Česká zemědělská univerzita v Praze

Česká zemědělská univerzita v Praze Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra genetiky a šlechtění

Tvorba a molekulární detekce somatických hybridů bramboru s vyšší odolností k plísni bramboru Disertační práce

Doktorand: Ing. Vladimíra Sedláková Školitel: Doc. Dr. Ing. Pavel Vejl Školitel specialista: Ing. Petr Sedlák, Ph.D.

2010

Ráda bych touto cestou poděkovala mému školiteli Doc. Dr. Ing. Pavlu Vejlovi a školiteli specialistovi Ing. Petru Sedlákovi, Ph.D. za jejich přátelský přístup, cenné informace, rady a tvůrčí myšlenky, které vedly k získání výsledků a k úspěšnému vypracování disertační práce. Dále bych chtěla poděkovat všem členům kolektivu Katedry genetiky a šlechtění za přínosné připomínky a náměty k zamyšlení, které obohatily tuto práci. Můj dík patří také všem pracovníkům genové banky při Výzkumném ústavu bramborářském v Havlíčkově Brodě, s.r.o. za poskytnutí cenných informací, biologického materiálu, za realizaci infekčních testů a jejich hodnocení a za zařazení v této práci získaných somatických hybridů bramboru do kolekce genotypů v genové bance. Dále děkuji členům Katedry chemie Ing. Kateřině Hejtmánkové a Ing. Vladimíru Pivcovi, CSc. Za pomoc při stanovení obsahu glykoalkaloidů v hlízách jednotlivých genotypů. V neposlední řadě bych ráda poděkovala Mgr. Pavle Suchánkové, Ph.D. z ÚEB AV v Olomouci a Mgr. Ing. Pavlu Trávníčkovi z Botanického ústavu AV ČR, v.v.i. v Průhonicích za umoţnění analýz vybraných genotypů metodou průtokové cytometrie. Výsledky byly získány s podporou projektu výzkumu a vývoje NAZV MZe ČR QF 4107 „Vývoj metod identifikace a charakterizace donorů rezistence k plísni bramboru z genofondu bramboru pomocí DNA markerů a biologického testu in vitro“; projektu FRVŠ 2232/06 „Inovace vybavení genetické laboratoře pro výuku předmětů zaměřených na aplikaci molekulární

genetiky

a

biotechnologií

v

zemědělství“;

výzkumného

záměru

MSM6046070901 „Setrvalé zemědělství, kvalita zemědělské produkce, krajinné a přírodní zdroje“ a interního grantu 21360/1312/3136 „Studium variability organelové DNA u vybraných diploidních druhů rodu Solanum pomocí nekódujících oblastí“.

2

Obsah 1

ÚVOD................................................................................................................................................... 14

2

LITERÁRNÍ PŘEHLED ..................................................................................................................... 15 2.1 ROD SOLANUM ................................................................................................................................. 15 2.1.1 Taxonomické třídění ................................................................................................................. 15 2.1.2 Původ ....................................................................................................................................... 15 2.1.3 Cytogenetická charakteristika................................................................................................... 16 2.1.4 EBN (Endosperm balance number) ............................................................................................ 17 2.2 LILEK BRAMBOR (SOLANUM TUBEROSUM L.) ................................................................................... 18 2.2.1 Původ a historie........................................................................................................................ 19 2.2.2 Ekonomické aspekty pěstování bramboru v České republice ...................................................... 21 2.2.3 Škodlivé faktory ovlivňující pěstování bramboru ........................................................................ 22 2.3 PLÍSEŇ BRAMBORU ........................................................................................................................... 24 2.3.1 Taxonomické zařazení .............................................................................................................. 25 2.3.2 Způsob rozmnožování ............................................................................................................... 25 2.3.3 Původ Phytophthora infestans .................................................................................................. 26 2.3.4 Epidemiologie........................................................................................................................... 27 2.3.5 Fyziologické rasy Phytophthora infestans .................................................................................. 28 2.4 ŠLECHTĚNÍ NA REZISTENCI K PLÍSNI BRAMBORU .............................................................................. 29 2.4.1 Specifická a nespecifická rezistence .......................................................................................... 30 2.4.2 Hypersenzitivní a extrémní rezistence ....................................................................................... 31 2.4.3 R geny rezistence ...................................................................................................................... 31 2.5 VYBRANÉ GENOVÉ ZDROJE REZISTENCE K PLÍSNI BRAMBORU A JEJICH CHARAKTERISTIKA ............ 34 2.5.1 Solanum bulbocastanum Dun. .................................................................................................. 34 2.5.2 Solanum berthaultii Hawkes. .................................................................................................... 35 2.5.3 Solanum pinnatisectum Bitt. ..................................................................................................... 35 2.5.4 Solanum polyadenium Greenm. ................................................................................................ 36 2.5.5 Solanum microdontum Bitt. ...................................................................................................... 36 2.5.6 Solanum vernei Firbas and Ross. ............................................................................................... 36 2.5.7 Solanum verrucosum Schlechtd................................................................................................. 37 2.6 SOMATICKÁ HYBRIDIZACE BRAMBORU ............................................................................................. 37 2.6.1 Protoplasty rostlin .................................................................................................................... 37 2.6.2 Historie protoplastových kultur ................................................................................................. 38 2.6.3 Fúze protoplastů ...................................................................................................................... 39 2.7 MOŢNOSTI DETEKCE SOMATICKÝCH HYBRIDŮ ................................................................................. 40 2.7.1 Morfologické a cytologické metody detekce somatických hybridů ............................................. 40 2.8 BIOCHEMICKÉ METODY DETEKCE SOMATICKÝCH HYBRIDŮ ............................................................. 42 2.8.1 Steroidní glykoalkaloidy............................................................................................................ 42 2.9 MOLEKULÁRNĚ GENETICKÉ METODY DETEKCE SOMATICKÝCH HYBRIDŮ ........................................ 45 2.9.1 Charakteristika rostlinného genomu ......................................................................................... 45 2.9.2 Genom somatického hybrida .................................................................................................... 46 2.9.3 Analýza DNA ............................................................................................................................ 47 2.9.4 Detekce somatických hybridů pomocí transgenů ....................................................................... 47

3

VĚDECKÉ HYPOTÉZY ..................................................................................................................... 48

4

CÍLE PRÁCE....................................................................................................................................... 49

5

MATERIÁL A METODY ................................................................................................................... 50 5.1 ROSTLINNÝ MATERIÁL ..................................................................................................................... 50 5.2 OPTIMALIZACE METOD IZOLACE PROTOPLASTŮ .............................................................................. 51 5.2.1 Izolace protoplastů z mezofylu listů .......................................................................................... 51 5.2.2 Vliv složení médií pro kultivaci výchozího materiálu na výtěžnost a viabilitu protoplastů ............ 52

3

5.3 VÝBĚR VÝCHOZÍHO MATERIÁLU VHODNÉHO PRO SOMATICKOU HYBRIDIZACI ................................. 53 5.3.1 Fenotypové zhodnocení odolnosti klonů k Phytophthora infestans ............................................ 53 5.3.2 Výběr vhodných genotypů z hlediska izolace protoplastů........................................................... 54 5.4 TVORBA SOMATICKÝCH HYBRIDŮ .................................................................................................... 54 5.4.1 Fúze protoplastů ...................................................................................................................... 54 5.4.2 Kultivace a regenerace protoplastových kultur .......................................................................... 55 5.5 ANALÝZY DNA PRO DETEKCI SOMATICKÝCH HYBRIDŮ .................................................................... 56 5.5.1 RAPD analýza ........................................................................................................................... 56 5.5.2 Analýza jaderné DNA................................................................................................................ 56 5.5.3 Analýza chloroplastové a mitochondriální DNA ......................................................................... 57 5.5.3.1 5.5.3.2 5.5.3.3 5.5.3.4

Výběr vhodných univerzálních primerů .......................................................................................... 57 Optimalizace podmínek amplifikace ............................................................................................... 58 Detekce variability ......................................................................................................................... 58 Stanovení sekvencí vybraných markerů .......................................................................................... 60

5.6 DETEKCE SOMATICKÝCH HYBRIDŮ ................................................................................................... 60 5.6.1 Morfologické a cytologické metody detekce somatických hybridů ............................................. 61 5.6.1.1 5.6.1.2

5.6.2

Morfologické hodnocení ................................................................................................................ 61 Detekce stupně ploidie .................................................................................................................. 61

Molekulárně genetické metody detekce somatických hybridů ................................................... 63

5.6.2.1 5.6.2.2

RAPD analýza ................................................................................................................................ 63 Analýza chloroplastového markeru Cp4.......................................................................................... 63

CHARAKTERISTIKA VYBRANÝCH VLASTNOSTÍ SOMATICKÝCH HYBRIDŮ Z HLEDISKA VYUŢITELNOSTI VE ŠLECHTĚNÍ BRAMBORU ......................................................................................................................... 63 5.7

5.7.1 5.7.2 5.7.3

Fenotypové zhodnocení odolnosti somatických hybridů k Phytophthora infestans ..................... 63 Tvorba a výnosový potenciál hlíz ............................................................................................... 64 Předpoklady pro sexuální křížení ............................................................................................... 64

5.7.3.1

5.7.4 6

Viabilita pylových zrn ..................................................................................................................... 64

Orientační stanovení obsahu solaninu a chaconinu v hlízách ..................................................... 65

VÝSLEDKY A DISKUZE .................................................................................................................. 66 6.1 OPTIMALIZACE METOD IZOLACE PROTOPLASTŮ .............................................................................. 66 6.1.1 Izolace protoplastů z mezofylu listů .......................................................................................... 66 6.1.2 Vliv složení médií pro kultivaci výchozího materiálu na výtěžnost a viabilitu protoplastů ............ 67 6.2 VÝBĚR VÝCHOZÍHO MATERIÁLU VHODNÉHO PRO SOMATICKOU HYBRIDIZACI ................................. 71 6.2.1 Fenotypové zhodnocení odolnosti klonů k Phytophthora infestans ............................................ 71 6.2.2 Výběr vhodných genotypů z hlediska izolace protoplastů........................................................... 72 6.3 TVORBA SOMATICKÝCH HYBRIDŮ .................................................................................................... 74 6.3.1 Fúze, kultivace a regenerace protoplastových kultur ................................................................. 74 6.4 ANALÝZY DNA PRO DETEKCI SOMATICKÝCH HYBRIDŮ .................................................................... 77 6.4.1 RAPD analýza ........................................................................................................................... 77 6.4.1.1

6.4.2 6.4.3

Detekce somaklonální variability .................................................................................................... 80

Analýza jaderné DNA................................................................................................................ 81 Analýza chloroplastové a mitochondriální DNA ......................................................................... 83

6.4.3.1 6.4.3.2 6.4.3.3

Optimalizace podmínek amplifikace ............................................................................................... 83 Detekce variability ......................................................................................................................... 84 Stanovení sekvencí vybraných markerů .......................................................................................... 94

6.5 DETEKCE SOMATICKÝCH HYBRIDŮ ................................................................................................. 102 6.5.1 Morfologické a cytologické metody detekce somatických hybridů ........................................... 102 6.5.1.1 6.5.1.2

6.5.2

Morfologické hodnocení .............................................................................................................. 102 Detekce stupně ploidie ................................................................................................................ 107

Molekulárně genetické metody detekce somatických hybridů ................................................. 112

6.5.2.1 6.5.2.2

RAPD analýza .............................................................................................................................. 112 Analýza chloroplastového markeru Cp4........................................................................................ 113

CHARAKTERISTIKA VYBRANÝCH VLASTNOSTÍ SOMATICKÝCH HYBRIDŮ Z HLEDISKA VYUŢITELNOSTI VE ŠLECHTĚNÍ BRAMBORU ....................................................................................................................... 114 6.6

6.6.1 6.6.2 6.6.3

Fenotypové zhodnocení odolnosti somatických hybridů k Phytophthora infestans ................... 114 Tvorba hlíz a výnosový potenciál ............................................................................................. 115 Předpoklady pro sexuální křížení ............................................................................................. 121

6.6.3.1

Viabilita pylových zrn ................................................................................................................... 122

4

6.6.4

Orientační stanovení obsahu solaninu a chaconinu v hlízách ................................................... 125

7

ZÁVĚR............................................................................................................................................... 130

8

PŘEHLED CITOVANÉ LITERATURY .......................................................................................... 132 8.1 8.2

9

CITACE INTERNETOVÝCH PUBLIKACÍ ............................................................................................. 157 INTERNETOVÉ DATABÁZE ............................................................................................................... 157

PŘÍLOHY .......................................................................................................................................... 158

5

Přehled obrázků Obrázek 1: Schéma průtokové komory (upraveno dle Doleţel et al., 2007) .......................... 41 Obrázek 2: Biochemická syntéza steroidních glykoalkaloidů α – solaninu a α – chaconinu (upraveno dle Krits et al., 2007) ......................................................................... 45 Obrázek 3: Graf závislosti koncentrace uvolněných protoplastů na čase během působení celulolytických enzymů ...................................................................................... 66 Obrázek 4: Solanum bulbocastanum PIS 54 kultivované in vitro na médiu s koncentrací Alaru 85 5 mg.l-1 s AgNO3 7,5 mg.l-1 (vpravo) a 0 mg.l-1 (vlevo) ................................. 71 Obrázek 5: Shluková analýza genotypů na základě amplifikace RAPD markerů primerem OPN 18 .............................................................................................................. 78 Obrázek 6: Detekce polymorfismů DNA genotypů rodu Solanum primerem OPN 11 ........... 79 Obrázek 7: Shluková analýza genotypů na základě RAPD markerů (primer OPN 11) ........... 79 Obrázek 8: Morfologické porovnání S. pinnatisectum PI275235 (vlevo) a S. polyadenium PI310963 (vpravo) ............................................................................................. 80 Obrázek 9: Detekce somaklonální variability sadou RAPD primerů OPN ............................. 81 Obrázek 10: Detekce polymorfismů jaderné DNA u genotypů rodu Solanum restrikčním štěpením produktů CAPS markeru SPUD237 enzymem AluI ............................. 82 Obrázek 11: Detekce polymorfismů jaderné DNA u genotypů rodu Solanum restrikčním štěpením produktů CAPS markeru GP21 enzymem AluI .................................... 83 Obrázek 12: Variabilita PCR produktů markeru Cp3 (trnL/trnL) .......................................... 84 Obrázek 13: Restrikční štěpení PCR produktu markeru Mt5 (cox1/cox1) enzymem HinfI .... 86 Obrázek 14: Restrikční štěpení PCR produktu markeru Cp3 (trnL/trnL) enzymem BsuRI (HaeIII).............................................................................................................. 87 Obrázek 15: Detekce polymorfismů mtDNA u genotypů rodu Solanum markerem Mt3 (rrn5/rrn18-1) pomocí metody SSCP .................................................................. 88 Obrázek 16: Elektroforeogram perpendikulárního gelu pro analýzu PCR produktů markeru Mt3 (rrn5/rrn18-1).............................................................................................. 89 Obrázek 17: Elektroforeogram perpendikulárního gelu pro analýzu PCR produktů markeru Cp4 (trnL/trnF)................................................................................................... 90 Obrázek 18: Elektroforeogram perpendikulárního gelu pro analýzu PCR produktů markeru Cp7 (trnV/16SrRNA) ......................................................................................... 91 Obrázek 19: Variabilita PCR produktů markeru Cp4 (trnL/trnF) detekovaná pomocí CDGE analýzy............................................................................................................... 92 6

Obrázek 20: Dendrogram sestavený na základě podobnosti PCR produktů markeru Cp4 (trnL/trnF) analyzovaných metodou CDGE ........................................................ 93 Obrázek 21: Variabilita PCR produktů markeru Cp7 (trnV/16SrRNA) detekovaná pomocí CDGE analýzy ................................................................................................... 94 Obrázek 22: Výsledky sekvenace produktů markeru Cp3 ..................................................... 98 Obrázek 23: Výsledky sekvenace produktů markeru Cp4 ................................................... 100 Obrázek 24: Morfologické srovnání genotypů ve skleníkovém pokusu, dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum 165 (vlevo), S. bulbocastanum PIS 66 (vpravo) a jejich somatický hybrid (uprostřed) ........................................................................................... 103 Obrázek 25: Morfologické srovnání genotypů v polním pokusu, a) a b) S. bulbocastanum PIS 17 (2n) a REG 5 (4n); c) dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum 165 (2n); d), e) a f) somatické hybridy REG 30 F, REG 34 F a REG 43 F (všechny 4n) .............. 104 Obrázek 26: Morfologické srovnání listů ............................................................................ 105 Obrázek 27: Morfologické srovnání květů, a), b) somatický hybrid REG 43 F; c), d) Solanum bulbocastanum PIS 61; e), f) dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum 165 ......... 106 Obrázek 28: Výstup cytologického vyšetření genotypu Solanum bulbocastanum PIS 61 (2n) získaný z průtokového cytometru Partec PAS (Německo). Dva píky představují obsah DNA v jádrech v G1 a G2 fázi buněčného cyklu .................................... 109 Obrázek 29: Výstup cytologického vyšetření genotypu somatického hybrida REG 50 F (4n) získaný z průtokového cytometru Partec PAS (Německo). Dva píky představují obsah DNA v jádrech v G1 a G2 fázi buněčného cyklu .................................... 110 Obrázek 30: Výstup analýzy rozptylu dvojného třídění dokumentující rozdíly mezi měřenými hodnotami stomatárních buněk rostlin s různým počtem chromozomů ............. 111 Obrázek 31: Porovnání velikostí svěracích buněk průduchů a počtu chloroplastů v těchto buňkách u diploidního a tetraploidního genotypu ............................................. 112 Obrázek 32: RAPD analýza PCR produktů primeru OPN 11 u somatických hybridů a jejich rodičovských komponent.................................................................................. 113 Obrázek 33: Výsledky sekvenace produktů markeru Cp4 pro detekci dědičnosti cytoplasmy u somatických hybridů ........................................................................................ 114 Obrázek 34: Jednoletý polní pokus na pokusném poli České zemědělské univerzity v lokalitě Praha 6 – Suchdol ............................................................................................ 118 Obrázek 35: Morfologické srovnání hlíz ............................................................................. 119

7

Obrázek 36: Sklizeň hlíz v polním pokusu dne 20.10.2009; a) dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165; b) somatický hybrid REG 43 F; c) Solanum bulbocastanum PIS 61 .............................................................................................................. 121 Obrázek 37: Viabilita pylových zrn stanovená barvením Lugolovým roztokem; a) S. bulbocastanum REG 5 (4n); b) somatický hybrid REG 43 F (4n) ..................... 125 Obrázek 38: Hlíza somatického hybrida REG 43 F ............................................................. 127 Obrázek 39: Souhrnná analýza obsahu solaninu a chaconinu u genotypu Solanum bulbocastanum PIS 61 metodou kapalinové chromatografie. Největší peak interpretuje celkový obsah solaninu a chaconinu v hlízách v čerstvém stavu..... 128 Obrázek 40: Souhrnná analýza obsahu solaninu a chaconinu u genotypu somatického hybrida REG 44 F metodou kapalinové chromatografie. Největší peak interpretuje celkový obsah solaninu a chaconinu v hlízách v čerstvém stavu .................................... 129

8

Přehled tabulek Tabulka 1: Procentické zastoupení odrůd bramboru v jednotlivých stupních ranosti z hlediska odolnosti k plísni bramboru v nati a v hlízách (Čermák, 2010) ........................... 30 Tabulka 2: Dosud popsané majorgeny rezistence bramboru k Phytophthora infestans .......... 33 Tabulka 3: Sekvence primerů CAPS markerů GP21 a SPUD 237 ......................................... 57 Tabulka 4: Sloţení reakční směsi pro markery SPUD237 a GP21 ......................................... 57 Tabulka 5: Podmínky průběhu PCR reakcí markerů SPUD237 a GP21................................. 57 Tabulka 6: Charakteristika vybraných cpDNA a mtDNA primerů ........................................ 58 Tabulka 7: Analýza rozptylu hlavních efektů vyhodnocená komplexně pro všechny měřené znaky ................................................................................................................. 67 Tabulka 8: Podrobné vyhodnocení Tukeyho metodou, kde proměnná je průměrná délka rostliny a třídícím faktorem druh ........................................................................ 68 Tabulka 9: Podrobné vyhodnocení Tukeyho metodou, kde proměnná je průměrná délka rostliny a třídícím faktorem koncentrace Alaru 85 a AgNO3 ............................... 68 Tabulka 10: Podrobné vyhodnocení Tukeyho metodou, kde proměnná je průměrný počet listů na 1 rostlině a třídícím faktorem druh ................................................................. 69 Tabulka 11: Podrobné vyhodnocení Tukeyho metodou, kde proměnná je průměrná hmotnost čerstvé biomasy na 1 cm délky rostliny a třídícím faktorem koncentrace Alaru 85 a AgNO3 ............................................................................................................ 70 Tabulka 12: Statistické hodnocení infekčních testů u 66 genotypů Solanum bulbocastanum . 72 Tabulka 13: Seznam genotypů vybraných pro somatickou hybridizaci na základě infekčních testů odolnosti vůči Phytophthora infestans ........................................................ 74 Tabulka 14: Počet a původ rostlin vzniklých in vitro regenerací z protoplastových kultur ..... 76 Tabulka 15: Výsledky restrikčního štěpení mtDNA a cpDNA markerů (štěpení při 37°C) .... 85 Tabulka 16: Vybrané charakteristiky analyzovaných druhů rodu Solanum ............................ 93 Tabulka 17: Výsledky stanovení stupně ploidie metodou průtokové cytometrie .................. 108 Tabulka 18: Orientační hodnocení výnosového potenciálu hlíz somatických hybridů v polních pokusech v letech 2009 a 2010 ......................................................................... 120 Tabulka 19: Viabilita pylových zrn stanovená barvením Lugolovým roztokem .................. 123 Tabulka 20: Statistické hodnocení viability pylu analýzou rozptylu jednoduchého třídění... 124 Tabulka 21: Hodnoty obsahu solaninu a chaconinu v hlízách.............................................. 127

9

Přehled příloh Příloha 1: Druhy rodu Solanum: S. bulbocastanum, S. microdontum, S. pinnatisectum a S. polyadenium ....................................................................................................... 158 Příloha 2: Druhy rodu Solanum: S. berthaulti, dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum, S. vernei a S. verrucosum........................................................................................ 159 Příloha 3: Chemické sloţení roztoků pro izolaci, kultivaci a regeneraci protoplastových kultur modifikovaných dle Cheng a Saunders (1995) .................................................... 160 Příloha 4: a) protoplasty před čištěním; b) test viability; c) Bürkerova počítací komůrka; d) prstenec nativních protoplastů ............................................................................ 161 Příloha 5: a) Phytophthora infestans; b) infekční testy in vitro rostlin; c) infekční testy metodou listových terčíků; d) detail nekrózy na listu .......................................... 162 Příloha 6: a) elektroporátor BTX; b) Petriho miska s fúzní komorou; c) řetízkování protoplastů; d) fúzované protoplasty 15 minut po elektrofúzi .............................. 163 Příloha 7: Izolace DNA pomocí DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, SRN) ............................. 164 Příloha 8: Koncentrace uvolněných protoplastů z 1 g naváţky z mezofylu listů při působení celulolytických enzymů ...................................................................................... 165 Příloha 9: Výsledky hodnocení růstových paramertů rostlin při charakterizaci vlivu sloţení kultivačních médií .............................................................................................. 166 Příloha 10: Výsledky hodnocení paramertů izolace protoplastů rostlin při charakterizaci vlivu sloţení kultivačních médií .................................................................................. 167 Příloha 11: Výsledky infekčních testů metodou listových terčíků........................................ 168 Příloha 12: Regenerace protoplastových kultur: a) 12. den; b) 14. den; c) 20. den; d) 70. den; e) 145. den a f) 165. den kultivace ...................................................................... 170 Příloha 13: a) S. bulbocastanum 66; b) dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum 165; c) somatické hybridy vzniklé jejich fúzí; d) a e) somatický hybrid REG 28 starý 14 a 30 dnů ................................................................................................................ 171 Příloha 14: Charakterizace 25 parametrů u rostlin v polním pokusu pomocí klasifikátoru pro rod Solanum (Vidner et al., 1987) ....................................................................... 172 Příloha 15: Výsledky měření délky svěracích buněk průduchů a stanovení počtu chloroplastů u somatického hybrida REG 34 F (4n) ................................................................ 174 Příloha 16: Výsledky měření délky svěracích buněk průduchů a stanovení počtu chloroplastů u genotypu Solanum bulbocastanum PIS 17 (2n) ................................................ 175

10

Příloha 17: Výsledky měření délky svěracích buněk průduchů a stanovení počtu chloroplastů u dihaploidního genotypu Solanum tuberosum ssp. tuberosum DH 387 (2n) ....... 176 Příloha 18: Výsledky měření délky svěracích buněk průduchů a stanovení počtu chloroplastů u genotypu Solanum tuberosum ssp. tuberosum R10 (4n) ................................... 177 Příloha 19: Hodnocení vybraných parametrů hlíz z polního a skleníkového pokusu pomocí klasifikátoru pro rod Solanum (Vidner et al., 1987) ............................................ 178

11

Seznam pouţitých zkratek ATP = adenosintrifosfát CAPS = Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (délkový polymorfismus restrikčně štěpené amplifikované DNA) CDGE = Constant Denaturing Gel Electrophoresis (konstantní denaturační gelová elektroforéza) CMS = Cytoplasmic Male Sterility (cytoplasmatická pylová sterilita) Cms = Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, původce bakteriální krouţkovitosti bramboru cpDNA = deoxyribonukleová kyselina uloţená v chloroplastech DAPI = 4-6-diamidin-2-phenylindol (C16H15N5), modré fluorescenční barvivo DGGE = Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (denaturační gradientová gelová elektroforéza) dNTP = deoxynukleotid-5´-trifosfát (obecně) EBN = Endosperm Balance Number EDTA = ethylendiamintetraoctová kyselina ETS = External Transcribed Spacer (vnější přepisovaný mezerník) EU = Evropská unie EVIGEZ = Evidence genových zdrojů FAO = Food and Agriculture Organization GMO = geneticky modifikovaný organismus GTP = guanosintrifosfát HMGR = 3-hydroxy-3-methylglutaryl koenzym A reduktáza LGT agarose = Low Gelling Temperature agarose (agaróza polymerizující při nízkých teplotách) IRa, IRb = dvě dlouhé invertované repetice chloroplastové DNA LRR = Leucine-Rich Repeat sequence (repetitivní sekvence bohalé na triplety kodující aminokyselinu leucin) LSC = Large Single Copy (rozsáhlá oblast v chloroplastové DNA obsaţená pouze v jedné kopii) LZ = leucinový zip mtDNA = deoxyribonukleová kyselina uloţená v mitochondriích NBS = Nucleotide Binding Site (nukleotidové vazebné místo) 12

NCBI = National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/ ORF = Open Reading Frame (otevřený čtecí rámec) PCR = Polymerase Chain Reaction (polymerázová řetězová reakce) PEG = polyethylenglykol PLVR = Potato Leaf-Roll Virus (virus svinutky bramboru) PSS1 = skvalen syntáza PVA = Potato Virus A PVM = Potato Virus M PVS = Potato Virus S PVS1 = vetispiradien (seskviterpen) cykláza PVX = Potato Virus X PVY = Potato Virus Y RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA (náhodná amplifikace polymorfní DNA ) RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism (délkový polymorfismus restrikčních fragmentů) RuBP = ribulósa-1,5-bisfosfát karboxyláza SGT1 = solanidin galaktosyltransferáza SGT2 = solanidin glukosyltransferáza SGT3 = rhamnosyltransferáza SMT1 = sterol C24-methyltransferáza typu 1 SNP = Single Nucleotide Polymorphism (jednonukleotidový polymorfismus) SSC = Small Single Copy (malá oblast v chloroplastové DNA obsaţená pouze v jedné kopii) SSCP = Single Strand Conformation Polymorphism (detekce jednovláknového konformačního polymorfismu) TAE = Trisacetátový pufr (SAMBROOK et al., 1989) Taq polymeráza = termostabilní DNA polymeráza bakterie Thermus aquaticus TBE = tris-borátový pufr (SAMBROOK et al., 1989) TE = Tris-EDTA pufr (SAMBROOK et al., 1989) UPGMA = Unweighted Pair Group Method with Arithmetic averages (metoda párování pomocí neváţených aritmetických průměrů) VB = Velká Británie

13

1 ÚVOD Brambory jsou celosvětově čtvrtou nejvýznamnější plodinou z hlediska lidské výţivy. Jako potravina mají širokou oblast vyuţití, která je národnostně specifická. Brambory dále představují strategickou surovinu pro výrobu škrobu, který v Evropské unii podléhá, stejně jako cukr, produkčním kvótám. Jako jakákoliv jiná zemědělská plodina je i brambor napadán řadou chorob a škůdců. Celosvětově ekonomicky nejdůleţitější a nejškodlivější chorobou je plíseň bramboru, jejímţ původcem je oomyceta Phytophthora infestans. Nejpouţívanější a nejúčinnější ochranou proti ní je pouţití chemické ochrany, která je finančně náročná a její nadměrné pouţívání vede k zatěţování ţivotního prostředí a zemědělských produktů rezidui fungicidů. Vzhledem k tomu, ţe současným celosvětovým trendem je program integrované ochrany rostlin, je snaha chemickou ochranu omezovat na ekonomicky a ekologicky únosnou úroveň. S tímto trendem se posiluje postavení rezistentního šlechtění u naprosté většiny zemědělských plodin. V rezistentním šlechtění bramboru jsou často vyuţívány genetické zdroje rodu Solanum, které nejsou mnohdy s kulturním bramborem v přímém fylogenetickém vztahu, ale poskytují široké spektrum genů rezistence k celé řadě klíčových chorob a škůdců. Obecně je však šlechtění bramboru na odolnost k patogenům často komplikováno neschopností vybraných kombinací rodičů poskytnout vitální potomstvo s odpovídající úrovní poţadované rezistence k patogenu. Jisté moţnosti v této oblasti přináší vyuţití technik elektrochemické fúze rostlinných protoplastů, které se uplatňují v dalších oblastech vědy a výzkumu. Při získávání somatických hybridů je také nezbytná jejich detekce. Morfologicko-anatomická identifikace umoţňuje specifikovat genotyp pouze orientačně. Metody molekulární analýzy DNA představují jednu z moţností detekce nejen somatických hybridů. V současné době se nabízí celá řada molekulárně genetických metod umoţňujících studium rostlinné DNA na úrovni jaderné i organelové DNA. Tato práce se zabývá tvorbou a detekcí somatických hybridů bramboru, jeţ mohou vznikat fúzí bramboru s nekulturními druhy rodu Solanum jako donory genů rezistence k Phytophthora infestans a následnou regenerací protoplastových kultur. Výsledky fúze protoplastů mohou být vysoce variabilní. Můţe docházet k homofúzi nebo heterofúzi (jader i cytoplasmy) nebo jenom určitých buněčných částí. Proto je potřebné z hlediska zachycení moţných rekombinací analyzovat somatické hybridy komplexně po všech stránkách – morfologické, cytologické i molekulárně genetické.

14

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Rod Solanum 2.1.1 Taxonomické třídění Rod Solanum L. obsahuje více neţ 1000 druhů, které se vyskytují po celém světě. Vzhledem ke stále ne zcela objasněným evolučním a fylogenetickým vztahům mezi jednotlivými druhy v rámci tohoto rodu existují i různá taxonomická třídění. Nejznámějším a nejpouţívanějším je třídění dle Hawkes (1990). V rámci rodu Solanum je definován podrod Potatoe obsahující sekci Petota, která je ekonomicky nejdůleţitější sekcí rodu. Druhy patřící do sekce Petota jsou rozšířené v oblasti od jihozápadu USA aţ po jiţní Chile a Argentinu. Sekce Petota je dále rozdělena na dvě subsekce. První subsekce se nazývá Estolonifera Hawkes a zahrnuje celkem devět druhů rozdělených do dvou sérií Etuberosa a Juglandifolia. Ţádný z těchto druhů není schopen tvořit hlízy ani stolony (Hawkes, 1990). Druhy série Etuberosa lze do jisté míry kříţit s tuberizujícími druhy druhé subsekce, zatímco Juglandifolia ne (Hawkes, 1994; Jackson a Hanneman, 1999). Předpokládá se, ţe série Juglandifolia je blízce příbuzná rodu Lycopersicon (rajče) (Hawkes, 1994). Druhá subsekce se nazývá Potatoe G. Don a zahrnuje jeden netuberizující a 224 tuberizujících druhů rozdělených do 19 sérií (Morelliformia, Bulbocastana, Pinnatisecta, Polyadenia,

Commersoniana,

Circaeifolia,

Lignicaulia,

Olmosiana,

Yungasensa,

Megistacroloba, Cuneolata, Conicibaccata, Piurana, Ingifolia, Maglia, Tuberosa planá, Tuberosa kulturní, Acaulia, Longipedicellata a Demissa). Druhy tvořící hlízy byly ještě dodatečně rozděleny na dvě subsérie Stellata a Rotata podle typu květní koruny (Hawkes, 1994).

2.1.2 Původ Existují dvě geografická centra diverzity nekulturních brambor, Mexiko a Jiţní Amerika (Peru, Bolívie, severní Argentina) (Hijmans a Spooner, 2001). Mexiko je tradičně přijímáno jako místo původu tuberizujících brambor z důvodu, ţe jsou zde koncentrovány morfologicky nejprimitivnější druhy, pro něţ je charakteristické 1EBN (Endosperm Balance 15

Number). Hawkes (1990) se domnívá, ţe v tomto případě primitivní „Proto-Petota“ migrovaly z Jiţní Ameriky do Mexika nejpozději před 37 – 40 miliony let v době, kdy existoval jednotný kontinent a Severní a Jiţní Amerika byly spojeny. V centrální Americe se formovaly primitivní Stellata s charakteristickým 1EBN a některé genotypy pak migrovaly zpět do Jiţní Ameriky. Tato migrace nastala v časném Pleiocénu v době, kdy se formovala Panamská šíje, tedy před 3,5 miliony let. V Jiţní Americe se ze skupiny primitivní Stellata vyvinula odvozená Stellata a dále primitivní a odvozená Rotata. Podle této teorie by měly být všechny tuberizující druhy blízce příbuzné a zřetelně by se měly odlišovat od netuberizujících druhů (Hawkes, 1990). Volkov et al. (2003) molekulární analýzou vnějšího transkribovatelného mezerníku (External Transcribed Spacer - ETS) ribozomální DNA prokázal vyšší podobnost mezi zástupci serie Etuberosa a mexickými tuberizujícími druhy serie Petota subserie Stellata, neţ by tomu bylo při jejich separaci před 37 – 40 miliony let. Předpokládá se, ţe se tuberizující druhy pravděpodobně vyvinuly z netuberizujících druhů serie Etuberosa, které se vyskytují pouze v Jiţní Americe. Primitivní Petota tudíţ pocházejí z Jiţní Ameriky odkud někteří zástupci skupiny primitivní Stellata migrovali do Mexika, zatímco z ostatních, kteří zůstali v Jiţní Americe, se formovaly skupiny odvozená Stellata a primitivní a odvozená Rotata (Volkov et al., 2003). Tato teorie byla podpořena analýzou repetitivních satelitních částí genomu (Stadler et al., 1995) a analýzou chloroplastové DNA (Spooner a Castillo, 1997). Pokusy s mezidruhovým kříţením rovněţ podporují tuto teorii. Jihoamerická primitivní Stellata (S. circaeifolium) poskytují fertilní potomstvo sexuálním kříţením s druhem Solanum tuberosum (Louwes et al., 1992), zatímco mexická Stellata pouze somatickou hybridizací (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum) (Menke et al., 1996; Oberwalder et al., 1997; Helgelson et al., 1998).

2.1.3 Cytogenetická charakteristika Cytogenetické poměry druhů rodu Solanum jsou velmi pestré. Základní počet chromozómů je n = 12 (Hawkes a Hjerting, 1969). U rodu Solanum se vyskytuje okolo 70 % diploidních, 15 % tetraploidních a 8 % hexaploidních druhů. Umělou indukcí polyploidie se podařilo získat formy aţ 12n (2n = 144). Většina diploidních druhů je autosterilní, respektive autoinkompatibilní, a proto jsou allogamní a entomofilní. Část diploidních druhů je autofertilní. Triploidní druhy mají autotriploidní a allotriploidní povahu. To svědčí o rozdílném způsobu jejich vzniku, který 16

vede v kaţdém případě ke sterilitě. Jejich existence se zabezpečuje vegetativním rozmnoţováním. Tetraploidní druhy jsou autofertilní, respektive autokompatibilní, některé allogamní. Celý rod Solanum se vyznačuje značnou homologií genomů, a proto je relativně snadná syntéza diploidních, tetraploidních a hexaploidních genomů do fertilních hybridů (Hraška et al., 1989).

2.1.4 EBN (Endosperm balance number) V současné době je snaha rozšiřovat genofond bramboru o nové geny rezistence proti chorobám a škůdcům pomocí vzdálené hybridizace. Brambory jsou plodinou se zřejmě největším rozsahem genetické diverzity, obsaţené v příbuzných nekulturních druzích rodu Solanum (Hawkes a Jackson, 1992). U tuberizujících druhů rodu Solanum je tok genů limitován vnitřními bariérami omezujícími křiţitelnost. Tyto bariéry lze rozdělit do dvou skupin: (1) pre-zygotická bariéra, která je zaloţena na mechanismu tzv. pylovo – pestíkové inkompatibility (Grun a Aubertin, 1966) a (2) post-zygotická bariéra, kde hraje jednu z nejdůleţitějších rolí endosperm (Johnston et al., 1980). Endosperm balance number (EBN) je geneticky podmíněná, dávkově závislá schopnost kříţení fungující u tuberizujících druhů rodu Solanum (Bamberg a Hanneman, 1990). Johnston et al. (1980) uvádí, ţe EBN determinuje efektivní stupeň ploidie a identifikuje EBN jako izolační mechanismus omezující přílišné kříţení v přirozených populacích lilků. V důsledku kříţení druhů s nekompatibilním EBN dochází k disbalanci endospermu semen a tím ke sníţení vitality embryí. Pro tvorbu fertilních semen je třeba, aby byl poměr mateřské a otcovské komponenty při oplození 2 : 1. Hodnota

EBN

koreluje

s předpokládanou

evolucí

a

současnou

taxonomií

tuberizujících druhů bramboru (Hawkes a Jackson, 1992). V rámci rodu Solanum se vyskytují tři skupiny druhů, lišící se v tomto ukazateli o stavu endospermu. Tyto skupiny se na první pohled liší například uspořádáním květní koruny (Hawkes, 1994). Mexické i jihoamerické druhy patřící do skupiny primitivní Stellata kvetou bíle a je pro ně charakteristické 1EBN. Evoluce typu květní koruny charakteristické pro skupinu Rotata je pravděpodobně spojena s endospermem typu 2EBN, který vznikl v Jiţní Americe (Hawkes a Jackson, 1992). Lilek brambor (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) patří do skupiny 4EBN a je dle této teorie nejlépe křiţitelný s autotetraploidními druhy S. gourlai, S. sucrense, S. tuberosum ssp. andigena a allohexaploidy ze série Demissa (S. demissum). Většina allotetraploidních 17

druhů rodu Solanum přísluší k 2EBN, diploidní druhy vykazují ve většině případů příslušnost k 1EBN. Druhy s 1EBN se snadno kříţí v rámci skupiny, mimo ni pouze vzácně. Po sníţení tetraploidního počtu chromozómů bramboru S. tuberosum ssp. tuberosum se sniţuje rovněţ EBN, coţ je výhodné při vzdálené hybridizaci s 2EBN druhy (Hawkes, 1994). Ve vztahu k výše uvedenému je EBN pouze jednou ze součástí komplexního systému regulace mezidruhové hybridizace v rámci rodu Solanum (Masuelli a Camadro, 1997). Dalším faktorem, který kromě EBN ovlivňuje evoluci polyploidních druhů je tvorba tzv. 2n gamet. Tyto gamety mají počet chromozómů shodný se somatickou buňkou a vznikají v důsledku modifikované meiozy, která ovlivňuje specifická stádia mikro a megasporogeneze (Carputo et al., 2003). Vzájemné splývání 2n gamet vede ke vzniku tetraploidních genotypů (Laptev, 1988).

2.2 Lilek brambor (Solanum tuberosum L.) Brambory patří mezi nejdůleţitější polní plodiny na světě. Lilek brambor, brambor obecný (Solanum tuberosum L.) je řazen do čeledi lilkovité (Solanaceae Pers.), rodu lilek (Solanum Tourn.), podrodu Potatoe, sekce Petota, subsekce Potatoe a série Tuberosa. Z genetického hlediska se jedná o autotetraploid (2n = 4x = 48), který prošel dlouhodobým vývojem po mezidruhové hybridizaci (Slavík et al., 2000; Bradshaw a Mackay, 1994). Archeologické pozůstatky brambor byly radiokarbonovou metodou datovány do doby před 7000 lety, je však pravděpodobné, ţe brambory byly domestikovány ještě před tímto datem (Hawkes, 1994). V průběhu rané domestikace se předpokládá, ţe došlo ke kříţení druhů Solanum leptophyes a S. canasense. Člověk v této době začal provádět negativní selekce zaměřené na vyloučení rostlin s hořkými hlízami bohatými na toxické alkaloidy. Tímto způsobem pak vznikaly první kulturní diploidní druhy, jako je například Solanum stenotomum. Předpokládá se, ţe kříţením S. stenotomum x S. sparsipilum nebo S. stenotomum x neznámý hybrid a následnou diploidizací genomu na tetraploidní úroveň vznikl druh S. tuberosum ssp. andigena (Bradshaw a Mackay, 1994). Solanum tuberosum spp. tuberosum pravděpodobně pochází z kříţení spp. andigena jako donora pylu s neznámým nekulturním druhem, který měl v mitochondriích kódovány faktory pro cytoplasmatickou pylovou sterilitu anebo měl výrazně se odlišující typ plastidové DNA (Grun, 1990). Naprostá většina současných odrůd bramboru botanicky přísluší k poddruhu tuberosum. Existují i odrůdy taxonomicky řazené k poddruhu Solanum tuberosum ssp. andigena nebo ke druhu Solanum chacoense. Těchto odrůd je však malý počet a svůj význam 18

mají zejména v oblastech Jiţní Ameriky jako donory různých vlastností v hybridizačních programech (Rybáček et al., 1988).

2.2.1 Původ a historie Kulturní brambor (Solanum tuberosum L.) zahrnuje vysoce variabilní skupinu moderních odrůd, které se pěstují po celém světě (Spooner et al., 2005). Vavilov ve své studii o původu kulturních rostlin z roku 1928 prokázal, ţe centrum původu kulturních plodin bylo nalezeno v těch oblastech, kde byla nejvyšší diverzita, a kde byl nalezen největší počet endemických znaků (Hawkes, 1944). Z tohoto důvodu je původ kulturního bramboru kladen do Jiţní Ameriky, kde Vavilov stanovil dvě genová centra, první andské v Peru a Bolívii a druhé v oblasti Chile (Hruška et al., 1974). První centrum leţí na území severní Bolívie a v jiţním Peru v okolí jezera Titicaca a přilehlých územích okolo 15° j.š. v nadmořské výšce 1500-4300 m (Hawkes, 1944). Tato oblast se nachází v podmínkách krátkého dne, na lehkých půdách, se značnými rozdíly mezi denní a noční teplotou, pravidelnými sráţkami a vysokou vzdušnou vlhkostí. Andské centrum je místem vzniku řady druhů bramboru, z nichţ nejvýznamnější je tetraploidní Solanum tuberosum spp. andigena, který se obecně povaţuje za předka běţného bramboru Solanum tuberosum spp. tuberosum. Solanum stenotomum je nejprimitivnější z kulturních diploidních druhů bramboru, a je povaţován za předka celé řady druhů jako například Solanum tuberosum spp. andigena, Solanum phureja a Solanum stenotomum spp. goniocalyx (Hawkes, 1990). Druhé centrum – chiloánské – leţí v oblasti Chile na ostrově Chiloé v oblasti 40° j.š. Zde jsou podmínky dlouhého dne s mírnými zimami a chladnými léty, přímořské klima s vysokými sráţkami, vysokou vzdušnou vlhkostí a niţšími teplotami (Hruška et al., 1974). Brambory byly do Evropy poprvé dovezeny v roce 1562 na Kanárské ostrovy. Z ostrova Gran Canaria byly exportovány do Antwerp v listopadu roku 1567 a z ostrova Tenerife přes Gran Canaria do Rouen v roce 1574 (Hawkes a Francisco-Ortega, 1993), odkud se rozšířily do celé Evropy a později do celého světa (Hawkes, 1990). Existují dvě hypotézy o oblasti původu prvních brambor introdukovaných do Evropy. Juzepczuk a Bukasov (1929) navrhovali Chile (skupina Chilotanum). Tato hypotéza byla dokládána morfologickou podobností mezi chilským a evropským bramborem a jejich adaptabilitou na dlouhou délku dne. Salaman (1937) navrhl andskou oblast (skupina Andigenum). Tuto hypotézu podporovala většina autorů. Hawkes (1944) uvádí, ţe kulturní brambor pochází od jezera 19

Titicaca – Cuzco z oblasti severní Bolívie a jiţního Peru (Andy), protoţe lze v této oblasti nalézt největší variabilitu druhů a forem, vlastnících mnoho endemických znaků. Tento region byl rovněţ kolébkou peruánských indiánských civilizací, které měly vyspělou kulturu dříve, neţ byly dobyty Španěly. První evropské brambory byly adaptovány na tvorbu hlíz za krátkého 12 hodinového dne v Andách a ne při dlouhém dni 16 – 18 hodin, jako tomu je u současných brambor. Ze španělských archivů je známo, ţe první evropské brambory byly adaptovány na krátký den, tvořily hlízy v prosinci a lednu patrně v oblastech bez mrazu v jiţním Španělsku a Itálii (Hawkes a Francisco-Ortega, 1992). Neúmyslná selekce, která v Evropě trvala několik století, zapříčinila adaptaci kulturního bramboru na dlouhý den. Tato selekce byla kompletní na přelomu 18. a 19. století, coţ umoţnilo pěstovat brambory ve střední a východní Evropě (Hawkes, 1994). Krajové odrůdy bramboru z těchto dvou oblastí mohou být odlišitelné, ačkoliv někdy obtíţně, pomocí faktorů cytoplasmatické pylové sterility - CMS (Cytoplasmic Male Sterility), morfologie, adaptace na délku dne, mikrosatelitních markerů a markerů chloroplastové (cp) a mitochondriální (mt) DNA (Spooner et al., 2005). Hosaka (1995) prokázal pomocí analýzy restrikčně štěpené chloroplastové DNA u diploidních kulturních a nekulturních druhů rodu Solanum rozsáhlý polymorfismus ve všech taxonech. To znamená, ţe andské diploidní kulturní brambory byly domestikovány mnohokrát z nekulturních druhů s následnou sexuální polyploidizací za vzniku tetraploidních kulturních brambor. Chilské přirozené variety tetraploidního Solanum tuberosum byly pravděpodobně selektovány z omezené podskupiny genofondu andských tetraploidních brambor někde blízko bolívijské a argentinské hranice. Jedna z reliktních odrůd Myatt’s Ashleaf, která se v Evropě dochovala po rané introdukci, obsahuje typ chloroplastové DNA totoţný s druhem Solanum tuberosum ssp. andigenum. Současné odrůdy však mají typ cp DNA shodný s chilským druhem S. tuberosum ssp. tuberosum. Hosaka a Hanneman (1988) uvádějí, ţe většina odrůd odvozených ze ssp. andigenum byla zničena během epidemie plísně bramboru v 19. století. Tyto odrůdy pak byly nahrazeny genotypy ssp. tuberosum pocházejícími z Chile. Z tohoto důvodu mají současné běţné odrůdy typ cp DNA totoţný s chilským Solanum tuberosum ssp. tuberosum. Ríos et al. (2007) ověřovali obě hypotézy, andskou a chilskou, pomocí analýzy jaderných mikrosatelitů a chloroplastové DNA u krajových odrůd Kanárských ostrovů. Byla zde detekována široká variabilita andských a chilských kultivarů i jejich moţných hybridů. Tato data ve spojení s historickými, molekulárními, agronomickými daty a daty z kříţení vedou k vyslovení hypotézy, ţe na Kanárských ostrovech proběhla mnohonásobná introdukce andského i chilského genofondu, a ţe tedy první evropské brambory byly selektovány 20

z rostlin introdukovaných z chilské oblasti dávno předtím, neţ vypukla epidemie plísně bramboru v roce 1840. Obdobnými metodami byly testovány indické odrůdy, u kterých se předpokládalo, ţe jsou odvozeny pouze z andských krajových odrůd. Výsledky prokazují přítomnost cp DNA typické pro andské i chilské krajové odrůdy, popřípadě jejich hybridy (Spooner et al., 2005).

