UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Klinische biologie Laboratorium voor niet-infectieuze serologie Academiejaar 2012-2013
DETECTIE VAN DFS70 ANTILICHAMEN: IS ER EEN MEERWAARDE VOOR HET ROUTINELABORATORIUM?
Elien HIMPENS Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Prof. Dr. Katrien Devreese
Commissarissen Apr. Carolien Bonroy Prof. Dr. Apr. Christophe Stove
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Klinische biologie Laboratorium voor niet-infectieuze serologie Academiejaar 2012-2013
DETECTIE VAN DFS70 ANTILICHAMEN: IS ER EEN MEERWAARDE VOOR HET ROUTINELABORATORIUM?
Elien HIMPENS Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Prof. Dr. Katrien Devreese
Commissarissen Apr. Carolien Bonroy Prof. Dr. Apr. Christophe Stove
AUTEURSRECHT De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. 31 mei 2013
SAMENVATTING Antinucleaire antilichamen (ANA) zijn belangrijke biomerkers in de diagnose van auto-immuunziekten. De beste methode voor het screenen naar ANA is volgens de American College of Rheumatology (ACR) indirecte immunofluorescentie (IIF). Nadeel is dat 20-30% van de gezonde populatie ANA IIF positief is. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat deze ANA positieve individuen auto-antistoffen bezitten tegen het dense fine speckles 70 (DFS70) auto-antigeen. Deze auto-antilichamen zouden minder prevalent zijn (<10%) bij patiënten met een auto-immuunziekte zoals systemische lupus erythematosus dan bij gezonde donoren. Ook zou het uitzonderlijk zijn om geïsoleerde DFS70 antistoffen te vinden bij patiënten met een auto-immuunziekte. In deze masterproef werd nagegaan of het detecteren van DFS70 antistoffen een rol kan hebben in de uitwerking van patiënten met een vermoeden van auto-immuunlijden en dus een meerwaarde kon bieden voor het routinelaboratorium. Om deze vraagstelling te onderzoeken gebeurden anti-DFS70 antistofbepalingen op drie cohorten: gezonde donoren, zieke controles en consecutieve routinestalen. Om de beste techniek te bepalen werden DFS70 antistoffen opgespoord met indirecte immunofluorescentie op twee substraten, namelijk HEp-2 en HEp-2000, en met behulp van een chemiluminescentie immunoassay (CLIA). Stalen die positief waren met minstens één techniek werden met western blot geanalyseerd ter confirmatie, waarbij een bandje bij 70 kDa werd verwacht. Slechts vier van de negen stalen werden geconfirmeerd. In een tweede fase werd de klinische performantie van DFS70 antistofdetectie onderzocht en vergeleken met de literatuur. Er kon geen verschil worden vastgesteld in de DFS70 antistofpositiviteit bij gezonde donoren en zieke controles. Tot slot werd nagegaan wat de invloed was van de integratie van DFS70 antistofdetectie in de routinematige uitwerking van ANA positiviteit. Door de vergelijkbare frequentie van DFS70 antistoffen in gezonde en zieke individuen en de aanwezigheid van deze antistof in combinatie met andere ziektespecifieke ANA kunnen DFS70 antistoffen niet als biomerker gebruikt worden voor het uitsluiten van auto-immuunziekten. Verder werd vastgesteld dat integratie van DFS70 antistofdetectie niet kostenbesparend was. Omwille van deze redenen lijkt de integratie van DFS70 antistofdetectie in de studiepopulatie zinloos.
DANKWOORD Eerst en vooral wil ik mijn promotor prof. dr. Katrien Devreese bedanken. Zij gaf mij de kans om mijn masterproef in het labo voor klinische biologie van het UZ Gent te realiseren. Mijn masterproef heb ik uitgevoerd op de afdeling niet-infectieuze serologie. Het hoofd van die afdeling is apr. Carolien Bonroy. Haar wil ik graag bedanken voor de tijd die ze aan mijn masterproef besteedde, voor de begeleiding, het verbeteren en het beschikbaar stellen van het materiaal dat ik nodig had. Door haar kan ik mijn masterproef nu met trots aan u voorstellen. Charlotte Verfaillie dank ik voor haar begeleiding bij het schrijven van de masterproef. Dank aan prof. dr. apr. Christophe Stove voor het nalezen van mijn masterproef. Ook bedank ik de laboranten van de afdeling niet-infectieuze serologie: Sylvia, Virgie, Vicky en Anette voor de leuke werksfeer, de hulp bij het gebruik van toestellen en het uitvoeren van sommige experimenten (waarvoor extra dank aan Sylvia). Mevr. Heidi De Baere van Menarini diagnostics dank ik voor de begeleiding bij het gebruik van toestellen en het helpen aflezen van een aantal resultaten. Dank aan mevr. Nathalie Vandeputte van Instrumentation Laboratory voor de begeleiding bij het gebruik van toestellen. Mijn vrienden en vooral mijn ouders wil ik bedanken voor de steun, de motivatie en de leuke momenten die ze me gaven. Met de hulp van al deze personen is mijn masterproef tot stand gekomen.
INHOUD
1.
INLEIDING ....................................................................................................................................... 1 1.1.
ANTINUCLEAIRE ANTILICHAMEN (ANA).................................................................................. 1
1.1.1.
Definitie .......................................................................................................................... 1
1.1.2.
Diagnostische waarde van ANA ...................................................................................... 1
1.1.3.
Detectiemethoden ANA .................................................................................................. 2
1.2.
1.1.3.1.
Indirecte immunofluorescentie .............................................................................. 2
1.1.3.2.
Enzyme immunoassay............................................................................................. 3
UITWERKING POSITIEVE ANA ................................................................................................. 4
1.2.1.
Extraheerbare nucleaire antigenen ................................................................................ 4
1.2.2.
Diagnostische waarde van ENA ...................................................................................... 4
1.2.3.
Detectiemethoden ENA .................................................................................................. 6
1.3.
1.2.3.1.
Enzyme immunoassay (EIA) .................................................................................... 6
1.2.3.2.
Western blotting ..................................................................................................... 7
1.2.3.3.
Andere detectiemethoden...................................................................................... 8
DFS70 ANTISTOFFEN............................................................................................................... 8
1.3.1.
Definitie en historiek ...................................................................................................... 8
1.3.2.
Diagnostische waarde van DFS70 antistoffen ................................................................. 9
1.3.3.
Detectie van DFS70 antistoffen ...................................................................................... 9
1.4.
1.3.3.1.
Opspoorbaarheid met behulp van IIF ..................................................................... 9
1.3.3.2.
Chemiluminescentie immunoassay ...................................................................... 10
1.3.3.3.
IIF op lens en cornea ............................................................................................. 10
REFLEX TESTING OF CASCADE TESTING ................................................................................ 11
2.
OBJECTIEVEN ................................................................................................................................ 13
3.
MATERIALEN EN METHODEN ....................................................................................................... 14 3.1.
STAALVERZAMELING ............................................................................................................ 14
3.2.
ANA INDIRECTE IMMUNOFLUORESCENTIE ........................................................................... 14
3.2.1.
Staalvoorbereiding ....................................................................................................... 14
3.2.1.1.
Materialen ............................................................................................................ 14
3.2.1.2.
Methode ............................................................................................................... 15
3.2.2.
3.3.
3.2.2.1.
Materialen ............................................................................................................ 17
3.2.2.2.
Methode ............................................................................................................... 17
IDENTIFICATIE VAN ANA ....................................................................................................... 18
3.3.1.
Materialen .................................................................................................................... 18
3.3.2.
Methode ....................................................................................................................... 19
3.4.
DETECTIE VAN DFS70 ANTISTOFFEN AAN DE HAND VAN CLIA ............................................. 20
3.4.1.
Materialen .................................................................................................................... 20
3.4.2.
Methode ....................................................................................................................... 21
3.5.
BEVESTIGING DFS70 ANTISTOFFEN AAN DE HAND VAN WESTERN BLOT ............................. 22
3.5.1.
Materialen .................................................................................................................... 22
3.5.2.
Methode ....................................................................................................................... 24
3.6. 4.
Geautomatiseerde aflezing ........................................................................................... 17
DATA-VERWERKING.............................................................................................................. 25
RESULTATEN ................................................................................................................................. 26 4.1.
DFS70 ANTISTOFDETECTIE: VERGELIJKING VAN DE VERSCHILLENDE DETECTIETECHNIEKEN ... .............................................................................................................................................. 26
4.2.
KLINISCHE PERFORMANTIE VAN DE DFS70 ANTISTOFBEPALING .......................................... 30
4.3.
INVLOED VAN DE INTEGRATIE VAN DFS70 ANTISTOFBEPALING IN DE ROUTINECASCADE .. 31
4.3.1.
DFS70 antistofdetectie in relatie tot andere testen in de ANA/ENA cascade ............... 31
4.3.1.1.
ANA indirecte immunofluorescentie .................................................................... 31
4.3.1.2.
Antistoffen tegen extraheerbare nucleaire antigenen .......................................... 32
4.3.2.
Invloed van de integratie van DFS70 antistofdetectie in de ANA/ENA cascade ............ 33
4.3.2.1. Pijlen met cijfer 1: "opsporen van DFS70 antistoffen voorafgaand aan EliA symphony®" ............................................................................................................................. 34 4.3.2.2.
4.4.
Pijl met cijfer 2: "opsporen van DFS70 antistoffen na negatieve ELiA symphony®" . .............................................................................................................................. 36
SAMENVATTING VAN DE ANALYSES ..................................................................................... 37
5.
DISCUSSIE ..................................................................................................................................... 38
6.
CONCLUSIE ................................................................................................................................... 42
7.
LITERATUURLIJST .......................................................................................................................... 43
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN (B)AA
(Bis)acrylamide
ACR
American College of Rheumatology
ALT
Alanine-aminotransferase
ANA
antinucleaire antilichamen
APS
Ammoniumpersulfaat
AST
Aspartaat-aminotransferase
BSA
Bovine Serum Albumine
CCD
Charge-Coupled Device
CENP-B
Centromeer proteïne B
CIE
Counterimmunoelectrophoresis
CLIA
Chemiluminescentie immunoassay
CRP
C-reactief proteïne
CTD
connective tissue diseases
CU
Chemiluminescent units
DFS70
Densed fine speckles 70
DID
Double immunodiffusion
dsDNA
Dubbelstrengig DNA
EIA
Enzyme immunoassay
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
ENA
Extraheerbare nucleaire antigenen
FEIA
Fluorescentie enzyme immunoassay
FITC
Fluoresceïne isothiocyanaat
HEp-2(000)
Humaan epitheliaal-2(000)
IIF
Indirecte immunofluorescentie
Jo-1
Anti-histidyl-tRNA synthetase
La
Lupus La proteïne
LED
Light Emitting Diode
LEDGF
Lens epithelium-derived growth factor
LIA
Line immunoassay
NFM
Non fat dry milk
PBS
Phosphate Buffered Saline
PCNA
Proliferating cell nuclear antigen
PI
Propabiliteitsindex
PM
Polymyositis
PVDF
Polyvinylideenfluoride
RLU
Relative Light Units
Ro 60
Ribonucleoproteïne Ro 60
Scl70
Scleroderma 70
SDS
Natriumdodecylsulfaat
SLE
systemische lupus erythematosus
Sm
Smith
snRNP
small nuclear ribonucleoproteïne
SS
Sjörgen syndroom
SSA
Sjögren Syndroom type A
SSB
Sjögren Syndroom type B
SSc
Systeemsclerose
TEMED
Tetramethylethyleendiamine
1. INLEIDING 1.1. ANTINUCLEAIRE ANTILICHAMEN (ANA) 1.1.1. Definitie Antinucleaire antilichamen (ANA) zijn auto-immuun antistoffen die voornamelijk reageren met componenten aanwezig in de celkern (1). Een aantal antilichamen tegen cytoplasmatische antigenen worden ook onder de noemer van ANA geplaatst, een voorbeeld hiervan zijn antilichamen tegen aminoacyl-tRNA-synthetases (ARS) (2). De aanwezigheid van anti-ARS antistoffen kan aanleiding geven tot een Jo-1 patroon (3). Een andere benaming voor ANA is antinucleaire factoren (ANF). 1.1.2. Diagnostische waarde van ANA De detectie van ANA wordt beschouwd als de beste screeningstest in de diagnostische uitwerking van systemische auto-immuunziekten of 'connective tissue diseases' (CTD) (4, 5). De aanwezigheid van ANA is onder andere één van de 11 diagnostische criteria van systemische lupus erythematosus (SLE) (6), want 95-100% van de SLE patiënten is ANA positief (7). Verder is detectie van ANA nuttig in de diagnose van systeemsclerose (SSc, 93% ANA positief), Sjörgen syndroom (SS, 40-70% ANA positief), myositis (30-80% ANA positief), geneesmiddelen-geïnduceerde lupus (100% ANA positief) en mixed connective tissue disease (100% ANA positief) (7, 8). ANA kan ook voorkomen in andere ziekten, waarvan het nut in de diagnose en prognose nog niet is aangetoond (1). Voorbeelden hiervan zijn reumatoïde artritis, multiple sclerose, schildklierziekte, infectieziekten, fibromyalgie en idiopathische thrombocytopenische purpura (9).
