukin-6 production in neonates but not in adults. Eur Cytokine Netw 2001;12:62-68. Olivieri F, Bonafe M, Cavallone L, Giovagnetti S, Marchegiani F, Cardelli M, Mugianesi E, Giampieri C, Moresi R, Stecconi R, Lisa R, Franceschi C: The 174 C/G locus affects in vitro/in vivo IL-6 production during aging. Exp Gerontol 2002;37:309-314.
87
72. 73. 74.
75. 76. 77.
78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87.
Muller-Steinhardt M, Ebel B, Hartel C: The impact of interleukin-6 promoter 597/-572/-174genotype on interleukin-6 production after lipopolysaccharide stimulation. Clin Exp Immunol 2007;147:339-345. Rivera-Chavez FA, Peters-Hybki DL, Barber RC, O'Keefe GE: Interleukin-6 promoter haplotypes and interleukin-6 cytokine responses. Shock 2003;20:218223. Olivieri F, Bonafe M, Giovagnetti S, Stecconi R, Cardelli M, Cavallone L, Spazzafumo L, Marchegiani F, Carrieri G, Mugianesi E, Giampieri C, Centurelli M, Moresi R, Tesei S, Lisa R, Viticchi C, Falsetti L, Salvioli S, Franceschi C: In vitro IL-6 production by EBV-immortalized B lymphocytes from young and elderly people genotyped for -174 C/G polymorphism in IL-6 gene: a model to study the genetic basis of inflamm-aging. Mech Ageing Dev 2003;124:549-553. Belfer I, Buzas B, Hipp H, Dean M, Evans C, Lorincz I, Max MB, Goldman D: Haplotype structure of inflammatory cytokines genes (IL1B, IL6 and TNF/LTA) in US Caucasians and African Americans. Genes Immun 2004;5:505-512. Villuendas G, San Millan JL, Sancho J, Escobar-Morreale HF: The -597 G-->A and -174 G-->C polymorphisms in the promoter of the IL-6 gene are associated with hyperandrogenism. J Clin Endocrinol Metab 2002;87:1134-1141. Hamid YH, Rose CS, Urhammer SA, Glumer C, Nolsoe R, Kristiansen OP, Mandrup-Poulsen T, Borch-Johnsen K, Jorgensen T, Hansen T, Pedersen O: Variations of the interleukin-6 promoter are associated with features of the metabolic syndrome in Caucasian Danes. Diabetologia 2005;48:251-260. Fife MS, Ogilvie EM, Kelberman D, Samuel J, Gutierrez A, Humphries SE, Woo P: Novel IL-6 haplotypes and disease association. Genes Immun 2005;6:367-370. Sutherland AM, Walley KR, Manocha S, Russell JA: The association of interleukin 6 haplotype clades with mortality in critically ill adults. Arch Intern Med 2005;165:75-82. Acalovschi D, Wiest T, Hartmann M, Farahmi M, Mansmann U, Auffarth GU, Grau AJ, Green FR, Grond-Ginsbach C, Schwaninger M: Multiple levels of regulation of the interleukin-6 system in stroke. Stroke 2003;34:1864-1869. Ross R: Atherosclerosis is an inflammatory disease. Am Heart J 1999;138:S419420. Wick G, Knoflach M, Xu Q: Autoimmune and inflammatory mechanisms in atherosclerosis. Annu Rev Immunol 2004;22:361-403. Wick G, Romen M, Amberger A, Metzler B, Mayr M, Falkensammer G, Xu Q: Atherosclerosis, autoimmunity, and vascular-associated lymphoid tissue. Faseb J 1997;11:1199-1207. Libby P: Inflammation in atherosclerosis. Nature 2002;420:868-874. Robertson AK, Hansson GK: T cells in atherogenesis: for better or for worse? Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006;26:2421-2432. Steffens S, Mach F: Inflammation and atherosclerosis. Herz 2004;29:741-748. Wieten L, Broere F, van der Zee R, Koerkamp EK, Wagenaar J, van Eden W: Cell stress induced HSP are targets of regulatory T cells: a role for HSP inducing compounds as anti-inflammatory immuno-modulators? FEBS Lett 2007;581:3716-3722.
