artus C. trachomatis Plus RG PCRKit Manuál

Leden 2015

artus® C. trachomatis Plus RG PCRKit Manuál

24 (Katalogové čís. 4559263) 96 (Katalogové čís. 4559265)

Verze 1 In vitro diagnostikum pro kvantitativní stanovení Pro použití s přístrojem Rotor-Gene® Q

4559263, 4559265 QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, NĚMECKO R6

1046969CS

Sample & Assay Technologies

QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN je vedoucím poskytovatelem inovativních technologií pro přípravu vzorků a jejich rozbory, které umožňují izolaci a analýzu jakéhokoliv biologického vzorku. Naše vysoce kvalitní produkty a služby Vám zajistí úspěšný výsledek. QIAGEN určuje standardy pro:

 purifikaci DNA, RNA a proteinů  rozbor nukleových kyselin a proteinů  microRNA výzkum a RNAi  automatizaci technologií pro přípravu vzorků a jejich rozbory Poskytujeme Vám nejnovější technologie, abyste rychle a spolehlivě dosáhli nejlepších výsledků. Více informací naleznete na www.qiagen.com.

Obsah Obsah kitu

4

Symboly

4

Skladování

5

Zamýšlený účel použití

5

Zvláštní pokyny pro použití produktu

5

Úvod

7

Princip

7

Informace o původci

7

Charakteristika výkonu

8

Potřebné vybavení a reagencie nedodávané se soupravou

18

Důležité pokyny

19

Všeobecná preventivní opatření

19

Odběr, skladování a přeprava vzorků

19

Izolace DNA

21

Interní kontrola

27

Protokol: PCR a analýza dat

28

Řešení problémů

37

Literatura

39

Informace o objednání

40

artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manuál 01/2015

3

Obsah kitu artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Katalogové číslo Počet reakcí

(24)

(96)

4559263

4559265

24

96

Modrá

C. trachomatis Plus RG Master

2 x 12 reakcí 8 x 12 reakcí

Žlutá

C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol*

400 µl

400 µl

Červená

C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control

200 µl

200 µl

Zelená

C. trachomatis Plus RG IC‡

1000 µl

2 x 1000 µl

Bílá

Water (PCR grade)

1000 µl

1000 µl

1

1

Manuál artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit (česky) * †

Roztok hořčíku. Interní kontrola.

Symboly

Obsah reagencií postačuje pro testů Použitelné do

Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro

Katalogové číslo Číslo šarže Číslo materiálu Komponenty Obsahuje

4


Počet Mezinárodní číslo obchodní položky GTIN Teplotní rozmezí Výrobce Přečtěte si informace uvedené v návodu k použití Upozornění

Skladování Komponenty artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit se skladují při –15 až –30°C a mají trvanlivost do data uvedeného na štítku. Zabraňte opakovanému rozmrazení a zmrazení (> 2 x), snižuje se tím senzitivita. Při nepravidelném používání by proto měly být reagencie alikvotovány. V případě, že je nutné komponenty skladovat při teplotě 2–8°C, skladujte je takto maximálně po dobu pěti hodin.

Zamýšlený účel použití artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit je in vitro amplifikační test nukleové kyseliny pro průkaz C. trachomatis DNA ze vzorků moči, stěrů z očí, výtěrů (endocervikální nebo uterální) nebo ze spermatu. Tato diagnostická souprava využívá polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a je konfigurována pro použití s přístroji Rotor-Gene Q.

Zvláštní pokyny pro použití produktu Všechny reagencie se smí používat výhradně pro diagnostiku in vitro. Prostředek by měli používat pouze pracovníci, kteří jsou speciálně poučeni a vyškoleni v metodice diagnostiky in vitro. Přesné dodržování protokolu je bezpodmínečně nutné k dosažení optimálních výsledků PCR. Dbejte na konec doby použitelnosti uvedený na balení a na štítcích jednotlivých komponent. Nepoužívejte reagencie s prošlou trvanlivostí. Přestože jde o vzácné př ípady, mohou mutace v rámci vysoce konzervovaných regionů bakteriálního genomu pokrytého priméry sady a/nebo sondou vést k nedostatečné kvantifikaci či neúspěšné detekci přítomnosti bakterie za takových okolností. Validita a chování designu rozboru se pravidelně revidují.


5

Varování a bezpečnostní opatření Při práci s chemikáliemi noste vždy laboratorní oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle. Více informací naleznete v příslušných bezpečnostních listech (safety data sheets, SDS). Tyto listy jsou k dispozici v podobě kompaktního a snadno použitelného PDF souboru na www.qiagen.com/safety, kde můžete nalézt, prohlédnout a vytisknout SDS ke každé QIAGEN® soupravě nebo komponentě. Bezpečnostní informace pro použitou purifikační sadu viz manuál k příslušné sadě. Bezpečnostní informace ohledně přístrojů viz příslušný návod k použití přístroje. Odpad ze vzorků a rozborů likvidujte podle místních bezpečnostních předpisů.

6


Úvod artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit je systém k přímému použití pro průkaz C. trachomatis DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) v přístrojích Rotor-Gene Q. C. trachomatis Plus RG Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou amplifikaci 106 bp dlouhého úseku genomu C. trachomatis a 111 bp dlouhého úseku kryptického plazmidu C. trachomatis, a také pro bezprostřední detekci obou amplifikátů ve fluorescenčním kanálu Cycling Green přístroje Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q a Rotor-Gene 6000, nebo v kanálu Cycling A.FAM® přístroje Rotor-Gene 3000. Kromě toho obsahuje artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit druhý heterologní amplifikační systém pro průkaz potenciální PCR inhibice. Tento systém je detekován jako interní kontrola (IC) ve fluorescenčním kanálu Cycling Yellow přístroje Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q a Rotor-Gene 6000, nebo v kanálu Cycling A.JOE™ přístroje Rotor-Gene 3000. Limit detekce analytické C. trachomatis PCR (viz “Analytická senzitivita”, strana 8) přitom není negativně ovlivněn. Spolu s produktem se dodává externí pozitivní kontrola (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control).

Princip Při diagnostikování pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) se amplifikují specifické oblasti genomu původce. Detekce probíhá při PCR v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce intenzity fluorescence v průběhu PCR v reálném čase umožňuje průkaz a kvantifikaci produktů, aniž by bylo nutné po PCR znovu otevírat testovací zkumavky.*

Informace o původci Bakterie rodu Chlamydia (C.) mají celosvětově velký epidemiologický význam. Chlamydia trachomatis (sérotypy D – L) patří na celém světě k nejčastějším původcům pohlavně přenosných chorob (STD – sexually transmitted diseases). Šestnáct sérovarů C. trachomatis vyvolává různá onemocnění. Sérovary A - C způsobují trachom, chronicky recidivující onemocnění spojivek a rohovky rozšířené v tropech. Sérovary D – K způsobují pohlavně přenosné urogenitální infekce a oční infekce, dále také novorozenecké infekce po perinatálním přenosu. Sérovary LGV I - III způsobují lymphogranuloma venereum, pohlavně přenosnou chorobu vyskytující se převážně v tropech. Trachom se vyskytuje téměř výhradně v tropických zemích v podmínkách s nedostatečnou hygienou. Představuje nejčastější oční chorobu na světě a je po šedém zákalu druhou nejčastější příčinou oslepnutí. Předpokládá se, že je infikováno přibližně 150 miliónů lidí. Přibližně u šesti miliónů došlo k oslepnutí. V průmyslově vyspělých zemích jsou chlamydie nejčastějšími bakteriálními původci urogenitálních infekcí. V Německu se počet nových genitálních infekcí odhaduje na 300 000 ročně. Incidence lymphogranuloma venereum (Lymphogranuloma inguinale, Durand* Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190.


7

Nicolas-Favreova choroba) celosvětově klesá. Tato pohlavně přenosná choroba je však v Asii, Africe, Jižní Americe a v částech Karibské oblasti stále ještě endemická.

Charakteristika výkonu Analytická senzitivita Pro validaci artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit byl určen jak analytický limit detekce, tak analytický limit detekce s přihlédnutím k izolaci (limit senzitivity). Analytický limit detekce s ohledem na izolaci byl určen na základě C. trachomatis pozitivních klinických vzorků a s přihlédnutím na použité metody izolace. Analytický limit detekce byl naproti tomu determinován na základě standardu známé koncentrace, bez klinických vzorků a nezávisle na metodě izolace. Pro určení analytického limitu detekce artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit byla vytvořena řada ředění C. trachomatis sérovarů E od 10 do 0,003 a od 6,6 do nominálně 0,0006 C. trachomatis ekvivalentů bakteriálního genomu/µl (ebg/µl) a analyzována pomocí artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit na přístroji Rotor-Gene Q MDx/Q/6000 resp. Rotor-Gene 3000. Experimenty byly provedeny ve třech různých dnech formou osminásobných určení. Výsledek byl zjištěn pomocí probitové analýzy na přístroji Rotor-Gene 6000. Jeho grafické vyhodnocení je zobrazeno na obrázku 1. Analytický limit detekce artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit leží u 0,04 egb/µl (p = 0,05) resp. 0,2 egb/µl (p = 0,05). To znamená, že bude s 95% pravděpodobností detekováno 0,04 egb/µl (p = 0,05) nebo 0,2 egb/µl (p = 0,05).

