Emlıs sejtek tenyésztése
A sejttenyészetek fenntartása Tápfolyadék (médium) • • • • •
Sók (NaCl, KCl, CaCl2, stb.) Esszenciális aminosavak Glükóz Vitaminok Puffer (pl.: Na-bikarbonát, HEPES) • Antibiotikum + gombaölı • Indikátor (fenolvörös) • + tápfolyadék kiegészítık – „supplements” (szérum /FCS/, B27 stb.)
A tápfolyadékok (médiumok) összetétele ismert és a szállító cég honlapján elérhetı
Ismertebb médiumok: 1. Minimum Essential Medium (MEM), developed by Harry Eagle, is one of the most widely used of all synthetic cell culture media. Early attempts to cultivate normal mammalian fibroblasts and certain subtypes of HeLa cells revealed they had specific nutritional requirements that could not be met by Eagle’s Basal Medium (BME). Subsequent studies using these and other cells in culture indicated additions to BME could be made to aid growth of a wider variety of fastidious cells. MEM, which incorporates these modifications, includes higher concentrations of amino acids so the medium more closely approximates the protein composition of cultured mammalian cells. MEM has been used for cultivation of a wide variety of cells grown in monolayers. Optional supplementation of non-essential amino acids to the formulations that incorporate either Hanks’ or Earle’s salts has broadened the usefulness of this medium. The formulation has been further modified by optional elimination of calcium to permit growth of cells in suspension culture.
2. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) is a modification of Basal Medium Eagle (BME) that contains a 4-fold higher concentration of amino acids and vitamins, as well as additional supplementary components. The original DME formula, first reported for culturing embryonic mouse cells, contained 1,000 mg/L of glucose. An alteration with 4,500 mg/L glucose is optimal in cultivating certain cell types.
Ismertebb médiumok: 3. RPMI-1640 medium was developed by Moore et al., at Roswell Park Memorial Institute, hence the acronym RPMI. The formulation is based on the RPMI-1630 series of media utilizing a bicarbonate buffering system and alterations in the amounts of amino acids and vitamins. RPMI-1640 medium has been used for the culture of human normal and neoplastic leukocytes. RPMI-1640 when properly supplemented, has demonstrated wide applicability for supporting growth of many types of cell cultures, including fresh human lymphocytes in the 72-hour phytohemagglutinin (PHA) stimulation assay.
4. Ham’s Nutrient Mixtures (F12) were originally developed to support clonal growth of several clones of Chinese hamster ovary (CHO) cells, as well as clones of HeLa and mouse L-cells. Both mixtures were formulated for use with or without serum supplementation, depending on the cell type being cultured. Ham’s F-10 has been shown to support the growth of human diploid cells, white blood cells for chromosomal analysis, primary explants of rat, rabbit and chicken tissues. Ham’s F-12 has been used for the growth of primary rat hepatocytes and rat prostate epithelial cells.
5. Neurobasal® Medium is a basal medium that meets the special cell culture requirements of pre-natal and embryonic neuronal cells when used with GIBCO® B-27® Supplement. Neurobasal® Medium can be used to grow neuronal cells from hippocampus, cortex and other regions of the brain. Neurobasal® Medium allows for both long and short term maintenance of homogeneous populations of neuronal cells without the need of an astrocyte feeder layer.
A sejttenyészetek fenntartása CO2 inkubátor • 37°C • 5% CO2 atmoszféra • 100% páratartalom
A sejttenyészetek fenntartása Steril fülke: • HEPA (high efficiency particulate air) szőrı 99.99%-ban kiszőri a levegıbıl a 0.3 µm mérető részecskéket • A szőrt levegıt a rendszer folyamatosan áramoltatja a munkafelületen • A munkafelület sterilizálható
Sejttenyészet típusok HeLa
Jurkat
CHO
• Felülethez kitapadó tenyészetek (pl: HeLa) • Sejtszuszpenzióban lévı tenyészetek (pl: fehérvérsejtek – Jurkat, tumorsejtek)
• Kitapadva és szuszpenzióban is fenntartható tenyészetek (pl: CHO)
Az egyik legismertebb humán sejtvonal: HeLa: Henrietta Lacks méhnyak karcinómájából származó biopsziából kitenyésztve (Dr. George Otto Gey, 1951.) Ez volt az elsı in vitro körülmények között jól fenntartható emberi sejtvonal
Sejtkultúrák készítése • Szövet izolálás (szerv explantátum, vér, embrió)
• A sejtek szétválasztása (darabolás szikével, késes homogenizátor, enzimatikus emésztés) • Primer sejtkultúra: Az eredeti szervbıl/szövetbıl frissen eltávolított sejtekbıl készült kultúra
• Szelekciós hatások (migrációs képesség, osztódási sebesség, médium, stb.)
Szekunder sejtkultúra, sejtvonal • Passzálás: Bizonyos sejtszám elérése után a
• • •
•
sejtosztódás leáll. Ilyenkor új felületet/teret kell adni a sejteknek. A tenyészet egy részét új tenyésztıedénybe visszük át és friss médiumot adunk hozzá. Generációs szám: osztódási ciklusok száma. Nem egyenlı a passzázs-számmal. Szekunder kultúra: A primer kultúra sejtjeinek egyszeri passzálása (átoltása) révén jön létre. Sejtvonal: A primer kultúrából néhány passzálás után kialakult véges élettartamú, korlátolt növekedéső (40100 passzálás) sejtkultúra. pl. fibroblaszt tenyészet Hayflick-limit: Az emlıs sejtek szaporodása korlátozott. Humán embrionális sejtek ált. 40-60 osztódáson mehetnek keresztül. Ezt a kromoszómák folyamatos rövidülése okozza.
