PERBEDAAN HITUNG LIMFOSIT PADA MENCIT BALB/C MODEL SEPSIS PAPARAN LIPOPOLISAKARIDA DENGAN CECAL INOCULUM
SKRIPSI Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran
Agri Vina Brahmantiani Suryono G 0005041
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET Surakarta 2009
PERNYATAAN Dengan ini menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Surakarta,
Mei 2009
AGRI VINA BRAHMANTIANI SURYONO NIM. G0005041
ABSTRAK Agri Vina B. S., G0005041, 2009. Perbedaan Hitung Limfosit pada Mencit Balb/C Model Sepsis Paparan Lipopolisakarida dengan Cecal Inoculum, Fakultas Kedokteran, Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Sepsis adalah keadaan patologis yang dapat menyebabkan kematian, hal tersebut terjadi karena pada sepsis fase lanjut terjadi penurunan imunitas terutama disebabkan oleh karena apoptosis limfosit. Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mendapatkan patofisiologi sepsis yang menyerupai sepsis yang sebenarnya pada manusia dan lebih terjangkau, salah satunya adalah bacterial peritonitis. Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan post test only control group design. Hewan uji mencit Balb/C jantan yang dibagi kelompok K sebagai kontrol, kelompok L diberikan paparan LPS intraperitonial, kelompok C diberi cecal inoculum intraperitonial. Hitung limfosit darah tepi menggunakan metode hitung jenis tiap 100 sel darah. Data yang diperoleh dianalisis dengan One Way ANOVA dilanjutkan Post Hoc Test dengan Least Significant Difference (LSD), menggunakan program SPSS for Windows Release 15.0 Hasil penelitian menunjukkan limfosit tiap seratus sel pada kelompok K 89,7±4,6, kelompok L 88,2±2,6, dan kelompok C 68,7±10,6. Dengan Post Hoc Test didapatkan perbedaan yang bermakna antara hitung limfosit kelompok K dengan kelompok C (p=0,000) dan kelompok L dengan C (p=0,003). Sedangkan hitung limfosit kelompok K dengan L perbedaannya tidak bermakna (p=0,114). Dari hasil penelitian ini disimpulkan bahwa terdapat perbedaan hitung limfosit pada mencit balb/c antara paparan LPS dengan cecal inoculum. Kata kunci : sepsis, LPS, cecal inoculum, limfosit
ABSTRACT Agri Vina B. S., G0005041, 2009. The difference of lymphocyte count in Balb/C Mice Sepsis Models Inducted by Lipopolysaccharide with Cecal Inoculum, Faculty of Medicine, Sebelas Maret University, Surakarta. Sepsis is a pathological condition that can cause death, that’s can happen because in further phase occur immunity reduction in main cause of lymphocyte apoptosis. A variety of experimental has been done to get the sepsis pathophysiology that closely the true sepsis in human and more achievable, one of them is bacterial peritonitis. This was a laboratory experimental with post test only control group design. We used Balb/C mice, they were divided in K group as control group, L group inducted by LPS intaperitonial, C group inducted by cecal inoculum intaperitonial. Lymphocyte counting with blood kind method every one hundred blood cells. The data was analyzed with One Way ANOVA method continued by Post Hoc Test with Least Significant Difference (LSD), used SPSS for Windows Release 15.0 program. The data showed that rate every one hundred blood cells of K group was 89,7±4,6, L group was 88,2±2,6, and C group was 68,7±10,6. With Post Hoc Test we got result there were significant difference of lymphocyte count between K group and C group (p=0,000), and L group and C group (p=0,003). The difference of lymphocyte count between K group and L group was not significant (p=0,114). From this experiment we conclude that there were a difference lymphocyte count in balb/c mice inducted by lipopolysaccharide with cecal inoculum. Key words : sepsis, LPS, cecal inoculum, lymphocyte
PRAKATA Dengan mengucap Alhamdulillahirobbil’alamin kehadirat Alloh SWT, atas izin dan ridho-Nya skripsi dengan judul “Perbedaan Hitung Limfosit pada Mencit Balb/C Model Sepsis Paparan LPS (Lipopolisakarida) dengan Cecal Inoculum” telah terselesai. Dalam pelaksanaan menyusun skripsi ini penulis tidak terlepas dari berbagai hambatan dan kesulitan. Namun berkat bimbingan dan bantuan berbagai pihak, penulis dapat menyelesaikannya. Untuk itu penulis menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:. 1. Prof. Dr. A.A. Subijanto, dr., MS, selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta. 2. Sri Wahjono, dr., MKes, selaku Ketua Tim Skripsi FK UNS. 3. Sri Sutati, Dra., Apt., SU. Pembimbing Utama yang dengan penuh kesabaran meluangkan waktunya, bimbingan, saran, koreksi dan nasehat kepada penulis. 4. Sarsono, Drs., M Si selaku Pembimbing Pendamping yang telah memberikan saran, bimbingan, dan koreksi kepada penulis. 5. Diding Heri Prasetyo dr., MSi selaku Penguji Utama yang telah berkenan menguji sekaligus memberikan saran dan juga koreksi bagi penulis. 6. Ipop Syarifah, Dra., MSi selaku Penguji Pendamping yang telah berkenan menguji dan memberikan saran yang berarti bagi penulisan skripsi ini. 7. Semua pihak yang tidak dapat penulis tulis satu persatu, atas doa, saran, dan dukungan yang telah diberikan. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi ilmu kedokteran pada khususnya dan masyarakat pada umumnya. Surakarta, Mei 2009 Penulis
DAFTAR ISI KATA PENGANTAR .........................................................................................vi DAFTAR ISI .......................................................................................................vii DAFTAR TABEL ...............................................................................................ix DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... x DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................xi BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................1 A. Latar Belakang Masalah ....................................................................1 B. Perumusan Masalah .......................................................................... 3 C. Tujuan Penelitian .............................................................................. 3 D. Manfaat Penelitian ............................................................................ 3 BAB II LANDASAN TEORI ............................................................................. 4 A. Tinjauan Pustaka ............................................................................... 4 B. Kerangka Pemikiran ..........................................................................12 C. Hipotesis ............................................................................................14 BAB III METODOLOGI PENELITIAN ............................................................15 A. Jenis Penelitian ..................................................................................15 B. Lokasi Penelitian ...............................................................................15 C. Subjek Penelitian ...............................................................................15 D. Teknik Sampling ............................................................................... 15 E. Variabel Penelitian ............................................................................ 15 F. Skala Variabel ................................................................................... 16
G. Definisi Operasional ..........................................................................16 H. Rancangan Penelitian ........................................................................ 18 I. Instrumentasi Penelitian .................................................................... 18 J. Cara Kerja ......................................................................................... 19 K. Alur Penelitian .................................................................................. 20 L. Analisis Data...................................................................................... 20 BAB IV HASIL PENELITIAN .......................................................................... 21 A. Data Hasil Penelitian ..........................................................................21 B. Analisis Data ...................................................................................... 24 BAB V PEMBAHASAN .................................................................................... 26 BAB VI SIMPULAN DAN SARAN ............................................................
