A termesztett szamóca gyümölcsfejl désében és érésében szerepet játszó gének izolálása

1

A termesztett szamóca gyümölcsfejlĘdésében és érésében szerepet játszó gének izolálása

Doktori értekezés Balogh Andrea

GödöllĘ 2006

2

A doktori iskola megnevezése:

SZIE Növénytudományi Doktori Iskola

tudományága:

Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok

vezetĘje:

Dr. Virányi Ferenc egyetemi tanár, az MTA doktora Szent István Egyetem Növényvédelemtani Tanszék

doktori program:

Növénynemesítés Genetikai és Biotechnológiai Módszerekkel

programvezetĘ:

Dr. Heszky László egyetemi tanár, az MTA tagja Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszék

témavezetĘ:

Dr. Kiss Erzsébet egyetemi tanár, a mezĘgazdasági tudomány kandidátusa Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszék

........................................................... Dr. Virányi Ferenc doktori iskola vezetĘje

........................................................... Dr. Kiss Erzsébet témavezetĘ

3

Tartalomjegyzék

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE........................................................................................................5

1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITĥZÉS…………………………………………………………7 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS………………………………………………………………9 2.1. A szamóca…………………………………………………………………………9 2.2. Az etilén bioszintézis……………………………………………………………..9 2.2.1. Az ACC-szintáz géncsalád.......................................................................11 2.2.2. Az ACC-oxidáz géncsalád……………………………………………………12 2.3. Az etilén jelátviteli mechanizmus………………………………………………12 2.4. A gyümölcsök érése…………………...………………………………………...14 2.5. A szamóca érése, az etilén szerepe…..…………………………………………17 2.6. GyümölcsfejlĘdéssel és éréssel kapcsolatos génexpressziós és funkcionális vizsgálatok szamócában……………………………………………………………..18 3. ANYAG ÉS MÓDSZER………………………………………………………………….20 3.1. cDNS-AFLP……………………………………………………………………..20 3.1.1. Növényi anyag…………………………………………………………………20 3.1.2. RNS izolálás, cDNS szintézis………………………………………………...20 3.1.3. cDNS-AFLP templát elĘállítása……………………………………………..20 3.1.4. Adapter ligálás és pre amplifikáció nem szelektív primerekkel…………22 3.1.5. Szelektív amplifikáció 33P izotóppal jelölt primerrel……………………..22 3.1.6. Az AFLP templát elkészítésekor használt pufferek összetétele…………..23 3.1.7. Az AFLP sávok jellemzése……………………………………………………23 3.1.8. Az expressziós mintázatok kvantitatív mérése és adatelemzés…………..24 3.2. 5’ és 3’ RACE reakciók…………………………………………………………24 3.3. A szamóca ACS, ACO és CTR1 részleges és teljes cDNS-ek izolálása………..25 3.4. Genomi DNS izolálás……………………………………………………………26 3.5. Genomi klónok izolalása………………………………………………………..26 3.6. Promoterek izolálása……………………………………………………………26 3.7. Szemi-kvantitatív RT-PCR analízis……………………………………………27 3.8. Bioinformatikai elemzés………………………………………………………..28 3.9. Rizs protoplaszt izolálás és a FaRing-GFP, FaHd-GFP fúzió tranziens expressziója…………………………………………………………………………..29

4

Tartalomjegyzék

3.9.1. A Rizs protoplaszt izolálás és a FaRing-GFP, FaHd-GFP fúzió tranziens expressziójához használt oldatok, táptalajok……………………………………………………….30 4. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK……………………………………………….31 4.1. A szamóca ACC-szintáz izolálása és expressziós mintázata…………………31 4.1.1. A FaACS promoterének izolálása, bioinformatikai elemzése……………35 4.2. A szamóca ACC-oxidáz izolálása és expressziós mintázata …………………37 4.3. A szamóca CTR1 izolálása és jellemzése………………………………………41 4.3.1. A FaCTR1 promoter izolálása, bioinformatikai elemzése……………….44 4.4. A gyümölcsérés során gátolt és indukált gének azonosítása cDNS-AFLP-vel……………………………………………………………..48 4.4.1. Zöld gyümölcsben expresszálódó gének funkcionális csoportosítása….49 4.4.2. Az érés során expresszálódó gének funkcionális csoportosítása…….....51 4.4 3. Az aszmagban expresszálódó gének funkcionális csoportosítása………55 4.5. Teljes hosszúságú cDNS-ek izolálása és jellemzése…………………………..57 4.5.1. NitrilázszerĦ fehérjét kódoló gén …………………………………………...61 4.5.2. Ring finger fehérjét kódoló gén ………………………………………….....63 4.5.3. Két szamóca receptorszerĦ kináz……………………………………………66 4.5.4. Az Arabidopsis SPATULA génnel homológ szamóca gén……………….68 4.5.5. Plazma membrán ferhérjét (vízcsatornát) kódoló szamóca gén………..69 4.5.6. Homeodomén fehérjét kódoló szamóca gén………………………………..69 4.6. Új tudományos eredmények……………………………………………………………72 5. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK…………………………………………...73 6. ÖSSZEFOGLALÁS………………………………………………………………………74 SUMMARY………………………………………………………………………………76 7. IRODALOMJEGYZÉK………………………………………………………………….78 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS………………………………………………………………90

5

Rövidítések jegyzéke

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

ABA: abszcizinsav ABI1: (ABA Insensitive 1) ABA inszenzitív 1 ACC: 1-aminociklopropán-1-karboxil sav ACS: ACC-szintáz ACO: ACC-oxidáz AFLP: (Amplified Fragment Length Polymorphism) felszaporított hossz polimorfizmus ARF: (Auxin Response Factor) auxin-válasz faktor ATP: adenozin-trifoszfát AuxRE: (Auxin Responsive Element) auxin-válasz elem AVG: Aminoetoxi-Vinil-Glicin BLAST: Basic Local Alignment Search Tool bp: bázispár bHLH: (basic-Helix-Loop-Helix) alap spirál-hurok-spirál BSA: (Bovine Serum Albumin) marha szérum albumin CaMV35S: karfiol mozaik vírus 35S promoter cDNS: (copy) kópia DNS CNR: (Colorless Non-Ripening) pigmenthiányos érésmutáns CTR1: (Constitutive Triple Response) konstitutív hármas válasz 1-Cys Prx: 1-Cys peroxiredoxin DDB1: (UV-Damaged DNA Binding protein 1) UV-károsított DNS kötĘ fehérje 1 DEPC: dietil-pirokarbonát DET1: (De-ETiolated 1) de-etiolált 1 dNTP: dezoxiribonukleotid trifoszfát DTT: ditiotreitol E value: (expected value) várható érték EC: (Ethylene-CTR specific) etilén CTR-specifikus EIN: (Ethylene Insensitive) etilén inszenzitív EOL: (ETO1-Like) ETO1-szerĦ ERD1: (early responsive to dehydration 1) dehidratáció korai válasz 1 gén ERE: (Ethylene Responsive Element) etilén-válasz elem EREBP: (ERE-Binding Protein) ERE-kötĘ fehérje

6

Rövidítések jegyzéke

ERF: (Ethylene Responsive transcription Factor) etilén válaszban résztvevĘ transzkripciós faktor EST: (Expressed Sequence Tag) expresszált szekvencia EtBr: etídium bromid ETO: (EThylene-Overproducer) etilén túltermelĘ ETR: (EThylene Response) etilén válasz GFP: (Green Fluorescent Protein): zöld fluoreszcens fehérje GUS: E. coli ß-D-glükuronidáz gén HDZip: homeodomén-leucin cippzár IAN: indol-3-acetonitril IES: indol-3-ecetsavMCP: 1-Metil-CikloPropén MES: 2-(N-morfolin) etánszulfonsav MTA: 5'-Metil-TioAdenozin NCBI: National Center for Biotechnology Information NOR: (NOn-Ripening) érésmutáns NOS: Nopalin szintáz nptII: Neomicin-foszfotranszferáz II ORF: (Open Reading Frame) nyitott olvasási keret PCR: (Polymerase Chain Reaction) polimeráz láncreakció PEG: polietilén glikol RACE: (Rapid Amplification of cDNA ends) cDNS végek gyors felszaporítása RAN1: (Responsive to ANtagonist) RIN: (Ripening Inhibitor) érés-gátló RLK: (Receptor-Like Kinase) receptorszerĦ kináz TAIL-PCR: (Thermal Asymmetric InterLaced Polymerase Chain Reaction) termál aszimmetrikus összetett polimeráz láncreakció UTR: (UnTranslated Region) nem transzlálódó szakasz TDF: (Transcript Derived Fragment) transzkriptum eredetĦ fragmentum U: (unit) egység

7

Irodalmi áttekintés

1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITĥZÉS

A gyümölcsök érése, akár utóérĘ, akár nem-utóérĘ gyümölcsrĘl van szó, olyan általános jelenségeket foglal magába, mint a sejtfal szerkezetének megváltozása, az íz és aroma összetevĘk minĘségi és mennyiségi módosulása, méret és színváltozás, ami mindenképpen jelentĘs génexpressziós változások eredménye. Ezek a változások lehetĘvé teszik - az eltérĘ RNS profil alapján - az érésben szerepet játszó gének és promotereik meghatározását: a transzkriptumok azonosításával az érés indukálta gének felfedezését, illetve az átíródó gének promotereinek izolálását. Ezen a területen új korszakot nyitottak a genomprojektek. Az Arabidopsis thaliana, és a rizs teljes fizikai térképe alapján megkezdĘdhetett a magasabbrendĦ növényekben mĦködĘ gének azonosítása és funkciójuk felderítése. Az etilén bioszintézisében és jelátviteli mechanizmusában szerepet jatszó gének izolálása. A klimaktérikus gyümölcsök érési mechanizmusa már jól ismert, és bizonyított tény, hogy a folyamatban az etilénnek kulcsfontossága van. Ezekben a növényekben (paradicsom, banán, alma) az etilén bioszintézisével és szignál transzdukciójával kapcsolatos géneket már azonosították, és többségüket funkcionálisan jellemezték. Ezzel ellentétben a nem klimaktérikus

gyümölcsök

gyümölcsérésben

betöltött

esetében

kevés

szerepérĘl.

adattal

Kutatásaink

rendelkezünk elkezdésekor

az a

etilénnek

szamóca

a

etilén

bioszintézisében és jelátviteli mechanizmus kulcsgénei közül egyedül az ETR-t kódoló gén részleges szekvenciája volt ismert, ezért elsĘdleges célunk volt az ACC-szintázt, ACCoxidázt és CTR1-et kódoló gének és promotereik azonosítása. A szamóca érését befolyásoló új gének izolálása, és az érés során különbözĘ expressziós szintet mutató gének azonosítása. A szamóca gyümölcs érésében feltételezetten szerepet játszó gének azonosítása és ezáltal a nem utóérĘ érés tanulmányozása céljából cDNS-AFLP módszert használtunk. A zöld, fehér, rózsaszín és piros érési stádiumban levĘ gyümölcsökben az aszmag és a gyümölcshús transzkriptum akkumulációjának elemzésével az expressziós mintázatok összehasonlítása volt a cél. Mivel szamócában kevés gén szekvenciainformációja publikus, kvantitatív cDNS-AFLP technikát alkalmaztunk, ami a gének expressziós mintázatának a nyomonkövetésével párhuzamosan, a ritka mRNS-ek detektálását, a tanulmányozott folyamatokban (gyümölcsfejlĘdés, érés) résztvevĘ új gének azonosítását is lehetĘvé teszi. A szövetspecifikus

(gyümölcshúsban

expresszálódó)

gének

azonosítása

mellett,

a

8


gyümölcshúsban és aszmagban egyaránt jelen levĘ, expressziós mintázatukban hasonló gének azonosítását is célul tĦztük ki a gyümölcshús és aszmag érésének közös szabályozási mechanizmusának és kölcsönhatásának feltárása végett. Teljes hosszúságú cDNS-ek izolálása és jellemzése Az érés során akkumulálódó transzkriptumok közül – az érésben betöltött feltételezhetĘ funkciójuk alapján – további jellemzésre olyanokat választottunk ki, amelyeket más gyümölcsök esetében már kapcsolatba hoztak az éréssel. A Ring finger gént, bHLH és HDzip transzkripciós faktorok, jelátviteli mechanizmusokban résztvevĘ kulcsgének (kinázok), auxin bioszintézisben résztvevĘ nitrilázszerĦ gének teljes hosszúságú cDNS-eit a cDNSAFLP fragmentumok szekvenciainformációjából kiindulva 5' és 3' RACE technikával izoláltuk. ElképzelhetĘ, hogy a nitrilázszerĦ fehérjét kódoló gén kivételével a többi gén funkcionális elemzése fényt deríthet a nem utóérĘ érési folyamatoknak egy hormonális szint fölötti, szabályozási mechanizmusának feltárására.

9


2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1. A szamóca A szamóca az egyik legkedveltebb és a legnagyobb mennyiségben termesztett bogyós gyümölcs a világon. ÉvelĘ, gyöktörzses, tĘszáras, indákkal szaporodó, lágyszárú növény. Levelei hármasan összetettek, a levélkék fĦrészes szélĦek. Fehér szirmú virágai tĘkocsányon, bogernyĘben állnak. Elhúsosodó vacokkúpja piros színĦ, édes, leveses, és ennek felületén ülnek a száraz aszmagtermések. A szamóca gyümölcse aszmag-terméscsoport, amelynek részei a gyümölcskocsány, csészelevelek, a meghúsosodott vacok és az aszmagok. A különbözĘ színĦ aszmagtermések a gyümölcs felületén, fajtára jellemzĘen eltérĘ mélységben ülnek. A szamóca a Fragaria nemzetségbe, a Rosidae alosztályba és a rózsafélék (Rosaceae) családjába tartozik. A 19 leírt Fragaria faj 4 természetes ploidia csoportot alkot, a következĘ fontosabb képviselĘkkel: a diploid F. vesca (2n = 2x = 14), a tetraploid F. orientalis (2n = 4x = 28), a hexaploid F. moschata (2n = 6x = 42) és az oktoploid F. virginiana és F. chiloensis (2n = 8x = 56). A kerti szamóca (Fragaria x ananassa Duch. = F. magna) az ÉszakAmerikából származó F. virginiana és a ChilébĘl származó F. chiloensis spontán keresztezõdésébõl a 18. század elején keletkezett Európában. Az új szamóca fajhibrid, amelyet Miller 1760-ban írt le, és amely a Fragaria x ananassa Duch. elnevezést kapta, a virginiai szamócától a piros gyümölcsszint, a keményebb húsállományt, a chilei szamócától pedig a gyümölcsnagyságot és a kiváló zamatot örökölte. Ez a fajhibrid lett az alapja a ma termesztett nagy gyümölcsĦ szamócafajtáknak. Magyarországon Ęshonos szamócafajok, a diploid erdei szamóca (Fragaria vesca L.) és a csattogó szamóca (Fragaria viridis Duch.) közül az elĘbbinek nemesítési és virológiai jelentĘsége van. Nemesítési szempontból könnyĦ csumázhatósága, kiváló zamata, egyes változatainak folytontermĘ (Fragaria vesca semperflorens Duch.), és indát nem képzĘ jellege (Fragaria vesca efflagellis Duch.) értékes. A F. vesca virológiai jelentĘségét vírusérzékenysége adja, így biotesztekben használható az egészséges anyanövények kiválasztásakor (Papp és Porpáczy 1999).

2.2. Az etilén bioszintézis A magasabbrendĦ növényekben az etilén bioszintézise metioninból indul (Yang és Hoffman, 1984): Metioninĺ S-adenozil-metionin (AdoMet)ĺ ACC (1-aminociklopropán-1-

10


karboxilát)ĺ C2H4 (etilén). Növényekben az 1-aminociklopropán-1-karboxilát szintáz (ACS, EC 4.4.1.14) az etilénbioszintézis kulcsenzime.

1. ábra. Az etilén bioszintézis útvonala és szabályozása (Wang et al. 2002).

Az S-AdoMet szintézisét a SAM szintetáz katalizálja metioninból, egy ATP molekula / SAdoMet felhasználásával. Az S-AdoMet nukleinsavak, fehérjék és lipidek metil donora. A SAdoMet a poliaminok bioszintézisében is részt vesz (spermidin/ spermin bioszintetikus út). A Yang ciklusban (Yang és Hoffmann, 1984), az etilén bioszintézis elsĘ lépése az S-AdoMet konverziója 1-amino-ciklopropán-1-karboxil savvá (ACC), amelyet a piridoxál 5'-foszfát függĘ enzim katalizál. Az ACC mellett 5'-metiltioadenozin (MTA) is szintetizálódik az ACCszintáz segítségével, amely új metionin molekulák kialakulásához vezet, lezárva a Yang ciklust. Ez a folyamat teszi lehetĘvé az állandó celluláris metionin koncentráció fenntartását és metil-tio csoportok megĘrzését, így a folyamatos etilén bioszintézis nagyobb metionin mennyiség igénybevétele nélkül zajlik le. Végül egy oxigénfüggĘ folyamatban az ACC-t az ACC-oxidáz etilénné, szén-dioxiddá és cianiddá alakítja. A cianid ȕ-cianoalaninná alakul a ȕcianoalanin szintáz segítségével, megelĘzve a cianid toxicitását intenziv etilén szintéziskor (1.