88
88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95.
96. 97. 98. 99. 100. 101.
102.
103. 104.
Soltesz P, Prohaszka Z, Fust G, Der H, Kerekes G, Szodoray P, Zeher M, Szekanecz Z: [The autoimmune features of vasculopathies]. Orv Hetil 2007;148 Suppl 1:53-57. Csermely P: Stresszfehérjék. Sejtjeink ősi védekező mechanizmusa. Budapest, Vince Kiadó, 2001. Xu Q: Role of heat shock proteins in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22:1547-1559. Prohaszka Z: [Heat shock proteins as chaperones of the immune response. The optimal stress of life]. Orv Hetil 2003;144:1331-1339. Mandal K, Jahangiri M, Xu Q: Autoimmunity to heat shock proteins in atherosclerosis. 2004. Calderwood SK, Mambula SS, Gray PJ, Jr., Theriault JR: Extracellular heat shock proteins in cell signaling. FEBS Lett 2007;581:3689-3694. Xu Q, Schett G, Seitz CS, Hu Y, Gupta RS, Wick G: Surface staining and cytotoxic activity of heat-shock protein 60 antibody in stressed aortic endothelial cells. Circ Res 1994;75:1078-1085. Kleindienst R, Xu Q, Willeit J, Waldenberger FR, Weimann S, Wick G: Immunology of atherosclerosis. Demonstration of heat shock protein 60 expression and T lymphocytes bearing alpha/beta or gamma/delta receptor in human atherosclerotic lesions. Am J Pathol 1993;142:1927-1937. Hirschberg H, Bergh OJ, Thorsby E: Antigen-presenting properties of human vascular endothelial cells. J Exp Med 1980;152:249s-255s. Hansson GK, Jonasson L, Holm J, Claesson-Welsh L: Class II MHC antigen expression in the atherosclerotic plaque: smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ and the invariant gamma chain. Clin Exp Immunol 1986;64:261-268. Pockley AG, Wu R, Lemne C, Kiessling R, de Faire U, Frostegard J: Circulating heat shock protein 60 is associated with early cardiovascular disease. Hypertension 2000;36:303-307. Xu Q, Schett G, Perschinka H, Mayr M, Egger G, Oberhollenzer F, Willeit J, Kiechl S, Wick G: Serum soluble heat shock protein 60 is elevated in subjects with atherosclerosis in a general population. Circulation 2000;102:14-20. Prohaszka Z, Fust G: Immunological aspects of heat-shock proteins-the optimum stress of life. Mol Immunol 2004;41:29-44. Xu Q, Dietrich H, Steiner HJ, Gown AM, Schoel B, Mikuz G, Kaufmann SH, Wick G: Induction of arteriosclerosis in normocholesterolemic rabbits by immunization with heat shock protein 65. Arterioscler Thromb 1992;12:789799. Xu Q, Kleindienst R, Waitz W, Dietrich H, Wick G: Increased expression of heat shock protein 65 coincides with a population of infiltrating T lymphocytes in atherosclerotic lesions of rabbits specifically responding to heat shock protein 65. J Clin Invest 1993;91:2693-2702. Schett G, Xu Q, Amberger A, Van der Zee R, Recheis H, Willeit J, Wick G: Autoantibodies against heat shock protein 60 mediate endothelial cytotoxicity. J Clin Invest 1995;96:2569-2577. Ripley BJ, Isenberg DA, Latchman DS: Elevated levels of the 90 kDa heat shock protein (hsp90) in SLE correlate with levels of IL-6 and autoantibodies to hsp90. J Autoimmun 2001;17:341-346.
89
105.
106. 107. 108. 109. 110. 111. 112.
113. 114. 115. 116. 117. 118.