29
A. Simpulan ........................................................................................
29
B. Saran ................................................................................................... 29 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 30 LAMPIRAN
DAFTAR TABEL
Tabel 1
Rata–rata hitung limfosit darah tepi mencit setelah perlakuan
Tabel 2
Analisis Statistik Antar Kelompok Perlakuan
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1
Skema kerangka pemikiran konseptual
Gambar 2
Skema rancangan penelitian
Gambar 3
Skema alur penelitian
Gambar 4
Histogram rata-rata hitung limfosit dengan kelompok perlakuan
Gambar 5
Pengamatan perlakuan
mikroskopis
limfosit
masing-masing
kelompok
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran A Jadwal penelitian Lampiran B Foto alat dan bahan penelitian Lampiran C Foto kegiatan penelitian Lampiran D Hasil Uji Analisis One Way Anova dan Post Hoc Test dengan Program SPSS For Windows Release 15.0 Lampiran E Hasil Laboratorium Hitung Limfosit Lampiran F Hasil Penghitungan Jumlah Limfosit Tiap Seratus Sel
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Sepsis adalah suatu sindroma klinik yang terjadi oleh karena adanya respon tubuh yang berlebihan terhadap rangsangan produk mikroorganisme (Guntur, 2007). Sepsis merupakan penyebab utama kematian di dunia, dan sebagai penyebab kematian di intensive care unit (ICU). Diperkirakan sekitar 1.400 pasian meninggal di ICU karena sepsis (Poeze et al, 2004). Di Amerika, menunjukkan angka kejadian sepsis berat sekitar 0,3 % atau mendekati 750.000 kasus setiap tahunnya, dengan angka kematian sampai 26% (Balk, 2000; Angus et al., 2001). Sedangkan di Indonesia melalui sebuah penelitian yang dilakukan Rumah Sakit Umum Daerah (RSUD) Dr.Moewardi Surakarta, ditemukan bahwa 130 (97%) dari 135 pasien sepsis dengan syok sepsis meninggal (Guntur, 2006a). Produk yang berperan penting terhadap sepsis adalah lipopolisakarida (LPS). LPS atau endotoksin glikoprotein kompleks merupakan komponen utama membran luar dari bakteri gram negatif (Guntur, 2008). Bakteri gram negatif (terutama Escherichia coli, Klebsiella species, Pseudomonas aeruginosa) dan kokus gram positif (terutama staphylococcus
dan
streptococcus) adalah mikroba yang paling banyak terisolasi dari pasien sepsis dan syok sepsis. Fungi, paling banyak Candida, hanya 5% dari seluruh kasus sepsis (Bochud dan Calandra, 2003).
Secara alami tubuh memiliki sistem imun yang mempunyai kemampuan untuk menetralisir dan menginaktivasi molekul asing (molekul yang dipresentasikan oleh virus, bakteri, dan parasit) dan untuk menghancurkan mikroorganisme atau sel asing (sel yang diinfeksi virus, sel pada transplantasi organ, dan sel kanker). Sel imun diedarkan di tubuh pada darah, limpa, epitel, dan jaringan pengikat. Sel yang ikut dalam respon imun adalah limfosit, sel plasma, sel mast, neutrofil, eosinofil, dan sel yang berperan pada fagositosis (Luiz dan Jose, 2005). Limfosit yang merupakan 20% dari semua leukosit dalam sirkulasi darah orang dewasa terdiri limfosit T dan limfosit B, merupakan pengontrol sistem imun (Guntur, 2008). Proses patologik yang utama pada sepsis adalah apoptosis dari sel-sel efektor imunologi, termasuk limfosit (Chang et al., 2007). Berbagai model penelitian sepsis telah dikembangkan untuk meneliti dan mencari patofisiologi sepsis serta mencari penanganan dan pengobatan yang sesuai. Model-model penelitian sepsis pada hewan coba ada beberapa macam diantaranya endotoxicosis model, infus live bacteria intravaskuler, bacterial peritonitis, peritonitis models, cecal ligation and perforation, soft tissue infection, pneumonia model, dan meningitis model. Model penelitian sepsis biasanya menggunakan LPS yang dapat menstimulasi berbagai macam mediator inflamasi, dan bertanggungjawab terhadap awal mula terjadinya proses sepsis (Alejandra el al., 2004). Namun demikian, penelitian ini
membutuhkan biaya yang relatif mahal (sekitar Rp 2.000.000,00) selain itu paparan ini hanya menunjukkan reaksi terhadap monomikrobial saja. Model sepsis yang lain menggunakan bahan fecal atau kultur yang dimasukkan ke dalam kavitas peritonial (Alejandra el al., 2004). Dari inoculum ini didapat strain Eschericia coli (E. coli) yang bercampur dengan material cecal yang lain untuk meniru peritonitis pada manusia (Edwin, 2005). Cecal inoculum yaitu dengan injeksi material cecal secara intraperitoneal (Chopra dan Sharma, 2007) yang diperoleh dari isi cecal mencit donor (Ren et al., 2001). Cecal inoculum ini termasuk peritonitis models. Model ini jauh lebih murah dibandingkan dengan model LPS, selain itu lebih mendekati terjadinya sepsis yang sebenarnya pada manusia yang tidak hanya diakibatkan oleh monomikrobia saja tetepi oleh polimikrobia. B. Perumusan Masalah Adakah perbedaan hitung limfosit pada mencit Balb/C model sepsis paparan LPS dengan Cecal Inoculum? C. Tujuan penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan hitung limfosit pada mencit Balb/C model sepsis paparan LPS dengan Cecal Inoculum. D. Manfaat Penelitian 1. Teoritis Penelitian
ini
diharapkan
dapat
digunakan
pertimbangan model-model sepsis dalam hewan coba.