Korlátlanul osztódó sejtek • Folyamatos sejtvonal: Korlátlan ideig fenntartható
sejtkultúra, mert sejtjei folyamatos osztódó képességgel rendelkeznek. Az ilyen sejtekben gyakran a normálisnál több kromoszóma van, vagy más genetikai elváltozás van.
• Korlátlanul osztódó emlıs sejtek:
Természetesen elıfordulók: ıssejtek és csírasejtek Immortalizáció = korlátlan osztódó képesség elnyerése Spontán imortalizáció (pl: hámsejt-, fehérvérsejt-kultúrák) Mutáció vagy vírus okozta immortalizáció (pl: tumorsejtek) Mesterséges immortalizáció (gének bevitele, hibridóma)
• Sejttörzs: Megfelelı tulajdonságok alapján szelektált sejtekbıl kiinduló sejtkultúra. A sejtek azonos típusúak.
Sejt klónok • Klón: Egyetlen sejtbıl származó utódsejtek populációja, amelyek genetikailag teljesen azonosak.
Tenyésztıedények Petri-csésze Flaska Plate Lombik
Speciális tenyésztıedények Chamber Slide:
Live cell imaging dish:
Sejtkultúrák befertızıdése • Okozhatja: baktérium, élesztı, gomba, mycoplasma • Jellemzık: – – – –
Médium zavarosodása Hirtelen pH csökkenés (baktérium) pH növekedés (gomba) Nagyon lassú sejtnövekedés (mycoplasma)
• Mikroszkóppal 100x-os nagyításban már látható (kivéve: mycoplasma – fluoszcens DNS festés ill. orcein vagy Giemsa festés)
Biosafety szintjei (Biosafety Levels = BL, vagy BS)
• 4 szint • NIH Guidelines: „Research Involving Recombinant DNA” • A gazdaszervezet veszélyességétıl függ • Lehetséges patogén hatások figyelembe vételével
1. védelmi szint Def.: Emberi megbetegedést vélhetıen nem okozó, környezetre nem veszélyes ágensekkel való munka. Nulla vagy nagyon alacsony szintő egyéni és társadalmi kockázat. pl. középiskolai, egyetemi oktató laborok. pl.
Bacillus subtilis Naegleria gruberi E. coli
1. védelmi szint • Személyi feltételek: • Laborvezetı általános laboratóriumi gyakorlattal és a megfelelı szakmai hátérrel rendelkezzen. • Laboránsok: a munkafolyamatoknak megfelelı specifikus tréningen kell résztvenniük.
1. védelmi szint
2. védelmi szint Def.: Az emberi egészségre és a környezetre mérsékelten veszélyes ágensekkel való munka. Olyan patogén, ami emberi vagy állati fertızést képes okozni, de várhatóan nem jelent komoly kockázatot az egyénre, közösségre, állatokra és a környezet egyéb részeire. A laboratóriumi fertızés komoly betegséget okozhat, de rendelkezésre áll hatékony és megfelelı kezelés, valamint a fertızés továbbterjedésének kockázata igen alacsony.
pl. Salmonellae, Hepatitis B virus
2. védelmi szint
Személyi feltételek: • Laborvezetı: A felelıssége tudatában lévı, a patogénekkel kapcsolatos szakmai tudás birtokában van. • Laboráns: Megfelelı gyakorlattal kell rendelkeznie a patogénekkel való munkában, melyet a hozzáértı laborvezetı irányít.
2. védelmi szint
biológiai veszélyt jelzı tábla
2. védelmi szint
Biztonsági berendezések •Arc védelme: ha fülkén kívül dolgozunk és fertızı vagy más veszélyes anyag kifröcskölıdése várható. (védıszemüveg, maszk) • Köpeny vagy egyenruha viselése kötelezı. Ezt az öltözéket a laborban kell hagyni távozáskor. Tilos hazavinni, helyben kell biztosítani a tisztításukat. • Egyszer használatos kesztyőt kell viselni, ha fertızött állattal vagy fertızı anyaggal, fertızött felületen vagy eszközzel dolgozunk. A munka végén helyben kell a kesztyőt levenni, es a fertızésbiztos tárolóedénybe helyezni.
3. védelmi szint
Def.: Belélegzéssel terjedı súlyos vagy halálos betegséget okozó ágensekkel való munka. Olyan patogén, mely várhatóan súlyos betegséget okoz állatban vagy emberben, de továbbterjedése egyénrıl egyénre nem valószínő. Hatékony kezelési módszer és megelızési lehetıség rendelkezésre áll.
3. védelmi szint
Személyi feltételek Labor vezetı: Felügyeli a dolgozókat, ezen ágensek terén megfelelıen jártas legyen mind az elméletben, mind a gyakorlatban. Labor személyzet: Speciális oktatáson kell részt venniük, mely a patogén vagy letalitást okozó ágensekkel való munkára készít fel.
3. védelmi szint
4. védelmi szint
Def.: Veszélyes és idegen ágensekkel való munka, melyek életveszélyes betegségekkel járnak. A fertızés valószínősége egyénrıl egyénre igen magas. Általában nem állnak rendelkezésre a megbetegedés kezelésére alkalmas módszerek.
Szükséges laboratóriumi eszközök * ajánlott biológiai biztonsági szint
1.
2.
3.
4.
labor izolálása
-
-
*
+
hermetikus lezárás lehetısége
-
-
+
+
szellıztetés be
-
*
+
+
sz. épület rendszerével
-
*
+
-
sz. elkülönítve
-
*
+
+
kimenı HEPA sz.
-
-
*
+
dupla-ajtós bejárat
-
-
+
+
légzár zuhannyal
-
-
-
+
elıtér öltözı
-
-
+
-
elıtér zuhannyal
-
-
*
-
elfolyó anyagok kezelése
-
-
*
+
