Daganat immunterápia molekuláris markereinek tanulmányozása biofizikai módszerekkel. Áramlási és képalkotó citometria Szöllősi János, Vereb György Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet Orvos- és Egészségtudományi Centrum DEBRECENI EGYETEM Debrecen, 2007
Sejtanalitikai Munkacsoport • Szöllősi János
• Kárász Andrea
• Nagy Péter
• Tóth Enikő
• Vereb György
• Ujlaky-Nagy László
• Horváth Gábor
• Szöőr Árpád
• Roszik János
• Fábián Ákos
• Krekk Zsuzsanna
• Friedländer Elza
• Lisboa Duarte
• Szabó Ágnes
• Barok Márk
KÉPELEMZŐ CITOMETRIA CLSM – CORE FACILITY Gerjesztés:
Ar ion 350-360 Ar ion 458 / 477 / 488 / 514 HeNe 543 HeNe 633
Emisszió (LSM):
3 PMT 1 dióda array (spektrális kép)
Emisszió (FCS):
2 APD
ÁRAMLÁSI CITOMETRIA NAGY SEBESSÉGŰ SEJTVÁLOGATÁS, MEDIUM/HIGH THROUGHPUT MÉRÉS BD FACSDiVa
Gerjesztések: 6 detektor
BD FACSArray
Ar ion 350-360 / 488 Dióda 532 HeNe 633
Gerjesztések:
Dióda 532 Dióda 635
6 detektor 96-well plate formátum
Alkalmazások IMAGE
FLOW Immunfluoreszcencia
Kitapadó, kitapasztott
Sejtek
szuszpenzióban
Metszetek
kvantifikálás Konfokális mód Z-irányú feloldás 3D rekonstrukció szubcelluláris lokalizáció Dekonvolúció reflexiós / transzmissziós kép
Nagy sejtszám – jó statisztika
Spektrális képalkotás
Polarizáció mérése
Kolokalizáció FRET
Sejtválogatás
PÉLDÁK AZ ALKALMAZOTT MÓDSZEREKRE Módszerek: • Immunfluoreszcencia sejteken (flow, image), szövettani metszeteken (image) • Szubcelluláris kolokalizáció kvantitatív elemzése • Molekuláris asszociácók vizsgálata FRET-tel egész sejt átlagban és mikroszkópos feloldással • Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia • Fluoreszcens fúziós fehérjék előállítása és transzfekciója • Kvantitatív digitális képelemzés • In vitro proliferációs esszék és gyógyszer-jelölt tesztelés • Xenograft tumormodellek (a Bőrklinikával együttműködésben), tumor szubklónok, keringő és disszeminált tumoresejtek vizsgálata
Bemutatott témakör: Receptor-specifikus immunterápiák és kis molekulájú inhibitorok Herceptin/trastuzumab kezelés, rezisztencia
Az EGF (ErbB) receptor család kinázai Heregulins
EGF TGFa Amphiregulin b-cellulin HB-EGF Epiregulin
NRG2 NRG3 Heregulins b-cellulin
1
2
3
4
Magas mitogenikus potenciállal rendelkező ErbB dimerek
1
1
2
2
1
3
1
2
2
3
Növekvő mitogenikus aktivitás
Az ErbB2 jelentősége tumorokban Az emlődaganatok kb. 30 %-ában
→ rossz prognózis
Mutáció vagy amplifikáció
Az ErbB mint terápiás célpont Antitest
Chaperon Antagonisták
K K
Receptor Internalizáció, lebontás, Jelátvitel gátlása, Immunválasz fokozása
Receptor lebontás
0 p9 Hs
K K
Kináz inhibitorok
K K TKI
Jelátvitel gátlása, lebontás serkentése
Toxin
Expresszió gátlása
K K
K K
Sejtpuszítás
Protein szintézis gátlás
Az első szolid tumor elleni humanizált antitest: az ErbB2 - specifikus Trastuzumab (Herceptin) Slamon et al., 1987; Carter et al., 1992, Genetech Inc.
Herceptest pozitivitás 3+
• 30-50% -ban hatásis • Primer és szekunder rezisztencia
Nagy affinitás és specificitás Kd = 5nM 95% humán, 5% egér (4D5) • Kevéssé immunogén • Hatékony immunválaszt mediál
FISH - ErbB2 amplifikáció
JIMT-1 Az első in vitro növeszthető trastuzumab rezisztens emlőtumor vonal
Az ErbB2 az ErbB3-mal kolokalizálódik
ErbB2 & ErbB3
ErbB2 & ErbB2
ErbB2 & TrfR
Keresztkorreláció számítása ( xi , j − x )( yi , j − y ) ∑ C = 1 teljes azonosság i∑j C= 2 2 C = 0 teljesen független képek ( x − x ) ( y − y ) ∑i ∑ j i , j ∑i ∑ j i , j C=0.50 – 0.75
C=0.85
C=0.17
Az egy klaszterben található receptorok egymás molekuláris közelségében vannak-e?