Naast ANA in zieke individuen kunnen ze ook worden teruggevonden bij 20% tot 30% van de gezonde populatie (10). Uit studies blijkt dat 75% van de ANA-positieve individuen geen aantoonbare reumatische aandoening heeft (11). Hierdoor laat de aanwezigheid van ANA niet toe om een onderscheid te maken tussen gezond en ziek (11). ANA bij gezonde individuen komen gewoonlijk voor in lage concentraties, hebben een lage affiniteit en zijn vaak van de klasse IgM. Patiënten met SLE en SS hebben daarentegen meestal hoge titers IgG ANA met een hoge affiniteit voor specifieke ziektegerelateerde nucleaire antigenen (11). 1
1.1.3. Detectiemethoden ANA 1.1.3.1.
Indirecte immunofluorescentie
Indirecte immunofluorescentie (IIF) wordt traditioneel gebruikt voor de detectie van ANA. De American College of Rheumatology (ACR) beveelt de IIF screeningstest aan om ANA te detecteren bij patiënten met een vermoeden van CTD (4). Met IIF worden antilichamen gericht tegen antigenen in het substraat, gefixeerd op een draagglaasje, gedetecteerd. De auto-antilichamen aanwezig in het patiëntenserum zullen binden aan de antigenen. Detectie gebeurt aan de hand van een fluoresceïne-geconjugeerd antihumaan IgG (figuur 1.1.). Met behulp van een fluorescentiemicroscoop worden fluorescentiepatronen en intensiteiten beoordeeld. Zowel het patroon van de cellen in rust als het patroon van de cellen in mitose worden geëvalueerd. De test wordt als positief beschouwd wanneer er een definieerbaar fluorescentiepatroon zichtbaar is. De concentratie waarin ANA aanwezig zijn, is evenredig met de intensiteit. Een andere manier om de concentratie aan ANA te bepalen is via eindpunttitratie. Een positieve test laat niet toe om de auto-antilichamen precies te identificeren (12). Daarom worden ANA-IIF positieve stalen onderworpen aan verdere analyse. De antigenen waartegen deze ANA gericht zijn, dienen geïdentificeerd te worden (cfr. 1.2.3. detectiemethoden ENA).
Figuur 1.1. Principe van indirecte immunofluorescentie. http://drugline.org/medic/term/indirect-immunofluorescence-assay/ (15/03/2013)
Meestal wordt vandaag bij IIF als substraat gebruik gemaakt van humane epitheliale-2 (HEp-2) cellen. Deze cellijn is afkomstig van een humaan larynxcarcinoom. Deze cellen zorgen voor standaardisatie omdat alle cellen identiek zijn (5, 9). Het gebruik van HEp-2 2
cellen als substraat in plaats van het vroeger gebruikte knaagdierweefsel resulteerde in een betere sensitiviteit van de test. Deze verbetering heeft daarentegen een negatieve invloed op de specificiteit van de test omdat een groter deel van de gezonde individuen of patiënten met een niet-inflammatoire aandoening positief testen (13). In het laboratorium voor klinische biologie van het UZ Gent wordt routinematig gebruik gemaakt van HEp-2000 cellen. Dit zijn HEp-2 cellen waarin het 60 kDa ribonucleoproteïne Ro (Ro 60) tot overexpressie is gebracht. Door deze overexpressie verhoogt de sensitiviteit voor de detectie van antiSjögren Syndroom type A antigen (SSA)/Ro60 antilichamen. Deze antilichamen zijn diagnostische merkers voor SS en SLE (14, 15).
Nadelen van indirecte immunofluorescentie zijn dat de test zeer tijdrovend is en moeilijk te standaardiseren en automatiseren is. De resultaten worden subjectief geïnterpreteerd, wat de reproduceerbaarheid in het gedrang brengt (16). 1.1.3.2.
Enzyme immunoassay
De laatste jaren zijn er ook enzyme immunoassay (EIA) kits beschikbaar om ANA screening uit te voeren. De commercieel beschikbare kits bevatten kernextracten of mengsels van opgezuiverde en/of recombinante antigenen (16). De resultaten zijn kwantitatief en worden meestal uitgedrukt in arbitraire eenheden door vergelijking met een ijklijn of kalibratoren (7).
Een voorbeeld van een geautomatiseerde EIA voor ANA screening is de EliA symphony®, dit is een fluorescentie enzyme immunoassay. De EliA symphony® bevat kuipjes gecoat met antigenenmengsels. Er wordt tegelijkertijd gescreend naar een aantal ANA reactiviteiten (anti-SSA/Ro (Ro52 en Ro60), anti-Sjögren Syndroom type B (SSB)/lupus La proteïne (La), anti-U1-small nuclear ribonucleoproteïne (snRNP), anti-Scleroderma (Scl) 70, anti-histidyl-tRNA synthetase (Jo-1), anti-centromeer proteïne B (CENP-B) en anti-Smith (Sm)) (17). ANA aanwezig in het serumstaal wordt gedetecteerd door toevoeging van een enzymgekoppeld anti-IgG antilichaam. Het enzym zal vervolgens een toegevoegd substraat omzetten in een fluorescerend eindproduct. De ontwikkelde fluorescentie is evenredig met de hoeveelheid ANA aanwezig in het staal (16). Het voordeel is dat deze EIA techniek makkelijk uit te voeren is en minder kost dan ANA-IIF (7). 3
Het gebruik van EIA voor ANA screening is controversieel. Verscheidene studies hebben EIA en IIF voor ANA analyse met elkaar vergeleken (16, 18, 19). Wanneer een EIA gebruikt wordt voor ANA screening is de sensitiviteit in theorie nooit gelijk aan 100%. Dit weerspiegelt zich ook in de resultaten van de vergelijkende studies. Inderdaad, voor een SSc populatie ligt de sensitiviteit van EIA tussen 68% en 77% (afhankelijk van het aantal antigenen geïncludeerd in de EIA) (18, 19). Dit is lager in vergelijking met de sensitiviteit behaald door IIF (81%-95%) (18, 19). De sensitiviteit van de test stijgt met het aantal antigenen, dit werd aangetoond door vergelijking van de EliA symphony® screen (68%) met de EliA CTD® screen (77%). Deze laatste bevat extra antigenen (RNA-polymerase-III, PM/Scl (polymyositis/scleroderma), fibrillarine, Th/To RNP, PCNA (proliferating cell nuclear antigen), Mi-2 en dsDNA (dubbelstrengig DNA))(19). Aan de andere kant is de specificiteit van een EIA hoog doordat er naar specifieke antigenen gescreend wordt. Andere niet-specifieke ANA, die niet gedetecteerd worden met EIA, kunnen daarentegen wel fluorescentiepatronen vertonen bij IIF (20). 1.2. UITWERKING POSITIEVE ANA 1.2.1. Extraheerbare nucleaire antigenen Extraheerbare nucleaire antigenen (ENA) worden gebruikt om de specifieke ANA reactiviteit te identificeren. ENA zijn oplosbare nucleaire en cytoplasmatische componenten. Vroeger gebeurde de identificatie door middel van zoutextractie, vandaar de benaming extraheerbare nucleaire antigenen. Op dit moment zijn al meer dan honderd ENA gekend (2, 21). 1.2.2. Diagnostische waarde van ENA De klinisch meest relevante ENA zijn Sm, U1-snRNP, SSA, SSB, Scl70, Jo-1 en centromeer. Antilichamen gericht tegen deze antigenen geven definieerbare fluorescentiepatronen op HEp-2(000). Nochtans is de identificatie van antistoffen enkel door middel van indirecte immunofluorescentie alleen niet mogelijk want meerdere auto-antilichamen kunnen gelijkaardige patronen geven en ook gemengde patronen worden frequent gezien. Specifiekere technieken zoals immunoblots, enzyme immunoassays of immunoprecipitatie zijn hiervoor noodzakelijk (21). Verdere analyse naar de reactiviteit tegen ENA draagt bij tot 4
de diagnostische waarde en laat het differentiëren tussen verschillende auto-immuunziekten toe. Een paar voorbeelden: antilichamen tegen het Smith (Sm) antigeen zijn specifiek voor SLE en antilichamen tegen het topoisomerase-I (synoniem anti-scleroderma 70, anti-Scl70) antigeen zijn kenmerkend voor systeemsclerose (2, 7). Naast de diagnostische bijdrage van antilichamen tegen ENA, spelen sommige van de anti-ENA ook een belangrijke rol in de prognose. Bijvoorbeeld, de circulatie van anti-SSA in de moeder kan neonatale SLE en/of congenitale hartblokkade geven. De aanwezigheid van anti-Scl70 antilichamen voorspelt een ernstiger verloop van systeemsclerose (2). Figuur 1.2. toont de associatie tussen specifieke patronen op HEp-cellen en auto-immuunziekten. De lijnen duiden aan naar welke autoantilichamen er gezocht moet worden bij de aanwezigheid van een respectievelijk patroon of klinisch vermoeden van ziekte (5).
Figuur 1.2. Associatie tussen specifieke patronen op HEp-cellen en auto-immuunziekten. De lijnen duiden aan naar welke auto-antilichamen er gezocht moet worden bij de aanwezigheid van een respectievelijk patroon of klinisch vermoeden van ziekte (Sack et al., 2009) (5). 5
1.2.3. Detectiemethoden ENA 1.2.3.1.
Enzyme immunoassay (EIA)
Om anti-ENA op te sporen wordt meestal gebruik gemaakt van EIA met geïsoleerde antigenen, dit in tegenstelling tot ANA screening met behulp van EIA. De antigenen zijn hetzij opgezuiverd of recombinant (7).
Een EIA maakt gebruik van de katalytische eigenschappen van enzymen om immunologische reacties te detecteren en te kwantificeren. De meest gebruikte enzymen zijn alkalische fosfatase, glucose-6-dehydrogenase en β-galactosidase. Deze enzymen worden als merkers gebruikt in EIA's en er bestaan verschillende detectiesystemen. Voor de detectie wordt gebruik gemaakt van fotometrie en fluorometrie (22).
Een bekend voorbeeld van een EIA is enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA is een techniek waarbij antigenen op een niet-specifieke wijze geadsorbeerd zijn aan een vaste fase (23). Als vaste fase wordt meestal gebruik gemaakt van microtiterplaten (22). Het volledige testprincipe is als volgt: een aliquot van het serum, welke het te meten antilichaam bevat, wordt toegevoegd en bindt vervolgens aan antigenen geadsorbeerd aan de vaste fase. Na een wasstap wordt een enzym-gekoppeld antihumaan IgG (secundair antilichaam) toegevoegd. Er wordt een soort “sandwich-complex” gevormd tussen het vastefase-antigen, het auto-antilichaam en secundaire antilichaam. Na een tweede wasstap wordt het enzymsubstraat toegevoegd. Het enzym katalyseert de omzetting van het substraat in bijvoorbeeld een gekleurd product. De gevormde hoeveelheid gekleurd product is evenredig met de hoeveelheid antilichaam in het staal (22). Een ander voorbeeld van EIA is lijn immunoassay (LIA). Met de huidig beschikbare commerciële LIA's kunnen antistoffen tegen volgende antigenen gedetecteerd worden: Sm, RNP, Ro52, Ro60, La/SSB, Cenp-B, Scl-70, Jo-1, ribosomaal P en histonen (14). Deze antigenen zijn afzonderlijk gecoat op een nylonstrip (figuur 1.3.). De antigenen zijn ofwel opgezuiverd of recombinant aangemaakt. Zo'n nylonstrip wordt geïncubeerd met serum. De auto-antilichamen aanwezig in het serum vormen complexen met de antigenen op de strip. Om de auto-antilichamen te detecteren, wordt een anti-humaan geitenantilichaam IgG, 6
gemerkt met alkalische fosfatase, toegevoegd. Het enzym zorgt voor een kleuromslag die evenredig is met de concentratie aan auto-antilichamen (12, 14).
Figuur 1.3. Voorbeeld van een LIA nylonstrip. http://www.innogenetics.com/fotos/INNO_LIA_ANA_Update_CE.pdf (18/04/2013)
Een enzyme immunoassay (EIA) is een meer objectieve test en is makkelijk te automatiseren waardoor een EIA weinig arbeidsintensief is (7). 1.2.3.2.
Western blotting
Western blotting laat toe om proteïnen te scheiden op basis van moleculair gewicht en deze te visualiseren. Een western blot gebeurt in verschillende fases. In een eerste fase worden de proteïnen van elkaar gescheiden door middel van gelelektroforese. In een tweede stap worden de proteïnen overgedragen vanuit het elektroforesemedium naar een vaste fase (blotten). Als vaste fase wordt gebruik gemaakt van een nitrocellulosestrip of een membraan op basis van nylon. De transfer kan gebeuren door middel van eenvoudige geassisteerde diffusie (vacuum, hoge druk), door capillaire krachten of elektroforetisch (elektroblotting). Na deze transfer worden de niet-specifieke bindingsplaatsen op de vaste fase geblokkeerd (23). Er wordt gebruik gemaakt van bovine serum albumine (BSA), gelatine, Tween 20 of mager melkpoeder om de vrije proteïnebindingsplaatsen op de nitrocellulosemembraan te verzadigen (24). Vervolgens kunnen de proteïnebanden gedetecteerd worden met behulp van antilichamen gekoppeld met enzymen of radioactieve isotopen (23). 7
In geval van anti-ENA bepaling is de bron voor proteïnen een kernextract. De eventueel aanwezige auto-antilichamen in het serumstaal zijn het primair antilichaam. De primaire antilichamen worden gevisualiseerd door toevoeging van een gemerkt IgG (secundair antilichaam).