2.2.2 Ekonomické aspekty pěstování bramboru v České republice V roce 2009 bylo v ČR podle údajů ČSÚ sklizeno celkem 36 722 ha brambor, z toho v zemědělském sektoru 28 734 ha a v rámci samozásobení domácností 7 988 ha. Celková produkce brambor dosáhla 928,8 tis. t. V zemědělském sektoru bylo sklizeno 752,5 tis. t. a v sektoru domácností 176,3 tis. t. Proti sklizni v roce 2008 se jednalo o meziroční pokles o 1,7 %, konkrétně o 16,5 tis. t. Celkovou niţší sklizeň brambor ovlivnilo především sníţení osázených ploch brambor proti předchozímu roku o 1 094 ha, tj. pokles o 2,9 %. Průměrný hektarový výnos v roce 2009 25,29 t.ha-1 byl srovnatelný s rokem 2008 25,00 t.ha-1. Spotřeba brambor na obyvatele činila v roce 2008 přibliţně 62,1 kg na osobu, přičemţ ještě v předchozích letech 2000 aţ 2005 spotřeboval průměrný Čech v průměru 74,4 kg brambor za rok. V České republice, stejně jako ve většině vyspělých zemí klesá spotřeba syrových brambor ke kuchyňské přípravě a je doplňována vysokou nabídkou polotovarů i hotových bramborových výrobků. Podle předběţných údajů tvoří brambory spotřebované na výrobky a polotovary jiţ 43 % z celkové spotřeby brambor v lidské výţivě. V roce 2009 provedla Státní zemědělská a potravinářská inspekce kontrolu 769 vzorků konzumních brambor. Právním předpisům nevyhovělo celkem 147 šarţí, tj. 19,1 %. Státní rostlinolékařská správa při průzkumu výskytu původce bakteriální krouţkovitosti bramboru (Cms) z tuzemské produkce brambor ze sklizně v roce 2009 z celkového počtu 2 782 vzorků sadbových brambor zjistila výskyt Cms v 7 testovaných vzorcích. Ze 767 vzorků odebraných z partií nesadbových brambor byl prokázán výskyt Cms u 2 vzorků. Dovoz sadbových brambor v souladu se zákonem č. 219/2003 Sb. činil 5 167 t v roce 2009 oproti 8 539 t v roce 2008. V roce 2009 bylo vyvezeno 6 032 t sadbových brambor oproti 4 404 t brambor vyvezených v roce 2008. Do uznávacího řízení bylo v roce 2008 přihlášeno 209 odrůd. Na ploše větší neţ 100 ha se však pěstovalo pouze 8 odrůd (Adéla, Dali, Impala, Magda, Marabel, Ornella, Princess a Rosara). V roce 2009 došlo oproti roku 2008 ke sníţení přihlášených mnoţitelských ploch sadbových brambor, ale uznaná plocha byla větší neţ v roce 2008, coţ svědčí o dobrém 21

zdravotním stavu sadby. Z hlediska zdravotního stavu bylo neuznáno pouze 4,2 % mnoţitelských ploch, zatímco v roce 2008 bylo neuznáno 19,7 % ploch. V závěru roku 2009 byla schválena novela zákona 219/2003 Sb., o oběhu osiva a sadby a následně vstoupila v platnost i nová vyhláška č. 369/2009 Sb., o podrobnostech uvádění osiva a sadby do oběhu. Významnou změnou je specifikace kategorií rozmnoţovacího materiálu a počtu generací. Na výrobu bramborového škrobu bylo v roce 2009 zpracováno 136,6 tis. t brambor. Průměrný výnos brambor určených k výrobě škrobu činil 33,0 t.ha -1 při škrobnatosti 18,70 %. Celkem bylo vyrobeno 29 618 t bramborového škrobu, tuzemským škrobárnám byla k dispozici národní výrobní kvóta ve výši 33 660 t. Dne 2. 3. 2010 Evropská komise povolila pěstování geneticky modifikované odrůdy bramboru pod názvem Amflora v EU pro průmyslové pouţití a také vyuţití vedlejších produktů škrobu z těchto brambor jako krmivo. V roce 2010 se nepředpokládají výrazné změny v celkových osázených plochách brambor (Ţiţka, 2010). Organizace spojených národů vyhlásila rok 2008 na základě návrhu FAO Mezinárodním rokem brambor. Tato akce měla zdůraznit důleţitost vyuţití brambor pro výţivu obyvatel v tzv. „rozvojových zemích třetího světa“. Na evropském kontinentě se spotřebuje čtyřikrát více brambor neţ v rozvojových zemích i přes to, ţe v posledních 40 letech se v těchto oblastech konzumace brambor zdvojnásobila, na rozdíl od Evropy, kde se naopak spotřeba sníţila (Ţiţka, 2008).

2.2.3 Škodlivé faktory ovlivňující pěstování bramboru Brambory patří mezi plodiny, které jsou napadány celou řadou chorob. Poškozovány jsou jimi jak nadzemní, tak i podzemní orgány bramboru. Poškození listů a stonků rostlin představuje redukci asimilační plochy a tím i negativní dopad na výnosy. Poškození kořenů a stolonů obvykle negativně ovlivňuje další růst rostliny, coţ se opět záporně projeví na výši výnosu. Výskyt chorob na hlízách ovlivňuje negativně jejich kvalitu, v některých případech je můţe i úplně znehodnotit. Choroby brambor mohou být původu fyziologického, virového, bakteriálního a houbového. Někdy mohou být způsobeny i viroidy a mykoplasmami (Vokál et al., 2004). Nejvyšší redukci výnosu způsobují zejména choroby virového původu. Mezi těţké virové choroby brambor patří onemocnění způsobené viry PVY (Potato Virus Y), PVA (Potato Virus A) a virem svinutky bramboru PLRV (Potato Leaf-Roll Virus). K lehkým 22

virovým chorobám jsou řazena onemocnění způsobená viry PVS (Potato Virus S), PVX (Potato Virus X) a PVM (Potato Virus M) (Rasocha et al., 2008). Mimořádně škodlivé jsou směsné infekce, kdy je rostlina bramboru napadena více viry (Vokál et al., 2003). Opomíjeným virem byl donedávna virus PVS, který byl povaţován za latentní a neškodný, nicméně se v posledních letech začínají uplatňovat postupy tzv. bezvirózního šlechtění. Virus S se stává velice problematickým, zejména z hlediska certifikace rozmnoţovacího materiálu bramboru a obchodu s ním v rámci Evropské unie (Ptáček a Dědič, 2003). V současné době je jeho výskyt při mnoţení sadby v České republice hodnocen pouze u základní sadby přepočtovým koeficientem 0,05 %. U certifikované sadby hodnocen není (Rasocha et al., 2008). Mezi významné patogeny patří rovněţ karanténní bakterie, zejména Cms (Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus Spieckermann et Kotthoff), která se rozšířila hlavně díky neuváţeným dovozům sadby ze zahraničí a je jedním z limitních faktorů ve výrobě rozmnoţovacího materiálu (Kůdela et al., 2002). Vzhledem k efektivní kontrole výskytu tohoto patogena a jeho eradikaci se v současné době vyskytuje v České republice vyjímečně (Kůdela, 2007). Teplomilná Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. je rovněţ karanténní bakterií, jejíţ výskyt u nás zatím nebyl potvrzen. Významnou bakteriózou (aktinomykózou) je aktinomycetová obecná strupovitost bramboru, jejímţ původcem je patogen Streptomyces scabies (Thaxter) Lambert et Loria a další blízce příbuzné druhy rodu Streptomyces (St-Onge et al., 2008). Mezi původce houbových chorob patří například Rhizoctonia solani Kühn, Alternaria solani (Ellis a Martin) Sorauer., rod Fusarium a Pythium (komplex skládkových chorob) a Colletotrichum coccodes (Wallr.) Hughes., způsobující vadnutí (Rasocha et al., 2004). V souvislosti

s kvalitou

mytých

hlíz

v posledních

letech

nabývá

na

významu

Helminthosporium solani Dur. et Mont., původce stříbřitosti slupky hlíz bramboru, která je poměrně hojně rozšířená (Sedláková et al., 2008). Na významu ztrácí chytridie Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc., zejména významně se na její postupné eradikaci podílí důsledná karanténa a rezistentní šlechtění (Rasocha et al., 2004). Obecně nejvýznamnějším patogenem bramboru je oomyceta Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, původce plísně bramboru. Tato dizertační práce se zabývá vyuţitím somatické hybridizace bramboru pro účely zvýšení odolnosti k Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Na bramboru se rovněţ vyskytuje i celá řada škůdců, kteří mohou parazitovat na nadzemních či podzemních částech rostlin. Škodit mohou přímo poţerem či sáním, nebo nepřímo a to tím, ţe mohou přenášet virové choroby nebo vzniklá poškození mohou být 23

vstupní branou pro řadu bakteriálních a houbových chorob. Výše škod závisí na řadě faktorů, především pak na populační dynamice škůdce, na průběhu klimatických a vegetačních podmínek, na pěstované odrůdě, agrotechnice, výţivě a především na způsobu ochrany, kterou zvolí pěstitel (Vokál et al., 2000).

2.3 Plíseň bramboru Pravé plísně (Oomycetes) představují skupinu eukaryotních organismů, které jsou morfologicky podobné, ale fylogeneticky odlišné od pravých hub (Qutob et al., 2006). Původcem plísně bramboru je oomyceta Phytophthora infestans. Je ekonomicky nejdůleţitější a nejškodlivější choroba brambor. Ročně působí ztráty několika biliónů dolarů a je celosvětovou hrozbou pěstitelů brambor (Cooke a Lees, 2004). Patogen zřejmě pochází z centrálního Mexika (Zimmoch-Guzowska et al., 2003). V polovině 19. století se dostal do USA a Evropy, kde zdevastoval řadu úrod – nejvíce známá je kalamita, která vedla k hladomoru v Irsku v roce 1845 (Smart a Fry, 2001). Phytophthora infestans je hemibiotrofní patogen, který napadá ţivé části rostlin z čeledi Solanaceae.

Hospodářsky významně parazituje zejména na bramboru a rajčeti.

Způsobuje léze s nekrotickými buňkami uprostřed, obklopenými prstencem pletiva, které se jeví jako zdravé, ale ve skutečnosti je napadené patogenem. Během vegetace můţe tato oomyceta zcela zničit, za příznivých podmínek počasí, během 10 aţ 15 dní bramborovou nať a ztráty na výnosu mohou v letech epidemického výskytu dosáhnout aţ 50 % a dokonce i 70 % (Tymčenko a Jefronová, 1987). V praxi se ochrana proti tomuto patogenu skládá z pěstitelských opatření, ošetření porostů fungicidy a likvidace natě mechanicky nebo chemicky. Všechna obecně doporučovaná opatření a zásahy proti chorobě musí být vţdy upřesněna podle konkrétních podmínek pro kaţdý porost zvlášť (Rasocha et al., 2008).

24

2.3.1 Taxonomické zařazení Taxonomická zařazení tohoto patogena se různí. Například Kalina a Váňa (2005) vycházejí ze studie Cavalier-Smith z roku 1986: Doména:

Eukarya (syn. Eukaryonta)

Říše:

Chromista (syn. Straminipila)

Podříše:

Chromobiothae

Kmen:

Bigyra

Podkmen:

Pseudofungi

Oddělení:

Peronosporomycota (syn. Oomycota)

Třída:

Peronosporomycetes (syn. Oomycetes)

Podtřída:

Peronosporomycetidae

Řád:

Pythiales

Čeleď:

Pythiaceae

Rod:

Phytophthora

Druh:

Phytophthora infestans

2.3.2 Způsob rozmnoţování Phytophthora infestans se rozmnoţuje dvěma způsoby – sexuálně (tvoří oospóry) a asexuálně (sporangia). Epidemie plísně bramboru jsou způsobené populační explozí prostřednictvím asexuálního rozmnoţování (Smart a Fry, 2001). V případě asexuálního rozmnoţování patogen přezimuje v napadených hlízách v místě oček (Vokál et al., 2004). Ţivotní cyklus P. infestans při nepohlavním rozmnoţování, tedy cyklus od tvorby jednoho sporangia k tvorbě následného sporangia probíhá sedm hodin. Phytophthora infestans je heterothalický organismus (Erwin a Ribeiro, 2005). Sexuální rozmnoţování všeobecně vyţaduje přítomnost dvou pohlavních typů A1 a A2 (Smart a Fry, 2001). Výsledkem jejich „kopulace“ jsou oospory, které mají v půdě poměrně značnou ţivotnost. Oba pohlavní typy se vyznačují rozdílným obsahem DNA, A1 typ má významně vyšší obsah DNA oproti typu A2. Výhodnější pro tohoto patogena je polyploidní genom, protoţe je lépe adaptován na chladnější podmínky a zároveň zaručuje širší moţnosti virulence (Sansome, 1977).

25

Také v České republice byl potvrzen výskyt obou pohlavních typů. V letech 2003 – 2006 byl tento poměr průměrně 68 : 32 % ve prospěch pohlavního typu A1 (Hausvater et al., 2007). Obecně lze říci, ţe pohlavní rozmnoţování má pro P. infestans řadu výhod, které se promítají do ochrany proti tomuto původci plísně bramboru. Oospory mohou odstartovat infekci v přítomnosti hostitele kdykoliv během vhodných podmínek pro rozvoj patogena, a tak vytvářet časnější a rozsáhlejší ohniska plísně bramboru. Oospory pravděpodobně infikují listy ve spodních patrech listového pokryvu a jsou tak chráněny před aplikací fungicidů. V nepříznivých podmínkách během vegetačního období plodiny mohou oospory přeţívat na listech a stoncích. Jakmile jsou opět vytvořeny vhodné podmínky pro rozvoj patogena, mohou iniciovat další infekce (Drenth et al., 1995). Následkem pohlavního rozmnoţování vznikají geneticky variabilnější populace P. infestans, které jsou spojeny s tvorbou nových agresivních ras schopných překonávat hostitelskou rezistenci a spolehlivé účinné látky fungicidů (Cooke et al., 2003).

2.3.3 Původ Phytophthora infestans V panmiktické populaci patogena jsou očekávány ekvivalentní frekvence pohlaví v souladu s Hardy – Weinbergovým zákonem. Poměr mezi oběma pohlavními typy 50 : 50 % byl prokázán pouze u populace plísně vyskytující se v Mexiku (Cooke et al., 2003). Za centrum původu P. infestans je proto povaţována omezená oblast vysočiny centrálního Mexika, čímţ byla vyvrácena andská teorie o původu patogena z Jiţní Ameriky (Niederhauser, 1991). Otázkou ale zůstává původ evropské populace plísně. Vzhledem k tomu, ţe je plíseň bramboru vysoce destruktivní choroba, je velice nepravděpodobné, ţe by se v Evropě vyskytovala před rokem 1840, aniţ by byla zaznamenána. Je proto vysoce pravděpodobné, ţe ke všem migracím P. infestans na dlouhé vzdálenosti došlo během posledních 165 let (Goodwin, 1997). Předpokládalo se, ţe izoláty P. infestans nalezené v Evropě a ve zbývajících částech světa vyjma Mexika, mezi obdobím 1848 a polovinou sedmdesátých let 20. století, byly přímými potomky původní generace patogena, která byla původcem epidemie plísně bramboru ve čtyřicátých letech 19. století. Tato hypotéza byla dále podpořena výsledky analýzy pomocí DNA fingerprintingu, kde všechny analyzované izoláty z Evropy, Severní Ameriky a z velké části i z afrického a asijského kontinentu byly klony jedné linie (Goodwin 26

et al., 1994 b). Tato linie byla označena US-1 a náleţela k pohlavnímu typu A, tudíţ se tyto populace mohly rozmnoţovat pouze asexuálně (Goodwin et al., 1994 a). Díky tomuto zjištění vyvstalo několik hypotéz o migraci P. infestans do Evropy. Pokud by patogen migroval do Evropy z Mexika, kde je jeho populace vysoce variabilní, musel by podstoupit značnou genetickou redukci, aby se mohla celosvětově rozšířit pouze jedna linie klonu US-1. Genotyp US-1 však nebyl v mexické populaci Phytophthora infestans nalezen (Goodwin et al., 1994 b). Plíseň bramboru byla zaznamenána dříve neţ v 19. století v Peru, kde se do relativně nedávné doby vyskytoval pouze genotyp klonu US-1 (Tooley et al., 1989; Perez et al., 2001). Nabízí se tudíţ hypotéza, ţe migrace genotypu US-1 měla tři etapy; první z Mexika do Peru před několika staletími a později druhá z Peru do USA v letech 1841 – 1842. Do Evropy se poté P. infestans dostala z Peru, USA nebo z obou lokalit v letech 1843 – 1844 (Andrivon, 1996). Analýzou mitochondriální DNA u izolátů P. infestans byly identifikovány čtyři haplotypy Ia, Ib, IIa a IIb (Griffith a Shaw, 1998). Genotyp US-1, který byl podle výše uvedených teorií povaţován za původce epidemie ze čtyřicátých let 19. století, odpovídá haplotypu Ib (Ristaino, 2002). Sekvenační analýza dochovaných vzorků z epidemie z roku 1848 však prokázala, ţe byl pro tyto izoláty P. infestans charakteristický haplotyp Ia. To znamená, ţe genotyp linie US-1 pravděpodobně nebyl původcem této epidemie a do Evropy se rozšířil později na počátku 20. století z Ekvádoru a Bolívie (May a Ristaino, 2004). V sedmdesátých letech 20. století došlo v Evropě k rychlému vytlačení této populace novými izoláty, které byly přivezeny do Evropy z Mexika společně s dodávkou velkého mnoţství brambor, v důsledku neúrody v roce 1976. Společně s touto poslední migrací byl na evropský kontinent zavlečen pohlavní typ A2 a tím prudce vzrostla genetická diverzita patogena (Spielman et al., 1991). Kromě pohlavního typu A2 introdukovala tato migrace nové genotypy pohlavního typu A1, čímţ zásadně ovlivnila tok genů (Doleţal, 2006).

2.3.4 Epidemiologie Epidemiologie plísně vychází z primárního inokula, které přečkává nepříznivé podmínky vegetačního klidu na hlízách v místě oček (Vokál et al., 2004). Po výsadbě mycelium prorůstá do nadzemní části rostliny a za příznivých podmínek, obvykle na vegetačním vrcholu fruktifikuje (Rasocha et al., 2008). Sekundárně se patogen šíří vzdušným prouděním pomocí sporangií. Tato mnohojaderná sporangia klíčí buď přímo, nebo se rozpadají na pohyblivé dvoubičíkaté zoospory (Walker et al., 2008). Zoospory klíčí v kapce 27

vody při teplotě 9 – 25°C. Maximální vývoj lézí probíhá v teplotním rozpětí 17 – 25°C (Vokál et al., 2004). Příznaky se na listech objevují průměrně týden po infekci. Napadeny mohou být i stonky. Hlízy jsou infikovány sporangiemi, které jsou smývány deštěm z napadených nadzemních částí do půdy. Mnoţství napadených hlíz závisí na stupni napadení natě, mnoţství a intenzitě dešťových sráţek, na vrstvě zeminy kryjící hlízy, vlhkosti a struktuře půdy a na dalších faktorech. Snadno dochází k napadení hlíz, pokud se dostanou do styku s infikovanou natí při sklizni. Málo významné jsou infekce prostřednictvím stolonů z mateřské hlízy na hlízu dceřinou v půdě anebo při dotyku hlíz ve skladu (Rasocha et al., 2008). Epidemiologii plísně narušuje přirozená odolnost zajišťovaná introdukcí majorgenů rezistence nebo polní odolností, která je odezvou na souhru faktorů vnějšího prostředí a genetického základu odrůdy. Významně se projevuje i tzv. rezistence stářím, kdy patogen jen obtíţně napadá ontogeneticky starší části rostlin. Tato odolnost hraje významnou roli v ochraně rostlin a optimalizaci fungicidní ochrany (Vokál et al., 2004).

2.3.5 Fyziologické rasy Phytophthora infestans Virulence je stanovována na základě inokulace diferenciačních sad genotypů brambor různými izoláty P. infestans. Kaţdý diferenciační genotyp obsahuje specifický gen rezistence R, popřípadě kombinaci několika genů. Dle kompatibilní či nekompatibilní reakce hostitele a patogena jsou u izolátů stanovovány rasy. Tento systém identifikace ras patogena je zaloţen na 11 známých R genech vertikální rezistence získaných hybridizací bramboru se Solanum demissum (Ordoñez et al., 1997). R geny jsou děděny dle Mendelových zákonů dědičnosti jako jednoduché dominantní faktory (Abu-El Samen et al., 2003). Rasy jsou označeny číslem, které odpovídá R genu rezistence hostitele, který tato rasa překonává (Erwin et Eibeiro, 2005). Rasa 0 je avirulentní, coţ znamená, ţe kaţdá odrůda nesoucí jakýkoliv gen rezistence ze S. demissum nebude touto rasou napadena. Zatímco například rasa 6 obsahuje gen avirulence v recesivní sestavě (avr6) a je schopna napadat klony bramboru nesoucí pouze majorgen rezistence R6 (Ordoñez et al., 1997). V případě komplexu ras, který je virulentní a tudíţ schopný infikovat rostlinu s více neţ jedním genem rezistence, je tento komplex ras označen čísly všech R genů, které překonává (Erwin et Eibeiro, 2005). Jako první charakterizovali geny rezistence u rodu Solanum a jim odpovídající geny avirulence u Phytophthora infestans Black et al., (1953), kteří vycházeli z Florovy teorie gen proti genu (Flor, 1971). Specifičnost virulence je dána variabilitou faktorů virulence, elicitinů 28

(extracelulární bílkoviny patogena). Takovým elicitinem je například INF1 (Kamoun et al., 1999), jehoţ rozpoznání buňkami hostitelské rostliny indukuje buněčnou smrt (Kanzaki et al., 2008). Visker et al. (2003) uvádí, ţe vzhledem k rozšíření komlexních ras plísně ztrácí šlechtění na specifickou rezistenci účinnost. Významnou vlastností agresivních ras je jejich pozdnější nástup během vegetace. Zatímco na počátku vegetace se napadení účastní nespecializované rasy, rasy schopné překonávat geny rezistence se uplatňují jednoznačně aţ v polovině vegetační sezony (Zadina a Jermoljev, 1972). Tato skutečnost naznačuje, ţe rezistentní šlechtění proti plísni bramboru má význam zejména u odrůd s delší vegetační dobou.

2.4 Šlechtění na rezistenci k plísni bramboru Ve státní odrůdové knize ČR bylo pro rok 2010 zapsáno celkem 155 odrůd bramboru. Jednalo se o 34 velmi raných, 47 raných, 50 poloraných a 24 polopozdních aţ pozdních odrůd. České odrůdy byly v tomto sortimentu zastoupeny z 29,7 %. Z tohoto počtu bylo 104 odrůd testováno na odolnost k Phytophthora infestans (Tabulka 1). Ideální odrůda by měla být odolná vúči plísni bramboru v hlízách i v nati a pouze 4 odrůdy by v roce 2010 tuto podmínku splňovaly. Jednalo se o rané odrůdy Adéla a Poutník, o poloranou odrůdu Spirit a polopozdní aţ pozdní odrůdu Sibu. Ţádná z těchto odrůd však nevykazovala 100 % odolnost zároveň v nati a v hlízách (Čermák, 2010). Proto je snaha šlechtit odrůdy bramboru s co nejvyšším stupněm odolnosti k P. infestans.

29

Tabulka 1: Procentické zastoupení odrůd bramboru v jednotlivých stupních ranosti z hlediska odolnosti k plísni bramboru v nati a v hlízách (Čermák, 2010) Stupeň

Počet

ranosti

odrůd

Velmi rané

24

Rané

29

Polorané

34

Polopozdní pozdní

17

Odolné

Středně

Méně

Náchylné

(9-8)

odolné (7-6)

odolné (5-4)

(3-1)

nať

0%

12,5 %

62,5 %

25 %

hlízy

54,2 %

33,3 %

12,5 %

0%

nať

10,4 %

41,4 %

24,1 %

24,1 %

hlízy

51,7 %

48,3 %

0%

0%

nať

2,9 %

32,4 %

52,9 %

11,8 %

hlízy

82,4 %

17,6 %

0%

0%

nať

5,9 %

58,8 %

29,4 %

5,9 %

hlízy

76,5 %

23,5 %

0%

0%

Poškození

2.4.1 Specifická a nespecifická rezistence Současná rezistence komerčně vyuţívaných odrůd druhu Solanum tuberosum ssp. tuberosum L. vůči plísni bramboru má jak vertikální, tak i horizontální charakter (Bradshaw a Mackay, 1994). Specifická (vertikální) rezistence je rezistence proti určité rase patogena. Vyznačuje se poměrně vysokou úrovní rezistence, která je méně závislá na prostředí (ročnících, lokalitách pěstování), bývá však se vznikem nových virulentních ras překonávána. Jedná se o oligogenní rezistenci, která je řízena geny velkého účinku, majorgeny (Chloupek, 2008). Jako zdroj specifické (vertikální) rezistence pro kříţení se Solanum tuberosum ssp. tuberosum se pouţívá hexaploidní botanický druh Solanum demissum Lindl. (Wastie, 1991). Celkově bylo klasifikováno jedenáct R genů (R1 – R11) na základě vzájemné kompatibility a inkompatibility specifických ras a diferenciačních klonů (Malcolmson a Black, 1966). Nespecifická (horizontální) rezistence je rezistence, kdy je hostitel schopen vzdorovat většímu počtu ras patogena. Vyznačuje se poměrně niţší úrovní rezistence, která je více závislá na prostředí (ročník a lokalita, tj. především teplota a vlhkost vzduchu a půdy), nebývá však po vzniku nových ras patogena překonávána. Jedná se o polygenní rezistenci, která je řízena větším počtem genů s malým účinkem, minorgeny (Chloupek, 2008). Horizontální rezistence je hlavním cílem šlechtitelských programů na odolnost bramboru vůči P. infestans (Tian et al., 2006). Jako zdroje pro horizontální rezistenci se vyuţívá rovněţ druhu Solanum 30

demissum Lindl. (Malcolmson a Black, 1966), dále pak S. tuberosum spp. andigenum, S. stoloniferum (Bradshaw a Mackay, 1994) a S. phureja (Śliwka et al., 2006).

2.4.2 Hypersenzitivní a extrémní rezistence Hypersenzitivní rezistence (HR) je spojena s programovanou buněčnou smrtí v počátečním místě infekce (Morel a Dangl, 1997). Následně dochází k vytvoření malé nekrotizované oblasti, která zabrání dalšímu šíření patogena v rostlině (Procházka et al., 1998). Extrémní rezistence se projevuje bezpříznakovostí neboli imunitou napadené rostliny (Bendahmane et al., 1997).

2.4.3 R geny rezistence Mnoho R genů rozpoznává pouze limitovaný počet ras patogena a proto neposkytují široké spektrum rezistence. Rezistence rostliny je podmíněna přítomností dominantní sestavy daného R genu. Tyto geny kódují tzv. R proteiny, které jsou lokalizovány na vnější straně plazmatické membrány, mohou se však nacházet i v cytoplazmě. Vytvoření komplexu R proteinu rostliny s elicitorem patogena je signálem pro spuštění obranných reakcí (Pavlová, 2005). R proteiny jsou řazeny do několika superrodin. Rodiny jsou zaloţeny na proteinových doménách, které jsou bohaté na aminokyselinu leucin a anglicky se nazývají „leucine-rich repeat sequence“ (LRR) (McDowell a Woffenden, 2003). Tyto sekvence mají délku 20 aţ 29 aminokyselin a jsou přítomné ve velkém počtu proteinů s rozdílnou funkcí. Primární funkcí těchto sekvencí je poskytnutí univerzálního rámce pro vytvoření interakcí protein – protein (Kobe a Kajava, 2001). Některé R geny, které jsou běţně detekovány pouze tehdy, kdyţ rostliny vykazují specifickou rezistenci, mají funkční homology i v rostlinných druzích pro daný patogen nehostitelských (Goulden a Baulcombe, 1993). Obvykle se u těchto R proteinů vyskytuje také oblast schopná vázat nukleotidy, označovaná jako NBS (Nucleotide Binding Site). Navázání nukleotidu ATP nebo GTP je nutné pro přenos signálu, tyto komplexy mohou, ale nemusí mít kinázovou aktivitu. V typickém rostlinném genomu jsou přítomny četné geny pro NBS-LRR proteiny. Kaţdý protein je specificky zapojený v konkrétní signální dráze obranné odpovědi proti určitému patogennímu organismu. Často tato obranná reakce vyúsťuje v lokalizovanou buněčnou smrt,

31

tedy hypersenzitivní reakci. Některé typy NBS-LRR proteinů mají ještě strukturu leucinového zipu (LZ), coţ jim umoţňuje vázat na sebe další proteiny (Pavlová, 2005). Bradshaw a Mackay (1994) popisují genové zdroje rezistentní vůči Phytophthora infestans, jakými jsou Solanum berthaultii, S. bulbocastanum, S. circaeifolium, S. demissum, S. microdontum, S. phureja, S. pinnatisectum, S. polyadenium, S. stoloniferum, S. tariense, S. tuberosum ssp. andigenum, S. vernei a S. verrucosum. U řady z nich jiţ byly popsány majorgeny rezistence bramboru k Phytophthora infestans. Konkrétní R geny včetně jejich lokalizace jsou uvedeny v tabulce 2.

32

Tabulka 2: Dosud popsané majorgeny rezistence bramboru k Phytophthora infestans Majorgen rezistence

Původní výskyt

Lokalizace

R1

S. demissum

Chromozóm V

R2

S. demissum

Chromozóm IV

S. demissum

Chromozóm XI

S. demissum

Chromozóm ???

R3a, R3b, R6, R7 R4 R5, R8, R9, R10, R11

S. demissum

Chromozóm XI – alelická série s R3

Autor Leonard-Schippers et al. (1992) Li et al. (1998) Huang et al. (2005) El-Kharbotly et al. (1996) Nebyl dosud lokalizován Huang et al. (2005)

Rpi1

S. pinnatisectum

Chromozóm VII

Kuhl et al. (2001)

RB

S. bulbocastanum

Chromozóm VIII

Naess et al. (2000)

Rpi-blb1

S. bulbocastanum

Chromozóm VIII

Van der Vossen et al. (2003)

Rpi-blb2

S. bulbocastanum

Chromozóm VI

Van der Vossen et al. (2005)

Rpi- blb3

S. bulbocastanum

Chromozóm IV

Park et al. (2005a)

Rpi-abpt

S. bulbocastanum

Chromozóm IV

Park et al. (2005b)

Rpi-moc1

S. mochiquense

Chromozóm IX

Smilde et al. (2005)

Rpi-ber

S. berthaultii

Chromozóm X

Rauscher et al. (2006)

Rpi-ber1

S. berthaultii

Chromozóm X

Park et al. (2009)

Rpi-ber2

S. berthaultii

Chromozóm X

Park et al. (2009)

Rpi-phu1

S. phureja

Chromozóm IX

Śliwka et al. (2006)

Kuhl et al. (2001) uvádí, ţe gen Rpi1 ze S. pinnatisectum pravděpodobně korespodnuje s genem R9 ze S. demissum. Ballvora et al. (2002) blíţe specifikují gen R1 ze S. demissum, který kóduje protein o velikosti 1293 aminokyselin a molekulové hmotnosti 149,4 kDa. Tento protein obsahuje LRR a NSB domény a motiv leucinového zipu. Tato disertační práce se blíţe týká genu rezistence Rpi-blb1, jehoţ donorem je druh Solanum bulbocastanum. Kódující sekvence tohoto genu je identická s genem RB a obě tyto alelické varianty jsou funkčně ekvivalentní, jedná se tedy o alelomorfy. Otevřený čtecí rámec (ORF) genu Rpi-blb1 kóduje predikovaný polypeptid skládající se z 970 aminokyselin s odhadovanou molekulovou hmotností 110,3 kDa. Tento protein obsahuje NBS doménu, LRR doménu a na N konci motiv leucinového zipu (Van der Vossen et al., 2003). 33

Ministerstvo ţivotního prostředí České republiky udělilo 10. května 2007 povolení společnosti BASF spol. s r.o. k uvádění geneticky modifikovaných brambor se zvýšenou odolností k Phytophthora infestans do ţivotního prostředí v České republice. Genetická modifikace spočívala ve vnesení R genů Rpi-blb1 a Rpi-blb2. K transformaci byla vyuţita bakterie Agrobacterium tumefaciens – kmeny AGL0, AGL1 nebo LBA4404. K identifikaci transformovaných rostlin byl jako selekční marker vnesen modifikovaný gen syntetázy acetohydroxykyseliny (ahas) z Arabidopsis thaliana. Exprese tohoto genu přináší toleranci vůči imazamoxu, aktivní sloţce herbicidů (např. Pulsar) ve tkáňové kultuře (MŢP, 2007). V současnosti existuje snaha všechny uvedené R geny rezistence vyuţívat při šlechtění kulturního bramboru za účelem zvyšování jeho odolnosti k plísni bramboru. Při utilizaci těchto genů do genofondu bramboru se často uplatňují prezygotické a postzygotické bariéry vzniku mezidruhových hybridů (Orczyk et al., 2003), coţ je moţné překonat vyuţitím metod somatické hybridizace (Helgelson, 1992). V současné době je snaha tyto geny rezistence klonovat a přenášet do odrůd bramboru, nicméně je tento proces komplikovaný z hlediska legislativy EU a je i výrazně finančně a technologicky náročný. Zároveň je většina dalších důleţitých vlastností vyuţívaných ve šlechtění polygenního charakteru a v současnosti nejsou k dispozici jejich izolované a charakterizované sekvence vyuţívané pro tvorbu GMO (Orczyk et al., 2003). Naopak fúze protoplastů transfer těchto polygenních vlastností umoţňuje (Millam et al., 1995).

2.5 Vybrané genové zdroje rezistence k plísni bramboru a jejich charakteristika V rámci této disertační práce byly blíţe analyzovány vybrané nekulturní druhy rodu Solanum, jakými jsou S. bulbocastanum, S. berthaultii, S. pinnatisectum, S. polyadenium, S. microdontum, S. vernei a S. verrucosum. Všechny uvedené druhy lze vyuţít pro somatickou hybridizaci s bramborem S. tuberosum ssp. tuberosum. Proto jsou tyto druhy podrobněji specifikovány i v rámci literárního přehledu.

2.5.1 Solanum bulbocastanum Dun. Druh Solanum bulbocastanum (Příloha 1) patří do série Bulbocastana, je diploidní, popřípadě triploidní (2n = 24, 3n = 36) a je pro něj charakteristické 1EBN (Bradshaw a Mackay, 1994). Hlavní oblast rozšíření jsou suché oblasti vysočiny centrálního Mexika a 34

Guatemala. Z morfologického hlediska se jedná o rostlinu s šedozelenými listy, dosahující výšky od 30 do 100 cm, kvetoucí bíle. Uspořádání květní koruny řadí tento druh do skupiny primitivní Stellata. Tvoří bílé popřípadě krémové hlízy dosahující velikosti aţ 7 cm (Correll, 1962). Dle Hawkes (1994) vykazuje tento druh rezistenci vůči Erwinia carotovora, některým druhům mšic, háďátkům Globodera rostochiensis a G. pallida a z abiotických faktorů vůči teplu a suchu. Je pro něj charakteristický především vysoký stupeň rezistence vůči všem známým rasám P. infestans, a to i v podmínkách silného infekčního tlaku. S. bulbocastanum tedy vykazuje rasově nespecifickou rezistenci k P. infestans (Helgelson et al., 1998). V rámci projevu rezistence se nejedná o totální eliminaci symptomů plísně bramboru, ale jen o jejich obecnou supresi (Colton et al., 2006). Vzhledem k sexuální inkompatibilitě S. bulbocastanum byla rezistence k plísni bramboru úspěšne přenesena do kulturního bramboru S. tuberosum ssp. tuberosum pomocí fúze protoplastů (Helgelson et al., 1998).

2.5.2 Solanum berthaultii Hawkes. Druh Solanum berthaultii (Příloha 2) patří do série nekulturní Tuberosa, je diploidní (2n = 24) a je pro něj charakteristické 2EBN (Bradshaw a Mackay, 1994). Vyskytuje se na křovinatých horských svazích v písčitojílovitých, kamenitých nebo jílovitých půdách v nadmořské výšce 2000 – 2800 m v oblastech jiţní Bolívie. Rostliny rostou do výšky aţ 90 cm, obvykle 50 cm. Barva květů je obvykle světle modrofialová, podle květní koruny jsou řazeny do skupiny primitivní Rotata. Tvoří naţloutlé hlízy elipsovitého tvaru do velikosti 5,5 cm (Correll, 1962). Solanum berthaultii je rezistentní vůči P. infestans, viroidu vřetenovitosti bramboru (PSTV), mandelince bramborové (Leptinotarsa decemlineata) a některým druhům mšic (Hawkes, 1994).

2.5.3 Solanum pinnatisectum Bitt. Druh Solanum pinnatisectum (Příloha 1) patří do série Pinnatisecta, je diploidní (2n = 24) a patří do skupiny 1EBN (Bradshaw a Mackay, 1994). Nejčastější oblastí výskytu jsou hory v centrálním Mexiku v nadmořské výšce 1800 – 2400 m. Rostliny dorůstají výšky 25 – 60 cm, kvetou bíle a typem květní koruny jsou řazeny do skupiny primitivní Stellata. Rostlina 35

vytváří často početné malé hlízy o velikosti 1,5 cm, které jsou zbarveny dočervena nebo doţluta (Correll, 1962). Solanum pinnatisectum je rezistentní k P. infestans, Erwinia carotowora a k abiotickým faktorům prostředí, jako je teplo a sucho (Hawkes, 1994).

2.5.4 Solanum polyadenium Greenm. Druh Solanum polyadenium (Příloha 1) patří do série Polyadenia, je diploidní (2n = 24) a je pro něj charakteristické 1EBN (Bradshaw a Mackay, 1994). Vyskytuje se endemicky v horách centrálního Mexika v nadmořské výšce 1900 – 2900 m. Rostliny dosahují výšky do 100 cm, květy mají nejčastěji bílou nebo krémovou barvu a podle květní koruny jsou řazeny do skupiny primitivní Stellata. Vytvářejí nápadně dlouhé převáţně bíle zbarvené hlízy dosahující délky aţ 40 cm. Charakteristické pro rostliny tohoto druhu je, obzvlášť kdyţ jsou čerstvé, ţe vydávají silný nepříjemný zápach, který je podobný kopretině řimbabě (Chrysanthemum parthenium) (Correll, 1962). Solanum polyadenium je potenciálně vhodný druh pro šlechtění na rezistenci k P. infestans a k mandelince bramborové (Hawkes, 1994).

2.5.5 Solanum microdontum Bitt. Druh Solanum microdontum (Příloha 1) patří do série nekulturní Tuberosa je diploidní, popřípadě triploidní (2n = 24, 3n = 36) a patří do skupiny 2EBN (Bradshaw a Mackay, 1994). Vyskytuje se v a na okraji vlhkých lesů, společně s keři na skalnatých svazích, v písčitých půdách a okolo starých polí v nadmořských výškách 1300 – 3500 m v oblastech jiţní Bolívie a severozápadní Argentiny. Rostliny rostou do výšky 1,5 m, květy mají bílé obvykle se zelenou hvězdou uprostřed a typen květní koruny příslušící skupině primitivní Rotata. Hlízy jsou kulaté, mají růţovofialovou barvu a dosahují velikosti okolo 1 cm (Correll, 1962). Solanum microdontum je nositelem rezistence k P. infestans, Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora, háďátku Meloidogyne incognita a k abiotickým faktorům, jako jsou extrémní teplo a sucho (Hawkes, 1994).

2.5.6 Solanum vernei Firbas and Ross. Druh Solanum vernei (Příloha 2) patří do série nekulturní Tuberosa. Je diploidní (2n = 24) a je pro něj charakteristické 2EBN (Bradshaw a Mackay, 1994). Vyskytuje se endemicky v oblasti severozápadní Argentiny v nadmořské výšce 2300 – 3500 m. Rostliny dosahují 36

výšky do 100 cm, kvetou různými odstíny vínové barvy a typem koruny patří mezi primitivní Rotata. Hlízy mají hnědavou barvu a dosahují velikosti do 8 cm (Correll, 1962). Solanum vernei je rezistentní k P. infestans, háďátkům Globodera rostochiensis a G. pallida a je mrazuvzdorné (Hawkes, 1994).

2.5.7 Solanum verrucosum Schlechtd. Druh Solanum verrucosum (Příloha 2) patří do série nekulturní Tuberos. Je diploidní (2n = 24) a je pro něj charakteristické 2EBN (Bradshaw a Mackay, 1994). Nejfrekventovanější výskyt je ve velehorách centrálního Mexika v nadmořské výšce 2400 – 3200 m. Rostliny dosahují výšky aţ 60 cm, kvetou tmavě nebo světle purpurově a podle květní koruny jsou řazeny do skupiny odvozená Rotata. Hlízy mají převáţně bílou barvu a dorůstají velikosti 3 – 6 cm (Correll, 1962). Hawkes (1994) uvádí, ţe Solanum verrucosum je rezistentní pouze vůči P. infestans.

2.6 Somatická hybridizace bramboru 2.6.1 Protoplasty rostlin Rostlinné buňky jsou na povrchu kryty buněčnou stěnou, pod kterou se nachází vnější buněčná membrána, plazmalema. Buněčnou stěnu lze z buňky odstranit například působením celulolytických enzymů. Buňky zbavené buněčné stěny se označují jako protoplasty a jsou schopny přeţívat v roztoku o vhodných osmotických podmínkách, ve kterém získávají energeticky nejméně náročný, tedy kulatý tvar (Brandt, 1995). Protoplasty rostlin se standardně pouţívají více jak tři desetiletí a staly se jedním z nejuniverzálnějších nástrojů v rostlinné biologii. Lze je izolovat ve velkých mnoţstvích z různých pletiv nebo orgánů. Uvolněním z celulózní buněčné stěny se plasmatická membrána stává přístupnější k purifikaci a různým formám výzkumu. Následně je moţné indukovat tvorbu kalusů, prýtů, kořenů nebo embryí a z nich regenerovat novou rostlinu (Negrutiu et al., 1992). Mezi moţnosti vyuţití protoplastů patří vnášení cizorodé DNA do hostitelského genomu, které lze uskutečnit dvojím způsobem. Jedná se o transformaci protoplastů, která je pravděpodobně nejuniverzálnější metodou transferu genů (Cherdshewasart et al., 1993) a o fúzi protoplastů, při které dochází k přenosu jaderné i organelové genetické informace (Lössl 37

et al., 1994). Protoplasty lze také vyuţít například při studiu genové exprese (Hilson et al., 1990) nebo v molekulární cytogenetice například při in situ hybridizaci, která umoţní lokalizovat geny na metafázických chromozómech (Mouras et al., 1987).