11


ábra). Az ACC szintáz és ACC oxidáz transzkripciós szabályozása szaggatott nyilakkal van jelölve az 1. ábrán. FeltételezhetĘ, hogy az ACC szintázt ismeretlen foszfatázok (Ptase) és kinázok reverzibilisen foszforilálják. A kinázokat valószínĦleg különbözĘ stresszfaktorok indukálják. Az ACC szintáz mindkét formája (natív és foszforilált (ACC szintáz-Pi)) mĦködĘképes, bár in vivo a natív ACC szintáz valószínĦleg kevésbé stabil vagy aktív. A fehérje C-terminális végéhez egy feltételezett inhibitor társulhat, ami leválik az enzimrĘl, ha ez foszforilálódik. Az etilén bioszintézisnek mind feed-back mind feed-forward szabályozását leírták különbözĘ növényfajokban (Kende 1993, Nakatsuka et al. 1998, Barry et al. 2000). Ebben a szabályozási mechanizmusban a célfehérjék valószínĦleg az ACS különbözĘ izoformái. Így például az etilén pozitívan szabályozza a paradicsom Le-ACS2 és Le-ACS4-et, és negatívan hat az Le-ACS6-ra (Nakatsuka et al. 1998).

2.2.1. Az ACC-szintáz géncsalád Az ACC szintázt multigén család kódolja. Az Arabidopsis genomban 13 ACC szintáz gént (ACS1-13) azonosítottak, ezekbĘl az ACS3 valoszínĦleg pszeudogén, míg az ACS1 nem funkcionális fehérjét kódol (Liang et al. 1992; Liang et al. 1995). Az Arabidospsis-hoz hasonlóan az ACC-szintáz enzimet más növényfajokban is egy többtagú géncsalád kódolja, amelyek közül már azonosították például a cukkini (Huang et al. 1991), a paradicsom (Rottman et al. 1991), a mungó bab (Botella et al. 1993), a rizs (Zarembinski és Theologis 1993), szegfĦ (Henskens et al. 1994), az alma (Lay-Yee et al. 1995; Rosenfield et al. 1996), a burgonya (Destefano-Beltran et al. 1995), a rózsa (Wang et al. 2004) megfelelĘ klónjait. Arabidopsis-ban az ACS3 kivételével átíródnak, és a növény fejlĘdése során differenciáltan expresszálódnak. Bizonyították, hogy az ACS izoenzimek biokémiailag különböznek, alkalmazkodva az egyedi sejtkörnyezethez, így lehetséges, hogy az etilén mint szignálmolekula szövet- vagy sejtspecifitással rendelkezik (Yamagami et al. 2003). Arabidopsis-ban 7 ACS gén expressziós mintázatát tanulmányozták. Az ACS2-t cikloheximid, sebzés és 2 órányi etilén kezelés indukálja. Az etilén indukálta expresszió fokozatosan csökken, a továbbtartó etilén kezeléssel, az ACS2 feed-back szabályozására utalva (Van der Straeten et al. 1992; Liang et al. 1996). Csíranövényekben az ACS4 cikloheximiddel, indolecetsavval és sebzéssel indukálható (Liang et al. 1992; Abel et al. 1995). Az ACS5 lítium kloriddal és kis koncentrációjú citokininnel indukálható etiolált csíranövényekben (Vogel et al. 1998). Az ACS6 specifikusan indukálható cianiddal, fényben nevelt levelekben ózonnal, érintés okozta mechanikai stresszel; indukálható továbbá cikloheximiddel, indolecetsavval és etilénnel (Vahala et al. 1998, Overmyer et al. 2000, Smith és Arteca 2000). Az ACS10 a

12


CONSTANS korai célgénje, ami Arabidopsis-ban fény hatására a virágzást idézi elĘ (Samach et al. 2000).

2.2.2. Az ACC-oxidáz géncsalád Az etilén bioszintézis utolsó lépését, az ACC etilénné történĘ alakítását az ACC oxidáz (ACO) enzim katalizálja. Az ACC oxidáznak fontos szerepe lehet az etilén bioszintézis szabályozásában különösképpen az etiléntermelést serkentĘ körülmények közt (Holdsworth et al. 1988). Az ACC oxidázt szintén multigén család kódolja, különbözĘ tagjait már számos növényfajban azonosították. Paradicsomból négy ACO gént (Le-ACO1-4) izoláltak, amelyek sebzés, virágfejlĘdés, levél és virágszeneszcencia és gyümölcsérés során indukálódnak (Nakatsuka et al. 1998). Arabidopsis-ban az ACO-t szintén multigén család kódolja, de kevés információval rendelkezünk az egyes génekkel kapcsolatban (Raz és Ecker 1999). Bár az etilén bioszintézis kulcsfontosságú szabályozó eleme az ACC szintáz, az ACO géncsalád tagjai szintén differenciáltan vannak szabályozva, bizonyítva funkcionális fontosságukat (Prescott és John 1996). Legalább két Arabidopsis ACO gén indukálható etilénnel (Zhong és Burns 2003). Az egyik ezek közül, ACO2, fĘleg a csíranövények apikális részén expresszálódik, ami a sejtek differenciált expanziójához és ennek következtében az apikális kampó kialakulásához vezet (Raz és Ecker 1999). Az etilénnel összhangban a gibberellineknek is szerepük van a folyamat szabályozásában (Vriezen et al. 2004). Ez a fajta több hormonos szabályozás az etilén bioszintézisnek közös vonása, ugyanis jelen van az auxin és etilén kölcsönhatásban is meghatározva két rizs ACO gén mĦködését: az etilén indukálja az OsACO3-at de csak auxin hiányában, míg az OsACO2-t etilén jelenlétében kis mértében az auxin indukálja (Chae et al. 2000). Szamócában két (FaACO1 és FaACO2), érés során expresszálódó ACO génrĘl számoltak be, mindkét génrĘl bizonyították, hogy etilén hatására indukálódik, a FaACO2 expresszióját az auxin gátolja, míg a FaACO1-et mérsékelten indukálja (Trainotti et al. 2005).

2.3 Az etilén jelátviteli mechanizmus Az etilén szignál transzdukciós útvonal több komponensét csíranövények, etilén hatására sötétben, a "hármas-válasz"-nak elnevezett fenotípusos elváltozása alapján azonosították. Talajban, a magvak csírázása etiléntermeléssel párosul, ami a csíranövények úgynevezett "hármas-válasz"-át váltja ki. A „hármas-válasz” a túlzott apikális huroknak nevezett, átmeneti (tranziens) fejĘdési struktúrának kialakulását, valamint a hipokotil és

13


gyökér megvastagodását jelenti (Abeles et al. 1992). A hármas-válasz a hajtás és a gyökér apikális merisztémáit óvja a talajon keresztüli növekedés során.

2. ábra. Az etilén jelátviteli út modellje. Az etilén receptor egy réz iont köt meg valószínĦleg a Golgi készülékben történĘ fehérje módosulás során. A réz iont a RAN1 szállító fehérje továbbítja. Az etilén receptor feltehetĘen az endoplazmatikus retikulum membránban található. Az EIN2 lokalizációja és a mĦködését befolyásoló szignálok még nincsenek tisztázva. Az EIN3 a sejtmagban mĦködik, de nem ismert, hogy etilén hiányában is nukleáris lokalizációjú vagy sem. Etilén hiányában az etilén receptor és a CTR1 aktívak és feltételezhetĘ, hogy gátolják az EIN2-t. Amikor az etilén receptor felismeri az etilént, kikapcsol, és az EIN2 aktiválja az EIN3-at. Az aktivált EIN3 az ERF1 gén expresszióját, az ERF1 transzkripciós faktor pedig az etilénválaszban szerepet játszó géneket indukálja (Hirayama és Ugajin 2003) A hármas válasz etilén-etilén receptor kölcsönhatás révén következik be. Az ETR1 hisztidin kináz doménje kölcsönhatásba lép a CTR1-el, az etilén jelátvitel következĘ elemével. A CTR1 Raf-szerĦ szerin/treonin kináz, (MAPKK kináz) és az etilén válasz negatív regulátora, ugyanis a ctr1 mutáns etilén hiányában konstitutív etilén válaszban nyilvánul meg (Kieber et al. 1993). Az etilén jelátviteli út tehát a következĘképpen mĦködik: etilén hiányában az etilénreceptorok aktiválják a CTR1-et, gátolva az etilén-válaszreakciókat. Etilén jelenlétében a receptorok nem aktiválják a CTR1-et, felszabadítva az etilén választ a CTR1

14


által közvetített gátlás alól, aminek eredménye az EIN2 aktiválása (2. ábra) (Hua és Meyerowitz 1998; Hirayama és Ugajin 2003). Az EIN2 aktiválásának következményeképpen egy transzkripciós kaszkád indul be, amiben részt vesznek az EIN3/EIL és ERF transzkripciós faktorok (2. ábra) indukálva az etilén válaszban szerepet játszó géneket. Az Arabidopsis-ban 5 etilén receptort kódoló gént azonosítottak: ETR1, ERS1, ETR2, ERS2 és EIN4 (Hua és Meyerowitz 1998). Funkcionális ETR1 homológokat izoláltak többek között rózsából (Müller et al. 2000), búzából (Ma és Wang 2003), körtébĘl (El-Sharkawy et al. 2003). A növény fejlĘdése során az etilén receptor gének szabályozása differenciált Arabidopsis-ban és paradicsomban (Hua és Meyerowitz 1998; Lashbrook et al. 1998). Az At-ERS1 (Hua és Meyerowitz 1998) és az NR (never ripe) (Wilkinson et al. 1995a) az etilén érzékelés autoregulációjában játszik szerepet, és expressziójuk indukálódik a hormon hatására. Szamócában három etilén receptorról van irodalmi adat (FaEtr1, FaErs1 és FaEtr2). Ezek közül a FaEtr1 és FaErs1 expressziója az érés során indukálódik, a FaEtr2 a fehér gyümölcsben mutatja a legnagyobb expressziós szintet, majd enyhén csökkenĘ tendenciát mutat (Trainotti et al. 2005). A CTR1 esetében Arabidopsis-ban eddig csak egy CTR1 funkciójú génrĘl számoltak be, ennek expressziós mintázata konstitutív. ElképzelhetĘ hogy a CTR-t is multigéncsalád kódolja, paradicsomban már 4 CTR gént azonosítottak (Le-CTR1-Le-CTR4) valamint ezek differenciált szabályozását. Érdekes adat, hogy az etilén válasz negatív szabályozó elemeként, az Le-CTR1 pozitív etilén választ ad, ami az etilén érzékenység modulálására szolgálhat a megfelelĘ etilénválasz létrejöttéhez a különbözĘ környezeti hatások és szövettípusok esetében (Adams-Phillips et al. 2004).

2.4. A gyümölcsök érése A gyümölcsök érése a fejlĘdés végsĘ stádiuma, amikor is a beérett magvak kiszabadulnak. Az Arabidopsis becĘje esetében ezt a folyamatot az érett termĘlevelek szeneszcenciáját követĘen ezek szétválása segíti elĘ. Az Arabidopsis-al ellentétben, a húsos gyümölcsök, például a paradicsom, az érési folyamat során olyan biokémiai, fiziológiai és szerkezeti változásokon mennek keresztül, amelyek a magterjesztĘ szervezetek vonzását célozzák. Bár az érést eredményezĘ jellegzetes biokémiai folyamatok a fajok között eltérĘek, a tipikus változások magukba foglalják (1) a szín változását karotinoid és / vagy flavonoid akkumuláción keresztül, (2) a sejt turgor módosulását és a sejtfal szerkezetének változását (3) cukrok, savak és illóanyagok összetételének változását, amely befolyásolja a gyümölcs minĘségét, ízét és aromáját, és (4) a sejtfal integritásának elvesztése következtében fokozott

15


érzékenység lép fel opportunista patogénekkel szemben (Giovannoni 2004). Annak ellenére, hogy a klasszikus növényélettan a gyümölcsfajokat két csoportra osztja a fokozott respiráció és etiléntermelés jelenléte (klimaktérikus) vagy hiánya (nem klimaktérikus) alapján (Lelievre et al. 1997), a fentiekben felsorolt fejlĘdésbeli változások mindkét csoport tagjaira jellemzĘek (Giovannoni 2004). Érésükhöz etilént igénylĘ klimaktérikus gyümölcsök körébe tartozik például a paradicsom, alma, banán és a legtöbb csonthéjas, míg a nem klimaktérikus csoportba sorolt szĘlĘ, ananász, citrom, narancs és szamóca érése fokozott etilén bioszintézis nélkül is bekövetkezik. Bár a két csoportot az irodalom élesen elkülöníti egymástól, egyre több publikáció számol be az etilén hatásáról nem klimaktérikus gyümölcsök érésében is (Goldschmidt et al. 1993, Alonso et al. 1995, El-Kereamy et al. 2003, Tesniere et al. 2004, Balogh et al. 2005b). Másrészt egyre több kutatási eredmény támasztja alá a nem hormonális tényezĘk szerepét klimaktérikus és nem klimaktérikus érés szabályozásában egyaránt. A nemutóérĘ szĘlĘben például a VvAdh2 transzkripciója 1-MCP-vel gátolható és az etiléngeneráló vegyülettel, a 2-klór-etil-foszfonsavval stimulálható (Verries et al. 2004). Ugyancsak szĘlĘben exogén etilénnel stimulálható az antocianin bioszintézissel kapcsolatos gének expressziója (El-Kereamy et al. 2003). Chervin és munkatársai (2004) arról számolnak be, hogy a szĘlĘ érésekor átmeneti etilén termelés észlelhetĘ. Ebben a stádiumban az etilén jelenléte szükséges a bogyó növekedéséhez, a savasság csökkenéséhez és az antocianin akkumulációjához. In silico génexpressziós vizsgálatban klimaktérikus és nem klimaktérikus érésre jellemzĘ génexpressziót hasonlítottak össze érett szĘlĘ és paradicsom EST adtabázisok segítségével. A mindkét fajban jelenlevĘ homológ gének között három transzkripciós faktort is találtak, ezek a MADS-box, RING cink ujj és bZip transzkripciós faktorok családjába tartoznak (Fei et al. 2004). Ugyanez a tanulmány 18 érés indukálta és 14 érés gátolta transzkripciós faktorról számol be paradicsomban, bár ezeknek az érés szabályozásával való funkcionális kapcsolata továbbra is ismeretlen. Paradicsomban, érésmutánsok tanulmányozásával több transzkripciós faktor érés szabályozási szerepére mutatták rá. Érdekes a rin, a nor (non-ripening) és Cnr (Colorless nonripening) paradicsom spontán érésmutáns, ugyanis az érés etilén szint feletti szabályozásával kapcsolatos (Adams-Philips et al. 2004). A rin vagy nor homozigóta valamint a domináns Cnr allélt hordozó gyümölcsök kifejlĘdnek és magot termelnek, de a gyümölcsök nem érnek be. A kifejlĘdött és be nem érett rin, nor és Cnr gyümölcsben nincs klimaktérikus légzés sem megnövekedett etilén bioszintézis. Az etilénkezelés nem állítja vissza a rin, nor vagy Cnr gyümölcsök érését, de indukálja az etilén-függĘ géneket (3. ábra). Ez a megfigyelés azt

16


támasztja alá, hogy a rin, nor és Cnr nagyobb befolyással rendelkezik a klimaktérikus érésszabályozásban, mint az etilén és az ilyen mechanizmusokról elképzelhetĘ, hogy a klimaktérikus és a nem klimaktérikus gyümölcsökben egyaránt jelen vannak (Giovannoni 2004). A rin és nor molekuláris jellemzésébĘl kiderült, hogy a rin-t egy MADS-box transzkripciós faktor (LeMADS-RIN) utolsó exonjának deléciója okozza (Vrebalov et al. 2002). A nor lokuszon szintén egy transzkripciós faktort azonosítottak, bár ez nem tartozik a MADS-box gének családjába (Adams-Philips et al. 2004). Az LeMADS-RIN homológját szamócából is izolálták (Fv-MADS-9), amely gyümölcs specifikus expressziót mutat és filogenetikailag az LeMADS-RIN-nel tartozik egy csoportba (Vrebalov et al. 2002). Ez a transzkripciós faktor a jelátviteli útban az etilén fölött helyezkedik el, és valószínĦleg a klimaktérikus és nem klimaktérikus érés szabályozásának közös láncszeme lehet (Vrebalov et al. 2002, Adams-Philips et al. 2004) (3. ábra). .