De western blot is een zeer tijdsrovende procedure en wordt daarom enkel nog in onderzoek gebruikt. 1.2.3.3.
Andere detectiemethoden
Een alternatieve detectiemethode van anti-ENA is immunoprecipitatie in agar. Dit kan uitgevoerd
worden
door
middel
van
dubbele
immunodiffusie
(DID)
of
via
counterimmunoelectrophoresis (CIE). Deze methodes worden weinig gebruikt (25). 1.3. DFS70 ANTISTOFFEN 1.3.1. Definitie en historiek Anti-dense fine speckles (DFS) 70 antilichamen werden in 1994 voor het eerst beschreven bij patiënten met interstitiële cystitis (26). Later werden deze antilichamen ook gezien bij patiënten met atopische dermatitis, astma, Vogt-Koynagi-Harada syndroom en SS (13). Nadien werden ze ook aangetoond bij kankerpatiënten en zelfs in het serum van gezonde individuen (27).
Anti-DFS70 antistoffen zijn antistoffen tegen het DFS70 antigeen. Dit antigeen werd geïdentificeerd als de nucleaire transcriptie coactivator p75, ook gekend als het lens epithelium-derived growth factor (LEDGF). LEDGF/p75 is een sterk geladen proline-rijk eiwit met een moleculair gewicht van 70 kDa (13). LEDGF/p75 is een nucleair proteïne en een overlevingsfactor dat de groei en weerstand tegen celdood bevordert. Het is een transcriptie activator die bindt aan promotorelementen van hitteshock en stressgerelateerde genen om de expressie van de respectievelijke genen te activeren. Bijgevolg stijgen de concentraties van stressgerelateerde proteïnen zoals hitte-shockproteïnen, antioxiderende proteïnen en detoxicatie-enzymen. Deze eiwitten kunnen mogelijk de door stress geïnduceerde apoptose onderdrukken (10). 8
1.3.2. Diagnostische waarde van DFS70 antistoffen Het spectrum van klinische associaties en het mechanisme van anti-DFS70 inductie is nog niet volledig opgehelderd. Opvallend is wel dat de prevalentie van DFS70 antilichamen hoger is bij schijnbaar gezonde individuen (ongeveer 20%) dan bij patiënten met CTD (< 10%) (28) (27). Uit de studie van Watanabe et al. bleek dat 54% van de ANA-positieve gezonde vrijwilligers (gezonde ziekenhuismedewerkers) anti-DFS70 antilichamen had (10). Een studie bekeek ook de aanwezigheid van DFS70 antistoffen in relatie tot de aanwezigheid van ziektegerelateerde antistoffen in CTD patiënten (29). Ongeveer 4% van de onderzochte populatie was DFS70 positief. In 86% van de anti-DFS70 positieve CTD patiënten werden eveneens ziektegerelateerde auto-antilichamen (anti-SSA, anti-Jo1, anti-Scl70, anti-Sm...) teruggevonden. Het is uitzonderlijk om enkel DFS70 antilichamen te vinden bij patiënten met CTD (29). Gebaseerd op deze bevindingen wordt gesuggereerd dat de aanwezigheid van geïsoleerde anti-DFS70 antilichamen zou kunnen gebruikt worden als een biomerker om de diagnose van CTD uit te sluiten (27). 1.3.3. Detectie van DFS70 antistoffen 1.3.3.1.
Opspoorbaarheid met behulp van IIF
Het fluorescentiepatroon dat door deze antistoffen wordt veroorzaakt op HEp-2, wordt beschreven als dicht opeen gepakte spikkels in de volledige kern van de cellen in interfase (= dense fine speckled patroon). Er is heterogeniteit in de intensiteiten van de verschillende spikkels. Het patroon is gelijkaardig voor het chromatine van de cellen in metafase (30). Het maken van een onderscheid tussen het DFS70 patroon en het “quasi homogeen” patroon is een uitdaging voor routinelaboratoria. Figuur 1.4. toont het karakteristiek DFS70 fluorescentiepatroon in vergelijking met andere veelvoorkomende ANA-IIF patronen op HEp-2 cellen (27). Er zijn in de literatuur geen beelden beschikbaar van DFS70 op Hep-2000.
9
Figuur 1.4. Het DFS70 patroon moet onderscheiden worden van gelijkaardige patronen zoals (a) gespikkelde patronen gegenereerd door auto-antilichamen tegen RNP, Ro-60 en SSB (La), (b) nucleolaire patronen gegenereerd door anti-Scl70 antilichamen en (c) homogene patronen gegenereerd door anti-dsDNA antilichamen. Foto’s (d)-(f) zijn DFS70 patronen afkomstig van drie verschillende stalen, (d) en (e) zijn monospecifiek anti-DFS70, (f) bevat ook nog lage titers aan antilichamen tegen ENA's (Mahler et al., 2012) (27). 1.3.3.2.
Chemiluminescentie immunoassay
Aan de hand van chemiluminescentie kunnen de DFS70 auto-antilichamen specifiek opgespoord worden. Hierbij wordt gebruik gemaakt van recombinant DFS70/LEDGF gecoat op paramagnetische beads (31). 1.3.3.3.
IIF op lens en cornea
Omdat het DFS70 antigeen ook gekend is als het lens epithelium-derived growth factor, lijkt het een logische stap om IIF uit te voeren op een substraat van lens en cornea afkomstig van muizen. Echter, in de studie van Bizarro et al. werd er aangetoond dat slechts 36% van de stalen, die DFS70 positief waren op HEp-2, antigenen herkenden in de lens of cornea. Het gebruik van dit substraat bleek geen goede methode te zijn om DFS70 autoantilichamen op te sporen (32).
10
1.4. REFLEX TESTING OF CASCADE TESTING Er bestaat nog geen consensus over de beste manier om ANA te screenen en te identificeren (12). In het routinelaboratorium wordt vaak gebruik gemaakt van cascade testing. Klassiek wordt, wanneer de aanwezigheid van ANA wordt vermoed op basis van een positief IIF beeld, een meer specifiekere test gebruikt om de identiteit van de autoantistof te bepalen. Dit is het klassieke tweestappen algoritme. In het klinisch laboratorium van het UZ Gent wordt een driestappen algoritme gebruikt. Dit wordt in figuur 1.5. weergegeven. Hierbij werd een EIA voor ANA screening (EliA Symphony®), die een mengsel van de meest klinisch relevante ENA bevat, geplaatst tussen de IIF screening en de finale identificatieassay (lijn immunoassay). Door de EliA Symphony® als tweede stap in te voeren, daalt het aantal finale identificatietesten. Deze invoering werkt bijgevolg kostenbesparend (17).
Omwille van de hoge gevoeligheid van de HEp-2(000) cellen aan zelfs kleine hoeveelheden ANA in het serum van patiënten, zijn er vaak 'vals-positieve' stalen na IIF screening. Zoals reeds vermeld, is de aanwezigheid van geïsoleerde DFS70 antistoffen eerder geassocieerd met gezonde individuen en is het onwaarschijnlijk om deze DFS70 antistoffen geïsoleerd terug te vinden bij patiënten die lijden aan een CTD. Er wordt daarom gesuggereerd dat het geïsoleerd vinden van anti-DFS70 antilichamen in deze ANA-IIF 'valspositieve' stalen CTD zou kunnen uitsluiten en ook kostenbesparend zou kunnen werken (10, 33). Het is daarom belangrijk om het voorkomen van deze anti-DFS70 antilichamen beter in kaart te brengen en de inclusie van anti-DFS70 in diagnostische algoritmes te overwegen (33). In figuur 1.5. duiden de zwarte pijlen mogelijke posities aan waar de opsporing van DFS70 antistoffen theoretisch zinvol zou kunnen zijn. Pijl 1 stelt voor om DFS70 antistoffen te detecteren voorafgaand aan de EliA symphony®, dit zou kostenbesparend kunnen zijn. Pijl 2 stelt voor om pas naar DFS70 antistoffen te zoeken wanneer stalen negatief testen op de EliA symphony®. Deze laatste strategie heeft vooral een bijdrage in de verklaring van het ANA fluorescentiepatroon, ze is niet direct kostenbesparend.
11
Figuur 1.5. Algoritme gebruikt in het UZ Gent. De zwarte pijlen duiden mogelijke posities aan waar de DFS70 antistoffen kunnen worden opgespoord. Pijl 1, DFS70 antistoffen opsporen voorafgaand aan ELiA Symphony®. Pijl 2, DFS70 antistoffen opsporen na negatieve testresultaat op de ELiA Symphony®.
12
2. OBJECTIEVEN De bepaling van antinucleaire antilichamen (ANA) als screeningstest is een belangrijk hulpmiddel in de diagnose van auto-immuunziekten (CTD). Indirecte immunofluorescentie (IIF) voor ANA screening wordt aanbevolen door de American College of Rheumatology. Echter, 20-30% van de gezonde donoren scoort ANA IIF positief (cfr. 1.2.2.). Een verklaring voor deze positieve resultaten kan zijn dat deze gezonde individuen antistoffen tegen het dense fine speckles (DFS) 70 antigeen bevatten, aangezien deze antilichamen worden teruggevonden bij ongeveer 20% van de gezonde populatie (cfr. 1.3.2.). Een opmerkelijk gegeven is dat deze antistoffen minder prevalent (<10%) zijn bij CTD patiënten. Bovendien worden deze DFS70 antistoffen enkel uitzonderlijk geïsoleerd teruggevonden bij CTD patiënten (cfr. 1.3.2.). De toenemende belangstelling voor deze parameter (voornamelijk in de Verenigde Staten) in combinatie met bovenstaande gegevens moedigt aan om na te gaan of de bepaling van DFS70 antistoffen kan bijdragen in de routinematige uitwerking van ANA/anti-ENA bepaling. Om de meerwaarde te bepalen van anti-DFS70 detectie in een routinesetting werd in een eerste fase gezocht naar de beste techniek om DFS70 antistoffen op te sporen. IIF op twee substraten werd vergeleken met een chemiluminiscentie immunoassay. De analyses werden uitgevoerd op stalen van drie cohorten: gezonde donoren, consecutieve routinestalen en controles afkomstig van patiënten die lijden aan systemische lupus erythematosus (SLE). Vervolgens werd de aanwezigheid van DFS70 antilichamen bevestigd met behulp van western blotting (cfr. 4.1.). In een tweede fase werd de klinische performantie van DFS70 antistof detectie onderzocht. Hiervoor werd de frequentie van DFS70 antistofpositiviteit binnen de klinisch goed gedefinieerde cohortes geëvalueerd (cfr. 4.2.) en vergeleken met de literatuur. Tot slot werd de vraag gesteld of de detectie van DFS70 antistoffen een plaats kan innemen in de uitwerking van ANA. Hiervoor werd gekeken waar de integratie van DFS70 detectie theoretisch zinvol zou kunnen zijn. De invloed op de klinische performantie werd bepaald en de gemiddelde kost per staal werd eveneens berekend (cfr. 4.3.2.).
13
3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1.
STAALVERZAMELING
De analyses werden uitgevoerd op 3 cohorten: gezonde donoren of 'healthy donors' (HD), consecutieve routinestalen en zieke controles (diseased controls, DC). Alle analyses gebeurden op serum, bekomen door het volbloed te centrifugeren bij 1880 g gedurende 8 minuten. De HD cohorte bestaat uit 100 stalen afkomstig van bloeddonoren van het rode kruis en 81 stalen afkomstig van gezondheidswerkers die tewerkgesteld zijn in het laboratorium voor klinische biologie van het UZ Gent. Om na te gaan of de gezonde donoren daadwerkelijk gezond waren, werden de aspartaat-aminotransferase (AST), alanineaminotransferase (ALT) en C-reactief proteïne (CRP) waarden bepaald en normaal bevonden. De tweede cohorte bestaat uit 222 consecutieve routinestalen waarop ANA/anti-ENA uitwerking was aangevraagd. De zieke controles zijn 44 SLE patiënten (op basis van klinische diagnose). Een positief DFS70 controlestaal werd bekomen via INOVA Diagnostics, Inc. 3.2.
ANA INDIRECTE IMMUNOFLUORESCENTIE 3.2.1. Staalvoorbereiding 3.2.1.1.
Materialen
Toestellen:
Pipetteerautomaat (Zenit Up, A. Menarini Diagnostics, Zaventem, België), figuur 3.1.
Reagentia: 1. HEp-2000 HEp-2000® Fluorescent ANA-Ro kit (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA): o HEp-2000 plaatjes (14 wells per plaat) o Conjugaat: geit anti-humaan immunoglobuline gelabeld met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) De volgende reagentia worden niet standaard bij de kit geleverd: o Phosphate Buffered Saline (PBS) buffer poeder (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA) o Gedestilleerd water (Laboratoire Aguetant, Lyon, France) o 0,5% Evans Blue (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA) 14
Mounting medium (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA)
2. HEp-2 Autoantibody Test System (A. Menarini diagnostics, Zaventem, België): o HEp-2 plaatjes (12 wells per plaat) o Geit anti-humaan immunoglobuline gemerkt met FITC met Evan’s Blue o Mounting medium o PBS poeder o Gebufferd diluens
Figuur 3.1. pipetteerautomaat, Zenit Up® (A. Menarini Diagnostics, Zaventem, België) http://www.menarinidiagnostics.nl/Producten/Autoimmunity/Zenit-UP (02/04/2013)
3.2.1.2.