2.6.2 Historie protoplastových kultur První úspěch při vývoji metod kultivace protoplastů a jejich regenerace v novou rostlinu publikovali autoři Nagata a Takebe (1970) u buněk tabáku. V souvislosti s tímto objevem se nabízela celá řada moţností jak protoplastové kultury vyuţít ve výzkumu a vývoji. Původní představy vycházely z moţnosti fúze protoplastů geneticky vzdálených druhů, které za normálních podmínek nelze kříţit sexuálním způsobem. Pokud by takto vzniklé somatické hybridy byly alespoň částečně fertilní, mohly by představovat způsob přenosu genů ze vzdálených taxonů do zemědělských plodin. Moţnost, ţe fúzí protoplastů lze kombinovat rovněţ cytoplasmatické organely, by umoţnila přenos faktorů zodpovídajících za cytoplasmatickou samčí sterilitu, která hraje důleţitou roli při produkci hybridního osiva. Ošetřením protoplastových kultur roztoky obsahujícími toxiny hub, herbicidy, vysoké koncentrace solí apod. a následnou regenerací ţivotaschopných buněk by bylo moţné získat rostliny rezistentní k houbovým patogenům, herbicidům popřípadě tolerantní k zasolení půdy apod. Selekcí rostlin vzniklých regenerací z protoplastových kultur, které byly ošetřeny mutageny popřípadě i bez tohoto ošetření, by bylo moţné získat genotypy s mutacemi působícími pozitivně na důleţité hospodářské vlastnosti (Grun et al., 1987). Protoplastové techniky otevřely novou cestu i šlechtitelům brambor. Přibliţně polovina odrůd bramboru byla částečně nebo zcela sterilní a tudíţ nevyuţitelná pro novošlechtění kříţením sexuálním způsobem. Poněvadţ pěstitelé brambor byli navyklí na osvědčené odrůdy, šlechtitelé se domnívali, ţe nové kultivary vzniklé z těchto odrůd vyuţitím protoplastových technik budou snadněji introdukovatelné do pěstebních systémů. První izolaci protoplastů bramboru (Solanum tuberosum ssp. tuberosum L.) uskutečnil v roce 1973 Lorenzini z hlíz kulturních odrůd, ovšem bez úspěšné kultivace (Grun et al., 1987). Upadhya (1975) získal u stejného druhu protoplasty z buněk mezofylu listů a vytvořil médium, na kterém tyto protoplasty vytvořily buněčné stěny, prodělaly mitotická dělení a vytvořily kalus. Regenerace prýtů však nebyla úspěšná. První úspěch v regeneraci rostlin z protoplastových kultur získaných z mezofylových buněk komerčních odrůd zaznamenali autoři Shepard a Totten (1977). Jejich metody se v různých modifikacích pouţívají dodnes. 38

Neexistuje však metoda, která by fungovala univerzálně pro všechny druhy rodu Solanum nebo pro všechny dihaploidy bramboru (Solanum tuberosum L. spp. tuberosum) popřípadě pro tetraploidní komerční odrůdy bramboru (Binding et al., 1978; Shepard, 1982).

2.6.3 Fúze protoplastů Fúze protoplastů vedoucí k somatické hybridizaci a následná in vitro regenerace rostlin umoţňují přenos kompletních genomů z jedné rostliny do rostliny jiné bez ohledu na mezidruhovou bariéru nekřiţitelnosti. Celá řada druhů rodu Solanum, včetně bramboru S. tuberosum ssp. tuberosum, jsou vhodným modelem pro somatickou hybridizaci vzhledem k vyšší regenerační schopnosti jejich protoplastových kultur (Cheng a Saunders, 1995). Běţně se pouţívají dvě metody fúze protoplastů; fúze chemická (Deimling et al., 1988) a fúze v elektrickém poli (Cooper-Bland et al., 1996). Pro indukci chemické fúze se vyuţívá látka polyethylenglykol (PEG). Elektrofúze je obvykle účinnější a převyšuje chemickou fúzi v několika aspektech (Fish et al., 1988):  jednoduchost procesu fúze  menší toxicita a mechanické poškození protoplastů  větší objem suspenze protoplastů, který lze najednou fúzovat  přímá kontrola a ovlivnění průběhu fúze. Fúze protoplastů se vyuţívá pro produkci různých typů hybridů. Somatický hybrid je jedinec, který vzniká fúzí kompletních protoplastů dvou genotypů. Asymetrický hybrid ve svých buňkách obsahuje kombinovanou cytoplasmu a kompletní jádro jednoho genotypu a pouze část jádra donora. Protoplasty donora jsou nejprve ozařovány X nebo γ paprsky a podle míry ozáření dochází k eliminaci části genomu jádra (Xu et al., 1993). Extrémním případem je cytoplasmatický hybrid, cybrid, kdy je ozářením eliminováno celé jádro donora a fúzí dochází pouze ke kombinaci cytoplasmy. Takto vzniklý jedinec si zachovává většinu vlastností získaných od recipienta a původní cytoplasma nebo její část je nahrazena cytoplasmou donora (Perl et al., 1990). Strategie tvorby cybridů se uplatňuje při získávání řady důleţitých hospodářských vlastností kódovaných chloroplastovou a mitochondriální DNA. Mezi tyto vlastnosti patří například rezistence k herbicidům a toxinům patogenů, tolerance k extrémním teplotám a cytoplasmatická pylová sterilita (Sidorov et al., 1994).

39

2.7 Moţnosti detekce somatických hybridů 2.7.1 Morfologické a cytologické metody detekce somatických hybridů Somatické hybridy je moţné hodnotit z hlediska morfologického, kde se porovnávají morfologické znaky těchto jedinců s rodičovskými komponentami. Vzhledem k tomu, ţe při somatické hybridizaci dochází i ke zvyšování stupně ploidie, lze hodnotit takto vzniklé jedince metodami detekce polyploidů. K nepřímým metodám detekce polyploidů patří například zjišťování počtu chloroplastů v uzavíracích párových buňkách průduchů, velikosti a počtu průduchů, měření velikosti pylových zrn nebo zjišťování počtu pórů na pylových zrnech. Všechny tyto metody jsou pouze orientační, a proto se pouţívá hlavně cytologická analýza, která je rozhodujícím a definitivním kriteriem. Cytologické vyšetření se provádí u kořenových špiček nebo u mladých listů rostlin (Zadina a Jermoljev, 1976). Při detekci somatických hybridů je důleţité stanovit kromě počtu chromozómů i sloţení genomu. K těmto účelům se v současné době pouţívá metoda průtokové cytometrie (angl. Flow Cytometry), kde je navíc moţné detekovat, zda se jedná o genotyp vzniklý homofúzí nebo heterofúzí a kolik buněk od kaţdé rodičovské komponenty se na vzniku tohoto genotypu podílelo. Metoda průtokové cytometrie se v posledních letech stala nedílnou součástí celé řady biologických disciplín. Její pomocí lze měřit vlastosti izolovaných buněk nebo jejich částí (Doleţel et al., 2007). Typický průtokový cytometr se skládá z několika základních komponent: světelný zdroj, průtoková komora a optické zařízení, fotodetektory a procesory pro přeměnu světelných signálů na analogové elektrické impulzy, analogově-digitální konvertory a počítačový systém pro analýzy a uchovávání digitálních dat. Jádrem průtokového systému je průtoková komora (Obrázek 1), ve které se tekuté pouzdro neobsahující částice setká s analyzovaným vzorkem, coţ vyústí v separaci a seřazení vzorkových částic do proudu po jedné. Tento fenomén se nazývá hydrodynamická fokusace. Průměr typického vstupního otvoru se pohybuje v rozmezí 50 – 100 µm, jehoţ výsledkem je rychlost proudu 1 – 10 m . s-1. Jednotlivé částice potom projdou paprskem intenzivního světla rychlostí 100 – 1000 částic.s-1. Pokud byly předtím částice barveny fluorescenčním barvivem schopným absorbovat zdrojem vyzařované světlo, nastane fluorescenční emise. Některé částice mohou obsahovat přirozené fluorochromy (například chlorofyl), na základě kterých funguje fluorescence také. Rozptýlené světlo a vysílaná fluorescence je sbírána čočkami, za kterými jsou umístěny optické filtry. Toho je vyuţíváno pro vyloučení excitační vlnové délky pro fluorescenční měření, a pokud je

40

potřeba, pro rozdělení fluorescenčního vyzařování při současném měření dvou nebo více fluorescenčních barev. Detektory potom přeměňují světelné pulzy na elektrické, které jsou dále zesilovány logaritmickým zesilovačem. Po zesílení je elektrický signál digitalizován pro následující počítačové zpracování a uchovávání. Výsledky analýzy jsou obvykle zobrazovány ve formě histogramů intenzity fluorescence mezi částicemi ve vzorku. Obecně má průtoková cytometrie dvě klíčové výhody oproti jiným metodám. První je, ţe můţe být vyhodnocen velký počet částic ve velmi krátkém čase, coţ dělá výsledky statisticky vysoce reprodukovatelné a reprezentativní pro celou populaci. Druhou výhodou je schopnost fyzicky roztřídit jednotlivé částice nebo buňky ze směsné populace. Tříděním je ţivotaschopnost buněk zachována a lze ho uskutečnit i ve sterilních podmínkách. Touto metodou lze detekovat i buňky s nízkou koncentrací ve vzorku (1 : 100 000 a více) a izolovat tak vzácnou populaci, která by nebyla za standardních podmínek identifikována (Doleţel et al., 2007). V konkrétních případech lze vyuţít i dalších charakteristik. Pro okamţitou detekci úspěšnosti fúze je moţné pouţít různě zbarvené protoplasty. Barsby et al. (1984) kombinovali albinotické protoplasty bramboru S. tuberosum s normálními protoplasty S. brevidens. Matheij et al. (1992) pouţili protoplasty S. circaeifolium, které mají vysoký obsah antokyanů ve vakuolách, a tedy fialové zbarvení, k fúzi se zelenými protoplasty S. tuberosum. Kalusy pak selektovali podle míry antokyanového zbarvení. Obrázek 1: Schéma průtokové komory (upraveno dle Doleţel et al., 2007)

41

2.8 Biochemické metody detekce somatických hybridů Z biochemického hlediska lze u genotypů rodu Solanum a jejich somatických hybridů hodnotit velké mnoţství parametrů. Z pohledu lidské výţivy je jedním z limitujících prvků ve šlechtění bramboru obsah antinutričních látek, mezi které patří zejména steroidní glykoalkaloidy.

2.8.1 Steroidní glykoalkaloidy Druhy z čeledi Solanaceae, zahrnující kulturní a nekulturní druhy bramboru a rajčete, produkují široké spektrum steroidních glykoalkaloidů. Jedná se o sekundární metabolity, pro které je charakteristická hořká chuť a toxicita (Friedmann a McDonald, 1997). Míra toxicity je mezi jednotlivými glykoalkaloidy vysoce variabilní, specifické kombinace glykoalkaloidů mohou vykazovat i synergistický účinek (Rayburn et al., 1995). Chemickou strukturu glykoalkaloidů tvoří dvě základní sloţky – sacharidová skupina nebo skupiny a steroidní alkaloid, kterým je solanidin nebo solasodin (Van Eck, 2007). Hlavními dvěma steroidními glykoalkaloidy v kulturním bramboru jsou α – solanin (solanidin – galaktóza – glukóza – rhamnóza) a α – chaconin (solanidin – glukóza – rhamnóza – rhamnóza) odvozené od solanidinu, které představují přibliţně 90 – 95 % celkového obsahu glykoalkaloidů. Obsah α – solaninu a α – chaconinu v hlízách se pohybuje v poměru 40 : 60 (Storey, 2007). Na buněčné úrovni vykazují tyto sloučeniny silné lytické vlastnosti a inhibují aktivitu acetylcholin-esterázy (Friedmann a McDonald, 1997). Kulturní odrůdy bramboru Solanum tuberosum ssp. tuberosum obsahují ve velmi nízkých koncentracích ještě další glykoalkaloidy, jako β – chaconin, γ – chaconin, β1 – solanin, β2 – solanin a γ – solanin (Storey, 2007). Dosud byly popsány pouze některé části drah biochemické syntézy steroidních glykoalkaloidů (Obrázek 2). Enzym 3-hydroxy-3-methylglutaryl koenzym A reduktáza (HMGR) katalyzuje přeměnu 3-hydroxy-3-methylglutaryl koenzymu A na kyselinu mevalonovou, coţ je prekurzor všech izoprenoidových sloţek. Mezi izoprenoidy rostlin patří mimo jiné antimikrobiální terpenové fytoalexiny, steroidní glykoalkaloidy, steroly, růstové regulátory jako je kyselina abcisová a giberelin, komponenty přenosu elektronů jako je plastochinon a ubichinon, karotenoidy a přírodní kaučuk. Všechny chemické dráhy vedoucí k těmto finálním produktům soutěţí o stejný prekurzor. Vznik daného finálního produktu řídí

42

první enzym, který se v dané chemické dráze angaţuje (Chappell, 1995). Klíčový enzym, který rozhoduje o biosyntéze steroidních glykoalkaloidů, nebyl dosud identifikován. Existují nejméně 3 podrodiny genů kódujících HMGR v bramboru. Gen hmg1 je silně exprimován v pletivech hlíz při jejich poranění, ale je potlačen v případě napadení patogenem. Geny hmg2 a hmg3 se v omezené míře transkribují v reakci na poranění hlízy, ale k jejich silné expresi dochází pří inokulaci patogenem (Choi et al., 1992). Aktivita enzymu HMGR je tedy v rostlinách regulována na úrovni mRNA odlišnou indukcí členů genové rodiny pro HMGR a dále posttranslačně modifikací enzymu (Stermer et al., 1994). Enzymy skvalen syntáza (PSS1) a vetispiradien (seskviterpen) cykláza (PVS1) jsou katalyzátory dalšího kroku vedoucího k syntéze buď sterolů a steroidních glykoalkaloidů (PSS1) nebo seskviterpenových fytoalexinů (PVS1). Tyto enzymy soupeří o stejný substrát farmesyl-PP (Krits et al., 2007). Z hlediska chemické dráhy biosyntézy glykoalkaloidů je aktivita enzymu HMGR dále zpětně regulována enzymem PSS1 (Yoshioka et al., 1999). Aktivita HMGR a PSS1 a následných enzymů určuje celkové mnoţství solanidinu, prekurzoru širokého spektra steroidních glykoalkaloidů (Friedmann et McDonald, 1997). Ten je syntetizován z cykloartenolu přes cholesterol (McCue et al., 2005). Metabolismus cykloarthenolu také vede k syntéze dalších rostlinných sterolů, hlavně pro plasmatickou membránu. Klíčovým enzymem této dráhy je sterol C24-methyltransferáza typu 1 (SMT1). Pokud dojde k silné expresi genů pro tento enzym, redukuje se hladina celkových steroidních glykoalkaloidů (Anqvist et al., 2003). Finální reakcí syntézy glykoalkaloidů je glykosylace solanidinu enzymy soladinin galaktosyltransferázou (SGT1) a solanidin glukosyltransferázou (SGT2) za vzniku γ – solaninu a γ – chaconinu. Enzym rhamnosyltransferáza (SGT3) nakonec katalyzuje tvorbu α – solaninu a α – chaconinu z jejich β forem (McCue et al., 2007). Steroidní glykoalkaloidy v hlízách bramboru mají negativní účinky na lidské zdraví. Mezi příznaky otravy patří gastrointestinální poruchy, zmatenost, halucinace, částečná paralýza, kóma a v některých případech i smrt (Smith et al., 1996). V hlízách nejsou glykoalkaloidy rozmístěny rovnoměrně. Nejvyšší koncentrace je v povrchové oblasti hlíz (Smith et al., 1996) a v blízkosti oček. Slupka, která představuje 2 – 3 % hlízy, obsahuje 30 – 80 % celkového mnoţství glykoalkaloidů. Loupáním hlíz se tak můţe částečně obsah glykoalkaloidů redukovat (Storey, 2007). Steroidní glykoalkaloidy nelze zničit vařením ani smaţením, jsou degradovatelné aţ při teplotách 230 – 280°C (Bushway a Ponnampalam, 1981).

43

Existují i faktory související s růstem, sklizní a posklizňovými úpravami hlíz, které mohou obsah steroidních glykoalkaloidů zvyšovat. Mezi tyto faktory patří například sucho (Berajano et al., 2000), vysoká teplota (Lafta a Lorenzen, 2000) nebo vystavení hlíz světlu (Griffiths a Dale, 2001; Percival et al., 1994). Z těchto důvodů by celkový obsah glykoalkaloidů v konzumních hlízách neměl přesáhnout 200 mg.kg -1 čerstvé hmoty (Rayburn et al., 1995). V České republice jsou hladiny glykoalkaloidů v konzumních odrůdách regulovány vyhláškou Ministerstva zdravotnictví č. 53/2002 Sb., která stanovuje přípustné mnoţství glykoalkaloidů ve výši 200 mg.kg-1 neloupaných hlíz. Steroidní glykoalkaloidy mají pozitivní efekty pro rostlinu, kterou jsou syntetizovány, vykazují antifungální aktivitu (Percival et al., 1998), rezistenci k virovým a bakteriálním chorobám (Rokka et al., 1994) a odpuzují hmyz (Sanford et al., 1992; Yencho et al., 2000). Ideální genotyp bramboru by potom měl mít vysokou hladinu glykoalkaloidů v listech, aby chránil úrodu proti ataku fytopatogenních organismů, a nulovou hladinu v hlízách (Krits et al., 2007). Při šlechtění bramboru na rezistenci k patogenům se často vyuţívá genových zdrojů rodu Solanum, které obvykle vykazují vysokou hladinu glykoalkaloidů v hlízách dosahující koncentrace aţ 2200 mg.kg -1 čerstvé hmoty (Van Gelder et al., 1989). Z hlediska spektra glykoalkaloidů jsou tyto genotypy mnohem variabilnější oproti S. tuberosum ssp. tuberosum (Distl a Wink, 2009), u kterého byly glykoalkaloidy selektovány během domestikace bramboru, a do moderních odrůd se inkorporovala pouze část glykoalkaloidové diverzity (Shakya a Navarre, 2008). Vyuţití genových zdrojů rodu Solanum ve šlechtitelském programu bramboru procesem sexuální popřípadě somatické hybridizace však můţe vést k produkci hlíz s vysokým obsahem glykoalkaloidů a k introdukci jiných glykoalkaloidů neţ je solanin a chaconin a tím vytvářet potenciální zdroj nebezpečí pro lidské zdraví (Savarese et al., 2009; Yencho et al., 2000).

44

Obrázek 2: Biochemická syntéza steroidních glykoalkaloidů α – solaninu a α – chaconinu (upraveno dle Krits et al., 2007)

2.9 Molekulárně genetické metody detekce somatických hybridů 2.9.1 Charakteristika rostlinného genomu U rostlinných druhů je genetická informace tvořena jadernou a organelovou DNA. Mitochondriální a chloroplastové specifické DNA jsou umístěny v semiautonomních organelách v cytoplasmě buňky a ve většině případů jsou děděny pouze po mateřské rostlině (Kemble a Shepard, 1984). Jedním z důvodů uniparentální dědičnosti cytoplasmy je obecně zabránění šíření symbiontů, parazitů apod. (Birky, 1995). První zprávy o nemendelistické dědičnosti byly zjištěny na dvou genetických modelech, pelargonii (Pelargonium) a nocence (Mirabilis) v roce 1909 Bauerem a Corrensem. Přítomnost cpDNA byla definitivně prokázána v roce 1963 (Sugiura, 2003). Později byly stejným způsobem detekovány i mitochondriální geny (Birky, 1995). Cytoplasmatická DNA je nositelkou celé řady důleţitých vlastností vyuţitelných ve šlechtění (Kemble et al., 1980; 1982). V poslední době se cpDNA a mtDNA rostlin s velkým zájmem vyuţívá ve fylogenetických a populačních studiích (Chiang et al., 1998; Yamagishi a Terachi, 2003). Dalším příkladem praktického vyuţití cpDNA a mtDNA je detekce somatických hybridů rostlin, u kterých je cytoplasma zděděna po obou rodičích (Scotti et al, 2003; Kemble et al., 1986). 45

Obecně je chloroplastový genom (plastom) představován cirkulární molekulou dsDNA čítající mezi 120 kbp aţ 160 kbp (Heinhorst et al., 1988). Analýza velké podjednotky ribulósa-1,5-bisfosfát karboxylázy (RuBP), která je kódována chloroplastovou DNA, prokázala, ţe genom cpDNA vykazuje vysokou konzervovanost (Scowcroft, 1979). I přesto však Wettstein et al. (1978) prokázali variabilitu cpDNA mezi blízce příbuznými druhy vyšší neţ se původně předpokládalo. Základní strukturu cpDNA tvoří dvě dlouhé invertované repetice (IRa, IRb), obsahující počátky replikace a geny např. pro ribozomální RNA, oddělující na kruhovém genomu unikátní oblasti označované jako "large single copy" (LSC) a "small single copy" (SSC) (Clegg, 1993; Wakasugi et al., 1998). Kompletní genová mapa cpDNA byla publikována u tabáku autory Yukawa et al. (2005). Mitochondriální genofor je u vyšších rostlin tvořen kruţnicovou dsDNA nebo lineární dsDNA a kolísá ve velikosti v rozmezí 250 kbp aţ 2000 kbp. Jeho struktura a uspořádání genů je značně variabilní, dokonce u stejného organismu (Rosypal, 1996; Flegr, 2005). Ve srovnání s cpDNA je mtDNA méně studována z důvodu niţších frekvencí změn v sekvenci během evolučního vývoje. Kódující oblasti v mitochondriálním genomu jsou vysoce konzervativní mezi druhy i rody. Nicméně sekvence intronů a oblastí mezi geny jsou vysoce variabilní, protoţe neobsahují sekvence nezbytné pro funkci organel (Hu a Luo, 2006). Variabilita nekódujících oblastí vedla k vytvoření sady univerzálních chloroplastových a mitochondriálních PCR primerů, které jsou aplikovatelné na většinu rostlinných druhů (Chiang et al., 1998; Kajita et al., 1998; Bastia et al., 2001; Hu a Luo, 2006).

2.9.2 Genom somatického hybrida Existuje mnoho moţností, jak můţe vypadat genom buněk vzniklých fúzí protoplastů dvou druhů rodu Solanum. Můţe docházet k homofúzi, k heterofúzi, k eliminaci některých chromozómů nebo dokonce celého jádra jednoho druhu. Tyto případy nastávají nejčastěji při následujících buněčných děleních. Fúze rodičovských jader můţe být rovněţ celková nebo pouze částečná (Pijinacher et al., 1978). Nejinak je tomu v případě cytoplasmy. U somatických hybridů čeledi Solanaceae převáţně dochází k eliminaci plastidů jednoho rodiče. Pokud je frekvence tvorby a distribuce chloroplastů obou rodičů ve fúzovaných buňkách ekvivalentní, dochází k této eliminaci náhodně (Lössl et al., 1994). Příčiny nenáhodné eliminace plastidů jedné rodičovské komponenty jsou často vysvětlovány odlišnou rychlostí replikace DNA organel (Glimelius et al., 1981). Bylo prokázáno, ţe intergenové rekombinace v rámci chloroplastového genomu jsou u vyšších rostlin vzácné oproti vysokému stupni 46

rekombinací v rámci mitochondriálního genomu (Fejes et al., 1990). Pro komplexní charakterizaci DNA rostlin vzniklých somatickou hybridizací je proto nutné provést analýzu jaderné, chloroplastové i mitochondriální DNA (Trabelsi et al., 2005).

2.9.3 Analýza DNA V současné době se nabízí celá řada molekulárně genetických metod umoţňujících studium rostlinné DNA. Pro detekci polymorfismů jaderné DNA lze vyuţít metody CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), která v sobě zahrnuje spojení metod PCR (Polymerase Chain Reaction) a RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). CAPS polymorfismy či SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) jsou často vyuţívané markery nacházející se v genomu ve vazbě na důleţité geny řídící hospodářsky významné vlastnosti, jako jsou různé geny rezistence (de Jong et al., 1997). Další moţností studia polymorfismu celkové genomické DNA je metoda RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), která se jeví jako cenově efektivní diagnostická metoda ve šlechtění rostlin (Masuelli et al., 1995). Vyuţití krátkých libovolných primerů pro náhodnou amplifikaci při studiu polymorfismů DNA poprvé publikovali Williams et al. (1990). Szczerbakowa et al. (2005) vyuţili tuto metodu pro charakterizaci vnitrodruhových a mezidruhových somatických hybridů bramboru. Další moţností genetické analýzy aplikované pro studium variability rostlin je vyuţití nekódujících oblastí chloroplastové DNA (cpDNA) a mitochondriální DNA (mtDNA) (Taberlet et al., 1991; Duminil et al., 2002).

2.9.4 Detekce somatických hybridů pomocí transgenů Jednou z moţností detekce somatických hybridů je detekce na základě genů rezistence například vůči antibiotikům. V tomto případě musí být jeden rodič geneticky modifikován, do genomu mu je vloţen například gen rezistence ke kanamycinu (Puite a Shaart, 1993) nebo streptomycinu (Sidorov et al., 1994). Fúzované buňky jsou pak kultivovány na selektivních médiích. Tyto moţnosti detekce jsou však závislé na úspěšném zvládnutí transgenóze výchozího materiálu.

47

3 VĚDECKÉ HYPOTÉZY Pro tuto práci byly stanoveny hlavní vědecké hypotézy, které jsou uvedeny v následujících bodech: 

Jsou známé genetické zdroje širokospektrální rezistence bramboru k Phytophthora infestans, které jsou obtíţně vyuţitelné při běţné hybridizaci bramboru.



Fúze protoplastů představují účinný nástroj umoţňující překlenutí problémů spojených s nekřiţitelností donorů genů rezistence a získání výchozího šlechtitelského materiálu nesoucího poţadované geny.



Somatické hybridy je moţné detekovat technikami molekulární analýzy DNA na úrovni jaderného a cytoplazmatického genoforu.

48

4 CÍLE PRÁCE Hlavním cílem této práce bylo získat somatického hybrida mezi nekulturním druhem rodu Solanum a kulturním bramborem S. tuberosum ssp. tuberosum a detekovat ho prostřednictvím technik molekulární analýzy DNA. Dílčí cíle práce jsou blíţe specifikovány v následujících bodech: 

Výběr kolekce donorů širokospektrální rezistence bramboru vůči Phytophthora infestans v rámci rodu Solanum.



Charakterizace vybrané kolekce z hlediska fenotypového projevu rezistence a pomocí DNA markerů.



Optimalizace metod odvození protoplastových kultur a somatických hybridů



Vyhodnocení metody fúze protoplastů pro získání rezistentního šlechtitelského materiálu.



Detekce somatických hybridů na základě morfologicko-anatomických, biochemických a molekulárně genetických charakteristik.



Fenotypové zhodnocení rezistence somatických hybridů.

49

5 MATERIÁL A METODY 5.1 Rostlinný materiál Z genové banky při Výzkumném ústavu bramborářském v Havlíčkově Brodě s.r.o. bylo získáno celkem 136 genetických zdrojů rodu Solanum a dihaploidů bramboru. Vybrané genové zdroje rodu Solanum jsou charakterizovány jako potenciální zdroje genů rezistence bramboru vůči plísni bramboru, jsou diploidní (2n = 24) a tudíţ vhodné pro somatickou hybridizaci s dihaploidy bramboru za předpokladu vzniku tetraploidního výchozího šlechtitelského materiálu odolného k Phytophthora infestans. Jednalo se o 94 genotypů Solanum bulbocastanum Dun. (PI243345, PI243512, PI275188, PI275192) z nichţ 79 genotypů (PI243510) bylo deklarováno jako donory genu rezistence Rpi-blb1 vůči Phytophthora infestans. Dále bylo hodnoceno 12 genotypů S. berthaultii Hawkes. (PI265857, PI265858, PI310925, PI265858, PI498109), po jednom genotypu Solanum pinnatisectum Bitt. (PI275235) a Solanum microdontum Bitt. (PI458356), 9 genotypů Solanum polyadenium Greenm. (PI310963, PI320342), 3 genotypy Solanum vernei Firbas and Ross. (BGRC 015451, BGRC 024732), 4 genotypy Solanum verrucosum Schlechtd. (PI161173) a 11 dihaploidních genotypů Solanum tuberosum ssp. tuberosum L. (DH 165, 185, 315, 318, 322, 323, 324, 329, 387, 388, 447). Pro rozšíření moţnosti detekce mezidruhové variability bylo do kolekce zařazeno 8 genotypů diploidních druhů S. chacoense Bitt. (BGRC 051236), S. yungasense Hawkes. (BGRC 055214), S. phureja Juz. et Buk., S. mochiquense Ochoa. (BGRC 032672), a tetraploidních druhů S.stenotomum ssp. goniocalyx Juz. et Buk. (CIP 701830), S. x sucrense Hawkes. (PI 473 392), Solanum tuberosum ssp. andigenum Juz. et Buk. (EVIGEZ 07S0300235) a S. polytrichon Rydb. (PI 275240). V této práci byly rovněţ pouţity tetraploidní diferenciační klony S. tuberosum ssp. tuberosum L. pro analýzu rasového spektra izolátů P. infestans určených pro testy rezistence. Sada obsahovala 9 genotypů s jedním genem rezistence R získaným ze S. demissum R1, R2, R3, R6, R7, R8, R9, R10, R11, dále pak jeden genotyp bez genů rezistence (rr) a jeden obsahující čtyři geny (R1234). Rostliny byly kultivovány in vitro v kultivačních boxech SANYO ve skleněných kultivačních nádobách o objemu 150 ml s plastovými uzávěry s průduchem. V kaţdé kultivační nádobě bylo 25 ml agarového média dle Murashige a Skoog (1962). Kultivace probíhala při fotoperiodě 16 hodin světlo a teplotě 25°C a 8 hodin tma a teplotě 18°C při 50

relativní vzdušné vlhkosti 50 %. Část kolekce byla převedena do stolového skleníku, kde byly rostliny pěstovány v kontejnerech o rozměrech 9,5 x 9,5 x 10,5 cm v 900 ml zahradnického substrátu (Agro CS, ČR) při teplotě 25°C ± 6°C.

5.2 Optimalizace metod izolace protoplastů 5.2.1 Izolace protoplastů z mezofylu listů Byla optimalizována metoda sterilní izolace, kde se jako nejvhodnější ukázala kombinace metod dle Carlberg et al. (1987) a Cheng a Saunders (1995). Izolace probíhala ve sterilních skleněných Petriho miskách o průměru 90 mm. Pro izolaci protoplastů byly pouţity in vitro rostliny ve stáří 4 – 5 týdnů. Listy těchto rostlin byly umístěny do roztoku 0,3 M sorbitolu a 0,05 M CaCl2, sterilizovaného autoklávováním, o objemu 12 ml, kde byly nakrájeny na segmenty o velikosti přibliţně 1 mm. Roztok slouţí k vyrovnání osmotického potenciálu mezi buňkami a vnějším prostředím a segmenty listů v něm byly inkubovány ve tmě jednu hodinu při teplotě 23°C. Po jedné hodině byl roztok odstraněn sterilní 3 ml Pasteurovou pipetou (PE) a nahrazen 12 ml tzv. digesčního roztoku, jehoţ sloţení je uvedeno v příloze 3 pod písmenem B. Tento roztok obsahoval enzymy slouţící k rozštěpení buněčné stěny, a to 0,5 % celulázy Onozuka R10 (Serva, SRN) a 0,1 % macerozymu R10 (Serva, SRN). Roztok byl sterilizován dvojí filtrací přes sterilní membránové bakteriologické filtry s velikostí pórů 0,45 µm a 0,22 µm. Petriho misky byly kultivovány ve tmě při teplotě 23°C po dobu 16 – 20 hodin na rotační třepačce o frekveci otáček 40 rpm. Odstraněním buněčných stěn a třepáním se do roztoku uvolňují protoplasty. Průběh uvolňování protoplastů byl sledován v hodinových intervalech u dvou genotypů R7 a R11 z diferenciační sady klonů tetraploidního bramboru Solanum tuberosum ssp. tuberosum. Jejich počet byl stanoven pomocí mikroskopu Olympus CK-X 41 (Japonsko) v Bürkerově počítací komůrce (Příloha 4). Výsledky byly statisticky zpracovány metodou regresní a korelační analýzy v programu Statistica CZ (Statsoft verze 7.0). Roztok s uvolněnými protoplasty byl poté ve sterilních podmínkách opatrně odebrán sterilní 3 ml Pasteurovou pipetou (PE) a přefiltrován přes silonovou síťku (velikost obdélníkových ok 50 x 100 µm), pro odstranění hrubých rostlinných zbytků a rozdělen po 6 mililitrech do dvou 15 ml polypropylénových centrifugačních zkumavek. Do Petriho misek bylo dále přidáno 12 ml tzv. promývacího roztoku sterilizovaného autoklávováním, který obsahoval 0,3 M KCl. Tento roztok poté obsahoval zbylé protoplasty a byl rovněţ

51

přefiltrován po 6 ml do zkumavek. Oba roztoky byly opatrně promíchány a tím se naředila koncentrace látek a enzymů z digesčního roztoku. Konečný objem v jedné zkumavce byl 12 ml. Zkumavky byly centrifugovány 5 minut při 71 x g při teplotě 20°C v centrifuze Hettich universal soft 30RF (SRN). Po centrifugaci byl odstraněn supernatant. Sediment obsahující ţivé protoplasty a zbytky buněk byl sterilní 3 ml Pasteurovou pipetou (PE) resuspendován v 10 ml sterilního roztoku 20 % sacharózy a převrstven 1 ml promývacího roztoku (0,3 M KCl). Roztoky tak vytvořily koncentrační gradient, který umoţnil separaci nativních protoplastů. Zkumavky byly následně centrifugovány 10 minut při 61 x g při teplotě 20°C. Ţivé protoplasty migrovaly na rozhraní gradientu, kde vytvořily prstenec (Příloha 4). Tento prstenec byl sterilní 3 ml Pasteurovou pipetou (PE) odebrán maximálně do objemu 2 ml do nových zkumavek, kde byl opatrně promíchán s 12 ml promývacího roztoku. Tím se sníţila koncentrace sacharózy na

minimum.

Takto

upravená suspenze

protoplastů byla

centrifugována 5 minut při 50 x g při teplotě 20°C. Sediment byl poté resuspendován v 6 ml 0,47 M sterilního roztoku mannitolu a znovu centrifugován 5 minut při 50 x g z důvodu odstranění zbývajících iontů, které by komplikovaly průběh vlastní fúze. Finálně byly protoplasty naředěny roztokem 0,47 M mannitolu na koncentraci odpovídající parametrům fúze, která je blíţe popsána v kapitole 5.4.1.

5.2.2 Vliv sloţení médií pro kultivaci výchozího materiálu na výtěţnost a viabilitu protoplastů Byl testován vliv sloţení média na kultivaci výchozího rostlinného materiálu s cílem získání co největší listové plochy pro zvýšení výtěţnosti izolace protoplastů z mezofylu rostlin. V pokusu byly pouţity tři genotypy Solanum verrucosum 299, S. bulbocastanum PIS 54 a S. berthaultii 260. Všechny rostliny byly kultivovány ve skleněných kultivačních nádobách o objemu 150 ml s plastovými uzávěry s průduchem. V kaţdé kultivační nádobě bylo 25 ml ţivného média. Bylo porovnáváno SH médium (Schenk a Hildebrandt, 1972), MS médium (Murashige a Skoog, 1962) a CH médium (Cheng a Saunders, 1995), které je v příloze 3 označeno písmenem A. Bříza a Machová (1991) uvádějí, ţe přidáním AgNO3 a morforegulátoru Alar 85 dochází ke zkrácení internodií a ke zvětšení listové plochy. Kaţdé médium bylo proto pouţito ve 3 variantách. První varianta byla kontrola, druhá s Alarem 85 v koncentraci 1 mg.l-1 a 52

AgNO3 v koncentraci 1,5 mg.l-1 a třetí varianta s Alarem 85 v koncentraci 5 mg.l-1 a s AgNO3 v koncentraci 7,5 mg.l-1. Nodální kultury byly kultivovány v kultivačních boxech při fotoperiodě 16 hodin světlo a teplotě 25°C a 8 hodin tma a teplotě 18°C při relativní vzdušné vlhkosti 50 %. Kultivace ve všech případech probíhala po dobu 6 týdnů. Hodnocení kultivace bylo prováděno vţdy na 6 rostlinách od kaţdého druhu a od kaţdé varianty média. Jako první byla měřena délka rostlin bez kořenů od prvního nódu po vrcholové větvení v cm. Byl stanoven počet listů kaţdé rostliny. Dále byla stanovena hmotnost čerstvé biomasy a sušiny rostlin. Sušina byla zjištěna po 4 hodinách sušení v horkovzdušné sušárně při 105°C. Výsledky byly statisticky vyhodnoceny metodou analýzy rozptylu hlavních efektů v programu Statistica CZ (Statsoft verze 7.0). Výtěţnost a ţivotaschopnost protoplastů byla hodnocena v Bürkerově počítací komůrce. Ţivotaschopnost byla stanovena barvením methylénovou modří. K 0,5 ml suspenze protoplastů v 0,47 M roztoku mannitolu bylo přidáno 10 µl 0,25 % methylenové modři rozpuštěné v roztoku mannitolu o stejné molaritě. Barvivo bylo ponecháno 10 minut působit. Byla provedena regresní a korelační analýza závislosti ţivotaschopnosti na výtěţnosti protoplastů programem Statistica CZ (Statsoft verze 7.0).

5.3 Výběr výchozího materiálu vhodného pro somatickou hybridizaci 5.3.1 Fenotypové zhodnocení odolnosti klonů k Phytophthora infestans Všechny genotypy uvedené v tabulce v příloze 11 byly z in vitro podmínek převedeny nejprve do perlitu z důvodu otuţení rostlin a po jednom týdnu do skleníku. Pro fenotypové zhodnocení odolnosti genotypů k P. infestans byl pouţit infekční test metodou listových terčíků (Příloha 5) (Zadina a Jermoljev, 1976). K testu byly pouţity listy o velikosti přibliţně 30 x 15 mm odebrané z rostlin ve stáří 6 týdnů. Tři listy byly na spodní straně listů inokulovány suspenzí sporangií izolátu Phytophthora infestans s komplexní virulencí k majorgenům rezistence R odvozenými ze Solanum demissum (R1, R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9, R10, R11). Koncentrace této suspenze byla 20 000 sporangií na 1 ml roztoku. Izolát pocházel z lokality Valečov (Česká republika) a byl získán ve spolupráci s Katedrou ochrany rostlin (ČZU v Praze). Kultivaci izolátu v in vitro podmínkách popisuje Mazáková (2008). Čtvrtý list byl ponechán jako negativní kontrola. Listy byly po jednom dni otočeny a po čtyřech dnech byl hodnocen fenotypový projev odolnosti případně náchylnosti genotypů. Genotypy byly posuzovány jako odolné (0 – 25 % poškozené listové plochy), středně odolné

53

(25,1 – 50 %) a náchylné (50,1 – 100 % nebo sporulace mycélia). Výsledky tohoto testu byly porovnány s výsledky genové banky při Výzkumném ústavu bramborářském v Havlíčkově Brodě s.r.o., kde bylo testováno 79 genotypů druhu S. bulbocastanum (PI243510) - donory genu Rpi-blb1, metodou inokulace celých rostlin in vitro (Příloha 5). Tato metoda spočívala v aplikaci inokula postřikem. Hodnocení probíhalo rovněţ po čtyřech dnech.

5.3.2 Výběr vhodných genotypů z hlediska izolace protoplastů Na základě výsledků fenotypového zhodnocení odolnosti k P. infestans byly vybrány odolné genotypy, které byly následně hodnoceny z hlediska vhodnosti pro tvorbu somatických hybridů fúzí v elektrickém poli. Hodnocena byla zejména výtěţnost ţivotaschopných protoplastů po izolaci.

5.4 Tvorba somatických hybridů 5.4.1 Fúze protoplastů Pro fúzi v eletrickém poli byl pouţit elektroporátor BTX verze 2001 (USA). Vlastní fúze probíhala ve sterilních podmínkách ve fúzní komoře o objemu 400 µl (Příloha 6) s roztečí elektrod 2 mm. Podmínky jednotlivých fúzí byly optimalizovány pro kaţdý vzorek zvlášť. K fúzi byly pouţity vţdy kombinace genotypů dihaploidu Solanum tuberosum ssp. tuberosum s nekulturním druhem rodu Solanum. Přehled pouţitých kombinací je uveden v kapitole 6.3.1 (Tabulka 14). Nativní protoplasty obou genotypů byly smíchány v poměru 1 : 1 a byla upravena finální koncentrace na přibliţně 400 000 protoplastů v 1 ml 0,47 M roztoku mannitolu. Parametry fúze byly ve většině případů shodné. Prvním krokem bylo působení střídavého proudu o napětí 55 V . cm-1. V této fázi dochází k polarizaci a následnému řetízkování protoplastů, coţ umoţní kontakt mezi cytoplasmatickými membránami (Příloha 6). Doba působení střídavého proudu byla stanovena pro kaţdý vzorek zvlášť s cílem dosaţení

dostatečného

zřetízkování

protoplastů.

V další

fázi

následoval

impulz

stejnosměrného proudu o napětí 2100 V . cm-1 po dobu 60 s. Pulzem dojde k narušení membrán a ke vzájemnému fúzování obsahů buněk. Třetím krokem je působení střídavého proudu o napětí stejném jako v prvním kroku po dobu 9 s, kdy dochází k obnovení funkce membrán.

54

5.4.2 Kultivace a regenerace protoplastových kultur Sterilní kultivace probíhala na mediích dle Cheng a Sounders (1995). Byla sledována schopnost a rychlost regenerace buněčné stěny, mitózy, tvorba mikrokalusů a kalusů aţ po regeneraci v novou rostlinu. Byla modifikována metoda převedení protoplastů po fúzi v elektrickém poli do kultivačních médií. Cheng a Saunders (1995) uvádějí, ţe roztok mannitolu má být po fúzi odstraněn centrifugací. Protoplasty ošetřené elektrickým polem jsou velmi náchylné k mechanickému poškození, které centrifugace ještě umocnila. Proto byla suspenze protoplastů po fúzi v roztoku 0,47 M mannitolu opatrně sterilně odebrána z fúzní komory a rovnou převedena do sterilních polystyrenových Petriho misek o průměru 30 mm (Nunc, Dánsko). Do misek byl poté přidán shodný objem kultivačního média C. Toto médium obsahovalo dvojnásobnou koncentraci všech látek kromě cukerného alkoholu sorbitolu, který má shodné vlastnosti jako mannitol. Mnoţství sorbitolu bylo sníţeno tak, aby mělo C médium shodnou molaritu jako 0,47 M mannitol. Suspenze protoplastů byla opatrně promíchána s C médiem a dále k nim byl přidán shodný objem D média, které obsahuje LGT (Low Melting) agarózu (Serva, SRN). Výsledkem bylo rovnoměrné rozmístění protoplastů v celém objemu kultivačního média a tím bylo dosaţeno sníţení moţnosti tvorby kalusů z více buněk. Kultivace probíhala ve tmě při teplotě 25°C. Za 30 – 50 dní byly kalusy o velikosti 0,5 mm převedeny na E médium, které obsahovalo jako gelující agens Phytagel (Sigma, SRN), a byly kultivovány rovněţ ve tmě při 25°C. Kalusy o velikosti přibliţně 1 mm byly převedeny na F médium, které obsahovalo Phytagel a z rostlinných fytohormonů navíc kyselinu giberelovou a indolyloctovou pro navození tvorby prýtů. Kultivace probíhala ve sterilních polystyrenových Petriho miskách o průměru 6 cm (Nunc, Dánsko) při fotoperiodě 16 hodin světlo o fotosynteticky aktivním ozáření 20 µE . m-2 . s-1 a teplotě 25°C a 8 hodin tma a teplotě 18°C. Prýty o velikosti větší neţ 10 mm byly odebrány a převedeny na standardní kultivační médium A bez růstových regulátorů, kde došlo k regeneraci kořenů. Sloţení všech médií A – F je uvedeno v Příloze 3.

55

5.5 Analýzy DNA pro detekci somatických hybridů DNA byla extrahována pomocí DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, SRN). Postup izolace je uveden v Příloze 7. Všechny analýzy pomocí PCR probíhaly v 0,2 ml sterilních polypropylénových zkumavkách v termocykleru T-gradient Thermocycler (Biometra, SRN).

5.5.1 RAPD analýza Vybrané genotypy kolekce druhů rodu Solanum byly podrobeny RAPD analýze s cílem charakterizovat vnitrodruhovou a mezidruhovou variabilitu s následným potenciálním vyuţitím metody pro detekci somatických hybridů. Byly otestovány sady dekamerických primerů OPG a OPN (Operon, USA). RAPD polymorfismy byly následně hodnoceny pomocí primerů OPG 8, OPN 3, 5, 8, 11, 15 a 18. U primerů OPN 11 a 18 bylo na základě podobnosti RAPD profilů jednotlivých genotypů provedeno statistické vyhodnocení metodou shlukové analýzy UPGMA v programu Quantity One (Bio-Rad, USA). Pomocí metody RAPD byla dále hodnocena somaklonální variabilita u genotypů S. bulbocastanum 17 a 41 a jejich protoplastových regenerantů pomocí sad RAPD primerů OPN, OPH, OPM, OPF a OPG (Operon, USA). 12,5 µl PCR reakční směsi obsahovalo 1x reakční pufr (10x Taq Buffer with KCl; Fermentas, Litva), 2,5 mM MgCl2, dNTP o koncentraci 0,3 mM, 15 ng primeru, 0,5 jednotky Taq polymerázy (Fermentas, Litva) a 10 ng DNA. Teplotní a časový profil reakce byl následující: 94°C po dobu 180 s při první denaturaci, následované 44 PCR cykly (94°C 20 s denaturace, 36,5°C 45 s annealing, 72°C 105 s elongace) a 72°C po dobu 360 s pro závěrečnou extenzi. Separace produktů amplifikace probíhala 2 hodiny při napětí 5 V.cm-1 vzdálenosti elektrod, v 1 x TBE pufru na 1,5 % horizontálním agarózovém gelu vizualizovaném pomocí ethidiumbromidu

(5g.ml-1).

