LAMPIRAN
Lampiran 1 Bagan alir penelitian
Biawak air bagian duodenum, jejenum, ileum, kolon
Cuci dengan akuades dan kerok lapisan atasnya (mukosa
Ekstraksi enzim protease
Analisis kadar protein
Pencirian enzim
SDS-PAGE
Analisis aktivitas keratinase (in vitro)
Lampiran 2 Prosedur pembuatan pereaksi kimia Pereaksi untuk analisis aktivitas enzim dan kadar protein •
Kasein Hammarsten 2% b/v Sebanyak 1 g kasein ditimbang, lalu dilarutkan dalam 40 ml bufer fosfat 50 mM, pH 7,0 kekeruhan larutan dihilangkan dengan penambahan NaOH 1 M, lalu diatur hingga pH 7 dengan penambahan HCl 1 M dan ditera dengan akuades hingga volume total 50 ml.
•
Tirosin 5 mM Sebanyak 0,0453 g tirosin dilarutkan dalam 40 ml akuades dan ditambahkan NaOH 1 M hingga larut, lalu dinetralkan hingga pH 7,0 dengan HCl 1 M. Selanjutnya, larutan ditera dengan akuades hingga volume 50 ml.
•
TCA 0.1 M Larutan stok TCA 1 M dibuat dengan cara melarutkan 16,339 g TCA dalam 100 ml akuades, lalu diaduk dengan pengaduk magnetik hingga homogen. Larutan kerja TCA 0,1 M dibuat dengan cara mengencerkan 10 ml larutan TCA 1 M dengan akuades hingga volume 100 ml.
•
Na2CO3 0,4 M Sebanyak 4,2397 g Na2CO3 dilarutkan dalam 100 ml akuades, lalu diaduk dengan pengaduk magnetik hingga homogen.
•
Pereaksi Folin-Ciocalteau (1:2) Sebanyak 10 ml pereaksi Folin-Ciocalteau diencerkan dengan akuades hingga volume 30 ml.
•
Pereaksi Bradford Stok larutan Bradford dibuat dengan cara melarutkan 0,1 g Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95% v/v dan 100 ml asam fosfat 85% v/v, lalu ditera dengan akuades hingga volume 200 ml. Larutan kerja Bradford dibuat dengan cara mengencerkan 5 ml larutan stok Bradford dengan akuades hingga volume total 50 ml.
Pereaksi untuk analisis SDS-PAGE dan zimografi •
Larutan A (40% (b/v) akrilamida; 2 % (b/v) bis-akrilamida) Sebanyak 4,38 ml akrilamida dan 2,40 bis-akrilamida untuk gel pemisah dan Sebanyak 0,48 ml akrilamida dan 0,26 ml bis-akrilamida untuk gel penahan.
•
Larutan B (bufer gel pemisah, Tris-HCl 1,5 M pH 8,8) Sebanyak 3,75 ml larutan Tris-HCl pH 8,8 dan 0,15 ml larutan SDS 10% (b/v) untuk gel pemisah.
•
Larutan C (bufer gel penahan, Tris-HCl 1,5 M pH 6,8) Sebanyak 1,26 ml larutan Tris-HCl pH 6,8 dan 50 µl larutan SDS 10% (b/v) untuk gel penahan.
•
Ammonium persulfat 10% (b/v) Sebanyak 0,1 g ammonium persulfat dilarutkan hingga homogen dengan 1 ml akuades.
•
Bufer elektroforesis Sebanyak 1.803 g Tris, 8,648 g glisin, dan 0,6 g SDS dilarutkan dengan 600 ml akuades, lalu ditera hingga pH 8,3 dengan HCl 1 M.
•
Bufer sampel 1. SDS-PAGE Sebanyak 0,3 ml Tris-HCl 1 M pH 6,8, 2,5 ml gliserol 50% (v/v), 1 ml SDS 10% (b/v), 0,25 ml 2-merkaptoetanol, 0,5 ml bromfenol biru 1% (b/v), dan 0,45 ml akuabides sampai volume total 5 ml. 2. Zimografi Sebanyak 0,5 g SDS, 1 ml gliserol 50% (v/v), 1 ml bromfenol biru 1% (b/v), 0,625 ml Tris-HCl 1 M pH 6,8, dan 2.,75 ml akuabides sampai volume total 5 ml.
•
Larutan pewarna Sebanyak 0,5 g Coomassie Brilliant Blue R-250 dilarutkan dalam campuran 225 ml metanol, 50 ml asam asetat glasial, dan 225 ml akuades sampai volume total 500 ml.