3. ábra. A klimaktérikus érést szabályozó molekuláris mechanizmus modellje. Az LeMADSRIN, LeNOR, valószínĦleg további MADS-box fehérjék, CNR és még nem azonosított tényezĘk (?) képviselik azt a fejlĘdésbeli jelátviteli rendszert, amely a klimaktérikus gyümölcsökben elindítja az érést. A LeMADS-RIN-el homológok, nem klimaktérikus fajokra is vonatkozhatnak. Ez a fejlĘdésbeli jelátviteli rendszer szabályozza az etilén szintézist a nem etilén-közvetítette érési válaszok mellett (piros szaggatott nyíllal jelölve). A fény befolyásolja az érést, a paradicsomban, a karotinoid akkumuláció kapcsolatban, és a DET1 (hp2) és DDB1 (hp1) géntermékek aktivitásán keresztül (Adams-Philips et al. 2004). Az etilénnel ellentétben, ami a klimaktérikus gyümölcsöknél a legtöbb érési folyamat befejezéséhez szükséges, a fény hatása az érésre a pigment akkumuláció szabályozásában

17


nyilvánul meg (Adams-Philips et al. 2004). A karotinodok és flavonoidok a foto-oxidációt semlegesítĘ antioxidáns tulajdonsággal rendelkeznek, de nutritív jelentĘségük is van (Hwang és Bowen, 2002). A paradicsom pigmentmutánsokra (hp1, hp2), a fokozott fényérzékenység következtében, a nagymértékĦ karotinoid és flavonoid akkumuláció jellemzĘ. Mindkét gént klónozták, és az Arabidopsis-ban már leírt fény jelátviteli út komponensei. A hp1 a DDB1-el (UV-Damaged DNA binding protein 1), a hp2 a DET1-el (De-Etiolated) génekkel homológ paradicsom gének mutációjának eredménye (Mustilli et al. 1999, Liu et al. 2004).

2.5. A szamóca érése, az etilén szerepe A szamóca gyümölcs növekedését leginkább az aszmagból a gyümölcshúsba áramló auxin befolyásolja (Nitsch 1950). A gyümölcsfejĘdés késĘbbi szakaszában (középsĘ zöld stádium), az érés elĘtt, a gyümölcshús auxin szintje csökken, valószínĦleg az aszmagból áramló auxinmennyiség csökkenése majd megszĦnése miatt, ami elĘidézi az érést (Given et al. 1988). Az érés kezdetekor olyan gének indukálódnak, amelyek felelĘsek a pigmentációban és szerkezeti tulajdonságokban bekövetkezett drámai változásokért (Manning 1994, 1998). Klimaktérikus gyümölcsökben az érést beindító jelmolekula az etilén, de nem minden érési folyamat etilén-függĘ (Lelièvre et al. 1997). A érése során, az érés utolsó fázisában, a szamóca enyhén emelkedĘ etiléntermelést mutat (Perkins-Veazie et al. 1996). Az ACCoxidázt és etilén receptorokat kódoló gének izolálásáról és expressziós mintázatukról megjelent friss irodalmi adatok összhangban vannak a Perkins-Veazie által leírt eredményekkel, ugyanis az érés során indukálódó FaACO1 és FaACO2 az etiléntermelés fokozódását jelenti (Trainotti et al. 2005). Releváns adat, hogy a megnövekedett etilénszintézissel párhuzamosan az etilén receptorok szintézise is fokozódott. Ezeknek a receptoroknak a többsége a degenerált hisztidin-kináz doménnel rendelkezĘ etilén receptorok csoportjába tartozik, amelyek a CTR1-el (etilén válasz negatív regulatorával) gyengebb kapcsolatot hoznak létre, így a szamóca alacsony etiléntermelése elégendĘ lehet az érési folyamtok beindításához (Trainotti et al. 2005). Az etilén szerepének tisztázása és esetleges gyakorlati haszon érdekében (a szamóca eltarthatóság idejének hosszabbítása) több kutatócsoport foglalkozott az 1-MCP szamóca gyümölcsérésre

kifejtett

hatásával.

Az

1-MCP

(1-metilciklopropén)

standard

szobahĘmérsékleten és nyomáson az gázhalmazállaptú. Hatásmechanizmusának alapja, hogy kötĘdik az etilén receptorokhoz és gátolja a jelátviteli folyamatokat (Sisler et al. 1996; Sisler és Serek 1997). Az 1-MCP az etilénnél tízszer nagyobb affinitással kötĘdik a receptorokhoz. Az etilénnel ellentétben, az 1-MCP hatása sokkal kisebb koncentrációnal jelentkezik. Az 1-

18


MCP néhány növényfaj esetében feed back gátlás révén az etilén bioszintézist is befolyásolja (Blankenship és Dole 2003). Már nagyon kis koncentrációnál (2,5 nl/l – 1 ȝl/l) hatékony (Sisler et al. 1996) és ebben a koncentrációtartományban nem mérgezĘ, ugyanakkor a növényi szövetbĘl gyorsan diffundál, almánál, a kezelést követĘen nyolc óra után már nem volt detektálható a gyümölcshúsban (Blankenship és Dole 2003). Tulajdonságai miatt az 1-MCP gyakorlati alkalmazása elterjedt, számos gyümölcs, zöldség és vágottvirág esetében gátolja az etilén

hatását,

növelve

a

gyümölcsök

eltarhatóságát

valamint

a

vágottvirágok

vázaélettartamát. Alapkutatásban az etilén szerepének tisztázása céljából alkalmazzák. Szamócában az 1-MCP hatását eddig az 'Everest', 'Tioga', 'Seascape' és 'Pajaro' fajták esetében vizsgálták (Ku és Willis 1999, Tian et al. 2000, Jiang et al. 2001). Az 1-MCP hatása függött az alkalmazott koncentrációtól, valamint az utólagos tárolási hĘmérséklettĘl. Ezekszerint 5-15 nl/l koncentrációban a kezelés hatására a gyümölcsök eltarthatósága 20ºC-on 35%-al, 5ºC-on pedig 150%-al nĘtt. Nagyobb koncentrációnál (500 nl/l) mind 20ºC-on mind 5ºC-on is 30-60%-al csökkent az eltarthatóság (Ku és Willis 1999). Jiang et al. (2001) kísérletében magas 1-MCP (500-1000 nl/l) koncentráció szintén negatívan befolyásolta a szamóca gyümölcsök eltarthatóságát ami fĘleg a patogénekkel szembeni nagyobb fogékonyság következménye. Nagy koncentracióban ugyanis az 1-MCP gátolta a fenilalanin ammónia-liáz aktivitását valamint csökkentette a gyümölcsök antocianin és fenol tartalmát. Ismert a növényi fenolok patogénekkel szembeni aktivitása, a csökkentett fenoltartalom tehát felelĘs lehet a kisebb rezisztenciáért. Ugyanakkor kisebb (10-200 nl/l) alkalmazott koncentráció esetében az 1-MCP csökkentette az etilén termelést és a gyümölcsök puhulását, javítva az eltarthatóságukat.

2.6. GyümölcsfejlĘdéssel és éréssel kapcsolatos génexpressziós és funkcionális vizsgálatok szamócában Az utóbbi években több kutatócsoport is beszámolt a szamóca érésében szerepet játszó gének

azonosításáról,

klónozásáról.

A

kutatások

elsĘdleges

célpontját

a

sejtfal

metabolizmusával kapcsolatos gének jelentették, ugyanis a gyümölcs puhulása, fĘleg a szamóca esetében, fontos minĘségi bélyeg tároláskor (1. táblázat). A legtöbb esetben az azonosított gének többségét a gyümölcshúsból izolálták, és csak néhány hozható kapcsolatba az

aszmag

fejlĘdésével.

Génazonosításra

alkalmazott

stratégiák:

degenerált

oligonukleotidokkal végzett RT-PCR (Kim és Chung 1998, Llop-Tous et al. 1999, Harrison et al. 2001, Trainotti et al. 2001) valamint klónkeresés cDNS könyvtárakban (Harpster et al. 1998, Nam et al. 1999, Civello et al. 1999). Gyümölcséréssel kapcsolatos gének izolálására és

19 génexpressziós

mintázatok

elemzése

céljából

Irodalmi áttekintés használták

a

fehérje

két-dimenziós

poliakrilamid gél-elektroforézist (Manning 1994, 1998), és a differential-display technikát (Wilkinson et al. 1995b) is. Az 1. táblázatban feltüntetett gének többségét gyümölcshúsból izolálták, de nemrég elkészült egy teljes növényt átfogó, 1304 szekvenciát tartalmazó EST gyĦjtemény is (Folta et al. 2005).

1. táblázat. Szamócában azonosított és funkcionálisan jellemzett gének Azonosított gén

Funkció

Pektát liázt kódoló Sejtfalbontás gén Sejtfalbontás FaExp2 SAAT

Gyümölcsaroma kialakulása

Faȕgal

Sejtfalbontás Antocianinok és flavonolok bioszintézisének szabályozása C-vitamin bioszintézis MADS box gén, AGAMOUS homológ Polifenol horgonyzás Sejtfalbontás Sejtfalbontás

FaMYB1 GalUR STAG1

SzerzĘk Medina-Escobar et al. (1997), Benitez-Burraco et al. (2003) Civello et al. (1999) Aharoni et al. (2000), Beekwilder et al. (2004) Trainotti et al. (2001) Aharoni et al. (2001) Agius et al. (2003) Rosin et al. (2003)

Blanco-Portales et al. (2004) Fahyprp Martinez et al. (2004) FaXyl1 Castillejo et al. (2004) FaPE1 - FaPE4 Fitocisztatint Kórokozókkal szembeni védekezés Martinez et al. (2005) kódoló gén Cinnamoil glükóz bioszintézise Lunkenbein et al. (2006) FaGT2 Rövidítések: FaExp2: expanzin2 gén, SAAT: alkohol aciltranszferáz gén, Faȕgal: ßGalaktozidáz gén, FaMYB1: MYB transzkripciós faktorok csoportjába tartozó gén, GalUR: D-galakturonsav reduktáz gén, Fahyprp: hidroxyprolinban gazdag protein gén, FaXyl1: betaxylozidáz gén, FaPE1 - FaPE4: pektin észterázt kódoló gén, FaGT2: glükoziltranszferáz gén Az érés és különbözĘ tényezĘk hatására módosuló génexpressziós mintázatok vizsgálatában jelentĘs áttörést értek el a microarray technika alkalmazásával (Aharoni és O’Connell 2002; Aharoni et al. 2002; Alba et al. 2004). Számos, az érés során expresszálódó új szamóca gént azonosítottak, több tucat auxin-függĘ és független, valamint az éréskor az oxidatív stressz hatására indukálódó génrĘl számoltak be (Aharoni et al. 2002). Az érés indukálta gének funkcionális vizsgálata során FaMYB1 transzkripciós faktorról a fehérje dohányban történt túltermeltetésével sikerült bizonyítani, hogy az antocianin és flavonolok bioszintézisének szabályozásában kulcsszerepet tölt be (Aharoni et al. 2001). Hasonló stratégiával bizonyították és jellemezték az alkohol aciltranszferázt kódoló SAAT gén funkcióját, amely a szamóca gyümölcsaromájának kialakulásáért felelĘs (Beekwilder et al. 2004).

20

Anyag és módszer

3. ANYAG ÉS MÓDSZER

3.1. cDNS-AFLP

3.1.1. Növényi anyag A cDNS-AFLP-ben használt szamóca gyümölcs (Fragaria x ananassa Duch. cv. ‘Elsanta’) egy genti (Belgium) kertészetbĘl származik. Zöld, fehér, rózsaszín és piros érési stádiumban levĘ gyümölcsöket gyĦjtöttünk be (4. ábra). Az RT-PCR-hez, DNS izoláláshoz használt növényi anyagot a SZIE kertészeti tanszéke biztosította, a Botrytis cinerea-val fertĘzött gyümölcsök is innen származnak.

4. ábra. A cDNS-AFLP-ben használt zöld, fehér, rózsaszín és piros érési stádiumban levĘ szamóca gyümölcs

3.1.2. RNS izolálás, cDNS szintézis Az aszmagból és gyümölcshúsból az összes RNS kivonást a Salzman et al. (1999) által közölt módszerrel végeztük. A vegetatív növényi részekbĘl az RNS izolálás a Qiagen cég RNeasy kit-jével történt. A reverz transzkripciót, cDNS szintézist valamint a cDNS-AFLP analízist Breyne et al. (2003) átal közölt módszer alapján végeztük (5. ábra). A reverz transzkripcióhoz, illetve cDNS szintézishez 10 ȝg össz RNS-t használtunk, biotinjelölt oligo-dT25 primer (Genset) és SuperScript II (Life Technologies) alkalmazásával. A cDNS szintézis reakcióelegye: 20 ȝl totál RNS, 1 ȝl oligo-dT25-bio (700 ng/ȝl), 4 ȝl H2O (DEPC-kezelt), 8 ȝl 5 x First Strand puffer, 4 ȝl 0,1 M DTT, 2 ȝl 10 mM dNTP, 1 ȝl Superscript II (200 U/ȝl). A reakcióelegyet két órán keresztül 42°C-on inkubáltuk. A második szál szintézisekor használt reakcióelegy összetétele: 40 ȝl elsĘ szál reakcióelegy, 16 ȝl 10 x E. coli DNS ligáz puffer, 3 ȝl 10 mM dNTP, 6 ȝl 0,1 M DTT, 1,5 ȝl E. coli DNS ligáz (10 U/ȝl), 5 ȝl E. coli DNS polimeráz I (10 U/ȝl), 1,6 ȝl RNáz H (1 U/ȝl), H2O 160 ȝl végtérfogatig. A reakcióelegyet egy órán keresztül

21

Anyag és módszer

12°C-on, majd egy órán keresztül 22°C-on inkubáltuk. A cDNS-t a QIAquick spin oszloppal (Qiagen) tisztítottuk.

3.1.3. cDNS-AFLP templát elĘállítása A kettĘsszálú cDNS restrikciós emésztéséhez a BstYI és MseI restrikciós enzimeket (New England Biolabs) használtuk. Az emésztést két lépésben hajtottuk végre. Az elsĘ emésztési elegy összetétele: 20 μl cDNS, 10 U BstYI, 4 μl 10 x RL puffer, H2O 40 μl végtérfogatig. Az elegyet 60°C-on inkubáltuk két órán keresztül.

5. ábra. A cDNS-AFLP technika elve (Breyne et al. 2003).

A BstYI enzimmel történt emésztés után a 3’ biotinjelölt fragmentumokat streptavidinnel burkolt gyöngyökre (Dynal) rögzítettük, majd a nem rögzített fragmentumokat mosással eltávolítottuk. Mintánként 10 μl gyöngyöt mostunk 100 μl 2 x STEX pufferben majd 40 μl 2 x STEX pufferben szuszpendáltuk újra és hozzáadtuk a 40 μl emésztett cDNS-hez. Az elegyet szobahĘn 30 percig inkubáltuk enyhe rázatás mellett (1000 rpm). Ezt követĘen a gyöngyöket mágnessel rögzítettük és 100 μl 1 x STEX pufferrel mostuk, majd új csĘbe pipettáztuk át, és négyszer mostuk 100 μl 1 x STEX pufferrel. Mosás után a gyöngyöket 30 μl T10E0.1-ben szuszpendáltuk fel. A streptavidin gyöngyökre rögzített cDNS fragmentumokat másodszorra

22

Anyag és módszer

MseI enzimmel emésztettük. Az emésztési elegy összetétele: 30 μl gyöngy-szuszpenzió, 10 U MseI, 4 μl 10 x RL puffer, H2O 40 μl végtérfogatig. Az emésztést 2 órán keresztül 37°C-on végeztük enyhe rázatás mellett (1000 rpm). Az MseI-gyel való második emésztés után a gyöngyökrĘl felszabadult fragmentumokat használtuk templátként a további AFLP reakciókban (5. ábra).