Methode
Zenit Up® is een pipetteerautomaat die zowel microtiterplaten voor ELISA als plaatjes voor IIF kan pipetteren. De identificatie van de stalen gebeurt ofwel manueel of via het scannen van een barcode. Het toestel in het laboratorium voor klinische biologie van het UZ Gent wordt momenteel enkel voor ANA IIF testen gebruikt. In het toestel is er ruimte voor 16 IIF plaatjes (34). De reagentia worden op het toestel geplaatst zoals aangeduid in figuur 3.2. De Zenit Up voert onderstaande stappen geautomatiseerd uit:
15
Automatisch verdunnen (1:40) van de sera en controles (positieve en negatieve controle): 50 µl serum en 1950 µl PBS Aanbrengen van 30 µl verdund serum op de wells van het HEp-2(000) ANA plaatje en een incubatie gedurende 30 minuten Wegwassen van ongebonden antilichamen met PBS Toevoegen van antihumaan IgG gemerkt met FITC (conjugaat) en incubatie gedurende 30 minuten Wegwassen van ongebonden conjugaat met PBS Tegenkleuren met Evan’s Blue Nadat de run volledig is afgelopen worden de plaatjes van het toestel gehaald. Op een paar welletjes wordt een druppel mounting medium aangebracht en elk plaatje wordt vervolgens afgedekt met een dekglaasje. Alle stalen werden standaard 1:40 verdund en vervolgens beoordeeld op positiviteit. Positieve stalen van de HD en DC cohorte werden verder uitgetitreerd tot een maximumverdunning van 1:1280 (eindpunttitratie). Alle stalen werden verwerkt op HEp2000 plaatjes, enkel de HD cohorte werd ook op HEp-2 plaatjes geanalyseerd. Het DFS70 controlestaal, geleverd door INOVA Diagnostics, Inc. werd manueel verwerkt op HEp-2(000) omwille van het beperkte volume (25µl) dat ontvangen werd. Er werd een verdunningsreeks gemaakt: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560 en 1:5120.
Figuur 3.2. overzichtscherm op Zenit Up® voor het plaatsen van de reagentia. 16
3.2.2. Geautomatiseerde aflezing 3.2.2.1.
Materialen
Toestel
Zenit G-sight (A. Menarini Diagnostics, Zaventem, België)
Reagentia
Cfr. 3.2.1.1. 3.2.2.2.
Methode
Zenit G-sight® (figuur 3.3.) is een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop die gebruik maakt van een Light Emitting Diode (LED) lichtbron (450-490 nm golflengte). Het toestel is voorzien van een gemotoriseerde objectieftafel en een CCD (charge coupled device) kleurencamera (35). Er kunnen maximum vijf IIF plaatjes op de objectieftafel geplaatst worden. De Zenit G-sight® wordt geleverd met twee objectieven (4x en 40x) en er is plaats om vier objectieflenzen bij te plaatsen (19, 35). De informatie over welke positie op het IIF plaatje bij welke patiënt hoort wordt doorgestuurd van Zenit Up® naar Zenit G-sight®. Er zijn drie scaninstellingen: small (5 focuspunten), medium (5 focuspunten) en full scan (13 focuspunten). In het UZ Gent wordt er gewerkt met de medium scanmodus. Bij de start zal de microscoop binnen een well vijf posities uitmeten, de Zenit G-sight® bepaalt zo de juiste focus en basislichtintensiteit. In een eerste stap focusseert de Zenit G-sight® met zijn 4x objectief het meest optimale beeld. Nadien wordt het 40x objectief gebruikt voor fijnere focussering binnen de well. Hieruit berekent de Zenit G-sight® de probabiliteitsindex (PI) op basis van de parameters die de focussering van de camera regelen. Deze PI's worden vervolgens gebruikt om onderscheid te maken tussen positief en negatief aan de hand van cut-off waarden voorgesteld door de firma (PI<8: negatief, 8≤PI≤50: onzeker negatief, PI>50: positief). Deze probabiliteitsindex correleert met de eindpunttiters van de klassieke IIF analyse (19, 35). Daarnaast is het toestel in staat vijf verschillende patronen te herkennen, namelijk homogeen, nucleolair, gespikkeld, centromeer en mitochondriaal. De resultaten worden steeds nagekeken en bijgestuurd waar nodig (expert review) (19, 35). Bij dit nazicht worden zowel de positieve of negatieve interpretatie, de patronen en de intensiteiten geëvalueerd en gevalideerd. De opgeslagen beelden kunnen steeds met behulp van een 17
virtuele microscoop bekeken worden. Deze virtuele microscoop laat toe elk detail van de gedigitaliseerde well te bekijken en in te zoomen waar gewenst (35).
Figuur 3.3. Fluorescentiemicroscoop, Zenit G-sight (A. Menarini Diagnostics, Zaventem, België). http://www.menarinidiagnostics.nl/Producten/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Fotogalerij (02/04/2013)
3.3.
IDENTIFICATIE VAN ANA
Alle stalen (exclusie van 81 gezondheidswerkers van het laboratorium voor klinische biologie van het UZ Gent) die ANA positief waren, werden verder geanalyseerd met de EliA Symphony®. 3.3.1. Materialen Toestel
ImmunoCAP 250 (Phadia GmbH, Freiburg, Duitsland)
Reagentia 1. EliA Symphony® test-specifieke reagentia (Phadia GmbH, Freiburg, Duitsland):
EliA ANA positieve controle 250 o IgG antilichamen tegen dsDNA, RNP, Sm, Ro, La, Scl-70, CENP en Jo-1
EliA IgG/IgM/IgA negatieve controle 250 o Serum afkomstig van gezonde donoren
EliA staaldiluens 18
o PBS o BSA (bovine serum albumine) o Natriumazide
EliA IgG conjugaat o Gemerkt met β-galactosidase
EliA IgG kalibrator strips o Humaan IgG (0, 4, 10, 20, 100, 600 µg/l) in staaldiluens
EliA IgG curve controlestrips o Humaan IgG (20µg/l) in staaldiluens
2. Phadia 250 algemene reagentia (Phadia GmbH, Freiburg, Duitsland):
Ontwikkelingsvloeistof o 0,01% 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside
Stopoplossing o 4% natriumcarbonaat
3.3.2. Methode EliA Symphony® is een fluorescentie enzyme immunoassay (FEIA), deze test wordt uitgevoerd op de ImmunoCAP 250 (Phadia GmbH, Freiburg, Duitsland). Bij EliA Symphony® zijn de kuipjes (wells) gecoat met antigenenmengsels (anti-SSA/Ro (Ro52 en Ro60), antiSSB/La, anti-U1-RNP, anti-Scl70, anti-Jo-1, anti-CENP-B en anti-Sm). De stalen en controles worden door het toestel 1:100 verdund en met dit mengsel geïncubeerd. De autoantilichamen aanwezig in het serumstaal binden specifiek aan de gecoate antigenen in de wells. Een wasstap verwijdert de niet-gebonden antilichamen. Vervolgens wordt een enzymgekoppeld antihumaan IgG (conjugaat) toegevoegd, waardoor een antilichaamconjugaatcomplex gevormd wordt. Tijdens incubatie in de ontwikkelingsvloeistof zorgt het enzym, β-galactosidase, voor de vorming van een fluorescent eindproduct dat na stoppen van de reactie gemeten wordt. De intensiteit van de fluorescentie is evenredig met concentratie aan specifieke ANA in het staal. Met behulp van een kalibratiecurve worden de resultaten bepaald, de verhouding van de respons van het staal op de kalibratorrespons 19
wordt berekend. De resultaten worden uitgedrukt als zijnde positief, borderline (twijfelachtig) en negatief (zie tabel 3.2.) (16). Tabel 3.2. Interpretatie resultaten van symphony op basis van de ratio. Reactiviteit Negatief Borderline Positief
3.4.
Ratio (x) x < 0,7 0,7 < x < 1,0 x > 1,0
DETECTIE VAN DFS70 ANTISTOFFEN AAN DE HAND VAN CLIA
Chemiluminescentie immunoassay (CLIA) werd op alle cohorten uitgevoerd (HD, DC en consecutieve routinecohorte). 3.4.1. Materialen Toestel Bio-Flash® (Inova Diagnostics, Inc, San Diego, USA) ACL AcuStar® (Instrumentation laboratory, Zaventem, Belgium) Reagentia 1. QUANTA Flash®DFS70 testkit (Inova Diagnostics, Inc, San Diego, USA):
Resuspensiebuffer (1 vial) (Inova Diagnostics, Inc, San Diego, USA)
Cartridge met daarin: o DFS70 antigeen gecoate paramagnetische beads in een buffer o Testbuffer o Tracer IgG (isoluminol gelabelde antihumane IgG antilichamen)
2. Triggers (Instrumentation laboratory, Zaventem, Belgium):
trigger 1: een ijzerbevattende porfyrine in NaOH
trigger 2: ureumperoxide
20
3.4.2. Methode De Bio-Flash® en AcuStar® zijn volautomatische chemiluminescentieanalysers en verschillen enkel in naam (figuur 3.4.). Met deze toestellen kunnen DFS70 antistoffen in humaan serum semi-kwantitatief gedetecteerd worden met behulp van de QUANTA Flash® DFS70 testkit.
Figuur 3.4. Afbeelding van het toestel Bio-Flash®. http://www.inovadx.com/store/products/bio-flashr-instrument/422?pid=13 (14/04/2013)
De paramagnetische beads zijn gecoat met recombinant DFS70. De serumstalen worden door het toestel automatisch verdund met staalbuffer in een plastieken cuvet. In een tweede cuvet worden kleine hoeveelheden van het verdund serum, DFS70 beads en de testbuffer samengevoegd en gemengd. Deze cuvet wordt vervolgens geïncubeerd bij 37°C gedurende 9,5 minuten. Tijdens deze incubatie binden de DFS70 antistoffen (indien aanwezig in het staal) aan de DFS70 antigenen. Nadien worden de beads gemagnetiseerd en enkele keren gewassen. Het antilichaam gemerkt met isoluminol (conjugaat) wordt toegevoegd aan de cuvet met daaropvolgend een tweede incubatie bij 37°C gedurende 9,5 minuten. Daarna worden de beads opnieuw gemagnetiseerd en herhaaldelijk gewassen. Wanneer de triggers worden toegevoegd aan de cuvet ontstaat er onder invloed van het isoluminolconjugaat een luminescentiereactie. Het uitgezonden licht wordt gemeten met behulp van een optisch systeem in het toestel en uitgedrukt als aantal ‘Relative Light Units’ (RLU) dat evenredig is met de hoeveelheid anti-DFS70 antilichamen aanwezig in het serumstaal.
Deze
RLU's
worden
vervolgens
door
het
toestel
omgerekend
in
chemiluminescent units (CU) die eveneens evenredig zijn met de hoeveelheid DFS70 antistoffen in het staal. Het onderscheid anti-DFS70 positief of negatief wordt bepaald op basis van tabel 3.3. (36). 21
Tabel 3.3. Bepaling reactiviteit op basis van CU (chemiluminescent units). Reactiviteit CU Negatief < 20 Positief ≥ 20 3.5.
BEVESTIGING DFS70 ANTISTOFFEN AAN DE HAND VAN WESTERN BLOT
Alle stalen die een DFS70-like patroon hadden en/of anti-DFS70 antistofpositief waren aan de hand van CLIA (twee van de gezonde donoren, zes van de consecutieve routinestalen en één uit de zieke controles) werden uitgewerkt op western blot om de aanwezigheid van DFS70 antistoffen te bevestigen. Op basis van de gegevens uit de literatuur wordt voor DFS70 antistoffen een bandje verwacht bij 70 kDa (10, 37). Een antiScl70 antistofpositief staal (Inova Diagnostics, Inc, San Diego, USA) werd ter controle meegenomen. 3.5.1. Materialen Toestellen 1. Trans-Blot® TurboTM Cassette (Biorad, Nazareth Eke, België) 2. VersadocTM imaging system (Biorad, Nazareth Eke, België) 3. Elektroforesecel (Biorad, Nazareth Eke, België) Reagentia 1. Reagentia voor het aanmaken van de resolving en stacking gel:
Gedestilleerd water (AD, aqua dest) (B.Braun Medical N.V., Diegem, België)
30% bisacrylamide (BAA of AA) (Biorad, Nazareth Eke, België)
1,5M TRIS pH 8,8 (Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België)
0,5M TRIS pH 6,8(Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België)
10% natriumdodecylsulfaat (SDS) (Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België)
10% ammoniumpersulfaat (APS) (Biorad, Nazareth Eke, België)
Tetramethylethyleendiamine (TEMED) (Biorad, Nazareth Eke, België)
2. Reagentia nodig voor het aanmaken van buffers: 22
Laemmli buffer: o 2% SDS (Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België) o 20% glycerol (Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België) o 0.005% broomfenolblauw (MERCK N.V.S.A., Overijse, België) o TRIS pH 6,8 (Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België)
Staalbuffer: o Laemmli buffer o β-mercaptoethanol (Biorad, Nazareth Eke, België) o Broomfenolblauw (MERCK N.V.S.A., Overijse, België)
Elektroforesebuffer: o 25 mM TRIS (Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België) o 192 mM glycine (Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België) o 0,1% SDS (Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België) o AD (B.Braun Medical N.V., Diegem, België) o Met HCL tot pH 8,3 gebracht
Blocking buffer: o 5% NFM (non fat dry milk) (Biorad, Nazareth Eke, België) o 3% BSA (bovine serum albumine) (Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België)
Wasbuffer: o 0,3% Tween 20 (Sigma-Aldrich BVBA, Diegem, België) o PBS (Oxoid N.V., Erembodegem, België)
3. Kernextract afkomstig van K562 cellen (humaan erythromyeloblast leukemie cellijn) gekweekt in het laboratorium voor klinische biologie van UZ Gent in het centrum voor moleculaire diagnostiek. 4. Immuno-Blot PVDF (polyvinylideenfluoride) / Filter Paper Sandwiches (Biorad, Nazareth Eke, België) 5. Super Signal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific, Erembodegem, België) 23
3.5.2. Methode De 10% resolving gel en 4% stacking gel werden aangemaakt zoals aangegeven in tabel 3.4. Het kernextract (bron van antigenen) werd aangemaakt volgens de methode eerder gerapporteerd in de literatuur (38). Twintig microgram van het kernextract werd 1:2 verdund met staalbuffer en vijf minuten opgekookt. Tabel 3.4. Samenstelling van stacking en resolving gel.