•
Larutan peluntur Komposisi larutan peluntur terdiri atas 50 ml metanol, 50 ml asam asetet glasial, dan 400 ml akuades sampai volume total 500 ml. Larutan berbagai bufer
Larutan kerja bufer 50mM dibuat dengan cara mengencerkan 25 ml larutan stok bufer 0,2 M dengan akuades hingga volume total 100 ml.
Lampiran 3 Pembuatan kurva standar Bradford.
[BSA] (mg/ml) 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00
Absorbansi (nm) 0,064 0,070 0,074 0,079 0,080 0,082 0,087 0,089 0,090 0,092
Sampel duodenum jejenum ileum kolon
Absorbansi 0,115 0,108 0,106 0,081
0,100 0,090
Absorbansi (nm)
0,080 0,070 0,060 y = 0,0299x + 0,0643 R2 = 0,9614
0,050 0,040 0,030 0,020 0,010 0,000 0,00
0,20
0,40
0,60 [BSA]m g/m l
0,80
1,00
1,20
kadar protein 1,6956 1,4615 1,3946 0,5585
Lampiran 4 Penentuan absorbansi enzim maksimum protease dari bagian usus biawak air
Suhu 45°C Waktu (menit) 5 10 15 20
Suhu 55°C Waktu (menit) 5 10 15 20
Suhu 65°C Waktu (menit) 5 10 15 20
A Blanko (nm)
A Standar (nm)
2,115 2,291 2,398 2,014
2,354 2,312 2,429 2,149
A Blanko (nm)
A Standar (nm)
2,129 2,186 2,150 2,265
2,299 2,287 2,226 2,468
A Blanko (nm)
A Standar (nm)
2,118 2,259 2,286 2,167
2,273 2,326 2,318 2,338
Duodenum 2,783 2,414 2,602 2,512
A Sampel (nm) Jejenum Ileum 2,642 2,609 2,396 2,385 2,613 2,481 2,404 2,428
Kolon 2,616 2,380 2,480 2,413
Duodenum 2,745 2,548 2,506 2,528
A Sampel (nm) Jejenum Ileum 2,685 2,684 2,546 2,484 2,497 2,363 2,277 2,596
Kolon 2,645 2,479 2,361 2,436
Duodenum 2,396 2,516 2,345 2,372
A Sampel (nm) Jejenum Ileum 2,332 2,316 2,519 2,559 2,318 2,346 2,329 2,325
Kolon 2,255 2,545 2,359 2,324
Lampiran 5 Penentuan aktivitas maksimum enzim spesifik dari bagian usus biawak air
Suhu 45 Waktu (menit) 5 10 15 20
Suhu 55 Waktu (menit) 5 10 15 20
suhu 65 Waktu (menit) 5 10 15 20
Aktivitas enzim (U/ml) Duodenum Jejenum Ileum 3,3540 2,6460 2,4803 3,5143 3,0000 2,6857 2,6322 2,7742 1,0710 1,1066 0,8666 0,9200
Aktivitas enzim Spesifik (U/mg) Kolon 2,5155 2,5428 1,0581 0,8867
Duodenum 1,9780 2,0725 1,5523 0,6526
Jejenum 1,8104 2,0526 1,8981 0,5929
Ileum 1,7785 1,9257 0,7679 0,6597
Kolon 4,5038 4,5527 1,8944 1,5875
Aktivitas enzim (U/ml) Duodenum Jejenum Ileum 4,3482 3,9247 3,9176 2,1505 2,1386 1,7703 1,8737 1,8263 1,1215 0,3887 0,0177 0,4892
Kolon 3,0353 1,7406 1,1105 0,2527
Aktivitas enzim Spesifik (U/mg) Duodenum Jejenum Ileum Kolon 2,5643 2,6853 2,8091 5,4345 1,2682 1,4633 1,2693 3,1164 1,1050 1,2496 0,8041 1,9883 0,2292 0,0121 0,3507 0,4525
Aktivitas enzim (U/ml) Duodenum Jejenum Ileum 2,1523 1,6567 1,5330 2,3015 2,3284 2,6865 0,7375 0,4000 0,7500 0,3596 0,2842 0,2772
Kolon 1,0606 2,5612 0,9125 0,2754
Aktivitas enzim Spesifik (U/mg) Duodenum Jejenum Ileum Kolon 1,2693 1,1335 1,0992 1,8990 1,3573 1,5931 1,9263 4,5856 0,4349 0,2737 0,5378 1,6338 0,2121 0,1945 0,1988 0,4932
Lampiran 6 Contoh perhitungan aktivitas enzim (U/ml) dan aktivitas spesifik (U/mg). Perhitungan aktivitas enzim (U/ml) Asampel − Ablanko faktorpeng enceran Aktivitas protease (U/ml) = Χ As tan dar − Ablanko waktuinkub asi Contoh perhitungan pada suhu 45 °C selama 5 menit sampel duodenum Aktivitas keratinase (U/ml) =
2,783 − 2,115 6 Χ 2,351 − 2,115 5
=3,3540 U/ml Perhitungan kadar protein (mg/ml) Persamaan dari kurva standar: y = 0,0299x + 0,0643
x = [BSA] mg/ml Y = Absorbansi (nm) Contoh perhitungan pada sampel duodenum dengan nilai absorbansi 0,115 y = 0,0299x + 0,0643 0,115 = 0,0299x + 0,0643 x = 1,6356 mg/ml [protein] (mg/ml) = 1,6356 mg/ml Perhitungan aktivitas spesifik enzim (U/mg) Aktivitas Enzim spesifik (U/mg) =
aktivitasenzim(U / mg ) [Pr otein](mg / ml )
Contoh perhitungan pada suhu 45 °C selama 5 menit sampel duodenum Aktivitas Enzim Spesifik (U/mg) =
3,3540 1,6356
=1,9779 U/mg
Lampiran 7 Data Pengaruha Suhu, pH dan ion logam pada aktivitas enzim maksimum dari ekstrak kasar enzim protease lapisan atas (mukosa) usus biawak air (Varanus salvator).