3.1.4. Adapter ligálás és pre-amplifikáció nem szelektív primerekkel A következĘ adaptereket használtuk: BstYI-F: 5’-CTCGTAGACTGCGTAGT-3’ és BstYI-R: 5’-GATCACTACGCAGTCTAC-3’, MseI-F: 5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’ és MseI-R: 5’-TACTCAGGACTCAT-3’. A BstYI adapter mix (5 pmol/μl) összetétele: 2,5 μl a 100 μM-os BstYI-F-bĘl illetve a 100 μM-os BstYI-R-bĘl és H2O 50 μl végtérfogatig. Az MseI adapter mix (50 pmol/μl) összetétele: 25 μl a 100 μM-os MseI-F és a 100 μM-os MseI-R-bĘl. Az adapter mixet 5 percig 65°C-on inkubáltuk, majd szobahĘmersékleten hagytuk lehülni. Az adapter ligálási mix összetétele: 1 μl BstYI adapter (5 pmol), 1 μl MseI adapter (50 pmol), 1 μl 10 mM rATP (Pharmacia), 2 μl 5 x RL-puffer, 1 μl T4 DNS ligáz (5 U/1 μl) (Pharmacia), 10 U BstYI, H2O 10 μl végtérfogatig. Ezt 40 μl templát fragmentumot tartalmazó elegyhez adtuk, majd 37°C-on inkubáltuk 3 órán keresztül. Pre-amlifikációhoz 5 μl-t használtunk a T10E0.1-el kétszeresre higított adapter ligált elegybĘl. Az adaptereknek megfelelĘ primerek BstYIC+

0

és

MseI

+

0

esetében:

5’-GACTGCGTAGTGATCC-3’

és

5’-

GATGAGTCCTGAGTAAN2-3’. A preamplifikációban a szelektív nukleotid nélküli MseI primer párjaként a 3’ végen C szelektív nukleotiddal rendelkezĘ BstYI primert használtuk (5. ábra). A reakcióelegy összetétele: 5 μl kétszeresre higított adapter ligált mix, 1,5 μl BstYI + 0 primer (50 ng/μl), 1,5 μl MseI+ 0 primer (50 ng/μl), 2,0 μl 5 mM dNTP, 0,2 μl Taq DNS polimeráz (AmpliTaq, Applied Biosystems, 5U/μl), 5 μl 10 x PCR puffer, H2O 50 μl végtérfogatig. A PCR reakció körülményei: 25 x 30 másodperc 94°C, 60 másodperc 56°C, 60 másodperc 72°C. A PCR reakciókat Eppendorf Mastercycler készülékben végeztük. 3.1.5. Szelektív amplifikáció 33P izotóppal jelölt primerrel Primer jelölés Az AFLP reakcióhoz 5 ng jelölt primert használtunk. A jelölési elegy összetétele: 0,1 μl az 50 ng/μl primer törzsoldatból, 0,1 μl 33P-Ȗ-ATP (§2000 Ci/mmol; Amersham), 0,05 μl 10 x T4 puffer, 0,2 U T4 polinukleotid kináz, H2O 0,5 μl végtérfogatig. A mixet 45 percig 37°C-on inkubáltuk, majd a kinázt 10 percig 80°C-on inaktiváltuk. Szelektív PCR reakció

23

Anyag és módszer

A preamplifikáció reakciótermékét T10E0.1-el 600 x-ra hígítottuk, majd ebbĘl 5 ȝl-nyit használtunk templátként a szelektív amplifikációkban. A PCR reakció mix összetétele: 5 μl preamplifikáció termék (600 x-ra hígított ), 0,5 μl jelölt BstYIC + N-primer (10 ng/μl), 6 μl jelöletlen MseI + N-primer (5 ng/μl), 0,8 μl 5 mM dNTP, 2 μl 10 x PCR puffer, 0,6 U AmpliTaq-Gold (5 U/μl, Applied Biosystems), H2O 20 μl végtérfogatig. A reakció körülményei: 10 perc 94°C, 13 x 30 másodperc 94°C, 30 másodperc 65°C Ļ 0,7°C/ciklus, 60 másodperc 72°C, 23 x 30 másodperc 94°C, 30 másodperc 56°C, 60 másodperc 72°C. A szelektív cDNS-AFLP reakciókat 48 primerkombinációval végeztük el, mindkét primer két szelektív nukleotiddal rendelkezett a 3’ végen. A reakciótermékeket 5%-os poliakrilamid gélen választottuk el (Sequigel, Biorad). A szárított gélt Kodak Biomax filmre exponáltuk és a PhosphoImager 445 SI segítségével szkenneltük (Amersham Biosciences).

3.1.6. Az AFLP templát elkészítésekor használt pufferek összetétele 10 x RL-puffer: 100mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgAc, 500 mM KAc, 50 mM DTT, 50 ng/μl BSA 2 x STEX: 2 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM EDTA, 0.2 % Triton X-100 T10E0.1: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA (pH 8.0) 3.1.7. Az AFLP sávok jellemzése A differenciáltan expresszálódó géneknek megfelelĘ sávokat az autoradiogram alapján a gélbĘl kivágtuk, és vízben oldottuk 1 órán keresztül. A fragmentumok újrafelszaporításához 2 μl-t használtunk templátként, a szelektív reakcióban használt primerekkel. A reakcióelegy a következĘ összetevĘket tartalmazta: 2 μl templát, 1 x reakció puffer, 0,4 μl dNTP (10 mM törzsoldat), 0,8 μl MgCl (25 mM törzsoldat), 0,6 μl BstC primer, 0,6 μl Mse primer (10 μM törzsoldat), 1,1 Unit Red-Taq DNS polimeráz (Sigma). A reakció körülményei a következĘk voltak: 2 perces 94ºC-os elĘciklus után 10 másodperc 94ºC, 30 másodperc 55ºC és 30 másodperc 72ºC lépések következtek 35-ször ismételve, majd 15 perces 72ºC-on történĘ utópolimerizációval zárult. A PCR terméket 1,0%-os, EtBr-dal festett gélen futtattuk. Szekvenáláshoz a §150 bp-nál kisebb méretĦ fragmentumokat TA-klónozással a pCR2.1 plazmidba (Invitrogen) ligáltuk, majd a plazmidokkal E. coli (INVĮF’) kompetens sejteket transzformáltunk. Plazmid DNS izoláláshoz a Quantum Prep/BioRad Plazmid Miniprep Kit-et használtuk. A §150 bp-nál nagyobb fragmentumokat közvetlenül a PCR termékbĘl szekvenáltattuk. A szekvenálási reakciókat az MBK (MezĘgazdasági Biotechnológia

24

Anyag és módszer

Kutatóközpont, GödöllĘ), valamint a Genoid Kft. (Budapest) laboratóriumában végeztettük ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) készülékkel.

3.1.8. Az expressziós mintázatok kvantitatív mérése és adatelemzés A gélfotók alapján történĘ kvantitatív elemzést az AFLP-QuantarPro képfeldolgozó programmal végeztük (Keygene), amely segítségével azonosítottuk és mértük valamennyi AFLP fragmentum intenzitását. Az esetleges mintafelvételi hibákból és a PCR reakció különbözĘ hatékonyságából adódó különbségek kiküszöbölése végett a nyers adatok korrekciójához a teljes sávintenzitást használtuk. Az intenzitási értékeket soronként összegeztük valamennyi primerkombináció esetében, majd minden összegzett értéket elosztottuk a legnagyobb értékkel. Az így kapott értékek a korrekciós faktorok, ezekkel osztottuk a nyers adatokat. A javított adatsor alapján kiszámoltuk valamennyi fragmentum CV értékét (= szórás/ átlag), majd CV = 1,0 küszöbérték fölötti értékekkel rendelkezĘ TDFekkel dolgoztunk tovább. Minél nagyobb a CV érték, annál nagyobbak az expressziós szintbeli különbségek.

3.2. 5’ és 3’ RACE reakciók A teljes hosszúságú cDNS-ek izolálását a cDNS-AFLP fragmentumok szekvencia információjából kiindulva 5’ és 3’ RACE reakciókkal végeztük el. A RACE reakciókhoz a Smart RACE kit-el (BD Biosciences) használtuk, templátként mRNS-bĘl kiindulva. Az mRNS izolálást zöld és érett gyümölcsbĘl származó össz RNS-bĘl a Qiagen cég Oligotex kitjével végeztük. A reakciókban használt primereket az 2. és 3. táblázat tünteti fel.

2. táblázat. Az 5’ és 3’ RACE reakciókban felhasznált primerek TDF

5’-RACE primer (5’ĺ3’)


C11M32M003 C24M33M004 C14M13M002 C14M21M006 C24M43M007 C24M44M003 C24M33M010

GTTTTGGCCATCTGCACGCATGTA CTTGGATGAGTTTGGGAGCTGAAA CTCGGATTCTGGTTGGAACTCACT CTGGGAGAAAGAGAAGCCAAGACCAT AATGAGATTTGGGATGGTCCTGATC TGCCACAGAACATGTTGCTCAAGC AGGTGGATTGCTGGGTGCAGGAAGGT

GAAGAATATGGGTCGTGGAGTCA AGAGAAGCAGAGCTGCAGAAGTTCA CTAGTGAGATCCATCCTCCGAATAGT CAAGCTTGGGGAACTTAGGGATGCT TGTCCTTGTCTACACCGTCTTCTC GAGACAGAGGGTTCTTGCAGTAATAGA CAAGCTTGGGGAACTTAGGGATGCT

3. táblázat. Az 5’ RACE reakciókban felhasznált primerek TDF


C23M42M006 C24M14M007

AGCTCCTCTCAAGCGAATGAGTAGCT AAGGCAGGTATTCAGCAAGGTGTA

25

Anyag és módszer

3.3. A szamóca ACS, ACO és CTR1 részleges és teljes cDNS-ek izolálása Az ACS, ACO és CTR1 részleges szekvenciákat a 4. táblázatban felsorolt primerpárokkal szaporítottuk fel RT-PCR-ben. A PCR reakcióelegy összetétele: 2,5 μl cDNS, 1,5 μl forward primer, 1,5 μl reverse primer (10 μM törzsoldat), 0,8 μl dNTP mix (5 mM törzsoldat), 2,5 μl 10 x puffer, 0,25 μl Pfu polimeráz (5 U/μl, Fermentas), H2O 25 μl végtérfogatig. A reakció körülményei: 1 x 94°C 2 perc, 30 x (94°C 30 másodperc, 55°C 30 másodperc, 72°C 1 perc), 1 x 72°C 5 perc. A PCR terméket a QIAquick (Qiagen) oszloppal tisztítottuk, majd 20 percig 72°C-on inkubáltuk Taq polimeráz kíséretében az 'A' végek szintetizálása végett (inkubációs elegy összetétele: 20,3 μl tisztított PCR termék, 1 μl MgCl2 (50 mM törzsoldat), 2,5 μl 10 x puffer, 0,2 U Taq (5 U/μl)). A terméket TA-klónozással a pCR2.1 plazmidba (Invitrogen) ligáltuk, majd a plazmidokkal E. coli (INVĮF’) kompetens sejteket transzformáltuk. EzekbĘl a szekvenciákból kiindulva izoláltuk a három gén teljes hosszúságú cDNS-ét 5’ és 3’ RACE módszerrel. A reakciókban használt primerek a 4. és 5. táblázatban vannak felsorolva.

4. táblázat. Az ACS, ACO és CTR részleges cDNS-ének izolálásához RT-PCR-ben használt degenerált oligonukleotidok Gén ACS-F ACS-R ACO-F ACO-R CTR1-F CTR1-R

Primer szekvencia (5’ĺ3’)

Hivatkozás

CARATGGGNYTNGCNGARAA QMGLAEN GCRAARCANCANCKRAACCA WFRVCFA CGC(GGATCC)GCNTGYSARAANTGGGGNTT KMPVRTGV AAA(CTGCAG)NGGYTCYTTNGCYTGRAAYTT FQAKEPRF ATGGAGCAAGAITTICATGCTGAGCG MEQDFHAER ATCTCGITIAACTTCIGGTGCCATCC WMAPEVNRD

Cazonnelli et al. (1998)

Nakatsuka et al. (1998)

El-Sharkawy et al. (2003)

A primerszekvenciák alatt feltüntettük a primerek alapjául szolgáló aminosavszekvenciákat is.

5. táblázat. Az FaACO, FaACS, FaCTR1 gének teljes hosszúságú cDNS-ének felszaporításához használt 5’ és 3’ RACE primerek Gén

5’ RACE Primer szekvencia (5’ĺ3’)

3’ RACE Primer szekvencia (5’ĺ3’)

ACO ACS CTR1

CGTGTCCAGAAACACAGTGGGTAT CTAGGCTGAGTGAACACAGTGGCAGCA GGCCAGGTTTATGCAACAGCCTATACA

GATGACAAGGTCAGTGGC GCAACCGGAGCTCATGAAGATGAT GGAATCCTCCCATTGTTCATCGAGAT

26

Anyag és módszer

3.4. Genomi DNS izolálás Genomi klónok és promoterek izolálásához szükséges genomi DNS-t fiatal szamócalevélbĘl izoláltuk a Qiagen cég Plant DNeasy Mini Kit-jével.

3.5. Genomi klónok izolalása A teljes hosszúságú cDNS-ek szekvenciainformációját felhasználva a genomi klónok felszaporításához használt primereket az 5' és 3' UTR-ekre terveztük, úgy, hogy azok lehetĘleg a klónok legvégén helyezkedjenek el (6. táblázat.).

6. táblázat. FaACS, FaACO, FaNit, FaHd genomi klónok izolálásához használt primerek Gén

Forward primer (5’ĺ3’)

Reverse primer (5’ĺ3’)

FaACS

TTCAGTGCATCATCAACAAGTTCCCAA

CTCTTTGATGGGAAACTTCGATGAG

FaACO

TTGAGCCAACACTCGAGAGAAAGA

GGTAAATCACTCCCTACAGAAGTA

FaNit

TCAAGGCTCATCTTTTACACACACA

ACTAAAAGATATGAACCGTTGGCA

FaHd

TCAACATGATAGCTGCCAGATTCTCA

AGAAAACTCATACAGCATCATTGGT

FaRingH2

TCTAGTTGCCAAAATACAACTATC

GTAGACGTGTAAGATTCTTCATAA

3.6. Promoterek izolálása A promoter izolálás Michiels et al. (2003) TAIL-PCR (Thermal Asymmetric InterLaced PCR) módszerével történt. A felhasznált degenerált (AD) és génspecifikus primer szekvenciákat a 7. táblázatban tüntettük fel. A reakcióelegy összetétele és a reakciókörülményeket a 8. és 9. táblázatban részleteztük.

7. táblázat. A FaCTR1 és FaACS promotereinek izolálásakor TAIL-PCR-ben használt génspecifikus (Pro1-Pro3) és degenerált primerek (AD) FaCTR1 promoter

FaACS1 promoter

AD2 CATCGNCNGANACGAA

AD1 TGAGNAGTANCAGAGA Pro1 CTCTGGCAAGCCATGATAGTCTTGAAA

Pro1 TCCCGATCCGATTCGACGGCGGATT Pro2 CGGTACCCTCCTCCTCCCGTCTC Pro3 CCTCTGCCGTCCACCTTGGCCT

GATGGC Pro2 AAGGCAATCATCTTCATGAGCTCCGGT TGCG Pro3 GGGAACTTGTTGATGATGCACTGAATAG

27

Anyag és módszer

8. táblázat. A TAIL-PCR-ben használt reakcióelegy összetétele elsĘdleges, másodlagos és harmadlagos reakciók során Komponensek

ElsĘdleges reakció

Másodlagos reakció

Harmadlagos reakció

Templát DNS

2 μl (40-80 ng) 2,5 μl 1 μl 0,5 μl 1 μl CTR1Pro1 v. ACSPro1

2 μl az elsĘdleges reakciótermék 50 x-es higításából 2,5 μl 1 μl 0,5 μl 1 μl CTR1Pro2 v. ACSPro2

1 μl a másodlagos reakciótermék 10 x-es higításából 2,5 μl 1 μl 0,5 μl 1 μl CTR1Pro3 v. ACSPro3

10 x PCR puffer MgCl2 (50 mM) dNTP mix (10 mM) Génspecifikus primer (10 μM) Degenerált (AD) primer (10 μM) Taq DNS-polimeráz (5 U/ μl) H2O

5 μl

5 μl

0,5 μl

0,25 μl

0,25 μl

0,25 μl

25 μl végtérfogatig



9. táblázat. A TAIL-PCR reakciókörülményei (Michiels et al. 2003) Reakció

Ciklusszám

HĘmérséklet és IdĘtartam

1 5 1

95°C-5 perc 94°C-30 s, 62°C-1 perc, 72°C-2,5 perc 94°C-30 s, 25°C-rĘl - 72°C-re 3 perc alatt, 72°C-2,5 perc 94°C-20 s, 68°C-3,5 perc 94°C-20 s, 68°C-3,5 perc 94°C-30 s, 42°C-1 perc, 72°C-2,5 perc 72°C-5 perc 94°C-20 s, 68°C-3,5 perc 94°C-20 s, 68°C-3,5 perc 94°C-30 s, 42°C-1 perc, 72°C-2,5 perc 72°C-5 perc 94°C-30 s, 42°C-1 perc, 72°C-2,5 perc 72°C-5 perc

ElsĘdleges 15 1 Másodlagos

Harmadlagos

12 1 30 1

3.7. Szemi-kvantitatív RT-PCR analízis A cDNS-AFLP-vel izolált néhány gén esetében az expressziós mintázatok ismétlése és jellemzése céljából szemi-kvantitatív RT-PCR-t végeztünk. A cDNS szintézist 2,5 μg összRNS-bĘl SuperScript II reverz transzkriptázzal végeztük (Invitrogen). A reverz transzkripció elĘtt az RNS mintákat DNázzal (Promega) kezeltük. Az RT-PCR körülményei: 1 x 94°C 2 perc, N x 94°C 30 másodperc, X°C 30 másodperc, 72°C 30 másodperc és 1 x 72°C 5 percig, ahol N a ciklusok száma és X°C a primer olvadáshĘje és génenként változó (10. táblázat). A PCR

exponenciális

fázisának

tükrözéséhez

szükséges

megfelelĘ

ciklusszám

28

Anyag és módszer

meghatározásához a PCR terméket 20, 25, 27 ciklus után futtattuk meg EtBr-el festett 1,5%os agaróz gélen. A PCR reakciókat iCycler készülékben végeztük (BioRad).