sebagai
bahan
2. Praktis Penelitian ini dapat digunakan sebagai bahan rujukan untuk penelitian sepsis lebih lanjut.
BAB II LANDASAN TEORI A. Tinjauan Pustaka 1. Sepsis Sepsis adalah suatu sindroma klinik sebagai manifestasi proses inflamasi imunologik yang terjadi karena adanya respon tubuh (imunitas) yang berlebihan terhadap rangsangan produk mikroorganisme. Manifestasi klinis yang berupa inflamasi sistemik disebut sistemic inflammation response syndrome (SIRS). Sesuai dengan pendapat Thijs (1998) menyatakan bahwa sepsis adalah SIRS dengan dugaan infeksi tersebut ditandai dengan takipneu (frekuensi respirasi lebih dari 20 kali/menit), takikardi (frekuensi jantung lebih dari 100 kali/menit), hiperthermia atau hipothermia (temperature axilar tubuh lebih dari 101 derajat F/38.3 derajat C atau 96.1 derajat F/35.6 derajat C), leukositosis (>12.000/mm), leukopenia (<4000/mm) dengan atau tanpa ditemukannya bakteri dalam darah (Guntur, 2007). Berdasarkan sindroma klinis tersebut sepsis dibedakan menjadi 5 derajat, yaitu: a. Systemic Inflammatory Responds Syndrome (SIRS), ditandai dengan ≥2 gejala sbb: 1) Hiperthermia/Hipothermia (>38,3° C/< 35,6° C) 2) Takipneu ( frekuensi respirasi >20 menit)
3) Takikardi ( frekuensi jantung >100/menit) 4) Leukositosis > 12.000/mm atau Leukopenia <4000/mm 5) Leukosit lebih dari 10% imatur b. Sepsis Gejala SIRS disertai infeksi c. Sepsis berat Sepsis disertai disfungsi organ multipel (MODS)/gagal organ multipel (MOF), hipotensi, oligouri bahkan anuria d. Sepsis dengan hipotensi Sepsis dengan hipotensi (tekanan sistolik < 90 mmHg atau penurunan tekanan tekanan sistolik > 40 mmHg) e. Syok sepsis Syok sepsis adalah subset dari sepsis berat, yang didefinisikan sebagai hipotensi yang diinduksi sepsis dan menetap kendati telah mendapat resusitasi cairan disertai hipoperfusi jaringan (Guntur, 2008). Reaksi
tubuh
sebagai
tanggapan
terhadap
mikroorganisme
penginfeksi melibatkan bermacam-macam komponen sistem imun baik yang bersifat proinflamasi maupun antiinflamasi (Guntur, 2006a). Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) adalah protein yang berperan pada system imun nonspesifik, yang akan membawa LPS ke reseptor CD14 pada sel monosit-makrofag (Shahin, et al., 2006). Ikatan
LPS-LBP kompleks kemudian
menuju CD14 reseptor di permukaan
seluler dan berinteraksi dengan toll-like receptor 4 (TLR4) untuk menginduksi nuclear factor κ-B (NFκ-B) sebagai sinyal dan transkripsi sitokin proinflamasi (Hongwei et al., 2005; Kristine et al., 2007). Termasuk sitokin proinflamasi antara lain TNF, IL-1, IL-6 dan Interferon, yang bekerja membantu sel untuk menghancurkan mikroorganisme yang menginfeksi. Sedang sitokin antiinflamasi adalah interleukin 1 reseptor antagonis, IL-4, IL-10 yang bertugas memodulasi koordinasi atau represi terhadap respon yang berlebihan (Guntur, 2006b). Produksi yang berlebihan sitokin inflamasi menyebabkan aktivasi respon sistemik berupa Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS) terutama pada paruparu, hati, ginjal, usus dan organ lainnya (Arul, 2001) yang mempengaruhi permeabilitas vaskuler, fungsi jantung dan menginduksi perubahan metabolik menyebabkan nekrosis jaringan, multiple organ failure (MOF) serta kematian (Elena et al., 2006; Javier et al., 2005; Arul, 2001). 2. Lipopolisakarida Lipopolisakarida adalah penyusun utama membran terluar dari bakteri gram negatif. LPS merupakan komponen penting pada dinding sel dan digunakan untuk viabilitas bakteri. LPS tidak bersifat toksik jika masih sebagai bagian dari membran terluar dari bakteri, tetapi setelah lepas dari dinding sel menjadi bersifat toksik, lipid A yang dikenali oleh sistem imun yang menyebabkan timbulnya respon inflamasi (Edwin et al.,
2003). Produk yang berperan penting terhadap sepsis terutama kandungan lipid A dalam LPS tersebut. LPS atau endotoksin glikoprotein kompleks merupakan komponen utama membran terluar dari bakteri gram negatif (Guntur, 2006a). LPS bersifat stabil terhadap panas, mempunyai berat molekul antara 3000 dan 5000 (lipooligosakarida) sampai beberapa juta (lipopolisakarida). Dalam aliran darah LPS akan terikat pada protein yang bersirkulasi kemudian berinteraksi dengan reseptor makrofag, limfosit dan monosit serta sel lain pada sistem retikuloendotelial. Hal ini akan mengakibatkan pelepasan sitokin dan pengaktifan jalur komplemen dan koagulasi. Runtutan peristiwa tersebut dapat diamati secara klinis sebagai demam,
leukopenia,
hipoglikemia,
hipotensi,
syok,
koagulasi
interavaskuler hingga kematian karena disfungsi organ (Brooks et al., 2003). 3. Cecal Inoculum Inoculum merupakan bahan yang dipakai dalam inokulasi. Inokulasi (inoculation) adalah pemasukan mikroorganisme, bahan infektif, serum, dan substansi lain ke dalam jaringan organisme hidup atau media biakan; pemasukan agen penyakit ke dalam individu sehat untuk menimbulkan bentuk ringan penyakit tersebut yang menimbulkan imunitas. Cecum adalah bagian pertama dari usus besar, membentuk kantong yang secara distal melebar ke ileum dan proksimal ke arah kolon, serta melepaskan apendiks vermiformis (Dorland, 2002). Model sepsis ini dibuat dari cecal
inoculum diperoleh dari isi cecal mencit donor (Ren et al., 2001) yang dimasukkan ke dalam kavitas peritonial (Alejandra et al., 2004). Dari model inoculum ini didapat strain Eschericia coli (E. coli) yang bercampur dengan material cecal yang lain untuk meniru peritonitis pada manusia (Edwin, 2005). 4. Limfosit Limfosit merupakan 20% sampai 25% dari leukosit total yang bersirkulasi. Pada darah tepi bentuknya bulat, tapi saat bermigrasi ke jaringan bentuknya pleomorfik. Limfosit mempunyai ukuran yang lebih besar dibandingkan eritrosit dan memiliki sedikit lekukan, inti sel bulat yang hampir memenuhi sel. Sitoplasma berwarna biru terang dan mengandung beberapa granula azurofilik (Leslie dan James, 2007). Umur limfosit bervariasi ada yang hanya berumur beberapa hari tetapi ada juga yang hidup dalam sirkulasi darah sampai berumur beberapa tahun (Luiz dan Jose, 2005). Limfosit berkembang pada jaringan limfoid di dalam tubuh yaitu pada limfonodus, limpa, dan folikel limfatik pada sumsum tulang. Maturasi limfosit dibagi dalam 3 tahapan yaitu : a. Limfoblas mempunyai diameter bervariasi dari 10-20µm, mempunyai intisel yang bulat dengan besar ±80% dari selnya. Kromatin jelas dan terdiri dari 2 anak inti. Sitoplasma basofilik dan agranular.