Elektroforeogramy

byly

dokumentovány

systémem

GelDocTMXR (Bio-Rad, USA). Statistické hodnocení podobností mezi RAPD profily bylo provedeno shlukovou analýzou UPGMA pomocí programu Quantity One (Bio-Rad, USA).

5.5.2 Analýza jaderné DNA Jako CAPS markery byly pro detekci polymorfismů pouţity SPUD 237 a GP21 (de Jong et al., 1997). Sekvence primerů a velikost PCR produktů před štěpením jsou uvedeny v tabulce 3, sloţení PCR reakce a její teplotní a časový profil v tabulkách 4 a 5. Štěpení PCR 56

produktu obou markerů probíhalo pomocí restrikčního enzymu AluI (Fermentas) při 37°C podle instrukcí výrobce. Tabulka 3: Sekvence primerů CAPS markerů GP21 a SPUD 237 Marker

Primer GP21F GP21 GP21R SPUD237F SPUD237 SPUD237R

Sekvence 5´ GGT TGG TGG CCT ATT AGC CAT GC 3´ 5´ AGT GAG CCA GCA TAG CAT TAC TTG 3´ 5´ TTC CTG CTG ATA CTG ACT AGA AAA CC 3´ 5´ AGC CAA GGA AAA GCT AGC ATC CAA G 3´

Produkt 600 bp 400 bp

Tabulka 4: Sloţení reakční směsi pro markery SPUD237 a GP21 DNA Reakční [ng] pufr 1x SPUD237 50 100 1x GP21 Marker

Sloţení 25 μl PCR reakce MgCl2 dNTP Primer F Primer R [mM] [mM] [μM] [μM] 2,5 0,4 0,5 0,5 2,5 0,4 0,5 0,5

Taq polymeráza [unit] 0,5 1

Tabulka 5: Podmínky průběhu PCR reakcí markerů SPUD237 a GP21 Počet cyklů

1x První Krok denaturace Teplota Čas Marker [°C] [s] 94 180 SPUD237 94 180 GP21

Průběh amplifikace 35x Další denaturace Teplota Čas [°C] [s] 94 20 94 20

Annealing Teplota [°C] 55 60

Čas [s] 20 35

Elongace Teplota [°C] 72 72

Čas [s] 45 90

1x Finální elongace Teplota Čas [°C] [s] 72 120 72 120

5.5.3 Analýza chloroplastové a mitochondriální DNA 5.5.3.1 Výběr vhodných univerzálních primerů Na základě literatury bylo vybráno celkem 8 párů univerzálních primerů: 4 páry pro amplifikaci nekódujících oblastí cpDNA a 4 páry pro mtDNA. Jejich charakterizace je uvedena v tabulce 6. Tyto primery nasedají v genomu chloroplastové a mitochondriální DNA do kódujících vysoce konzervativních oblastí exonů příslušných genů, proto jsou tyto primery vysoce specifické pro danou organelovou DNA.

57

Tabulka 6: Charakteristika vybraných cpDNA a mtDNA primerů Název

Gen

Mt1 F Mt1 R Mt2 F

atp9 atp9 nad2/4

5´ CCAAGTGAGATGTCCAAGAT 3´ 5´ CTTCGGTTAGAGCAAAGCC 3´ 5´ TTCATATAGAATCCATGTCC 3´

Mt2 R

nad2/5

5´ CTATTTGTTCTTCGCCGCTT 3´

Mt3 F

rrn5

5´ GAGGTCGGAATGGGATCGGG 3´

Mt3 R

rrn18-1

5´ GGGTGAAGTCGTAACAAGGT 3´

Mt5 F

cox1

5´ TTGTTACGACCACGAAGA 3´

Mt5 R

cox1

5´ TCGGTGCCATTGCTGGAG 3´

Cp3 F Cp3 R Cp4 F Cp4 R

trnL trnL trnL trnF

Cp5 F

rbcL

5´ CGAAATCGGTAGACGCTACG 3´ 5´ GGGGATAGAGGGACTTGAAC 3´ 5´ GGTTCAAGTCCCTCTATCCC 3´ 5´ ATTTGAACTGGTGACACGAG 3´ 5´ATGTCACCACAAACAGAAACTA AAGCAAGT 3´ 5´CTTCACAAGCAGCAGCTAGTTC AGGACTCC 3´ 5´ AGTTCGAGCCTGATTATCCC 3´

Cp5 R

rbcL

Sekvence

trnV 16S 5´ GCATGCCGCCAGCGTTCATC 3´ Cp7 R rRNA A – Arabidopsis thaliana, N – Nicotiana tabacum Cp7 F

Annealing [°C]

Délka produktu [bp]

59

279

59

1800

58

273

59

1360

63

557

63

418

67

64

Pozice

Autor

A 7882179081 A 129794128013 A 161129161383 A 149988151329 4929849855 4985450272

Duminil et al. (2002)

1381

N 5758758967

Hiratsuka et al. (1989)

297

N 102509102805

Al-Janabi et al. (1994)

Duminil et al. (2002) Duminil et al. (2002) Duminil et al. (2002) Taberlet et al. (1991) Taberlet et al. (1991)

5.5.3.2 Optimalizace podmínek amplifikace U všech markerů byla nejprve provedena pro kaţdý pár primerů optimalizace sloţení reakční směsi, kde proměnné představovaly mnoţství MgCl2, dNTP a primerů. Dále byla optimalizována anelační teplota pomocí teplotního gradientu a časový profil reakce. Optimalizace byla uskutečněna vţdy na dvou genotypech druhů S. bulbocastanum a S. berthaultii. Produkty PCR byly separovány 1,5 hodiny při napětí 5 V.cm-1 vzdálenosti elektrod na horizontální agarózové elektroforéze v 1,5 % agarózovém gelu umístěném v 1xTBE pufru. Výsledky byly zdokumentovány systémem GelDocTMXR (Bio-Rad, USA).

5.5.3.3 Detekce variability Vybrané optimalizované markery byly aplikovány na vybranou kolekci genotypů diploidních a tetraploidních druhů rodu Solanum. Byla sledována variabilita mezidruhová i vnitrodruhová. Vnitrodruhová variabilita byla charakterizována u druhů čítajících větší počet genotypů získaných z různých genových bank na světě (tj. z různých populací).

58

U většiny vybraných markerů nebyla detekována variabilita ve velikosti produktů amplifikace, a proto bylo pouţito restrikční štěpení těchto produktů pomocí vybraných enzymů, analýza SSCP (detekce jednovláknového konformačního polymorfismu) a DGGE (denaturační gradientová gelová elektroforéza), popřípadě CDGE (konstantní denaturační gelová elektroforéza). U analýzy metodou SSCP probíhala separace PCR produktů markerů Mt3 a Cp4 ve vertikálním 8 % akrylamidovém gelu (AA : bisAA – 37,5 :1) o rozměrech 16 x 16 x 0,075 cm v 1 x TBE pufru. Vzorky byly denaturovány 95 % formamidem při 95°C po dobu 10 min a separovány při 30 W po dobu 210 min v cele DCode (Bio-Rad) při 15°C a vizualizovány v 1 x TBE pufru pomocí ethidium bromidu (1,5 μg.ml-1 barvící lázně). Metody DGGE a CDGE musely být nejprve optimalizovány z hlediska koncentrace akrylamidu, denaturantů (močoviny a formamidu) v elektroforetickém gelu a dále z hlediska teplotního a časového profilu elektroforézy. Pomocí těchto metod byly poté analyzovány čtyři markery Mt1, Mt3, Cp4 a Cp7. Všechny analýzy probíhaly ve vertikálním akrylamidovém gelu (AA : bisAA – 37,5 :1) o rozměrech 16 x 16 x 0,1 cm v 1 x TAE pufru (40 mM Tris, 20 mM ledová kyselina octová, 1 mM EDTA, pH 8,0) obsahujícím denaturační činidla močovinu a formamid. Například 40 % koncentrace denaturantů se skládá z 16 ml formamidu a z 16,8 g močoviny na 100 ml roztoku gelu. Koncentrace akrylamidového gelu a denaturačních činidel byly optimalizovány pro kaţdý marker zvlášť a jsou uvedeny v části výsledky a diskuze v kapitole 6.4.3.2.3. Výsledky separace byly vizualizovány pomocí ethidium bromidu (1,5 μg.ml-1). Perpendikulární denaturační gradientová elektroforéza (DGGE) probíhala 120 min při teplotě 56°C a napětí 150V v cele DCode (Bio-Rad). Pomocí perpendikulární denaturační gradientové elektroforézy byla stanovena optimální koncentrace denaturačních činidel (kapitola 6.4.3.2.3) pro konstantní gradientovou elektroforézu (CDGE), která následně umoţní detekovat konkrétní bodové mutace u konkrétních genotypů. Parametry konstantní gradientové elektroforézy byly optimalizovány a jsou uvedeny v části výsledky a diskuze v kapitole 6.4.3.2.4. Všechny výsledky byly dokumentovány systémem GelDocTMXR (Bio-Rad, USA). Statistické hodnocení variability bylo provedeno pomocí programu Quantity One (Bio-Rad, USA) – u metody CDGE byl na základě podobnosti elektroforetických drah vybraných genotypů u markeru Cp4 shlukovou analýzou sestaven dendrogram.

59

5.5.3.4 Stanovení sekvencí vybraných markerů Pro ověření mezidruhové variability detekované markerem Cp4 metodou CDGE byla provedena sekvenace PCR produktů tohoto markeru u vybraných genotypů. Pro ověření výsledků molekulárně genetických analýz byla u vybraných genotypů dále provedena přímá oboustranná sekvenace produktů markerů Mt1, Mt3, Cp3 a Cp7 pomocí sekvenátoru ABI 3110 (Applied Biosystems, USA). Výsledky byly zpracovány v programu BioEdit a sekvence porovnány s nukleotidovou databází NCBI.

5.6 Detekce somatických hybridů Všechny genotypy získané in vitro regenerací protoplastových kultur a jejich rodiče byly převedeny do skleníku, aby bylo moţno provést komplexní hodnocení. Jednalo se o celkem 42 genotypů, z toho 3 genotypy druhu S. bulbocastanum, 1 x S. verrucosum, 2 x dihaploidy S. tuberosum ssp. tuberosum, 7 x rostliny vzniklé regenerací protoplastů pouze S. bulbocastanum a 29 potenciálních somatických hybridů. Dále bylo 18 genotypů převedeno ze skleníku do polních podmínek na pokusné pole České zemědělské univerzity v lokalitě Praha 6 – Suchdol. Do polního pokusu bylo v roce 2009 zařazeno celkem 18 genotypů, z toho 1x S. bulbocastanum (S. blb 17), 1 x dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum (DH 165), 3 x rostliny vzniklé regenerací protoplastů pouze S. bulbocastanum (REG 5, 9 a 36) a 13 potenciálních somatických hybridů (REG 28 F, 29 F, 30 F, 31 F, 32 F, 34 F, 35 F, 38 F, 40 F, 43 F, 44 F, 46 F a 47 F). Výsadba pokusu proběhla ve druhé polovině května roku 2009. Rostliny o velikosti 20 cm ve stáří 4 týdnů byly vysázeny do hrůbků po pěti exemplářích od kaţdého genotypu. Během sezóny byla podle signalizace provedena dvě insekticidní ošetření proti mandelince bramborové (Leptinotarsa decemlineata) přípravkem Mospilan 20SP. Přípravek byl aplikován ručním postřikovačem dle pokynů na etiketě přípravku. Ve druhém roce pokusů proběhla standardní výsadba hlíz o velikosti 3 – 6 cm získaných z polního pokusu v předešlém roce. K výsadbě bylo pouţito 12 genotypů somatických hybridů s dostatečným počtem hlíz a tudíţ s předpokladem vyššího výnosového potenciálu (REG 28 F, 29 F, 30 F, 32 F, 34 F, 35 F, 38 F, 40 F, 43 F, 44 F, 46 F a 47 F). Dále byly vysázeny hlízy dvou genotypů

S. tuberosum ssp. tuberosum dihaploid DH 387 a

tetraploidní odrůda Apta, ze které byl odvozen dihaploid DH 165, jedna z rodičovských komponent vytvořených somatických hybridů. Pokus byl doplněn o výsadbu rostlin genotypů 60

REG 48 F, 67 F, 69 F a 72 F. Výsadba pokusu proběhla ve druhé polovině května roku 2010. Hlízy i rostliny byly rovněţ vysázeny do hrůbků po pěti exemplářích od kaţdého genotypu, avšak ve dvou opakováních. Během sezóny byla podle signalizace provedena tři insekticidní ošetření proti mandelince bramborové (Leptinotarsa decemlineata) přípravkem Mospilan 20SP ručním postřikovačem dle pokynů na etiketě přípravku. Sklizeň pokusů proběhla v polovině října. Hodnocení genotypů zahrnovalo jednak morfologický popis, dále metody nepřímé detekce (odhadu) stupně ploidie rostlin pomocí níţe uvedených cytologických měření a dále dvě nezávislé metody molekulární analýzy DNA.

5.6.1 Morfologické a cytologické metody detekce somatických hybridů 5.6.1.1 Morfologické hodnocení U rostlin převedených do skleníku a do polních podmínek bylo provedeno vizuální hodnocení a fotodokumentace. Rostliny z dvouletého polního pokusu byly dále popsány pomocí klasifikátoru pro rod Solanum (Vidner et al., 1987). U nadzemních částí rostlin bylo klasifikováno celkem 25 parametrů.

5.6.1.2 Detekce stupně ploidie 5.6.1.2.1 Průtoková cytometrie Jako exaktní důkaz zvýšeného počtu chromozómů regenerovaných rostlin ve srovnání s výchozími partnerskými genotypy byla vyuţita analýza velikosti jader průtokovou cytometrií ve spolupráci s ÚEB AV v Olomouci a s Botanickým ústavem AV ČR, v.v.i. v Průhonicích. Pro detekci stupně ploidie metodou průtokové cytometrie byly pouţity rostliny, převedené z in vitro podmínek do skleníku, ve stáří 3 týdnů. Bylo analyzováno celkem 44 genotypů, z toho 3 genotypy druhu S. bulbocastanum, 1 x S. verrucosum, 2 x dihaploidy S. tuberosum ssp. tuberosum, 9 x rostliny vzniklé regenerací pouze S. bulbocastanum a 29 potenciálních somatických hybridů. Jako srovnávací standard byla pouţita diploidní rostlina sedmikráska obecná (Bellis perenis) z důvodů nízkého obsahu jader v G2 fázi buněčného cyklu, coţ zajišťuje správnou interpretaci výsledků analýzy.

61

Vzorky pro vlastní analýzu byly připraveny modifikovanou metodou dle Otto (1990) skládající se z několika bodů: 1. Příprava barvícího pufru přidáním 1 ml zásobního roztoku fluorochromu DAPI a 50 µl β – merkaptoethanolu do 25 ml pufru Otto II. Zásobní roztok β – merkaptoethanolu má koncentraci 2 µl.ml-1 a slouţí k zabránění oxidace polyfenolických látek. 2. Nařezání mladých nepoškozených listů o velikosti 1 cm2 analyzovaného genotypu společně s dvojnásobným mnoţstvím listů srovnávacího standardu rostliny Bellis perenis novou ţiletkou v Petriho misce obsahující 500 µl pufru Otto I chlazeného v ledové lázni. 3. Promíchání a přefiltrování vzniklé suspenze přes nylonové síto o průměru ok 42 µm. 4. Inkubace vzorku při laboratorní teplotě po dobu 5 min. 5. Přidání 1 ml pufru Otto II obohaceného o fluorochrom (viz. 1. bod postupu) a dobře promíchat. 6. Inkubace ve tmě při pokojové teplotě po dobu 5 min. 7. Analýza obsahu DNA izolovaných jader ve vzorku pomocí průtokového cytometru Partec PAS (Německo). Pufr Otto I má sloţení 0,1 M monohydrát kyseliny citrónové a 0,5 % Tween 20, filtruje se přes 0,22 µm filtr a uchovává se při teplotě 4°C. Pufr Otto I se skládá z 0,4 M Na2HPO4 . 12 H2O, filtruje se přes 0,22 µm filtr, uchovává se při teplotě 4°C a před kaţdým pouţitím je třeba ho znovu přefiltrovat. Chemický název fluorochromu DAPI je 4´-6diamidin-2-phenylindol (C16H15N5). Jedná se o modré fluorescenční barvivo, které tvoří komlexy s molekulami DNA vazbou na A – T páry. Zásobní roztok DAPI barviva má koncentraci 0,1 mg.ml-1, filtruje se přes 0,22 µm filtr a uchovává se při -20°C ve zkumavkách o objemu 1 ml (Otto, 1990; Gichner et al., 2006). Z výsledků analýz průtokovou cytometrií byl stanoven stupeň ploidie a sloţení genomu somatických hybridů.

5.6.1.2.2 Analýza uzavíracích párových buněk průduchů Metoda průtokové cytometrie byla doplněna nepřímým hodnocením stupně ploidie analýzou velikosti průduchových buněk a počtu chloroplastů v obou svěracích buňkách průduchu. Byla odebrána část spodní pokoţky ze středové části listů prvních čtyř listových 62

pater rostliny a obarvena 0,1 % AgNO3. V rámci této analýzy byly vzájemně porovnány genotypy Solanum bulbocastanum 17 (2n), DH 387 (2n), S. tuberosum R10 (4n) a somatický hybrid REG 34 F (4n). Výsledky byly statisticky zpracovány v programu Statistica CZ (Statsoft verze 9.0).

5.6.2 Molekulárně genetické metody detekce somatických hybridů Jako důkaz hybridnosti genotypu byly vyuţity dvě nezávislé metody molekulární analýzy DNA, které měly doloţit jak hybridnost v oblasti jaderné DNA tak i DNA cytoplazmatické.

5.6.2.1 RAPD analýza Hodnocení hybridnosti celkové DNA bylo provedeno metodou RAPD. Pro analýzu bylo pouţito celkem 8 RAPD primerů OPN 8, 11, 13, 14, 15, 20, OPH 20 a OPF 5. Sloţení reakční směsi, teplotní a časový profil PCR reakce a metoda vyhodnocení jsou uvedeny v kapitole 5.5.1.

5.6.2.2 Analýza chloroplastového markeru Cp4 Chloroplastová DNA rodičovských genotypů a potenciálních somatických hybridů byla analyzována na základě markeru Cp4 metodou DGGE a CDGE. Postup analýzy je uveden v kapitole 5.5.3.3. Pro detailní vyhodnocení byl tento produkt osekvenován u genotypů Solanum bulbocastanum PIS 66, 17, Solanum verrucosum 299, DH 165, 322 a potenciálních somatických hybridů REG 20 F, 24 F, 30 F, 34 F, 35 F, 39 F a 52 F a vyhodnocen v programu BioEdit.

5.7 Charakteristika vybraných vlastností somatických hybridů z hlediska vyuţitelnosti ve šlechtění bramboru 5.7.1 Fenotypové zhodnocení odolnosti somatických hybridů k Phytophthora infestans Pro fenotypové zhodnocení odolnosti genotypů, převedených do skleníku, k P. infestans byl pouţit infekční test metodou listových terčíků (Příloha 5) (Zadina a Jermoljev, 63

1976). Detailní popis této metody je uveden v kapitole 5.3.1. Dále byla zhodnocena odolnost v polních podmínkách s přirozeným infekčním tlakem patogena.

5.7.2 Tvorba a výnosový potenciál hlíz Všechny genotypy potenciálních somatických hybridů a jejich rodičů byly hodnoceny z hlediska schopnosti tvořit hlízy. U hlíz byla dále provedena fotodokumentace a morfologické hodnocení pomocí klasifikátoru pro rod Solanum (Vidner et al., 1987). Bylo hodnoceno celkem 9 parametrů u všech genotypů z polního a skleníkového pokusu. U vybraných genotypů z dvouletého polního pokusu byl orientačně stanoven výnosový potenciál v t.ha-1, kde na 1 ha bylo počítáno se 44 000 trsy (rostlinami).

5.7.3 Předpoklady pro sexuální kříţení U rostlin ve skleníku i v polním pokusu bylo provedeno reciproké kříţení. Do pokusu byly zahrnuty tetraploidní genotypy somatických hybridů a tetraploidní referenční klony Solanum tuberosum ssp. tuberosum odolné k jednotlivým rasám Phytophthora infestans. Dále bylo provedeno opylení somatických hybridů pylem odrůd kulturního bramboru. Jednalo se o pyl odrůd Vendula, Bella, Evelin, Nomade a Valfi, který byl získán ve spolupráci s genovou bankou při Výzkumném ústavu bramborářském v Havlíčkově Brodě. U zralých poupat byly odstraněny prašníky a pyl byl štětečkem nanesen na bliznu.

5.7.3.1 Viabilita pylových zrn U genotypů somatických hybridů REG 28 F, 29 F, 30 F, 32 F, 34 F, 35 F, 38 F, 43 F, 44 F, 46 F, 47 F, odrůdy Valfi a u jedince vzniklého regenerací protoplastů pouze genotypu S. bulbocastanum REG 5 byla stanovena viabilita. Z rostlin byly odebrány celé květy, usušeny a uskladněny při laboratorní teplotě 20°C a pyl byl odebrán z květů vţdy před kaţdým stanovením. U odrůdy Valfi a genotypu REG 43 F byly květy usušeny, poté byl odebrán pyl, uskladněn při teplotě 4°C a poté pouţit k analýzám. Viabilita pylových zrn byla stanovena barvením preparátu Lugolovým roztokem (Wang et al., 2004). Lugolův roztok se pouţívá pro barvení škrobových zrn, kde tmavě zbarvené pylové zrno je definováno jako ţivotaschopné. Roztok se skládá z 5 % I2 a 10 % KI, kde koncentrace iodu je 130 mg.ml-1. Viabilita byla stanovena v procentech.

64

Viabilita pylových zrn byla statisticky vyhodnocena metodou analýzy rozptylu jednoduchého třídění v programu Statistica CZ (Statsoft verze 9.0).

5.7.4 Orientační stanovení obsahu solaninu a chaconinu v hlízách Obsah vybraných alkaloidů byl stanoven ve spolupráci s Katedrou chemie FAPPZ ČZU v Praze. Bylo provedeno orientační stanovení pouze obsahu solaninu a chaconinu, jejichţ limitní mnoţství v hlízách kulturních odrůd brambor je 200 mg.kg-1 čerstvé hmoty hlíz i se slupkou (Rayburn et al., 1995). Analyzovány byly hlízy 9 genotypů, sklizené z polního pokusu v roce 2009 v lokalitě Praha 6 – Suchdol. Jednalo se o jeden genotyp Solanum bulbocastanum PIS 17, dihaploid S. tuberosum

DH 165, rostliny vzniklé regenerací

protoplastů pouze ze S. bulbocastanum - REG 5 a somatické hybridy REG 30 F, 34 F, 35 F, 38 F, 43 F a 44 F. K 15 g omytých a osušených syrových hlíz ve slupce bylo přidáno 60 ml methanolu. Hlízy byly mixovány a suspenze byla poté kvantitativně převedena přes papírový filtr do 100 ml baňky a roztok byl doplněn methanolem na objem 100 ml. Roztok byl dále filtrován přes membránový bakteriologický filtr 0,45 µm pro odstranění zbylých nečistot. Obsah solaninu a chaconinu byl stanoven metodou kapalinové chromatografie na přístroji, jehoţ komponenty tvořil chromatografický systém pro HPLC - Ultimate 3000 RS (Dionex, USA) a hmotnostní detektor - 3200 QTRAP (Applied Biosystems, USA). Obsah solaninu a chaconinu byl stanoven v mg.kg-1 čerstvé hmoty a sušiny. Parametry stanovení sušiny v horkovzdušné sušárně byly 24 a 32 hodin při teplotě 105°C. Suma hodnot obsahu obou alkaloidů byla porovnána s limitním mnoţstvím 200 mg.kg -1.

65

6 VÝSLEDKY A DISKUZE 6.1 Optimalizace metod izolace protoplastů 6.1.1 Izolace protoplastů z mezofylu listů V rámci této etapy výzkumu byl sledován průběh uvolňování protoplastů z mezofylu listů dvou genotypů R7 a R11 z diferenciační sady klonů tetraploidního bramboru Solanum tuberosum ssp. tuberosum. Naváţka u genotypu R7 činila 289,3 mg a u R11 287,8 mg. Koncentrace protoplastů v 1 ml byla stanovena v hodinových intervalech. Diference byly přepočítány na standardní naváţku 1 g čerstvé listové biomasy a jsou uvedeny v příloze 8. Byla provedena regresní a korelační analýza závislosti koncentrace vyizolovaných protoplastů na době extrakce (Obrázek 3). Výsledek u obou genotypů odpovídá charakteru logaritmické funkce a prakticky popisuje průběh enzymatické aktivity. Korelační koeficient má u genotypu R7 hodnotu r = 0,9623 a u R11 r = 0,9675, jedná se tedy o velmi silnou závislost na hladině významnosti α = 0,05. Obrázek 3: Graf závislosti koncentrace uvolněných protoplastů na čase během působení celulolytických enzymů Graf závislosti koncentrace vyizolovaných protoplastů na délce inkubace Koncentrace protoplastů R11 * g-1 * ml-1 = -1,0787*106+2,342*107*log10(x) Koncentrace protoplastů R7 * g-1 * ml-1 = -4,3649*105+1,7376*107*log10(x)

30000000

Koncentrace protoplastů [ks.g-1.ml-1]

25000000

20000000

15000000

10000000

5000000

0

-5000000 0

2

4

6

8

Délka inkubace [hodiny]

66

10

12

Koncentrace protoplastů genotypu R11 Koncentrace protoplastů genotypu R7

6.1.2 Vliv sloţení médií pro kultivaci výchozího materiálu na výtěţnost a viabilitu protoplastů Byl testován vliv sloţení média na kultivaci výchozího rostlinného materiálu s cílem získání co největší listové plochy pro zvýšení výtěţnosti izolace protoplastů z mezofylu rostlin. V pokusu byly pouţity tři diploidní genotypy Solanum verrucosum 299, S. bulbocastanum PIS 54 a S. berthaultii 260. Výsledky všech měření jsou uvedeny v Přílohách 9 a 10. Zjištěné hodnoty byly statisticky zpracovány metodou analýzy rozptylu hlavních efektů v programu Statistica CZ (Statsoft verze 7.0) (Tabulka 7). Vzhledem k tomu, ţe struktura pokusů, místo a čas jejich provedení byly stejné, lze vţdy hodnotit vliv pouze jednoho faktoru. Mezi hodnocené třídící faktory patřily druh, typ média a obsah morforegulátorů. Hodnocena byla délka rostlin, počet listů, hmotnost rostlin a hmotnost sušiny rostlin. Tabulka 7: Analýza rozptylu hlavních efektů vyhodnocená komplexně pro všechny měřené znaky Vícerozměrné testy významnosti. (Tabulka médií s Alarem 85) Sigma-omezená parametrizace Dekompozice efektivní hypotézy Efekt Test Hodnota F Efekt SV Chyba SV Wilksův 0,020149 206,6775 4 17 Abs. člen Wilksův 0,050680 14,6286 8 34 Druh Wilksův 0,531508 1,5795 8 34 Médium -1 0,276416 3,8336 8 34 Alar 85 [mg .l ] Wilksův

p 0,000000 0,000000 0,167694 0,002631

Vzhledem k tomu, ţe pro třídící faktor druh vyšel průkazný F-test můţeme na hladině významnosti α = 0,01 říci, ţe existuje alespoň jedna dvojice botanických druhů, která se mezi sebou statisticky významně liší ve všech sledovaných znacích. F-test vyšel průkazný i pro třídící efekt Alar 85, kde lze na hladině významnosti α = 0,01 nalézt alespoň jednu dvojici koncentrací Alaru 85 v médiu, které se statisticky významně liší. Pro tato dvě třídící kritéria bylo provedeno podrobnější vyhodnocení Tukeyho metodou, kde uţ byl kaţdý znak hodnocen zvlášť. Třídící efekt médium neměl vliv na sledované znaky, coţ se neshoduje s výsledky Bříza a Machová (1991), kteří uvádějí, ţe na SH médiu měly rostliny kratší internodia a větší listy oproti MS médiu. Důvodem neshody by mohla být kultivace odlišných genotypů příslušících jinému druhu rodu Solanum s odlišným stupněm ploidie. Autoři Bříza a Machová (1991) pouţili ke svým pokusům tetraploidní odrůdy bramboru Xenia a Bintje (Solanum tuberosum ssp. tuberosum). 67

Podrobnějším vyhodnocením průměrné délky rostlin v cm Tukeyho metodou byl na hladině významnosti α = 0,01 prokázán statisticky velmi významný rozdíl mezi druhy S. verrucosum a S. berthaultii a mezi druhy S. berthaultii a S. bulbocastanum (Tabulka 8). Dále byl na stejné hladině významnosti prokázán statisticky velmi významný rozdíl mezi koncentrací Alaru 85 5 mg.l-1 s AgNO3 7,5 mg.l-1 a ostatními variantami (Tabulka 9). V rámci hodnocení průměrného počtu listů na jedné rostlině existuje na hladině významnosti α = 0,01 statisticky velmi významný rozdíl mezi druhem S. bulbocastanum a ostatními dvěma druhy (Tabulka 10). V ostatních parametrech nebyl nalezen statisticky průkazný rozdíl. Tabulka 8: Podrobné vyhodnocení Tukeyho metodou, kde proměnná je průměrná délka rostliny a třídícím faktorem druh

Č. buňky 1 2 3

Tukeyův HSD test; proměnná Průměrná délka 1 rostliny [cm] (Tabulka médií s Alarem 85) Přibliţné pravděpodobnosti pro post hoc testy Chyba: meziskup. PČ = 3,5429, sv = 20,000 {1} {2} {3} Druh 7,6278 3,8922 9,1248 0,001315 0,234629 S. verrucosum 0,001315 0,000163 S. berthaultii 0,234629 0,000163 S. bulbocastanum

Tabulka 9: Podrobné vyhodnocení Tukeyho metodou, kde proměnná je průměrná délka rostliny a třídícím faktorem koncentrace Alaru 85 a AgNO3

Č. buňky 1 2 3

Tukeyův HSD test; proměnná Průměrná délka 1 rostliny [cm] (Tabulka médií s Alarem 85) Přibliţné pravděpodobnosti pro post hoc testy Chyba: meziskup. PČ = 3,5429, sv = 20,000 {1} {2} {3} Alar 85 [mg.l-1] 8,5814 7,6244 4,4389 0,537975 0,000531 0 0,537975 0,005085 1 0,000531 0,005085 5

68

Tabulka 10: Podrobné vyhodnocení Tukeyho metodou, kde proměnná je průměrný počet listů na 1 rostlině a třídícím faktorem druh

Č. buňky 1 2 3

Tukeyův HSD test; proměnná Průměrný počet listů na 1 rostlině (Tabulka médií s Alarem 85) Přibliţné pravděpodobnosti pro post hoc testy Chyba: meziskup. PČ = 15,309, sv = 20,000 {1} {2} {3} Druh 10,903 8,8900 24,070 0,530208 0,000145 S. verrucosum 0,530208 0,000145 S. berthaultii 0,000145 0,000145 S. bulbocastanum

Z tabulek je patrné, ţe délka internodálních segmentů a počet listů jsou u in vitro rostlin druhově specifické. Bylo rovněţ potvrzeno, ţe vyšší dávka morforegulátoru Alar 85 a dusičnanu stříbrného obecně ovlivňuje zkracování internodií. Přípravek s obchodním názvem Alar 85 obsahuje 85 % účinné látky daminozid (N-dimethylamino sukcinová kyselina - C6H12N2O3). Daminozid je rostlinný růstový regulátor původně vyuţívaný pouze u ovocných dřevin k regulaci jejich růstu, usnadňující sklizeň a zlepšující barvu jejich plodů. V současné době je vyuţíván i u mnoha zemědělských plodin určených k potravinářskému vyuţití. Daminozid částečně blokuje 3 -hydroxylaci a tím inhibuje tvorbu vysoce aktivních giberelových kyselin z neaktivních prekurzorů (Rademacher, 2000). Inhibuje internodální prodluţování a tím podporuje tvorbu kompaktnějších rostlin. Dusičnan stříbrný inhibuje tvorbu ethylenu (Bříza a Machová, 1991). Přepočtem hmotnosti čerstvé listové biomasy na 1 cm výšky rostliny byl prokázán statisticky velmi významný rozdíl na hladině významnosti α = 0,01, kde vykazují zvýšení hmotnosti biomasy listů rostliny kultivované na růstových regulátorech o koncentraci Alaru 85 5 mg.l-1 s AgNO3 7,5 mg.l-1 (78,75 mg.cm-1) oproti variantám s niţší dávkou (48,66 mg.cm-1) a bez morforegulátorů (7,2 mg.cm-1) (Tabulka 11). Tyto rozdíly mohou být způsobeny jednak zvětšením listové plochy, jednak zmohutněním stonků. Tyto faktory však nebyly v této práci posuzovány. Z výsledků proto nelze určit, zda se přídavkem morforegulátorů zvětšuje listová plocha, jak uvádějí Bříza a Machová (1991). Koncentraci morforegulátorů Alaru 85 5 mg.l-1 s AgNO3 7,5 mg.l-1 by bylo moţné vyuţít i při dlouhodobém uchovávání genotypů, kde by se prodlouţil interval mezi pasáţemi přibliţně o 4 týdny v závislosti na genotypu, coţ umoţní lepší organizaci práce při zpracovávání větších objemů in vitro kultur (Obrázek 4). 69

Pro vyhodnocení závislosti počtu vyizolovaných protoplastů na hmotnosti naváţky listů byl pouţit model lineární regrese. Závislost nebyla prokázána, coţ potvrzuje i hodnota korelačního koeficientu r = 0,09, a proto nebyla hodnocena viabilita protoplastů v souvislosti s koncentrací vyizolovaných protoplastů v 1 ml suspenze přepočítanou na 1 g naváţky listů. Z tohoto důvodu byla provedena regresní a korelační analýza závislosti ţivotaschopnosti na reálné výtěţnosti protoplastů programem Statistica CZ (Statsoft verze 7.0). Modelem lineární regrese byla detekována pozitivní korelace (r = 0,476). Ţivotaschopnost protoplastů je však pouze z 22,66 % vysvětlována jejich reálnou výtěţností. To znamená, ţe se na ţivotaschopnosti protoplastů budou rovněţ podílet další blíţe nespecifikované faktory. Tabulka 11: Podrobné vyhodnocení Tukeyho metodou, kde proměnná je průměrná hmotnost čerstvé biomasy na 1 cm délky rostliny a třídícím faktorem koncentrace Alaru 85 a AgNO 3

Č. buňky 1 2 3

Tukeyův HSD test; proměnná Hmotnost na 1 cm (Tabulka 1) Přibliţné pravděpodobnosti pro post hoc testy Chyba: meziskup. PČ = ,00021, sv = 20,000 {1} {2} Alar 85 [mg.l-1] 0,03720 0,04866 0,236810 0 0,236810 1 0,000156 0,000853 5

70

{3} 0,07875 0,000156 0,000853

Obrázek 4: Solanum bulbocastanum PIS 54 kultivované in vitro na médiu s koncentrací Alaru 85 5 mg.l-1 s AgNO3 7,5 mg.l-1 (vpravo) a 0 mg.l-1 (vlevo)

6.2 Výběr výchozího materiálu vhodného pro somatickou hybridizaci 6.2.1 Fenotypové zhodnocení odolnosti klonů k Phytophthora infestans Hodnocená kolekce 136 genotypů vykazovala vysokou variabilitu v reakci na působení Phytophthora infestans (Příloha 11). U všech 11 dihaploidů Solanum tuberosum ssp. tuberosum byla detekována 100 % náchylnost hodnocená pomocí metody listových terčíků. Vysokou náchylnost rovněţ vykazovaly například genotypy Solanum polyadenium (99,5 % poškozené listové plochy), S. vernei 068 (57 %). Středně odolné byly například S. microdontum (27 %), odolné S. verrucosum (10 %) nebo většina klonů S. berthaultii. Klon S. berthaultii 260 nevykázal ţádný příznak infekce. Podrobnější hodnocení 66 genotypů druhu Solanum bulbocastanum z původního počtu 79 s deklarovanou přítomností genu rezistence Rpi-blb1 ukázalo výraznou variabilitu reakce těchto genotypů na přítomnost patogena. U ţádného se neprojevila fruktifikační aktivita patogena ani přítomnost mycelia. Mezi genotypy se vyskytovali tři jedinci, kteří nevykazovali jakékoliv známky infekce (bezpříznakovost, imunita). Ostatní genotypy reagovaly na 71

napadení hypersenzitivní reakcí, která byla rozsahem poškození listové plochy vysoce variabilní. Hypersenzitivní reakcí bylo zasaţeno 2 – 96 % hodnocené listové plochy terčíků. Z hlediska reakce těchto genotypů S. bulbocastanum na přítomnost pouţitého izolátu patogena je moţné konstatovat rezistenci těchto klonů. Z hlediska vhodnosti tohoto materiálu pro vyuţití v rezistentním šlechtění popřípadě pro somatickou hybridizaci lze doporučit jen genotypy s poškozením listové plochy maximálně do 25 %. Dojde-li k odumření pletiva na většině asimilační plochy listů, rostlina výrazně sniţuje fotosyntetickou aktivitu, coţ by mělo za následek i zhoršování výnosotvorných schopností. Bylo provedeno statistické zhodnocení shodnosti dvou infekčních testů, metody listových terčíků a inokulace in vitro u 66 genotypů S. bulbocastanum pomocí analýzy asociace. Výsledky hodnocení jsou uvedeny v tabulce 12. Obě metody testování virulence patogena vykazovaly míru asociace 84 %, avšak bylo zaznamenáno 11 % případů, kdy opakovaně došlo k extrémní neshodě výsledků hodnocení mezi metodami. Tento jev lze vysvětlit odlišným fyziologickým stavem testované rostliny a vlivem vnějších faktorů prostředí, jakými byly sloţení kultivačních médií, vlhkostní a teplotní podmínky při zakládání infekčních testů, lidský faktor (subjektivní hodnocení pokusů) apod. Výsledná odolnost konkrétního genotypu S. bulbocastanum je proto zřejmě funkcí jeho genové výbavy (gen Rpiblb1), dalších fyziologických pochodů v rostlině a faktorů vnějšího prostředí. Tabulka 12: Statistické hodnocení infekčních testů u 66 genotypů Solanum bulbocastanum Odolný / středně odolný genotyp Náchylný genotyp Inokulace listových terčíků

49

17

Inokulace in vitro rostlin (VÚB)

53

13

Koeficient korelace

R = 0,5465

Intenzita asociace

Q = 0,8432

6.2.2 Výběr vhodných genotypů z hlediska izolace protoplastů Ze 136 genotypů rodu Solanum bylo vybráno 15 odolných genetických zdrojů a 11 dihaploidů bramboru uvedených v tabulce 13, jako potenciálně vhodný materiál pro tvorbu somatických hybridů. Dále u nich byla testována výtěţnost izolace nativních protoplastů. Výtěţnost protoplastů kolísala řádově mezi 1.105 a 3.106 . ml-1, coţ se přibliţně shoduje 72

s výsledky Greplová a Polzerová (2007) a Trabelsi et al. (2005). Mnoţství získaných nativních protoplastů bylo zcela náhodné a vysoce kolísavé i u jedné varianty jednoho genotypu, coţ potvrzují i základní statistické parametry, kdy směrodatná odchylka aritmetického průměru (S = 1.106 protoplastů . ml-1) hodnotu aritmetického průměru převyšuje (x = 744,6 tis. protoplastů . ml-1). Výtěţnost protoplastů nebyla závislá na mnoţství naváţky, coţ bylo prokázáno v kapitole 6.1.2. U některých genotypů nebylo moţné opakovaně získat dostatečné mnoţství nativních protoplastů, coţ se shoduje se závěry Binding et al. (1977). V tomto případě by byla nutná nová optimalizace sloţení médií zejména z hlediska osmotického potenciálu a obsahu iontů v médiích pro izolaci a kultivaci protoplastů pro kaţdý genotyp zvlášť a pravděpodobně by pak tato média nebyla kompatibilní s ostaními, coţ by ztíţilo proces somatické hybridizace.

73

Tabulka 13: Seznam genotypů vybraných pro somatickou hybridizaci na základě infekčních testů odolnosti vůči Phytophthora infestans Poškození listové plochy Genotyp (listové terčíky) 

Stupeň rezistence (listové terčíky)

Stupeň rezistence (in vitro rostliny VÚB)

Shoda

Genotyp

Poškození listové plochy (listové terčíky) 

Stupeň rezistence (listové terčíky)

SB PIS S. BER 0,00 R R ANO 0,00 R 17 a 260 SB PIS S. VERU 0,00 R R ANO 9,00 R 23 299 a SB PIS 2,20 R R ANO 100,00 S DH 165 a 40 a SB PIS 0,00 R M NE 100,00 S DH 185 a 41 a SB PIS 19,00 R R ANO 100,00 S DH 315 a 47 a SB PIS 0,00 R M NE 100,00 S DH 318 a 59 SB PIS 8,33 R R ANO 100,00 S DH 322 a 60 a SB PIS 47,00 M M ANO 100,00 S DH 323 61 a SB PIS 13,33 R R ANO 100,00 S DH 324 a 66 a SB PIS 0,00 R R ANO 100,00 S DH 329 a 70 a SB PIS 23,00 R R ANO 100,00 S DH 387 a 71 a SB PIS 6,67 R R ANO 100,00 S DH 388 a 73 a SB PL 0,00 R 100,00 S DH 447 a 14 SB PIS / PL – Solanum bulbocastanum, S. BER – S. berthaultii, S. VERU – S. verrucosum, DH – dihaplod S. tuberosum ssp. tuberosum, R – odolný, M – středně odolný, S - náchylný a úspěšná izolace protoplastů

6.3 Tvorba somatických hybridů 6.3.1 Fúze, kultivace a regenerace protoplastových kultur Celkem byla provedena kultivace protoplastů u 19 genotypů rodu Solanum, ze kterých bylo 17 genotypů v 16 různých kombinacích pouţito pro fúzi protoplastů v elektrickém poli. Bylo kultivováno celkem 141 Petriho misek, z nichţ 74 obsahovalo fúzovaný materiál. Kaţdá Petriho miska obsahovala 400 µl suspenze protoplastů a 1200 µl kultivačního média. Výsledná koncentrace protoplastů při kultivaci činila přibliţně 100 000 ks.ml-1 média. Regenerace buněčné stěny proběhla během 2 – 3 dnů. První mitózu prodělaly buňky přibliţně do 8 – 12 dnů od počátku kultivace stejně jako u Fish et al. (1988), zatímco Mattheji a Puite (1992) uvádějí nástup první mitózy jiţ po třech dnech kultivace a Binding et al. (1978) 74

po 2 – 8 dnech v závislosti na genotypu. Rozdíly v nástupu regenerace nemusí být způsobeny pouze genotypem, ale dle mého názoru i typem pouţitých kultivačních médií. Po několika mitózách vytvářely buňky tzv. mikrokalusy. Jakmile kalusy dosáhly velikosti alespoň 0,5 mm, byly převedeny na E médium. Na tomto médiu bylo kultivováno celkem 3926 kalusů, ze kterých 3042 bylo produktem procesu elektrofúze a 884 tímto procesem neprošlo. Při dosaţení velikosti přibliţně 1 mm byly převedeny na F médium pro regeneraci prýtů. Na toto médium bylo převedeno 715 kalusů, z nichţ 595 vzniklo regenerací fúzovaných protoplastů. Přibliţně po 60 aţ 90 dnech kultivace dosahovaly kalusy velikosti 2 mm a po 150 dnech začaly u prvních z nich regenerovat prýty. Prýty byly odebrány a kultivovány na A médiu, kde u některých z nich během 60 dnů proběhla regenerace v novou rostlinu. Tyto výsledky jsou blíţe shrnuty v tabulce 14. Celkem došlo k regeneraci v novou rostlinu u 15 kalusů, ze kterých bylo získáno 38 rostlin. Rostlin potenciálně vzniklých somatickou hybridizací bylo 29. Cooper-Bland et al. (1996) uvádějí, ţe regenerace od protoplastu po celou rostlinu trvá 4 aţ 5 měsíců (cca 150 dnů). V případě pokusů v této dizertační práci byla tato doba o 2 aţ 3 měsíce delší (170 – 200 dnů), coţ se shoduje s výsledky Greplové a Polzerové (2007). U některých kalusů docházelo během jejich růstu k produkci sekundárních metabolitů. Jejich nadměrná produkce vedla ke zhnědnutí kultivačního média a odumření všech kalusů v Petriho misce. Produkci těchto látek se nepodařilo omezit ani přenesením kalusů na nové médium. Fleck et al. (1979) uvádějí, ţe izolace protoplastů pomocí celulolytických enzymů spouští celou řadu metabolických změn, které ve výsledku mohou vést k de novo syntéze stresem vyvolaných látek. Vzhledem k tomu, ţe k těmto případům docházelo zcela náhodně a nezávisle na genotypu, čase a absolvování elektrofúze, lze se domnívat, ţe je produkce těchto látek ovlivněna obtíţně kontrolovatelnými faktory.