Pengaruh suhu Suhu Blanko (°C) (nm) 45 55 65
2,115 2,129 2,118
Pengaruh pH Blanko pH (nm) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1,340 1,307 1,275 1,283 1,301 1,362 1,217 1,328 1,285 1,266
Standar (nm) 2,354 2,299 2,273
Duodenum 2,783 2,745 2,396
Standar (nm) 1,980 1,932 1,981 1,941 1,979 1,982 2,116 1,984 1,935 1,996
Duodenum 1,696 1,705 1,767 1,818 1,873 1,892 2,056 1,883 1,716 1,708
Sampel (nm) Jejenum Ileum 2,642 2,609 2,685 2,684 2,332 2,316
Sampel (nm) Jejenum Ileum 1,689 1,652 1,759 1,715 1,836 1,765 1,871 1,803 1,893 1,823 1,918 1,846 2,002 1,982 1,813 1,844 1,780 1,831 1,750 1,699
Colon 2,616 2,645 2,255
Colon 1,695 1,727 1,770 1,838 1,879 1,883 1,998 1,724 1,542 1,529
Aktivitas enzim (U/ml) Duodenum Jejenum Ileum 3,354 2,6460 2,4803 4,3482 3,9247 3,9176 2,1523 1,6568 1,5329
Colon 2,5154 3,0353 3,0353
Aktivitas enzim (U/ml) Duodenum Jejenum Ileum 0,668 0,654 0,585 0,764 0,868 0,783 0,836 0,954 0,833 0,976 1,072 0,948 1,012 1,048 0,924 1,026 1,076 0,937 1,120 1,048 1,021 1,015 0,887 0,944 0,796 0,914 1,008 0,727 0,796 0,712
Colon 0,666 0,806 0,841 1,012 1,023 1,008 1,042 0,724 0,474 0,432
Pengaruh ion logam
ion NaCl Cacl2 MgCl2 KCl Kontrol
Blanko (nm)
Standar (nm)
0,095 0,064 0,097 0,071 0,114
0,313 0,239 0,325 0,321 0,531
Duedenum 0,164 0,068 0,101 0,148 0,256
Sampel (nm) Jejenum Ileum 0,134 0,153 0,066 0,073 0,102 0,098 0,141 0,132 0,235 0,243
Colon 0,132 0,069 0,104 0,112 0,202
Aktivitas enzim (U/ml) Duedenum Jejenum 0,0317 0,0179 0,0023 0,0011 0,0018 0,0022 0,0308 0,0280 0,0341 0,0290
Ileum 0,0266 0,0051 0,0004 0,0244 0,0309
Colon 0,0170 0,0029 0,0031 0,0164 0,0211
Lampiran 8 Pembuatan kurva standar SDS-PAGE.
BM (KDa) 203 118 86 51,6 34,1 29 19,2
Standar Log BM 2,3075 2,0719 1,9345 1,7126 1,5327 1,4624 1,2833
Sampel Rf (cm) 0,0794 0,1508 0,2143 0,3809 0,5714 0,6984 0,9127
Rf (Cm) 0,1666 0,2381 0,3190 0,3238 0,4603 0,6666 0,9841
Log BM 1,8231 1,7605 1,6897 1,6855 1,5659 1,3853 1,1073
BM 66,54 57,61 48,94 48,47 36,80 24,28 12,80
2,5
Log BM
2 1,5 y = -1,142x + 2,2486 R2 = 0,9404
1 0,5 0 0
0,2
0,4
0,6 Rf (cm)
0,8
1
