Cytogenetika • 1. Postnatální (periferní lymfocyty) • 2. Prenatální (amniocyty, fibroblasty z plodové vody, chorium, placentální tkáň, pupečníková krev, sekční materiál.) • 3. Preimplantační (buňky rýhujícího se embrya) • 4. Onkologická (kostní dřeň, periferní lymfocyty, nádorová tkáň)
Indikace ke chromozomálnímu vyšetření • • • • • • •
Infertilita, dysfertilita Růstové selhání u dětí Psychomotorická retardace u dětí Selhání pohlavního dozrávání Dysmorfické rysy u dětí VVV u novorozenců Expozice účinkům mutagenů (mutageneza)
Mutageneza Vyšetření zaměřené na detekci změn v genomu po po expozici různých mutagenů .
Sledují se zlomy, gapy, double minutes. Provádí se specializovaná vyšetření zaměřená na výměnu sesterských chromatid.
Syndromy s defektem reparačního mechanizmu DNA 1. 2. 3. 4.
Xeroderma pigmentosum Ataxia teleangiectasia Bloomův syndrom Fanconiho anemie
Častá přítomnost cytogenetických anomálií Většinou AR dědičnost
Kultivace a zpracování lymfocytů periferní krve 1.Nasazení krevního vzorku do média 2. Kultivace 3. Zástava mitotického dělení 4. Hypotonie 5. Fixace 6. Příprava preparátu 7. Barvení
Typy chromozomálních aberací • Numerické
• Strukturální
Numerické chromozomální aberace 1.
Polyploidie (triploidie 69,XXX)
2. Aneuploidie - trisomie (47,XXY;47,XX,+21) - monosomie (45,X) 3. Marker chromozomy 4. Mozaiky
Vznik polyploidie
Strukturální chromozomální aberace Zahrnující jeden chromozom: delece duplikace ring inverze isochromosom Zahrnující více chromozomů: translokace robertsonské reciproké
Delece
Duplikace
Ring chromozom Inzerce
Inverze Isochromosom Paracentrická Pericentrická
Robertsonská translokace
Reciproká translokace
Incidence 1 : 800
Vznik Downova syndromu: 1. Volná trisomie – meiotická nondisjunkce 2. Translokační forma 3. Mozaika – mitotická nondisjunkce
Detekce trisomie chromozomu 21. Zpracováno technikou interfázní FISH na nekultivovaných amniocytech a klasickou metodou z kultivovaných fibroblastů.
Meioza
Fertilizace
Meioza
Fertilizace
Trisomie 18 – Edwardsův syndrom 90 % meiotická nondisjunkce 10 % mozaicismus Parciální trisomie – vzácné
Incidence: 1:8000
Mikrocefalie Krátké sternum Ztluštění kůže na šíji Pedes equinovarus Flexní deformity prstů Kardiovaskulární defekty Závažná MR a další VVV
Trisomie 13 – Patauův syndrom
Deleční syndromy Incidence: 1:50000
Cri-du-chat
5p-
80-85 % de novo delece 10-15 % důsledek translokace u rodičů Charakteristický pláč u novorozenců Závažná MR, hyperaktivita Mikrocefalie Dysmorfické rysy: asymetrická tvář, krátké filtrum
Chromozomální vyšetření u rodiny s balancovanou přestavbou
Karyotypy rodičů: 46,XX 46,XY,t(5;18)(p13.3;q21.3) Karyotyp probanda: 46,XX,del(5)(p13.3pter.)