75

Tabulka 14: Počet a původ rostlin vzniklých in vitro regenerací z protoplastových kultur Genotyp / Kombinace

Fúze

Číslo kalusu

NE

S. blb PIS 41

NE

S. tuber R2 S. blb PIS 60 + DH 388

NE ANO

S. blb PIS 66 + DH 165

ANO

ANO S. blb PIS 17 + DH 387 ANO S. veru 299 + DH 322 S. blb – Solanum bulbocastanum, S. tuberosum, S.veru – S. verrucosum

Název regenerované rostliny

REG 1 REG 2 2 2 REG 36 3 7 REG 37 REG 55 4 1 5 4 6 5 REG 5 REG 9 7 5 REG 11 REG 14 8 1 9 2 REG 20 F REG 27 F REG 28 F REG 29 F REG 30 F REG 32 F REG 33 F REG 38 F 10 16 REG 39 F REG 40 F REG 41 F REG 42 F REG 43 F REG 70 F REG 71 F REG 34 F REG 44 F REG 46 F REG 47 F REG 48 F 11 11 REG 49 F REG 50 F REG 51 F REG 67 F REG 68 F REG 69 F REG 35 F 12 2 REG 52 F 13 1 14 1 15 1 REG 24 F tuber – S. tuberosum ssp. tuberosum, DH – dihaploid S. tuberosum ssp. 1

S. blb PIS 17

Počet prýtů 6

76

6.4 Analýzy DNA pro detekci somatických hybridů 6.4.1 RAPD analýza Mezidruhová variabilita byla hodnocena primery OPG 8, OPN 3, 5, 8, 11, 15 a 18. Na základě RAPD profilů dekamerického primeru OPN 18 byla provedena shluková analýza UPGMA v programu Quantity One (Bio-Rad, USA). Tento primer se ukázal vhodným pro tuto analýzu z důvodu produkce malého počtu amplifikovaných fragmentů, které však poskytovaly dostatečný polymorfismus umoţňující odlišit rodičovské komponenty i následné potenciální somatické hybridy. Výsledný dendrogram (Obrázek 5) zahrnuje tři základní shluky genotypů. Do prvního shluku byly setříděny všechny analyzované genotypy druhu Solanum bulbocastanum. Do druhé skupiny byla zařazena uniformní podskupina genotypů druhu S. polyadenium, a dále pak genotypy S. microdontum 049, S. verrucosum 299 a diploidní S. tuberosum DH 322. Třetí skupina vykazovala vyšší variabilitu oproti dvěma předchozím. Byla do ní hlavně přiřazena většina diploidních klonů S. tuberosum a zbývající genetické zdroje rodu Solanum z testované kolekce. Z výsledků shlukové analýzy je patrné, ţe RAPD primer OPN 18 lze vyuţít pro detekci vnitrodruhové i mezidruhové variability a tím je vyuţitelný v konkrétních případech detekce somatických hybridů bramboru.

77

Obrázek 5: Shluková analýza genotypů na základě amplifikace RAPD markerů primerem OPN 18

S. blb – Solanum bulbocastanum, S. ber – S. berthaultii, S. veru – S. verrucosum, S. micro – S. microdontum, S. poly – S. polyadenium, S. vern – S. vernei, S. pinn – S. pinnatisectum, DH – dihaploid S. tuberosum, S. blb 60 + DH 388 – směs DNA obou genotypů, S. ? – genotyp příslušící neznámému druhu rodu Solanum

Analýzou DNA profilů RAPD primeru OPN 11 byly rovněţ spolehlivě odlišeny jednotlivé druhy rodu Solanum (Obrázek 6). Proto se tento primer ukazuje jako vhodný pro odlišení potenciálních somatických mezidruhových hybridů. Výsledky byly statisticky zpracovány formou dendrogramu (Obrázek 7).

78

Obrázek 6: Detekce polymorfismů DNA genotypů rodu Solanum primerem OPN 11

M – standard Gene Ruller 100 bp Plus (Fermentas, Litva), SB PIS 60 + DH 388 – směs DNA genotypů S. bulbocastanum 60 a dihaploidu S. tuberosum 388, S. ? – genotyp příslušící k neznámému druhu rodu Solanum

Obrázek 7: Shluková analýza genotypů na základě RAPD markerů (primer OPN 11)

PIS 60 + DH 388 – směs DNA genotypů S. bulbocastanum 60 a dihaploidu S. tuberosum 388

Na základě těchto analýz bylo zjištěno, ţe 9 genotypů in vitro, uváděných jako S. pinnatisectum, vykazovalo zcela odlišné elektroforetické profily RAPD markerů (OPG 8, OPN 3, 5, 8, 11, 15 a 18), ve srovnání s referenčním klonem S. pinnatisectum PI275235. Morfologickým srovnáním rostlin ve skleníku a jejich porovnáním s literaturou (Correll, 1962) bylo zjištěno, ţe jde o 9 genotypů S. polyadenium (Obrázek 8). Chyba v identifikaci 79

druhové příslušnosti genetických zdrojů není ojedinělá. Příkladem je Dinu et al. (2005), který uvádí S. bulbocastanum pod kódovým označením S. polyadenium (PI310963). Výsledky naznačují potřebu revize a detailní charakterizace evropských sbírek genetických zdrojů rodu Solanum introdukovaných z genových bank v USA. Tyto výsledky byly předány genové bance při Výzkumném ústavu bramborářském s.r.o. v Havlíčkově Brodě. Obrázek 8: Morfologické porovnání S. pinnatisectum PI275235 (vlevo) a S. polyadenium PI310963 (vpravo)

6.4.1.1 Detekce somaklonální variability RAPD analýza byla dále pouţita k detekci případné somaklonální variability, která hypoteticky můţe nastat v potomstvech odvozených regenerací z protoplastových kultur u kterých neproběhla fúze. Pomocí 70 dekamerických primerů sad OPN, OPH, OPM, OPF a OPG byla prokázána 100 % identita RAPD produktů rostliny vzniklé regenerací z protoplastové kultury (REG 1) a donora buněk S. bulbocastanum 17 (Obrázek 9). V těchto

80

70 dvojicích porovnávaných vzorků DNA nebyl nalezen ani jeden RAPD produkt, který by vykazoval polymorfismus. Dále byly hodnoceny rostliny vzniklé regenerací z protoplastové kultury S. bulbocastanum 41 (REG 5, 9 a 11). Pomocí 36 dekamerických primerů sad OPN, OPF a OPH byla opět prokázána 100 % identita RAPD produktů. Z těchto výsledků je patrné, ţe byť je metoda RAPD často povaţována za obtíţně reprodukovatelnou a málo spolehlivou (Jones et al., 1997), pro účely detekce somaklonální variability se jeví za standardních podmínek jako pouţitelná i dostatečně opakovatelná. Obrázek 9: Detekce somaklonální variability sadou RAPD primerů OPN

M – standard Gene Ruller 100 bp (Fermentas, Litva), a – regenerant vzniklý kultivací protoplastů genotypu S. bulbocastanum 17, b – genotyp S. bulbocastanum 17

6.4.2 Analýza jaderné DNA CAPS markery SPUD237 a GP21 jsou lokalizovány v jaderné DNA na pátém chromozómu v genové vazbě s genem Nb udělujícím bramboru hypersenzitivní rezistenci k viru X a lokusem genu rezistence R1 k Phytophthora infestans (de Jong et al., 1997). Restrikčním štěpením amplikonu SPUD237 enzymem AluI byl v analyzované kolekci detekován polymorfismus DNA, kdy byly určeny tři alelické sestavy z hlediska přítomnosti a lokalizace restrikčního místa enzymu AluI (Obrázek 10). Restrikčním štěpením amplikonu GP21 enzymem AluI byla detekována mezidruhová i vnitrodruhová variabilita (Obrázek 11). 81

Pomocí těchto výsledků lze prokázat, zda došlo k fúzi jader u rostlin vzniklých somatickou hybridizací. Nicméně, výsledky jsou aplikovatelné pouze v určité kombinaci genotypů jako je například v rámci markeru SPUD237 S. bulbocastanum 10 + dihaploid S. tuberosum 322 nebo S. verucossum 299 + dihaploid S. tuberosum 387. V této situaci by měl výsledný genotyp obsahovat dvě různé alely a na výsledném elektroforeogramu by se tato skutečnost projevila třemi pozorovatelnými fragmenty DNA. Z obrázků 10 a 11 je však patrné, ţe na základě těchto markerů je moţno v rámci hodnoceného souboru vytvořit poměrně širokou škálu kombinací rodičů somatických hybridů, které by následně bylo velmi snadné těmito markery identifikovat. Obrázek 10: Detekce polymorfismů jaderné DNA u genotypů rodu Solanum restrikčním štěpením produktů CAPS markeru SPUD237 enzymem AluI

M – standard Gene Ruller 100 bp Plus (Fermentas, Litva) S. blb – Solanum bulbocastanum, S. ber – S. berthaultii, S. veru – S. verrucosum, S. micro – S. microdontum, S. poly – S. polyadenium, S. vern – S. vernei, S. pinn – S. pinnatisectum, DH – dihaploid S. tuberosum, S. ? – genotyp příslušící neznámému druhu rodu Solanum

82

Obrázek 11: Detekce polymorfismů jaderné DNA u genotypů rodu Solanum restrikčním štěpením produktů CAPS markeru GP21 enzymem AluI

M – standard Gene Ruller 100 bp Plus (Fermentas, Litva) S. blb – Solanum bulbocastanum, S. pinn – S. pinnatisectum, S. poly – S. polyadenium, S. vern – S. vernei, S. micro – S. microdontum, S. gonio – S. stenotomum ssp. goniocalyx, S. sucr – S. sucrense, S. and – S. tuberosum ssp. andigenum, S. chac – S. chacoense, S. potri – S. polytrichon, S. moch – S. mochiquense, S. yung – S. yungasense, S. phu – S. phureja, S. veru – S. x verrucosum, DH – dihaploid S. tuberosum, REG – regenerant vzniklý kultivací protoplastů S. bulbocastanum, S. blb + DH – směs DNA genotypů S. bulbocastanum a dihaploidu S. tuberosum

Markery SPUD237 a GP21 nelze pouţít pro detekci aktuálně získaných potenciálních somatických hybridů z důvodu realizovaných kombinací rodičovských genotypů, které nejsou těmito markery odlišitelné.

6.4.3 Analýza chloroplastové a mitochondriální DNA 6.4.3.1 Optimalizace podmínek amplifikace V rámci této etapy práce musela být nejprve provedena optimalizace podmínek amplifikace jednotlivých markerů. Z tohoto důvodu je zoptimalizovaný metodický postup součástí kapitoly výsledky a diskuze. Sloţení reakční směsi bylo pro všechny markery stejné. 25 l reakční směsi obsahovalo 1x reakční pufr (10x Taq Buffer with KCl; Fermentas, Litva), 2,5 mM MgCl2, 0,3 mM dNTP, 0,32 µM od kaţdého primeru, 1 jednotka Taq polymerázy (Fermentas, Litva) a 20 ng DNA. Teplotní a časový profil PCR reakce byl následující: 180 s při teplotě 94°C pro první denaturaci následovanou 30 PCR cykly (40 s při 94°C pro denaturaci, 30 s při teplotě specifické pro daný pár primerů pro jejich nasedání (annealing), 60 s při 72°C pro extenzi) a 83

360 s při teplotě 72°C pro finální extenzi. Optimalizované teploty annealingu pro jednotlivé páry primerů jsou uvedeny v tabulce 6.

6.4.3.2 Detekce variability Pomocí elektroforetické separace PCR produktů hodnocené kolekce genotypů rodu Solanum v 1,5 % agarózovém gelu byl detekován polymorfismus pouze u markeru Cp3 (trnL/trnL) (Obrázek 12). Prokazatelně se lišil pouze genotyp Solanum mochiquense od ostatních genotypů. U ostatních markerů nebyl na horizontální agarózové elektroforéze u hodnocené kolekce detekován délkový polymorfismus amplikonů. Proto bylo pro další analýzu pouţito restrikční štěpení vybranými restrikčními enzymy. Obrázek 12: Variabilita PCR produktů markeru Cp3 (trnL/trnL)

M – standard Gene Ruller 100 bp Plus (Fermentas, Litva) S. blb – Solanum bulbocastanum, S. ber – S. berthaultii, S. pinn – S. pinnatisectum, S. poly – S. polyadenium, S. vern – S. vernei, S. moch – S. mochiquense, S. micro – S. microdontum, S. veru – S. x verucossum, S. gonio – S. stenotomum ssp. goniocalyx, S. and – S. tuberosum ssp. andigenum, S. potri – S. polytrichon, S. yung – S. yungasense, DH – dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum

84

6.4.3.2.1 Restrikční štěpení Bylo provedeno hodnocení variability restrikčním štěpením produktů amplifikace markerů Mt5 (cox1/cox1) a Cp3 (trnL/trnL). Pouţité restrikční endonukleázy jsou uvedeny v tabulce 15. Tabulka 15: Výsledky restrikčního štěpení mtDNA a cpDNA markerů (štěpení při 37°C) Marker

1,5 % agaróza polymorfismus

Mt5

NE

Cp3

ANO

Restrikční enzym AluI EcoRV DraI EcoRI HinfI MspI (Hpa II) RsaI XbaI CfoI AccI RsaI AluI HhaI EheI (Nar I) BsuRI (Hae III) EcoRV

Rozpoznávací sekvence AG↓CT GAT↓ATC TTT↓AAA G↓AATTC G↓ANTC C↓CGG GT↓AC T↓CTAGA GCG↓C GT↓(A,C)(T,G)AC GT↓AC AG↓CT GCG↓C GG↓CGCC GG↓CC GAT↓ATC

Štěpení ANO NE NE NE ANO NE ANO NE ANO NE NE ANO NE NE ANO NE

Polymorfismus (mezidruhový) S. mochiquense S. mochiquense S. mochiquense S. mochiquense S. mochiquense S. mochiquense S. mochiquense

Marker Mt5 (cox1/cox1) amplifikuje 1360 bp dlouhou oblast intronu mitochondriální cytochrom c oxidázové podjednotky 1 (Duminil et al., 2002). Enzym HinfI poskytl polymorfismus rozštěpených PCR produktů umoţňující odlišení druhu S. mochiquense od ostatních genotypů (Obrázek 13). Restrikční enzymy AluI, RsaI a CfoI poskytovaly uniformní produkty štěpení. Ostatní restriktázy ve studovaném intronu nenašly odpovídající restrikční místo.

85

Obrázek 13: Restrikční štěpení PCR produktu markeru Mt5 (cox1/cox1) enzymem HinfI

M – standard Gene Ruller 100 bp (Fermentas, Litva) S. yung – S. yungasense, S. moch – S. mochiquense, S. potri – S. polytrichon, S. chac – S. chacoense, S. and – S. tuberosum ssp. andigenum, S. sucr – S. x sucrense, S. gonio – S. stenotomum ssp. gonicalyx, S. veru – S. verrucosum, DH – dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum

Marker Cp3 (trnL/trnL) amplifikuje oblast intronu chloroplastové DNA o velikosti 557 bp (Taberlet et al., 1991). Enzymem BsuRI (Hae III) bylo nalezeno štěpné místo pouze u PCR produktu S. mochiquense (Obrázek 14). Restrikčním štěpením enzymem AluI nebyl nalezen polymorfismus mezi hodnocenými genotypy a ostatní restriktázy studovaný intron neštěpily.

86

Obrázek 14: Restrikční štěpení PCR produktu markeru Cp3 (trnL/trnL) enzymem BsuRI (HaeIII)

M – standard Gene Ruller 100 bp Plus (Fermentas, Litva) S. blb – Solanum bulbocastanum, S. ber – S. berthaultii, S. pinn – S. pinnatisectum, S. poly – S. polyadenium, S. vern – S. vernei, S. moch – S. mochiquense, S. micro – S. microdontum, S. veru – S. x verrucosum, S. gonio – S. stenotomum ssp. goniocalyx, S. and – S. tuberosum ssp. andigenum, S. potri – S. polytrichon, S. yung – S. yungasense, DH – dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum

Markery Mt5 (cox1/cox1) a Cp3 (trnL/trnL) lze vyuţít pro detekci somatických hybridů pouze v případě fúze protoplastů, kde by bylo jednou rodičovskou komponentou Solanum mochiquense. Tato kombinace však nebyla v disertační práci pouţita.

6.4.3.2.2 SSCP analýza Pomocí primerů vysoce specifických k mtDNA byl amplifikován mitochondriální intergenový mezerník oddělující geny pro 5S a 18S rRNA o velikosti 273 bp označovaný v této práci jako Mt3 (rrn5/rrn18-1) (Duminil et al., 2002; Hu a Luo, 2006). Na horizontální agarózové elektroforéze nebyl u hodnocené kolekce detekován délkový polymorfismus DNA. SSCP analýzou tohoto regionu byly jednoznačně odlišeny genotypy druhu S. bulbocastanum od genotypů ostatních druhů (Obrázek 15). Nebyla zaznamenána variabilita v SSCP profilu mezi původními genotypy S. bulbocastanum (17 a 41) a jejich protoplastovými regeneranty (REG 1 a 5). Pokud by pomocí PCR došlo k amplifikaci pouze jednoho DNA fragmentu, pomocí SSCP analýzy by se fragment separoval na tři, tj. dvě jednovláknové vlásenky a jeden homoduplex. Vzhledem k tomu, ţe je z elektroforeogramu na obrázku 15 patrný větší počet fragmentů u genotypů Solanum bulbocastanum, nabízí se dvě moţnosti vysvětlení. Rosypal 87

(1996) a Flegr (2005) uvádějí, ţe struktura a uspořádání mitochondriálního genomu je značně variabilní, dokonce u stejného organismu. To naznačuje potenciální moţnost variability sledovaného PCR produktu markeru Mt3 i v rámci jednoho genotypu, coţ můţe vést ke vzniku heteroduplexů. Druhou moţností jsou nespecifické amplifikace, ke kterým během PCR můţe docházet. Pro potvrzení popřípadě vyvrácení těchto moţností byl marker Mt3 dále podroben analýze metodou DGGE. Obrázek 15: Detekce polymorfismů mtDNA u genotypů rodu Solanum markerem Mt3 (rrn5/rrn18-1) pomocí metody SSCP

M – standard Gene Ruller 100 bp Plus (Fermentas, Litva) S. blb – Solanum bulbocastanum, S. ber – S. berthaultii, S. micro – S. microdontum, S. poly – S. polyadenium, S. pinn – S. pinnatisectum, DH – dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum, REG – regenerant daného genotypu vzniklý z protoplastových kultur b – varianta téhoţ genotypu vzniklá izolací DNA z různě starých in vitro rostlin

Marker Cp4 (trnL/trnF) amplifikuje oblast intergenového mezerníku chloroplastové DNA o velikosti 418 bp (Taberlet et al., 1991). Na horizontální agarózové elektroforéze, vertikální polyakrylamidové gelové elektroforéze a SSCP analýzou nebyl u hodnocené kolekce detekován ani délkový ani bodový polymorfismus v rámci tohoto úseku. Proto byly PCR produkty tohoto markeru dále podrobeny analýze metodou DGGE.

88

6.4.3.2.3 DGGE analýza Výsledkem DGGE analýzy v perpendikulárním gradientu byly u hodnocených PCR produktů markerů Mt1 (atp9/atp9), Mt3 (rrn5/rrn18-1), Cp4 (trnL/trnF) a Cp7 (trnV/16SrRNA) zaznamenány nestandardní výsledky v podobě nespojitých denaturačních křivek (Obrázek 16a). Rickwood a Hames (1990) uvádějí pouţití GC-svorky, coţ je úsek molekuly DNA bohatý na G a C báze, který má vysokou teplotu tání a tím je obtíţně denaturovatelný. Adaptací jednoho z primerů pouţitého páru o tuto svorku na 5’ konci byly nedostatky této primární analýzy odstraněny (Obrázek 16b). Konkrétně byla pouţita GCsvorka 5’-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3’ podle Mota et al. (2008), která byla připojena na 5’ konec primerů Mt1 F, Mt3 F, Cp4 F a Cp7 F. Pro analýzu byla pouţita směs amplikonů genotypů Solanum bulbocastanum PIS 17, S. berthaultii 260, S. verrucosum 299, S. chacoense, S. mochiquense a dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum 165, u kterých lze předpokládat, ţe se od sebe geneticky liší. Obrázek 16: Elektroforeogram perpendikulárního gelu pro analýzu PCR produktů markeru Mt3 (rrn5/rrn18-1)

7 % polyakrylamidový gel, koncentrace denaturantu 0 % - 100 %, parametry separace: 120 min při teplotě 56°C a napětí 150V v cele DCode (Bio-Rad), 16a – produkty markeru Mt3 o velikosti 273 bp, 16b – produkty markeru Mt3 s navázanou svorkou na 5’ konci primeru Mt3 F o velikosti 313 bp

PCR produkt markeru Mt1 (atp9/atp9) o délce 319 bp byl analyzován v 7 % polyakrylamidovém perpendikulárním gelu s gradientem denaturantu 0 % - 100 %. 89

V analyzované sekvenci nebyl zjištěn polymorfizmus, coţ naznačuje konzervovanost této sekvence v hodnocené kolekci rodu Solanum. PCR produkt markeru Mt3 (rrn5/rrn18-1) o velikosti 313 bp byl analyzován za stejných podmínek a se stejnými výsledky jako marker Mt1 (Obrázek 16b). Tyto výsledky rovněţ vylučují variabilitu produktů tohoto markeru v rámci jednoho genotypu. Analýzou variability tohoto markeru metodou SSCP bylo potvrzeno, ţe se pravděpodobně jedná o nespecifické amplifikace, ke kterým došlo v průběhu PCR. Za předpokladu biparentální dědičnosti sloţek cytoplasmy při somatické hybridizaci nelze markery Mt1 a Mt3 pouţít pro detekci somatických hybridů. PCR produkt markeru Cp4 (trnL/trnF) o velikosti 458 bp byl analyzován v 6 % polyakrylamidovém perpendikulárním gelu s gradientem denaturantu 20 % - 70 %. Z výsledků uvedených na obrázku 17 je patrné, ţe sekvence PCR produktu tohoto markeru je polymorfní. Šipka na obrázku označuje optimální koncentraci denaturačních činidel umoţňujících odlišení mutantních alel. Proto byl tento marker podroben analýze metodou CDGE. Obrázek 17: Elektroforeogram perpendikulárního gelu pro analýzu PCR produktů markeru Cp4 (trnL/trnF)

6 % polyakrylamidový gel, koncentrace denaturantu 20 % - 70 %, parametry separace: 120 min při teplotě 56°C a napětí 150V v cele DCode (Bio-Rad)

PCR produkt markeru Cp7 (trnV/16SrRNA) o velikosti 337 bp byl analyzován v 7 % polyakrylamidovém perpendikulárním gelu s gradientem denaturantu 20 % - 70 %. Výsledky metody DGGE prokázaly, ţe je sekvence PCR produktu tohoto markeru polymorfní, a proto byl tento marker podroben analýze metodou CDGE (Obrázek 18). 90

Obrázek 18: Elektroforeogram perpendikulárního gelu pro analýzu PCR produktů markeru Cp7 (trnV/16SrRNA)

7 % polyakrylamidový gel, koncentrace denaturantu 20 % - 70 %, parametry separace: 120 min při teplotě 56°C a napětí 150V v cele DCode (Bio-Rad)

6.4.3.2.4 CDGE analýza Pro podrobnější vyhodnocení markeru Cp4 (trnL/trnF) u analyzované kolekce genotypů rodu Solanum byl pouţit 5,5 % akrylamidový konstantní denaturační gel o koncentraci denaturantu 40 %. Separace konstantní gradientové elektroforézy probíhala 230 min při teplotě 56°C a napětí 100V v cele DCode (Bio-Rad). Byla detekována mezidruhová variabilita v hodnocené kolekci 16 druhů rodu Solanum (Obrázek 19). Analýzou tohoto markeru byly nalezeny tři alely lišící se elektroforetickou mobilitou. Vnitrodruhová variabilita byla sledována u genotypů druhu Solanum bulbocastanum, Solanum vernei a dihaploidů Solanum tuberosum ssp. tuberosum. Ani v jednom z uvedených případů nebyla variabilita uvnitř druhu potvrzena.

91

Obrázek 19: Variabilita PCR produktů markeru Cp4 (trnL/trnF) detekovaná pomocí CDGE analýzy

5,5 % polyakrylamidový gel o konstantní koncentraci denaturantu 40 %, parametry separace: 230 min při teplotě 56°C a napětí 100V v cele DCode (Bio-Rad) S. blb – Solanum bulbocastanum, S. ber – S. berthaultii, S. pinn – S. pinnatisectum, S. poly – S. polyadenium, S. vern – S. vernei, S. micro – S. microdontum, S. gonio – S. stenotomum ssp. goniocalyx, S. sucr – S. x sucrense, S. and – S. tuberosum ssp. andigenum, S. chac – S. chacoense, S. potri – S. polytrichon, REG – regenerant daného genotypu vzniklý z protoplastových kultur

Výsledky molekulární analýzy PCR produktů markeru Cp4 byly dány do souvislostí s charakteristikami jednotlivých druhů dle Bradshaw a Mackay (1994) a Correll (1962). Stupeň ploidie, hodnota EBN (Endosperm Balance Number) a oblast původu jsou uvedeny v tabulce 16. Na základě těchto charakteristik a uvedeného polymorfismu markeru Cp4 byl shlukovou analýzou v programu Statistica CZ (Statsoft verze 9.0) sestaven dendrogram (Obrázek 20). Pomocí shlukové analýzy byly studované druhy rozděleny na dvě hlavní skupiny. Do jedné skupiny byly přiřazeny všechny tetraploidní druhy: Solanum tuberosum ssp. tuberosum, S. tuberosum ssp. andigenum, S. x sucrense, S. stenotomum ssp. goniocalyx a S. polytrichon. Mezi těmito druhy je rovněţ blízký fylogenetický vztah (Bradshaw a Mackay, 1994). Největší odlišnost od ostatních druhů v rámci shlukové analýzy vykazoval genotyp druhu Solanum mochiquense. Tento výsledek potvrzuje data získaná pomocí agarózové elektroforézy a restrikčního štěpení produktů amplifikace markerů Mt5 a Cp3.

92

Tabulka 16: Vybrané charakteristiky analyzovaných druhů rodu Solanum Druh Solanum tuberosum ssp. tuberosum Solanum stenotomum ssp. goniocalyx Solanum sucrense Solanum tuberosum ssp. andigenum Solanum polytrichon Solanum pinnatisectum Solanum verucossum Solanum bulbocastanum Solanum polyadenium Solanum phureja Solanum berthaultii Solanum chacoense Solanum microdontum Solanum vernei Solanum yungasense Solanum mochiquense

Ploidie 2n 48 48 48 48 48 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24

EBN 4 2 4 4 2 1 2 1 1 2 2 2 2 2 2 1

Alela markeru Cp4 A A A A A A A B B B C C C C C C

Oblast původu Peru, Bolivie, Chile El Mantaro - Peru Potosi - Bolivie Peru Mexiko Jalisco - Mexiko Michoacan - Mexiko Federal district -Mexiko Michoacan - Mexiko Kolumbie Cochamba - Bolivie Bolivie Argentina Argentina Argentina Peru

Obrázek 20: Dendrogram sestavený na základě podobnosti PCR produktů markeru Cp4 (trnL/trnF) analyzovaných metodou CDGE Str. diagram pro 18 případů Jednoduché spojení Euklid. vzdálenosti S. tub S. tub S. tub S. sucr S. and S. gonio S. potri S. pinn S. veru S. blb S. poly S. phu S. ber S. chac S. micro S. vern S. yung S. moch 0

5

10

15

20

Vzdálenost spoje S. tub –Solanum tuberosum ssp. tuberosum, S. blb – S. bulbocastanum, S. ber – S. berthaultii, S. pinn – pinnatisectum, S. poly – S. polyadenium, S. vern – S. vernei, S. micro – S. microdontum, S. gonio – stenotomum ssp. goniocalyx, S. sucr – S. x sucrense, S. and – S. tuberosum ssp. andigenum, S. chac – chacoense, S. potri – S. polytrichon, S. veru – S. verrucosum, S. yung – S. yungasense, S. phu – S. phureja, moch – S. mochiquense

93

25

S. S. S. S.

Pro podrobnější vyhodnocení markeru Cp7 (trnV/16SrRNA) u analyzované kolekce genotypů rodu Solanum byl pouţit 6 % akrylamidový konstantní denaturační gel o koncentraci denaturantu 55 %. Separace konstantní gradientové elektroforézy probíhala 220 min při teplotě 56°C a napětí 100V v cele DCode (Bio-Rad). U kaţdého genotypu byl detekován identický soubor dvou fragmentů DNA, coţ jednak objasnilo výskyt dvou posunutých křivek v průběhu perpendikulární analýzy a zároveň vyloučilo předpokládaný DGGE polymorfismus (Obrázek 21). Pro úplné vyloučení mezidruhového polymorfismu markeru byla provedena sekvenace obou fragmentů. Obrázek 21: Variabilita PCR produktů markeru Cp7 (trnV/16SrRNA) detekovaná pomocí CDGE analýzy

6 % polyakrylamidový gel o konstantní koncentraci denaturantu 55 %, parametry separace: 220 min při teplotě 56°C a napětí 100V v cele DCode (Bio-Rad) S. blb – Solanum bulbocastanum, S. ber – S. berthaultii, S. pinn – S. pinnatisectum, S. poly – S. polyadenium, S. vern – S. vernei, S. micro – S. microdontum, S. gonio – S. stenotomum ssp. goniocalyx, S. sucr – S. x sucrense, S. and – S. tuberosum ssp. andigenum, S. yung – S. yungasense, S. chac – S. chacoense, S. potri – S. polytrichon, REG – regenerant daného genotypu vzniklý z protoplastových kultur

6.4.3.3 Stanovení sekvencí vybraných markerů

6.4.3.3.1 Marker Mt1 Marker Mt1 (atp9/atp9) amplifikuje oblast intronu mitochondriální DNA o velikosti 279 bp (Duminil et al., 2002). Vzhledem k tomu, ţe polymorfismus tohoto fragmentu nebyl detekován ţádnou z molekulárních analýz pouţitých v této práci, bylo přistoupeno k sekvenování pouze pro potvrzení stávajících výsledků. Přímou oboustrannou sekvenací se podařilo osekvenovat pouze 5’ – 3’ vlákno fragmentu na základě primeru Mt1 F u genotypů 94

S. bulbocastanum PIS 17 a dihaploidu S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165. Opakovaná sekvenace 3’ – 5’ vlákna fragmentu na základě primeru Mt1 R nebyla úspěšná. Z tohoto důvodu se nepodařilo získat kompletní sekvenci ţádného z fragmentů uvedených genotypů. Získané sekvence však mezi sebou vykazovaly 100 % homologii. Sekvence obou fragmentů byly porovnány s nukleotidovou databází NCBI. Osekvenovaný fragment genotypu S. bulbocastanum o velikosti 142 bp vykazoval 100 % homologii se sekvencemi jednoho genotypu druhu Capsicum annuum GU357549.1 a Solanum tuberosum ssp. tuberosum X63610.1 a se dvěma genotypy druhů Lycopersicum esculentum FJ374974.1, X54409.1 a Nicotiana tabaccum BA000042.1, X04019.1. Osekvenovaný fragment dihaploidu S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165 o velikosti 191 bp vykazoval 100 % homologii pouze se sekvencí genotypu druhu Lycopersicum esculentum X54409.1. Dále byla detekována 91 – 99 % homologie se 100 sekvencemi v databázi náleţícími zástupcům 40 druhů nejen z čeledi Solanaceae, u kterých byla tato sekvence analyzována. Mezi genotypy, u kterých bylo moţné porovnat celý úsek 191 bp sekvence, patřily zástupci druhů Lycopersicum esculentum (100 % homologie), Nicotiana tabaccum BA000042.1, X04019.1 (99 %), Petunia hybrida X05807.1 (98 %), Vitis vinifera GQ220323.1, FM179380.1 (93 %), Malus x domestica D37958.1 (93 %), Diplotaxis muralis AB243572.1 (92 %), Brassica napus AP006444.1, D13696.1 (92 %) a Brassica rapa AC172860.1 (92 %). U ostatních genotypů bylo moţné porovnat pouze část sekvence z důvodu neúplnosti sekvencí v databázi NCBI. I zde byla potvrzena 91 – 100 % homologie v částech sekvencí například u genotypů druhů Capsicum annuum GU357549.1, Camellia sinensis DQ461974.1, Helianthus annuus X51895.1 a AF258785.1, Arabidopsis thaliana Y08501.2 a D82062.1, Cucurbita pepo GQ856148.1, Oryza sativa BA000029.3 a DQ167400.1, Triticum aestivum AP008982.1, Triticum durum X80469.1, Secale cereale X99020.1, Hordeum vulgare X74365.1, Beta vulgaris DQ381444.1 apod. Z těchto výsledků vyplývá, ţe tento intergenový mezerník vykazuje mezi druhy různých čeledí relativně nízkou variabilitu, z čehoţ lze usuzovat na vysokou míru konzervovanosti napříč rostlinnou říší.

6.4.3.3.2 Marker Mt3 Marker

Mt3

(rrn5/rrn18-1)

amplifikuje

oblast

intergenového

mezerníku

mitochondriální DNA o velikosti 273 bp. Vzhledem k tomu, ţe polymorfismus tohoto fragmentu nebyl detekován ţádnou z molekulárních analýz pouţitých v této práci, bylo přistoupeno k sekvenování pouze pro potvrzení stávajících výsledků. Byla provedena přímá 95

oboustranná sekvenace fragmentu u genotypů S. berthaultii 260, S. bulbocastanum PIS 17 a dihaploidu S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165. Fragmenty mezi sebou vykazovaly 100 % homologii. Srovnáním této sekvence s databází NCBI byla detekována 100 % homologie pouze se sekvencí genotypu druhu Nicotiana tabaccum BA000042.1. Dále mezi genotypy, u kterých bylo moţné porovnat celou sekvenci, patřily pouze zástupci druhů Vitis vinifera GQ220326.1, XR077859.1, FM179380.1 (95 % homologie), Dunia sinensis AJ431632.1, AJ431631.1, AJ431630.1 (94 %), Citrus maxima FJ356258.1 (93 %) a Carica papaya EU431224.1 (90 %). Vzhledem k tomu, ţe databáze neobsahovala analyzovanou sekvenci ţádných jiných druhů z čeledi Solanaceae a jen velmi málo ostatních rostlinných druhů, u kterých bylo moţné porovnat pouze sekvence do velikosti 82 bp, nelze z těchto výsledků vyvozovat konkrétní závěry.

6.4.3.3.3 Marker Cp3 U 557 bp produktu markeru Cp3 (trnL/trnL) byl pomocí horizontální agarózové elektroforézy detekován délkový polymorfismus (Obrázek 12). Analyzovaný fragment byl u genotypu druhu Solanum mochiquense o několik bází delší neţ fragmenty ostatních genotypů. Pro přesnou identifikaci polymorfismu byla provedena sekvenace fragmentu u tohoto genotypu a jako kontroly byly pouţity genotypy S. berthaultii 260, dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165 a S. bulbocastanum PIS 17. Sekvenací byl u genotypu S. mochiquense detekován v pozici 448 inzert o velikosti 18 bp. Inzert vznikl duplikací části sekvence počínající v této pozici jak je patrno z obrázku 22. V důsledku přítomnosti štěpného místa pro enzym BsuRI (Hae III) GG↓CC uvnitř inzertu, S. mochiquense obsahuje dvě štěpná místa pro tento enzym zatímco ostatní genotypy pouze jedno. Z tohoto důvodu byl u S. mochiquense restrikčním štěpením detekován fragment o 18 bp kratší neţ u ostaních genotypů (Obrázek 14). Porovnáním celé sekvence fragmentu genotypu S. mochiquense s nukleotidovou databází NCBI nebyl nalezen ţádný genotyp, který by tento inzert obsahoval. Databáze navíc neobsahovala sekvenci ţádného genotypu příslušícího tomuto druhu. Nelze proto říci, zda je detekovaný inzert unikátní a specifický pro druh S. mochiquense. Sekvenací byla dále detekována substituce C za G v pozici 230 u genotypu S. bulbocastanum oproti ostatním analyzovaným genotypům (Obrázek 22). Porovnáním celé sekvence s nukleotidovou databází NCBI se tato substituce jeví jako specifická pouze pro druh Solanum bulbocastanum. Z těchto výsledků vyplývá, ţe je marker Cp3 vhodný pro 96

detekci dědičnosti cytoplasmy u somatických hybridů S. bulbocastanum PIS 66 x DH 165. Případné pouţití tohoto markeru je však vázáno na určení sekvence nukleotidů, coţ zvyšuje finanční náročnost analýzy. Detekce variability produktů markeru Cp3 u rodičovských komponent metodami DGGE a CDGE není moţná. Substituce C za G by v tomto případě nezměnila mobilitu fragmentů DNA v denaturačních podmínkách (močovina, formamid) akrylamidového gelu. Genotypy S. berthaultii 260 a dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165 vykazovaly v analyzované sekvenci 100 % homologii. Porovnáním této sekvence s databází NCBI byla nalezena 100 % homologie se sekvencemi tří moţných genotypů S. tuberosum ssp. tuberosum HM006842.1, DQ386163.2, DQ131549.1, s genotypem S. pinnatisectum DQ180453.1 a S. brevicaule DQ180443.1 a dále s fylogeneticky vzdálenějšími zástupci druhů rodu Solanum, jakými byly S. laciniatum HM006852.1, HM006851.1, HM006835.1, DQ180467.1, S. aviculare HM006854.1, HM006853.1, S. aggregatum DQ180460.1, S. triflorum DQ180457.1, S. nitidum DQ180451.1, S. caesium HM006843.1, DQ180445.1, S. aligerum DQ180441.1, S. symonii HM006858.1, HM006857.1, HM006838.1, S. linearifolium HM006850.1, HM006849.1, HM006833.1 a S. vescum HM006848.1, HM006847.1, HM006832.1. Většina těchto druhů pochází z oblastí centrální a Jiţní Ameriky. Pro druhy S. laciniatum a S. aviculare je však charakteristická oblast výskytu Austrálie, Nová Guinea, Tasmánie a Nový Zéland. Tyto dva druhy patří sice do rodu Solanum, ale jejich základní počet chromozomů n = 23 je v tomto rodu unikátní (Bohs a Olmstead, 1997). Diploidní S. aviculare a tetraploidní S. laciniatum patří do podrodu Archaesolanum v rámci rodu Solanum. Tento podrod tvoří izolovanou skupinu, u které nebyla dosud prokázána blízká příbuznost s ostatními druhy v rámci rodu Solanum (Poczai et al., 2008). 100 % homologie produktu markeru Cp3 s kulturním bramborem však naznačují platnost domněnky autorů Olmstead a Palmer (1997) o společném prapředkovi, který v časných fázích evoluce, pravděpodobně v době existence společného kontinentu Pangea, migroval mimo jiné na australský kontinent, kde se izolovaně vyvíjel a vytvořil podrod Archaesolanum. Jelikoţ marker Cp3 (trnL/trnL) amplifikuje oblast intronu chloroplastové DNA o velikosti 557 bp (Taberlet et al., 1991) a primery tohoto markeru nasedají v genomu chloroplastové DNA do kódujících vysoce konzervativních oblastí exonů genu kodujícího tRNA pro aminokyselinu leucin, je variabilní pouze oblast intronu mezi kódujícími sekvencemi (exony). To dělá z markeru Cp3 vysoce specifický marker pro chloroplastovou DNA, který je aplikovatelný napříč rostlinnou říší. Srovnáním sekvence s databází NCBI byla 97

tato skutečnost potvrzena. Porovnáním pouze počáteční a koncové sekvence tohoto fragmentu, tedy exonových oblastí, byla detekována 100 % homologie mezi genotypy druhů z různých čeledí rostlinné říše. Naopak intronová oblast byla vysoce homologní pouze u čeledi Solanaceae. Obrázek 22: Výsledky sekvenace produktů markeru Cp3

S. ber – Solanum berthaultii, DH – dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum, S. blb – S. bulbocastanum, S. moch – S. mochiquense

6.4.3.3.4 Marker Cp4 U 418 bp produktu markeru Cp4 (trnL/trnF) byl pomocí denaturační gradientové gelové elektroforézy

(DGGE) a konstantní denaturační gelové elektroforézy (CDGE)

detekován polymorfismus (Obrázek 17 a 19). Pro přesnou identifikaci polymorfismu byla provedena sekvenace fragmentu u genotypů obsahujících jednotlivé alely A, B nebo C. Jednalo se o dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165 (A) a DH 322 (A), S. verrucosum 299 (A), S. pinnatisectum 051 (A), S. bulbocastanum PIS 17 (B), S. chacoense (C), S. yungasense (C), S. microdontum 049 (C), S. mochiquense (C) a S. berthaultii 260 (C). Sekvenováním byla detekována mezidruhová variabilita v podobě bodových mutací (substituce, delece), která nijak nekorespondovala s výsledky CDGE analýzy (Obrázek 23). Z výsledků je patrné, ţe metoda perpendikulární DGGE (ve vertikálně rostoucím denaturačním gradientu) se zdá být z hlediska predikce variability vhodná, zatímco metoda CDGE, slouţící pro přesnou detekci variability mezi jednotlivými genotypy, v tomto případě jako nedostačující a zavádějící. I přes všechna úskalí je marker Cp4 vhodný pro detekci dědičnosti cytoplasmy u somatických hybridů S. bulbocastanum PIS 66 x DH 165 a S. bulbocastanum PIS 60 x DH 388, coţ je podrobněji diskutováno v kapitole 6.5.2.2. Případné 98

pouţití tohoto markeru je však vázáno z výše uvedených důvodů na určení sekvence nukleotidů. Jednotlivé sekvence markeru Cp4 byly porovnány s nukleotidovou databází NCBI. Nekódující oblast intergenového mezerníku v této sekvenci je vysoce homologní pouze u čeledi Solanaceae. Byla detekována 100 % homologie mezi genotypy dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165 a DH 322 a S. verrucosum 299, v databázi NCBI však nebyl nalezen ţádný genotyp, který by s nimi vykazoval 100 % homologii. Naopak sekvence analyzovaného genotypu S. berthaultii 260 byla 100 % homologní se čtyřmi dostupnými sekvencemi S. tuberosum ssp. tuberosum HM006842.1, DQ386163.2, FJ490824.1, DQ231562.1 v databázi NCBI. Tyto výsledky naznačují výskyt vnitrodruhové variability chloroplastové DNA u druhu S. tuberosum ssp. tuberosum. Důvodem je, ţe se jako výchozí šlechtitelský materiál u moderních kulturních odrůd často vyuţívají mezidruhové hybridy, které zlepšují významné hospodářské vlastnosti. Odrůda Apta, ze které byl odvozen dihaploid DH 165 a DH 388, byla vyšlechtěna v Německu v roce 1951 jako výsledek kříţení mezidruhového hybridu v pozici matky a odrůdy Hindenburg (The European Cultivated Potato Database, VB; EVIGEZ, ČR). Bliţší určení původu daného mezidruhového hybridu databáze neuvádějí a je pravděpodobné, ţe odrůda Apta zdědila cytoplasmu po některém genovém zdroji rodu Solanum. Vzhledem k tomu, ţe dihaploid DH 322 pochází rovněţ z Německa a jeho autoři neudávají ţádné bliţší údaje, je pravděpodobné, ţe jeho rodokmen bude obdobný jako u DH 165. Z těchto důvodů můţe být problematické zařazovat druh S. tuberosum ssp. tuberosum do fylogenetických studií. Pro přesnější podchycení vnitrodruhové variability chloroplastové DNA v rámci druhu S. tuberosum ssp. tuberosum a jeho pouţitelnosti ve fylogenetických studiích by bylo třeba charakterizovat široké spektrum odrůd kulturního bramboru velkým počtem markerů pro chloroplastovou DNA a případně získané sekvence porovnat s druhy rodu Solanum, které se v rodokmenu dané odrůdy vyskytují. 100 % homologie byla dále detekována u sekvencí genotypů druhů S. chacoense, S. yungasense, S. microdontum 049 a genotypu S. brevicaule DQ180443.1 z NCBI. Druh S. brevicaule se vyskytuje v oblastech Bolívie a vzácně v oblastech SZ Argentiny, coţ se shoduje s oblastmi výskytu ostatních třech druhů (Correll, 1962). Všechny čtyři druhy jsou diploidní s 2EBN, druhy S. chacoense a S. yungasense patří do série Yungasensa a druhy S. microdontum a S. brevicaule do série nekulturní Tuberosa (Bradshaw a Mackay, 1994). Výše uvedené výsledky naznačují určitou míru příbuznosti mezi těmito čtyřmi druhy, kterou však nelze přesně definovat na základě analýzy jediného markeru. 99

Porovnáním celé sekvence genotypu S. bulbocastanum PIS 17 s nukleotidovou databází NCBI byla detekována 100 % homologie pouze se sekvencemi genotypů stejného druhu DQ180444.1 a DQ347958.1, a proto se tato sekvence jeví jako specifická pouze pro druh Solanum bulbocastanum. Porovnáním celé sekvence markeru genotypu S. mochiquense s nukleotidovou databází NCBI nebyl nalezen ţádný genotyp se 100 % shodou. Databáze navíc neobsahovala osekvenovaný fragment u ţádného genotypu příslušícího tomuto druhu. 100 % homologie v analyzované sekvenci genotypu S. pinnatisectum 051 nebyla detekována dokonce ani u sekvence genotypu stejného druhu DQ180453.1 uvedeného v databázi NCBI, proto lze v tomto případě hovořit o vnitrodruhové variabilitě. Obrázek 23: Výsledky sekvenace produktů markeru Cp4

S. tub DH – dihaploid Solanum tuberosum ssp. tuberosum, S. vru – S. verrucosum, S. pin – S. pinnatisectum, S. blb – S. bulbocastanum, S. chac – S. chacoense, S. yun – S. yungasense, S. micro – S. microdontum, S. moch – S. mochiquense, S. ber – S. berthaultii, REG F – regenerant vzniklý fúzí protoplastů S. blb x S. tub DH

6.4.3.3.5 Marker Cp7 Marker

Cp7

(trnV/16SrRNA)

amplifikuje

oblast

intergenového

mezerníku

chloroplastové DNA o velikosti 297 bp. Vzhledem k tomu, ţe se u všech analyzovaných genotypů amplifikoval soubor dvou fragmentů (Obrázek 21), byla pro srovnání provedena 100

jejich sekvenace u genotypů S. bulbocastanum PIS 17 a S. berthaultii 260. V rámci přímé oboustranné sekvenace se v obou případech podařilo osekvenovat pouze 5’ – 3’ vlákno fragmentu na základě primeru Cp7 F. Opakovaná sekvenace 3’ – 5’ vlákna fragmentu na základě primeru Cp7 R nebyla úspěšná. Z tohoto důvodu se nepodařilo získat kompletní sekvenci ţádného z fragmentů uvedených genotypů. Části fragmentů, které se podařilo osekvenovat, však mezi sebou vykazovaly 100 % homologii. Nejdelší osekvenovaný úsek, fragment S. berthaultii 260 o velikosti 247 bp, byl porovnán s nukleotidovou databází NCBI. V rámci této databáze byla detekována 100 % homologie

se sekvencemi

čtyř

genotypů

Lycopersicum

esculentum

AC239738.5,

AM087200.3, AY216521.1, DQ347959.1, dvou genotypů S. tuberosum ssp. tuberosum DQ386163.2, DQ231562.1 a S. bulbocastanum DQ347958.1. Dále byla detekována 95 – 99 % homologie s genotypy 57 druhů nepatřících do čeledi Solanaceae, u kterých byla tato sekvence analyzována. Například 99 % homologii vykazovali zástupci druhů Solanum nigrum Y18934.1, Nicotiana tomentosiformis AB240139.1, Nicotiana sylvestris AB237912.1, Nicotiana tabacum Z00044.2, Nicotiana plumbaginifolia X70938.1, Atropa belladonna AJ316582.1 a Datura dioxia FJ971407.1. Z těchto výsledků vyplývá, ţe se tento intergenový mezerník nachází u širokého spektra rostlinných druhů s poměrně nízkou variabilitou a lze tudíţ do jisté míry hovořit o jeho konzervovanosti napříč rostlinnou říší. Zároveň bylo zjištěno, ţe výše zmíněná 100 % homologie byla u daných genotypů v chloroplastovém genomu nalezena na dvou místech. V prvním případě se jednalo o srovnání vláken se stejnou orientací, tedy plus/plus. U genotypů S. tuberosum ssp. tuberosum se tato sekvence nacházela dle NCBI v pozici 101610 – 101856 (DQ231562.1) nebo 101598 – 101844 (DQ386163.2) a u S. bulbocastanum 101645 – 101891 (DQ347958.1). Podle kompletní genové mapy cpDNA tabáku (Nicotiana tabacum) se tento intergenový mezerník nachází v invertované repetici IRa a má velikost 112 bp (Yukawa et al., 2005; Wakasugi et al., 1998). V druhém případě byly srovnány sekvence vláken s opačnou orientací, tedy plus/minus. U genotypu S. tuberosum ssp. tuberosum se potom tato sekvence nacházela v pozici 139452 – 139206 nebo 139436 – 139190 a u S. bulbocastanum 139483 – 139237. Yukawa et al. (2005) a Wakasugi et al. (1998) uvádějí, ţe je tento mezerník umístěn u druhu Nicotiana tabacum v druhé invertované repetici IRb a má velikost 183 bp. Velikostní rozdíl mezi těmito invertovanými mezerníky je potom 71 bp. Amplifikovaný Cp3 fragment by měl mít velikost 297 bp. Tento rozdíl je způsoben tím, ţe specifické primery tohoto markeru nasedají do kódujících oblastí genů trnV a 16S rRNA a amplifikuje se tudíţ nejen vlastní intergenový mezerník, ale i část kodujících sekvencí. 101

Vzhledem k tomu, ţe sekvence genotypu Nicotiana tabacum Z00044.2 uloţená v databázi NCBI vykazovala 99 % homologii s analyzovaným genotypem S. berthaultii 260, bylo by moţné předpokládat obdobné velikostní rozdíly mezi oběma získanými fragmenty uloţenými v invertovaných repeticích IRa a IRb. Separace fragmentů v 1,5 % agarózovém gelu však tento velikostní rozdíl nepotvrdila. Pro detekci variability těchto sekvencí proto bude nutné provést sekvenaci fragmentu klonovaného do plazmidu a sestavit tak kompletní sekvenci.