119. 120.
Stephanou A, Conroy S, Isenberg DA, Maione D, Poli V, Ciliberto G, Latchman DS: Elevation of IL-6 in transgenic mice results in increased levels of the 90 kDa heat shock protein (hsp90) and the production of anti-hsp90 antibodies. J Autoimmun 1998;11:249-253. Schiffrin EL: The endothelium and control of blood vessel function in health and disease. Clin Invest Med 1994;17:602-620. Penna C, Rastaldo R, Mancardi D, Cappello S, Pagliaro P, Westerhof N, Losano G: Effect of endothelins on the cardiovascular system. J Cardiovasc Med (Hagerstown) 2006;7:645-652. Garcia X, Stein F: Nitric oxide. Semin Pediatr Infect Dis 2006;17:55-57. Danese S, Dejana E, Fiocchi C: Immune regulation by microvascular endothelial cells: directing innate and adaptive immunity, coagulation, and inflammation. J Immunol 2007;178:6017-6022. Adams RH, Alitalo K: Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol 2007;8:464-478. Hadi HA, Carr CS, Al Suwaidi J: Endothelial dysfunction: cardiovascular risk factors, therapy, and outcome. Vasc Health Risk Manag 2005;1:183-198. May LT, Torcia G, Cozzolino F, Ray A, Tatter SB, Santhanam U, Sehgal PB, Stern D: Interleukin-6 gene expression in human endothelial cells: RNA start sites, multiple IL-6 proteins and inhibition of proliferation. Biochem Biophys Res Commun 1989;159:991-998. Merika M, Orkin SH: DNA-binding specificity of GATA family transcription factors. Mol Cell Biol 1993;13:3999-4010. Dorfman DM, Wilson DB, Bruns GA, Orkin SH: Human transcription factor GATA-2. Evidence for regulation of preproendothelin-1 gene expression in endothelial cells. J Biol Chem 1992;267:1279-1285. Veres A, Prohaszka Z, Kilpinen S, Singh M, Fust G, Hurme M: The promoter polymorphism of the IL-6 gene is associated with levels of antibodies to 60-kDa heat-shock proteins. Immunogenetics 2002;53:851-856. De la Vega FM, Lazaruk KD, Rhodes MD, Wenz MH: Assessment of two flexible and compatible SNP genotyping platforms: TaqMan SNP Genotyping Assays and the SNPlex Genotyping System. Mutat Res 2005;573:111-135. Aird WC: Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circ Res 2007;100:158-173. Fust G, Arason GJ, Kramer J, Szalai C, Duba J, Yang Y, Chung EK, Zhou B, Blanchong CA, Lokki ML, Bodvarsson S, Prohaszka Z, Karadi I, Vatay A, Kovacs M, Romics L, Thorgeirsson G, Yu CY: Genetic basis of tobacco smoking: strong association of a specific major histocompatibility complex haplotype on chromosome 6 with smoking behavior. Int Immunol 2004;16:1507-1514. Toth EK, Kocsis J, Madaras B, Biro A, Pocsai Z, Fust G, Blasko B, Karadi I, Adany R, Laki J: The 8.1 ancestral MHC haplotype is strongly associated with colorectal cancer risk. Int J Cancer 2007;121:1744-1748. Laki J, Kiszel P, Vatay A, Blasko B, Kovacs M, Korner A, Madacsy L, Blatniczky L, Almassy Z, Szalai C, Rajczy K, Pozsonyi E, Karadi I, Fazakas A, Hosszufalusi N, Panczel P, Arason GJ, Wu YL, Zhou B, Yang Y, Yu CY, Fust G: The HLA 8.1 ancestral haplotype is strongly linked to the C allele of 429T>C promoter polymorphism of receptor of the advanced glycation
90
121.
122. 123.
124.
125. 126. 127.