Diagnostika nebalancované přestavby u plodu der(18)t(5;18)(p13.3;q21.3)
Wolf-Hirschorn syndrom Incidence: 1:50000
Typická facie: „Greek helmet face“ Růstová retardace Mentální retardace 90 % de novo delece 4p16 10 % důsledek translokace u rodičů
Nejčastější gonozomální aberace Vznik: meiotická nondisjunkce mitotická nondisjunkce - mozaiky
Techniky v prenatální diagnostice • Invazivní:
• • • •
Amniocentéza CVS Kordocentéza Fetoskopie
• Neinvazivní:
• Ultrazvuk • Jiné typy zobrazování (MI, retgen) Fetální buňky v mateřském oběhu
Identifikace rizika před početím CHR chromosomalní, SGD monogenní, MCM polygenní + spojeno, - nespojeno, (+) může být spojeno Věk matky nad 35 Příbuzenský sňatek Etnický původ Positivní rodinná anamnéza • Onemocnění matky, medikace • • • •
• CHR + • + • -
SGD + + + -
MCM + (+) + +
Identifikace rizika během těhotenství CHR chromosomalní,SGD monogenní, MCM polygenní • Abnormální UZ • AFP screening • Jiné biochemické markery • Expozice teratogením látkám
• • • •
CHR (+) (+) (+)
• -
SGD (+) (+) -
MCM + (+) -
-
+
Indikace k AC • • • •
Věk matky nad 35 Positivní biochemický screening Abnormální UZ Pozitivní rodinná anamnéza (přenašečství balancované chromozomální translokace, předchozí gravidita postižena chromozomální aberací)
Vyšetření prováděná z plodové vody • Chromozomální • Biochemická (enzymatická) • DNA analýza (vyloučení infekce,monogenních onem.) • FISH na interfázních jádrech
Indikace ke kordocentéze • • • • • • • • •
Vyšší týdny gravidity (nad 20. týden) Hemofilie A and B * Závažná kombinovaná imunodeficience Srpková anemie, beta thalasemie* Fetální infekce Suspektní mozaicismus In utero transfuse u Rh isoimmunizace Selhání kultivace v případě AC Závažný patologický nález na UZ
Vyšetření z choriových klků • Metoda 1. trimestru gravidity • Výhody: včasná karyotypizace plodu • Nevýhody: výskyt placentálního mozaicismu riziko spontánního abortu 1-2 %
Výsledky vyšetření pacientky s nálezem mozaiky Vyšetření UZ
Výsledky Výrazný edém podkoží v oblasti šíje - nuchální translucence 6.6 - 10 mm (12. týden gravidity)
Karyotyp
46,XX [11]/47,XX,+18 [2]
CVS přímá FISH (CEP 18 )
disomické buňky : trisomickým
17
:
1
Karyotyp
46,XX,-18,+ mar [10]/ 46,XX,-18,-21,+ 2mar [2]
FISH (CEP 18)
46,XX,-18,+ idic(18)
CVS kult.
disomické buňky : trisomickým
9
:
4
Karyogram z kultivované choriové tkáně u pacientky s chromosomální přestavbou
FISH na kultivovaných fibroblastech z choriové tkáně u pacientky s nálezem mozaiky
Druhy mozaik • A generalizovaný • B CPM (obě linie zastoupeny v placentě) • C CPM(v placentě zastoupena jen jedna linie) • D potvrzený embryonický Kalousek, D. K., (1992)
Prader-Willi Syndrom • • • •
hypotonie počáteční neprospívání faciální dysmorfie opožděný psychomotorický vývoj • hypogonadismus • poruchy stravování
• Mikrodelece na paternálním homologu chrom. 15
Angelman Syndrom • • • •
hypotonie třesy nekoordinované pohyby faciální dysmorfismus
• závažná MR • opožděný vývoj • delece na mat. kopii chrom. 15
Mikrodelece u pacienta se syndromem PraderWilli SNRPN/ Tel 15q
Metylačně senzitivní analýza
Prokázaná isodisomie u pacientky s Angelmanovým syndromem dítě
matka
otec
Patologické důsledky uniparentální disomie • Recesivní onemocnění zděděné od jednoho z rodičů • IRR, spontánní abort • Imprintingový efekt (Prader-Willi syndrom)
Princip FISH
Denaturace Hybridizace Vizualizace
Použití metody FISH • Klinická genetika: postnatální prenatální
• Onkologická genetika: hematoonkologická nádorová
• Preimplantační genetika • Mapování genomu
Možnosti využití FISH v PD
Detekce gonozomů u pacienta s mozaikou Klinefelterova sy prováděná na kultivovaných lymfocytech.
Mikrodeleční syndromy detekované FISH • DiGeorge • Prader Willi Angelman
• 22q11.2 • 15q11-13
• • • • •
• • • • •
Williams Beuren Smith-Magenis Wolf Hirschhorn Miller-Dieker Cri-du-Chat
7q11.23 17p11.2 4p16.3 17p13.3 5p15.2-15.3
Pacient s prokázanou mikrodelecí 7q11.23
Detekce mikrodelece 7q11.23 u pacienta se syndromem Williams Beuren
Princip CGH
Použití CGH v klinické genetice • Zjišťování původu marker chromosomu • Zjišťování původu nadbytečného chrom. materiálu u derivovaných chromosomů • Detekce větších delecí (Mb) • V případě inverzí a přestaveb „de novo“ ověřování zachování genetického materiálu
Karyogram plodu s derivací de novo
Comparative genomic hybridization
Comparative genomic hybridization
M- FISH
Osmibuněčné embryo - stádium vhodné k biopsii blastomer
Preimplantační cytogenetická diagnostika
1. biopsie blastomery z 8 buněčného embrya
2. biopsie blastocysty
FISH na embryu ve dvoubuněčném stádiu použitá sonda CEP 21 (Vysis)