Obrázek 1. Probitová analýza : C. trachomatis (Rotor-Gene 6000). Analytická senzitivita soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit za užití přístroje Rotor-Gene 6000.

Analytický limit detekce s ohledem na izolaci (QIAamp® DNA Mini Kit, QIAGEN) soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit na přístroji Rotor-Gene byl určen řadou ředění C. trachomatis sérovarů E od 6,6 do nominálně 0,0006 C. trachomatis ebg/µl v klinických výtěrových vzorcích. Tyto vzorky byly podrobeny izolaci DNA

8


pomocí QIAamp DNA Mini Kit (extrakční objem: 200 µl, eluční objem: 100 µl). Jednotlivé fáze ředění z celkových 8 byly analyzovány ve třech různých dnech formou osminásobných určení za užití artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Výsledek byl zjištěn probitovou analýzou. Jeho grafické vyhodnocení je zobrazeno na obrázku 3. Analytický limit detekce s ohledem na izolaci soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit v kombinaci s Rotor-Gene 3000 leží u 300 ebg/ml (p = 0,05). To znamená, že bude s 95 % pravděpodobností detekováno 300 ebg/ml.

Obrázek 2. Probitová analýza : C. trachomatis (Rotor-Gene 3000). Analytická senzitivita s ohledem na izolaci (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN) soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit za užití přístroje 3000.

U analytické senzitivity s ohledem na izolaci pomocí QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit za užití přístroje RotorGene lze předpokládat srovnatelnou senzitivitu, která byla dosažena s QIAamp DNA Mini Kit, protože průměrný úbytek po izolaci obou použitých extrakčních metod činí 0,3 – 1,8 %. Specificita Specificita artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit je v první řadě zaručena výběrem primerů a sond, jakož i volbou přísných reakčních podmínek. Primery a sondy byly na základě sekvenční analýzy přezkoušeny na eventuální homologie se všemi sekvencemi publikovanými v genových bankách. Detekovatelnost všech relevantních sérovarů byla zajištěna jak pomocí alignmentu databáze, tak pomocí PCR na přístroji Rotor-Gene s následujícími sérovary (viz Tabulka 1).


9

Tabulka 1. Testování specificity relevantních sérovarů

Chlamydia

Sérovar

Zdroj

C. trachomatis (Cycling Green nebo A.FAM)

Interní kontrola (Cycling Yellow nebo A.JOE))

C. trachomatis

A

ATCC* (VR-571B)

+

+

C. trachomatis

B

ATCC (VR-573)

+

+

C. trachomatis

Ba

ATCC (VR-347, prep 1)

+

+

C. trachomatis

C

ATCC (VR-572)

+

+

C. trachomatis

D

ATCC (VR-885)

+

+

C. trachomatis

E

ATCC (VR-348B)

+

+

C. trachomatis

F

ATCC (VR-346)

+

+

C. trachomatis

G

ATCC (VR-878)

+

+

C. trachomatis

H

ATCC (VR-879)

+

+

C. trachomatis

I

ATCC (VR-880)

+

+

C. trachomatis

J

ATCC (VR-886)

+

+

C. trachomatis

K

ATCC (VR-887)

+

+

C. trachomatis

LGV I

ATCC (VR-901B)

+

+

C. trachomatis

LGV II

ATCC (VR-902B)

+

+

C. trachomatis

LGV II

ATCC (VR-577)

+

+

C. trachomatis

LGV III

ATCC (VR-903)

+

+

* American Type Culture Collection.

10


Validace specificity byla provedena na 30 různých C. trachomatis negativních vzorcích moči, 100 vzorcích výtěrů a 30 vzorcích spermatu, které spolu s C. trachomatis specifickými primery a sondami obsaženými v C. trachomatis Plus RG Master negenerovaly žádný signál. K určení specificity artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit byla kontrolní skupina uvedená v tabulce 2 testována na křížovou reaktivitu. Žádný z testovaných původců nebyl reaktivní. Při smíšených infekcích se nevyskytly žádné křížové reaktivity.

Tabulka 2. Testování specificity diagnostické soupravy pomocí potenciálně křížově reaktivních původců

Kontrolní skupina

C. trachomatis (Cycling Green nebo Cycling A.FAM)

Interní kontrola (Cycling Yellow nebo Cycling A.JOE))

Acinetobacter spp.

–

+

Bordetella pertussis

–

+

Candida albicans

–

+

Candida glabrata

–

+

Chlamydia pneumoniae

–

+

Chlamydia psittaci

–

+

Enterobacter cloacea

–

+

Enterococus faecalis

–

+

Escherichia coli

–

+

Gardnerella vaginalis

–

+

Haemophilus parainfluenzae

–

+

Klebsiella pneumoniae

–

+

Neisseria gonorrhoeae

–

+

Proteus mirabilis

–

+

Proteus vulgaris

–

+

Salmonella enteritides

–

+

Salmonella typhimurium

–

+

Staphylococcus aureus

–

+

Streptococcus pneumoniae

–

+

Streptococcus pyogenes

–

+


11

–

Herpes simplex virus 1 a 2

+

Přesnost Údaje o přesnosti pro artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit byly získány za užití přístrojů Rotor-Gene a umožňují stanovení celkové variability testovacího systému. Tato celková variabilita se skládá z Intra-Assay variability (variabilita vzorků stejné koncentrace v rámci jednoho pokusu), z Inter-Assay variability (variabilita způsobená provedením experimentu různými osobami v jedné laboratoři a užitím různých přístrojů stejného typu) a z Inter-Batch variability (variabilita způsobená použitím různých šarží). Přitom byla vždy vypočítána standardní odchylka, variance a koeficient variace jak pro specifickou PCR původce, tak i pro PCR interní kontroly. Tyto údaje byly pro artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit stanoveny na základě C. trachomatis sérovaru E pomocí koncentrace (2,1 ebg/µl s ohledem na izolaci, 0,66 ebg/µl bez ohledu na izolaci), která leží nejblíže k třínásobné cut-off hodnotě. Experimenty byly provedeny formou osminásobných určení. Vyhodnocení výsledků bylo provedeno na základě CT hodnot amplifikačních křivek (CT: threshold cycle, viz Tabulka 3). Celková variabilita libovolného vzorku uvedené koncentrace činí tedy 2,45 % (CT) a 1,87 % (CT) s ohledem na izolaci (QIAamp DNA Mini Kit, Tabulka 4); pro průkaz interní kontroly 3,34 % (CT) a 2,13 % (CT) s ohledem na izolaci (QIAamp DNA Mini Kit). Tyto hodnoty se zakládají na souhrnu všech dílčích hodnot zjištěných variabilit. Tabulka 3: Údaje o přesnosti na základě CT hodnot

Intra-Assay variabilita: C. trachomatis sérovar E (0,66 ebg/µl) Intra-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Assay variabilita: C. trachomatis sérovar E (0,66 ebg/µl) Inter-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Batch variabilita: C. trachomatis sérovar E (0,66 ebg/µl) Inter-Batch variabilita: Interní kontrola Celková variabilita:

12

Standardní odchylka

Variance

Koeficient variace (%)

0,38

0,14

1,23

0,05

0,01

0,36

0,58

0,33

1,90

1,08

1,18

4,80

0,46

0,21

1,47

0,39

0,15

1,74

0,64

0,41

2,45


C. trachomatis sérovar E (0,66 ebg/µl) Celková variabilita: Interní kontrola

0,85

0,72

3,34

Tabulka 4. Údaje o přesnosti na základě Ct hodnot s ohledem na izolaci s QIAamp DNA Mini Kit

Intra-Assay variabilita: C. trachomatis sérovar E (2,1 ebg/µl) Intra-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Assay variabilita: C. trachomatis sérovar E (2,1 ebg/µl) Inter-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Batch variabilita: C. trachomatis sérovar E (2,1 ebg/µl) Inter-Batch variabilita: Interní kontrola Celková variabilita: C. trachomatis sérovar E (2,1 ebg/µl) Celková variabilita: Interní kontrola

Standardní odchylka

Variance

Koeficient variace (%)

0,33

0,11

1,06

0,27

0,07

1,12

0,49

0,11

1,09

0,49

0,24

2,07

0,58

0,34

1,83

0,31

0,09

1,33

0,58

0,34

1,87

0,50

0,25

2,13

Robustnost Přezkoušení robustnosti slouží k stanovení celkové četnosti chyb soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Za tímto účelem bylo 100 C. trachomatis negativních vzorků moči, 100 výtěrových vzorků a 30 vzorků spermatu smíseno s 2,1 ebg/µl elučního objemu kontrolní C. trachomatis DNA (cca třínásobná koncentrace analytického limitu senzitivity), pomocí QIAamp DNA Mini Kit (vzorky výtěrů a spermatu) a QIAamp Viral RNA Mini Kit (vzorky moči) izolováno a pomocí artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit analyzováno. Robustnost interní kontroly byla dodatečně přezkoušena izolací a analýzou 30 C. trachomatis negativních vzorků moči, 100 výtěrových vzorků a 30 vzorků spermatu. Celková četnost chyb činila 0 %.