128. 129. 130. 131. 132. 133. 134.
endproduct (RAGE) gene. Haplotype-independent association of the -429C allele with high hemoglobinA1C levels in diabetic patients. Mol Immunol 2007;44:648-655. Harcos P, Laki J, Kiszel P, Szeplaki Z, Szolnoki Z, Kovacs M, Melegh B, Szeplaki G, Fust G, Blasko B: Decreased frequency of the TNF2 allele of TNFalpha -308 promoter polymorphism is associated with lacunar infarction. Cytokine 2006;33:100-105. Barton JC, Bertoli LF, Acton RT: HLA-A and -B alleles and haplotypes in 240 index patients with common variable immunodeficiency and selective IgG subclass deficiency in central Alabama. BMC Med Genet 2003;4:3. Price P, Witt C, Allcock R, Sayer D, Garlepp M, Kok CC, French M, Mallal S, Christiansen F: The genetic basis for the association of the 8.1 ancestral haplotype (A1, B8, DR3) with multiple immunopathological diseases. Immunol Rev 1999;167:257-274. Bertorelli G, Bocchino V, Zhuo X, Chetta A, Del Donno M, Foresi A, Testi R, Olivieri D: Heat shock protein 70 upregulation is related to HLA-DR expression in bronchial asthma. Effects of inhaled glucocorticoids. Clin Exp Allergy 1998;28:551-560. Schroeder S, Reck M, Hoeft A, Stuber F: Analysis of two human leukocyte antigen-linked polymorphic heat shock protein 70 genes in patients with severe sepsis. Crit Care Med 1999;27:1265-1270. Berra A, Dutt JE, Nouri M, Foster CS: Heat shock protein expression in human conjunctiva. Invest Ophthalmol Vis Sci 1994;35:352-357. Takahashi K, Kubo T, Goomer RS, Amiel D, Kobayashi K, Imanishi J, Teshima R, Hirasawa Y: Analysis of heat shock proteins and cytokines expressed during early stages of osteoarthritis in a mouse model. Osteoarthritis Cartilage 1997;5:321-329. Hegedus CM, Skibola CF, Bracci P, Holly EA, Smith MT: Screening the human serum proteome for genotype-phenotype associations: an analysis of the IL6 174G>C polymorphism. Proteomics 2007;7:548-557. Heinrich PC, Behrmann I, Haan S, Hermanns HM, Muller-Newen G, Schaper F: Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation. Biochem J 2003;374:1-20. Hirano T, Ishihara K, Hibi M: Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene 2000;19:2548-2556. Bajramovic JJ, Bsibsi M, Geutskens SB, Hassankhan R, Verhulst KC, Stege GJ, de Groot CJ, van Noort JM: Differential expression of stress proteins in human adult astrocytes in response to cytokines. J Neuroimmunol 2000;106:14-22. Inoue T, Node K: Vascular failure: A new clinical entity for vascular disease. J Hypertens 2006;24:2121-2130. Yoshida S, Sotozono C, Ikeda T, Kinoshita S: Interleukin-6 (IL-6) production by cytokine-stimulated human Muller cells. Curr Eye Res 2001;22:341-347. Martin MU, Wesche H: Summary and comparison of the signaling mechanisms of the Toll/interleukin-1 receptor family. Biochim Biophys Acta 2002;1592:265280.