6.5 Detekce somatických hybridů 6.5.1 Morfologické a cytologické metody detekce somatických hybridů 6.5.1.1 Morfologické hodnocení Většina rostlin potenciálně vzniklých somatickou hybridizací vykazovala ve skleníku (Obrázek 24) a v polním pokusu (Obrázek 25) viditelně intenzivnější růst, vývoj a vzrůst neţ původní rodičovské genotypy a mnoho morfologických znaků intermediálního charakteru, coţ se shoduje s výsledky Waara et al. (1992) a Helgelson et al. (1998). Příkladem jsou zejména listy, kdy hybridní rostliny obsahují pouze 2 jařma párových lístků a jeden koncový lístek, zatímco S. bulbocastanum má listy jednoduché vejčité a S. tuberosum DH165 list sloţený obvykle z 5 párů jařmových lístků (Obrázek 26). Důleţitou vlastností je také schopnost většiny získaných regenerantů tvořit květy. Tvar, uspořádání a barva květní koruny jsou znaky oligogenního charakteru, kde mají navíc některé geny pleiotropní účinnek na zbarvení stonků, řapíků listů, slupky a duţniny hlíz apod. (Hraška et al., 1989; Bradshaw a Mackay, 1994). Z těchto důvodů je velmi obtíţné přesně definovat genové pozadí vybraných znaků u somatických hybridů a jejich rodičovských komponent. Z hlediska tvaru a uspořádání květní koruny a jejího zbarvení se u somatických hybridů prokázala přítomnost a spolupůsobení všech genů od obou rodičovských komponent, které se na projevu daných znaků podílely. Uspořádání květní koruny je u somatických hybridů totoţné s druhem Solanum tuberosum ssp. tuberosum, které se typem květní koruny řadí do skupiny odvozená Rotata (Hawkes, 1990) a lze tudíţ předpokládat, ţe se jedná o dominantní projev znaku. Tvar a velikost smetanově zbarvené vnitřní části koruny somatických hybridů, takzvané hvězdy, jsou však zcela identické s květem druhu S. bulbocastanum a lze předpokládat, ţe dominantní alely genů zodpovídajících za tento znak získaly somatické hybridy od druhu S. bulbocastanum (Obrázek 27). 102

Genotypy REG 24 F a 52 F vykazovaly z morfologického hlediska znaky shodné pouze s dihaploidy S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165 a 322, kde REG 24 F vykazoval niţší vitalitu, naopak REG 52 F intezivnější růst a produkci nadzemní biomasy oproti původním rodičovským dihaploidním genotypům. Genotypy REG 1, 5, 9, 11 a 14 vzniklé regenerací pouze z protoplastů genotypů druhu S. bulbocastanum, tedy bez fúze, vykazovaly intentivnější růst a větší podíl biomasy oproti původnímu diploidnímu genotypu, ze kterého byly odvozeny. Naopak rostliny genotypu REG 2, vzniklého stejným způsobem, vykazovaly niţší vitalitu neţ původní druh. Z výsledků lze usuzovat, ţe mají tyto genotypy pravděpodobně odlišný stupeň ploidie. Pro přesné stanovení stupně ploidie byly uvedené genotypy dále analyzovány metodou průtokové cytometrie. Charakterizace 25 parametrů u rostlin v polním pokusu pomocí klasifikátoru pro rod Solanum (Vidner et al., 1987) včetně vysvětlivek klasifikátoru je uvedena v příloze 14. V rámci hodnocení pomocí klasifikátoru byly charakterizovány pouze genotypy druhu Solanum bulbocastanum, genotypy vzniklé regenerací protoplastů pouze tohoto druhu a potenciální somatické hybridy. Ţádnou rostlinu rodičovského dihaploidního genotypu S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165, ani DH 387, ani odrůdu Apta se nepodařilo v polních podmínkách dopěstovat z důvodů niţší vitality dihaploidů a obecně vysoké náchylnosti genotypů k Phytophthora infestans. Obrázek 24: Morfologické srovnání genotypů ve skleníkovém pokusu, dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum 165 (vlevo), S. bulbocastanum PIS 66 (vpravo) a jejich somatický hybrid (uprostřed)

103

Obrázek 25: Morfologické srovnání genotypů v polním pokusu, a) a b) S. bulbocastanum PIS 17 (2n) a REG 5 (4n); c) dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum 165 (2n); d), e) a f) somatické hybridy REG 30 F, REG 34 F a REG 43 F (všechny 4n)

104

Obrázek 26: Morfologické srovnání listů

105

Obrázek 27: Morfologické srovnání květů, a), b) somatický hybrid REG 43 F; c), d) Solanum bulbocastanum PIS 61; e), f) dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum 165

106

6.5.1.2 Detekce stupně ploidie 6.5.1.2.1 Průtoková cytometrie Výsledky stanovení stupně ploidie metodou průtokové cytometrie byly získány ve spolupráci s ÚEB AV v Olomouci a Botanickým ústavem AV ČR, v.v.i. v Průhonicích a jsou uvedeny v tabulce 17. Cytometrická vyšetření rostlin morfologicky přechodného typu ukazují na zvýšený počet chromozómů oproti původním diploidním jedincům pouţitým k fúzím protoplastů (Obrázek 28 a 29). Metoda odhalila u některých potenciálních somatických hybridů více jak 1,5 násobek obsahu jaderné hmoty (zřejmě se jedná o aneuploidy), většina hybridů však vykazovala přibliţně dvojnásobný obsah oproti původním diploidům. Genotyp REG 24 F byl identifikován jako autohexaploid a REG 52 F jako autotetraploid s genomem druhu Solanum tuberosum ssp. tuberosum. U genotypů REG 1, 5, 9, 11 a 14 byl touto metodou prokázán tetraploidní a u genotypu REG 2 hexaploidní stav. Vzhledem k tomu, ţe se jedná o genotypy vzniklé regenerací pouze z protoplastů genotypů diploidního druhu S. bulbocastanum, zvýšení stupně ploidie mohlo nastat buď samovolnou fúzí buněk během izolace protoplastů nebo spontánní polyploidizací buněk v rané fázi regenerace protoplastových kultur v novou rostlinu. Tetraploidní genotyp REG 1 a hexaploidní genotyp REG 2 pocházejí ze dvou prýtů jednoho kalusu označeného číslem 1 (Tabulka 8). Odlišný stupeň ploidie těchto genotypů mohl být způsoben spontánní polyploidizací buňky nebo buněk, které daly vzniknout danému prýtu. Druhou moţností je srůst dvou kalusů během kultivace. Tetraploidní somatický hybrid REG 35 F a tetraploidní genotyp REG 52 F, který obsahuje genom příslušící pouze druhu Solanum tuberosum ssp. tuberosum, pocházejí rovněţ z odlišných prýtů jednoho kalusu označeného číslem 12 (Tabulka 8). V tomto případě došlo pravděpodobně ke srůstu dvou kalusů během kultivace. Shrnutí výsledků morfologického hodnocení a analýzy genotypů metodou průtokové cytometrie naznačuje, ţe nejvyšší produkci nadzemní biomasy vykazují tetraploidní genotypy u obou druhů Solanum bulbocastanum (REG 1, 5, 9, 11 a 14) a S. tuberosum ssp. tuberosum (REG 52 F). Zvýšením stupně ploidie na hexaploidní úroveň (REG 2, REG 24 F) došlo u genotypů obou druhů ke zhoršení vitality, a téţ ke sníţení produkce biomasy výrazně pod úroveň diploidních genotypů těchto druhů. Tyto výsledky pravděpodobně naznačují jeden z moţných aspektů ukotvení tetraploidního stavu v rámci vzniku a domestikace kulturních brambor S. tuberosum ssp. tuberosum.

107

Tabulka 17: Výsledky stanovení stupně ploidie metodou průtokové cytometrie Botanický ústav AV ČR, v.v.i., Průhonice Genotyp

Index

Ploidie

S. blb PIS 61

0,4640

DH 388

ÚEB AV, Olomouc Genotyp

Index

Ploidie

2x

S. blb PIS 17

0,5056

2x

0,5350

2x

S. blb PIS 60

0,5015

2x

REG 1

0,9320

4x

S. blb PIS 61

0,5007

2x

REG 2

1,4480

6x

DH 165

0,5770

2x

REG 5

0,9390

4x

REG 14

0,9977

4x

REG 9

0,9340

4x

REG 29 F

0,9678

aneuploid ?

REG 11

0,9320

4x

REG 30 F

0,9959

aneuploid ?

REG 20 F

1,0000

4x

REG 32 F

1,0811

4x

REG 24 F

1,5570

6x

REG 35 F

1,1157

4x

REG 27 F

1,0000

4x

REG 36

0,4971

2x

REG 28 F

1,0000

4x

REG 44 F

1,1116

4x

REG 33 F

1,0000

4x

REG 46 F

1,1013

4x

REG 34 F

1,0000

4x

REG 49 F

1,1140

4x

REG 37

0,4800

2x

REG 50 F

1,1097

4x

REG 38 F

1,0000

4x

REG 52 F

1,0594

4x

REG 39 F

1,0000

4x

REG 40 F

1,0000

4x

REG 41 F

1,0000

4x

REG 42 F

1,0000

4x

REG 43 F

1,0000

4x

REG 47 F

1,0000

4x

REG 48 F

1,0000

4x

REG 51 F

1,0000

4x

REG 55

0,4740

2x

REG 67 F

1,0000

4x

REG 68 F

1,0000

4x

REG 69 F

1,0000

4x

REG 70 F

1,0000

4x

REG 71 F

1,0000

4x

Solanum bulbocastanum

Solanum tuberosum ssp. tuberosum Somatický hybrid

Index – relativní vajádření velikosti genomu neznámého vzorku vůči standardu (= 1), S. blb – Solanum bulbocastanum, DH – dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum, REG – jedinec vzniklý regenerací protoplastových kultur, F – genotypy, u kterých proběhla fúze protoplastů

108

Obrázek 28: Výstup cytologického vyšetření genotypu Solanum bulbocastanum PIS 61 (2n) získaný z průtokového cytometru Partec PAS (Německo). Dva píky představují obsah DNA v jádrech v G1 a G2 fázi buněčného cyklu

109

Obrázek 29: Výstup cytologického vyšetření genotypu somatického hybrida REG 50 F (4n) získaný z průtokového cytometru Partec PAS (Německo). Dva píky představují obsah DNA v jádrech v G1 a G2 fázi buněčného cyklu

6.5.1.2.2 Analýza variability uzavíracích párových buněk průduchů Hodnocení vlastností průduchů se oproti metodě průtokové cytometrie (Tabulka 17) ukázalo být jednoduchou a hlavně minimálně nákladnou metodou pouţitelnou jako důkaz změny stavu karyotypu. Z naměřených dat (Přílohy 15, 16, 17 a 18) bylo zjištěno, ţe původní diploidy s hodnotou karyotypu 2n = 2x = 24 vykazovaly průměrnou délku průduchových buněk 24,01µm (s = 3,4µm), kdeţto tetraploidy (2n = 4x = 48) vykazovaly délku 34,29 µm (s = 3,87µm). Obdobná situace nastala i v případě počtu chloroplastů ve svěracích buňkách průduchů, kdy diploidy obsahovaly v průduchu v průměru 13,1 chloroplastů (s = 1,87 ks) zatímco tetraploidy průměrně 21,9 chloroplastů (s = 3,37 ks). Výsledky jsou dokumentovány na obrázku 30. Číselné hodnoty o počtu chloroplastů odpovídají informacím podle Zadina a Jermoljev (1976). Analýza rozptylu prokázala, ţe rozdíly mezi diploidy a tetraploidy jsou statisticky velmi významné (p << 0,01). Výsledky dokumentuje graf na obrázku 31. 110

Z metodického hlediska je důleţité zjištění, ţe stomata jsou z hlediska délky a obsahu chloroplastů nejméně variabilní ve třetím listovém patře. Obrázek 30: Výstup analýzy rozptylu dvojného třídění dokumentující rozdíly mezi měřenými hodnotami stomatárních buněk rostlin s různým počtem chromozomů

Pis17 – diploidní genotyp Solanum bulbocastanum, DH387 – dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum, StuR10 – tetraploidní genotyp S. tuberosum ssp. tuberosum, Reg34F – jedinec vzniklý somatickou hybridizací S. bulbocastanum PIS 66 a DH 165

111

Obrázek 31: Porovnání velikostí svěracích buněk průduchů a počtu chloroplastů v těchto buňkách u diploidního a tetraploidního genotypu

6.5.2 Molekulárně genetické metody detekce somatických hybridů Jako důkaz hybridnosti genotypu byly vyuţity dvě nezávislé metody molekulární analýzy DNA, které měly doloţit jak hybridnost v oblasti jaderné DNA tak i DNA cytoplazmatické. 6.5.2.1 RAPD analýza Z hlediska molekulární analýzy DNA potenciálních somatických hybridů a jejich rodičovských komponent, bylo pomocí RAPD profilů dekamerických primerů OPN 8, 11, 13, 14, 15, 20, OPH 20 a OPF 5 prokázáno, ţe se jedná o somatické hybridy v případě 27 z 29 genotypů (Obrázek 32). U genotypu REG 52 F, který pocházel z kombinace S. blb 66 x DH 165, bylo RAPD analýzou zjištěno, ţe k fúzi nedošlo a tento regenerant je z hlediska RAPD produktů totoţný s DH 165. Stejný výsledek vykazoval genotyp REG 24 F pocházející z kombinace S. veru 299 x DH 322. Tento regenerant byl rovněţ genotypově totoţný s DH 322. Zde je moţné dodat, ţe ačkoliv je aplikace metody RAPD často zpochybňována (Jones et al., 1997), experimenty prokázaly, ţe je pro účely detekce somatických hybridů plně vyhovující. Jednak je velmi rychlá a nedestruktivní, v zásadě však i relativně levná a pro účely detekce somatických hybridů dostatečně opakovatelná a citlivá. K podobným závěrům

112

dospěli i autoři Baird et al. (1992) a Rasmussen a Rasmussen (1995). Popsané primery lze proto doporučit pro detekci somatických hybridů bramboru univerzálně. Obrázek 32: RAPD analýza PCR produktů primeru OPN 11 u somatických hybridů a jejich rodičovských komponent

S. blb – Solanum bulbocastanum, DH – dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum, REG – jedinec vzniklý somatickou hybridizací S. blb 66 a DH 165

6.5.2.2 Analýza chloroplastového markeru Cp4 Sekvenační analýzou produktu markeru trnL/trnF u rodičovských komponent S. blb 66 a DH 165 a jejich sedmi potenciálních somatických hybridů bylo prokázáno, ţe zdědily tuto část chloroplastové DNA pouze po jednom rodiči. Genotypy REG 24 F, 30F, 34 F, 35 F, 39 F a 52 F ji zdědily po dihaploidu kulturního bramboru Solanum tuberosum ssp. tuberosum DH 165 a genotyp REG 20 F po S. bulbocastanum PIS 66 (Obrázek 33). Zvláštností chloroplastové DNA je to, ţe v ní pravděpodobně nedochází k rekombinaci. To má za následek, ţe jsou všechny její geny (cistrony) selektovány najednou, jako jedna evoluční jednotka, jeden gen (Flegr, 2005). Pokud somatické hybridy zdědily analyzovanou část chloroplastové DNA pouze po jednom z rodičů, lze předpokládat, ţe se to bude týkat celého chloroplastového genomu. Tyto výsledky se shodují s Kemble et al. (1986). Pokud by došlo k fúzi cytoplazmy obou komponent, měly by vzniklé genotypy standardně obsahovat oba typy chloroplastové DNA v rámci analyzovaného lokusu. Tento výsledek by na první pohled bylo moţno interpretovat dvěma způsoby, buď k fúzi cytoplazmy vůbec nedošlo, nebo byly chloroplasty jedné rodičovské komponenty v průběhu regenerace protoplastů v cytoplazmě eliminovány. Výsledky metody RAPD a průtokové cytometrie prokazují, ţe u těchto 113

somatických hybridů došlo k fúzi pravděpodobně celých jader. Proto je nepravděpodobné, ţe by společně s jádry obou rodičovských komponent nefúzovala alespoň malá část cytoplazmy. Tuto moţnost prakticky vylučují i přímá pozorování průběhu fúze, kdy dochází ke slévání obsahu celých buněk. Proto se lze přiklánět spíše k předpokladu, ţe v průběhu vývoje hybridního

kalusu

došlo

k eliminaci

proplastidů

pocházejících

z dané

rodičovské

komponenty. Obrázek 33: Výsledky sekvenace produktů markeru Cp4 pro detekci dědičnosti cytoplasmy u somatických hybridů

S. tub DH – dihaploid Solanum tuberosum ssp. tuberosum, S. vru – S. verrucosum, S. pin – S. pinnatisectum, S. blb – S. bulbocastanum, S. chac – S. chacoense, S. yun – S. yungasense, S. micro – S. microdontum, S. moch – S. mochiquense, S. ber – S. berthaultii, REG F – regenerant vzniklý fúzí protoplastů S. blb x S. tub DH

6.6 Charakteristika vybraných vlastností somatických hybridů z hlediska vyuţitelnosti ve šlechtění bramboru 6.6.1 Fenotypové zhodnocení odolnosti somatických hybridů k Phytophthora infestans Ze šlechtitelského hlediska velmi důleţité hodnocení somatických hybridů týkající se odolnosti k Phytophthora infestans přineslo do jisté míry pozitivní výsledky, jelikoţ jak v laboratorním tak polním pokusu rostliny vykázaly poměrně značnou míru odolnosti. Zatímco dvouleté polní pokusy v oblasti Prahy informují o vysoké polní odolnosti, kdy prakticky po celou dobu vegetace nebyly zaznamenány symptomy choroby na listech ani stoncích, v laboratorním pokusu většina somatických hybridů vykazuje odolnost střední aţ vysokou. Pozitivní je zejména fakt, ţe pokud dojde k rozvoji nekróz na listu, patogen je schopen sporulace pouze při extrémní vlhkosti prostředí. Navíc, sporangiofory vytváří pouze 114

sporadicky a jen v oblasti nekróz a nikoliv v oblasti pletiva nekrózy ohraničujícího, jako je tomu u listů rostlin extrémně náchylných, kam patří i pouţité dihaploidy S. tuberosum DH 165 a DH 388. Ačkoliv tedy projev odolnosti nebyl tak silný jako v případě S. bulbocastanum PIS 66, je evidentní, ţe genetické interakce v hybridním genotypu udrţely odolnost na relativně vysoké úrovni, která sice nevede k úplnému potlačení patogena, ale významně omezuje jeho šíření v rostlině i v porostu. V případě genotypů REG 24 F a REG 52 F byla infekčním testem metodou listových terčíků detekována 100 % náchylnost k Phytophthora infestans, coţ potvrzuje výsledky předchozích analýz a oba tyto genotypy obsahují genom pouze druhu S. tuberosum ssp. tuberosum.

6.6.2 Tvorba hlíz a výnosový potenciál Dvouletý polní pokus byl na pokusném poli České zemědělské univerzity v lokalitě Praha 6 – Suchdol zaloţen ve druhé polovině května roku 2009 a 2010. Sklizeň proběhla 20. 10. 2009 a 15.10 2010. Délka vegetační doby byla přibliţně 155 dní. V době sklizně byly všechny somatické hybridy a protoplastové regeneranty odvozené od klonů Solanum bulbocastanum stále zelené a nejevily příznaky napadení plísní bramboru (Obrázek 34). Nať dihaploidních genotypů S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165 a DH 387 odumřela v polovině vegetační sezóny následkem napadení plísní bramboru a ke konci sezóny začaly rostliny těchto genotypů znovu obrůstat. Odrůda Apta vykazovala rovněţ silné poškození listové plochy plísní bramboru a poţerky způsobené mandelinkou bramborovou. Všechny genotypy zařazené do polního pokusu tvořily hlízy (Obrázek 35). Genotyp DH 165 vznikl dihaploidizací odrůdy Apta, kterou Genová banka při výzkumném ústavu bramborářském v Havlíčkově Brodě deklaruje

jako odrůdu polopozdní. Druh S.

bulbocastanum pochází z Mexika a jedná se o rostlinu krátkodení a v našich podmínkách by tvořila hlízy na podzim (Correll, 1962). Z těchto údajů lze předpokládat, ţe hodnocené somatické hybridy se budou řadit mezi genotypy s dlouhou vegetační dobou, coţ se v polním pokusu potvrdilo. Z hlediska stanovení počtu a hmotnosti hlíz pod trsem a orientačního výnosu v t.ha-1 jsou hodnocené genotypy variabilní (Tabulka 18, Obrázek 36). Hodnoty uvedené v tabulce 18 za rok 2010 jsou průměry ze dvou opakování. Diploidní rodičovské genotypy druhů S. bulbocastanum a S. tuberosum ssp. tuberosum mají přibliţně shodný počet hlíz pod trsem o shodné hmotnosti. Tetraploidní genotypy druhu S. bulbocastanum (REG 5 a REG 9) mají 115

obdobný počet hlíz pod trsem, ale jejich hmotnost je 2 – 5 x vyšší neţ u diploidního genotypu (S. blb 17). Tyto výsledky potvrzují, ţe i v rámci nekulturního druhu S. bulbocastanum tetraploidní stav můţe vést ke zvýšení výnosového potenciálu. Nízký počet nasazených hlíz pod trsem u genotypů tohoto druhu můţe být způsoben jeho krátkodenností. Rostliny začaly nasazovat hlízy aţ v době sklizně. Somatické hybridy vykazovaly v průměru větší počet hlíz pod trsem a mnohonásobně vyšší výnosy neţ původní rodičovské komponenty, coţ se shoduje s výsledky Waara et al. (1992) a Mattheij a Puite (1992). Nejlepších výsledků dosáhly genotypy REG 34 F, 43 F a 44 F. Ve srovnání s tetraploidy REG 5 a REG 9 (S. bulbocastanum) má většina somatických hybridů větší počet a hmotnost hlíz pod trsem. To naznačuje posun vegetační doby hybridů ve směru k polopozdní odrůdě Apta, ze které byl odvozen rodič DH 165. Souhrnné statistické hodnocení výnosotvorných parametrů u genotypů zařazených do polních pokusů v obou letech nebylo moţné z důvodu odlišného způsobu výsadby. V případě pouţití rostlin jako sadbového materiálu byly teoretické výnosy somatických hybridů odhadnuty v rozmezí 0,298 (REG 40 F) – 11,774 (REG 43 F) t.ha-1. Pouţitím hlíz jako sadbového materilálu se zvýšil počet stonků a stolonů na jedné rostlině somatických hybridů, coţ vedlo k navýšení teoretického výnosu na průměných 30,76 t.ha-1 (Tabulka 18). Tyto teoretické výnosy se přibliţují k výnosům současných konvenčně pěstovaných odrůd bramboru (Čermák, 2010). Pro přesnější určení těchto charakteristik je však třeba provést víceleté polní pokusy o větším plošném rozsahu. U hlíz všech genotypů z polního a skleníkového pokusu bylo hodnoceno celkem 9 parametrů podle klasifikátoru pro rod Solanum (Vidner et al., 1987) (Příloha 19). Některé parametry jako je velikost hlíz, vyrovnanost v tvaru apod. nebylo moţné hodnotit z důvodu sklizně omezeného počtu hlíz. Genotypy REG 2, 20 F, 24 F, 55 a 71 F nemohly být z tohoto důvodu charakterizovány vůbec. Všechny diploidní a tetraploidní genotypy druhu Solanum bulbocastanum měly kulaté hlízy s bezbarvou slupkou a bílou barvou duţniny, coţ se shoduje s botanickým popisem tohoto druhu (Correll, 1962; Bradshaw a Mackay, 1994). Dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165 se ve většině parametrů shodoval s odrůdou Apta, ze které byl odvozen. Vyjímkou byl vzhled hlíz, kde hlízy genotypu DH 165 vykazovaly vysoké procento deformací. Silné deformace se objevily i u genotypu DH 387. Tetraploidní REG 52 F, který dle předchozích výsledků obsahuje pouze genom S. tuberosum ssp. tuberosum (DH 165), byl ve všech parametrech srovnatelný s odrůdou Apta. Z těchto výsledků je patrné, ţe

116

dihaploidizace kulturního bramboru můţe pravděpodobně způsobovat zhoršení některých kvalitativních parametrů hlíz. Z hlediska tvaru hlíz a barvy duţniny vykazují všechny somatické hybridy rysy přechodného charakteru. U většiny somatických hybridů však dochází k výraznějšímu zhoršení kvality slupky. Některé hlízy měly aţ korkovitou strukturu slupky. Všechny somatické hybridy zdědily ţlutohnědou barvu slupky po genotypu DH 165 (S. tuberosum ssp. tuberosum). Tyto výsledky prokazují, ţe zbarvení slupky je dominantní nad slupkou bezbarvou. Z hlediska tvorby a výnosového potenciálu hlíz se somatické hybridy zdají být vhodným výchozím šlechtitelským materiálem, ze kterého by zpětným nasycovacím kříţením s tetraploidním bramborem mohly vzniknout nové odrůdy.

117

Obrázek 34: Jednoletý polní pokus na pokusném poli České zemědělské univerzity v lokalitě Praha 6 – Suchdol

118

Obrázek 35: Morfologické srovnání hlíz

119

Tabulka 18: Orientační hodnocení výnosového potenciálu hlíz somatických hybridů v polních pokusech v letech 2009 a 2010 Počet

2009 Hmotnost

Teoretický

hlíz pod

hlíz pod

výnos

trsem

trsem [g]

S. blb 17

3

Počet

2010 Hmotnost

Počet

2009 Hmotnost

Teoretický

Počet

2010 Hmotnost

Teoretický

hlíz pod

hlíz pod

výnos

hlíz pod

hlíz pod

výnos

trsem

trsem [g]

[t.ha ]

trsem

trsem [g]

[t.ha ]

REG 34 F

12,8

232,66

10,237

15,0

1215,0

53,46

51,45

2,264

16,6

350,0

15,40

Teoretický Genotyp

hlíz pod

hlíz pod

výnos

[t.ha ]

trsem

trsem [g]

[t.ha ]

13,2

0,581

-

-

-

DH 165

3,5

11,25

0,495

-

-

-

REG 35 F

3,5

DH 387

-

-

-

13,0

537,4

23,65

REG 38 F

6,6

158,56

6,977

11,1

460,0

20,24

Apta

-

-

-

20,0

1218,0

53,68

REG 40 F

1,4

6,78

0,298

10,0

470,0

20,68

REG 5

2,6

48,38

2,129

-

-

-

REG 43 F

0,950

-

-

-

REG 44 F

11,774 10,247

43,78

21,6

267,6 232,88

995,0

3

13,8 11,8

12,5

REG 9

12,3

1150,0

50,60

REG 36

1,8

2,34

0,103

-

-

-

REG 46 F

9,3

125

5,5

13,7

1335,0

58,74

REG 28 F

3,8

100,84

4,437

18,2

955,0

42,02

REG 47 F

3

7,15

0,315

6,6

440,0

19,36

REG 29 F

5

91,24

4,015

4,2

190,0

8,36

REG 48 F

-

-

-

7,8

210,0

9,24

REG 30 F

3,25

113,4

4,99

11

310,0

13,64

REG 67 F

-

-

-

10,8

260,0

11,44

REG 31 F

4,25

32,525

1,431

-

-

-

REG 69 F

-

-

-

6,6

70,0

3,08

REG 32 F

3,75

69,925

3,077

13,9

520,0

22,88

REG 72 F

-

-

-

1,4

50,0

2,2

Genotyp

-1

-1

-1

S. blb – Solanum bulbocastanum, DH – dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum, REG – jedinec vzniklý regenerací protoplastových kultur, F – genotypy, u kterých proběhla fúze protoplastů; Sadba – rostliny převedené z in vitro podmínek do skleníku, Sadba – hlízy o velikosti 3 – 6 cm

120

-1

Obrázek 36: Sklizeň hlíz v polním pokusu dne 20.10.2009; a) dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum DH 165; b) somatický hybrid REG 43 F; c) Solanum bulbocastanum PIS 61

6.6.3 Předpoklady pro sexuální kříţení V případě reciprokého kříţení se v ţádném z pokusů nepodařilo dosáhnout oplození a tím tvorby bobulí a semen. Zralá poupata somatických hybridů opylená pylem kulturních odrůd bramboru i poupata odrůd bramboru opylená pylem somatických hybridů přibliţně po 24 h extrémně rozkvetla a květy do 72 h opadaly. Tyto výsledky naznačují moţnou sexuální inkompatibilitu mezi somatickými hybridy a kulturním bramborem Solanum tuberosum ssp. tuberosum. V rámci sexuální nekřiţitelnosti těchto genotypů by se mohly uplatňovat některé prezygotické a postzygotické bariéry (Orczyk et al., 2003). Pre-zygotická bariéra je zaloţena na mechanismu tzv. pylovo – pestíkové inkompatibility (Grun a Aubertin, 1966). Tuto bariéru lze v některých případech

alternativními postupy při kříţení překonat. V případě post-

zygotické bariéry hraje jednu z nejdůleţitějších rolí endosperm. Pro tvorbu fertilních semen je třeba, aby byl poměr mateřské a otcovské komponenty při oplození 2 : 1, přičemţ sexuální hybridizace probíhá bez větších problémů u genotypů se stejným EBN (Johnston et al., 1980). V případě somatických hybridů získaných v rámci této disertační práce měly původní rodičovské komponenty odlišné EBN, genotyp Solanum bulbocastanum 1EBN a dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum 2EBN. Otázkou zůstává jaké EBN mají vzniklé somatické hybridy. Jednou moţností je, ţe při somatické hybridizaci došlo v této charakteristice k převládnutí pouze jednoho rodičovského genomu, vzniklé genotypy by potom měly 1EBN nebo pravděpodobněji 2EBN. Při úspěšné somatické hybridizaci však dochází k promíchání celých 121

obsahů buněk, mohlo by tedy dojít i k navýšení EBN. 3EBN se v rámci rodu Solanum nevyskytuje (Hawkes, 1994). 4EBN je typické pro řadu tetraploidních druhů v rámci rodu Solanum a vzniklé genotypy se 4EBN by bylo moţné kříţit s kulturním bramborem. Pro ověření role endospermu by bylo nutné kříţit hodnocené somatické hybridy s genotypy druhů rodu Solanum s odlišným EBN, například tetraploidní S. bulbocastanum (2EBN) - REG 1, 5, 9, 11 a 14, tetraploidní S. polytrichon (2EBN), tetraploidní S. sucrense (4EBN), tetraploidní S. tuberosum ssp. tuberosum (4EBN), popřípadě diploidní S. bulbocastanum (1EBN), diploidní S. verrucosum (2EBN) apod. Dalším potenciálním důvodem moţného neúspěchu při opylení a oplození při reciprokém kříţení, je porucha tvorby gamet, vajíček a pylových zrn, hodnocených somatických hybridů. Pro ověření této hypotézy bylo provedeno hodnocení viability pylových zrn.

6.6.3.1 Viabilita pylových zrn Viabilita pylových zrn stanovená barvením Lugolovým roztokem se u somatických hybridů pohybovala v rozmezí od 0,58 % do 8,97 % (Tabulka 19, Obrázek 37). Statistickým hodnocením metodou analýzy rozptylu jednoduchého třídění byly tyto rozdíly statisticky neprůkazné. Vyjímku tvořil genotyp REG 47 F s viabilitou 19,647 %. Srovnávací odrůda Valfi a tetraploidní genotyp druhu S. bulbocastanum REG 5 vykazovaly viabilitu vyšší neţ 74 % a tudíţ statisticky průkazně odlišnou od somatických hybridů (p  0,01) (Tabulka 20, Obrázek 37). Pyl odrůdy Valfi umoţňuje úspěšné opylení a oplození s následnou tvorbou vitálního potomstva, z tohoto důvodu je viabilita 75 % plně dostačující při sexuálním kříţení. Nízká viabilita pylových zrn somatických hybridů pravděpodobně naznačuje i nízkou viabilitu vajíček, coţ by mohl být hlavní limitující faktor úspěšnosti sexuálního kříţení. Teplota uskladnění sušeného pylu nemá vliv na jeho ţivotaschopnost. Z hlediska teploty při uskladnění pylu nebyl u genotypu REG 43 F nalezen statisticky průkazný rozdíl mezi teplotami skladování 20°C a 4°C.

122

Tabulka 19: Viabilita pylových zrn stanovená barvením Lugolovým roztokem Teplota uskladnění

Viabilita

Teplota uskladnění

Viabilita

sušeného pylu [°C]

[%]

sušeného pylu [°C]

[%]

Valfi

4

74,55

REG 35 F

20

7,50

REG 5

20

78,44

REG 38 F

20

4,98

REG 28 F

20

2,03

REG 43 F

4

8,97

REG 29 F

20

0,58

REG 43 F

20

8,56

REG 30 F

20

5,77

REG 44 F

20

1,72

REG 32 F

20

0,94

REG 46 F

20

9,17

REG 34 F

20

6,10

REG 47 F

20

19,65

Genotyp

Genotyp

REG – jedinec vzniklý regenerací protoplastových kultur, F – genotypy, u kterých proběhla fúze protoplastů

123

Tabulka 20: Statistické hodnocení viability pylu analýzou rozptylu jednoduchého třídění HSD při nestejných N; proměnná Viabilita [%] (Viabilita pylu) Přibliţné pravděpodobnosti pro post hoc testy Chyba: meziskup. PČ = 15,436, sv = 42,000 {1} {2} {3} {4} {5} Číslo Genotyp 74,550 6,1029 9,1780 78,442 2,0300 0,000135 0,000135 0,968290 0,000135 1 Valfi 0,988082 0,000135 0,985297 2 REG 34 F 0,000135 0,000135 0,577669 3 REG 46 F 0,000135 0,988082 0,000135 4 REG 5 0,968290 0,000135 0,000135 5 REG 28 F 0,000135 0,985297 0,577669 0,000135 6 REG 29 F 0,000135 0,875079 0,298995 0,000135 1,000000 7 REG 30 F 0,000135 1,000000 0,996900 0,000135 0,992750 8 REG 32 F 0,000135 0,917380 0,360743 0,000135 1,000000 9 REG 35 F 0,000135 1,000000 0,999998 0,000135 0,881104 10 REG 38 F 0,000135 1,000000 0,981130 0,000135 0,999223 11 REG 43 F 0,000135 0,982468 1,000000 0,000135 0,650593 12 REG 44 F 0,000135 0,973774 0,512922 0,000135 1,000000 13 REG 47 F 0,000135 0,007330 0,090550 0,000135 0,000256

{6} 0,58333 0,000135 0,875079 0,298995 0,000135 1,000000 0,914216 1,000000 0,625347 0,973292 0,358938 1,000000 0,000159

{7} 5,7733 0,000135 1,000000 0,996900 0,000135 0,992750 0,914216 0,946804 0,999997 1,000000 0,998899 0,985859 0,005453

{8} 0,94333 0,000135 0,917380 0,360743 0,000135 1,000000 1,000000 0,946804 0,698779 0,986418 0,426679 1,000000 0,000171

REG – jedinec vzniklý regenerací protoplastových kultur, F – genotypy, u kterých proběhla fúze protoplastů

124

{9} 7,5033 0,000135 1,000000 0,999998 0,000135 0,881104 0,625347 0,999997 0,698779

{10} 4,9767 0,000135 1,000000 0,981130 0,000135 0,999223 0,973292 1,000000 0,986418 0,999834

{11} 8,8280 0,000135 0,982468 1,000000 0,000135 0,650593 0,358938 0,998899 0,426679 1,000000 0,990756

{12} 1,7200 0,000135 0,973774 0,512922 0,000135 1,000000 1,000000 0,985859 1,000000 0,837352 0,997955 0,586055

0,999834 1,000000 0,990756 0,837352 0,997955 0,586055 0,024507 0,002647 0,070023 0,000221

{13} 19,647 0,000135 0,007330 0,090550 0,000135 0,000256 0,000159 0,005453 0,000171 0,024507 0,002647 0,070023 0,000221

Obrázek 37: Viabilita pylových zrn stanovená barvením Lugolovým roztokem; a) S. bulbocastanum REG 5 (4n); b) somatický hybrid REG 43 F (4n)

6.6.4 Orientační stanovení obsahu solaninu a chaconinu v hlízách Všechny somatické hybridy vytvářely kulovitooválné hlízy se ţlutou slupkou, fialovými očky a ţlutou duţninou (Obrázek 38). Senzorickým hodnocením bylo zjištěno, ţe hlízy měly nahořklou chuť, která je pravděpodobně způsobena vyšším obsahem alkaloidů v hlízách. Z tohoto důvodu bylo provedeno orientační stanovení obsahu dvou glykoalkaloidů α – solaninu a α – chaconinu, pro které jsou stanoveny hygienické limity. V tabulce 21 jsou uvedeny výsledky hodnocení a na obrázcích 39 a 40 výstupy v podobě grafů z kapalinového chromatografu. Nejdůleţitější parametr je celkový obsah obou glykoalkaloidů obsaţený v čerstvé

hmotě

hlíz

i

se

slupkou,

který

by

neměl

u

brambor

přesáhnout

200 mg.kg-1 (Rayburn et al., 1995). Z výsledků je patrné, ţe genotypy druhu S. bulbocastanum, diploidní S. blb 17 a tetraploidní REG 5, měly nízkou hladinu hodnocených glykoalkaloidů, coţ se shoduje s výsledky Savarese et al. (2009) a Distl a Wink (2009). Zdá se tedy, ţe stupeň ploidie nemá vliv na expresi genů podílejících se na biosyntéze α – solaninu a α - chaconinu. Při hodnocení obsahu α – solaninu byly detekovány ještě další dva výraznější píky příslušící pravděpodobně jiným glykoalkaloidům, které nebyly blíţe identifikovány (Obrázek 39). Jejich koncentrace v hlízách však byla poměrně nízká, coţ koresponduje se závěry Shakya a Navarre (2008), ţe S. bulbocastanum obsahuje široké spektrum solanidinových a solanidinu podobných alkaloidů. Všechny somatické hybridy měly vyšší obsah solaninu a chaconinu, který byl srovnatelný s dihaploidem DH 165. Ve třech případech (REG 34 F, 35 F a 43 F) byl obsah

125

dokonce nadlimitní. Z výsledků vyplývá, ţe obsah α – solaninu a α – chaconinu u somatických hybridů je dominantní vlastnost zděděná po S. tuberosum ssp. tuberosum. Obsah α – solaninu a α – chaconinu v hlízách druhu S. tuberosum ssp. tuberosum se pohybuje v poměru 40 : 60 (Storey, 2007). Tento parametr dihaploid tohoto druhu (DH 165) nesplňoval, jeho poměr byl přibliţně 51 : 49. Odlišný výsledek mohl být způsoben analýzou velmi malého počtu hlíz o nízké hmotnosti z důvodu velmi nízkého výnosu při sklizni polního pokusu. Obsah obou glykoalkaloidů mohl být rovněţ ovlivněn řadou stresových faktorů vnějšího prostředí, mezi které patřilo například napadení rostlin plísní bramboru. To způsobilo totální zničení natě jiţ v polovině vegetační sezóny, rostliny začaly na konci sezóny znovu obrůstat. U genotypů somatických hybridů byl tento poměr ještě více posunut ve prospěch α – solaninu, dosahoval poměru 57 : 43. To mohly způsobit mimo jiné i interakce genomů rodičovských komponent, kde má u druhu S. bulbocastanum výraznou převahu α – solanin nad α – chaconinem. Vzhledem k tomu, ţe hořkou chuť hlíz vykazovaly z rodičovských komponent pouze genotypy druhu S. bulbocastanum, je tato vlastnost u somatických hybridů způsobena pravděpodobně vyšším obsahem jiných typů glykoalkaloidů, zděděných po druhu S. bulbocastanum, které nebyly metodou kapalinové chromatografie diagnostikovány. Vyšší hladina solaninu a chaconinu však není limitujícím faktorem při novošlechtění bramboru. Kříţením somatických hybridů s genotypy bramboru s nízkým obsahem glykoalkaloidů lze koncentrace těchto látek v hlízách výrazně sniţovat. Druh S. bulbocastanum obsahuje mimo jiné i glykoalkaloid leptin I (Distl a Wink, 2009). Přítomnost leptinů v rostlinách zvyšuje jejich odolnost k mandelince bramborové (Leptinotarsa decemlineata) (Yencho et al., 2000). Z hodnocení jednoletého polního pokusu bylo patrné, ţe tento škůdce preferoval genotypy sestupně od S. tuberosum ssp. tuberosum, přes somatické hybridy po S. bulbocastanum. I přesto musely být v průběhu vegetace provedeny dva (rok 2009), respektive tři (rok 2010), insekticidní postřiky.

