17.4.2012
Přímá analýza mutací jedné známé mutace (SNP polymorfismy) MOLEKULÁRNÍ DIAGNOST IKA PŘÍMOU ANALÝZOU
PCR – RFLP viz předešlý seminář ARMS (ASA) Real-time PCR viz také přednáška dr Libry
Martin Beránek
Hybridizace na pevném podkladě – druhá polovina přednášky Primer extension
Přednáška pro magistry FaF UK
Sekvenování – zde většinou konfirmační metoda
Alelově specifická PCR
Základní složení PCR směsi • • • • • • • • •
5´
3´
3´
5´
DNA polymeráza matrice /templát/ - ssDNA primery - oligonukleotidy pufr – optimalizace chem. podmínek reakce hořečnaté ionty – pro činnost polymerázy dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP (2´-deoxy…trifosfát) aditiva – efektivita PCR voda negativní kontrola
5´
1. zkum.
Deficit AT Deficit proteinu C Deficit proteinu S FV Leiden G20210 FII Dysfibrinogenemie Deficit plasminogenu Vyšší Hcy
• • • • • • • •
Věk + rod. anamnéza Imobilizace Chirurgické operace Malignita Hormon. antikoncepce Obezita Antifosfolipidový sy
3´
5´
bodová mutace
3´
WT
M
2. zkum.
• • • • •
Rizikové faktory pro vznik a rozvoj trombofilních stavů • • • • • • • •
normální genotyp
Určí známé typy bodových mutací Není nezbytná přítomnost palindromu primery plně komplementární k populační sekvenci genu amplifikují wild-type alelu primery s 3´ mismatchy umožňují amplifikaci mutantních alel V obou zkumavkách je stejná délka PCR produktů
Vyšetřované trombofilní mutace Gen
Mutac e
Důsledek
Dědičnost
Projev
FV
G1691A Leiden
Arg 506 Gln
AD
APC resistence
FII
G20210A
změna 3´ UTR
AD
protrombin
MTHFR
C677T
Ala 222 V al
AR
homocystein
Genetický podklad + vlivy prostředí → trombus
1
17.4.2012
Stručná charakteristika PCR-RFLP a ASA • Přímá analýza (potřeba DNA pacienta, nikoliv rodinných příslušníků a postiženého) • Standardní PCR amplifikace • Nutná elektroforéza • Doba analýzy: 2-3 dny • Náklady: 1000 - 1500 Kč • Počet pacientů v sérii: 5-10
Vyšetření známé mutace hydrolytickou (= hydrolyzační) sondou
Lze PCR a detekci produktů zautomatizovat?
• jen1 hydrol ytická sonda nasedající na dané vlákno • každá sonda 2 značky (jen 1 z nich schopná fl uorescence) • 2 reakční směsi (jako ASA), v každé 1 sonda komplementární k wt či mut. sekvence • oba typy sond pok rývají oblast mutace (jako primery u ASA) • snímání fluorescence pouze při polymeraci (při štěpení sond)
K rozlišení obou alel (wt a M) hydrolytickými (Taqman) sondami se používá metoda alelické diskriminace
• rozlišení alel vzájemnou diskriminací (soutěž o řetězce)
wt M
• ve 2 zkumavkách (stejný fluorofor) nebo v 1 zk. (rozdílné fluorofory)
400-600 nm
400-600 nm Zářič
Quencher zhášeč (energie odchází formou tepla)
Při TaqMAN detekci se rostoucí fluorescence snímá po elongaci
ANNEALING
1-5 base
ROCHE 525 nm 640 (705) nm
Vyšetření známé mutace párem hybridizačních sond
Donor záření Akceptor záření • Dvě FRET sondy nasedající těsně za sebou na
vlákno
• Obě sondy jsou designované zpravidla pro wt alelu
F
• Jen jedna z nich pokrývá místo mutace • Každá sonda vlastní značku (obě schopné fl uorescence) • Snímání fluorescence pouze při annealingu • Rozlišení alel pomocí teploty tání hybridizačních sond
t
2
17.4.2012
Stručná charakteristika real-time PCR
Metoda primer extension Izolace DNA
• Potřeba DNA pacienta, nikoliv rodiny • PCR amplifikace se sondami (či interkalačními látkami) • Bez elektroforézy • Doba analýzy: 1 den • Náklady: 1500-2000 Kč • Počet pacientů v sérii: 10-30
Mutaci dopředu známe
PCR amplifikace
Syntetická reakce (asymetrická amplifikace se značenými ddNTPs)
5´ 3´ ddATP – JOE (550 nm) ddCTP – FAM (520 nm) ddGTP- TAMRA (585 nm) ddTTP – ROX (620 nm)
Separace produktů na HPCE (kapilárním sekvenátoru)
Analýza omezeného počtu známých bodových mutací (jedna či několik)
Metoda primer extension wt/wt
M/wt A
5´
ddT
3´
G
F
t
ddC
3´
ddC
3´ ddT
G
5´
ddT
3´ 5´
F
M/M A
5´
A C G T
ddT/C
F
ddC
t
Duchennova muskulární dystrofie
• • • • • • • • •
Trombofilní mutace (FV, FII, MTHFR) Hemochromatosa (HFE) Defekt v genu pro alfa-1-antitrypsin (A1AT) Defekt v genu pro apolipoprotein B (apoB) Genotypizace genu apoE Farmakogenetika (izoenzymy P450) Fenylketonurie (PAH) Srpkovitá anémie (beta globin) Hemoglobinopatie (HbS, HbC,…)
t
One-tube multiplex PCR (příklad DMD)
1
2
3
M
750 bp
500 bp
426 bp - exon 44 357 bp - exon 43 212 bp - exon 53 181 bp - exon 47 113 bp - exon 52
300 bp 200 bp 100 bp 50 bp
Velké delece podmiňují přes 60% případů DMD
3
17.4.2012
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)
Hybridizace - Southern blotting Hybridizační sonda pro gen se značkou
DNA fragment se sekvencí genu
nylon agarózový gel
DNA fragmenty
Sekvence sondy
Dot blotting Anti GGT (12)
1. Fixace vyšetřované DNA do membrány v ss formě 2. Hybridizace sondy komplementární ke genu (s normální nebo mutantní sekvencí) 3. Vizualizace signálu sondy Anti GTT (12)
Anti GAT (12) Vzorek:
1
2
3
4
5
Al-Mulla F. J Pathol, 185, 1998, 130-138.
4
17.4.2012
Reverzní blotting 1. Fixace mnoha neoznačených sond ke genu do membrány 2. Amplifikace DNA a značení (primeru) 2. Hybridizace vyšetřované ss DNA k sondám 3. Vizualizace signálu primeru DNA vzorek č. 1
Sonda:
antiGAT 1
antiGTT antiGCT 2 3
antiAGT antiCGT 4 5
Podklady pro nanesení sond • Nylonová membrána (desítky až stovky sond) • Plasty (stovky) • Sklo (tisíce až stotisíce) • Křemík (stotisíce až milióny)
Microarray Příprava spotů pro navázání sondy mikropipetováním
Stručná charakteristika hybridizačních metod • Potřeba DNA pacienta, nikoliv rodiny • PCR se značeným primerem nebo DNA značení po PCR • Není nutná elektroforéza • Doba analýzy: 2-3 dny • Náklady: 200-500 Kč / 1 spot • Počet spotů v sérii: nad 20
5
17.4.2012
Analýza velkého počtu známých mutací či mikrodelecí v genu (cca nad 20) • Cystická fibrosa • Duchennova/Beckerova svalová dystrofie • Williamsův-Beurenův syndrom
6