10. táblázat. Szemi-kvantitatív RT-PCR-ben használt primerek, ciklusszám Gén

Forward primer (5’ĺ3’)

FaRing FaSpa FaNit FaHd FaRLK1 FaRLK2

TCTAGTTGCCAAAATACAACTATC AGAGAAGCAGAGCTGCAGAAGTTCA GAAGAATATGGGTCGTGGAGTCA GAGACAGAGGGTTCTTGCAGTAATAGA CAAGCTTGGGGAACTTAGGGATGCT GGGAGAAGGGATATGAGATTATTACTG

Reverse primer (5’ĺ3’) GTAGACGTGTAAGATTCTTCATAA CTTGGATGAGTTTGGGAGCTGAAA GTTTCCAGCTGGTCCACCAAAGAGTA TGCCACAGAACATGTTGCTCAAGC CTGGGAGAAAGAGAAGCCAAGACCAT GCCTTTGACATTGTTGGTCGTA

Ciklus szám 20 25 20 25 25 25

Kontrollként a konstitutív expressziót mutató szamóca FaGAPDH gént (AF421145) (glicerinaldehid-3-foszfát

dehidrogenáz)

használtunk

(forward

primer:

5’-

ATTAGGATCGGAATCAACGG-3’, reverse primer: 5’-GTAACCCCATTCGTTGTCGTA3’). A génspecifikus primerek és az alkalmazott PCR ciklusszám a 10. táblázatban vannak felsorolva. A reakcióelegy összetétele: 2,5 μl cDNS, 0,6 μl forward primer, 0,6 μl reverse primer (10 μM törzsoldat), 0,8 μl dNTP mix (5 mM törzsoldat), 1 μl MgCl2 (50 mM törzsoldat), 2,5 μl 10 x puffer, 0,25 μl Taq polimeráz (5 U/ μl) (Invitrogen), H2O 25 μl végtérfogatig. A reakció körülményei: 1 x 94°C 2 perc, 20 x (94°C 30 másodperc, 55°C 30 másodperc, 72°C 30 másodperc), 1 x 72°C 5 perc. 3.8. Bioinformatikai elemzés A szekvenciák homológia keresését a BLASTN és BLASTX programokkal végeztük (NCBI, National Center for Biotechnology Information). A cDNS-AFLP-ben differenciáltan experesszálódó TDF-ek csoportosítását a hierarchikus klaszter analízissel végeztük (Eisen et al. 1998). A szekvenálási eredményeket az EditSeq (DNASTAR, Inc.) programcsomaggal elemeztük. A RACE és TAIL-PCR reakciókkal kapott szekvenciákat SeqMan software-el (DNASTAR, Inc.) illesztettük össze. A fehérje összehasonlítást és kladogram készítésekor a ClustalW programot használtuk (Thompson et al. 1994). A promoterek bioinformatikai elemzésekor a PLACE (Higo et al. 1999) és PLANTCARE (Rombauts et al. 1999) programokat/adatbázisokat használtuk. A fehérjeszinten található domének azonosítását a SMART (Letunic et al. 2004) és Pfam software-ekkel (Sonnhammer et al. 1998) végeztük.

29

Anyag és módszer

3.9. Rizs protoplaszt izolálás és a FaRing-GFP, FaHd-GFP fúzió tranziens expressziója A pBI 121 vektorban (Clontech) a GUS-t GFP-vel cseréltük ki amit a 35S GFP pPCV plazmidból XbaI és SacI-el emésztettünk ki. Az új vektort pBI121GFP-nek neveztük el (6. ábra). RB

LB NOS-Pro

NPT II (Kan R)

NOS-ter

CaMV 35SPro

GFP

NOS-ter

6. ábra. A pBI121GFP vektor szerkezete

A FaHd kódoló régióját a Hdfwd: 5'-TCAACATGATAGCTGCCAGATTCTCA-3’ és Hd5RACE: 5’-TGCCACAGAACATGTTGCTCAAGC-3’ primerekkel Pfu polimerázzal (Fermentas) piros gyümölcsbĘl izolált RNS-bĘl szintetizált cDNS templáton szaporítottuk fel. A PCR terméket TA klónozással ligáltuk a pTZ57R/T plazmidba (Fermentas), majd innen az inszertet az XbaI és SalI enzimekkel hasítottuk és ligáltuk a pBI121GFP plazmidba a CaMV 35SPro után. A FaRing kódoló régióját a BamHI hasítóhelyet tartalmazó (aláhúzva) Ringfwd: 5'ATGGATCCTCTAGTTGCCAAAATACAACTA-3'

és

Ringrev:

5'-

CCAAAAGCAGGAGGTCTCCT-3' primerekkel szaporítottuk fel zöld gyümölcsbĘl izolált RNS-bĘl szintetizált cDNS-rĘl. A PCR terméket TA klónozással ligáltuk a pGEM-T Easy plazmidba (Promega), majd innen az inszertet BamHI és SalI enzimekkel hasítottuk és ligáltuk a pBI121GFP vektorba a CaMV 35Spro után. A vektorok helyes szerkezetét szekvenálással ellenĘriztük. A transzformáláshoz használt protoplasztot rizs-sejtszuszpenzióból (Oryza sativa, Taipei 309 fajta) nyertük a Jenes et al. (1992) által leírt módszerrel. Két ml-nyi sejtszuszpenzióhoz 10 ml enzim oldatot adtunk, majd 3 órán keresztül inkubáltuk szobahĘn, enyhe (30 rpm) rázatás mellett. A sejtszuszpenziót 75 μm-es, majd 35 μm steril szĦrĘn mostuk át mosó oldat felhasználásával, majd 700-800 rpm-en 5 percig centrifugáltuk. A sejteket 10 ml mosó oldatban szuszpendáltuk, majd az oldathoz 1 ml transzformációs oldatot és 20 μg-nyi plazmidot adtunk a 35S: GFP (kontroll), 35S: FaRing-GFP és a 35S: FaHd-GFP vektorokból. Az elegyet alaposan összeráztuk. Az 1 ml PEG4000 (30%) fokozatos hozzámérése után a szuszpenziót 30 percig szobahĘn inkubáltuk, majd fokozatosan mosó oldattal 10 ml-ig hígitottuk, és 700 rpm-en 5 percig centrifugáltuk, a mosást megismételtük, majd a sejteket 4 ml RY-2 táptalajban szuszpendáltuk, és 28 ºC-on sötétben inkubáltuk 48 órán át. A

30

Anyag és módszer

kiértékelést Olympus IMT-2 inverz fénymikroszkóppal végeztük, a fényképeket pedig Nikon D-100 fényképezĘgéppel készítettük.

3.9.1. A Rizs protoplaszt izolálás és a FaRing-GFP, FaHd-GFP fúzió tranziens expressziójához használt oldatok, táptalajok Enzim oldat: 100 ml oldathoz: 1 g Onozuka RS celluláz (Sigma), 0,1 g pektoliáz (Sigma), 6,50 ml glicerin, 1 g CaCl2 x 2 H2O, 0,1 g MgSO4 x 7 H2O, 0,05 g KH2PO4, pH: 5,8. Mosó oldat: 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 M KCl, 5 M glükóz, pH: 6. MaMg transzformációs oldat: 0,4 M mannit, 15 mM Mg Cl2, 0,1% MES. Az RY-2 táptalaj összetételét a 11. táblázatban soroltuk fel.

11. táblázat. RY-2 táptalaj rizs protoplaszthoz (Yamada et al. 1986) Ásványi sók

mg/l

(NH4)2SO4 KNO3 KH2PO4 CaCl2 x 2 H2O MgSO4 x 7 H2O MnSO4 x 4 H2O Fe/Na2 - EDTA KI H3BO3 ZnSO4 x H2O Na2MoO4 x H2O CuSO4 x 5 H2O CoCl2 x 6 H2O

67 1900 170 440 370 22,30 19,25 0,83 6,20 8,60 0,25 0,025 0,025

Szerves savak

Vitaminok Nikotinamid Piridoxin HCl Tiamin HCl D-Ca-pantotenát Folsav p-aminobenzoesav Biotin Kolin klorid

mg/l

1 1 10 0,5 0,2 0,01 0,005 0,5

Riboflavin Aszkorbin sav Retinol D3 vitamin B12 vitamin Egyéb kiegészítĘk Inozit 2,4-D MES Borjú szérum Glükóz

0,1 1 0,005 0,005 0,005 100 5 1 mM 8 ml/l 0,45 M

31

Eredmények és megvitatásuk

4. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK

4.1. A szamóca ACC-szintáz izolálása és expressziós mintázata

Az etilén bioszintézisében szereplĘ gének izolálásához a kiindulási alapot Cazzonelli et al. (1998) közleménye jelentette, amely az érés indukálta ACC szintáz és oxidáz cDNS-ek izolálásáról számol be a szintén nem-klimaktérikus ananászból. A Cazzonelli et al. (1998) által leírt degenerált ACS-F és ACS-R primerekkel (4. táblázat) 1200 bp-nyi fragmentumot amplifikáltunk cDNS templátról és 1300 bp-nyit genomi DNS-rĘl (7. ábra). Szemi-kvantitatív RT-PCR-el, 25 PCR ciklus után a transzkriptum zöld, Botrytis cinerea-val fertĘzött érett gyümölcsben és az inda csúcsi részében volt detektálható (7. ábra. A.). 35 PCR ciklus után a transzkriptum detektálható volt az öreg levélben és indában is (7. ábra. B.). Ļ

Ļ

A.

ĸ500 bp

ĸ500 bp

B. M

1

2 3 4 5

6 7

8

9 10 11 12 M

7. ábra. Az ACS-F és ACS-R primerpárral RT-PCR-ben felszaporított amplikonok. A.: 25 PCR ciklus, B.: 35 ciklus. 1., 2,. 3,. 4. minták: zöld, fehér, rózsaszín és érett érési stádiumban levĘ gyümölcshús, 5. és 6. Botrytis cinerea-val fertĘzött érett és túlérett gyümölcs. 7. fiatal levél, 8. öreg levél, 9. inda, 10. inda csúcsa, 11., 12. genomi DNS. M: DNS molekulatömeg marker (Fermentas, GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Plus: 3.0, 2.0, 1.5, 1.2, 1.031, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 kb). Az 1200 bp és 1300 bp fragmentumokat nyilak jelölik. A teljes hosszúságú cDNS-t zöld gyümölcsbĘl izoláltuk 5’ és 3’ RACE reakció segítségével. A 1900 bp-nyi cDNS 138 bp 5’ és 289 bp 3’ UTR által határolt 1473 bp ORFbĘl áll. Az izolált ACS gén elnevezése FaACS, hivatkozási száma a GenBankban: AY661301. Nukleotid szinten a legnagyobb homológiát (84%) az alma (Malus domestica L.) MdACS-5B (AB034993) génjével valamint a körte (Pyrus communis L.) PcACS5 (AF386523) (84%) génjével mutatta. Fehérje szinten szintén az alma MdACS5 (BAA92351) és körte PcACS génjével (AAL66205) mutatta a legnagyobb azonosságot (71%, illetve 70%). Nagyfokú homológiát (65% illetve 66%) mutat továbbá a szintén nem klimaktérikus gyümölcsök

32


csoportjába tartozó narancs (Citrus sinensis L.) ACS génjével (CAB60721), valamint a papaja (Carica papaya L.) ACC szintázzal (AAC98809). A felsorolt fajok ACC szintáz génjei valamint az általunk klónozott szamóca ACC szintáz gén által kódolt fehérjék ClustalW programmal történt összehasonlításának eredménye a 9. A. ábrán látható. A FaACS teljes hosszúságú genomi klón 2578 bp, 4 exonból és 3 intronból áll (8. és 10. ábra), más ACS génekhez hasonlóan, mint például az Le-ACS2 (paradicsom, X59139; Rottmann et al. 1991), AtACS1 (Arabidopsis; Liang et al. 1992) és MdACS1 (alma, AAA73941; Harada et al. 1997). Az intronok méreti eloszlása a paradicsom ACS2 génjében is a szamócáéhoz hasonló, az elsĘ két intron 91, illetve 84 bp, míg az utolsó 880 bp (Rottmann et al. 1991).

1. Intron 85 bp

ATG

5' UTR 138 bp

1. Exon 171 bp

2. Intron 131 bp

2. Exon 133 bp

ORF

3. Intron 463 bp

3. Exon 161 bp

4. Exon 1007 bp

1473 bp

TAG

3' UTR 289 bp

8. ábra. A FaACS genomi klón szerkezete.

A szamóca ACC-szintáz 12 aminosavból álló aktív centruma (SLSKDMGFPGFR) (Kende 1993) azonos az összehasonlított fehérjék többségében, kivéve a paradicsom ACS2 és az alma ACS1 enzimeket (9. ábra. A.). Az enzim tartalmazza az ACC szintázokra és különbözĘ aminotranszferázokra jellemzĘ 11 aminosavat (Rottmann et al. 1991), valamint a szubsztrátspecificitást biztosító glutamátot (McCarthy et al. 2001). Bár az ACC szintázok legkevésbé konzervált régiója a C-terminális vég (Kende 1993), néhány ACC szintázban azonban jelen van egy rövid, RLSF (R-arginin, L-leucin, S-szerin, Ffenilalanin) aminosavakból álló konzervált motívum (9. ábra. A.).

QMCFDLIQEWILNNPEASICTAAGVNEFKDIAIFQDYHGLPEFRNAVANFMGKVRGNRVT EMCFDLIQEWVLNNPEASICTAAGVNEFKDIAIFQDYHGLPEFRNAVTNFMGRVRGNRVT QLSFDLIQEWVLKNPEASICTAQGAKEFKDTAIFQDYHGLPEFRNAVANFMGKVRGNRVT QLCFNLIHEWLLKNPEASICTAQGAAEFRDIAIFQDYHGLAEFREAVAKFMGKVRRNRAS LLCHELVEDWLMNNPKASICSAEGLNEFKGIAIFQDYHGLPEFRNAVAKFMGKVRGNRIT QLSFEFVEKWMKNNPRASICSVEGIDEFKDIAIFQDYHGLPEFRNAVANFMGKVRGNRVK QLSFEFVEKWMKNNPQASICSVEGIDEFKDIAIFQDYHGLPEFRNAVANFMGKVRGNRVK QLSFEFVEDWIKNNPQASICSVEGLDEFKDIAIFQDYHGLPEFRNAWRILWGKVRGDRVK QLCLDLIEDWIKRNPKGSICS-EGIKSFKAIANFQDYHGLPEFRKAIAKFMEKTRGGRVR QLCFDLLESWLAKNPEAAAFKKNGESIFAELALFQDYHGLPAFKKAMVDFMAEIRGNKVT

FDADRIVMSGGATGAHEMIAFCL-ADPGDAFLVPVPYYPGFDRDLGWRTGVQLIPVACDS FDADRIVMSGGATGAHETIAFCL-ADPGDAFLVPVPYYPGFDRDLGWRTGVQLIPVACDS FNPDRIVMSGGATGAHEDDCLLLGLIPERDFWCQFLIIQDSIEDLRWRTGVQLLPVACES FDPDRIVMSGGATGAHEMIAFCL-ADPGDAFLVPTPYYPGFDRDLRWRTGVKLIPVVCES FDPDRIVMSGGATGAHETVAFCL-ADPGDAFLVPTPYYPGFDRDLRWRTGVQLVPVVCDS FDPDRVVMSGGATGAHETMAFCL-ADPGEAFLVPVPYYPGFDRDLRWRTGVEIVPVICES FDPDRVVMSGGATGAHETMAFCL-ADPGEAFLVPVPYYPGFDRDLRWRTGVEIVPVKCES FDPDRVVMSGGATGAHETVAFCL-ADPGEAFLVPVPYYPGFDRDLRWRTGVKIVPVVCNS FDPERVVMAGGATGANETIIFCL-ADPGDAFLVPSPYYPAFNRDLRWRTGVQLIPIHCES FDPNHLVLTAGATSANETFIFCL-ADPGEAVLIPTPYYPGFDRDLKWRTGVEIVPIHCTS