AD 30% (B)AA 1,5M TRIS pH 8,8 0,5M TRIS pH 6,8 10% SDS 10% APS TEMED
4% Stacking gel 6,0 ml 1,33 ml 2,5 ml 100 µl 100 µl 10 µl
10% Resolving gel 3,15 ml 2,67 ml 2 ml 80 µl 160 µl 16 µl
AD, aqua dest; (B)AA, (bis)acrylamide; SDS, sodium dodecylsulphate;APS,ammoniumpersulfaat; TEMED, tetramethylethyleendiamine.
De gels werden in de elektroforesecel geladen en de cel werd gevuld met elektroforesebuffer. Vervolgens werd het verdunde kernextract geladen in de slotjes van de gels. De elektroforese werd uitgevoerd bij 150V gedurende 15 minuten, nadien nog een uur bij 200V.
De
proteïnen
(antigenen)
uit
het
kernextract
werden
geblot
op
een
polyvinylideenfluoride membraan (PVDF membraan) met behulp van de Trans-Blot® TurboTM Cassette. Het blokkeren van de vrije bindingsplaatsen op de blot gebeurde met 5% NFM/3% BSA in PBS (blocking buffer) gedurende een uur bij kamertemperatuur. De membraan werd nadien in strips versneden. De stalen werden 1:100 verdund met blocking buffer en de strips werden overnacht geïncubeerd met het verdund serum.
Na een aantal wasstappen met de wasbuffer werden de strips gedurende een uur geïncubeerd met enzym gemerkt anti-humaan IgG (1:10 000 verdund in wasbuffer, dit is het secundair antilichaam), gevolgd door een laatste wasstap. 24
Met behulp van de 'Super Signal West Dura Extended Duration Substrate' en de 'VersadocTM imaging system' kon het verkregen patroon op de blotjes gevisualiseerd worden. 3.6. DATA-VERWERKING Alle data werden verwerkt met behulp van de programma's IBM® SPSS® versie 21 (SPSS inc., Chicago, IL, USA) en MedCalc versie 12.6.0 (MedCalc Software bvba, Oostende, België).
25
4. RESULTATEN 4.1. DFS70
ANTISTOFDETECTIE:
VERGELIJKING
VAN
DE
VERSCHILLENDE
DETECTIETECHNIEKEN Om de analytische performantie van de verschillende methodes voor de detectie van DFS70 antilichamen na te gaan en te vergelijken werden in totaal 447 stalen (181 HD, 222 consecutieve routinestalen en 44 DC) geanalyseerd met IIF en CLIA. Voor de HD werd gebruik gemaakt van twee verschillende substraten voor IIF analyse, namelijk HEp-2 en HEp2000. Voor de overige stalen werd enkel HEp-2000 gebruikt. Stalen die positief werden bevonden, hetzij op IIF hetzij op CLIA, werden verder uitgewerkt met western blotting ter confirmatie van DFS70 antistofpositiviteit. Vooraleer de digitale beelden van IIF werden geanalyseerd, werd een positief controlestaal (Inova Diagnostics, Inc, San Diego, USA) met DFS70 antistoffen ingezet op HEp2 en HEp-2000 (figuur 4.1.). Op basis van het beeld, gevonden op beide substraten werd het ‘DFS70-like beeld’ per substraat gedefinieerd dat vervolgens werd gebruikt om de verdere stalen te analyseren. Voor HEp-2 zijn de cellen in rust fijn gespikkeld, al dan niet met uitsparingen van de nucleoli. De mitosecellen hebben een sterkere intensiteit dan de cellen in rust en zien er fijn gespikkeld uit. Voor HEp-2000 zijn de cellen in rust fijn gespikkeld, vaak met uitsparingen van de nucleoli, de mitosecellen hebben een sterkere intensiteit en zijn fijn gespikkeld. Een frequentietabel voor de DFS70 antistofpositiviteit per techniek wordt hieronder weergegeven (tabel 4.1.). Tabel 4.1. Frequenties van DFS70 antistofpositiviteit per techniek IIF HEp-2(a)
IIF HEp-2000(b)
CLIA
n
181
447
447
n positief (%)
2 (1,1%)
6 (1,3%)
7 (1,6%)
n,aantal; IIF, indirecte immunofluorescentie; CLIA, chemiluminescentie immunoassay (a) DFS70-like patroon op HEp-2: cellen in rust fijn gespikkeld (al dan niet met uitsparingen van de nucleoli), mitosecellen fijn gespikkeld positief + sterkere intensiteit dan de cellen in rust (b) DFS70-like patroon op HEp-2000: cellen in rust fijn gespikkeld (vaak met uitsparingen van de nucleoli), mitosecellen fijn gespikkeld positief + sterkere intensiteit dan de cellen in rust
26
(a) Controlestaal DFS70 antistoffen op HEp-2 bij dilutie 1:40
Cel in rust
Mitosecel
(b) Controlestaal DFS70 antistoffen op HEp-2000 bij dilutie 1:40
Mitosecel Cel in rust
Figuur 4.1. Definitie van DFS70-like beeld bij 1:40 dilutie op (a) HEp-2 en (b) HEp-2000. Het aantal positieve resultaten voor DFS70 antistoffen op de verschillende testmethodes werd onderling vergeleken aan de hand van kruistabellen (tabel 4.2.) en de overeenkomstige overeenkomst;
Cohens
kappa-waarden
0,61≤κ≤0,80:
substantiële
(κ)
werden
berekend
overeenkomst;
0,41≤κ≤
(κ>0,80:
goede
0,60:
matige
overeenkomst; 0,21≤κ≤ 0,40: redelijke overeenkomst; κ<0,20: zwakke overeenkomst (39)). In totaal werden 9 stalen positief bevonden met IIF en/of CLIA. Zes stalen waren positief op IIF (twee van de zes werden zowel aangetoond op HEp-2 als op HEp-2000, de overige 4 stalen werden enkel op HEp-2000 geanalyseerd), slechts vier hiervan werden bevestigd op CLIA. Daarnaast pikte CLIA drie extra stalen op die op IIF geen suggestief patroon vertoonden (twee stalen hadden een gespikkeld patroon, het derde staal had een cytoplasmatisch patroon). 27
Tabel 4.2. Kruistabellen ter vergelijking van de DFS70 antistof detectiemethoden: (a) vergelijking HEp-2000 met CLIA (b) vergelijking HEp-2 met CLIA (c) vergelijking HEp-2000 met HEp-2. (a)
DFS70 CLIA
negatief positief
Totaal
DFS70-like patroon op Totaal HEp-2000 negatief positief 438 2 440 3 4 7 441 6 447
κ = 0,61 (95% CI 0,30 - 0,92) (b)
DFS70 CLIA
negatief positief
Totaal
DFS70-like patroon op HEp-2 negatief positief 179 0 0 2 179 2
Totaal
DFS70-like patroon op HEp-2000 negatief positief 179 0 0 2 179 2
Totaal
179 2 181
κ = 1,0 (c)
DFS70-like patroon op negatief HEp-2 positief Totaal
179 2 181
κ = 1,0
28
Stalen die positief waren op IIF en/of CLIA (n=9) werden ingezet op western blot ter confirmatie. De western blot beelden van deze stalen zijn terug te vinden in figuur 4.2.
Figuur 4.2. Western blot van de 9 stalen die positief waren op ANA IIF en/of CLIA. Laan 14: IIF+/CLIA+; laan 5-7: IIF-/CLIA+; laan 8-9: IIF+/CLIA-. Een verwachte 70 kDa band compatibel met DFS-70 antistoffen kon enkel worden waargenomen voor de stalen in laan 1-4. Aangezien de beschikbaar gestelde hoeveelheid staal van de anti-DFS70 positieve controle niet voldoende was en extra staal niet tijdig voorhanden was, kon deze niet worden meegenomen in het experiment. Ter controle van de kwaliteit van de western blot werd wel een anti-Scl70 antistofpositief staal meegenomen op laan 10 (bandjes volgens verwachting rond 100kDa (DNA topoisomerase I) en 70 kDa (afbraakproduct)). DFS70 antistoffen zijn gericht tegen LEDGF/p75, hetgeen theoretisch overeenkomt met een 70kDa band op western blot (10, 37). Een duidelijke en scherp afgelijnde 70 kDa band is aanwezig voor laan 1-4. Daarnaast zijn er antistoffen aanwezig tegen antigenen met een ander moleculair gewicht. Voor deze stalen is er een overeenkomst tussen IIF, CLIA en western blotting. Voor de stalen op laan 5 tot en met 7 kan geen duidelijke band worden waargenomen ter hoogte van 70 kDa. Er zijn wel antistoffen aanwezig tegen antigenen met een ander moleculair gewicht. Bijgevolg is er voor deze stalen geen overeenkomst tussen de positiviteit op CLIA en western blotting, hetgeen klopt met de afwezigheid van het DFS70-like patroon op IIF. Voor 29
de stalen in laan 8 en 9 (enkel DFS70-like patroon op IIF, CLIA negatief) ontbreekt eveneens de verwachte 70 kDa band. Zoals in tabel 4.1. weergegeven werd de hoogste detectiefrequentie gezien bij CLIA. Het DFS70-like patroon werd gedetecteerd in 1,1% (n=2/181) van de stalen bij analyse op HEp-2 substraat en in 1,3% (n=6/447) van de stalen bij analyse op HEp-2000. Het nadeel hier is dat voor HEp-2 enkel de HD cohorte werd geanalyseerd (n=2/181). Met behulp van CLIA was 1,6% (n=7/447) DFS70 positief. De detectiefrequenties tussen de verschillende technieken waren niet significant verschillend op 5% significantieniveau (chi kwadraattest). HEp-2 versus HEp-2000 had een p-waarde van 0,8472. Bij HEp-2 versus CLIA en HEp-2000 versus CLIA waren de p-waarden respectievelijk 0,9156 en 0,9240.
4.2. KLINISCHE PERFORMANTIE VAN DE DFS70 ANTISTOFBEPALING Om de klinische performantie van de verschillende methodes voor de detectie van DFS70 antilichamen na te gaan en te vergelijken werd de frequentie van positiviteit binnen de verschillende klinisch goed gedefinieerde cohortes geëvalueerd. De resultaten worden weergegeven in tabel 4.3. Tabel 4.3. DFS70 antistofpositiviteit in functie van de populatie. Anti-DFS70 antistofpositiviteit IIF HEp-2
IIF HEp-2000
CLIA
WB geconfirmeerd
% (n)
% (n)
% (n)
n
HD (n=181)
1,1% (2)
1,1% (2)
1,1% (2)
2
DC (n=44)
n.b.
2,3% (1)
2,3% (1)
1
Consecutief (n=222)
n.b.
1,4% (3)
1,8% (4)
1
n,aantal; n.b., niet bepaald; IIF, indirecte immunofluorescentie; CLIA, chemiluminescentie immunoassay WB, western blot; HD, gezonde donoren; DC, zieke controles.
Twee stalen (1,1%) van de HD cohorte hadden een positief testresultaat voor DFS70 antistoffen op HEp-2(000) en CLIA. Deze stalen werden bevestigd op western blot (cfr. figuur 4.2. bandje bij 70 kDa op laan 1-2). Ook In de DC cohorte was het staal dubbelpositief voor 30
DFS70 antistoffen op HEp-2000 en CLIA. Dit DC staal werd eveneens bevestigd op de western blot (cfr. figuur 4.2. bandje bij 70 kDa op laan 3). Bij de consecutieve routinecohorte was één staal zowel positief op HEp-2000 als positief op CLIA. Enkel dit staal vertoonde een bandje bij 70 kDa op western blot (cfr. figuur 4.2. laan 4). De overige stalen (cfr. figuur 4.2. laan 5-9) die enkel positief waren op HEp-2000 of CLIA werden niet bevestigd met western blot. De detectiefrequentie voor DFS70 antistoffen met behulp van de verschillende technieken was niet significant verschillend tussen de HD cohorte en de DC cohorte (chi kwadraattest, pwaarde bij de vergelijking tussen beide technieken was gelijk aan 0,9122). Ook in de consecutieve cohorte werd een vergelijkbare detectiefrequentie gezien. P-waarden bij de HD cohorte versus de consecutieve routinecohorte op HEp-2000 en CLIA waren gelijk aan 0,8572 en 0,8698 (chi kwadraattest). De p-waarden bij de DC cohorte versus de consecutieve routinecohorte op HEp-2000 en CLIA waren gelijk aan 0,8208 en 0,7009 (chi kwadraattest).