Az ErbB1, ErbB2 és ErbB3 molekuláris asszociációi FRET méréssel kimutathatók akceptor ErbB2
ErbB1
E=19+1%
ErbB2
E=14+1%
ErbB3
E=19+1%
donor
1-10 nm
Donor Akceptor
E
R06 E= 6 R0 + R6
0.5
kex
R0
R
kf
kt
kf
ErbB2 aktiváció vizsgálata: asszociáció mérése FRET-tel akceptor fotoelhalványítás előtt
akceptor fotoelhalványítás után II FD(i, j)
I D (i , j )
F
donor
akceptor
E(i , j ) = 1− γ = FDref(i,,Ij )
FDI (i , j ) II γ ⋅ FD(i, j) ref ,II FD(i , j)
0%
FRET
19%
Barátságos interaktív program FRET kiértékeléshez
ÚJ PROGI
ErbB2 aktiváció vizsgálata: asszociáció mérése FRET-tel donor ( I0d+a)
donor ( I0d )
14
SKBR-3
FRET (%) + SEM
12 10 8 6 4 2 0
akceptor
kiégetett akceptor
JIMT-1
+Trast.
ErbB1-ErbB2
+EGF
ErbB2-ErbB2
SKBR-3 sejteken az ErbB1/ErbB2, ill. ErbB2/ErbB2 asszociáció számottevő az ErbB2 homoasszociáció EGF és trastuzumab kezelésre fokozódott JIMT-1 sejteken az ErbB2 hetero- ill. homoasszociációja alacsony EGF és trastuzumab kezelésre nem változott
A rezisztencia oka JIMT-1 sejteken az ErbB2 funkcióvesztése?
+Trast.
ErbB2 aktiváció vizsgálata trastuzumab-mikrogyöngyökkel Kvantitatív digitális képelemzés
160
egész sejt stimlált régió stimulálatlan régió
140 120 100 80 60 40 20
gy
y EG
Fgy
ön
ng
TR -g
yö
ab zu m
ön Fgy
EG
SKBR-3
tr a stu
gy
y ng
TR -g
yö
ab
0 tr a stz um
JIMT-1
SKBR-3
Aktivált ErbB2 (Ab18)
trastuzumab oldat P - ErbB2 fluoreszcencia
trastuzumab-gyöngy
JIMT-1
• A trastuzumab csökkent kötődése és hatékonysága lehet sztérikus gátlás eredménye • Ezt a mikrogyöngyök által biztosított nagy ligandsűrűség és mechanikai hatások képesek legyőzni • Az ErbB2 JIMT-1 sejteken is működőképes
Kihasználható-e ez az ErbB2 leszabályozására?
ErbB2 aktiváció módosítása a citoplazma felől 15
SKBR-3
12
FRET (%) (%) + SEM FRET
FRET (%) + SEM
a HSP-90 számos jelátviteli fehérje szerkezetét stabilizálja JIMT-1
9 6 3 0 Kontroll
2'
5'
9 6 3 0
10'
Kontroll
ErbB2 – ErbB2 asszociáció
Sejtszám
2'
5'
ErbB2 – ErbB3 asszociáció SKBR-3 17-AAG SKBR-3 17-AAG +TR JIMT-1 17-AAG JIMT-1 17-AAG + TR
C50=0.076 µM
15000 C50=0.011 µM
5000 -4
-3
10'
17-AAG
17-AAG
25000
A HSP-90 az ErbB2-t inaktív állapotban tartja a membránban
SKBR-3
-2
-1
log (17-AAG, μM)
0
A HSP-90 gátlása ErbB2 aktivációt, internalizációt és proliferáció gátlást okoz, így TR rezisztens tunorok esetén potenciális terápiás módszer 1 lehet
In vivo xenograft modell: A trastuzumab kezdetben hatékony saline trastuzumab suspended trastuzumab continuous trastuzumab
2500 2000
Tumor volume (mm3)
1500 1000 500 0 0
14
28
42
56
*
70
84
98
112
1200 saline trastuzumab trastuzumab-F(ab')2
1000 800 600 400 200 0 0
14
Days post-inoculation Fiz. só
TR
28
42
56
70
84
Days post-inoculation TR(fab)2
TR-susp
Fluorescence intensity
Tumor volume (mm3)
in vitro rezisztens sejteken is (ADCC mechanizmus)
saline continuous trastuzumab suspended trastuzumab trastuzumab F(ab')2
160 140 120 100 80 60 40 20 0
ErbB2
Konklúziók • A trastuzumab-rezisztencia oka lehet az ErbB2 homodimerek hiánya ¾ Az ErbB2 aktiváhatósága és leszabályozhatósága csökkent • A MUC4 és CD44-hialuronsav komplex sztérikus gátlást okozhat ¾ A sztérikus gátlás mikrogyöngyökkel legyőzhető, az ErbB2 működőképes ¾ A hialuronsav szintézis gátlása fokozza a trastuzumab tumorellenes hatását • Egyéb ErbB heterodimerek (pl. ErbB2-ErbB3) szerepe a sejtosztódásban • A trastuzumab kezelés ADCC útján in vivo kis tumorméreteknél hatékony in vitro rezisztencia esetén is, valamint csökkenti a keringő tumorsejtek számát akkor is, ha a primer tumor már rezisztens trastuzumabra • A jövő: gyógyszer koktélok?