SNNFKVTRAALEAAYEKAQKANIRVKGLLITNPSNPLGTVLDRDTLISLVTFINEKKIHL SNNFEVTRAALEAAYEKAQKANIRVKGLLITNPSNPLGTVLDRDTLRSSVTFINEKKIHL SNNFKITRAALEDAYEKAQKANIRVKGLIITNPSNPLGTILDRETLKSLVTFINEKNIHL SNDYQITIEALEAAYETAQEADIKVKGLLIPNPSNPLGTIITKDTLEALVTFTNHKNIHL SNDFKVTMEALEAAYEKAQESNIRIKGVLITNPSNPLGTFLDRETLKDIVSFINEKNIHL SNNFKLTREALETAYEEAQKSNIKIKGLLITNPSNPLGTVYDRQTLETAVSFINEKNIHL SNNFKLTREALETAYEEAEKSNIRIKGLLITNPSNPLGTVYDRQTLETAVSFINEKNIHL SNNFKLTREALETAYEKAQESNIKIKGLLITNPSNPLGTVCDRQTLETAVAFINQKKIHL SNNFKITSKAVKEAYENAQKSNIKVKGLILTNPSNPLGTTLDKDTLKSVLSFTNQHNIHL SNGFQITETALEEAYQEAEKRNLRVKGVLVTNPSNPLGTTMTRNELYLLLSFVEDKGIHL

VCDEIYAATVFS-QPSFISIAEIIEEN--IGCNRN-----LIHIVYSLSKDMGFPGFRVG VCDEIYAATVFS-QPSFISIAEIIEEN--IGCNRN-----LIHIVYSLSKDMGFPGFRVG VCDEIYAATVFT-QPRFISIAEILEEED-VVCNRD-----LVHIVYSLSKDMGFPGFRVR VCDEIYAATVFS-QPEFTSIAEIIEEDK-ICCNRD-----LIHIIYSLSKDMGFPGFRVG VCDEIYAATVFTKEPSFVSIAEIIDQD--IACNRN-----LIHIVYSLSKDMGFPGFRVG VCDEIYAATVFA-EPGFISISEVIDNS-DIECDRN-----LVHVVYSLSKDMGFPGFRVG

MdACS5 PcACS5 FaACS CpACS CsACS Cs-ACS2 Me-ACS2 Cm-ACS3 Le-ACS2 MdACS1


MdACS5 PcACS5 FaACS CpACS CsACS Cs-ACS2

MGFTLSN----QQQLLSKIATGNGHGENSPYFDGWKAYDSDPFHPTKNPNGVIQMGLAEN MGFTLSN----QQQLLSKMATGDGHGENSPYFDGWKAYDSDPFHPTKNPNGVIQMGLREN MGFTLSN----QQQLLSKIATGTGDSENTPYFDGWKAFDSDPYHPTTNPQGVIQMGLAEN MVLMLRN----QE-LLSKIATSNGHGEDSPYFDGWKAYDSDPFHPTQNPEGVIQMGLAEN MAFALSN----QVQLLSKIAAGNGHGEDSPYFDGWKAFESDPYHPTKNPNGVIQMGLAEN MVLVSSNDNGNAKKVLSKLAKGNGHGEDSSYFDGWKAYDSDPFHPIINPRGVIQMGLAEN MVLVSSNDNGNAKKVLSKLAKGNGHGEDSSYFDGWKAYDSDPFHPIINPRGVIQMGLAEN MVLVSSN----ANNLLSKLAKGNGHGEDSPYFDGWKAYDTDPFHPIMNPRGVIQMGLAEN MGFEIAK----TNSILSKLATNEEHGENSPYFDGWKAYDSDPFHPLKNPNGVIQMGLAEN ------------MRMLSRNATFNSHGQDSSYFLGWQEYEKNPYHEVHNTNGIIQMGLAEN



A.

33

FTMGLAQVSTNCLK-SNGGLFVWMDLRRLLKEQTFEAEMVLWRTIIHEVKLNVSPGSSFH FTMELAQVGTSCLK-SNGGLFVWMDLRRLLKEQTFEAEMELWRTIIHEVKLNVSPGSSFH FTEGLEEQGTTCLK-SNGGLFVWMDLHKHLKEQTFEAEMALWRTIINIVKLNVSPGVSFH FTQRLAQVGINCLK-SNAGLFVWMDLRRLLKEQTFEAEMVLWRVIINEIKLNVSPGSSFH FTWGLSQVGIGCLK-SNAGLFLWMDLHHLLKEQTYEAEMALWRVIINEVKLNVSPGSSFH FTKGLAQVGIGYLK-GSGGLFLWMDLRHLLKEKTLEAEMALWKVIINEVKLNVSPGSSFH FTKGLAQVGIGYLK-GSGGLFLWMDLRHLLKEKTLEAEMALWKVIINEVKLNVSPGSSFH FTRGLAQVGIGYLR-GSGGLFLWMDLRHLLTEKTLEAEMALWRVIINDVKAECVAGVVFP FTNGLEVVGIKCLK-NNAGLFCWMDLRPLLRESTFDSEMSLWRVIINDVKLNVSPGSSFE LVSGLQKSGISCLN-GNAGLFCWVDMRHLLRSNTFEAEMELWKKIVYEVHLNISPGSSCH CP-EPGWFRVCFANMDDKTMEVALTRIRTFVLQNKEAIVP--RKSNRLWHSN-LRLSFQS CP-EPGWFRVCFANMDDKTMEVALTRIRTFVLQDKEAIVP--RKSNRLWKAT-LGSAFQS CP-QPGWFRVCFANMDAQPMEVALERIRNFVLQDKEAAVVAMKKKKNCWQSKKLSLSFNH CS-EPGWFRVCFANMDDKTMEIALSRIKTFMLQHKEAMVP---KKKLCWQTS-LRLSFSS CP-NPGWFRVCFANMDDRTMEIALSRITSFMLKNVEAKVP--NKKKLCWQRS-LRLSMSS CS-EPGWFRVCFANMDDNTMDISITRIRNFVLQNKEVTTK-VKKQKFCWRQSSLELRLSS CS-EPGWFRVCFANMDDSTMDISITRIRNFVLQNKEVTTK-VKKQKFCWRQSSLELRLSS LLGSPGWFRVCFANMDDNTMEISITRIRNFVLQNKEVTTK-IKKQKFCWRQSSLELRLSS CQ-EPGWFRVCFANMDDGTVDIALARIRRFVGVEKSGDKSSSMEQKQQWKKNNLRLSFSK CT-EPGWFRVCFANLPERTLDLAMQRLKAFVGEYYNVPEVNGGSQSSHLSHS-RRQSLTK RRMDDTMMSPCMMSPHTPIPQSPLVRATRRMDDNMMSPCMMSPHTPIPQSPLVRATRRFDEVNMS-----PHSPIPQSPLVRATRYEDIMETPGSFMSPHSPIPQSPLVRART RRMDDFMAS------PCMSPQSPLVQART RRLEDIMSP------HSPLPQSPMHRATT RRLEDIMSP------HSPLPQSPMLRATT RRLEDIMSP------HSPLPQSPMLRATT RMYDESVLSP----LSSPIPPSPLVR--WVSRLSFDD------RGPIPGR

MdACS5 PcACS5 FaACS CpACS CsACS Cs-ACS2 Me-ACS2 Cm-ACS3 Le-ACS2 MdACS1 MdACS5 PcACS5 FaACS CpACS CsACS Cs-ACS2 Me-ACS2 Cm-ACS3 Le-ACS2 MdACS1

-IVYSYNDAVVNC-ARKMS-SFGLVSTQTQHLIASMLSDNEFVKRFIAQSAKRLKTRHMR -IVYSYNDAVVNC-ARKMS-SFGLVSTQTQHLIASMLSDNEFVERFIAQSAKRLKTRHMR NTRTHYNDAVSGLRAEKMSRSSGWVSTQTQCLIASMLSDNEFVDRFIVESAKRLEARHTK -IVYSYNDAVVSC-ARKMS-SFGLVSSQTQYLIASMLADDEFVDQFIVESRKRLAMRHSF -IIYSYNDQVVSC-ARKMS-SFGLVSSQTQHLIATMLSDDQFVEKFIAESAKRIAERHKA -IIYSYNDAVVAC-ARKMS-SFGLVSSQTQYLIASMLLDDVFVDNFLAGSAEKLAARHRN -IIYSYNDAVVAC-ARKMS-SFGLVSSQTQYLIASMLSDDVFVDNFLAGSAEKLAVRHRN -IIYSYNDAVVNC-ARKMS-SFGLVSSQTQHLIASMLSDDEFVESFLVGSAKKLAARHRN -IIYSFNDDVVNC-ARKMS-SFGLVSTQTQYFLAAMLSDEKFVDNFLRESAMRLGKRHKH -AIYSNDDMVVAA-ATKMS-SFGLVSSQTQHLLSAMLSDKKLTKNYIAENHKRLKQRQKK

MdACS5 PcACS5 FaACS CpACS CsACS Cs-ACS2 Me-ACS2 Cm-ACS3 Le-ACS2 MdACS1 MdACS5 PcACS5 FaACS CpACS CsACS Cs-ACS2 Me-ACS2 Cm-ACS3 Le-ACS2 MdACS1

VCDEIYAATVFA-EPGFISISEVIDNMNDVECDRN-----LIHVVYSLSKDMGFPGFRVG VCDEIYAATVFT-EPGFISISEVIEND--TKCDKN-----LIHVVYSLSKDMGFPGFRVG VCDEIYAATVFD-TPQFVSIAEILDEQEMTYCNKD-----LVHIVYSLSKDMGLPGFRVG ISDEIYSGTAFS-SPSFISVMEVLKDR---NCDENSEVWQRVHVVYSLSKDLGLPGFRVG

Me-ACS2 Cm-ACS3 Le-ACS2 MdACS1


34


B.

9. ábra. A FaACS (Fragaria x ananassa, AAT77723), MdACS5 (Malus domestica, AAA73941 és AB034993), PcACS5 (Pyrus communis, AF386523), CpACS (Carica papaya, U68216), CsACS (Citrus sinensis, AJ012551), Cm-ACS3 (Cucurbita maxima, AB038559), Cs-ACS2 (Cucumis sativus, BAA33375), Me-ACS2 (Cucumis melo D37937), Le-ACS2 és LE-ACS7 (Lycopersicon esculentum, AAP96918 és AAC32317), AtACS6 (Arabidopsis thaliana, NP_192867) és Pe-ACS1 (Populus euphratica, AB033502) aminosavszekvenciák összehasonlítása a ClustalW programmal. A.: Fehérje összehasonlítás. A konzervált aminosavakat keret jelzi. Az aktív centrumot (Kende 1993) a fekete négyzet jelzi, a 11, szürke háttérben levĘ aminosav az ACC szintázok és különbözĘ aminotranszferázokra jellemzĘ aminosav (Rottmann et al. 1991). A csillaggal jelölt glutamátnak (E) a szubsztrátspecificitásban van szerepe (McCarthy et al. 2001) B.: A rokonsági viszonyt ábrázoló kladogram. A C terminális vég és az ETO1/ EOL fehérjék megkötĘképessége alapján az ACC szintázok három csoportba sorolhatók (Yoshida et al. 2005): 1. az RLSF konszenzus szekvencia után 23-27 aminosavból álló szekvencia található (LeACS2, FaACS, stb.), 2. az RLSF elĘtt WVF konszenzus szekvenciát tartalmazó és az RLSF után rövid (5-8 aminosav), argininben, aszparaginsavban vagy glutaminsavban gazdag aminosavszekvenciával rendelkezĘ enzimek (AtACS5), és 3. RLSF szekvenciát nem tartalmazó izoenzimek (MdACS1). A 2. csoportba tartozó ACC szintázok poszttranszlációs szabályozásában az ETO1 játszik közre (in vitro körülmények közt az ETO1 gátolja az ACS5 aktivitását). A FaACS az elsĘ csoportba sorolható, tehát valószínĦleg posztranszlációs szabályozásában az ETO1 nem vesz részt. A kladogram alapján a FaACS egy klaszterben helyezkedik el a Rosaceae család többi ACS

génjeivel

(MdACS5,

PcACS5),

bár

ezek

a

fajok

gyümölcsérést

tekintve

klimaktérikusak, és távolabb helyezkedik el a szamócához hasonló nem-klimaktérikus fajok ACS génjétĘl. A szamóca FaACS génnel mind nukleotid mind fehérje szinten legnagyobb homológiát mutató alma ACS-5B és ACS-5B géneket (Sunako et al. 2000) levélbĘl izolálták és expressziójuk sebzés hatására indukálódik. A FaACS-el szintén nagy homológiát mutató körte

35


PcACS5 gént gyümölcsbĘl izolálták, de expressziójának szabályozásáról nincs adat (ElSharkawy et al. 2004). A kladogramban a szamóca génhez közelebb helyezkedik el a citrom ACS génje, és távolabb az aktív centrumban is különbséget mutató szintén Rosaceae családba tartozó MdACS valamint a paradicsom LeACS2 génje, amelyek a gyümölcsérés során etilén hatására indukálódnak (Lay-Yee és Knighton, 1995, Barry et al. 2000). A kladogram tehát viszonylag jól tükrözi a fajok rokonsági viszonya mellett, a különbözĘ ACS izoformák fiziológiai szerepe közti hasonlóságot is (9. ábra).

4.1.1. A FaACS promoterének izolálása, bioinformatikai elemzése A TAIL-PCR-el felszaporított FaACS promoter régió hossza 889 bp (10. ábra). A PLANTCARE és PLACE adatbázisok (Rombauts et al. 1999, Higo et al. 1999) segítségével azonosított szabályozó elemek közül említésre méltó a cirkadián ritmus szabályozásában szerepet játszó elem (CAANNNNATC) két formája (CAAATCCATC és CAATTGCATC), amelyet elĘször a paradicsom klorofill a/b-kötĘ fehérjék promoterében azonosítottak, és a cirkadián szabályozásában vesz részt (Piechulla et al. 1998). Arabidopsis-ban több ACC szintáz gén mĦködése, illetve az etilén emissziónak fény-függĘ, cirkadián szabályozása ismert (Thain et al. 2004), bár a folyamat biológiai jelentĘsége még nincs feltárva. Jelen vannak különbözĘ stresszválaszért felelĘs szabályozó elemek, a CAACTG motívum két példánya például szárazság indukálhatóságért felelĘs MYB transzkripciós faktor kötĘhely (Abe et al. 2003). A TTTGACT szekvencia elicitor válaszreakcióért felelĘs, a WRKY gének promoterében azonosították, ezek a transzkripciós faktorok a korai védekezési válaszban résztvevĘ gének mĦködését szabályozzák (Eulgem et al. 1999). A TGTCTC motívum auxinválaszért felelĘs, a korai auxinválasz génjeinek promoterében ARF1 (auxin response factor) kötĘ helyként azonosították (Ulmasov et al. 1999). Az ACGT szekvencia etioláláskor indukálja a génexpressziót, az Arabidopsis erd1 (early responsive to dehydration) gén promoterében mutatták ki (Simpson et al. 2003). Az ACCGAGA és ACCGAC abszcizinsav és szárazságstressz válaszért felelĘsek (Busk et al. 1997). Hasonló szabályozó elemek azonosítása céljából a FaACS promoterét az AtACS2, AtACS6 és LeACS7 gének promotereivel hasonlítottuk össze (16. ábra). Összehasonlításunkat korlátozta a különbözĘ ACS gének promotereire vonatkozó kevés szekvenciainformáció. A nem utóérĘ gyümölcsök etilén bioszintézisben résztvevĘ gének promotereirĘl semmiféle adattal nem rendelkezünk, utóérĘ gyümölcsöknél a paradicsomban ismert néhány ACS gén promotere. Adott viszont az Arabidopsis valamennyi ACS gén promoterszekvenciája és némelyik funkcionális jellemzése (Rodrigues-Pousada et al. 1993, Wang et al. 2005).