b. Prolimfosit mempunyai diameter bervariasi dari 10-18µm, intisel bulat, lebih terang, dan sitoplasma lebih banyak dibandingkan limfoblas c. Limfosit (Gillian, 1996) Secara fungsional limfosit dibedakan menjadi tiga jenis yaitu: a. Limfosit B b. Limfosit T c. Sel null Meskipun secara morfologi tidak dapat dibedakan satu dengan yang lainnya,
jenis
sel
limfosit
tersebut
dapat
dikenali
secara
immunocytochemically dengan membedakannya menurut petanda pada permukaannya. Kira-kira 80% yang bersirkulasi adalah sel T, 15% adalah sel B, dan sisanya adalah sel null. Umur limfosit T bisa hidup selama beberapa tahun, sedangkan sel B dapat mati dalam beberapa bulan (Leslie dan James, 2007). Pada manusia limfosit B dimatangkan di sumsum tulang, sedangkan limfosit T pada timus. Secara umum sel B befungsi untuk sistem imun humoral, sedangkan sel T bertanggungjawab untuk sistem imun seluler (Stuart, 2002). Limfosit T mempunyai 3 kelompok : a. Sel T Pembantu (Th) Berperan sebagai pengatur utama bagi seluruh fungsi imun, melalui serangkain mediator protein yang disebut limfokin. Limfokin
penting yang disekresikan oleh sel-sel T pembantu antara lain IL-2, IL3, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-γ dan GM-CSFfaktor perangsang koloni monosit-granulosit (Guyton and Hall, 1997).Mengeliminasi agen asing melalui aktivasi sel-sel fagositer seperti makrofag dan menyekresikan mediator inflamasi (Abbas and Litchman, 2005). b. Sel T Sitotoksik (Tc) Merupakan sel penyerang langsung yang mampu membunuh mikroorganisme dan, pada suatu saat, bahkan membunuh sel-sel tubuh sendiri melalui sebuah mekanisme sekresi protein pembentuk lubang pada membran sel yang diserang yang disebut perforin. Hal ini menyebabkan gangguan keseimbangan sel disertai pula oleh substansi sitotoksik dari sel T tersebut, sehingga dengan segera sel yang diserang membengkak dan larut (Guyton and Hall, 1997; Abbas and Litchman, 2005). c. Sel T Supresor (Ts) Merupakan sel T yang mempunyai kemampuan menekan fungsi sel T sitotoksik dan sel T pembantu. Fungsi supresor ini menyebabkan pengaturan aktivitas sel-sel lain dan menjaganya agar tidak berlebihan dan menimbulkan kerusakan jaringan tubuh, yang disebut toleransi imun (Guyton dan Hall, 1997). Limfosit B bertanggung jawab dalam sintesis antibodi yang bersirkulasi dan dikenal juga dengan nama imunoglobulin. Imunoglobulin
plasma terutama disintesis di dalam sel plasma. Sel plasma merupakan sel khusus turunan sel B yang mensintesis dan mensekresikan imunoglobulin ke dalam plasma sebagai respon terhadap pajanan berbagai macam antigen (Robert dkk, 2003;Guyton dan Hall, 1997). Terdapat lima golongan umum imunoglobulin yaitu IgA, IgG, IgM, IgD, IgE. Dua golongan imunoglobulin terpenting adalah IgG yang merupakan antibodi bivalen dan kira-kira 75% dari seluruh antibodi pada orang normal, dan IgE yang merupakan antibodi dalam jumlah kecil, khususnya terlibat dalam peristiwa alergi (Robert dkk, 2003). Sedang imunoglobulin yang berperan penting dalam imunitas mukosa adalah IgA (Abbas dan Litchman,
2005). IgA merupakan
pertahanan garis depan terhadap bakteri dan virus (Stryer, 2000). IgA diproduksi di jaringan limfoid mukosa dan disekresikan melalui epitel mukosa ke dalam lumen. IgA akan mengikat mikroba dan toksin yang terdapat dilumen dan menetralisasinya melalui hambatan jalur masuk ke host (Abbas dan Litchman, 2005).
B. Kerangka Pemikiran 1. Kerangka Berpikir Konseptual Lipopolisakarida
Cecal Inoculum
Antigen Presenting Cell
Limfosit
Sitokin
Respon
Respon
Proinflamasi ↑↑
Anti-inflamasi
Hiperinflamasi
Systemic Inflamatory Response Sindrome (SIRS)
Apoptosis Keterangan : : Merangsang ↑↑
: Jumlah meningkat
↓↓
: Jumlah menurun
Limfosit ↓↓
Sepsis
Gambar 1. Skema Kerangka Pemikiran Konseptual
2. Kerangka Berpikir Teoritis Masuknya mikroorganisme penginfeksi ke dalam tubuh akan difagosit oleh makrofag kemudian akan ditampilkan sebagai Antigen Presenting Cell (APC). Eksotoksin, virus, dan parasit berperan sebagai superantigen (Guntur, 2006b), superantigen adalah molekul yang sangat poten terhadap mitogen sel T (Diding, 2005), akan difagosit oleh monosit atau makrofag yang berperan sebagai Antigen Processing Cell dan kemudian ditampilkan dalam APC. APC tersebut memproduksi dan melepas sitokin yang merangsang limfosit T untuk berproliferasi dan berdeferensiasi. Antigen ini membawa muatan polipeptida spesifik yang berasal dari Major Histocompatibility Complex (MHC). Antigen yang bermuatan peptida MHC kelas II akan berikatan dengan CD4+ (limfosit Th1 dan Th2) dengan perantaraan TCR (T Cell Receptor), kemudian akan berfungsi sebagai imunomodulator dan berfungsi untuk mengekpresikan sitokin proinflamatori yang akan menyebabkan inflamasi sebagai tanggapan imunitas tubuh terhadap berbagai macam stimulasi imunogen dari luar dan sitokin anti inflamasi. Apabila terjadi ketidakseimbangan antara kedua jenis sitokin tersebut dimana sitokin proinflamasi lebih dominan maka akan terjadi hiperinflamasi. Manifestasi klinis yang berupa inflamasi sistemik disebut SIRS dan sesuai dengan pendapat bahwa sepsis adalah SIRS dengan dugaan infeksi.
Pada sepsis limfosit merupakan inti dari sei imun spesifik dan secara cepat akan bereaksi terhadap rangsangan sitokin dan stimulasi antigen spesifik. Secara normal apoptosis limfosit adalah sebuah proses untuk menghilangkan autoreaktif limfosit atau menekan aktivasinya. Apoptosis merupakan proses penting dimana sel-sel akan dimusnahkan dalam rangka mengontrol untuk meminimalisir kerusakan jaringan yang diakibatkan reaksi yang berlebihan (Wesche et al., 2005) sehingga pada sepsis akan terjadi penurunan limfosit. C. Hipotesis Terdapat perbedaan hitung limfosit pada mencit Balb/C model sepsis paparan LPS dengan cecal inoculum.
BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini bersifat eksperimental laboratorik dengan post test only control group design. B. Lokasi Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. C. Subjek Penelitian Subjek penelitian berupa 18 ekor mencit Balb/C jantan dengan berat badan + 20-32 gram, dan berumur 4-6 minggu. Mencit Balb/C diperoleh dari Universitas Setia Budi, Mojosongo, Surakarta. Bahan makanan mencit digunakan pakan mencit BR I. D. Teknik Sampling Untuk pengambilan sampel digunakan teknik incidental sampling. E. Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas
: LPS dan cecal inoculum
2. Variabel Terikat : Hitung limfosit 3. Variabel luar a. Dapat dikendalikan
: Genetik, berat badan, makanan, umur
b. Tidak dapat dikendalikan
: Variasi kepekaan mencit terhadap suatu zat
F. Skala Variabel Hitung limfosit
: skala rasio
Sepsis paparan LPS
: skala nominal
Sepsis paparan Cecal inoculum
: skala nominal
G. Definisi Operasional 1. Model sepsis Mencit model sepsis dibuat dengan metode injeksi LPS dan cecal inoculum secara peritonial. a. LPS yang digunakan : LPS diperoleh dari Sigma Aldrich (Deisenhofen, Germany) dengan dosis 0,1 mg/mencit secara intraperitonial (Wang et al., 2006; Krutzel et al., 2002). b. Cecal inoculum yang digunakan : Cecal inoculum dibuat setiap hari dari mencit donor dengan mensuspensikan 200 mg material cecal pada 5 mL dekstrose water 5% (Ren et al., 2002) kemudian diinjeksikan masing-masing 4 mg/mencit secara intraperitonial (Brahmbhatt et al., 2005; Chopra dan Sharma., 2007). 2.
Hitung Jumlah Sel Limfosit Darah mencit diambil dari ekor mencit, dibuat apusan darah pada obyek glass, kemudian diberi pulasan Giemsa yang sebelumnya sudah difiksasi terlebih dahulu dengan metilalkohol. Leukosit terdiri dari basofil, eosinofil, netrofil, limfosit, dan monosit. Menghitung jumlah sel limfosit
menggunakan pengelompokan tiap 10 sel yang dihitung sampai terdapat 100 sel. Hasil hitung jenis berdasarkan 100 sel sebenarnya hanya bermakna pada keadaan normal, jika terdapat leukositosis harus dihitung lebih banyak; untuk leukositosis antara 10.000-20.000 hitung jenis atas 200 sel; leukositosis antara 20.000-50.000 hitung jenis atas 300 sel; leukositosis diatas 50.000 hitung jenis atas 400 sel (Gandasoebrata, 2001). Limfosit merupakan sel yang sferis, garis tengah 6-8um. Limfosit yang normal memiliki inti relatif besar, berbentuk bulat dengan sedikit cekungan pada satu sisi, kromatin inti padat, dan anak inti baru terlihat dengan mikroskop elektron. Sitoplasmanya sangat sedikit, sedikit basofilik dan mengandung granula-granula azurofilik. Bagian yang berwarna ungu dengan Romonovsky mengandung ribosom bebas dan poliribisom. Klasifikasi lainnya dari limfosit ialah dengan ditemuinya tanda-tanda molekuler khusus pada permukaan membran sel-sel tersebut. Beberapa diantaranya membawa reseptor seperti imunoglobulin yang mengikat antigen spesifik pada membrannya. Limfosit dalam sirkulasi darah normal dapat berukuran 10-12µm. Ukuran yang lebih besar disebabkan sitoplasmanya yang lebih banyak. Kadang-kadang disebut dengan limfosit sedang. Sel limfosit besar berada dalam kelenjar getah bening dan akan tampak dalam darah pada keadaan patologis dengan inti vesikuler dan anak inti yang jelas (Zukesti, 2003). Pemeriksaan limfosit menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x.
H. Rancangan Penelitian K S
K
K1
L
K2
C
Uji ANOVA dilanjutkan dengan Post Hoc Test
Gambar 2. Skema Rancangan Penelitian Keterangan : S : Jumlah mencit yang digunakan K : Kelompok kontrol negatif K1 : Kelompok perlakuan 1 (injeksi intra peritonial LPS) K2 : Kelompok perlakuan 2 (injeksi intra peritonial Cecal Inoculum) K : Kelompok kontrol negatif L : Kelompok LPS C : Kelompok Cecal Inoculum
I. Instrumentasi Penelitian 1. Alat penelitian a. Kandang hewan percobaan ukuran 30x38x15 cm3 b. Timbangan hewan camry c. Spuit injeksi 0,1ml d. Labu takar 1ml e. Beaker glass 5ml f. Timbangan analisis metler toledo g. Pinset
h. Sarung tangan i. Masker j. Kaca objek k. Mikroskop cahaya Olympus 2. Bahan penelitian a. Lipopolisakarida (LPS) Sigma Aldrich (Deisenhofen, Germany) b. Phosphate Buffered Saline (PBS) c. Cecal inoculum d. Hewan uji (18 ekor Mencit Balb/C) e. Hewan donor (6 ekor Mencit Balb/C) f. Pakan mencit BR I g. Alkohol 70% h. Dekstrose water 5% i. Zat pulas Giemsa J. Cara Kerja 1. Sebelum perlakuan a. Hewan uji diadaptasi dengan kondisi laboratorium tempat penelitian dilakukan. b. Hewan uji dikelompokkan menjadi 3 kelompok. Masing masing kelompok terdiri dari 6 ekor mencit. 2. Pemberian perlakuan Sejak hari ke-0 sampai dengan hari ke-6.
Kelompok K, K1, dan K2 diberi diet standar. Masing-masing kelompok diberi perlakuan yang berbeda sesuai alur penelitian.
K. Alur Penelitian Mencit 18 ekor
Kelompok K 6 ekor mencit
Kelompok K1 6 ekor mencit
Kelompok K2 6 ekor mencit
+ diet standar ( BR1& air)
+ diet standar (BR1 & air)
+ diet standar (BR1 & air)
Diinjeksi LPS intraperitonial pada hari ke-0
Diinjeksi Cecal Inoculum intraperitonial setiap hari
Hari ke 7 mencit diambil darahnya
Hitung jumlah sel limfosit darah tepi
Gambar 3. Skema Alur Penelitian L. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji ANOVA dan dilanjutkan dengan Post Hoc Test menggunakan program SPSS for windows release 15.0.