126

Obrázek 38: Hlíza somatického hybrida REG 43 F

Tabulka 21: Hodnoty obsahu solaninu a chaconinu v hlízách Celkový

Sušina

Obsah [mg.kg-1

[%]

sušiny]

4,7

15,86

29,92

91

177

18,12

974,19

118

144

263

17,86

1 472,33

REG 30F

73

82

155

22,17

697,82

REG 44F

63

82

145

17,84

813,39

REG 38F

69

84

153

24,21

631,74

REG 43F

91

141

232

18,86

1 229,31

REG 34F

91

142

233

17,92

1 301,73

REG 5

0,4

3,5

3,9

24,97

15,55

Chaconin

Solanin

[mg.kg-1]

[mg.kg-1]

S.blb 17

0,3

4,4

DH 165

86

REG 35F

Genotyp

obsah GA [mg.kg-1]

S. blb – Solanum bulbocastanum, DH – dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum, REG – jedinec vzniklý regenerací protoplastových kultur, F – genotypy, u kterých proběhla fúze protoplastů

127

Obrázek 39: Souhrnná analýza obsahu solaninu a chaconinu u genotypu Solanum bulbocastanum PIS 61 metodou kapalinové chromatografie. Největší peak interpretuje celkový obsah solaninu a chaconinu v hlízách v čerstvém stavu

128

Obrázek 40: Souhrnná analýza obsahu solaninu a chaconinu u genotypu somatického hybrida REG 44 F metodou kapalinové chromatografie. Největší peak interpretuje celkový obsah solaninu a chaconinu v hlízách v čerstvém stavu

129

ZÁVĚR

7

Závěry jsou shrnuty v několika bodech. 

Všechny pouţité metody infekčních testů rostlin a izolace a kultivace protoplastových kultur se ukázaly jako vhodné pro výběr rostlinného materiálu určeného pro somatickou hybridizaci bramboru s cílem zvýšení odolnosti k Phytophthora infestans. Tyto metody jsou obecně aplikovatelné na další genetické zdroje rodu Solanum.



Výsledky infekčních testů mohou být zatíţeny hlavně vlivem působení kultivačních podmínek, mnoţství inokula, momentálního fyziologického stavu rostliny a virulencí respektive rasovým spektrem inokula.

. 

Metody molekulární analýzy DNA jsou při dodrţení uvedených podmínek vhodné pro předběţnou detekci somatických hybridů bramboru. Zvláštní pozornost lze věnovat studiu nekódujících oblastí mitochondriální a zejména chloroplastové DNA, jejichţ vysoká evoluční konzervovanost umoţňuje mimo jiné analyzovat fylogenetické vztahy mezi jednotlivými druhy z čeledi Solanaceae.



DGGE a CDGE analýzou markeru Cp4 (trnL/trnF) byl detekován mezidruhový polymorfismus studované sekvence. Sekvenováním byla prokázána spolehlivost metody DGGE, metodou CDGE však nelze jednoznačně odlišit polymorfní sekvence. Metodu CDGE proto nelze v tomto případě doporučit jako nástroj přesné identifikace polymorfismů mezi genotypy.



Byly získány somatické hybridy mezi genotypy Solanum bulbocastanum PIS 66 a dihaploidem Solanum tuberosum ssp. tuberosum 165 a dále mezi genotypy Solanum bulbocastanum PIS 60 a dihaploidem Solanum tuberosum ssp. tuberosum 387. Tento výsledek byl potvrzen metodami detekce stupně ploidie a analýzami DNA. V morfologicko – anatomické analýze vykazovala většina znaků rysy přechodného charakteru. U některých znaků, jako například typ uspořádání květní koruny, zbarvení vnitřní části květů tzv. hvězdy a barva slupky hlíz se projevila úplná dominance. 130



Z pohledu vybraných hospodářsky důleţitých vlastností se somatické hybridy zdají být perspektivním výchozím šlechtitelským materiálem pro tvorbu nových odrůd bramboru. Limitujícími faktory však mohou být některé prezygotické (viabilita pylových zrn a vajíček) a postzygotické bariéry (Endosperm Balance Number), na které je moţné narazit při zpětném nasycovacím kříţení s kulturním bramborem Solanum tuberosum ssp. tuberosum. Dalším problémem je snaha šlechtitelů o co nejrychlejší a nejefektivnější produkci nových odrůd. Mezidruhové kříţení prodluţuje šlechtění o dalších několik let. Z hlediska rezistentního šlechtění se jeví metoda somatické hybridizace vedle GMO jako perspektivní při získávání genotypů s polygenní rezistencí.

131

8 PŘEHLED CITOVANÉ LITERATURY Abu-El Samen, F. M., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. 2003. Variability in Virulence Among Asexual Progenies of Phytophthora infestans. Phytopathology, 93 (3), 293 – 304.

Al-Janabi, S. M., McClelland, M., Petersen, C., Sobral, B. W. S. 1994. Phylogenetic analysis of organellar DNA sequences in the Andropogoneae: Sacharinae. Theoretical and Applied Genetics, 88, 933 – 944.

Andrivon, D. 1996. The origin of Phytophthora infestans populations present in Europe in the 1840s: a critical review of historical and scientific evidence. Plant Pathology, 45 (6), 1027 – 1035.

Arnqvist, L., Dutta, P. C., Jonsson, L., Sitbon, F. 2003. Reduction of Cholesterol and Glycoalkaloid Levels in Transgenic Potato Plants by Overexpression of a Type 1 Sterol Methyltransferase cDNA. Plant Physiology, 131, 1792 – 1799.

Baird, E., Cooper-Bland, S., Waugh, R., DeMaine, M., Powell, W. 1992. Molecular characterisation of inter- and intra-specific somatic hybrids of potato using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Molecular and General Genetics, 233 (3), 469 – 475. Ballvora, A., Ercolano, M. R., Weiβ, J., Meksem, K., Bormann, C. A., Oberhagemann, P., Salamini, F., Gebhardt, C. 2002. The R1 gene for potato resistance to late blight (Phytophthora infestans) belongs to the leucine zipper / NBS / LRR class of plant resistance genes. The Plant Journal, 30 (3), 361 – 371.

Bamberg, J. B., Hanneman, Jr. R. E. 1990. Allelism of Endosperm Balance Number (EBN) in Mexican tuber-bearing Solanum species. Theoretical and Applied Genetics, 80, 161 – 166.

Barsby, T. L., Shepard, J. F., Kemble, R. J., Wong, R. 1984. Somatic hybridization in the genus Solanum: S. tuberosum and S. brevidens. Plant Cell Reports, 3, 165 – 167.

132

Bastia, T., Scotti, N., Cardi, T. 2001. Organelle DNA analysis of Solanum and Brassica somatic hybrids by PCR with „universal primers“. Theoretical and Applied Genetics, 102, 1265 - 1272.

Bendahmane, A., Kanyuka, K., Baulcombe, D. C. 1997. High-resolution genetical and physical mapping of the Rx gene for extreme resistance to potato virus X in tetraploid potato. Theoretical and Applied Genetics, 95, 153-162.

Bejarano, L., Mignolet, E., Devaux, A., Espinola, N., Carrasco, E., Larondelle, Y. 2000. Glycoalkaloids in potato tubers: the effect of variety and drought stress on the α - solanine and α - chaconine contents of potatoes. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80 (14), 2096 – 2100.

Binding, H., Nehls, R., Schieder, O., Sopory, S. K., Wenzel, G. 1978. Regeneration of Mesophyll Protoplasts Isolated from Dihaploid Clones of Solanum tuberosum. Physiologia Plantarum, 43 (1), 52 – 54.

Birky, C. W., Jr. 1995. Uniparental inheritance of mitochondrial and chloroplast genes: Mechanism and evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 92, 11331 - 11338.

Black, W., Mastenbroek, C., Mills, W. R., Peterson, L. C. 1953. A proposal for an international nomenclature of races of Phytophthora infestans and of genes controlling immunity in Solanum demissum derivatives. Euphytica, 2 (3), 173 – 179.

Bohs, L., Olmstead, R. G. 1997. Phylogenethic Relationships in Solanum (Solanaceae) based on ndhF Sequences. Systematic botany, 22 (1), 5 – 17.

Bradshaw, J. E., Mackay, G. R. 1994. Potato genetics. CAB International, Cambridge, 552 p. ISBN 0-85198-869-5.

Brandt, P. 1995. Transgene Pflanzen: Herstellung, Anwendung, Risiken und Richtlinien. Birkhäuser, Schweiz, 306 p. ISBN 3-7643-5202-7.

133

Bříza, J., Machová, I. 1991. Regeneration of Plants from Leaf Mesophyll Protoplasts of the Tetraploid Potato Cultivars Xenia and Bintje. Biologia Plantarum (Praha), 33(3), 225 – 233. Bushway, R. J., Ponnampalam, R. 1981. α – Chaconine and α – Solanine Content of Potato Products and Their Stability during Several Modes of Cooking. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 29, 814 – 817.

Carlberg, I., Karlsson, S., Eriksson, T. 1987. Improved Culture Techniques for Potato Protoplasts. In: Bajaj, Y. P. S. 1987. Biotechnology in Agriculture and Forestry 3, Potato. Springer-Verlag, 187 – 194. ISBN 3-540-17966-6.

Carputo, D., Frusciante, L., Peloquin, S. J. 2003. The Role of 2n Gametes and Endosperm Balance Number in the Origin and Evolution of Polyploids in the Tuber-Bearing Solanums. Genetics, 163, 287 – 294.

Clegg, M. T. 1993. Chloroplast gene sequences and the study of plant evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 90, 363 - 367.

Colton, L. M., Groza, H. I., Wielgus, S. M., Jiang, J. 2006. Marker-Assisted Selection for the Broad-Spectrum Potato Late Blight Resistance Conferred by Gene RB Derived from a Wild Potato species. Crop Science, 46, 589 – 594.

Commun, K., Mauro, M. C., Chupeau, Y., Boulay, M., Burrus, M., Jeandet, P. 2003. Phytoalexin production in grapevine protoplasts during isolation and culture. Plant Physiology and Biochemistry, 41, 317 – 323.

Cooke, D. E. L., Lees, A. K. 2004. Markers, old and new, for examining Phytophthora infestans diversity. Plant Pathology, 53, 692–704.

Cooke, D. E. L., Young, V., Birch, P. R. J., Toth, R., Gourlay, F., Day, J. P., Carnegie, S. F., Duncan, J. M. 2003. Phenotypic and genotypic diversity of Phytophthora infestans populations in Scotland (1995 – 97). Plant Pathology, 52, 181 – 192.

134

Cooper-Bland, S., De Maine, M. J., Stewart, H. E., Fleming, M. L. M. H., Phillips, M. S., Kumar, A. 1996. Intraspecific somatic and sexual hybridisation between dihaploid lines of Solanum tuberosum L.: evaluation of morphological traits and resistance to late blight Phytophthora infestans (Mont.) de Bary in the foliage. Euphytica, 90, 209 – 216.

Correll, D. S. 1962. The Potato and Its Wild Relatives. Texas Research Foundation, Renner, Texas, 606 p. Čermák, V. 2010. Seznam doporučených odrůd bramboru 2010. Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Brno, 109 s., ISBN 978-80-7401-025-5.

Deimling, S., Zitzlsperger, J., Wenzel, G. 1988. Somatic Fusion for breeding of Tetraploid Potatoes. Plant breeding, 101, 181 – 189.

De Jong, W., Forsyth, A., Leister, D., Gebhardt, C., Baulcombe, D. C. 1997. A potato hypersensitive resistance gene against potato virus X maps to a resistance gene cluster on chromosome 5. Theoretical and Applied Genetics, 95, 246 – 252.

Dinu, I. I., Hayes, R. J., Kynast, R. G., Phillips, R. L., Thill, C. A. 2005. Novel inter-series hybrids in Solanum, section Petota. Theoretical and applied genetics, 110, 403−415.

Distl, M., Wink, M. 2009. Identification and Quantification of Steroidal Alkaloids from Wild Tuber-Bearing Solanum Species by HPLC and LC-ESI-MS. Potato Research, 52, 79 – 104. Doleţal, P. 2006. Uplatnění fungicidů a fungicidních sledů proti plísni bramboru a vznik rezistence u patogena. Disertační práce, ČZU v Praze, 120 s. Doleţel, J., Greilhuber, J., Suda, J. 2007. Flow Cytometry with Plant Cells. Analysis of Genes, Chromosomes and Genomes. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 479 s. ISBN 978-3-527-31487-4.

Drenth, A., Janssen, E. M., Govers, F. 1995. Formation and survival of oospores of Phytophthora infestans under natural conditions. Plant Pathology, 44, 86 – 94.

135

Duminil, J., Pemonge, M. H., Pettit, R. J. 2002. A set of 35 consensus primer pairs amplifying genes and introns of plant mitochondrial DNA. Molecular Ecology Notes, 2, 428 – 430. El-Kharbotly, A., Palomino-Sánchez, C., Salamini, F., Jacobsen, E., Gebhardt, C. 1996. R6 and R7 alleles of potato conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans (Mont.) de Bary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosome XI. Theoretical and applied genetics 92 (7), 880 – 884.

Erwin, D. C., Ribeiro, O. K. 2005. Phytophthora Diseases Worldwide. APS PRESS, The American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, 562 p. ISBN 0-89054-212-0.

Fejes, E., Engler, D., Maliga, P. 1990. Extensive homologous chloroplast DNA recombination in the pt 14 Nicotiana somatic hybrid. Theoretical and applied genetics, 97, 28 – 32.

Fish, N., Karp, A., Jones, M. G. K. 1988. Production of somatic hybrids by electrofusion in Solanum. Theoretical and applied genetics, 76, 260 – 266.

Fleck, J., Durr, A., Lett, M. C., Hirth, L. 1979. Changes in protein synthesis during the initial stage of life of tobacco protoplasts. Planta, 145 (3), 279 – 285. Flegr, J. 2005. Evoluční biologie. Academia, Praha, 559 s. ISBN 80-200-1270-2.

Flor, H. H. 1971. Current status of the gene-for-gene concept. Annual Review of Phytopathology, 9, 275-298. In: Marano, M. R., Malcuit, I., De Jong, W., Baulcombe, D. C. 2002. High-resolution genetic map of Nb, a gene that confers hypersensitive resistance to potato virus X in Solanum tuberosum. Theoretical and Applied Genetics, 105, 192-200.

Friedman, M., McDonald, G. 1997. Potato glycoalkaloids: chemistry, analysis, safety and plant physiology. Critical reviews in plant sciences, 16, 55–132. Gichner, T., Mukherjee, A., Velemínský, J. 2006. DNA staining with the fluorochromes EtBr, DAPI and YOYO-1 in the comet assay with tobacco plants after treatment with ethyl methanesulphonate, hyperthermia and DNase-I. Mutation Research, 605, 17 – 21.

136

Glimelius, K., Chen, K., Bonnett, H. T. 1981. Somatic hybridization in Nicotiana: Segregation of organellar traits among hybrid and cybrid plants. Planta, 153 (6), 504 – 510. Goodwin, S. B. 1997. The population genetics of Phytophthora. Phytopatology, 87, 462 – 473. Goodwin, S. B., Cohen, B. A., Deahl, K. L., Fry, W. E. 1994 a. Migration from Nothern Mexico as the Probable Cause of Recent Genetic Changes in Populations of Phytophthora infestans in the United States and Canada. Phytopathology, 84 (6), 553 – 558.

Goodwin, S. B., Cohen, B. A., Fry, W. E. 1994 b. Panglobal distribution of a single clonal lineage of the Irish potato famine fungus. The Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 91, 11591 – 11595.

Goulden, M. G., Baulcombe, D. C. 1993. Functionally Homologous Host Components Recognize Potato Virus X in Gomphrena globosa and Potato. The Plant Cell, 5, 921-930. Greplová, M., Polzerová, H. 2007. Shortening of time of the plant regeneration from protoplast-derived calli in genus Solanum. Vědecké práce, 15, Výzkumný ústav bramborářský, Havlíčkův Brod, 61 – 69.

Griffith, G. W., Shaw, D. S. 1998. Polymorphisms in Phytophthora infestans: Four Mitochondrial Haplotypes Are Detected after PCR Amplification of DNA from Pure Cultures or from Host Lesions. Applied and Environmental Microbiology, 64 (10), 4007 – 4014.

Griffiths, D. W., Dale, M. F. B. 2001. Effect of Light Exposure on the Glycoalkaloid Content of Solanum phureja Tubers. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49 (11), 5223 – 5227. Grun, P. 1990. The Evolution of Cultivated Potatoes. Economic Botany, 44 (3), 39 – 55.

Grun, P., Aubertin, M. 1966. The inheritance and expression of unilateral inkompatibility in Solanum. Hederity, 21, 131 – 138.

137

Grun, P., Wang M.-W., Radke, S. 1987. Regeneration of Plants from Potato Protoplasts. In: Bajaj, Y. P. S. 1987. Biotechnology in Agriculture and Forestry 3, Potato, Springer – Verlag, 195 – 210. ISBN 3-540-17966-6. Hausvater, E., Mazáková, J., Doleţal, P., Táborský, V., Rasocha, V., Ryšánek, P., Satrapová, V. 2007. Population

structure of Phytophthora infestans relating to mating types and

fungicide resistance in 2003 – 2006 and the efficacy of fungicides against potato late blight. Vědecké práce, Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, 15, 85 – 99.

Hawkes, J. G. 1944. Potato Collecting Expeditions in Mexico and South Amerika. Imperial Bureau of Plant Breeding and Genetics, Cambridge, 142 p.

Hawkes, J. G. 1990. The Potato Evolution, Biodiversity and Genetic Resources. Smithsonian Institution Press, Washington DC. In: Volkov, R. A., Komarova, N. Y., Panchuk, I. I., Hemleben, V. 2003. Molecular evolution of rDNA external transcribed spacer and phylogeny of sect. Petota (genus Solanum). Molecular Phylogenetics and Evolution, 29, 197 – 202.

Hawkes, J. G. 1994. Origins of Cultivated Potatoes and Species Relationships. In: Bradshaw, J. E., Mackay, G. R. 1994. Potato genetics. CAB International, Cambridge, 3 - 42. ISBN 0 85198 869 5.

Hawkes, J. G., Francisco-Ortega, J. 1993. The early history of the potato in Europe. Euphytica, 70, 1 – 7.

Hawkes, J. G., Francisco-Ortega, J. 1992. The Potato in Spain During the Late 16th Century. Economic Botany, 46 (1), 86 – 97.

Hawkes, J. G., Hjerting, J. P. 1969. The potatoes of Argentina, Brazil, Paraguay, and Uruguay. A biosystematic study. Clarendon press, Oxford, 525 p.

Hawkes, J. G., Jackson, M. T. 1992. Taxonomic and evolutionary implications of the Endosperm Balance Number hypothesis in potatoes. Theoretical and Applied Genetics, 84, 180 – 185.

138

Heinhorst, S., Gannon, G. C., Galun, E., Kenschaft, L., Weissbach, A. 1988. Clone bank and physical and genetic map of potato DNA. Theoretical and Applied Genetics, 75, 244 - 251.

Helgelson, J. P. 1992. New genes fo disease resistances through somatic hybridization. European Journal of Plant Pathology, 98, 223 – 229.

Helgelson, J. P., Pohlman, J. D., Austin, S., Haberlach, G. T., Wielgus, S. M., Ronis, D., Zambolim, L., Tooley, P., McGrath, J. M., James, R. V., Stevenson, W. R. 1998. Somatic hybrids between Solanum bulbocastanum and potato: a new source of resistance to late blight. Theoretical and Applied Genetics, 96, 738 – 742.

Hijmans, R. J., Spooner, D. M. 2001. Geographic distribution of wild potato species. American Journal of Botany, 88 (11), 2101 – 2112.

Hilson, P., de Froidmont, D., Lejour, C., Hirai, S. I., Jacquemin, J. M., Yaniv, M. 1990. Fos and Yun Oncogenes Transactivate Chimeric or Native Promoters Containing AP1/GCN4 Binding Sites in Plant Cell. The Plant Cell, 1, 651 – 658.

Hiratsuka, J., Shimada, H., Whittier, R., Ishibashi, T., Sakamoto, M., Mori, M., Kondo, C., Honji, Y., Sun, C. R., Meng, B. Y., Li, Y. Q., Kanno, A., Nishizawa, A., Hirai, A., Shinozaki, K., Sugiura, M. 1989. The complete sequence of the rice (Oryza sativa) chloroplast genome: intermolecular recombination between distinct tRNA genes accounts for a major plastid DNA inversion during the evolution of the cereals. Molecular Genetics and Genomics, 217 (2 – 3), 185 – 194. Horáčková, V., Domkářová, J., Kreuz, L. 2008. Metodika biologického testu in vitro pro účely selekce náchylných materiálů vůči plísni bramboru (Phytophthora infestans Mont de Bary). Metodické postupy vyuţitelné ve šlechtění. Výzkumný ústav bramborářský, Havlíčkův Brod, 27–30. ISBN 978-80-86940-13-7.

Hosaka, K. 1995. Successive domestication and evolution of the Andean potatoes as revealed by chloroplast DNA restriction endonuclease analysis. Theoretical and Applied Genetics, 90 (3 – 4), 356 – 363.

139

Hosaka, K. 1986. Who is the mother of the potato? – restriction endonuclease analysis of chloroplast DNA of cultivated potatoes. Theoretical and Applied Genetics, 72, 606 – 618.

Hosaka, K., Hanneman Jr., R. E. 1988. The origin of the cultivated tetraploid potato based on chloroplast DNA. Theoretical and Applied Genetics, 76, 172 – 176. Hraška, Š., Bartoš, P., Maršálek, L. 1989. Špeciálna genetika pol´nohospodárskych rastlín. Príroda, Bratislava, 211 s. ISBN 80-07-00022-4. Hruška, L., Beránek, J., Daniel, J., Fousek, J., Jun, J., Mejstřík, J., Míča, B., Musil, J., Nohejl, J., Poppr, J., Radil, B., Rasocha, V., Strašil, F., Vaňha, B., Zadina, J., Zrůst, J. 1974. Brambory. Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 416 s. ISBN 07-019-74.

Hu, D., Luo, Z. 2006. Polymorhism of amplified mitochondrial DNA non-coding regions in Diospyros spp. Scientia Horticulturae, 109, 275 – 281.

Huang, S., Van der Vossen, E. A. G., Kuang, H., Vleeshouwers, V. G., Zhang, N., Borm, T. J. A., Van Eck, H. J., Baker, B., Jacobsen, E., Visser, R. G. F. 2005. Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato. The Plant Journal 42, 251 – 261.

Chappell, J. 1995. The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism. Plant Physiology, 107, 1 – 6.

Cheng, J., Saunders, J. A. 1995. Protoplast Electrofusion and Regeneration in Potato. In: Methods in Molecular Biology, 55. In: Plant Cell Electroporation and Electrofusion Protocols, 181 – 188.

Cherdshewasart, W., Gharti-Chhetri, G. B., Saul, M. W., Jacobs, M., Negrutiu, I. 1993. Expression instability and genetic disorders in transgenic Nicotiana plumbaginifolia L. plants. Transgenic Research, 2 (6), 307 – 320.

140

Chiang, T. Y., Schaal, B. A., Peng, Ch. I. 1998. Universal primers for amplification and sequencing a noncoding spacer between the atpB and rbcL genes of chloroplast DNA. Botanical Bulletin of Academia Sinica, 39, 245 – 250. Chloupek, O. 2008. Genetická diverzita, šlechtění a semenářství. Academia, Praha, 307 s. ISBN 978-80-200-1566-2.

Choi, D., Ward, B. L., Bostock, R. M. 1992. Differential Induction and Suppression of Potato 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase Genes in Response to Phytophthora infestans and to Its Elicitor Arachidonic Acid. The Plant Cell, 4, 1333 – 1344.

Jackson, S. A., Hanneman Jr., R. E. 1999. Crossability between cultivated and wild tuber- and non-tuber-bearing Solanums. Euphytica, 109, 51 – 67.

Johnston, S. A., den Nijs, T. P. M., Peloquin, S. J., Hanneman, Jr. R. E. 1980. The Significance of Genic Balance to Endosperm Development in Interspecific Crosses. Theoretical and Applied Genetics, 57, 5 – 9.

Jones, C. J., Edwards, K. J., Castaglione, S., Winfield, M. O., Sala, F., van den Wiel, C., Bredemeijer, G., Vosman, B., Matthes, M., Daly, A., Brettschneider, R., Bettini, P., Buiatti, M., Maestri, E., Malcevschi, A., Marmiroli, N., Aert, R., Volckaert, G., Rueda, J., Linacero, R., Vazquez, A., Karp, A. 1997. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratoires. Molecular Breeding, 3, 381 – 390.

Juzepczuk, S. W., Bukasov, S. M. 1929. A contribution to the question of the origin of the potato (in Russian). Proc USSR Congr Genet Plant Anim Breed, 3, 592 – 611. In: Spooner, D. M., Nuñez, J., Rodriguez, F., Naik, P. S., Ghislain, M. 2005. Nuclear and chloroplast DNA reassessment of the origin of Indian potato varieties and its implications for the origin of the early European potato. Theoretical and Applied Genetics, 110, 1020 – 1026.

Kajita, T., Kamiya, K., Nakamura, K., Tachida, H., Wickneswari, R., Tsumura, Y., Yoshimaru, H., Yamazaki, T. 1998. Molecular Phylogeny of Dipetrocarpaceae in Southeast Asia Based on Nucleotide Sequences of matK, trnL Intron, and trnL-trnF Intergenic Spacer Region in Chloroplast DNA. Molecular phylogenetics and evolution, 10 (2), 202 - 209. 141

Kalina, T., Váňa, J. 2005. Sinice, řasy, houby, mechorosty a podobné organismy v současné biologii. Univerzita Karlova v Praze, Karolinum, 606 s. ISBN 80-246-1036-1. Kamoun, S., Honée, G., Weide, R., Laugé, R., Kooman-Gersmann, M., de Groot, K., Govers, F., de Wit, P. J. G. M. 1999. The Fungal Gene Avr9 and the Oomycete Gene inf1 Confer Avirulence to Potato Virus X on Tobacco. Molecular Plant-Microbe Interactions, 12 (5), 459 – 462.

Kanzaki, H., Saitoh, H., Takahashi, Y., Berberich, T., Ito, A., Kamoun, S., Terauchi, R. 2008. NbLRK1, a lectin-like receptor kinase protein of Nicotiana benthamiana, interacts with Phytophthora infestans INF1 elicitin and mediates INF1-induced cell death. Planta, 228, 977 – 987.

Kemble, R. J., Barsby, T. L., Wong, R. S. C., Shepard, J., F. 1986. Mitochondrial DNA rearrangements in somatic hybrids of Solanum tuberosum and Solanum brevidens. Theoretical and Applied Genetics, 72, 787 - 793.

Kemble, R. J., Flavell, R. B., Brettell, R. I. S. 1982. Mitochondrial DNA Analyses of Fertile and Sterile Maize Plants Derived from Tissue Culture with the Texas Male Sterile Cytoplasm. Theoretical and Applied Genetics, 62, 213 - 217.

Kemble, R. J., Gunn, R. E., Flavell, R. B. 1980. Classification of normal and male-sterile cytoplasms in maize. II. electrophoretic analysis of DNA species in mitochondria. Genetics, 95, 451 - 458.

Kemble, R. J., Shepard, J. F. 1984. Cytoplasmic DNA variation in a potato protoclonal population. Theoretical and Applied Genetics, 69, 211 – 216.

Kobe, B., Kajava, A. V. 2001. The leucine-rich repeat as a protein recognition motif. Current Opinion in Structural Biology, 11, 725-732.

Krits, P., Fogelman, E., Ginzberg, I. 2007. Potato steroidal glycoalkaloid levels and the expression of key isoprenoid metabolic genes. Planta, 227, 143 – 150. 142

Kůdela, V. 2007. History of Bacterial Ring Root of Potato in the Czech Lands and a Proposal for Relaxation of Strict Quarantine Measures. Plant protection science, 43 (2), 35 – 46. Kůdela, V., Novacky, A., Fucikovsky, L. 2002. Rostlinolékařská bakteriologie. Academia, Praha, 347 s. ISBN 80-200-0899-3.

Kuhl, J. C., Hanneman Jr., R. E., Havey, M. J. 2001. Characterization and mapping of Rpi1, a late-blight resistance locus from diploid (1EBN) Mexican Solanum pinnatisectum. Molecular Genetics and Genomics, 265, 977-985.

Lafta, A. M., Lorenzen, J. H. 2000. Influence of hight temperature and reduced irradiance on glycoalkaloid levels in potato leaves. Journal of the American Society for Horticultural Science, 125, 563 – 566. Laptev, J. P. 1988. Heteroploidia v šl’achtení rastlín. Príroda, Bratislava, 278 s. ISBN 064026-88.

Leonards-Schippers, C., Gieffers, W., Salamini, F., Gebhardt, Ch. 1992. The R1 gene conferring race specific resistance to Phytophthora infestans in potato is located on potato chromosome V. Molecular and general genetics 233, 278-283.

Li, X., Van Eck, H. J., Rouppe van der Voort, J.N.A.M., Huigen, D.J., Stam, P., Jacobsen, E. 1998. Autotetraploids and genetic mapping using common AFLP markers: the R2 allele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4. Theoretical and applied genetics 96, 1121 – 1128. Lössl, A., Frei, U., Wenzel, G. 1994. Interraction between cytoplasmic composition and yield parameters in somatic hybrids of S. tuberosum L. Theoretical and applied genetics, 89, 873 – 878.

143

Louwes, K. M., Hoekstra, R., Mattheij, W. M. 1992. Interspecific hybridization between the cultivated potato Solanum tuberosum subspecies tuberosum L. and the wild species S. circaeifolium subsp. Circaeifolium Bitter exhibiting resistance to Phytophthora infestans (Mont.) de Bary and Globodera pallida (Stone) Behrens. Theoretical and Applied Genetics, 84, 362 – 370.

Malcolmson, J. F., Black, W. 1966. New R genes in Solanum demissum Lindl. And their complementary races of Phytophthora infestans (Mont,) de Bary. Euphytica, 15, 199 – 203.

Masuelli, R. W., Camadro, E. L. 1997. Crossability relationships among wild potato species with different ploidies and Endosperm Balance Numbers (EBN). Euphytica, 94, 227 – 235.

Masuelli, R. W., Tanimoto, E. Y., Brown, C. R., Comai, L. 1995. Irregular meiosis in a somatic hybrid between S. bulbocastanum and S. tuberosum detected by species-specific PCR markers and cytological analysis. Theoretical and Applied Genetics, 91, 1995, 401 – 408.

Mattheij, W. M., Eijlander, R., de Koning, J. R. A., Louwes, K. M. 1992. Interspecific hybridization between the cultivated potato Solanum tuberosum subspecies tuberosum L. and the wild species S. circaeifolium subsp. circaeifolium Bitter exhibiting resistance to Phytophthora infestans (Mont.) de Bary and Globodera pallida (Stone) Behrens. Theoretical and Applied Genetics, 83, 459 – 466.

Mattheij, W. M., Puite, K. J. 1992. Tetraploid potato hybrids through protoplast fusions and analysis of their performance in the field. Theoretical and Applied Genetics, 83, 807–812.

May, K. J., Ristaino, J. B. 2004. Identity of the mtDNA haplotype(s) of Phytophthora infestans in historical specimens from the Irish Potato Famine. Mycological Research, 108 (5), 471 – 479. Mazáková, J. 2008. Determinace pohlavních typů A1, A2 a hladiny rezistence k systémovým fungicidům u populací patogena Phytophthora infestans v ČR. Disertační práce, ČZU v Praze, s. 92.

144

McCue, K. F., Allen, P. V., Shepherd, L. V. T., Blake, A., Maccree, M. M., Rockhold, D. R., Novy, R. G., Stewart, D., Davies, H. V., Belknap, W. R. 2007. Potato glycosterol rhamnosyltransferase, the terminal in triose side-chain biosynthesis. Phytochemistry, 68, 327 – 334.

McCue, K. F., Shepherd, L. V. T., Allen, P. V., Maccree, M. M., Rockhold, D. R., Corsini, D. L., Davies, H. V., Belknap, W. R. 2005. Metabolic compensation of steroidal glycoalkaloid biosynthesis in transgenic potato tubers: using reverse genetics to confirm the in vivo enzyme function of a steroidal alkaloid galactosyltransferase. Plant Science, 168, 267 – 273.

McDowell, J. M., Woffenden, B. J. 2003. Plant disease resistance genes: recent insights and potential applications. Trends in Biotechnology, 21 (4), 178-183.

Menke, U., Schilde-Rentschler, L., Ruoss, B., Zanke, C., Hemleben, V., Ninnemann, H. 1996. Somatic hybrids between the cultivated potato Solanum tuberosum L. and the 1EBN wild species Solanum pinnatisectum Dun.: morphological and molecular characterization. Theoretical and Applied Genetics, 92, 617 – 626.

Millam, S., Payne, L. A., Mackay, G. R. 1995. The integration of protoplast fusion-derived material into a potato breeding programme – a review of progress and problems. Euphytica 85, 451 – 455.

Mota, D., Faria, F., Gomes, E. A., Marriel, I. E., Paiva, E., Seldin, L. 2008. Bacterial and Fungal Communities in Bulk Soil and Rhizospheres of Aluminium-Tolerant and AluminiumSensitive Maize (Zea mays L.) Lines Cultivated in Unlimed and Limed Cerrado Soil. Journal of Microbiology and Biotechnology, 18 (5), 805 – 814.

Mouras, A., Saul, M. W., Essad, S., Potrykus, I. 1987. Localization by in situ hybridization of a low copy chimaeric resistance gene introduced into plants by direct gene transfer. Molecular and General Genetics, 207 (2 – 3), 204 – 209.

Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology, 15(3), 473 – 497.

145

Naess, S. K., Bradeen, J. M., Wielgus, S. M., Haberlach, G. T., McGrath, J. M., Helgeson, J. P. 2000. Resistance to late blight in Solanum bulbocastanum is mapped to chromosome 8. Theoretical and Applied Genetics, 101 (5 – 6), 697 – 704.

Nagata, T., Takebe, I. 1970. Cell Wall Regeneration and cell Division in Isolated Tobacco Mesophyll Protoplasts. Planta, 92, 301 – 308.

Negrutiu, I., Hinnisdaels, S., Cammaerts, D., Cherdshewasart, W., Gharti-Chhetri, G., Jacobs, M. 1992. Plant protoplasts as genetic tool: selectable markers for developmental studies. International Journal of Developmental Biology, 36, 73 – 84.

Niederhauser, J. S. 1991. Phytophthora infestans: the Mexican connection. In: Lucas, J. A., Shattock, R. C., Shaw, D. S., Cooke, L. R. 1991. Phytophthora. Cambridge University press, Cambridge, 25 – 45. Oberwalder, B., Ruoβ, B., Schilde-Rentschler, L., Hemleben, V., Ninnemann, H. 1997. Asymetric fusion between wild and cultivated species of potato (Solanum spp.) – detection of asymmetric hybrids and genome elimination. Theoretical and Applied Genetics, 94, 1104 – 1112.

Olmstead, R. G., Palmer, J. D. 1997. Implications for the Phylogeny, Classifications, and Biogeography of Solanum from cpDNA Restriction Site Variation. Systematic Botany, 22 (1), 19 – 29.

Orczyk, W., Przetakiewicz, J., Nadolska-Orczyk, A. 2003. Somatic hybrids of Solanum tuberosum – application to genetics and breeding. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 74, 1 – 13. Ordoñez, M. E., Forbes, G. A., Trognitz, B. R. 1997. Resistance to late blight in potato. A putative gene that suppresses R genes and is elicited by specific isolates. Euphytica, 95 (2), 167 – 172.

146

Otto, F. 1990. DAPI staining of fixed cells for high – resolution flow cytometry of nuclear DNA. In: Chrissman, H. A., Darzynkiewicz, Z. (eds.) Methods in cell biology, 33, Academic Press, New York, 105 – 110.

Park, T. H., Foster, S., Brigneti, G., Jones, J. D. G. 2009. Two distinct potato late blight resistance genes from Solanum berthaultii are located on chromosome 10. Euphytica, 165, 269 – 278.

Park, T. H., Gross, J., Sikkema A., Vleeshouwers, V. G. A. A., Muskens, M., Allefs, S., Jacobsen, E., Visser, R. G. F., Van der Vossen, E. A. G. 2005 a. The late blight resistance locus Rpi-blb3 from Solanum bulbocastanum belongs to a major late blight R gene cluster on chromosome 4 of potato. Molecular Plant-Microbe Interaction, 18 (7), 722-729.

Park, T. H., Vleeshouwers, V. G. A. A., Hutten, R. C. B., Van Eck, H. J., Van der Vossen, E. A. G., Jacobsen, E., Visser, R. G. F. 2005 b. High resolution mapping and analysis of the resistance locus Rpi-abpt against Phytophthora infestans in potato. Molecular breeding, 16, 33 – 43. Pavlová, L. 2005. Fyziologie rostlin. Karolinum, Praha, 253 s. ISBN 80-246-0985-1.

Percival, G., Dixon, G., Sword, A. 1994. Glycoalkaloid concentration of potato tubers following continuous illumination. Journal of the Science of Food and Agriculture, 66 (2), 139 – 144.

Percival, G. C., Karim, M. S., Dixon, G. R. 1998. Influence of light-enhanced glycoalkaloids on resistance of potato tubers to Fusarium sulphureum and Fusarium solani var. coeruleum. Plant Pathology, 47 (5), 665 – 670.

Perl, A., Aviv, D., Galun, E. 1990. Protoplast-fusion-derived Solanum cybrids: application and phylogenetic limitations. Theoretical and Applied Genetics, 79, 632 – 640.

Perez, W. G., Gamboa, J. S., Falcon, Y. V., Coca, M., Raymundo, R. M., Nelson, R. J. 2001. Genetic Structure of Peruvian Populations of Phytophthora infestans. Phytopathology, 91 (10), 956 – 965. 147

Pijinacher, L. P., Ferwerda, M. A., Puite, K. J., Roest, S. 1978. Elimination of Solanum phureja chromosomes in Solanum tuberosum – Solanum phureja somatic hybrids. Theoretical and Applied Genetics, 73, 878 – 882. Poczai, P., Taller, J., Szabó, I. 2008. Analysis of phylogenetic relationships in the genus Solanum (Solanaceae) as revealed by RAPD markers. Plant Systematics and Evolution, 275, 59 – 67. Ptáček, J., Dědič, P. 2003. Postup bezvirového udrţovacího šlechtění stávajících odrůd bramboru v České republice. Vědecké práce, Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, 14, 103 – 113.

Puite, K. J., Schaart, J. G. 1993. Nuclear genomic composition of asymetric fusion products between irradiated transgenic Solanum brevidens and S. tuberosum: limited elimination of donor chromosomes and polyploidization of the recipient genome. Theoretical and Applied Genetics, 86, 237 – 244.

Qutob, D., Tedman-Jones, J., Gijzen, M. 2006. Effector-triggered immunity by the plant pathogen Phytophthora. TRENDS in Microbiology, 14 (11), 470 – 473.

Rasmussen, J. O., Rasmussen, O. S. 1995. Characterization of somatic hybrids of potato by use of RAPD markers and isosyme analysis. Physiologia Plantarum, 93 (2), 357 – 364. Rasocha, V., Hausvater, E., Doleţal P. 2004. Choroby, škůdci a abionózy bramboru. Orin s.r.o., České Budějovice, Příloha měsíčníku Agro – ochrana, výţiva, odrůdy 5, 74 s. ISSN 1211-362 X. Rasocha, V., Hausvater, E., Doleţal, P. 2008. Škodliví činitelé bramboru: abionózy, choroby, škůdci (Harmful agent sof potato: Abionoses, diseases, pests). Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, 161 s. ISBN 978-80-86940-12-0.

Rauscher, G. M., Smart, D. C., Simko, I., Bonierbale, M., Mayton, H., Greenland, A., Fry, W. E. 2006. Characterisation and mapping of Rpi-ber, a novel potato late blight resistance gene from Solanum berthaultii. Theoretical and Applied Genetics, 112, 674 – 687. 148

Rayburn, J. R., Friedman, M., Bantle, J. A. 1995. Synergistic interaction of glycoalkaloids αchaconine and α-solanine on developmental toxicity in Xenopus embryos. Food and chemical toxikology, 33 (12), 1013 – 1019. Rickwood, D., Hames, B. D. 1990. Gel Electrophoresis of Nucleic Acids – A Practical Approach. Oxford University Press, New York, 311 p. ISBN 0-19-963083-6. Ríos, D., Ghislain, M., Rodríguez, F., Spooner, D. 2007. What Is the Origin of the European Potato? Evidence from Canary Island Landraces. Crop Science, 47, 1271 – 1280.

Ristaino, J. B. 2002. Tracking historic migrations of the Irish potato famine pathogen, Phytophthora infestans. Microbes and Infection, 4, 1369 – 1377.

Rokka, V. M., Xu, Y. S., Kankila, J., Kuusela, A., Pulli, S., Pehu, E. 1994. Identification of somatic hybrids of dihaploid Solanum tuberosum lines and S. brevidens by species specific RAPD patterns and assessment of disease resistance of the hybrids. Euphytica, 80 (3), 207 – 217. Rosypal, S. 1996. Úvod do molekulární biologie první díl. Brno, 304 s. Rybáček, V., Čača, Z., Fric, V., Fricová, E., Šroller, J., Votoupal, B., Daniel, J., Findejs, R., Míča, B., Radil, B., Rasochová, M., Rasocha, V., Tuček, V., Vokál, B., Zrůst, J. 1988. Brambory. Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 360 s. ISBN 07-134-88.

Salaman, R. N. 1937. The potato in its early home and its early introduction into Europe. J R Hortic Soc, 62, 61 – 77, 112 – 123, 153 – 162, 253 – 266. In: Spooner, D. M., Nuñez, J., Rodriguez, F., Naik, P. S., Ghislain, M. 2005. Nuclear and chloroplast DNA reassessment of the origin of Indian potato varieties and its implications for the origin of the early European potato. Theoretical and Applied Genetics, 110, 1020 – 1026.

Sambrook, J., Maniatis, T., Fritsch, E. F. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

149

Sanford, L. L., Deahl, K. L., Sinden, S. L., Ladd, T. L. 1992. Glycoalkaloid contents in tubers from Solanum tuberosum populations selected for potato leafhopper resistance. American Journal of Potato Research, 69 (11), 693 – 703.

Sansome, E. 1977. Polyploidy and induced gametangial formation in British isolates of Phytophthora infestans. Journal of general mikrobiology, 99, 311 – 316.

Savarese, S., Andolfi, A., Cimmino, A., Carputo, D., Frusciante, L., Evidente, A. 2009. Glycoalkaloids as Biomarkers for Recognition of Cultivated, Wild, and Somatic Hybrids of Potato. Chemistry and Biodiversity, 6, 437 – 446.

Scotti, N., Monti, L., Cardi, T. 2003. Organelle DNA Variation in parental Solanum spp. genotypes and Nuclear-cytoplasmic interactions in Solanum tuberosum (+) S. commersonii somatic hybrid-backcross progeny. Theoretical and Applied Genetics, 108, 87 - 94.

Scowcroft, W. R. 1979. Nucleotide Polymorphism in Chloroplast DNA of Nicotiana debneyi. Theoretical and Applied Genetics, 55, 133 - 137. Sedláková, V., Hausvater, E., Doleţal, P. 2008. Polní náchylnost odrůd bramboru k obecné strupovitosti, vločkovitosti hlíz a stříbřitosti slupky. Vědecké práce, Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, 16, 113 – 126.

Shakya, R., Navarre, D. A. 2008. LC-MS Analysis of Solanidane Glycoalkaloid Diversity among Tubers of Four Wild Potato Species and Three Cultivars (Solanum tuberosum). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56, 6949 – 6958.

Shepard, J. F. 1982. Cultivar dependent cultural refinements in potato protoplast regeneration. Plant Science Letters, 26, 127 – 132.

Shepard, J. F., Totten, R. E. 1977. Mesophyll Cell Protoplasts of Potato: Isolation, Proliferation and Plant Regeneration. Plant Physiology, 60, 313 – 316.

150

Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. 1972. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian Journal of Botany, 50, 199 – 204.

Sidorov, V. A., Yevtushenko, D. P., Shakhovsky, A. M., Gleba, Y. Y. 1994. Cybrid production based on mutagenic innactivation of protoplasts and rescuing of mutant plastids in fusion products: potato with a plastome from S. bulbocastanum and S. pinnatisectum. Theoretical and Applied Genetics, 88, 525 – 529. Slavík, B. a kolektiv. 2000. Květena České republiky 6. Academia, Praha, 770 s. ISBN 80200-0306-1. Śliwka, J., Jakuczun, H., Lebecka, R., Marczewski, W., Gebhardt, C., Zimnoch-Guzowska, E. 2006. The novel, major locus Rpi-phu1 for late blight resistance maps to potato chromosome IX and is not correlated with long vegetation period. Theoretical and Applied Genetics, 113, 685 – 695.

Smart, C. D., Fry, W. E. 2001. Invasions by the late blight pathogen: renewed sex and enhanced fitness. Biological Invasions 3 (3), 235 – 243.

Smilde, W. D., Brigneti, G., Jagger, L., Perkins, S., Jones, J. D. G. 2005. Solanum mochiquencse chromosome IX carries a novel late blight resistance gene Rpi-moc1. Theoretical and Applied Genetics, 110, 252-258.

Smith, D. B., Roddick, J. G., Jones, J. L. 1996. Potato glycoalkaloids: some unaswered questions. Trends in Food Sience and Technology, 7, 126 – 131.

Spielman, L. J., Drenth, A., Davidse, L. C., Sujkovski, L. J., Gu, W., Tooley, T. W., Fry, W. E. 1991. A second world-wide migration and population displacement of Phytophthora infestans? Plant Pathology, 40, 422 – 430.