36


Cactagtgattatcgagtatggagttaaaaaaaaaaaatgtatattatgtttttctttttttgatatatgtatttttgttcaatcaagcccaccgactccctgac caattctgcatcttctttttgtttatacatgattacgtctttattcttcagttcctcagttcatattccgctcttcctcctagtttctcctccttaaatctcaaaaaatc caaatttttggggaaaattttgttgggttttcaattttgtctctaattttcagaattttcttctactttcattgatgcctactttgttttgaatacttattaacgtctact tgagctcttacattttgtatggttgtatctgaaattttttttgcctccggctaaatttgaagcccaccccatatcgaaatctaagatccgccactggtgctattt gagatcgttggttcaaatccatcgaagactctcgatgatgtccgcatttttcattcatcattagagaattgtccgtgtaatttgtgagttgtgaccgtgtacc tagctaactcgttttggttacaaacttcacttggatggtttgactgaattgagactattatgacagttaaggttaccttcaataatgccttggccttgcatgaa gggaaagagaccatgaaacagcgaatccccaactggcttagaatttacttagtttaacactgattgaaaatcaaggcacaaaccaactgccaccgag attttcaaaatcaaagtcgcaacaattgcatcttcatggaaacttccccagaaattcaagaacaaaaagtcctacgcttattttaattatcagagccatctg aacagaacctcatccctaacatctataaataacattcaggaagttgtattctcatccaactacaaaactattcagtgcatcatcaacaagttcccaaag ca ACS PRO3 cttgaccatttagctagctcctctttccccttctttgtagaattctcattgcactaaaggttagatctttgaggcacattacaagaacaATGGG ATTCACTTTGAGCAACCAACAGCAACTGTTGTCTAAGATAGCAACCGGTACCGGAGACAGCGAAA ACACTCCATATTTTGATGGCTGGAAGGCCTTTGATAGTGATCCTTACCATCCCACCACCAACCCTCA AGGGGTTATTCAGATGGGTCTTGCAGAAAATCAAgtaagaaatttgaaaccagaaaccttgtattacaagcaacatatcatctcttgg cttttcactaattggtttcttctgtatgcagCTTTCTTTTGATTTGATCCAAGAATGGGTTCTGAAAAACCCAGAAGCCT CCATTTGCACAGCACAAGGAGCAAAAGAATTCAAGGACACAGCCATCTTTCAAGACTATCATG ACS PRO2 ACS PRO1 GCTTGCCAGAGTTCAGAAATGtatgcattgatcaacatccataaaactttcttagcatcacttgtttaactcactacacaatcttaacgaaataacttt agtccaatattaatttaacaaaatttaattattttctttgaaacttccacaggCTGTTGCAAATTTCATGGGAAAAGTGAGAGGAAATC GAGTCACATTCAACCCTGACCGCATTGTTATGAGCGGAGGCGCAACCGGAGCTCATGaAGATGATT GCCTTTTGCTTGGCTtGATCCCGGAGAGGGATTTCTGGTGCCAGTTCCTTATTATCCAGGgctaagctagct gattaagtttatctttctaagattgactttgatccaactaagacaggaaaaactaaactaattgaggccagttgcctaaaattatatgagaaattagcaatatgaaagaga ctgagttgacccttagtttaatgccatccctatgtgtccttggaccagcttgaattattgacgggggaatgaaaacgatctttgtatactaattgccatcatctacctcttttg acaaagatgaaagatgcctcaggaaaattaggaccatttgtgacttgttcatctaaaacgacattacgtacgtaacttcatatagtagctagctaactgcaccaaatacg tccctagttctcgacgaaggattccatgcttagtagtagaatagaatttattcataaccgttgatatattttccatgggttgctttgctaaataagtttttgtacttcattgcaaa ATTCGATAGaAGATTTGAGATGGCGAACTGGGGTACAGCTTCTTCCAGTAGCTTGTGAAAGCTCAA ACAATTTCAAGATCACGAGAGCAGCCTTGGAAGATGCCTATGAGAAAGCACAAAAGGCCAACATC AGAGTTAAAGGCTTGATCATTACCAACCCCTCAAACCCACTAGGCACAATCCTAGACAGAGAGACT CTTAAGAGCTTAGtGaCTTTCATCaATGAGAAGAACATCCACCTAGTCTGTGATGAGATCTATGCTGC CACTGTGTTCACTCAGCCTAGGTTCATCAGCATTGCTGAAATACTGGAGGAAGAAGATGTAGTATG CAACCGCGACCTGGTTCACATTGTCTACAGTCTTTCCAAAGACATGGGGTTCCCTGGCTTTAG GG S L S K D M G F P G F R TAAGGAATACGCGCACTCATTACAATGATGCCGTAAGTGGACTGCGCGCCGAAAAGATGTCGAGG TCTTCGGGTTGGGTTTCTACGCAAACTCAGTGTCTAATTGCATCCATGCTATCAGACAATGAGTTTG TGGATAGATTCATTGTAGAAAGTGCTAAGAGGTTGGAAGCAAGGCACACAAAATTCACTGAGGGA CTTGAGGAACAAGGTACTACTTGTTTGAAGAGCAATGGTGGCTTGTTTGTGTGGATGGACTTGCAC AAACATCTAAAGGAGCAGACTTTTGAAGCAGAAATGGCATTGTGGAGAACCATAATCAATATAGT TAAGCTCAATGTGTCACCTGGTGTTTCTTTTCATTGCCCCCAACCAGGTTGGTTCAGGGTTTGCTTTG CCAACATGGATGCCCAGCCCATGGAAGTTGCTTTGGAAAGAATCAGAAACTTTGTGCTTCAAGACA AGGAGGCAGCTGTGGTCGCAATGAAGAAGAAGAAGAACTGCTGGCAAAGTAAGAAGCTGAGTCTC AGCTTCAATCATCGAAGATTCGATGAGGTCAACATGTCACCGCATTCCCCTATTCCTCAGTCACCTC TTGTTCGAGCCACTTAGagaagtgatgatcatctccatttagttatgcagctagaatcattgatactcatgttttctcttaattagttcctatatttcaatactc taggttaattgttagctaaaataacacaaaaaagaactaagactaggtatgccccctaattggaagctagtcaatacatgcaatgttttcttacctgcagattgcaggtttt tttctttttccgattcagtggaatagtttgtcttagtttgtaatgatttctcatcgaagtttcccatcaaagagttttgagtgctttcaaaaaaaaaaa

10. ábra. A FaACS nukleotid szekvenciája. A feltétlelezett TATA box és poliadenilációs szignál szekvenciák két vonallal vannak aláhúzva. A transzlációs start és stop kodonokat szürke háttér jelöli. Az aktív centrumot alkotó dodekapeptid a megfelelĘ nukleotidszekvencia alatt van feltüntetve. Az ábrán vastag betĦvel jelöltük a TAIL-PCR reakcióban a promoter izoláláshoz használt primereket (ACS PRO1 és ACS PRO3, komplementer szál). A nem kódoló szekvenciákat (5' és 3' UTR, intronok) kisbetĦvel írtuk. A promoterben azonosított cisz elemeket aláhúztuk.

37


Arabidopsis ACS gének közül nukleotid és fehérje szinten a szamóca génnel a legnagyobb homológiát az AtACS2 (At1G01480) és AtACS6 (At1G011280) gének mutatják, összehasonlításunkba emiatt kerültek be ezeknek a géneknek a promoterei, az AtACS2 promotert funkcionálisan is vizsgálták (Rodrigues-Pousada et al. 1993). Az LE-ACS7 (AF043122) expressziójáról bizonyították, hogy levélben sebzés és elárasztás hatására indukálódik (Shiu et al. 1998). Mind a négy promoterben jelen van a sebzési (vagy elicitor), anaerob stressz válaszreakcióért felelĘs, valamint a dehidratáció és sötétség indukálta szeneszcencia folyamatának szabályozásáért felelĘs elemek. Az auxinválaszért felelĘs elem az AtACS6-ban fordul elĘ, míg a szárazság stresszben szerepet játszó szekvencia az AtACS6 mellett az LeACS7 promoterében is fellelhetĘ. A fényindukálhatóságért felelĘs motívum (TTTCAAA) a szamóca, AtACS2 és LeACS7 promoterekben van jelen. Az AtACS2 promoter funkcionális elemzése szerint is a fény befolyásolja az AtACS2 expresszióját, indukálva azt (Rodrigues-Pousada et al. 1993).

4.2. A szamóca ACC-oxidáz izolálása és expressziós mintázata Az ACO gén izolálása céljából RT-PCR reakcióban az ACO-F és ACO-R (Nakatsuka et al. 1998) degenerált primerpárt használtuk (4. táblázat). Valamennyi vizsgált mintában felszaporított fragmentum 830 bp méretĦ (11. ábra). Genomiális DNS-t használva templátként a felszaporított fragmentum 1200 bp méretĦ (11. ábra. B). Szemi-kvantitatív RT-PCR-ben, 25 PCR ciklus után a transzkriptum akkumulációja érés specifikus volt, és a gén indukálódott Botrytis cinerea fertĘzött érett gyümölcsben is (túlérett, fertĘzött gyümölcsben kevésbe volt detektálható 25 ciklus után, valószínĦleg a transzkripció gátlása vagy az RNS gyengébb minĘsége miatt) (11. ábra. A). 35 PCR ciklus után a transzkriptum valamennyi mintában (zöld, fehér, rózsaszín, piros érési stádiumban levĘ gyümölcshús, Botrytis cinerea-val fertĘzött érett és túlérett gyümölcshús, fiatal levél, öreg levél, inda, inda csúcsa) jelen volt (11. ábra. B). Az érett gyümölcsbĘl felszaporított fragmentumot megszekvenáltuk, majd 5’ és 3’ RACE reakció segítségével sikerült a teljes cDNS-t felszaporítani. A teljes cDNS hossza 1235 bp, ebbĘl 963 bp az ORF, 71 bp az 5’ UTR és 201 bp a 3’ UTR. A szekvencia génbanki összehasonlítása alapján nukleotid szinten a FaACO (AY706156) a legnagyobb homológiát (85%) az alma (Malus domestica L.) ACO génjével (AB086888) valamint a homoki körte (Pyrus pyrifolia L.) PPAOX3 (AB042107) (84%) génjével adja. Fehérje szinten az Ęszibarack

38


(Prunus persica L., CAA54449) és kajszibarack (Prunus armeniaca L., AAC33524) ACO génjével 81%, míg az alma ACO génjével 80% homológiát mutat. A. ĸ500 bp

B. ĸ500 bp

M

1

2

3 4

5 6

7 8 9

10 11 12 M

11. ábra. Az ACO-F és ACO-R primerpárral RT-PCR-el felszaporított fragmentumok. A.: 25 PCR ciklus, B.: 35 PCR ciklus 1., 2,. 3,. 4. minták: zöld, fehér, rózsaszín, piros érési stádiumban levĘ gyümölcshús, 5. és 6. Botrytis cinerea-val fertĘzött érett és túlérett gyümölcshús, 7. fiatal levél, 8. öreg levél, 9. inda, 10. inda csúcsa, 11., 12. genomi DNS, M: DNS molekulasúly marker (Fermentas, GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Plus: 3.0, 2.0, 1.5, 1.2, 1.031, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 kb). A 830 bp és 1200 bp méretĦ fragmentumokat nyilak jelölik. Bár fehérjeszinten a szamóca és más fajok ACC oxidáza közti homológia nagy, a gének szerkezete különbözĘ. A két intronból és három exonból álló genomi klón (12. ábra) szerkezete eltér az adatbázisokban talált teljes hosszúságú ACO genomi klónokétól. A paradicsom LeACO1 (X58273), a lóhere TrACO1 (DQ112347), petúnia PETACO3 (L21978), gének például három intront tartalmaznak, amelyek pozíciója hasonló, méreteik viszont eltérĘek. A FaACO-ban az elsĘ intron pozíciója azonos a fent említett gének elsĘ intronjával, a második intron megfelelĘje hiányzik a FaACO-ból, a harmadik intron helye szintén hasonló.

5'UTR71 bp

ATG

ORF

1. Exon 105 bp

3'UTR201 bp

963 bp

2. Exon 562 bp

1. Intron 93 bp

12. ábra. A FaACO genomi klón szerkezete.

3. Exon 293 bp 2. Intron 209 bp

TAA

39


A. FaACO FaACO1 PaACO PAO1 MdACO2 CsACO FsACO1 LeACO1 FaACO2 CpACO

MENFPVINMEKLNGEERNATMETIKDACENWGFFELVNHGIPTVFLDTVEKMTKDHYKNC ----------------------------------ELVSHGIPTEFLDTVEKMTKDHYKNC MENFPIINLEGLNGEGRKATMEKIKDACENWGFFELVSHGIPTEFLDTVERLTKEHYRQC MENFPIINLEGLNGEGRKATMEKIKDACENWGFFELVSHGIPTEFLDTVERLTKEHYRQC MENFPVINLESLNGEGRKATMEKIKDACENWGFFELVSHGIPTEFLDTVERLTKEHYKQC MENFPVISLENINGAERAAILEKINEACEKWGFFELVNHGIEPEFMDTVERLTKAHYRKC MENFPVINLEKLNGEERGTTMEKIKDACENWGFFELVNHGLPHELLDTVERLAKEHYKKC MENFPIINLEKLNGDERANTMEMIKDACENWGFFELVNHGIPHEVMDTVEKMTKGHYKKC ----------------------------------ELVSHGISHELMDKVEKLTKEHYRKC MENFPVIDLSKLNGEERASTMELIHDACENWGFFELVNHGISHDLMDTVERLTKEHYKKC 1. box LEQRFKEPVASKGLNAVNTEVNDMDWESTFYLKHLPRSNISEVPDLDEEYRKVMKDFALK LEQRFKELVASKGLNAVNTEVNDMDWESTFYLKHLPRSNISEVPDLDEEYRKVMKEFALK LEQRFKELVASKGLEAVKTEVNDMDWESTFYLRHLPKSNISEVPDLEDQYRNVMKEFALK LEQRFKELVASKGLEAVKTEVNDMDWESTFYLRHLPKSNISEVPDLEDQYRNVMKEFALK LEQRFKELVASKGLEGVQTEVKDMDWESTFHLRHLPQSNISEVPDLKDEYRNVMKEFALK MEQRFKELVASRALEGIQTEVNDMDWESTFYVRHLPQSTINEVPDLDEEYRKVMKEFALK MEQRFKELVTAQGLEGVQTEVNDLDWESTFHVRHLPQSNISEIPDLEDEYRKVMKEFALK MEQRFKELVASKGLEAVQAEVTDLDWESTFFLRHLPTSNISQVPDLDEEYREVMRDFAKR MEQRFKEMVASKGLEAVNSEIEDLDWESTFFLRHLPFSNISQVPDLDEDYREAMKEFAVE MEQRFKEMVESNGLEAVQSEINDMDWESTFFLRHLPASNMHEIPDLEDDYRKAMKEFAVG

60 26 60 60 60 60 60 60 26 60

179 145 178 178 178 178 178 178 144 178

FaACO FaACO1 PaACO PAO1 MdACO2 CsACO FsACO1 LeACO1 FaACO2 CpACO

LEKLAEELLDLFCENLGLEEGYLKKAFY-GSQGSPTFGTKVSNYPPCPTPDLIKGLRSHT LEKLAEELLDLFCENLGLEKGYLKKAFY-GSQGSPTFGTKVSNYPPCPTPDLIKGLRSHT LEKLAEQLLDLLCENLGLEQGYLKKAFY-GTNG-PTFGTKVSNYPPCPNPELIKGLRAHT LEKLAEQLLDLLCENLGLEQGYLKKAFY-GTNG-PTFGTKVSNYPPCPNPELIKGLRAHT LEKLAEQLLDLLCENLGLEQGYLKKAFY-GTKG-PTFGTKVSNYPPCPNPDLIKGLRAHT LEKLAEELLDLLCENLGIEKGYLKKVFH-GANG-PTFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHT LEKLAEELLDLLCENLGLEKGYLKKAFH-GSKG-PNFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHT LEKLAEELLDLLCENLGLEKGYLKNAFY-GSKG-PNFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHT LEKLAEQLLDLLCENLGLEKGYLKKAFY-GSKG-PNFGTKVSNYPPCPKPDLVKGLRAHT LQKLAEQMLDLLCENLGLEKGYLKKVFY-GSKG-PNFGTKVRNYPPCPKPDLIKGLRAHT 2. box DAGGDILLFQDDKVSGLQLLKDGEWIDVPPMRHSIVINLGDQLEVITNGKYKSVEHRVIA DAGGVILLFQDDKVSGLQLLKDGEWIDVPPMRHSIVINLGDQLEVITNGKYKSVEHRVIA DAGGLILLFQDDKVSGLQLLKDGQWIDVPPMRHSIVINLGDQLEVITNGKYKSVEHRVIA DAGGLILLFQDDKVSGLQLLKDGQWIDVPPMRHSIVINLGDQLEVITNGKYKSVEHRVIA DAGGLILLFQDDKVSGLQLLKDGEWVDVPPMRHSIVINLGDQLEVITNGKYKSVEHRVIA DAGGIILLFQDDKVSGLQLLKDGQWIDVPPLRHSIVVNLGDQIEVITNGKYKSVEHRVVS DAGGIILLFQDDKVSGLQLLKDGQWIDVPPMRHSIVINLGDQLEVITNGKYKSVLHRVIA DAGGIILLFQDDKVSGLQLLKDEQWIDVPPMRHSIVVNLGDQLEVITNGKYKSVLHRVIA DAGGVILLFQDDKV---------------------------------------------DAGGIILVFQDDKVSGLQLLKDDQWVDVPPMKHSIVINLGDQLEVITNGKYKSVMHRVIA 3. box QTDG-TRMSIASFYNPGSDAVIYPAPSLVETETEEKNQVYPKFVFDDYMKLYAVLKFQAK QTDG-TRMSIASFYNPGSDAVIYPAPSLVETETEEKNQVYPKFVFDDYMKP--------QTDG-TRMSIASFYNPGSDAVIYPAPTLVEKEAEEKNQVYPKFVFEDYMKLYAGLKFQPK QTDG-TRMSIASFYNPGSDAVIYPAPTLVEKEAEEKNQVYPKFVFEDYMKLYAGLKFQPK QTDG-TRMSIASFYNPGSDAVIYPAPTLVEKEAEEKNQVYPKSVFEDYMKLYAGVKFEAK QTDGEGRMSLASFYNPGSDAVIYPAPALLEKEAEKK-QVYPKFVFEDYMKLYVPLKFQAK QTNG-NRMSIASFYNPGGDAVIYPATALVEKEAEEKNNVYPKFVFEDYMKLYAGLKFQAK QTDG-TRMSLASFYNPGSDAVIYPAKTLVEKEAEESTQVYPKFVFDDYMKLYAGLKFQAK -----------------------------------------------------------QTDG-NRMSLASFYNPGDDAVIYPAPSLVEKEAEK-NQIYPKFVFDDYMKLYVGLKFQAK

FaACO FaACO1 PaACO PAO1 MdACO2 CsACO FsACO1 LeACO1 FaACO2 CpACO MaACO

EPRFEAMKTVEANPSLAA---IATA ------------------------EPRFEAMKAVETNISLGP---IATA EPRFEAMKAVETNISLGP---IATA EPRFEAMKAVEIKASFGLGPVISTA EPRFEAMKAVETNVNLGP---IATA EPRFEAMKAVESNVTVGP---IATA EPRFEAMKAMESDPIASA------------------------------EPRFEAMKAMESTVTPGAIATV--EPRFEAMKAMEA-VATHP---IATS

FaACO FaACO1 PaACO PAO1 MdACO2 CsACO FsACO1 LeACO1 FaACO2 CpACO FaACO FaACO1 PaACO PAO1 MdACO2 CsACO FsACO1 LeACO1 FaACO2 CpACO FaACO FaACO1 PaACO PAO1 MdACO2 CsACO FsACO1 LeACO1 FaACO2 CpACO

320 319 319 322 319 319 315 318 318

120 86 120 120 120 120 120 120 86 120

239 205 238 238 238 238 238 238 158 238 298 255 297 297 297 297 297 297 296

40


B.