BAB IV HASIL PENELITIAN A. Data Hasil Penelitian Setelah dilakukan penelitian mengenai hitung limfosit model sepsis paparan lipopolisakarida dan cecal inoculum pada mencit Balb/C, didapatkan pemberian LPS mampu menurunkan jumlah limfosit tiap 100 sel, hal ini terlihat pada kelompok L (88,2), selain itu pada CI menunjukkan penurunan jumlah limfosit yaitu 68,7, dari kelompok kontrol 89,7. Secara umum dapat dilihat pada tabel 1 Tabel 1. Rata – rata hitung limfosit tiap seratus sel darah tepi mencit setelah perlakuan Kelompok Rata-rata±SD Kontrol (K)
89,7±4,6
LPS (L)
88,2±2,6
Cecal Inoculum (C)
68,7±10,6
Keterangan: K : Kelompok kontrol negatif L : Kelompok LPS C : Kelompok Cecal Inoculum
Dari hasil di atas dapat digambarkan dalam histogram di bawah ini :
90 80 70 60 Rata-rata hitung
50
Kontrol
40
LPS
limfosit tiap seratus sel
30 20
CI
10 0 1
Jenis Perlakuan
Gambar 4. Histogram Rata-Rata Hitung Limfosit Tiap Seratus Sel pada Tiap Kelompok Perlakuan Pengamatan mikroskop limfosit masing-masing kelompok dapat dilihat sebagai berikut :
a.
b.
c. Gambar 5. Pengamatan Mikroskopis Limfosit Masing-Masing Kelompok Perlakuan Keterangan: a. Gambaran dengan 3x limfosit b. Gambaran dengan 3x limfosit
limfosit kelompok K pengecatan Giemsa, perbesaran 400x optical zoom Mpix digital camera. Panah hitam menunjukkan limfosit kelompok L pengecatan Giemsa, perbesaran 400x optical zoom Mpix digital camera. Panah hitam menunjukkan
c. Gambaran limfosit kelompok C pengecatan Giemsa, perbesaran 400x dengan 3x optical zoom Mpix digital camera. Panah hitam menunjukkan limfosit B. Analisis Data Hasil penelitian di atas menunjukkan bahwa rata-rata hitung limfosit tiap seratus sel dari kontrol (K) 89,67 tiap seratus sel, LPS (L) 88,17 tiap seratus sel, dan cecal inoculum (C) 68,67 tiap seratus sel. Analisis statistik terhadap data hasil penelitian di atas dilakukan dengan One Way ANOVA, didaptkan hasil p = 0.000 Hasil analisis variansi satu jalan terhadap rata-rata hitung limfosit mencit antar kelompok perlakuan menunjukkan perbedaan yang bermakna dengan p<0,05. Ini berarti, tiap satu pasang kelompok secara statistik menunjukkan perbedaan bermakna. Sehingga, dilanjutkan dengan Post Hoc Test (LSD). Hasil penelitian di atas menunjukkan bahwa rata-rata hitung limfosit tiap seratus sel dari kontrol (K) adalah 89,67 tiap seratus sel. Setelah dilakukan pemaparan LPS (L) terjadi penurunan rata-rata hitung limfosit tiap seratus sel kontrol menjadi 88,17 tiap seratus sel (p=0,114), dan terhadap kelompok cecal inoculum (C) juga didapatkan penurunan rata-rata hitung limfosit terhadap seratus sel yaitu 68,67 tiap seratus sel (p=0,000). Hasil analisis terhadap kelompok L dan C didapatkan hasil p=0,003.
Hasil analisis statistik antar kelompok dapat diringkas dalam tabel sebagai berikut: Tabel 2. Analisis Statistik Antar Kelompok Perlakuan Kelompok P value K–L 0,114
Kemaknaan Tidak Signifikan
K–C
0,000
Signifikan
L–C
0,003
Signifikan
BAB V PEMBAHASAN Dari penelitian didapatkan hasil bahwa rata-rata hitung limfosit dari seratus sel darah kelompok sepsis paparan LPS menunjukkan nilai lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol meskipun secara statistik menunjukkan nilai yang tidak bermakna (p=0,114). Hal ini sesuai bahwa LPS merupakan komponen penting penyusun membran luar bakteri gram negatip dan mempunyai peranan yang sangat penting dalam induksi sepsis (Alexander, 2001), dimana dalam sepsis akan terjadi disfungsi seluler yang dalam penelitian-penelitian sepsis menunjukkan adanya apoptosis limfosit (Remick, 2007). Namun pada penelitian oleh Hotchkiss et al bahwa pada pasien dengan sepsis akan terjadi apoptosis limfosit yang signifikan (Hotchkiss et al, 2001), dan juga akan menginduksi secara masif, pelepasan secara cepat beberapa molekul proinflamatori pada hewan percobaan dan manusia (Copeland et al, 2005) hal ini dimungkinkan terjadi karena pada penggunaan model endotoksin, dalam hal ini LPS, berdasarkan peristiwa syok septik dan MODS (Deitch, 2005). Pada paparan CI hitung limfosit menunjukkan nilai lebih yang rendah daripada kelompok kontrol dan secara statistik bermakna (p=0,000). Hal ini sesuai bahwa pada hari ke-3 dan hari ke-7 terjadi kenaikan caspase-3, procaspase-3, dan Bax tetapi terjadi penurunan BCl2 yang akan menginduksi apoptosis (Chopra dan Sharma, 2007).
Kematian sel secara apoptosis terjadi melalui 3 jalur utama yaitu: jalur ekstrinsik (tipe I), jalur intrinsik (mitokondrial) (type II), dan jalur retikulum endoplasmik (RE) atau stress-induced pathway. Antigen Fas [cell differentiation antigen 95 (CD95)] adalah protein permukaan sel pada membran reseptor TNF, yang bertanggungjawab sebagai sinyal apoptosis jalur ekstrinsik pada tipe I. Fas diekspresisksn oleh berbagai macam tipe sel, termasuk timosit, sel B teraktivasi, sel T, monosit, makrofag, neutrofil, sebagaimana pula pada berbagai macam non imun sel pada hati, paru-paru, dan jantung. Ketika Fas berikatan dengan ligannya yaitu FasL akan menyebabkan trimerisasi dan kemudian membentuk formasi death-induced signaling complex (DISC), dimana akan terjadi pengerahan pembentukan molekul adaptor kematian sel, yang akan berikatan dengan procaspase 8. kemudian jalur ini akan melalui jalur caspase cascade. Ketika procaspase 8 is membelah dan menjadi caspase 8 aktif, kemudian mengaktivasi caspase 3, yang akan menjadi inhibitor caspase-aktivasi DNase dan pembelahan DNA pada nukleus (Aneway, 2001) menyebabkan apoptosis. Alternatif yang lain adalah
tipe II diperankan oleh mitokondria yang akan melepaskan molekul
destruktif, dan sedikit membentuk DISC. Jalur tersebut teraktivasi saat kehilangan faktor pertumbuhan seperti IL-2, IL-4, atau or granulocyte macrophage-colony stimulating factor, peningkatan sitokin seperti IL-1 dan IL-6, atau eksogen stresor seperti steroid, reactive oxygen intermediates (ROIs), peroxynitrite, or NO, yang akan mengaktivasi pro atau antiapoptosis anggota kelompok Bcl-2. Proapoptotik Bcl-2 seperti t-Bid atau Bax diperkirakan berlokasi pada sitosol, dimana secara
normal dalam batas tertentu, dalam membran mitokondrial digunakan untuk mengurangi
m. Mitochondrion kemudian melepas sitokrome c, Smac/Diablo,
dan apaf-1, lewat formasi apoptosome, mengaktivasi downstream caspases seperti caspase 9. Downstream caspase ini menyebabkan kematian sel. Bergantung pada keseimbangan anggota kelompok Bcl-2, dalam keadaan dominan pada kelompok antiapoptosis seperti bisa mempertahankan kehidupan sel (Krammer, 2000) RE mengaktivasi caspese 12 by Ca2+ dan stess oksidan (Oyadomari dan Mori, 2004).