13

Inhibice nebyly pozorovány. Robustnost artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit činí tedy  99 %.

14


Reprodukovatelnost Údaje o reprodukovatelnosti jsou pořizovány za účelem pravidelného hodnocení výkonnosti artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit a výkonnostního srovnání s ostatními produkty. Tyto údaje jsou získávány na základě účastí v uznávaných programech pro výkonnostní hodnocení. Diagnostické hodnocení artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit byl evaluován ve 4 studiích. Diagnostické hodnocení 1: Srovnání výtěrových vzorků a vzorků moči s COBAS® Amplicor® CT/NG Assay Při srovnání soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit s COBAS Amplicor CT/NG Assay bylo testováno 107 retrospektivních výtěrových vzorků a vzorků moči. Senzitivita soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit činila v této studii 98 %. Inhibice nebyly pozorovány. Diagnostická specificita soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit činí 100 %. Diskrepantní vzorek (Tabulka 5) byl v předchozím testování na přístroji LightCycler® 2.0 a COBAS Amplicor CT/NG Assay pozitivně analyzován dvěma průkazovými systémy pro C. trachomatis (artus versus COBAS® Amplicor). Skladováním způsobený úbytek koncentrace vzorku vede k posunutí limitu detekce obou rozborů. Diskrepantní výsledky obou vzorků tedy nebyly způsobeny nespecifickou amplifikací nebo detekcí na straně artus souprav nebo COBAS Amplicor Assay. Tabulka 5. Výsledky srovnávací validační studie 1 COBAS Amplicor CT/NG Assay

artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit

+

–

Celkově

+

47

1

48

–

1

58

59

Diagnostické hodnocení 2: Srovnání vzorků spermatu s COBAS Amplicor CT/NG Assay Při srovnání soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit s COBAS Amplicor CT/NG Assay bylo testováno 65 prospektivních vzorků spermatu. Pro 65 testovaných prospektivních vzorků spermatu vychází korelace soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit o 100 % v porovnání s COBAS Amplicor Assay. Četnost inhibicí činí 0 %. Diagnostická senzitivita činí 100 %. Diagnostická specificita soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit činí 100 %. (Tabulka 6).


15

Tabulka 6. Výsledky srovnávací validační studie 2 COBAS Amplicor CT/NG Assay


+

–

Celkově

+

16

0

16

–

0

49

49

Diagnostické hodnocení 3: Srovnání výtěrových vzorků a vzorků moči s LCx® a Aptima® Combo 2™ Assay Při srovnání soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit s LCR (ligázovou řetězovou reakcí, LCx® CT Assay) a TMA (transkripcí zprostředkovaná amplifikace Aptima Combo 2 Assay) bylo testováno 234 retrospektivních výtěrových vzorků a vzorků moči. Korelace ligázové řetězové reakce (LCx CT Assay) a Aptima Combo 2 Assay s artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit činí v této studii 98 % pro retrospektivní výtěrové vzorky a vzorky moči. Diagnostická specificita soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit činí 99 % (Tabulka 7). Tabulka 7. Výsledky srovnávací validační studie 3 LCx/Aptima Combo 2


+

–

Celkově

+

104

1

105

–

2

127

129

Diagnostické hodnocení 4: Testování klinických očních stěrů 100 dříve testovaných vzorků očních stěrů bylo retrospektivně testováno pomocí artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Pro 100 testovaných retrospektivních očních stěrů činí diagnostická senzitivita soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 100 %. Diagnostická specificita soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit činí 100 % (Tabulka 8).

16


Tabulka 8. Výsledky srovnávací validační studie 4 Očekávaný výsledek


+

–

Celkově

+

5

0

5

–

0

95

95


17

Potřebné vybavení a reagencie nedodávané se soupravou Při manipulaci s chemikáliemi noste vždy laboratorní oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle. Další informace naleznete v příslušných bezpečnostních listech (safety data sheets, SDS), které získáte u výrobce.

     

DNA-izolační souprava (viz “Izolace DNA“, strana 21)



Rotor-Gene Q MDx/Rotor-Gene Q software verze 1.7.94 nebo vyšší (RotorGene 6000 software verze 1.7.65, 1.7.87, 1.7.94; Rotor-Gene 3000 software verze 6.0.23)



Strip Tubes and Caps, 0,1 ml, pro použití s 72 jamkovým rotorem (kat. čís. 981103 nebo 981106)



artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit není validována pro použití s 36 jamkovým rotorem Rotor-Gene



Chladicí blok (Loading Block 72 x 0.1 ml Tubes, kat. čís. 9018901 nebo Loading Block 96 x 0.2 ml Tubes, kat. čís. 9018905)

18

Pipety (nastavitelné)* Sterilní pipetovací špičky s filtrem Vortex mixer * Stolní centrifuga* s rotorem pro 2 ml zkumavky Přístroj Rotor-Gene Q MDX, Rotor-Gene Q nebo Rotor-Gene* s fluorescenčními kanály Cycling Green a Cycling Yellow, nebo s fluorescenčními kanály Cycling A.FAM a Cycling A.JOE


Důležité pokyny Všeobecná preventivní opatření Uživatel by měl dbát na následující:

 

Používejte sterilní pipetovací špičky s filtrem.



Všechny komponenty před počátkem testu úplně rozmrazte při pokojové teplotě (15-25°C).



Následně komponenty řádně promíchejte (opakovaný náběr pipetou a vypuštění pipety nebo krátký vortex) a krátce centrifugujte.



Pracujte rychle a udržujte komponenty na ledu nebo v chladicím bloku (72/96well loading block).

Skladujte, izolujte a přidávejte pozitivní materiál (vzorky, kontroly, amplifikáty) do reakce na jiném místě než ostatní reagencie.

Odběr, skladování a přeprava vzorků Poznámka: Se všemi vzorky se musí zacházet jako s potenciálně infekčními. Přípustné jsou pouze následující vzorky, u kterých se musí bezpodmínečně dodržovat následující pravidla a předpisy pro odběr, skladování a přepravu.

  

Moč Endocervikální a uretrální výtěry a oční stěry Sperma

Aby byla zaručena vysoká kvalita vzorku, měla by přeprava vzorku proběhnout co nejrychleji. Vzorky musí být přepravovány za uvedených teplotních podmínek. Vzorky moči Poznámka: Pacient nesmí dvě hodiny před odběrem močit. Odeberte 5 - 30 ml první porce moči do čisté polypropylenové nádobky bez konzervačních činidel. Nádobky uzavřete a nadepište. Poznámka: Nepoužívejte vzorky moči, které byly odebrány do nádobek s konzervačními činidly. Bude-li rozbor moči proveden do 24 hodin, mohou být vzorky uloženy při pokojové teplotě (19 - 23°C). Pokud bude rozbor proveden do sedmi dnů od odběru, musí být vzorky uchovávány v lednici při 2 - 8°C. Vzorky moči, které nebudou zpracovány během sedmi dnů, mohou být skladovány nejdéle po dobu 30-ti dnů při -20°C nebo méně. Vzorky moči, které jsou určeny k zaslání, musí být až do odeslání uloženy v lednici při 2 - 8°C. Vzorky musí být zaslány podle platných místních a státních předpisů pro přepravu látek vyvolávajících nákazu.*

* International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations.


19

Výtěrové vzorky Poznámka: Pro odběr endocervikálních a uretrálních výtěrových vzorků a očních stěrů používejte prosím následující materiály. Poznámka: Používejte pouze výtěrové tampony se špičkami z Dacronu ®, Rayonu nebo z kalciumalginátu na násadách z plastu. Nepoužívejte výtěrové tampony s dřevěnými nebo hliníkovými násadami. Endocervikální a uretrální výtěrové vzorky a oční stěry mohou být odebrány a přepraveny v 1 - 3 ml následujících médií.