4.3. INVLOED
VAN
DE
INTEGRATIE
VAN
DFS70
ANTISTOFBEPALING
IN
DE
ROUTINECASCADE 4.3.1. DFS70 antistofdetectie in relatie tot andere testen in de ANA/ENA cascade 4.3.1.1.
ANA indirecte immunofluorescentie
Voor alle cohortes werd een ANA IIF bepaling op Hep-2000 uitgevoerd (n=447). Een overzicht van de fluorescentiepatronen van de ANA IIF positieve stalen per cohorte is weergegeven in tabel 4.4. Op de totale cohorte werd 55,9% van de stalen ANA IIF positief bevonden. Zoals verwacht, is de ANA IIF positiviteit bij de HD (29%) significant kleiner dan de ANA IIF positiviteit in de DC (>95%; chi kwadraattest, p-waarde <0,0001) en de consecutieve cohorte (70%; chi kwadraattest, p-waarde < 0,0001). In totaal wordt bij 2,4% van alle ANA positieve stalen een DFS70-like patroon opgepikt. Het patroon komt voor in 3,8% van de ANA IIF positieve HD. Binnen de ANA IIF positieve stalen van de DC cohorte en consecutieve cohorte bedraagt dit respectievelijk 2,4% en 1,9%. Voor de drie subpopulaties is er geen verschil op 5% significantieniveau (chi kwadraattest; HD versus DC, p-waarde = 0,8362; HD versus consecutief, p-waarde = 1,8008 en DC versus consecutief, p-waarde = 0,6779).
31
Tabel 4.4. ANA IIF positiviteit en beschrijving van de fluorescentiepatronen voor de verschillende cohortes.
ANA IIF positief n (%) ANA IIF patronen n (%): homogeen gespikkeld nucleolair centromeer homogeen+SSA homogeen+nucleolair gespikkeld+nucleolair DFS70 like homogeen met spikkels gespikkeld+SSA(a) Andere
HD (n=181) 52 (28,7%)
DC (n=44) 42 (95,5%)
Consecutief (n=222) 156 (70,2%)
Totaal (n=447) 250 (55,9%)
14 (26,9%) 15 (28,8%) 7 (13,5%) 0 (0%) 0 (0%) 4 (7,7%) 3 (5,8%) 2 (3,8%) 3 (5,8%) 0 (0%) 4 (7,7%)
13 (31,0%) 5 (11,9%) 2 (4,8%) 0 (0%) 1 (2,4%) 2 (4,8%) 1 (2,4%) 1 (2,4%) 5 (11,9%) 10 (23,8%) 2 (4,8%)
20 (12,8%) 88 (56,4%) 6 (3,8%) 10 (6,4%) 0 (0%) 5 (3,2%) 3 (1,9%) 3 (1,9%) 14 (9,0%) 4 (2,6%) 3 (1,9%)
47 (18,8%) 108 (43,2%) 15 (6,0%) 10 (4,0%) 1 (0,4%) 11 (4,4%) 7 (2,8%) 6 (2,4%) 22 (8,8%) 14 (5,6%) 9 (3,6%)
HD, gezonde donoren; DC, zieke controles; IIF, indirecte immunofluorescentie; SSA, Sjögren Syndroom antigen A.
4.3.1.2.
Antistoffen tegen extraheerbare nucleaire antigenen
Om het effect van de bepaling van DFS70 antistoffen op de routine cascade in te schatten, is het ook belangrijk te documenteren of deze antistoffen ook samen voorkomen met de andere klassieke ENA reactiviteiten. Daarom werd anti-ENA bepaald met behulp van EliA symphony® op 366 van de 447 stalen (exclusie van de 81 HD afkomstig van de gezondheidswerkers in laboratorium voor klinische biologie van het UZ Gent). Globaal werd 15,6% van de stalen anti-ENA positief bevonden (n=57). DFS70 antistoffen op CLIA werden gevonden in 1,8% van deze anti-ENA positieve stalen (n=1, laantje 5 in figuur 4.2.). Van de 366 stalen was 84,4% anti-ENA negatief (n=309). DFS70 antistoffen op CLIA werd gevonden in 1,6% van de anti-ENA negatieve stalen (n=5, laantjes 1, 4-3 en 6-7 in figuur 4.2.). Van de ENA positieve stalen (n=57) was geen enkel staal zowel positief met IIF als CLIA. Bij de ENA negatieve stalen (n=309) was 1% (n=3) IIF/CLIA dubbel positief (laantjes 1,3 en 4 in figuur 4.2.). De detectiefrequentie voor DFS70 antistoffen was niet significant verschillend in ENA positieve groep en de ENA negatieve groep (chi kwadraattest, pwaarde=0,6514). 32
4.3.2. Invloed van de integratie van DFS70 antistofdetectie in de ANA/ENA cascade In figuur 4.3. wordt de cascadetesting die gebruikt wordt in het laboratorium voor klinische biologie van het UZ Gent weergegeven (cfr. 1.4.). In deze figuur duiden de zwarte pijlen mogelijke posities aan waar de opsporing van DFS70 antistoffen theoretisch zinvol zou kunnen zijn. De pijlen met cijfer 1 stellen voor om DFS70 antistoffen te detecteren voorafgaand (IIF patroon [groen] of CLIA [rood]) aan de EliA symphony®. Dit zou kostenbesparend kunnen zijn. De pijl met cijfer 2 stelt voor om DFS70 antistoffen pas op te sporen indien stalen negatief testen op de EliA symphony® [paars]. Deze strategie zou voornamelijk een bijdrage kunnen leveren in de verklaring voor de aanwezigheid van het ANA fluorescentiepatroon. Het effect op de klinische performantie en de kost van de verschillende mogelijkheden worden hieronder besproken. De berekeningen werden uitgevoerd op basis van de resultaten van de consecutieve cohorte (n=222). De verdeling van deze stalen over de cascade zoals heden toegepast in het UZ Gent is aangeduid op figuur 4.3.
De kostprijsberekeningen gebeurden op basis van volgende kosten per analyse: IIF € 10, ENA (EliA symphony®) € 15 en anti-DFS70 CLIA € 11. Zonder integratie van DFS70 detectie is de gemiddelde kost per staal in het huidige UZ Gent algoritme gelijk aan € 20,50 (zwart in figuur 4.3., berekening zie tabel 4.5.). Tabel 4.5. kostenberekening per staal zonder integratie van DFS70 antistofdetectie.
Test IIF negatief IIF positief/ENA Totaal Gemiddeld per staal
n
berekening kost (€ ) 66 66*10 660 156 156*10 1560 156*15 2340 222
4560 20,50
n, aantal; IIF, indirecte immunofluorescentie (€ 10); ENA, extraheerbare nucleaire antigenen (€ 15)
33
Figuur 4.3. Algoritme gebruikt in het UZ Gent. De zwarte pijlen duiden mogelijke posities aan waar de DFS70 antistoffen kunnen worden opgespoord. Pijlen met cijfer 1: DFS70 antistoffen worden opgespoord voorafgaand aan ELiA Symphony®. Pijl met cijfer 2: DFS70 antistoffen worden opgespoord na negatief testresultaat op de ELiA Symphony®.
4.3.2.1.
Pijlen met cijfer 1: "opsporen van DFS70 antistoffen voorafgaand aan
EliA symphony®" De eerste fase in het algoritme is ANA IIF op HEp-2000. Van de 222 consecutieve stalen zijn er 156 stalen ANA positief. Enkel deze 156 stalen zullen in de volgende fase van het algoritme verder geanalyseerd worden. Volgens de pijlen met cijfer 1 (cfr. figuur 4.3.) is de volgende fase het detecteren van DFS70 antistoffen. De detectie van DFS70 antistoffen op dit niveau kan op twee manieren gebeuren, namelijk met IIF op HEp-2000 (herkenning van het DFS70-like patroon) of met CLIA.
34
In het geval geopteerd wordt om te werken met het patroon (groen in figuur 4.3.), zullen de 3 stalen met een DFS70-like patroon niet verder worden uitgewerkt in de cascade. De resterende stalen worden verder geanalyseerd met EliA Symphony® (n=153). Hiervan zijn 25 stalen anti-ENA positief. Geen van de stalen met het DFS70-like patroon is anti-ENA positief. Op basis hiervan kan worden besloten dat door het invoegen van IIF DFS70-like patroon als exclusiemaat voor verdere analyse geen anti-ENA positieve stalen gemist worden. De gemiddelde kost per staal bij deze integratie van DFS70 antistofdetectie bedraagt € 20,30 (berekening zie tabel 4.6.). Tabel 4.6. Berekening invloed op kost bij integratie van DFS70 antistofdetectie aan de hand van het DFS70-like fluorescentiepatroon.
Test IIF negatief IIF positief/DFS70-like positief IIF positief/DFS70-like negatief/ENA Totaal Gemiddeld per staal
n
berekening kost (€ ) 66 66*10 660 3 3*10 30 153 153*15 2295 152*10 1530 222 4515 20,30
n, aantal: IIF, indirecte immunofluorescentie (€ 10); ENA, extraheerbare nucleaire antigenen (€ 15); DFS70, dense fine speckels 70
De tweede mogelijkheid (rood in figuur 4.3.) voor de DFS70 antistofdetectie is aan de hand van CLIA op de 156 ANA IIF positieve stalen. Hiervan zijn er vier stalen anti-DFS70 positief. Hieruit volgt dat er 152 stalen in de volgende fase op EliA symphony® moeten worden geplaatst, waarvan er 25 stalen anti-ENA positief zijn. Van de vier stalen met antiDFS70 antistofpositiviteit op CLIA is er 1 staal zwak positief op EliA Symphony®. Verdere analyse op een lijn immunoassay (INNO-LIA ANA Update, Innogenetics NV, Zwijnaarde, België) kon echter geen specifieke reactiviteit aantonen. Dus ook door het invoegen van DFS70 antistofdetectie met behulp van CLIA als exclusiemaat voor verdere analyse, wordt finaal geen anti-ENA positief staal gemist. De gemiddelde kost per staal bedraagt € 28,00 (berekening zie tabel 4.7.).
35
Tabel 4.7. Berekening invloed op kost bij integratie van DFS70 antistofdetectie aan de hand van CLIA. Test IIF positief IIF positief/CLIA positief IIF positief/CLIA negatief/ENA
Totaal Gemiddeld per staal
n
berekening kost (€ ) 66 66*10 660 4 4*11 44 4*10 40 152 152*10 1520 152*11 1672 152*15 2280 222 6216 28,00
n, aantal; IIF, indirecte immunofluorescentie (€ 10); ENA, extraheerbare nucleaire antigenen (€ 15); CLIA, chemiluminescentie immunoassay (€ 11)
4.3.2.2.
Pijl met cijfer 2: "opsporen van DFS70 antistoffen na negatieve ELiA
symphony®" De pijl met cijfer 2 in figuur 4.3. stelt voor om DFS70 antistoffen te detecteren bij stalen die een negatief testresultaat hebben met EliA symphony® (paars in figuur 4.3.). Van de 156 ANA IIF positieve stalen hadden 131 stalen een negatief testresultaat op EliA symphony® (anti-ENA negatief). Na analyse met CLIA werden bij twee stalen DFS70 antilichamen gedetecteerd. Deze extra DFS70 antistofdetectie kan slechts voor 1,5% (n=2/131) van de ANA IIF positieve/anti-ENA negatieve stalen een verklaring bieden. De gemiddelde kost per staal bedraagt € 27,00 (berekening zie tabel 4.8.).
36
Tabel 4.8. Berekening invloed op kost bij integratie van DFS70 antistofdetectie aan de hand van CLIA na negatief testresultaat op EliA symphony®. Test IIF negatief IIF positief/ENA negatief/CLIA negatief
IIF positief/ENA negatief/CLIA positief
IIF positief/ENA positief Totaal Gemiddeld per staal
n 66 129
2
25 222
berekening 66*10 129*10 129*15 129*11 2*10 2*15 2*11 25*10 25*15
kost (€ ) 660 1290 1935 1419 20 30 22 250 375 6001 27,00
n, aantal; IIF, indirecte immunofluorescentie (€ 10); ENA, extraheerbare nucleaire antigenen (€15); CLIA, chemiluminescentie immunoassay (€ 11)
4.4. SAMENVATTING VAN DE ANALYSES In figuur 4.4. wordt nog een kort overzicht gegeven welke cohortes met welke testen zijn geanalyseerd.