BAB VI SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan Dalam penelitian ini didapatkan CI secara bermakna mampu menurunkan hitung limfosit dibandingkan LPS. B. Saran Untuk penelitian lebih lanjut dapat dilakukan: 1. Perhitungan limfosit secara lebih spesifik misalnya limfosit CD4+ 2. Pemeriksaan sitokin-sitokin yang berkaitan dengan patogenesis sepsis 3. Penggunaan cecal inoculum sebagai pertimbangan salah satu model penelitian sepsis
DAFTAR PUSTAKA Abbas A. K. and Lichtman A. H., 2005. Cellular and Molecular Immunology. 5th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders, pp : 295-343.
1
Alexander C., Rietschel E.T. 2001. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. J Endotoxin Res. 7:167-202. Amersfoort E. S. V., Berkel T. J. C. V., Kuiper J. 2003. Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. Clin Microbiol Rev. 16(3): 379–414. Angus D. C., Linde Z. W. T., Lidicker J., Clermont G., Carcillo J., Pinsky M. R. 2001. Epidemiology of severe sepsis in the united state: analysis of incidence and associated costs of care. Crit Care Med. 29: 1303-9. Aneway C. W., Jr. 2001. How the immune system works to protect the host from infection: a personal view. Proc Natl Acad Sci. 98: 7461-8. Arul M. C., Markus H. L., Chandan K. S., Terrence R. B., Sunita S. S., Vidya J. S., Vaishalee A. P., and Peter A.W. 2001. Molecular signatures of sepsis multiorgan gene expression profiles of systemic inflammation. Am J Pathol. 159(4): 1199–1209. Balk R. A. 2000. Severe sepsis and septic shock: definition, epidemiologi, and clinical manifestation. Crit Care Clin. 16(2): 179-92. Bochud P. Y., Calandra T. 2003. Science, medicine, and the future, Pathogenesis of sepsis: new concepts and implications for future treatment. BMJ. 326:262–6. Brahmbhatt S., Gupta A., Sharma A.C. 2005. Bigendothelin-1 (1-21) fragment during early sepsis modulates tau, p38-MAPK phosphorylation and nitric oxide synthase activation. molecular and cellular biochemistry. Experimental Cell Research. 271:225–37. Brooks G. F., Butel J., Morse A.S. 2003. Medical Microbiology. 22th ed. Singapore: Mc Graw Hill Co, p: 217. Chang K. C., Unsinger J., Davis C. G., Schwulst S. J., Muenzer J. T., Strasser A., Hotchkiss R. S. 2007. Multiple triggers of cell death in sepsis: death receptor and mitochondrialmediated apoptosis. FASEB J. 21: 708-19.
Chopra M. and Sharma A. C. 2007. Distinct cardiodynamic and molecular characteristics during early and late stages of sepsis-induced myocardial dysfunction. Life Sci. 81(4): 306–16. Copeland S., Warren H. S., Lowry S. F., Calvano S. E., Remick D. 2005. Acute inflammatory response to endotoxin in mice and humans. Clin Diagn Lab Immunol. 12: 60–7 Deitch E. A. 2005. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24, Suppl.1: 19-23. Diding H. P. 2005. Imunokimia. Dalam: Kimia Kedokteran. Surakata: Sebelas Maret University Press, p: 148. Dorland, W.A. 1998. Kamus Saku Kedokteran Dorland. Jakarta: EGC, pp: 199, 559. Fox, S. I. 2002. Human Physiologi. 7th ed. Boston: McGraw Hill Co, p: 452. Gaïni S., Koldkjær O.G., Pedersen C., Pedersen S. S. 2006. Procalcitonin, lipopolysaccharide-binding protein, interleukin-6 and C-reactive protein in community-acquired infections and sepsis: a prospective study. Critical Care. 10: 1-10. cce Gandasoebrata, R. 2001. Penuntun Laboratorium Klinik. Jakarta: Dian Rakyat, p: 33. Garrido A. G., Poli F. F., Silva M. R. 2004. Experimental models of sepsis and septic shock: an overview. Acta Cir Bras. 19(2): 82-8. Gartner L. P., Hiatt J. L. 2007. Color Textbook of Histology. 3th ed, International Edition. Philadelphia: Elsevier, pp: 231. Guntur A. H. 2006a. Penyakit tropik dan infeksi, sepsis. Dalam: Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Jilid III Edisi IV. Jakarta: Pusat Penerbitan Departemen Ilmu Penyakit Dalam FKUI, pp:1840-3. Guntur A. H. 2006b. Sirs & Sepsis: Imunologi, Diagnosis, Penatalaksanaan. Surakarta: Sebelas Maret University Press, pp: 1-14. Guntur A. H. 2007. Imunopatobiologik sepsis dan penatalaksanaanya. Simposium Nasional SEPSIS dan Antimikrobial Terkini. Surakarta: PETRI, pp: 31-6.