          

digene® Female Swab Specimen Collection Kit (QIAGEN, kat. čís. 5123-1220) digene Cervical Sampler (QIAGEN, kat. čís. 5122-1220) AMPLICOR STM (transportní médium pro vzorek, Roche, Inc.) STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.) M4 CTM (MicroTestTM, Thermo Fischer Scientific) 2SP CTM (Bartels, Inc.) Bartels ChlamTrans™ CTM (Bartels,Trinity Biotech) MastazymeTM Chlamydia Swab Set (MAST DIAGNOSTICA) Mastazyme Chlamydia Transport Medium (MAST DIAGNOSTICA) IDEIA™ Chlamydia Specimen Collection Kit (DakoCytomation) MicroTrak® II Chlamydia EIA Specimen Collection Kit (Trinity Biotech)

Tampon ponechte v transportním médiu. Nádobky uzavřete a nadepište. Dbejte předpisů pro přepravu a skladování.* Vzorky se skladují při 2 - 8°C. (Pokud musí být výtěrové vzorky do výzkumné laboratoře zaslány, musí být odeslány co nejdříve po odběru v souladu s laboratorními předpisy pro přepravu vzorků chlamydií.) Výtěrové vzorky, které nebudou testovány bezprostředně po doručení do laboratoře, musí být uskladněny při 2 - 8°C a během sedmi dní zpracovány. Výtěrové vzorky, které nemohou být zpracovány do sedmi dní po odběru, musí být uskladněny při –15 až –30°C nebo méně a testovány do 30-ti dnů po odběru. Výtěrové vzorky musí být přepravovány v chladu. Musí-li být výtěrové vzorky do laboratoře zaslány, je nutné je odeslat co nejdříve po odběru v souladu s laboratorními předpisy pro přepravu v chladu. Vzorky musí být zaslány podle platných místních a státních předpisů pro přepravu látek vyvolávajících nákazu.†

*

Biosafety in Microbiological Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. † International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations.

20


Vzorky spermatu Poznámka: Odběr vzorku by měl proběhnout nejdříve dva až čtyři dny po poslední ejakulaci. Poznámka: Vzorek spermatu musí být odebrán v ten samý den, kdy je zaslán do laboratoře. Za použití běžného laboratorního postupu může být vzorek spermatu odebrán jedním z následujících způsobů:



masturbací přímo do sterilní, čisté a suché nádobky na vzorek. Ujistěte se, že se do nádobky dostal celý vzorek. Došlo-li k úniku části vzorku, musí to být zaznamenáno do protokolu o odběru vzorku.



masturbací za použití prezervativu. Po ejakulaci kondom sejměte. Je důležité, aby byl nahoře uzavřen gumičkou kvůli udržení vzorku spermatu uvnitř prezervativu. Kondom následně vložte do transportní nádobky.

Poznámka: Používejte pouze nádobky bez konzervačních činidel resp. kondomy bez spermicidů a umělých přídavných látek (např. barviv). Vzorek spermatu postavte na 30 až 45 minut do tmy (např. do zásuvky nebo do skříně), dokud nezkapalní. Vzorek ihned po zkapalnění zmrazte v kryozkumavce při –20°C nebo nižší teplotě. Vzorky spermatu, které nebudou testovány ihned po doručení do laboratoře, musí být skladovány při –20°C nebo nižší teplotě a testovány během 30 dnů po odběru. Musí-li být výtěrové vzorky do laboratoře zaslány, je nutné je odeslat ve stejný den, kdy byly odebrány, v souladu s laboratorními předpisy pro přepravu vzorků chlamydií. Kromě toho je nutné dbát na to, aby byly vzorky spermatu zasílány v chladu. Vzorky musí být zaslány podle platných místních a státních předpisů pro přepravu látek vyvolávajících nákazu.*

Izolace DNA Soupravy společnosti QIAGEN uvedené v tabulce 9 jsou validovány pro izolaci DNA z uvedených druhů vzorků pro použití s artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Proveďte purifikaci DNA podle níže popsaných instrukcí, které se v některých případech liší od informací v manuálu souprav.


21

Tabulka 9. Izolační soupravy validované pro použití s artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Katalogové číslo (QIAGEN)

Nosič RNA

Materiál vzorku

Izolační souprava

Moč

QIAamp Viral RNA Mini Kit (50)

52904

obsažen

Sperma, výtěry

QIAamp DNA Mini Kit (50)

51304

neobsažen

Poznámka: artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit není vhodný pro izolace na bázi fenolu. Použití soupravy QIAamp Viral RNA Mini Kit se vzorky moči Poznámka: Užití nosiče RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtěžek DNA/RNA. Přidejte ke každé extrakci správné množství nosiče RNA podle instrukcí v QIAamp Viral RNA Mini Handbook. Poznámka: Interní kontrolu soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit lze vložit přímo do izolace (viz “Interní kontrola”, strana 27). AVL pufr používaný při QIAamp Viral RNA Mini proceduře byl vyvinut speciálně pro inaktivaci neidentifikovaných inhibitorů vyskytujících se v moči. Proto se výslovně doporučuje používat protokol QIAamp Viral RNA Mini Kit pro extrakci buněčné, bakteriální nebo virové DNA z moči. Ekvilibrujte vzorky na pokojovou teplotu (19–23°C). Protože je ve vzorcích moči obsaženo často jen velmi malé množství bakterií, měl by být zkoumaný materiál koncentrován. Za tímto účelem centrifugujte zkoumané vzorky moči (5 - 30 ml) po dobu 15 - 20 minut při maximálních otáčkách (18 000 x g; alternativně 30 minut při 3 000 x g). Supernatant opatrně odlijte a proveďte úplnou resuspenzi peletu pomocí vortexování s intervaly (15 - 30 sekund) v 1 200 µl 1 x PBS. Použijte 140 µl takto připraveného vzorku pro izolaci DNA. Postupujte od začátku protokolu QIAamp Viral RNA Mini Spin Protocol (QIAamp Viral RNA Mini Handbook, Third Edition, DecemberApril 2010, strana 23). Poznámka: Důrazně doporučujeme provést doporučený centrifugační krok 10 pro odstranění zbylého ethanolu. Doporučujeme zvýšit dobu centrifugace na 3 minuty. Doporučujeme použít eluční objem o 60 µl. Použití soupravy QIAamp DNA Mini Kit s výtěrovými vzorky nebo vzorky spermatu Poznámka: Užití nosiče RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtěžek DNA/RNA. Prosím povšimněte si, že je při izolaci nukleových kyselin z nebuněčných tělesných tekutin resp. materiálů s malým obsahem DNA/RNA (např. likvor) důrazně doporučeno přidat nosič RNA (RNA Homopolymer Poly[rA],

22


neobsaženo v QIAamp DNA Mini Kit). V tomto případě připravte nosič RNA následujícím způsobem:



Resuspendujte lyofilizovaný nosič RNA (RNA Homopolymer Poly[rA], neobsaženo v QIAamp DNA Mini Kit) v elučním pufru (nepoužívejte lyzační pufr) izolační soupravy (AE pufr soupravy QIAamp DNA Mini Kit) a ředěním vytvořte roztok o koncentraci 1 µg/µl. Rozdělte tento roztok nosiče RNA na počet alikvotů odpovídající Vaším požadavkům a skladujte je při –15 až -30°C. Zabraňte opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosiče RNA.



Používejte 1 µg nosiče RNA na 100 µl lyzačního pufru. Je-li extrakčním protokolem stanoveno např. 200 µl lyzačního pufru na jeden vzorek, vložte 2 µl nosiče RNA (1 µg/µl) přímo do lyzačního pufru (AL pufr soupravy QIAamp DNA Mini Kit). Před začátkem každé izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu čerstvě vytvořena směs lyzačního pufru a nosiče RNA (popř. i interní kontroly, viz „Interní kontrola“, strana 27):

Tabulka 10. Pipetovací schéma pro použití s QIAamp DNA Mini Kit Počet vzorků

1

12

např. 200 µl

např. 2400 µl

2 µl

24 µl

Celkový objem

202 µl

2424 µl

Objem na jednu izolaci

200 µl

po 200 µl

AL pufr (lyzační pufr)† Nosič RNA (1 µg/µl)

†

Obsahuje guanidin hydrochlorid; viz manuál soupravy pro bezpečnostní informace.

Poznámka: Tuto čerstvě vytvořenou směs lyzačního pufru a nosiče RNA vložte ihned do izolace. Skladování směsi není možné. Poznámka: Interní kontrolu soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit lze vložit přímo do izolace (viz “Interní kontrola”, strana 27). Proveďte izolaci pomocí soupravy QIAamp DNA Mini Kit podle následujících kroků, které se liší od pokynů v protokolu QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook.