Figuur 4.4. Overzicht van de analyses. Rood duidt aan welke stalen ENA positief zijn, groen ENA negatief, zwart zijn de stalen die geen ENA bepaling hebben ondergaan. 37
5. DISCUSSIE De algemene doelstelling van deze masterproef is het bepalen van de meerwaarde van DFS70 antistofdetectie in de routinematige uitwerking van ANA positiviteit. Hiervoor werd in een eerste fase nagegaan welke techniek het best is om DFS70 antistoffen op te sporen. Detectie met IIF op twee substraten, namelijk HEp-2 en HEp-2000, werd vergeleken met CLIA. De hoogste detectiefrequentie voor DFS70 antistofpositiviteit werd gezien bij CLIA (1,6%, cfr. tabel 4.1.). De vergelijking van de detectie van DFS70 antistoffen aan de hand van het DFS70-like patroon op HEp-2000 en CLIA, toonde een substantiële overeenkomst tussen beide technieken (κ-waarde=0,61 [95% CI 0,30-0,92]) (cfr. tabel 4.2.). Dit is lager dan wat in de studie van Miyara et al. werd gerapporteerd. Daar werd een κ-waarde van 0,88 (95% CI 0,81-0,95) en dus een goede overeenkomst gevonden tussen DFS70-like patroon op HEp2000 en CLIA (40). De overeenkomst tussen IIF op HEp-2 en CLIA en tussen beide IIF substraten was perfect (κ=1). Een beperking van de studie is dat enkel de HD cohorte en dus slechts 181 van de 447 stalen op HEp-2 werden geanalyseerd. De stalen die anti-DFS70 antistof positief waren op IIF en/of CLIA (n=9) werden met western blot geanalyseerd om de aanwezigheid van deze antistoffen te confirmeren (cfr. figuur 4.2.). Voor DFS70 antistoffen werd een bandje verwacht ter hoogte van 70 kDa (10, 37). Dit bandje werd slechts duidelijk bij vier stalen met dubbelpositiviteit (IIF en CLIA positief) teruggevonden (laan 1-4). Daarnaast werden bij alle stalen (laan 1-9) bandjes gezien ter hoogte van 60-65 kDa. Opvallend was ook dat laan 6 een bijkomende sterke band vertoonde rond 50-55 kDa. Verder onderzoek is nodig om na te gaan of dit wijst op de aanwezigheid van auto-antistoffen tegen afbraakproducten van DFS70 die een moleculair gewicht hebben van 58 kDa en 65 kDa of tegen de alternatieve splicing variant van DFS70, namelijk p52 (41). In de tweede fase werd de klinische performantie van de technieken onderzocht (cfr. 4.2.). Hiervoor werd de frequentie van anti-DFS70 antistofpositiviteit binnen de klinisch goed gedefinieerde cohortes nagegaan (cfr. tabel 4.3.). Zoals verwacht (cfr. tabel 4.4.), was de ANA IIF positiviteit significant lager in de HD cohorte (29%) dan in de DC cohorte (>95%) en stemden de percentages overeen met wat in de literatuur gerapporteerd wordt (7). Het DFS70-like patroon komt voor in 1,1% van de HD en 3,8% van de ANA positieve HD. Eerdere 38
studies rapporteerden een hogere prevalentie, namelijk 22% van alle gezonde bloeddonoren in de studie van Yamada et al. (42) en 54% bij de ANA positieve gezonde ziekenhuismedewerkers (10). Deze hoge percentages werden wel ontkracht in de studie van Ochs et al. waar geen DFS70 antistoffen gevonden werden bij 39 gezonde controles (37). Binnen de DC cohorte, bestaande uit SLE patiënten, werd het DFS70-like patroon gevonden bij 2,4% van de ANA positieve stalen. Dit percentage stemt overeen met de prevalentie gerapporteerd door Watanabe et al.: 2% van de SLE patiënten had DFS70 antistoffen op IIF HEp-2 (10) en met de data van Mahler et al., namelijk 3% (geanalyseerd met CLIA) (31). Een iets hoger percentage aan DFS70 antistoffen werd gevonden in de studie van Muro et al., 6% van de SLE patiënten had DFS70 antistoffen op IIF HEp-2 (29). In deze masterproef waren de prevalenties van het DFS70-like patroon op HEp-2000 in de HD cohorte en de DC cohorte niet significant verschillend. Dit in tegenstelling tot de studie van Mahler et al. (p-waarde <0,001) (31) en Watanabe et al. (p-waarde<0,002) (10). In de consecutieve routinecohorte van deze masterproef werd voor het DFS70-like patroon een prevalentie van 1,9% op de ANA positieve stalen teruggevonden. Dit is heel wat lager dan de resultaten van Dellavance et al. Die studie kon bij 30% van de ANA positieve consecutieve routinestalen het DFS70-like patroon onderscheiden (13). Andere studies tonen een lagere prevalentie die vergelijkbaar is met deze teruggevonden in de consecutieve routine cohorte van het UZ Gent. In de studie van Miyara et al. werd in de vergelijkingsgroep, bestaande uit 100 consecutieve ANA positieve stalen, een prevalentie van 3% voor het DFS70-like patroon gedetecteerd (40). In de studie van Mahler et al. had ongeveer 2% van de routinestalen een DFS70-like patroon (31). Eén studie vond een lagere prevalentie (0,8% had DFS70-like patroon) in de onderzochte consecutieve routinecohorte (32). In het kader van reflextesting is het belangrijk te weten of DFS70 antistoffen steeds geïsoleerd voorkomen. Met behulp van EliA symphony® werd anti-ENA positiviteit opgespoord. Van de 57 anti-ENA positieve stalen had 1 staal (1,8%) een positief testresultaat voor DFS70 antistoffen op CLIA. Verdere analyse van dit staal met lijn immunoassay kon geen specifieke reactiviteit aantonen. Dit komt overeen met een studie die de aanwezigheid van DFS70 antistoffen in relatie tot de aanwezigheid van andere ziektegerelateerde antistoffen bij CTD patiënten onderzocht. Van de onderzochte CTD populatie had 4% DFS70 39
antistoffen naast antistoffen tegen volgende antigenen: Sm, cardiolipine, SSA, SSB, U1-RNP, Scl-70, centromeer, dubbelstrengig DNA en enkelstrengig DNA (29). DFS70 antistoffen zijn bijgevolg niet mutueel exclusief voor het vinden van andere ENA reactiviteiten. Tot slot werd de invloed van de integratie van DFS70 antistofdetectie in de ANA/antiENA cascade onderzocht op basis van de resultaten van de consecutieve routinecohorte (cfr. 4.3.2.). Wanneer in het algoritme geopteerd wordt voor integratie van DFS70 antistofdetectie, zijn er twee mogelijkheden: integratie van DFS70 antistofdetectie voor of na de ANA screenings enzyme immunoassay (EliA symphony®). In de eerste optie worden, na de initiële ANA IIF screening, DFS70 antistoffen opgespoord aan de hand van het ANA IIF patroon of CLIA. Stalen die anti-DFS70 antistof positief zijn, worden geëxcludeerd uit het algoritme. Deze eerste mogelijkheid met detectie van DFS70 antistoffen aan de hand van het fluorescentiepatroon, had een gemiddelde kostprijs van € 20,30 per staal. Zonder integratie van DFS70 antistofdetectie is de gemiddelde kostprijs per staal € 20,50. Dit zou slechts € 0,20 per staal uitsparen ten opzichte van de originele ANA/anti-ENA cascade gebruikt in het laboratorium voor klinische biologie van het UZ Gent. Het dient wel opgemerkt te worden dat door het invoegen van het IIF DFS70-like patroon als exclusiemaat voor verdere analyse geen anti-ENA positieve stalen werden gemist. Alternatief kan ook CLIA worden gebruikt voor de detectie van DFS70 antistoffen (al dan niet voor of na de ANA screening enzyme immunoassay). Maar omdat er in deze masterproef weinig DFS70 antistoffen werden gevonden in combinatie met de meerkost voor de CLIA, was het gebruik van CLIA in de cascade niet kostenbesparend (gemiddelde kostprijs per staal bedroeg meer dan € 27,00). Ook bij deze manier van integreren werd finaal geen anti-ENA positief staal gemist op de consecutieve routinecohorte (n=222). In de DC cohorte echter, werd bij een staal zowel het DFS70-like patroon als een positief testresultaat voor CLIA opgepikt. Dit staal zou bijgevolg niet verder routinematig geanalyseerd worden en dus als vals negatief gerapporteerd worden naar de aanvragende arts. Bij de tweede optie heeft het inpassen van de DFS70 antistofdetectie bij ANA IIF positieve/anti-ENA negatieve stalen voornamelijk de bedoeling om bij te dragen in een verklaring van het ANA IIF patroon na een negatief testresultaat op EliA symphony®. Voor 1,5% van de ANA IIF positieve/anti-ENA negatieve stalen kon DFS70 antistofpositiviteit een verklaring geven voor het opgemerkte patroon. Dit algoritme zou daarom wel (in beperkte 40
mate) indirect kostenbesparend kunnen zijn. Hiermee wordt bedoeld dat wanneer een arts de ANA/anti-ENA cascade voor een bepaalde patiënt op korte termijn voor een tweede keer zou aanvragen, deze cascade overbodig zou zijn aangezien enkel DFS70 antistoffen werden gevonden voor deze patiënt bij de eerste aanvraag. Echter, op lange termijn (bijvoorbeeld na twee jaar) kunnen zich nieuwe relevante antistoffen ontwikkelen.
41
6. CONCLUSIE In de literatuur wordt gesuggereerd dat het vinden van dense fine speckles (DFS) 70 antistoffen kan gebruikt worden voor het uitsluiten van de diagnose van autoimmuunziekten (CTD) (10, 27, 29, 33). Deze suggestie was gebaseerd op de resultaten van deze studies die geïsoleerde DFS70 antistofpositiviteit voornamelijk terugvonden bij gezonde donoren. In deze masterproef werd geen statistisch significant verschil gevonden tussen de prevalentie van DFS70 antistoffen bij gezonde donoren en bij CTD patiënten. Bovendien kwamen DFS70 antistoffen ook voor bij extraheerbare nucleaire antigenen (ENA) positieve stalen, dit zelfs in dezelfde grootteorde als bij de ENA negatieve stalen. Omwille van het risico om belangrijke anti-ENA positieve stalen te missen, kunnen DFS70 antistoffen niet gebruikt worden om te sturen in de antinucleaire antilichamen (ANA)/anti-ENA routinecascade. Bijgevolg kunnen DFS70 antistoffen niet aangewend worden als biomerker om de diagnose van CTD uit te sluiten. Bovendien was de integratie van DFS70 antistofbepaling in de ANA/anti-ENA routinecascade niet kostenbesparend wegens de lage prevalentie aan DFS70 antistoffen in deze masterproef. Omwille van deze bovenstaande redenen is het voor de studiepopulatie van deze masterproef zinloos om de DFS70 antistofdetectie te integreren in de routinematige uitwerking van ANA/anti-ENA bepaling.