91
11 Saját közlemények jegyzéke Értekezésben összefoglalt saját közlemények I. Kiszel P, Fust G, Pessi T, Hurme M, Prohaszka Z. Associations between Interleukin-6 genetic polymorphisms and levels of autoantibodies to 60-kDa heat-shock proteins. Human Heredity 2006; 62:77-83; IF: 2.051 II. Kiszel P , Mako V, Prohaszka Z, Cervenak L. Interleukin-6 -174 promoter polymorphism does not influence IL-6 production after LPS and IL-1beta stimulation in human umbilical cord vein endothelial cells. Cytokine 2007 Oct; 40 (1): 17-22; IF: 2.355 III. Kiszel P, Kovacs M, Szalai C, Yang Y, Pozsonyi E, Blasko B, Laki J, Prohaszka Z, Fazakas A, Panczel P, Hosszufalusi N, Rajczy K, Wu YL, Chung EK, Zhou B, Blanchong CA, Vatay A, Yu CY, Fust G. Frequency of carriers of 8.1 ancestral haplotype and its fragments in two Caucasian populations. Immunol Invest. 2007; 36 (3): 307-19; IF: 1.276 Értekezés témájában megjelent egyéb közlemények IV. Harcos P, Laki J, Kiszel P, Szeplaki Z, Szolnoki Z, Kovacs M, Melegh B, Szeplaki G, Fust G, Blasko B. Decreased frequency of the TNF2 allele of TNFalpha -308 promoter polymorphism is associated with lacunar infarction. Cytokine 2006 Jan; 33(2):100-5; IF: 2.355 V. Laki J, Kiszel P, Vatay A, Blasko B, Kovacs M, Korner A, Madacsy L, Blatniczky L, Almassy Z, Szalai C, Rajczy K, Pozsonyi E, Karadi I, Fazakas A, Hosszufalusi N, Panczel P, Arason GJ, Wu YL, Zhou B, Yang Y, Yu CY, Fust G. The HLA 8.1 ancestral haplotype is strongly linked to the C allele of -429T>C promoter polymorphism of receptor of the advanced glycation endproduct (RAGE) gene. Haplotype-independent association of the -429C allele with high hemoglobin(A1C) levels in diabetic patients. Mol. Immunol. 2007 Jan; 44 (4): 648-55; IF: 4.768 Más témában megjelent közlemények VI. Fust A, Veres A, Kiszel P, Nagy ZZ, Cervenak L, Csakany B, Maka E, Suveges I, Grus FH. Changes in tear protein pattern after photorefractive keratectomy. Eur J Ophthalmol. 2003 Jul; 13(6): 525-31; IF: 0.519
92
12 Köszönetnyilvánítás Elsősorban szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Füst György professzor úrnak, aki lehetőséget adott arra, hogy kutatólaboratóriumában dolgozhassam, valamint lelkesedésével és támogatásával nagymértékben segítette munkámat. Nagyon sokat köszönhetek Cervenak Lászlónak, aki egyetemista éveimtől kezdve tanított a következetes kísérlettervezésre, a pontos laboratóriumi munkára, a logikus adatkiértékelésre, érthető előadások elkészítésére. Köszönöm, hogy végig hasznos tanácsokkal javította ki munkámat. Köszönettel tartozom Prohászka Zoltánnak, aki szintén végigkísérte laboratóriumi munkámat. Sokat segített nagy adatbázisok statisztikai kiértékelésében, igényes közlemények megírásában. Köszönöm Szalai Csabának, hogy laboratóriumában újabb genetikai módszereket sajátíthattam el. Köszönöm Mikko Hurme professzor úrnak, hogy finnországi laboratóriumában hasznos tapasztalatokat szerezhettem. Külön köszönet Kovács Margitnak és Szigeti Antalnénak, akik fáradságot nem kímélve nagyban segítették a nagy esetszámú kísérletek elvégzését. Köszönet a jóhangulatú közös munkákért Makó Veronikának, Mindlerné Weiszhár Zsókának, Czúcz Juditnak, Keszei Mártonnak és Veres Amarillának. Köszönet minden társszerzőnek, hogy munkájukkal, kísérleteikkel, javaslataikkal hozzájárultak az eredmények publikálásához. Köszönöm Gergely Péter és Mandl József professzor uraknak, hogy helyet biztosítottak számomra az Elméleti és Klinikai Immunológia Doktori Iskola programban. Hálával tartozom a Kutatólaboratórium összes dolgozójának, a PhD hallgatóknak, a többi asszisztenseknek és a könyvtárosoknak. Végül, de nem utolsó sorban köszönetet szeretnék mondani családomnak és barátaimnak, akik végig mellettem álltak.
93