 

Ekvilibrujte vzorky na pokojovou teplotu (19–23°C).



Opatrně odstraňte ze zkumavek víčka a dbejte na to, aby nebyly rukavice kontaminovány. Kontaminované rukavice musí být před zpracováním dalšího vzorku vyměněny za nové.



Přitiskněte tampon na stěnu zkumavky, aby odtekla tekutina. Případné zbytky hlenu ve vzorku sejměte tamponem. Zbylou tekutinu hlenu v tamponu odstraňte výše uvedeným způsobem. Tampon s případnými zbytky hlenu odstraňte a zlikvidujte.



Pipetujte 200 µl transportního média k 180 µl ATL pufru do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a důkladně promíchejte vortexováním.

Výtěrové vzorky, které jsou uchovávány v transportním médiu, musí být důkladně promíchány vortexováním.


23



Suché tampony převeďte přímo do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a vortexujte spolu s 180 µl ATL pufru po dobu 15 – 30 sekund. Alternativně vložte 200 µl ATL pufru do transportní zkumavky a vortexujte tampon ve zkumavce 15 – 30 sekund. Následně převeďte 180 µl do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky. Dbejte prosím na to, aby byla tekutina z tamponu vymačkána na stěně zkumavky. Tampon následně odstraňte a zlikvidujte.



Pro extrakci DNA ze vzorků spermatu rozřeďte prosím 60 µl vzorku s 140 µl PBS (1x) v 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavce. Po důkladném vortexování pipetujte prosím 100 µl zředěného roztoku k 180 µl ATL pufru. Směs míchejte 15 - 30 sekund vortexováním s intervaly.



Ke vzorku přidejte 20 µl proteinázy K. Promíchejte jej vortexováním a inkubujte směs při 56°C po dobu 15 minut (výtěry) resp. 1 - 12 hodin (vzorky spermatu). Pro promíchání vzorku jej během inkubace příležitostně vortexujte nebo jej vložte do termomixeru. Poznámka: Prosím povšimněte si, že se musí použít proteináza K. QIAGEN proteáza má za přítomnosti ATL pufru redukovanou aktivitu.



Centrifugujte krátce 1,5 ml zkumavky, aby se zabránilo křížovým kontaminacím způsobeným vystříknutím tekutiny vzorku ve vnitřní části víčka při otevření nádobky.



Ke vzorku přidejte 200 µl AL pufru (s nosičem RNA a popř. s interní kontrolou, viz “Interní kontrola”, strana 27), rázně promíchejte 15 sekund na vortexu a inkubujte vzorek 10 minut při 70°C. 1,5 ml zkumavky krátce centrifugujte, aby se zabránilo křížovým kontaminacím způsobeným vystříknutím tekutiny vzorku ve vnitřní části víčka při otevření nádobky. Je velmi důležité vzorek a AL pufr rázně promíchat, aby se vytvořil homogenní roztok.



Přidejte 200 µl ethanolu (96 – 100 %) ke vzorku a znovu promíchejte na vortexu po 15 sekund. Následně zkumavky krátce centrifugujte, aby se zabránilo křížovým kontaminacím.



Opatrně vložte 500 µl směsi (včetně precipitátu) – bez pokropení horního okraje – na QIAamp kolonku (v 2 ml sběrné zkumavce). Opatrně uzavřete víčko a centrifugujte jednu minutu při 6 000 x g (8 000 ot/min). Následně vložte QIAamp kolonku do čisté 2 ml sběrné zkumavky a použitou sběrnou zkumavku spolu s filtrátem vyhoďte. Uzavřete všechny kolonky, aby se zabránilo tvorbě aerosolů během centrifugace.

 

Zopakujte předchozí krok tím, že vložíte zbytek směsi na QIAamp Mini kolonku.



Opatrně otevřete QIAamp Mini kolonku a přidejte 500 µl AW2 pufru, bez potřísnění horního okraje. Víčko opatrně uzavřete a centrifigujte tři minuty při maximálních otáčkách (např. 16 000 ot/min). Použitou sběrnou zkumavku spolu s průtokem vyhoďte a vsaďte QIAamp Mini kolonku do čisté 2 ml sběrné

Opatrně otevřete QIAamp Mini kolonku a přidejte 500 µl AW1 pufru, bez potřísnění horního okraje. Víčko opatrně uzavřete a centrifigujte jednu minutu při 6 000 x g (8 000 ot/min). Následně vložte QIAamp Mini kolonku do čisté 2 ml sběrné zkumavky a použitou sběrnou zkumavku spolu s filtrátem vyhoďte.*

* Průtok obsahuje AL nebo AW1 pufr a není tedy kompatibilní s bělidly. Viz manuál QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook pro bezpečnostní informace.

24


zkumavky. Centrifugujte tři minuty při maximálních otáčkách (např. 16 000 ot/min). Následně vložte QIAamp kolonku do čisté 1,5 ml sběrné zkumavky a použitou sběrnou zkumavku spolu s filtrátem vyhoďte.



QIAamp Mini kolonku opatrně otevřete a přidejte 50 µl AE pufru. Inkubujte jednu minutu při pokojové teplotě (15–25°C) a následně kolonku centrifigujte jednu minutu při 6 000 x g (8 000 ot/min).

Použití soupravy QIAamp DNA Mini Kit s lyofilizovanými vzorky Poznámka: Užití nosiče RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtěžek DNA/RNA. Prosím povšimněte si, že je při izolaci nukleových kyselin z nebuněčných tělesných tekutin resp. materiálů s malým obsahem DNA/RNA (např. likvor) důrazně doporučeno přidat nosič RNA (RNA Homopolymer Poly[rA], neobsaženo v QIAamp DNA Mini Kit). V tomto případě připravte nosič RNA následujícím způsobem:



Resuspendujte lyofilizovaný nosič RNA (RNA Homopolymer Poly[rA], neobsaženo v QIAamp DNA Mini Kit) v elučním pufru (nepoužívejte lyzační pufr) izolační soupravy (AE pufr soupravy QIAamp DNA Mini Kit) a ředěním vytvořte roztok o koncentraci 1 µg/µl. Rozdělte tento roztok nosiče RNA na počet alikvotů odpovídající Vaším požadavkům a skladujte je při –15 až -30°C. Zabraňte opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosiče RNA.



Používejte 1 µg nosiče RNA na 100 µl lyzačního pufru. Je-li extrakčním protokolem stanoveno např. 200 µl lyzačního pufru na jeden vzorek, vložte 2 µl nosiče RNA (1 µg/µl) přímo do lyzačního pufru (AL pufr soupravy QIAamp DNA Mini Kit). Před začátkem každé izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu čerstvě vytvořena směs lyzačního pufru a nosiče RNA (popř. i interní kontroly, viz „Interní kontrola“, strana 27):


25

Tabulka 11. Pipetovací schéma pro použití s QIAamp DNA Mini Kit Počet vzorků

1

12

např. 200 µl

např. 2400 µl

2 µl

24 µl

Celkový objem

202 µl

2424 µl

Objem na jednu izolaci

200 µl

po 200 µl

AL pufr (lyzační pufr)* Nosič RNA (1 µg/µl)

* Obsahuje guanidin hydrochlorid; viz manuál soupravy pro bezpečnostní informace.

Poznámka: Tuto čerstvě vytvořenou směs lyzačního pufru a nosiče RNA vložte ihned do izolace. Skladování směsi není možné. Poznámka: Interní kontrolu soupravy artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit lze vložit přímo do izolace (viz “Interní kontrola”, strana 27). Proveďte izolaci pomocí soupravy QIAamp DNA Mini Kit podle následujících kroků, které se liší od pokynů v protokolu QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook.

 

Ekvilibrujte vzorky na pokojovou teplotu (19–23°C).



Pipetujte 200 µl rekonstituovaného vzorku k 360 µl ATL pufru do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a důkladně promíchejte pomocí vortexování.



Ke vzorku přidejte 20 µl proteinázy K. Směs promíchejte vortexováním a inkubujte ji při 56°C po dobu 1 - 12 hodin. Pro promíchání vzorku jej během inkubace příležitostně vortexujte nebo jej vložte do termomixeru.

Lyofilizovaný vzorek pečlivě rekonstituujte v 500 µl PBS (1x) opatrným pootáčením ruky. Vzorek následně inkubujte nejméně 30 minut při pokojové teplotě (15–25°C). Použijte k tomu třepačku (např. termomixer), je-li k dispozici.

Poznámka: Prosím povšimněte si, že se musí použít proteináza K. QIAGEN proteáza má za přítomnosti ATL pufru redukovanou aktivitu.



Centrifugujte krátce 1,5 ml zkumavky, aby se zabránilo křížovým kontaminacím způsobeným vystříknutím tekutiny vzorku ve vnitřní části víčka při otevření nádobky.