42
7. LITERATUURLIJST 1. Almeida Gonzalez D, Cabrera de Leon A, Rodriguez Perez Mdel C, Brito Diaz B, Gonzalez Hernandez A, Garcia Garcia D, et al. Efficiency of different strategies to detect autoantibodies to extractable nuclear antigens. Journal of immunological methods. 2010;360:89-95. 2. Damoiseaux JG, Tervaert JW. From ANA to ENA: how to proceed? Autoimmunity reviews. 2006;5:10-7. 3. Matsushita T, Hasegawa M, Fujimoto M, Hamaguchi Y, Komura K, Hirano T, et al. Clinical evaluation of anti-aminoacyl tRNA synthetase antibodies in Japanese patients with dermatomyositis. The Journal of rheumatology. 2007;34:1012-8. 4. Gonzalez DA, Leon AC, Varela AR, Garcia MG, Rahola Mde S, Perez Mdel C, et al. Autoantibody detection with indirect immunofluorescence on HEp-2 cells: starting serum dilutions for systemic rheumatic diseases. Immunology letters. 2011;140:30-5. 5. Sack U, Conrad K, Csernok E, Frank I, Hiepe F, Krieger T, et al. Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 2009;1173:166-73. 6. American College of Rheumatology Ad Hoc Committee on Immunologic Testing G. 1997 Update of the 1982 American College of Rheumatology Revised Criteria for Classification of Systemic Lupus Erythematosus. 1997. 7. Kavanaugh A, Tomar R, Reveille J, Solomon DH, Homburger HA. Guidelines for clinical use of the antinuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. American College of Pathologists. Archives of pathology & laboratory medicine. 2000;124:71-81. 8. Op De Beeck K, Vermeersch P, Verschueren P, Westhovens R, Marien G, Blockmans D, et al. Antinuclear antibody detection by automated multiplex immunoassay in untreated patients at the time of diagnosis. Autoimmunity reviews. 2012;12:137-43. 9. Solomon DH, Kavanaugh AJ, Schur PH, American College of Rheumatology Ad Hoc Committee on Immunologic Testing G. Evidence-based guidelines for the use of immunologic tests: antinuclear antibody testing. Arthritis and rheumatism. 2002;47:434-44. 10. Watanabe A, Kodera M, Sugiura K, Usuda T, Tan EM, Takasaki Y, et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis and rheumatism. 2004;50:892-900. 11. Ulvestad E, Kanestrom A, Madland TM, Thomassen E, Haga HJ, Vollset SE. Evaluation of diagnostic tests for antinuclear antibodies in rheumatological practice. Scandinavian journal of immunology. 2000;52:309-15. 12. Peene I, Meheus L, Veys EM, De Keyser F. Detection and identification of antinuclear antibodies (ANA) in a large and consecutive cohort of serum samples referred for ANA testing. Annals of the rheumatic diseases. 2001;60:1131-6. 13. Dellavance A, Viana VS, Leon EP, Bonfa ES, Andrade LE, Leser PG. The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern. The Journal of rheumatology. 2005;32:2144-9. 14. Hoffman IE, Peene I, Veys EM, De Keyser F. Detection of specific antinuclear reactivities in patients with negative anti-nuclear antibody immunofluorescence screening tests. Clinical chemistry. 2002;48:2171-6. 15. Keech CL, Howarth S, Coates T, Rischmueller M, McCluskey J, Gordon TP. Rapid and sensitive detection of anti-Ro (SS-A) antibodies by indirect immunofluorescence of 60kDa Ro HEp-2 transfectants. Pathology. 1996;28:54-7. 43
16. Gonzalez C, Garcia-Berrocal B, Perez M, Navajo JA, Herraez O, Gonzalez-Buitrago JM. Laboratory screening of connective tissue diseases by a new automated ENA screening assay (EliA Symphony) in clinically defined patients. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 2005;359:109-14. 17. Van Praet JT, Vander Cruyssen B, Bonroy C, Smith V, Delanghe J, De Keyser F. Validation of a new screening strategy for anti-extractable nuclear antigen antibodies. Clinical and experimental rheumatology. 2009;27:971-6. 18. Op De Beeck K, Vermeersch P, Verschueren P, Westhovens R, Marien G, Blockmans D, et al. Detection of antinuclear antibodies by indirect immunofluorescence and by solid phase assay. Autoimmunity reviews. 2011;10:801-8. 19. Bonroy C, Verfaillie C, Smith V, Persijn L, De Witte E, De Keyser F, et al. Automated indirect immunofluorescence antinuclear antibody analysis is a standardized alternative for visual microscope interpretation. Clinical chemistry and laboratory medicine : CCLM / FESCC. 2013:1-9. 20. Jaskowski TD, Schroder C, Martins TB, Mouritsen CL, Litwin CM, Hill HR. Screening for antinuclear antibodies by enzyme immunoassay. American journal of clinical pathology. 1996;105:468-73. 21. Bradwell AR, Hughes RG. Atlas of HEp-2 patterns and laboratory techniques. 3th ed2007. 22. Burtis CA. Tietz fundamentals of clinical chemistry. 6th ed. St. Louis, Mo.: Saunders/Elsevier; 2008. 952 p. 23. Lothar Thomas MD. Clinical laboratory diagnostics: use and assessment of clinical results. 1st ed1998. 1527 p. 24. Spinola SM, Cannon JG. Different blocking agents cause variation in the immunologic detection of proteins transferred to nitrocellulose membranes. Journal of immunological methods. 1985;81:161-5. 25. Peene I. Autoantibodies in rheumatology practice: relevance for diagnosis and associations with clinical features. Ghent: Ghent University; 2004. 26. Ochs RL, Stein TW, Jr., Peebles CL, Gittes RF, Tan EM. Autoantibodies in interstitial cystitis. The Journal of urology. 1994;151:587-92. 27. Mahler M, Fritzler MJ. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clinical & developmental immunology. 2012;2012:494356. 28. Ganapathy V, Casiano CA. Autoimmunity to the nuclear autoantigen DFS70 (LEDGF): what exactly are the autoantibodies trying to tell us? Arthritis and rheumatism. 2004;50:6848. 29. Muro Y, Sugiura K, Morita Y, Tomita Y. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 2008;17:171-6. 30. Mariz HA, Sato EI, Barbosa SH, Rodrigues SH, Dellavance A, Andrade LE. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis and rheumatism. 2011;63:191-200. 31. Mahler M, Parker T, Peebles CL, Andrade LE, Swart A, Carbone Y, et al. AntiDFS70/LEDGF antibodies are more prevalent in healthy individuals compared to patients with systemic autoimmune rheumatic diseases. The Journal of rheumatology. 2012;39:210410. 44
32. Bizzaro N, Tonutti E, Visentini D, Alessio MG, Platzgummer S, Morozzi G, et al. Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects. Annals of the New York Academy of Sciences. 2007;1107:174-83. 33. Mahler M, Hanly JG, Fritzler MJ. Importance of the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells and anti-DFS70 antibodies for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Autoimmunity reviews. 2012;11:642-5. 34. Zenit Up, automated micro-plate and slide processor. User manual. A. Menarini Diagnostics. 35. Bossuyt X, Cooreman S, De Baere H, Verschueren P, Westhovens R, Blockmans D, et al. Detection of antinuclear antibodies by automated indirect immunofluorescence analysis. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 2013;415:101-6. 36. INOVA Diagnostics I. QUANTA Flash DFS70. 2012. 37. Ochs RL, Muro Y, Si Y, Ge H, Chan EK, Tan EM. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. The Journal of allergy and clinical immunology. 2000;105:1211-20. 38. Van Praet JT, Van Steendam K, Smith V, De Bruyne G, Mimori T, Bonroy C, et al. Specific anti-nuclear antibodies in systemic sclerosis patients with and without skin involvement: an extended methodological approach. Rheumatology. 2011;50:1302-9. 39. Moor GD, Maele GV. Inleiding tot de biomedische statistiek. 1st ed. Leuven: Acco; 2008. 40. Miyara M, Albesa R, Charuel JL, El Amri M, Fritzler MJ, Ghillani-Dalbin P, et al. Clinical phenotypes of patients with anti-DFS70/LEDGF antibodies in a routine ANA referral cohort. Clinical & developmental immunology. 2013;2013:703759. 41. Ganapathy V, Daniels T, Casiano CA. LEDGF/p75: a novel nuclear autoantigen at the crossroads of cell survival and apoptosis. Autoimmunity reviews. 2003;2:290-7. 42. Yamada K, Senju S, Shinohara T, Nakatsura T, Murata Y, Ishihara M, et al. Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH. Immunology letters. 2001;78:161-8.
URL-LIJST: 1. http://drugline.org/medic/term/indirect-immunofluorescence-assay/ (15/03/2013) 2. http://www.innogenetics.com/fotos/INNO_LIA_ANA_Update_CE.pdf (18/04/2013) 3. http://www.menarinidiagnostics.nl/Producten/Autoimmunity/Zenit-UP (02/04/2013) 4. http://www.menarinidiagnostics.nl/Producten/Autoimmunity/Zenit-GSight/Fotogalerij (02/04/2013) 5. http://www.inovadx.com/store/products/bio-flashr-instrument/422?pid=13 (14/04/2013)
45
BIJLAGE: INTERNATIONALISATION AT HOME VERSLAG LEZING 1: Biedt het kiwimodel een oplossing voor de financiële problemen van de sociale zekerheid? (Dirk Van Duppen). De overheid vertrekt vanuit een wetenschappelijke behoefte-analyse en kiest op basis van objectieve wetenschappelijke criteria en evidence based medicine studies de beste geneesmiddelen. Dit gebeurt via een onafhankelijke wetenschappelijke commissie. De overheid gebruikt de gezamenlijke koopkracht van de gemeenschap (de ziekteverzekering) om via een openbare offerte-aanvraag de beste voorwaarden op te stellen. Dit alles omvat het kiwimodel. Het kiwimodel maakt de keuze van beste geneesmiddel vooraf. Hierdoor kan de arts niet meer beïnvloed worden door farmaceutische bedrijven en zal de marketing van medicijnen verdwijnen. Via openbare aanbesteding is er concurrentie voor de laagste prijs (tot 90% goedkoper). Van de nieuwe geneesmiddelen is 85% een 'me too' geneesmiddel. Me too's worden gebruikt om het patent van een bedrijf te verlengen. Door de hype van het kiwimodel kende het geneesmiddelenbudget in 2005-2006 voor het eerst een absolute daling van 40 miljoen euro. In België werden er door minister Onkelinx de zogenaamde Kiwi-light maatregelen ingevoerd. Het kiwimodel lijkt een mogelijke oplossing voor te dure geneesmiddelen, maar het geld dat ze daarop besparen zou kunnen gebruikt worden voor een ander vergoedingssysteem van apotheker. VERSLAG LEZING 2: Registration of new vaccins in the EU: Not an easy task (Pieter Neels). De registratie van vaccins is een zeer ingewikkelde procedure. Vaccinatie werd ontdekt door Edward Jenner in de 18de eeuw, hij deed onderzoek naar pokken. Een volgend belangrijk persoon was Louis Pasteur die een eeuw later een vaccin uitbracht tegen rabiës. Sindsdien kwamen er steeds meer vaccins tegen allerlei infectieziekten. Vaccins zijn van groot belang omdat ze veel onnodige dodelijke slachtoffers voorkomen. De huidige kennis over het immuunsysteem, de pathologie en biotechnologie groeit nog steeds en maakt het mogelijk om steeds nieuwe vaccins te ontwikkelen. Het ideale vaccin is 100% effectief, veilig, goedkoop, geeft levenslange bescherming en moet slechts op een eenvoudige manier eenmalig toegediend worden. Vaccins zijn een klasse apart binnen de geneesmiddelengroep. Ze worden voornamelijk toegediend aan gezonde individuen, meestal op jonge leeftijd. Het doel van een vaccin is de preventie van ziekte, niet genezing. De doeltreffendheid van een vaccin is belangrijker en beter dan de werkzaamheid, dit maakt de vaccins zo speciaal. Door zoveel mogelijk individuen te vaccineren, ontstaat kudde-immuniteit. Hierdoor is de kans dat een niet-gevaccineerd individu ziek wordt minimaal. De lezing was interessant maar niet echt nuttig voor ons publiek. We zijn apothekers in opleiding en ik veronderstel dat niemand meer moet overtuigd worden van het belang van vaccinatie. VERSLAG LEZING 3: Innovating for a better and sustainable healthcare (Rudi Pauwels). De lezing begon met de diagnose van de huidige gezondheidszorg die op dit ogenblik niet gezond is. De levensverwachting is in de laatste 20 tot 35 jaar enorm gestegen. Men kan verwachten dat de kosten voor de gezondheidszorg enorm zullen stijgen. Een ander huidig probleem is dat niet alle geneesmiddelen werken. Het principe "one size fits all" loopt op zijn einde. Elk individu in de populatie heeft in het DNA variaties van gemeenschappelijke kenmerken. Geneesmiddelen moeten
geïndividualiseerd worden om optimaal te kunnen werken. Ook de rol van biomerkers groeit en er is een groeiende complicatie tussen behandeling en diagnose. Huidige laboratoria om biomerkers te testen zijn gelimiteerd in standaardisatie, hebben een tekort aan technisch personeel, tijd,... Daarom werd iets nieuws ontworpen, namelijk "next generation (M)Dx platforms". Deze zijn gestandaardiseerd, er kan een breed spectrum aan stalen op geanalyseerd worden, ze zijn eenvoudig in gebruik, kosten-effectief en nemen weinig plaats in. Het was een zeer interessante lezing omdat ze heel toekomstgericht was en omdat er al oplossingen werden voorgesteld voor toekomstige problemen in de huidige gezondheidsmaatschappij. VERSLAG LEZING 4: Hospital admissions related to medication (Patricia van den Bemt). Geneesmiddelen kunnen schade veroorzaken bij de patiënt. Intrinsiek door de eigenschappen van het geneesmiddel, elk geneesmiddel heeft bijwerkingen (ADR, adverse drug reactions). Deze schade kan niet voorkomen worden. Ook extrinsiek kan schade veroorzaakt worden door het geneesmiddelgebruik, bijvoorbeeld bij het gebruik van een verkeerde dosis (ADE, adverse drug events). Dit kan wel voorkomen worden. In de literatuur worden deze termen vaak verkeerdelijk gebruikt. De studieopzet van de HARM (Hospital Admissions Related to Medication) studie werd uitgelegd. De studie had als doel de frequentie van en de mogelijke te voorkomen medicatiegerelateerde ziekenhuisopnames in Nederland te bepalen. Conclusie uit deze studie was dat 5,6% van de acute ziekenhuisopnames te wijten wa s aan geneesmiddelen, bijna 50% daarvan kon voorkomen worden. Als gevolg van deze resultaten werd een tweede studie opgericht, PHARM (Preventing Hospital Admissions by Reviewing Medication). Gedurende een jaar werd het medicatiegebruik per patiënt beoordeeld, dit gebeurde in samenwerking met artsen en apothekers. Oudere patiënten die minstens vijf geneesmiddelen gebruiken en lijden aan minstens vijf comorbiditeiten kunnen voordeel halen uit deze multidisciplinaire evaluatie van hun medicatie. In deze studie werd een significante daling van medicatiegerelateerde schade gezien. Een laatste studie was de "High 5's Netherlands" waarbij patiënten boven de 65 jaar in de studie werden opgenomen. Hierbij kon besloten worden dat controle op het geneesmiddelgebruik een daling gaf in het aantal ongewenste effecten ten gevolge van medicatie. De lezing toonde een mooie rol voor apothekers. De medicatie opvolgen van patiënten kan schade ten gevolge van verkeerd medicatiegebruik voorkomen.