Guntur A. H. 2008. Clinical observation of IVIG in management of sepsis. Proseding of National Symposium : The Second Indonesia SEPSIS Forum. Surakarta: PETRI, pp:106-13. Guyton and Hall, 1997. Resistensi tubuh terhadap infeksi: leukosit, granulosit, sistem makrofag-monosit, dan inflamasi. Dalam : Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. 9th ed. Jakarta: EGC, pp: 556-66. Hongwei Q., Cynthia A.W., Sun J.L., Xueyan Z., and Etty N. B. 2005. LPS induces CD40 gene expression through the activation of NF-κB and STAT-1α in macrophages and microglia. Blood.106(9): 3114–22. Hotchkiss R. S., Dunne W. M., Swanson P. E., Davis C. G., Tinsley K. W., Chang K. C., Buchman T. G., Karl I. E. 2001. Role of apoptosis in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Science. 294:1783. Junqueira L.C., Carneiro J. 2005. Basic Histology. 11th ed. Boston: McGraw Hill Co, p: 233. Krammer, P. H. 2000. CD95’s deadly mission in the immune system. Nature. 407: 789-95. Kristine M. J., Sarah B. L., Anncatrine L. P., Jesper E. O., and Thomas B. 2007. Common TNF-α, IL-1β, PAI-1, uPA, CD14 and TLR4 polymorphisms are not associated with disease severity or outcome from Gram negative sepsis. BMC Infect Dis. 7: 108. Krutzel M. L., Harari Y., Chen C. Y., Castro G. A. 2000. Lactoferin protecs gut mucosal integrity during endotoxemia induce by lipopolysaccharide in mice. Inflammation. 24: 33-44. Murray K.R., Granner K. D., Mayes A. P., Rodwell W. V. 2003. Biokimia Harper. 23th ed. Jakarta: EGC, p :711. Oyadomari, S., Mori, M. 2004. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ. 11: 381-9 Poeze M., Ramsay G., Gerlach H., Rubulotta F., Levy M. 2004. An international sepsis survey: a study of doctors' knowledge and perception about sepsis. Critical Care. 8(6): 409-13. Remick D. G. 2007. Biological perspectives pathophysiology of sepsis. Am J Pathol. 170(5). 1435-44.
Ren J., Ren B. H., Sharma, A. C. 2002. Sepsis-induced depressed contractile function of isolated ventricular myocytes is due to altered calcium transient properties [basic science aspects]. Shock. 18(3): pp 285-8. Rey E. G., Chorny A., Robledo G., Delgado M. 2006. Cortistatin, a new antiinflammatory peptide with therapeutic effect on lethal endotoxemia. J Exp Med. 203(3): 563–71. Rozenberg G. 1996. Microscopic Haematology: a Practical Guide for Laboratory. Amsterdam: Harwood Academica Publisher GmbH, p: 90. Wang X. L., Li Y., Kuang J. S., Zhao Y., Liu P. 2006. Increase heat shock protein 70 expression in the pancreas of rats with endotoxic shock. World J Gastroenterol. 12(5): 780-3 Wesche D. E., Lomas-Neira J. L., Perl M., Chung C. S., Ayala A. 2005. Leukocyte apoptosis and its significance in sepsis and shock. Journal of Leukocyte Biology. 78:325-37. Zukesti, E. 2003. Peranan Leukosit Sebagai Anti Inflamasi Alergik Dalam Tubuh. USU Digital Library.
Lampiran A. Jadwal Penelitian Kelompok
Hari ke0
1
2
3
4
5
Kontrol
LPS
0,1 mg LPS/ mencit/ i.p
Cecal inoculum
4 mg CI/ mencit/ i.p
4 mg CI/ mencit/ i.p
4 mg CI/ mencit/ i.p
4 mg CI/ mencit/ i.p
4 mg CI/ mencit/ i.p
4 mg CI/ mencit/
Lampiran B. Foto Alat dan Bahan Penelitian
Gambar 1. Mencit Kelompok Kontrol
Gambar 2. Mencit Kelompok LPS
Gambar 3. Mencit Kelompok Cecal Inoculum
Gambar 4. Timbangan Camry Gambar 6. Gelas Ukur
Gambar 5. Spuit Injeksi
Lampiran C. Foto Kegiatan Penelitian
Gambar 1. Adaptasi Mencit Gambar 3. Mengambil Caecum Mencit
Gambar 2. Menimbang Mencit
Gambar 4. Membuat Caecal Inoculum Gambar 6. Membuat Apusan Darah
Gambar 5. Injeksi Intra Peritoneal
Lampiran D. Hasil Uji Analisis One Way Anova dan Post Hoc Test dengan Program SPSS For Windows Release 15.0 Descriptives Hitung Limfosit N
Mean
Std. Deviation
4.590
1.874
Lower Bound 84.85
Upper Bound 94.48
88.17
2.563
1.046
85.48
90.86
68.67
10.633
4.341
57.51
79.83
82.17
11.759
2.772
76.32
88.01
Kontrol
6
89.67
LPS
6
Cecal Inoculum
6 18
Total
95% Confidence Interval for Mean
Std. Error
Test of Homogeneity of Variances Hitung Limfosit Levene Statistic 1.882
df1
df2 2
Sig. .187
15
Oneway ANOVA Hitung Limfosit
Between Groups
Sum of Squares 1647.000
Mean Square 2
823.500
703.500
15
46.900
2350.500
17
Within Groups Total
df
F
Sig.
17.559
.000
Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: jumlah limfosit LSD
(I) perlakuan
(J) perlakuan
kontrol
Lps Ci
lps
Control Ci
Mean Difference (I-J)
Std. Error
Control Lps
95% Confidence Interval
6.667 21.000(*)
3.974 3.974
.114 .000
Lower Bound -1.80 12.53
Upper Bound 15.14 29.47
-6.667
3.974
.114
-15.14
1.80
3.974 3.974 3.974
.003 .000 .003
5.86 -29.47 -22.80
22.80 -12.53 -5.86
14.333(*) -21.000(*) -14.333(*) * The mean difference is significant at the .05 level. ci
Sig.
Minimum
Lampiran E Hasil Laboratorium Hitung Limfosit Jenis Sampel Kontrol-1 Kontrol-2 Kontrol-3 Kontrol-4 Kontrol-5 Kontrol-6 Rata-rata
Persentase Limfosit 86% 92% 87% 94% 84% 95% 90%
Jenis Sampel LPS 0,1-1 LPS 0,1-2 LPS 0,1-3 LPS 0,1-4 LPS 0,1-5 LPS 0,1-6
Persentase Limfosit 90% 85% 86% 92% 88% 88%
Rata-rata Jenis Sampel CI-1 CI-2 CI-3 CI-4 CI-5 CI-6 Rata-rata
88% Persentase Limfosit 88% 58% 60% 68% 70% 68% 69%
Lampiran F. Hasil Penghitungan Jumlah Limfosit Tiap Seratus Sel No
Kelompok Perlakuan K-1 K-2 K-3 K-4 K-5 K-6
Jumlah Limfosit 86 92 87 94 84 95 538 89,7
Kelompok Perlakuan L-1 L-2 L-3 L-4 L-5 L-6
1 2 3 4 5 6 Jumlah Rata-rata Keterangan: K : Kelompok kontrol negatif L : Kelompok LPS C : Kelompok Cecal Inoculum
Jumlah Limfosit 90 85 86 92 88 88 529 88,2
Kelompok Perlakuan C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6
Jumlah Limfosit 88 58 60 68 70 68 412 68,7