Ke vzorku přidejte 400 µl AL pufru (s nosičem RNA a popř. s interní kontrolou, viz “Interní kontrola”, strana 27), rázně jej 15 sekund promíchejte na vortexu a inkubujte po dobu 10 minut při 70°C.



Ke vzorku přidejte 400 µl ethanolu (96 - 100 %) a opět jej promíchejte 15 sekund na vortexu.



Opatrně vložte 700 µl směsi – bez pokropení horního okraje – na QIAamp Mini kolonku. Uzavřete víčko a centrifugujte jednu minutu při 6 000 x g (8 000 ot/min). Následně vložte QIAamp Mini kolonku do čisté 2 ml sběrné zkumavky a použitou sběrnou zkumavku spolu s filtrátem vyhoďte.*

* Průtok obsahuje AL nebo AW1 pufr a není tedy kompatibilní s bělidly. Viz manuál QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook pro bezpečnostní informace.

26


 

Zopakujte předchozí krok tím, že vložíte zbytek směsi na QIAamp Mini kolonku. Postupujte podle protokolu pro zpracování tkáně (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook, Third Edition, June 2012, strana 32) počínaje přidáním AW1 pufru u kroku 8. Poznámka: Důrazně doporučujeme provést doporučený centrifugační krok 10 pro odstranění zbylého ethanolu. Doporučujeme zvýšit dobu centrifugace na 3 minuty.



Doporučuje se eluční objem o 50 µl AE pufru.

Interní kontrola Spolu s produktem se dodává interní kontrola (C. trachomatis Plus RG IC). Máte tak možnost kontrolovat jak izolaci DNA, tak také možnou inhibici PCR. Pro tuto aplikaci přidejte k izolaci interní kontrolu v poměru 0,1 µl na 1 µl elučního objemu. Jestliže například používáte QIAamp DNA Mini Kit a eluujete DNA v 200 µl AE pufru, vložte 6 µl interní kontroly. Jestliže např. eluujete v 100 µl, vložte 10 µl. Množství vkládané interní kontroly závisí pouze na elučním objemu. Poznámka: Interní kontrola a nosič RNA (viz “Izolace DNA“) by měly být přidávány pouze ke směsi lyzačního pufru a vzorku nebo přímo k lyzačnímu pufru. Interní kontrola nesmí být přidána přímo ke vzorku. Při přidání k lyzačnímu pufru se musí dbát na to, aby byla směs interní kontroly, lyzačního pufru a nosiče RNA čerstvě připravena a ihned použita (skladování směsi při pokojové teplotě nebo v lednici může již po několika hodinách vést k vynechání interní kontroly a ke snížení efektivity izolace). Poznámka: Interní kontrolu a nosič RNA nepipetujte přímo do vzorku. Aby byla izolace hodnocena jako úspěšná, musí CT hodnota interní kontroly negativního vzorku zahrnutého do izolace (QIAamp DNA Mini Kit nebo QIAamp Viral RNA Mini Kit) za užití přístroje Rotor-Gene Q ležet u CT = 24  3 (threshold: 0,02). Uvedená variabilita až o 3 CT hodnotách je podmíněná přístrojovou variabilitou a variabilitou izolace. Větší odchylka poukazuje na problémy s izolací. V tomto případě musí být izolace přezkoušena a popřípadě nově validována. Pokud se vyskytnou další otázky nebo problémy, kontaktujte prosím naší technickou podporu. Volitelně lze interní kontrolu použít výhradně ke kontrole možné inhibice PCR. V tomto případě přidejte interní kontrolu přímo k C. trachomatis Plus RG Master a C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol, jak je popsáno u kroku 2b (strana 29).


27

Protokol: PCR a analýza dat Důležité pokyny před začátkem

 

Před začátkem procedury si přečtěte “Důležité pokyny”, strany 19–26.



Dbejte na to, aby byla v každém běhu PCR zahrnuta alespoň jedna pozitivní kontrola a jedna negativní kontrola (Water, PCR grade).

Před začátkem protokolu se dobře seznamte s přístrojem Rotor-Gene Q. Prostudujte si uživatelský manuál přístroje.

Další pokyny před začátkem



Ověřte, že je chladicí blok (příslušenství přístroje Rotor-Gene Q) předem vychlazen na 2–8°C.



Všechny reagencie se musí před začátkem testu zcela rozmrazit, musí být dobře promíchány (opakovaný náběr pipetou a vypuštění piplety nebo krátký vortex) a následně centrifugovány.

Provedení Umístěte požadovaný počet PCR zkumavek do adaptérů chladicího bloku. Chcete-li interní kontrolou kontrolovat jak izolaci DNA, tak možnou inhibici PCR, postupujte podle kroku 2a. Jestliže chcete interní kontrolu použít výhradně ke kontrole PCR inhibice, postupujte podle kroku 2b. 2a. Interní kontrola byla již přidána k izolaci (viz “Interní kontrola”, strana 27). V tomto případě připravte Master Mix podle tabulky 12. 1. 2.

Reakční směs obsahuje všechny komponenty potřebné pro PCR kromě vzorku. Tabulka 12. Příprava Master Mixu (interní kontrola použitá ke sledování izolace DNA a kontrole inhibicí PCR) Počet vzorků

1

12


13 µl

156 µl

C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol

2 µl

24 µl

C. trachomatis Plus RG IC

0 µl

0 µl

15 µl

180 µl

Celkový objem

28


2b. Interní kontrola musí být přidána přímo ke směsi C. trachomatis Plus RG Master a C. trachomatis Plus LC/RG Mg Sol. V tomto případě připravte Master Mix podle tabulky 13. Reakční směs obsahuje všechny komponenty potřebné pro PCR kromě vzorku. Tabulka 13. Příprava Master Mixu (interní kontrola použitá výhradně ke kontrole inhibice PCR) Počet vzorků

1

12


13 µl

156 µl

C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol

2 µl

24 µl

C. trachomatis Plus RG IC

1 µl

12 µl

16 µl*

192 µl*

Celkový objem

* Zvýšení objemu podmíněné přidáním interní kontroly je při přípravě PCR reakce opominuto. Senzitivita není omezena.

3.

Pipetujte do každé PCR zkumavky 15 µl Master Mixu. Následně přidejte 10 µl eluátu z izolace DNA (viz Tabulka 14). Obdobně musíte přidat jako pozitivní kontrolu 10 µl (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control) a jako negativní kontrolu 10 µl vody (Water, PCR grade). Tabulka 14. Příprava PCR reakce Počet vzorků

4.

5.

1

12

Master Mix

15 µl

po 15 µl

Vzorek

10 µl

po 10 µl

Celkový objem

25 µl

po 25 µl

Uzavřete PCR zkumavky. Ujistěte se, že byl na 72 jamkový rotor nasazen Locking Ring (příslušenství přístroje Rotor-Gene), jako prevence nechtěného otevření. Pro detekci C. trachomatis DNA vytvořte teplotní profil podle následujících kroků.


29

Nastavení obecných parametrů PCR

Obrázky 3, 4, 5

Počáteční aktivace Hot Start enzymu

Obrázek 6

Amplifikace DNA

Obrázek 7

Nastavení senzitivity fluorescenčních kanálů

Obrázek 8

Start běhu

Obrázek 9

Veškeré údaje se vztahují na software Rotor-Gene Q MDx/Rotor-Gene Q verzi 1.7.94, Rotor-Gene 6000 verzi 1.7.65, 1.7.87, 1.7.94 a Rotor-Gene 3000 software verzi 6.0.23. Podrobnosti k programování přístroje Rotor-Gene si prostudujte v uživatelském manuálu přístroje. Na obrázcích jsou tato nastavení zvýrazněna černými rámečky. Ilustrace jsou uvedeny pro Rotor-Gene Q. Jsou-li pro Rotor-Gene 3000 požadovány jiné hodnoty, je tak uvedeno v textu. 6.

Nejdříve otevřete okno “New Run Wizard” (Obrázek 3). Zaškrtněte rámeček “Locking Ring Attached” a klikněte na “Next”.

Obrázek 3. Menu “New Run Wizard”.

30


7.

Zvolte 25 jako objem PCR reakce a klikněte na “Next” (Obrázek 4).

Obrázek 4. Nastavení obecných parametrů PCR.

8.

Klikněte na tlačítko “Edit Profile” v dalším okně “New Run Wizard” (Obrázek 5) a naprogramujte teplotní profil podle obrázků 5–7.

Obrázek 5. Úprava profilu.


31

Obrázek 6. Počáteční aktivace Hot Start enzymu.

Obrázek 7. Amplifikace DNA. Prosím povšimněte si, že software přístroje Rotor-Gene 3000 definuje fluorescenční barviva jako “FAM/Sybr, JOE”.