Spooner, D. M., Castillo, R. T. 1997. Reexamination of series relationships of South American wild potatoes (Solanaceae: Solanum S. sect. Petota): evidence from chloroplast DNA restriction site variation. American Journal of Botany, 84, 5, 671 – 685. 151

Spooner, D. M., Nuñez, J., Rodriguez, F., Naik, P. S., Ghislain, M. 2005. Nuclear and chloroplast DNA reassessment of the origin of Indian potato varieties and its implications for the origin of the early European potato. Theoretical and Applied Genetics, 110, 1020 – 1026.

Stadler, M., Stelzer, T., Borisjuk, N., Zanke., C., Schilde-Rentschler, L., Hemleben, V. 1995. Distribution of novel and known repeated elements of Solanum and application for the identification of somatic hybrids among Solanum species. Theoretical and Applied Genetics, 91, 1271 – 1278.

Stermer, B. A., Bianchini, G. M., Korth, K. L. 1994. Regulation of HMG-CoA reductase activity in plants. Journal of Lipid Research, 35, 1133 – 1140.

St-Onge, R., Goyer, C., Coffin, R., Filion, M. 2008. Genetic diversity of Streptomyces spp. causing common scab of potato in eastern Canada. Systematic and Applied Microbiology, 31 (6 – 8), 474 – 84.

Storey, M. 2007. The Harvested Crop. In: Vreugdenhil, D., Bradshaw, J., Gebhardt, C., Govers, F., MacKerron, D. K. L., Taylor, M. A., Ross, H. A. 2007. Potato Biology and Biotechnology, Advances and Perspectives. Elsevier, Italy, 91 – 115, ISBN 978–0–444– 51018–1.

Szczerbakowa, A., Boltowicz, D., Lebecka, R., Radomski, P., Wielgat, B. 2005. Characteristics of the interspecific somatic hybrids Solanum pinnatisectum (+) S. tuberosum H-8105. Acta Physiologiae Plantarum, 27 (3A), 265-273.

Sugiura, M. 2003. History of chloroplast genomics. Photosynthesis Research, 76, 371 - 377.

Taberlet, P., Gielly, L., Pautou, G., Bouvet, J. 1991. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105 - 1109.

Tian, Z. D., Liu, J., Wang, B. L., Xie, C. H. 2006. Screening and expression analysis of Phytophthora infestans induced genes in potato leaves with horizontal resistance. Plant Cell Reports, 25, 1094 – 1103.

152

Tooley, P. W., Therrien, C. D., Ritch, D. L. 1989. Mating Type, Race Composition, Nuclear DNA Content, and Isozyme Analysis of Peruvian Isolates of Phytophthora infestans. Phytopathology, 79 (4), 478 – 481.

Trabelsi, S., Gargouri-Bouzid, R., Vedel, F., Nato, A., Lakhoua, L., Drira, N. 2005. Somatic hybrids between potato Solanum tuberosum and wild species Solanum vernei exhibit a recombination in the plastome. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 83, 1 – 11. Tymčenko, V., Jefronovová, T. 1987. Atlas škůdců a chorob zeleniny a bramboru. Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 181 s.

Upadhya, M. D. 1975. Isolation and culture of mesophyll protoplasts of potato (Solanum tuberosum L.). Potato Research, 18, 438 – 445.

Van der Vossen, E. A. G., Gross, J., Sikkema A., Muskens, A., Wouters, D., Wolters, P., Pereira A., Allefs, S. 2005. The Rpi-blb2 gene from Solanum bulbocastanum is an Mi-1 gene homolog conferring broad-spectrum late blight resistance in potato. The Plant Journal, 44, 208-222.

Van der Vossen, E. A. G., Sikkema, A., Hekkert, B., Gross, J., Stevens, P., Muskens, M., Wouters, D., Pereira, A., Stiekema, W., Allefs, S. 2003. An ancient R gene from the wild potato species Solanum bulbocastanum confers broad spectrum resistance to Phytophthora infestans in cultivated potato and tomato. The Plant Journal, 36, 867-882.

Van Eck, H. J. 2007. Genetics of Morphological and Tuber Traits. In: Vreugdenhil, D., Bradshaw, J., Gebhardt, C., Govers, F., MacKerron, D. K. L., Taylor, M. A., Ross, H. A. 2007. Potato Biology and Biotechnology, Advances and Perspectives. Elsevier, Italy, 91 – 115, ISBN 978–0–444–51018–1.

Van Gelder, W. M. J., Tuinstra, L. G. M. T. H., Van Der Greef, J., Scheffer, J. J. C. 1989. Characterization of novel steroidal alkaloids from tubers of Solanum species by combined gas chromatography – mass spectrometry: Implications for potato breeding. Journal of Chromatography A, 482 (1), 13 – 22.

153

Vidner, J., Dobiáš, K., Konrád, J., Dědič, P., Bareš, I., Sehnalová, J. 1987. Klasifikátor genus Solanum L. Výzkumný a šlechtitelský ústav bramborářský Havlíčkův Brod, Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha – Ruzyně, Praha, 45 s.

Visker, M. H. P. W., Keizer, L. C. P., Van Eck, H. J., Jacobsen, E., Colon, L. T., Struik, P. C. 2003. Can the QTL for late blight resistance on potato chromosome 5 be attributed to foliage maturity type? Theoretical and Applied Genetics, 106 (2), 317 – 325. Vokál, B., Čepl, J., Číţek, M., Diviš, J., Domkářová, J., Fér, J., Hamouz, K., Hausvater, E., Jůzl, M., Rasocha, V., Zrůst, J. 2004. Pěstování brambor. Agrospoj, Praha, s. 261. ISBN 80239-4235-2. Vokál, B., Čepl, J., Hausvater, E., Rasocha, V. 2003. Pěstujeme brambory. Grada, Praha, 103 s. ISBN 80-247-0567-2.

Volkov, R. A., Komarova, N. Y., Panchuk, I. I., Hemleben, V. 2003. Molecular evolution of rDNA external transcribed spacer and phylogeny of sect. Petota (genus Solanum). Molecular Phylogenetics and Evolution, 29, 197 – 202.

Waara, S., Pijnacker, L., Ferwerda, M. A., Wallin, A., Eriksson, T. 1992. A cytogenetic and phenotypic characterization of somatic hybrid plants obtained after fusion of two different dihaploid clones of potato (Solanum tuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics, 85 (4), 470 – 479.

Wakasugi, T., Sugita, M., Tsudzuki, T., Sugiura, M. 1998. Updated Gene Map of Tobacco Chloroplast DNA. Plant Molecular Biology Reporter, 16, 231 - 241. Walker, C. A., Köppe, M., Grenville-Briggs, L. J., Avrova, A. O., Horner, N. R., McKinnon, A. D., Whisson, S. C., Birch, P. R. J., van West, P. 2008. A putative DEAD-box RNAhelikase is required for normal zoospore development in the late blight pathogen Phytophthora infestans. Fungal Genetics and Biology, 45, 954 – 962.

154

Wastie, R. L. 1991. Breeding for resistance. Advanced Plant Pathology, 7, 193 – 223. In: Tian, Z. D., Liu, J., Wang, B. L., Xie, C. H. 2006. Screening and expression analysis of Phytophthora infestans induced genes in potato leaves with horizontal resistance. Plant Cell Reports, 25, 1094 – 1103.

Wang, Z. Y., Ge, X., Scott, M., Spangenberg, G. 2004. Viability and longevity of polen from transgenic and nontransgenic tall fescue (Festuca arundinacea) (Poaceae) plants. American Journal of Botany, 91 (4), 523 – 530.

Wettstein, D., Poulsen, C., Holder, A. A. 1978. Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase as a Nuclear and Chloroplast Marker. Theoretical and Applied Genetics, 53, 193 - 197.

Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A., Tingey, S. V. 1990. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18, 6531-6535.

Xu, Y. S., Murto, M., Dunckley, R., Jones, M. G. K., Pehu, E. 1993. Production of asymetric hybrids between Solanum tuberosum and irradiated S. brevidens. Theoretical and Applied Genetics, 85, 729 – 734.

Yamagishi, H., Terachi, T. 2003. Multiple origins of cultivated radisches as evidenced by comparsion of the structural variations in mitochondrial DNA of Raphanus. Genome, 46, 89 94.

Yencho, G. C., Kowalski, S. P., Kennedy, G. G., Sanford, L. L. 2000. Segregation of Leptine Glycoalkaloids and Resistance to Colorado Potato Beetle (Leptinotarsa decemlineata (Say)) in F2 Solanum tuberosum (4x) x S. chacoense (4x) Potato Progenies. American Journal of Potato Research, 77 (3), 167 – 178.

Yoshioka, H., Yamada, N., Doke, N. 1999. cDNA Cloning of Sesquiterpene Cyclase and Squalene Synthase, and Expression of the Genes in Potato Tuber Infected with Phytophthora infestans. Plant and Cell Physiology, 40 (9), 993 – 998.

155

Yukawa, M., Tsudzuki, T., Sugiura, M. 2005. The 2005 Version of the Chloroplast DNA Sequence from Tobacco (Nicotiana tabacum). Plant Molecular Biology Reporter, 23, 359365. Zadina, J., Jermoljev, E. 1976. Šlechtění bramboru. Academia, Praha, 359 s.

Zimmoch-Guzowska, E., Lebecka, R., Kryszczuk, A., Maciejewska, U., Szczerbakowa, A., Wielgat, B. 2003. Resistance to Phytophthora infestans in somatic hybrids of Solanum nigrum L. and diploid potato. Theoretical and Applied Genetics, 107, 43 – 48. Ţiţka, J. 2008. Situační a výhledová zpráva brambory duben 2008. Ministerstvo zemědělství ČR, s. 41. Ţiţka, J. 2010. Situační a výhledová zpráva brambory duben 2010. Ministerstvo zemědělství ČR, s. 48.

156

8.1 Citace internetových publikací Ministerstvo

ţivotního

prostředí.

2007.

http://www.mzp.cz/www/env-

gmo.nsf/$pid/MZPMVFKH4EIY/$file/oer-4697ENV07_BASF_rozhodnut%C3%AD20070517.pdf , povolení společnosti BASF spol. s.r.o. k uvádění geneticky modifikovaných brambor se zvýšenou odolností k Phytophthora infestans do ţivotního prostředí v České republice, poslední revize 14. 4. 2009.

8.2 Internetové databáze EVIGEZ

(Evidence

genových

zdrojů

v ČR),

Česká

republika.

http://genbank.vurv.cz/genetic/resources/ The European Cultivated Potato Database, Velká Británie. http://www.europotato.org

157

9 PŘÍLOHY Příloha 1: Druhy rodu Solanum: S. bulbocastanum, S. microdontum, S. pinnatisectum a S. polyadenium

158

Příloha 2: Druhy rodu Solanum: S. berthaulti, dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum, S. vernei a S. verrucosum

159

Příloha 3: Chemické sloţení roztoků pro izolaci, kultivaci a regeneraci protoplastových kultur modifikovaných dle Cheng a Saunders (1995) Sloţení NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4 . 7H2O CaCl2 . 2H2O Na2EDTA FeSO4 . 7H2O MnSO4 . 4H2O ZnSO4 . 7H2O H3BO3 KI Na2MoO4 . 2H2O CoCl2 . 6H2O CuSO4 . 5H2O Glycin Nikotinová kyselina Pyridoxin Thiamin Inositol Kasein hydrolyzát Glutamin Adenin sulfát Sacharóza Glukóza Mannitol Sorbitol PVP MES IAA NAA 2, 4-D Zeatin GA3 Agar Phytagel LGT agaróza pH

A mg/l 1650 1900 170 370 440 37,3 27,8 22,3 10,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025 2,0 0,5 0,5 1,0 100,0 250,0 20g 7g 5,7

B mg/l 950 85 185 660 18,65 13,9 11,15 5,3 3,1 0,415 0,125 0,013 0,013 2,0 0,5 0,5 10,0 100,0 18g 73g 5g 1g 5,7

C mg/l 1900 170 370 1320 37,3 27,8 22,3 10,6 6,2 0,83 0,25 0,026 0,026 4,0 1,0 1,0 20,0 200,0 500,0 200,0 20g 60g 14,4g 2,5 0,5 2,0 5,7

160

D mg/l 950 85 185 660 18,65 13,9 11,15 5,3 3,1 0,415 0,125 0,013 0,013 2,0 0,5 0,5 10,0 100,0 250,0 100,0 10g 30g 50g 1,25 0,25 1,0 8g 5,7

E mg/l 950 85 185 660 18,65 13,9 11,15 5,3 3,1 0,415 0,125 0,013 0,013 2,0 0,5 0,5 10,0 100,0 250,0 100,0 10g 30g 50g 1,25 0,25 1,0 2g 5,7

F mg/l 1650 1900 270 370 440 37,3 27,8 22,3 10,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025 2,0 0,5 0,5 1,0 100,0 250,0 100,0 100,0 10g 30g 0,01 3,0 0,5 2g 5,7

Příloha 4: a) protoplasty před čištěním; b) test viability; c) Bürkerova počítací komůrka; d) prstenec nativních protoplastů

161

Příloha 5: a) Phytophthora infestans; b) infekční testy in vitro rostlin; c) infekční testy metodou listových terčíků; d) detail nekrózy na listu

162

Příloha 6: a) elektroporátor BTX; b) Petriho miska s fúzní komorou; c) řetízkování protoplastů; d) fúzované protoplasty 15 minut po elektrofúzi

163

Příloha 7: Izolace DNA pomocí DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, SRN) 

Předehřát vodní lázeň na teplotu 65°C. Odváţit 100 mg rostlinného materiálu. Vzorek vloţit do mikrozkumavky o objemu 2 ml, ponořit do tekutého dusíku a rozdrtit skleněnou tyčinkou.



K homogenizovanému vzorku přidat 400 μl Buffer AP1 a 4 μl RNasy A a směs důkladně protřepat na vibrační třepačce.



Vzorek inkubovat 10 minut ve vodní lázni předehřáté na 65°C. V průběhu inkubace vzorek 2-3x opatrně promíchat.



K lyzátu přidat 130 μl Buffer AP2, promíchat a vzorek na 5 minut umístit do mrazícího boxu při teplotě –20°C (dochází k vysráţení proteinů a polysacharidů).



Obsah zkumavky přenést do QIAshedder Mini Spin zkumavky (fialová barva) a centrifugovat maximální rychlostí (13 500 otáček . minuta-1) 2 minuty.



Supernatant přelít do nové 2 ml zkumavky, přidat 675 μl Buffer AP3/E a pipetou promíchat.



Přenést 650 μl vzorku do DNeasy Mini Spin zkumavky (bílá barva) a centrifugovat 1 minutu při rychlosti 8000 otáček . minuta-1. Totéţ provést se zbývající částí vzorku.



DNeasy Mini Spin zkumavku (filtr) vloţit do nové 2 ml zkumavky a přidat 500 μl promývacího roztoku Buffer AW. Do pufru byl předtím přidán ethanol. Centrifugovat 1 minutu při rychlosti 8000 otáček . minuta-1. Odlít supernatant.



Přidat 500 μl Buffer AW, centrifugovat maximální rychlostí (13 500 otáček . minuta -1) 2 minuty. Supernatant odlít.



Propláchnout kolonu 200 μl neředěného ethanolu a následně centrifugovat po dobu 2 minut při stejných otáčkách. Mezitím nahřát pufr AE (TE).



Přenést DNeasy Mini Spin zkumavku (filtr) do nové 2 ml zkumavky a přidat 100 μl Buffer AE (1xTE pufr), inkubovat při laboratorní teplotě 5 minut. Centrifugovat 1 minutu při rychlosti 8000 otáček . minuta-1.



Opakovat předchozí krok.



Fáze prošlá kolonou obsahuje DNA.

164

Příloha 8: Koncentrace uvolněných protoplastů z 1 g naváţky z mezofylu listů při působení celulolytických enzymů Hodiny od

Koncentrace

začátku

protoplastů genotypu

inkubace

R7 [ks.ml-1]

1

1 106 256,5

-

1 528 978,5

-

2

3 595 022,5

2 488 766,0

3 752 606,0

2 223 627,5

3

6 982 233,0

3 387 211,0

9 311 833,3

5 559 227,3

4

9 194 746,0

2 212 513,0

11 257 818,0

1 945 984,7

5

11 821 638,4

2 626 892,0

15 774 704,7

4 516 886,7

6

13 135 292,1

1 313 654,0

18 207 227,2

2 432 522,5

7

13 964 880,8

829 588,7

18 554 551,8

347 324,6

8

16 038 852,4

2 073 972,0

18 971 508,0

416 956,2

9

16 453 646,7

414 794,3

20 639 332,9

1 667 824,9

10

17 075 838,2

622 191,5

20 847 811,0

208 488,1

11

17 905 426,9

829 588,7

27 310 632,4

6 462 821,4

Diference R7

165

Koncentrace protoplastů genotypu R11 [ks.ml-1]

Diference R11

Příloha 9: Výsledky hodnocení růstových paramertů rostlin při charakterizaci vlivu sloţení kultivačních médií Druh

Médium

Alar 85

AgNO3

Průměrná délka jedné

Průměrný počet listů na

Průměrná hmotnost jedné

Průměrná hmotnost sušiny

Sušina

[mg.l-1]

[mg.l-1]

rostliny [cm]

jednu rostlinu

rostliny [g]

jedné rostliny [g]

[%]

S. verrucosum 299

SH

0

0

10,20

11,80

0,2907

0,0237

8,15

S. verrucosum 299

SH

1

1,5

8,67

10,50

0,4639

0,0387

8,34

S. verrucosum 299

SH

5

7,5

8,68

13,33

0,5356

0,0414

7,73

S. verrucosum 299

MS

0

0

9,60

14,00

0,2670

0,0199

7,45

S. verrucosum 299

MS

1

1,5

7,13

10,33

0,3493

0,0261

7,47

S. verrucosum 299

MS

5

7,5

3,43

6,50

0,2355

0,0219

9,30

S. verrucosum 299

CH

0

0

7,35

11,17

0,2983

0,0202

6,77

S. verrucosum 299

CH

1

1,5

7,42

8,83

0,3470

0,0249

7,18

S. verrucosum 299

CH

5

7,5

6,17

11,67

0,5342

0,0459

8,59

S. berthaultii 260

SH

0

0

4,65

9,17

0,2373

0,0202

8,51

S. berthaultii 260

SH

1

1,5

6,67

10,67

0,5135

0,0342

6,66

S. berthaultii 260

SH

5

7,5

2,50

7,83

0,1522

0,0150

9,86

S. berthaultii 260

MS

0

0

4,15

10,17

0,1781

0,0216

12,13

S. berthaultii 260

MS

1

1,5

4,18

8,83

0,1879

0,0154

8,20

S. berthaultii 260

MS

5

7,5

3,55

8,17

0,3649

0,0300

8,22

S. berthaultii 260

CH

0

0

4,10

10,83

0,2996

0,0314

10,48

S. berthaultii 260

CH

1

1,5

3,35

8,67

0,1635

0,0150

9,17

S. berthaultii 260

CH

5

7,5

1,88

5,67

0,1957

0,0188

9,61

S. bulbocastanum 54

SH

0

0

14,50

16,80

0,3054

0,0218

7,14

S. bulbocastanum 54

SH

1

1,5

14,12

17,33

0,3720

0,0385

10,35

S. bulbocastanum 54

SH

5

7,5

6,78

21,50

0,2636

0,0238

9,03

S. bulbocastanum 54

MS

0

0

13,60

24,00

0,2849

0,0300

10,54

S. bulbocastanum 54

MS

1

1,5

7,95

25,33

0,3744

0,0428

11,43

S. bulbocastanum 54

MS

5

7,5

2,83

20,17

0,2389

0,0250

10,47

S. bulbocastanum 54

CH

0

0

9,083

25,00

0,2625

0,0298

11,35

S. bulbocastanum 54

CH

1

1,5

9,13

35,50

0,4063

0,0302

7,43

S. bulbocastanum 54

CH

5

7,5

4,13

31,00

0,4162

0,0336

8,07

166

Příloha 10: Výsledky hodnocení paramertů izolace protoplastů rostlin při charakterizaci vlivu sloţení kultivačních médií Druh

Médium

Alar 85

AgNO3

Hmotnost naváţky

Hmotnost naváţky

Koncentrace

Koncentrace protoplastů

Viabilita

[mg.l-1]

[mg.l-1]

celkem [g]

listů [g]

protoplastů v 1 ml

v 1ml na 1g naváţky listů

[%]

S. verrucosum 299

SH

0

0

1,1365

0,2329

75000

322027

55,56

S. verrucosum 299

SH

1

1,5

3,191

1,2864

81250

63161

53,66

S. verrucosum 299

SH

5

7,5

0,5292

0,057

100000

1754386

87,5

S. verrucosum 299

MS

0

0

1,1694

0,2365

1790000

7568710

65,6

S. verrucosum 299

MS

1

1,5

1,0968

0,5226

1275000

2439725

78,57

S. verrucosum 299

MS

5

7,5

0,84

0,2526

262500

1039192

97,96

S. verrucosum 299

CH

0

0

1,038

0,222

1990000

8963964

71,43

S. verrucosum 299

CH

1

1,5

0,9384

0,117

593750

5074786

83,28

S. verrucosum 299

CH

5

7,5

0,7002

0,0726

306250

4218320

95,84

S. berthaultii 260

SH

0

0

1,5144

0,3048

Pod 50000

0

0

S. berthaultii 260

SH

1

1,5

1,6572

1,0266

156250

152201

75

S. berthaultii 260

SH

5

7,5

0,2376

0,0312

Pod 50000

0

0

S. berthaultii 260

MS

0

0

1,839

0,7398

pod 50000

0

0

S. berthaultii 260

MS

1

1,5

1,4196

0,462

93750

202922

42,86

S. berthaultii 260

MS

5

7,5

0,666

0,1068

pod 50000

0

0

S. berthaultii 260

CH

0

0

0,6414

0,2568

pod 50000

0

0

S. berthaultii 260

CH

1

1,5

0,8088

0,3006

81250

270293

50

S. berthaultii 260

CH

5

7,5

0,9828

0,0774

pod 50000

0

0

S. bulbocastanum 54

SH

0

0

0,771

0,039

3125000

80128205

92,37

S. bulbocastanum 54

SH

1

1,5

1,2576

0,1812

2956250

16314846

91,75

S. bulbocastanum 54

SH

5

7,5

0,5424

0,1086

462500

4258748

87,95

S. bulbocastanum 54

MS

0

0

0,4734

0,744

1280000

1720430

88,95

S. bulbocastanum 54

MS

1

1,5

1,0398

0,2466

981250

3979116

69,23

S. bulbocastanum 54

MS

5

7,5

0,5706

0,1476

pod 50000

0

0

S. bulbocastanum 54

CH

0

0

1,1796

0,4374

3625000

8287609

87,02

S. bulbocastanum 54

CH

1

1,5

0,6618

0,2568

93750

365070

85,91

S. bulbocastanum 54

CH

5

7,5

1,422

0,3048

425000

1394357

90,74

167

Příloha 11: Výsledky infekčních testů metodou listových terčíků Genotyp SB PIS 1 SB PIS 2 SB PIS 3 SB PIS 4 SB PIS 5 SB PIS 6 SB PIS 7 SB PIS 8 SB PIS 9 SB PIS 10 SB PIS 11 SB PIS 12 SB PIS 13 SB PIS 14 SB PIS 15 SB PIS 17 SB PIS 18 SB PIS 19 SB PIS 20 SB PIS 21 SB PIS 22 SB PIS 23 SB PIS 24 SB PIS 25 SB PIS 26 SB PIS 27 SB PIS 29 SB PIS 30 SB PIS 32 SB PIS 33 SB PIS 34 SB PIS 35 SB PIS 36 SB PIS 37 SB PIS 38 SB PIS 39 SB PIS 40 SB PIS 41 SB PIS 44 SB PIS 45 SB PIS 46 SB PIS 47 SB PIS 48 SB PIS 49 SB PIS 50 SB PIS 51 SB PIS 53 SB PIS 54 SB PIS 55

Průměrné poškození listové Odolnost metoda plochy [%] listových terčíků 52,00 N 56,00 N 47,50 S 26,00 S 56,67 N 63,33 N 71,00 N 21,00 O 49,20 S 56,00 N 51,00 N 20,00 O 8,33 O 15,00 O 23,75 O 0,00 O 2,00 O 48,00 S 35,00 S 35,00 S 15,33 O 0,00 O 15,00 O 66,00 N 39,00 S 53,00 N 63,33 N 13,33 O 84,00 N 7,00 O 23,33 O 32,00 S 35,00 S 40,00 S 33,33 S 23,33 O 2,20 O 0,00 O 16,67 O 96,67 N 6,00 O 19,00 O 98,00 N 12,00 O 22,00 O 10,00 O 26,67 S 13,00 O 43,00 S

168

Odolnost in vitro rostlin (VÚB) N N S S S O N S S N N O O O O O N S S O S O O O S N N O O O O O O O S O O S O O S O O S O S S O S

Shoda ANO ANO ANO ANO ne ne* ANO ne ANO ANO ANO ANO ANO ANO ANO ANO ne* ANO ANO ne ne ANO ANO ne* ANO ANO ANO ANO ne* ANO ANO ne ne ne ANO ANO ANO ne ANO ne* ne ANO ne* ne ANO ne ANO ANO ANO

SB PIS 56 SB PIS 57 SB PIS 59 SB PIS 60 SB PIS 61 SB PIS 62 SB PIS 63 SB PIS 64 SB PIS 65 SB PIS 66 SB PIS 67 SB PIS 68 SB PIS 70 SB PIS 71 SB PIS 72 SB PIS 73 SB PIS 75 SB PL 7 SB PL 10 SB PL 11 SB PL 19 SB HB 263 SB HB 267 SB HB 270 SB HB 309 SB HB 310 SB HB 313 S. BER 031 S. BER 033 S. BER 233 S. BER 251 S. BER 252 S. BER 254 S. BER 255 S. BER 256 S. BER 257 S. BER 259 S. BER 260 S. BER 261 S. VERN 068 S. VERN 234 S. VERU 299 S. MICRO 049 S. PINN 051 S. ? 052 Genotyp

76,00 N 30,00 S 0,00 O 8,33 O 47,00 S 52,50 N 49,00 S 27,00 S 73,00 N 13,33 O 51,00 S 29,20 S 0,00 O 23,00 O 68,00 N 6,67 O 2,00 O 45,00 79,67 100,00 50,00 6,67 46,67 100,00 53,00 41,67 83,33 21,67 10,30 10,00 1,00 6,67 5,00 45,00 6,67 8,33 3,33 0,00 29,67 56,67 11,67 9,00 26,67 99,33 0,00 Průměrné poškození listové Odolnost metoda plochy [%] listových terčíků

N N S O S N S S S O S S O O N O N Odolnost in vitro rostlin (VÚB)

ANO ne ne ANO ANO ANO ANO ANO ne ANO ANO ANO ANO ANO ANO ANO ne* Shoda

SB – S. bulbocastanum, S. BER – S. berthaultii, S.VERN – S. vernei, S. MICRO – S. microdontum, S. PINN – S. pinnatisectum, S. ? – genotyp neznámého původu

O – odolná S – středně náchylná * – extrémní neshoda

N – náchylná

169

Příloha 12: Regenerace protoplastových kultur: a) 12. den; b) 14. den; c) 20. den; d) 70. den; e) 145. den a f) 165. den kultivace

170

Příloha 13: a) S. bulbocastanum 66; b) dihaploid S. tuberosum ssp. tuberosum 165; c) somatické hybridy vzniklé jejich fúzí; d) a e) somatický hybrid REG 28 starý 14 a 30 dnů

171

Příloha 14: Charakterizace 25 parametrů u rostlin v polním pokusu pomocí klasifikátoru pro rod Solanum (Vidner et al., 1987) S. blb 17

S. blb 61

REG 5

REG 9

REG 28 F

REG 29 F

REG 30 F

REG 31 F

REG 32 F

REG 34 F

REG 35 F

REG 36

REG 38 F

REG 40 F

REG 43 F

REG 44 F

REG 46 F

REG 47 F

REG 48 F

REG 67 F

REG 69 F

REG 72 F

Typ trsu

7

7

7

7

8

7

8

8

6

6

7

7

8

7

6

6

6

6

7

7

7

7

Tvar trsu

1

1

1

1

2

3

2

1

2

2

2

1

3

3

2

2

2

2

2

2

2

2

Výška rostliny

6

3

6

6

7

3

4

2

6

8

3

1

5

5

8

8

6

5

8

4

4

4

Vzpřímenost stonku

9

9

9

9

5

1

1

9

5

5

5

9

1

5

5

5

5

5

5

5

5

5

Větvení stonku

4

4

4

4

8

8

8

4

8

8

8

4

8

8

8

8

8

8

8

8

8

8

Tloušťka stonku

5

4

5

5

7

6

6

4

7

7

6

3

6

5

7

7

7

6

6

6

6

6

Barva stonku

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

Počet stonků na rostlinu

1

1

1

1

1/7

1/7

1/7

1

1/7

1/7

1/7

1

1/7

1/7

1/7

1/7

1/7

1/7

1

1

1

1

Tvar listu

9

7

5

6

7

9

9

9

7

5

7

7

7

5

5

5

5

7

5

5

5

5

Počet párů základních lístků

1

1

1

1

3

3

3

1

3

3

2

1

3

3

3

3

3

3

2

2

2

2

Tvar bočních lístků

x

x

x

x

5

5

5

x

5

5

5

x

5

5

5

5

5

5

4

4

4

4

Výskyt lístečků

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

Členitost listu

x

x

x

x

2

2

2

x

2

2

2

x

2

2

2

2

2

2

1

1-2

1

1

Povrch listu

5

5

5

5

5

5

5

5

5

4

5

5

5

5

4

4

4

5

3

3

3

3

Velikost listu

3

3

7

5

5

5

4

3

5

7

5

3

5

5

7

7

7

5

5

5

5

5

Barva listu

9

9

9

9

9

7

9

7

9

9

7

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

Lesk listu

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

Postavení článku květní stopky

x

7

3

x

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

3

3

3

3

Anthokyanová barva květní stopky

9

9

9

9

7

7

7

7

7

7

7

x

7

7

7

7

7

7

9

9

9

7

Dvoukorunka

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

Průměr korunky

x

3

3

x

8

5

5

x

6

8

7

x

5

x

8

8

8

8

6

7-8

8

7

1 smet.

1 smet.

1 smet.

1 smet.

1/6

1/6

1/6

x

1/6

1/6

1/7

x

1/6

x

1/6

1/6

1/6

1/6

1/6

1/6

1/6

1/6

Projev květenství

3-4

4

5

3-4

8

8-9

7

1

7

8-9

7

1

8-9

5

8-9

8-9

8-9

5

7

8-9

8

8

Shazování poupat

3

3

3

3

7

7

7

7

7

7

7

x

7

7

7

7

7

7

7

3

3

3

Bobule

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

x

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

Znak

Barva korunky

Počet stonků na rostlinu: 1 - sadba rostliny převedené z in vitro podmínek do skleníku, 7 - sadba hlízy o velikosti 3 – 6 cm Barva korunky: 1/6 – bílomodrá

172

Klasifikátor pro rod Solanum (Vidner et al., 1987) pro hodnocené parametry Hodnocení

Znak

Typ trsu

Tvar trsu

Stonkový řídký Stonkový Stonkový hustý Přechodný Listový řídký Listový Listový hustý Kuţelovitý Deštníkovitý Zarovnaný Velmi nízká Nízká

Výška rostliny

Střední Vysoká

Vzpřímenost stonku Větvení stonku

Velmi vysoká Rozkleslý Polovzpřímený Vzpřímený Na spodu stonku Uprostřed stonku Na vrcholu stonku Po celém stonku Velmi tenký Tenký

Tloušťka stonku

˂25cm 25 – 30 31 – 35 36 – 40 41 – 45 46 – 50 51 – 55 56 – 70 ˃70

Střední Tlustý Velmi tlustý

Stupnice 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 5 9 2 4 6 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Znak

Barva stonku

Počet stonků na rostlinu

Tvar listu

Velikost listu

Počet párů základních lístků

Hodnocení

Stupnice

Slabě načervenalá Modrofialová Červenohnědá Červená Modrofialově ţíhaná Tmavozelená Zelená Světle zelená Zeleně ţíhaná Velmi nízký ˂2,0 2,0 – 3,0 Nízký 3,1 – 4,0 4,1 – 5,0 Střední 5,1 – 6,0 6,1 – 7,0 Vysoký 7,1 – 8,0 8,1 – 9,0 Velmi vysoký ˃9,0 Okrouhlý Široce oválný Dlouze oválný Podlouhlý Čárkovitý - úzký Velmi malý Malý Střední Velký Velmi velký List nedělený 1 pár 2 páry 3 páry 4 páry 5 párů 6 párů 7 párů ˃7 párů

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 3 5 7 9 1 3 5 7 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Znak

Tvar bočních lístků (délka : šířka)

Výskyt lístečků

Členitost listu

Povrch listu

Barva listu

Lesk listu

Postavení článku květní stopky

Anthokyanová barva květní stopky

173

Hodnocení

Stupnice

Čárkovité ˃5,0 Úzce kopinaté 5,0 – 4,1 Kopinaté 4,0 – 3,1 Široce kopinaté 3,0 – 2,1 Úzce oválné 2,0 – 1,9 Oválné 1,8 – 1,7 Široce oválné 1,6 – 1,5 Eliptické 1,4 – 1,2 Okrouhlé ˂1,2 Chybí Nepravidelné Pravidelné Uzavřený Přechodný Otevřený Plochý Vlnitý Silně vlnitý aţ kadeřavý Šedozelená Hnědozelená Světlezelená Zelená Tmavozelená Matný Slabě lesklý Lesklý V horní 1/4 V horní 1/3 Ve středu V dolní 1/3 V dolní 1/4 Chybí Slabá Střední Silná Velmi silná

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 1 2 3 3 5 7 1 3 5 7 9 1 5 9 1 3 5 7 9 1 3 5 7 9

Znak Dvoukorunka

Průměr korunky

Barva korunky

Projev květenství

Shazování poupat

Bobule – počet na rostlině

Hodnocení

Stupnice

Nevyskytuje se Vyskytuje se nepravidelně Vyskytuje se pravidelně Velmi malý ˂8mm Malý 8 – 11 Střední 12 – 15 Velký 16 – 19 Velmi velký 20 – 23 24 – 27 28 – 31 32 – 35 ˃35 Bílá Růţová Světle červenofialová Červenofialová Temně červenofialová Modrá Světle fialová Šedofialová Tmavofialová Nekvete Velmi slabé Slabé Slabé aţ střední Střední Středně hojné Hojné Velmi hojné Extrémně hojné Časté Střední Řídké Chybí Ojediněle Malý ˂10 Velký 10 – 20 Velmi velký ˃20

1 5 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3 5 7 1 3 5 7 9

Příloha 15: Výsledky měření délky svěracích buněk průduchů a stanovení počtu chloroplastů u somatického hybrida REG 34 F (4n) Listové patro

2.

Číslo

Počet

průduchu

chloroplastů

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

26 26 24 21 18 20 26 27 21 24 24 23 27 19 22 21 24 21 20 22 31 25 20 20 21 27 19 19 29 22

3. Délka průduchu [µm] 33,4 34,6 30,0 28,1 30,0 26,0 37,4 40,0 27,1 36,2 36,0 33,0 35,3 34,0 39,3 30,0 32,1 32,1 34,0 30,0 38,4 38,7 32,8 25,0 33,1 36,2 24,3 30,9 37,1 31,2

Počet chloroplastů 18 24 19 18 21 20 26 21 22 21 20 21 21 26 20 29 20 19 19 21 18 20 18 20 18 20 22 18 26 21

174

4. Délka průduchu [µm] 34,0 37,4 32,8 31,5 35,0 34,3 40,2 32,8 36,8 36,2 34,6 34,6 34,0 40,2 32,6 41,2 33,7 27,5 32,4 32,4 34,3 34,3 31,8 32,4 33,7 36,5 39,3 34,0 42,1 35,3

Počet chloroplastů 23 21 21 24 20 22 20 22 21 18 20 18 21 12 21 21 24 20 18 21 23 18 21 19 23 23 23 23 21 23

Délka průduchu [µm] 35,9 32,4 33,4 34,6 33,7 34,6 34,6 33,4 33,4 30,6 30,6 31,5 35,3 31,2 34,6 35,3 39,0 35,6 34,9 37,8 37,1 30,9 35,6 34,0 36,0 36,8 36,2 34,3 35,0 34,0

Příloha 16: Výsledky měření délky svěracích buněk průduchů a stanovení počtu chloroplastů u genotypu Solanum bulbocastanum PIS 17 (2n) Listové patro

2.

Číslo

Počet

průduchu

chloroplastů

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

13 10 19 14 13 16 12 15 14 10 14 12 16 12 13 12 12 10 12 12 17 10 11 12 14 10 10 15 17 11

3. Délka průduchu [µm] 20,0 16,0 23,2 18,4 16,8 20,8 20,8 20,0 20,8 20,0 20,0 19,2 22,4 24,0 18,4 20,0 15,2 19,2 19,2 18,4 22,4 17,6 20,0 17,6 22,4 16,0 20,0 21,6 24,0 17,6

Počet chloroplastů 14 13 12 14 12 12 16 16 16 13 10 13 14 11 14 14 13 14 13 11 12 11 13 16 13 12 14 13 14 12

175

4. Délka průduchu [µm] 24,0 24,0 24,8 24,8 25,6 22,4 20,8 27,2 32,0 22,4 24,0 22,4 24,8 24,0 28,8 26,4 19,2 24,0 24,8 25,6 27,2 27,2 25,6 25,6 27,2 27,2 25,6 25,6 27,2 26,4

Počet chloroplastů 16 10 15 13 13 15 13 14 12 10 11 14 16 16 13 13 15 14 14 17 13 13 13 16 12 11 11 16 12 16

Délka průduchu [µm] 25,6 22,4 25,6 25,6 24,0 27,2 25,6 27,2 27,2 24,0 24,0 24,0 27,2 28,8 28,8 24,0 27,2 25,6 27,2 25,6 24,0 28,8 30,4 25,6 27,2 25,6 23,2 27,2 23,2 25,6

Příloha 17: Výsledky měření délky svěracích buněk průduchů a stanovení počtu chloroplastů u dihaploidního genotypu Solanum tuberosum ssp. tuberosum DH 387 (2n) Listové patro

2.

Číslo

Počet

průduchu

chloroplastů

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

12 12 11 13 18 17 14 13 12 16 14 20 11 13 13 14 10 13 13 12 13 13 17 14 15 12 13 14 13 13

3. Délka průduchu [µm] 27,2 22,4 22,4 22,4 24,0 25,6 19,2 21,6 22,4 25,6 25,6 32,0 19,2 20,8 19,2 25,6 20,8 21,6 26,4 25,6 19,2 20,8 23,2 23,2 20,8 19,2 22,4 23,2 25,6 27,2

Počet chloroplastů 9 12 13 13 11 10 14 13 11 13 12 12 13 11 13 13 14 13 14 13 14 15 14 13 12 14 14 11 13 15

176

4. Délka průduchu [µm] 19,2 22,4 27,2 23,2 20,8 18,4 25,6 32,0 28,8 20,8 19,2 22,4 28,8 22,4 28,8 23,2 24,0 21,6 20,8 26,4 23,2 27,2 32,0 28,8 27,2 25,6 31,2 26,4 25,6 28,8

Počet chloroplastů 14 14 13 11 13 13 11 13 16 12 17 13 12 13 12 13 13 13 12 14 13 11 11 11 13 13 15 10 13 12

Délka průduchu [µm] 24,0 24,0 24,0 22,4 24,0 28,8 22,4 27,2 28,8 26,4 28,0 24,0 21,6 27,2 25,6 25,6 24,0 24,8 27,2 26,4 22,4 23,2 22,4 24,0 28,8 24,0 25,6 20,8 27,2 24,0

Příloha 18: Výsledky měření délky svěracích buněk průduchů a stanovení počtu chloroplastů u genotypu Solanum tuberosum ssp. tuberosum R10 (4n) Listové patro

2.

Číslo

Počet

průduchu

chloroplastů

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

17 14 22 21 22 20 22 31 20 26 21 23 32 20 20 27 30 31 22 28 21 20 15 27 26 24 21 22 26 27

3. Délka průduchu [µm] 32,0 32,0 35,2 33,6 35,2 30,4 28,8 41,6 32,0 38,4 25,6 32,0 40,0 35,2 28,8 36,8 40,0 40,0 32,0 38,4 33,6 30,4 24,0 40,0 35,2 33,6 32,0 32,0 32,0 36,8

Počet chloroplastů 21 20 20 21 19 21 21 24 26 18 22 21 17 21 21 34 19 21 21 18 20 21 20 19 20 26 23 21 19 20

177

4. Délka průduchu [µm] 41,6 32,0 33,6 30,4 28,8 36,8 33,6 33,6 40,0 30,4 35,2 35,2 32,0 32,0 35,2 51,2 32,0 33,6 33,6 32,0 35,2 35,2 30,4 30,4 35,2 36,8 36,8 30,4 32,0 33,6

Počet chloroplastů 29 18 18 19 18 19 26 22 19 21 28 20 19 26 25 20 23 21 23 23 22 20 25 21 25 24 24 25 23 22

Délka průduchu [µm] 43,2 35,2 33,6 27,2 33,6 33,6 43,2 35,2 35,2 30,4 40,0 38,4 28,8 43,2 40,0 30,4 35,2 40,0 36,8 32,0 32,0 33,6 40,0 35,2 33,6 28,8 38,4 33,6 32,0 36,8

Příloha 19: Hodnocení vybraných parametrů hlíz z polního a skleníkového pokusu pomocí klasifikátoru pro rod Solanum (Vidner et al., 1987) Hloubka

Vzhled

Barva

Rozdělení

Barva duţniny

Barva duţniny

oček

slupky

slupky

barvy

(v rámci rodu)

(S. tuberosum)

7

7

9

8

9

7

x

9

7

7

9

8

9

7

x

9

9

7

7

9

8

7

7

x

REG 5

9

7

7

7

9

8

9

7

x

REG 9

9

9

7

7

9

8

9

7

x

REG 11

9

9

7

7

9

8

7

7

x

REG 14

9

9

7

7

9

8

9

7

x

REG 36

9

9

7

7

9

8

9

7

x

REG 37

9

9

7

7

9

8

7

7

x

DH 165

3

9

3

5

9

7

9

5

5

Apta

4

7

9

7

9

7

9

5

5

Genotyp

Tvar

Sploštělost

Vzhled

S. blb 60

9

9

S. blb 61

9

REG 1

DH 387

2

9

5

7

9

7

9

6

3

REG 27 F

4

9

7

7

5

7

9

6

x

REG 28 F

6

7

7

7

5

7

9

4

x

REG 29 F

6

7

5

7

5

7

9

6

x

REG 30 F

6

7

7

7

9

7

7

6

x

REG 32 F

5

7

7

7

9

7

9

9

x

REG 33 F

6

9

7

7

9

7

9

6

x

REG 34 F

7

7

7

7

9

7

9

4

x

REG 35 F

7

7

5

7

5

7

9

5

x

REG 38 F

6

7

5

7

5

7

5

6

x

REG 39 F

5

9

7

7

5

7

9

5

x

REG 40 F

6

9

7

7

9

7

9

4

x

REG 41 F

6

9

7

7

5

7

7

5

x

REG 42 F

4

9

5

7

5

7

9

5

x

REG 43 F

6

7

7

7

5

7

7

4

x

REG 44 F

6

7

7

7

5

7

9

4

x

REG 46 F

6

7

7

7

5

7

9

4

x

REG 47 F

6

9

5

7

5

7

9

4

x

REG 48 F

6

9

7

7

5

7

9

5

x

REG 49 F

7

9

7

7

5

7

7

4

x

REG 50 F

6

9

7

7

5

7

7

5

x

REG 51 F

5

9

5

7

5

7

5

6

x

REG 52 F

5

7

9

7

9

7

9

4

7

REG 67 F

5

9

7

7

9

7

9

5

x

REG 68 F

6

9

7

7

9

7

9

5

x

REG 69 F

5

9

7

7

9

7

7

6

x

REG 70 F

5

9

7

7

5

7

9

5

x

S. veru 299

8

9

5

7

9

6/8

5

6

x

178

Klasifikátor pro rod Solanum (Vidner et al., 1987) pro hodnocené parametry Znak

Hodnocení

Dlouhý Ledvina, rohlíček Dlouze oválný – oválný Oválný, dlouze oválný Tvar hlíz Oválný Kulovitooválný, okrouhlooválný Okrouhlý Okrouhlokulovitý Kulovitý Velmi zploštělá Středně zploštělá Zploštělost Slabě zploštělá hlíz Ojediněle zploštělá Plná Nevzhledné Méně vzhledné Vzhled hlíz Středně vzhledné Vzhledné Velmi vzhledné

Stupnice 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 3 5 7 9 1 3 5 7 9

Znak

Hloubka oček

Vzhled slupky

Barva duţniny (Solanum tuberosum)

Hodnocení

Stupnice

Velmi hluboké Hluboké Střední Mělké Velmi mělké Rozpraskaná Rozbrázděná Korkovitá Drsná Mírně drsná Síťkovaná Hladká Bílá Slabě naţloutlá Naţloutlá Ţlutá Sytě ţlutá

1 3 5 7 9 1 2 3 4 5 6 9 1 3 5 7 9

179

Znak

Barva slupky

Rozdělení barvy slupky

Barva duţniny (v rámci rodu)

Hodnocení

Stupnice

Tmavošedá Šedá Světle šedá Světle červená Červená Růţová Ţlutohnědá Bezbarvá Jiná Neplošné Přechodné Plošné Anthokyanová – plošná Anthokyanová – neplošná Tmavoţlutá Ţlutá Světle ţlutá Krémová Bílá

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 5 9 1 2 3 4 5 6 7