32


9.

Měřící rozsah fluorescenčních kanálů je třeba určit podle fluorescenční intenzity v PCR zkumavkách. Klikněte na “Gain Optimisation” v okně menu “New Run Wizard” (viz Obrázek 5) pro otevření okna “Auto-Gain Optimisation Setup”. Nastavte kalibrační teplotu na 60, aby odpovídala reasociační (annealing) teplotě amplifikačního programu (viz Obrázek 8).

Obrázek 8. Nastavení senzitivity fluorescenčních kanálů. Prosím povšimněte si, že software přístroje Rotor-Gene 3000 definuje fluorescenční barviva jako “FAM/Sybr” a “JOE”.


33

10. Hodnoty “Gain“ zjištěné kalibrací kanálu se automaticky uloží a jsou uvedeny v posledním okně menu programování (Obrázek 9). Stiskněte “Start Run”.

Obrázek 9. Start běhu. Prosím povšimněte si, že software přístroje Rotor-Gene 3000 definuje fluorescenční barviva jako “ FAM/Sybr” a “JOE ”.

11. Po dokončení běhu vyhodnoťte data. Může dojít k následujícím výsledkům (11a, 11b a 11c). Příklady pozitivních a negativních PCR reakcí jsou uvedeny na obrázcích 10 a 11. 11a. Ve fluorescenčním kanálu Cycling Green je detekován signál. Výsledek analýzy je pozitivní: Vzorek obsahuje C. trachomatis DNA. V tomto případě je detekce signálu v kanálu Cycling Yellow podružná, protože vysoké výchozí koncentrace C. trachomatis DNA (pozitivní signál v kanálu Cycling Green) mohou vést k redukovanému až chybějícímu fluorescenčnímu signálu interní kontroly v kanálu Cycling Yellow (kompetice). Poznámka: Povšimněte si, že se na přístroji Rotor-Gene 3000 relevantní kanály jmenují Cycling A.FAM pro pozitivní signál a Cycling A.JOE pro interní kontrolu. 11b. Ve fluorescenčním kanálu Cycling Green není detekován žádný signál, nýbrž pouze v kanálu Cycling Yellow (signál interní kontroly). Ve vzorku není prokazatelná žádná C. trachomatis DNA. Lze jej proto považovat za negativní. Při negativní C. trachomatis PCR vylučuje detekovaný signál interní kontroly možnost PCR inhibice.

34


Poznámka: Povšimněte si, že se na přístroji Rotor-Gene 3000 relevantní kanály jmenují Cycling A.JOE pro interní kontrolu a Cycling A.FAM pro chybějící signál. 11c. Signál není detekován ani v kanálu Cycling Green ani v kanálu Cycling Yellow. Není možné učinit diagnostický závěr. Pokyny týkající se zdrojů chyb a jejich odstranění jsou uvedeny v kapitole “Řešení problémů“, strana 37. Poznámka: Povšimněte si, že se na přístroji Rotor-Gene 3000 relevantní kanály jmenují Cycling A.FAM a Cycling A.JOE.

Obrázek 10. Průkaz kvantifikačních standardů (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control) ve fluorescenčním kanálu Cycling Green. NTC: non-template control (negativní kontrola).


35

Obrázek 11. Průkaz interní kontroly (IC) ve fluorescenčním kanálu Cycling Yellow při současné amplifikaci kvantifikačních standardů (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control). NTC: non-template control (negativní kontrola).

36


Řešení problémů V této kapitole naleznete užitečné informace, které Vám mohou pomoci při řešení případných problémů. Více informací lze získat také na internetové stránce naší technické podpory: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx. Vědci z naší technické podpory vždy rádi zodpoví Vaše otázky ohledně údajů a protokolu v tomto manuálu i obecně k molekulárně biologickým aplikacím (možnosti navázání kontaktu viz zadní strana nebo www.qiagen.com). Komentáře a návrhy Žádný signál při pozitivních kontrolách (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control) ve fluorescenčním kanálu Cycling Green nebo Cycling A.FAM a) Volba fluorescenčního kanálu při analýze dat PCR neodpovídá protokolu

K analýze dat zvolte fluorescenční kanál Cycling Green nebo Cycling A.FAM pro analytickou C. trachomatis PCR a fluorescenční kanál Cycling Yellow nebo Cycling A.JOE pro PCR interní kontroly.

b) Naprogramování teplotního profilu přístroje Rotor-Gene je chybné

Porovnejte teplotní profil s údaji protokolu (viz “Protokol: PCR a analýza dat“, strana 28).

c) PCR reakce byla chybně nastavena

Porovnejte Vaše pracovní kroky s pipetovacím schématem (“Protokol: PCR a analýza dat“, strana 28) a popř. PCR zopakujte.

d) Podmínky skladování jednoho nebo více komponentů soupravy neodpovídají předpisům uvedeným v kapitole “Skladování“ (strana 5)

Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte popř. novou soupravu.

e) Doba použitelnosti soupravy artus C. trachomtis Plus RG PCR Kit vypršela


Slabý nebo chybějící signál interní kontroly negativního vzorku podrobeného izolaci (CT = 24 ± 3; threshold, 0,02) ve fluorescenčním kanálu Cycling Yellow resp. Cycling A.JOE při současné nepřítomnosti signálu v kanálu Cycling Green resp. Cycling A.FAM: a) Podmínky PCR neodpovídají protokolu

Zkontrolujte podmínky PCR (viz výše) a popř. PCR zopakujte s opraveným nastavením.

b) PCR byla inhibována

Ujistěte se, že používáte námi doporučený postup izolace a držte se přesně předpisů výrobce.


37

Komentáře a návrhy c) Během izolace dochází k úbytku DNA

Byla-li k izolaci přidána interní kontrola, může nepřítomnost signálu interní kontroly znamenat úbytek DNA během izolace. Ujistěte se, že používáte námi doporučený postup izolace (viz “Izolace DNA“, strana 21) a držte se přesně předpisů výrobce. Přesvědčte se, že byl při izolaci DNA před elucí proveden dodatečný doporučený centrifugační krok k úplnému odstranění zbytků ethanolu (viz “Izolace DNA“, strana 21).

d) Podmínky skladování jednoho nebo více komponentů soupravy neodpovídají předpisům uvedeným v kapitole “Skladování“ (strana 5)


e) Doba použitelnosti Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i soupravy dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a artus C. trachomatis Plus použijte popř. novou soupravu. RG PCR Kit vypršela Signály při negativních kontrolách ve fluorescenčním kanálu Cycling Green resp. Cycling A.FAM analytické PCR a) Během přípravy PCR došlo ke kontaminaci

Zopakujte PCR v replikátech s novými reagenciemi. Uzavřete jednotlivé PCR zkumavky pokud možno ihned po vložení zkoumaného vzorku. Pipetujte pozitivní kontroly zásadně jako poslední. Ujistěte se, že jsou pracovní plochy a přístroje pravidelně dekontaminovány.

b) Během izolace dochází ke kontaminaci

Zopakujte izolaci a PCR zkoumaných vzorků za užití nových reagencií. Ujistěte se, že jsou pracovní plochy a přístroje pravidelně dekontaminovány.

38


Literatura QIAGEN udržuje rozsáhlou aktuální online databázi vědeckých publikací, které hodnotí produkty QIAGEN. Podrobné volby hledání umožňují nalezení potřebných článků, buďto jednoduchým zadáním klíčových slov nebo upřesněním druhu aplikace, oboru výzkumu, názvu etc. Úplný seznam literatury naleznete v QIAGEN Reference Database na stránce www.qiagen.com/RefDB/search.asp nebo kontaktujte Technický servis QIAGEN popř. Vašeho místního distributora.


39

Informace o objednání Produkt

Obsah

Kat. čís.

artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit (24)

Pro 24 reakcí: Master, roztok hořčíku, pozitivní kontrola, interní kontrola, voda (PCR grade)

4559263

artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit (96)

Pro 96 reakcí: Master, roztok hořčíku, pozitivní kontrola, interní kontrola, voda (PCR grade)

4559265

digene Cervical Sampler a digene Female Swab Specimen Collection Kit — pro odběr cervikálních vzorků digene Cervical Sampler

50 cervikálních kartáčků a transportní médium pro odběr cervikálních vzorků

5122-1220

digene Female Swab Specimen Collection Kit

50 Dacron tamponů a transportní médium pro odběr cervikálních vzorků

5123-1220

QIAamp Viral RNA Mini Kit — pro izolaci virové RNA z nebuněčných tělesných tekutin QIAamp Viral RNA Mini Kit (50)

Pro 50 příprav: 50 QIAamp Mini Spin kolonek, nosič RNA, sběrné zkumavky (2 ml), pufry prosté RNáz

52904

QIAamp DNA Mini Kit — pro izolaci genomické, mitochondriální, bakteriální a virové DNA a DNA parazitů QIAamp DNA Mini Kit (50)

Pro 50 DNA příprav: 50 QIAamp Mini Spin kolonek, QIAGEN proteináza K, reagencie, pufry, sběrné zkumavky (2 ml)

51304

Rotor-Gene Q MDX a příslušenství Rotor-Gene Q MDx 5plex Platform

Real-time PCR cyklér s 5 kanály (zelený, žlutý, oranžový, červený, purpurový), notebook počítač, software, příslušenství, roční záruka na součásti a služby, instalace a školení není zahrnuto

9002022

9002023

40


Produkt

Obsah

Kat. čís.

Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform

Real-time PCR cyklér a analyzátor křivek tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melt - HRM) s 5 kanály (zelený, žlutý, oranžový, červený, purpurový) plus HRM kanál, notebook počítač, software, příslušenství, roční záruka na součásti a služby, instalace a školení není zahrnuto

9002032

Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System

Real-time PCR cyklér a analyzátor křivek tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melt - HRM) s 5 kanály (zelený, žlutý, oranžový, červený, purpurový) plus HRM kanál, notebook počítač, software, příslušenství, roční záruka na součásti a služby, instalace a školení

9002033

Rotor-Gene Q MDx 6plex System

Real-time PCR přístroj se 6 kanály (modrý, zelený, žlutý, oranžový, červený, purpurový), inkl. notebook počítač, software, příslušenství, zarhnuje roční záruku na součásti a služby, instalace a školení

9002043

Rotor-Gene Q MDx 2plex Platform

Real-time PCR cyklér s 2 kanály (zelená, žlutá), notebook počítač, software, příslušenství, včetně roční záruky na součásti a služby, instalace a školení nejsou zahrnuty

9002002

Rotor-Gene Q MDx 2plex HRM Platform

Real-time PCR cyklér a analyzátor křivek tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melt - HRM) se 2 kanály (zelená, žlutá) plus HRM kanál, notebook,včetně počítač, software, příslušenství, roční záruka na součásti a služby, instalace a školení nejsou zahrnuty

9002012

Loading Block 72 x 0.1 ml Tubes

Hliníkový blok pro manuální nastavení reakce za užití 72 x 0,1 ml zkumavek

9018901

Loading Block 96 x 0.2 ml Tubes

Hliníkový blok pro manuální nastavení reakce ve standardním 8 x 12 seskupení za užití 96 x 0,2 ml zkumavek

9018905


41

Kat. čís.

Produkt

Obsah

Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250)

250 proužků o 4 zkumavkách a víčkách pro 1000 reakcí

981103

Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500)

10 x 250 proužků o 4 zkumavkách a víčkách pro 10,000 reakcí

981106

Informace o aktuálních licenčních podmínkách a specifických licencích k produktům získáte v odpovídajícím manuálu k soupravě QIAGEN. Manuály k soupravám QIAGEN jsou dostupné na www.qiagen.com nebo na požádání u Technického servisu QIAGEN nebo lokálního distributora.

42


Tato stránka byla úmyslně ponechána prázdná


43


44




45

Koupě tohoto produktu opravňuje kupce k jeho užití v rámci humánní in vitro diagnostiky. Není poskytnut žádný obecný patent nebo licence jiná než toto specifické právo užití vycházející z koupě. ®

®

®,

®

®

®

Ochranné známky: QIAGEN , QIAamp , artus digene® Rotor-Gene® (QIAGEN Group); AMPLICOR , COBAS (Roche Group); LightCycler ® ® (Roche Group) Aptima , Combo 2™ (Gen-Probe, Inc.); ClamTrans™, MicroTrak® Trinity Biotech; DACRON (Invista North America S.A.R.L.); ® FAM™, JOE™ subsidiarit SYBR® (Life Technologies); IDEIA™ (DakoCytomation); LCx (Abbott Laboratories); Mastazyme™ (MAST DIAGNOSTICA); MicroTest™ (Thermo Fisher Scientific).. Omezená licenční smlouva pro artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Použitím produktu vyjadřuje kupec nebo uživatel produktu souhlas s následujícími podmínkami: 1.

Produkt smí být používán výhradně v souladu s protokoly dodávanými s produktem a tímto manuálem a pouze s komponenty obsaženými v soupravě. QIAGEN neposkytuje žádnou licenci v rámci kteréhokoliv svého duševního vlastnictví k použití nebo k začlenění přiložených komponent soupravy s komponenty, které nejsou zahrnuty v této soupravě, s vyjímkou případů uvedených v protokolech dodávaných s produktem, tomto manuálu a dodatečných protokolech dostupných na www.qiagen.com. Některé z těchto dodatečných protokolů byly poskytnuty QIAGEN uživateli pro uživatele QIAGEN. Tyto protokly nebyly důkladně testovány ani optimalizovány QIAGEN. QIAGEN za ně neposkytuje žádné záruky a ani nezaručuje, že nebudou narušovat práva třetích stran.

2.

Mimo výslovně uvedenou licenci QIAGEN neposkytuje žádnou záruku, že tato souprava a/nebo její použití neporušuje práva třetích stran.

3.

Tato souprava a její komponenty jsou licencovány pro jedno použití a nesmí být znovu použity, obnoveny či znovu prodány.

4.

QIAGEN zvláště vylučuje odpovědnost za jakékoliv jiné licence, vyjádřené či implikované, než výslovně uvedené.

5.

Kupec a uživatel soupravy souhlasí s tím, že nepodnikne nebo nikomu neumožní podniknout kroky, které by mohly vést nebo usnadnit zakázané skutky uvedené výše. QIAGEN může zákazy tohoto Licenčního ujednání prosadit u každého soudu a vyžadovat úhradu všech vyšetřovacích a soudních poplatků, inkl. poplatků za advokáta, v rámci jakéhokoliv postupu k prosazení tohoto Licenčního ujednání nebo jakýchkoliv jiných práv duševního vlastnictví vztahujících se na tento kit a/nebo jeho komponenty.

Pro aktualizovaná licenční ustanovení viz. www.qiagen.com. © 2009-2014 QIAGEN, všechna práva vyhrazena.

www.qiagen.com Australia  Orders 1-800-243-800  Fax 03-9840-9888  Technical 1-800-243-066 Austria  Orders 0800-28-10-10  Fax 0800-28-10-19  Technical 0800-28-10-11 Belgium  Orders 0800-79612  Fax 0800-79611  Technical 0800-79556 Brazil  Orders 0800-557779  Fax 55-11-5079-4001  Technical 0800-557779 Canada  Orders 800-572-9613  Fax 800-713-5951  Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China  Orders 86-21-3865-3865  Fax 86-21-3865-3965  Technical 800-988-0325 Denmark  Orders 80-885945  Fax 80-885944  Technical 80-885942 Finland  Orders 0800-914416  Fax 0800-914415  Technical 0800-914413 France  Orders 01-60-920-926  Fax 01-60-920-925  Technical 01-60-920-930  Offers 01-60-920-928 Germany  Orders 02103-29-12000  Fax 02103-29-22000  Technical 02103-29-12400 Hong Kong  Orders 800 933 965  Fax 800 930 439  Technical 800 930 425 Ireland  Orders 1800 555 049  Fax 1800 555 048  Technical 1800 555 061 Italy  Orders 800-789-544  Fax 02-334304-826  Technical 800-787980 Japan  Telephone 03-6890-7300  Fax 03-5547-0818  Technical 03-6890-7300 Korea (South)  Orders 080-000-7146  Fax 02-2626-5703  Technical 080-000-7145 Luxembourg  Orders 8002-2076  Fax 8002-2073  Technical 8002-2067 Mexico  Orders 01-800-7742-639  Fax 01-800-1122-330  Technical 01-800-7742-436 The Netherlands  Orders 0800-0229592  Fax 0800-0229593  Technical 0800-0229602 Norway  Orders 800-18859  Fax 800-18817  Technical 800-18712 Singapore  Orders 1800-742-4362  Fax 65-6854-8184  Technical 1800-742-4368 Spain  Orders 91-630-7050  Fax 91-630-5145  Technical 91-630-7050 Sweden  Orders 020-790282  Fax 020-790582  Technical 020-798328 Switzerland  Orders 055-254-22-11  Fax 055-254-22-13  Technical 055-254-22-12 UK  Orders 01293-422-911  Fax 01293-422-922  Technical 01293-422-999 USA  Orders 800-426-8157  Fax 800-718-2056  Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737)

1046969CS 145052592

Sample & Assay Technologies

artus C. trachomatis Plus RG PCRKit Manuál

Recommend Documents