13. ábra. A FaACO (AAU10090) és néhány ACC oxidáz fehérjeszintĦ összehasonlítása: FaACO1 és FaACO2 (Fragaria x ananassa, CAH65482, CAH65483), MdACO2 (Malus domestica, BAC53656), PaACO (Prunus armeniaca, AAC33524), PAO1 (Prunus persica, CAA54449), CpACO (Carica papaya, AAF64528), LeACO1 (Lycopersicon esculentum, CAA41212), CsACO (Citrus sinensis, AAG49361), FsACO1 (Fagus sylvatica, CAD21844), aminosavszekvenciák összehasonlítása a ClustalW programmal. A.: Fehérje összehasonlítás. A kilenc jelölt aminosav megtalálható a dioxigenázok valamennyi Fe (II) aszkorbát tagjában. A 3 konzervált domént (Lasserre et al. 1996) vonal jelzi. A fekete háttérel jelölt 3 aminosav a FaACO és FaACO1 közötti eltérést jelöli. B.: A rokonsági viszonyt ábrázoló kladogram. A FaACO tartalmazza az ACC oxidázok három konzervált doménjét (13. ábra: A, Box 1, Box 2, potenciális leucin cippzár domén, Box 3, vas ion kötĘ domén) valamint mĦködésükhöz vasiont és aszkorbátot igénylĘ enzimek csoportjára jellemzĘ 12 konzervált aminosavat (P5, A27, H39, H177, D179, L195, Q196, G218, H234, R244, S246) (Lasserre et al. 1996) (13. ábra. A). A kladogram alapján a FaACO a Trainotti et al. (2005) által leírt FaACO1-hez áll a legközelebb, és egy csoportban van a szintén Rosaceae családba tartozó alma, kajszi és Ęszibarack ACO fehérjékkel, és távolabb helyezkedik el a szintén Trainotti et al. (2005) által leírt FaACO2-tĘl, amely a paradicsom, papaya, citrom ACO fehérjékkel van egy klaszterben, legtávolabbi rokonságot a bükk ACO-val mutatja (FsACO1) (13. ábra B). A FaACO1 és FaACO2 gének részleges cDNS-ek. ElképzelhetĘ, hogy a FaACO-val legközelebbi rokonságot mutató FaACO1 azonos az általunk leközölt génnel, ugyanis az adatbankban meglévĘ parciális szekvencia aminosavszinten csak 3 aminosavban különbözik az általunk leközölt ACO szekvenciától, különbség, ami könnyen adódhat szekvenálási hibákól is (13. ábra. A). Expressziós mintázatukat tekintve a FaACO1 és FaACO2 az általunk leírt FaACO gén mintázatához hasonló, az érés során indukálódik (Trainotti et al. 2005).

41


4.3. A szamóca CTR1 izolálása és jellemzése

Az etilén jelátviteli útban az etilén receptorok (ETR1, ERS1) egy szerin/treonin protein kinázzal, a CTR1-el lépnek kölcsönhatásba, amely az etilén jelátviteli út negatív regulátoraként mĦködik (Kieber et al. 1993). Etilén hiányában az etilén receptorok közvetlenül aktiválják a CTR1 kináz aktivitását, ami foszforilálja a downstream célfehérjéket leállítva az etilén jelátviteli útat. Szamócában, más növényfajokhoz hasonlóan, az ETR géncsalád több tagját is azonosították, a CTR1-rĘl mi számolunk be elsĘként. A CTR1 degenerált primerpárral (El-Sharkawy et al. 2003) (4. táblázat) RT-PCR-ben egy 423 bp méretĦ fragmentumot szaporítottunk fel (14. ábra).

500 bp M 1 2

3 4

5

6 7

8 9 10 11 12 M

14. ábra. Az CTR1-F és CTR1-R primerpárral RT-PCR-el felszaporított fragmentumok. 1., 2,. 3,. 4. minták: zöld, fehér, rózsaszín, piros érési stádiumban levĘ gyümölcshús, 5. és 6. Botrytis cinerea-val fertĘzött érett és túlérett gyümölcshús, 7. fiatal levél, 8. öreg levél, 9. inda, 10. inda csúcsa, 11., 12. genomi DNS, M: DNS molekulasúly marker (Fermentas, GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Plus: 3.0, 2.0, 1.5, 1.2, 1.031, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 kb). Az RT-PCR-bĘl származó fragmentum szekvencia információjából kiindulva 5' és 3' RACE-el egy 3073 bp-nyi szekvenciát izoláltunk zöld gyümölcsbĘl származó templáton. EbbĘl 2535 bp kódolja az ORF-et, 538 bp pedig a 3' UTR-t képviseli. A teljes hosszúságú gén nukleotid szinten az alma (Malus domestica L.) CTR1-el (AY670703) 90%-os, valamint a körte (Pyrus communis L.) CTR1 génnel (AF386508) pedig 88%-os homológiát mutat. A FaCTR1 (AY538771) fehérje szinten a legnagyobb homológiát (90%) a rózsa (Rosa hybrida) CTR1-el (AAK40361), valamint egy paradicsom CTR1-szerĦ fehérjével (LeCTR3) (AAR89823) (67%) mutatja. A. LeCTR3 LeCTR4 FaCTR1 AAK40361 AtCTR1 XP_466052 PcCTR1

MEMS--TRRSNYTLLSQVADDNYLPPPPKYSVTGGGGGGGGVAPYYESHSGEKGKGKTGD MEVP--VRRSNYAILQQQP------------------------PYDEFNSDEKSKSR-GD MEMITTTRRSNYTLLSQVPDDQF------------TATSFYEGEGKNNNNNNNNKAK-VD MEMP--GRRSNYTLLSQVPDDHFAA---------ATATSFYESEGKN----NNNKAK-GD MEMP--GRRSNYTLLSQFSDDQVSVSVT--GAPPPHYDSLSSENRSNHNSGNTGKAK-AE MKAD--AKWPAMVLGGGGGGGRRASPGS-------APPPAAPAAVAYSLLATSPPASIGN ------------------------------------------------------------

58 33 47 44 55 51

LeCTR3 LeCTR4 FaCTR1 AAK40361 AtCTR1

NRGFDWDL---SDHRSNMMQASNRIGAAAFPGSIGLQRQSSGSSFGESSISGEYYMPSLS -KGLYWDL---IDRRK---------GTTPFQASIVLPTQSSEGSFAESSISG-------GRGFDWET-GGGGYRAANNPPSNRIGN--VFLSVGLQRQSSGSSFGESSLSGEYYAPTLS SRGFDWET-GGGEYRAA---PANRIGN--VYSSVGLQRQSSGSSFGESSLSGEYYAPTLS RGGFDWDPSGGGGGDHRLNNQPNRVGNNMYASSLGLQRQSSGSSFGESSLSGDYYMPTLS

115 72 104 98 115

42


XP_466052 PcCTR1

GGGSPHCDDGDASRGLG------------VADWLRLQRHSSGSSAGDD---GDGFS---- 92 ------------------------------------------------------------

LeCTR3 LeCTR4 FaCTR1 AAK40361 AtCTR1 XP_466052 PcCTR1

----NAEASFGYLNDGG-----------GGAEVRMKPLEANLFGGSSS-KSWAQQTEESY -------VSFGYMN------------------------AYSDVGGSLS-KSWAQQTEESY TMAANEIDGFGYVNDEG---------FRGKIG--MDETXVGPTGXSSFGKSWAQQTEESY TTAANEIDGFGYVNDDGFKTGGGGGEFRGKGG--GMDGGVGPPGGSSSGKSWAQQTEESY -AAANEIESVGFPQDDGFRLG-----FGGGGGDLRIQMAADSAGGSSSGKSWAQQTEESY -----SVSTLATADKGG----------------DPADRPAGSSGGGGS-KSWAQQAEEAY -----------------------------------------------DVQYLTGHVDERK

159 100 153 156 169 130 13


QLQLALALRLSSEATCADDPNFLDHVPDESASRASASAASAETLSHRFWVNGCLSYFDKV QLQLTLALRISTEATCADDPNLLDYVPDESVSHASASSASVEAMSHRFWVNGSLSYFDKV QLQLALALRLSSEATCADDPNFLDPVPDESWSRLS---SSADAVSHRFWVNGCLSYFDKV QLQLALALRLSSEATCADDPNFLDPVPDESSSRLS---SSADAVSHRFWVNGCLSYFDKV QLQLALALRLSSEATCADDPNFLDPVPDESALRTSP--SSAETVSHRFWVNGCLSYYDKV QLQLALALRLCSEASTAPDPNFLDSAVAAADDHHRD-APSPQSLSHRFWVNGSLSYSDKV PPQLADFLN-----------WFLHDKKGTSTLSKP---SSTGHRPHHVRVTGRLS-----

219 160 210 213 227 189 54


PDGFYLIHGMDPYVWIVCSDLQENARVPSIESMRAVDPSVVPSVEVILIDRRTDPSLKEL PDGFYFIQGMDPYIWTVCSDLQESGRIPSIESLMAVDPSVVPSVEVILIDRQSDPRLKEL PDGFYLIHGIDSYVWSMCTDVQESGRIPSIESLRSIDPGTGSSIEVILIDRCSDPSLKEL PDGFYLIHGIDSYVWSMCTDVQESGRIPSIESLKSVDPGTGSSIEVVLIDRRSDPSLKEL PDGFYMMNGLDPYIWTLCIDLHESGRIPSIESLRAVDSGVDSSLEAIIVDRRSDPAFKEL LDGFYLIHGMDPFVWTLCNDLRDGARVPSIESLKAMNP-TESSVEVVLIDRVVDYDLRQL ----------------TSCHLVDEDRELLLPRRHHNDDDHDNHVSSIFIDQS--------

279 220 270 273 287 248 90


QNRIHSLSPTCGTTKEVVDQLAQLVCSHMGG-ATSAGEDELVPLWKECSYELKDCLGSTV QNRIHSMYRSCNTTKEVVDQLAKLVCNHMGG-AASVGEGDFIPIWKECCNDLKDCLGCFV QNRVLSISCACITTTEIVDQLAKLVCSRMGG-SASVGEADFFPIWRESSDELKDCLGSVV QNRVLSISYACITTTEIVDQLAKLVCSRMGG-SASVGEAEFFSIWRESSDDLKDCLGSVV HNRVHDISCSCITTKEVVDQLAKLICNRMGG-PVIMGEDELVPMWKECIDGLKEIF-KVV ISTAIDVSRSRADSREITTRLAGIVSSKMGGSVASTEEHELCPRWRDSAGFLKISSGSVV -----------------------LTDGGEGG-----------QIIKETS----------L

338 279 329 332 345 308 106


LPIGSLSVGLCRHRALLFKVLADAIGLPCRIAKGCKYCNRADASSCLVRFGPDREYLVDL FPIGSLSVGLCRHRTLLFKVLADIIDLPCRIARGCKYCKESDAFSCLVRFGLDREYLVDL VPIGSLSIGLCRHRALLFKVLADTIDLPCRIAKGCKYCTRDDASSCLVRFGVDRELFVDL VPIGSLSIGLCRHRALLFKVLADTIDLPCRIAKGCKYCTRDDASSCLVRFGIDRELLVDL VPIGSLSVGLCRHRALLFKVLADIIDLPCRIAKGCKYCNRDDAASCLVRFGLDREYLVDL LPIGKLSIGLCRHRSLLFKTLADTISLPCRVVRGCRYCKSAGAASCLVHFGNDREYLIDL LPGDQTRFGLESS---LMRLELKGNSPHCLVQSDIPPCVQGDASEALDVTATAVASLEEC

398 339 389 392 405 368 163


IGSPGCLCEPDSSLNGPSSISISSPLRFPRFREVEPTTDFRSLAKQYFSDCQSLNLVFEE IRDPGCLYEPNSLLNGPSSISIPSPLRLPRFGQVEPAMDFTSFAKQYFSDCLSLNLAFDD IGNPGCLCEPDSLLNGPSTISISSPLRFPRIRTVEPTIDFRTLAKQYFSDCQLLNLVFDE IGNPGCLCEPDSLLNGPSSISISSPLRFPRLRTVEPTIDFRSLAKQYFSDCQLLNLVFDE VGKPGHLWEPDSLLNGPSSISISSPLRFPRPKPVEPAVDFRLLAKQYFSDSQSLNLVFDP IGNPGFLSEPDSLLNGLSSISVSSPLRPPKYNSADIVNNFKSLAKQYFLDCQSLNMMFND AR----LSEENDVVQQAYRKEIVVSRNQVIRNSVEQPK--VTLYNQSDLEGVHSELVK--

458 399 449 452 465 428 215


SSAGAAVDGDAGQTDRNNIERNSAVTG---PSNRDEVSRLPVPAI--------------SSAGTAVDGDAGQTDRSSMDKSSAVPS---SSNRDEVSRLPLPSINAWNKGCDKGSQLPA APAGSAGNEDNKGFSMYPKQKFTDGNNLFLDSSLDDDTSMHVDDRSPQLLKSYNPSQ--APAGSAGDEDNKGFSMYPKQKFTDGNNLFLVSGLGDDTSMHVDDRNPQFLKSFNPSQ--AS-------DDMGFSMFHRQYDNPG---------GENDALAENGGG-----SLPPSA--PAAVSGTVVDLDEAMGSNIGPNLSPAT-----NSDFQANFSHRS-------------------------QGRITAVTN-----------------------------------------

500 456 506 509 501 467 224


--------------RDMAPVKYVRPVLHGDTQLSDP----RDIGNDMRFLERGSQLVPSK KYHPPNMSISMSQEKDLIHLKNVPPIRYVDAHLIAISEARTDTINDQRYFEGVGRLAPAK -----NIVHQQTMLKDQIPLKRIPPIGHRDISRLDT--------SRDSRSGEGLQVVPSK -----NIVHQQTVLKDQIPLKRIPPIGHRDISRLDT--------SKDSRFGEGLQVVPSK -----NMPPQN-MMRASNQIEAAP-MNAPPIS----------------------QPVPNR --------------RGAQSSGQDGNFLIQKSSPEDT------------------QSAQSD ---------------------------------------------------------PRY

542 516 553 556 532 495 227

43



ISRDIALEIEDFDIPWEDLVLKERIGAGSFGTVHRADWNGSDVAVKILMEQDFHAERFKE PSRGLVLDVEDLDIPWNDLVLKERIGAGSFGTVHRADWNGSDVAVKILMEQDFHAERYKE PNKELTFDVDDLDIPWSELALKERIGAGSFGTVHRADWHGSDVAVKILMEQEFMLNALKS PNKELTLDVDDLDIPWSDLVLKERIGAGSFGTVHRADWHGSDVAVKILMEQEFHAERFNE ANRELGLDGDDMDIPWCDLNIKEKIGAGSFGTVHRAEWHGSDVAVKILMEQDFHAERVNE PFSDISLDIEDLIIPWSELVLKEKIGAGSFGTVHRADWNGSDVAVKILMEQDFHPERLKE LNLEPTLAMDWLEISWDELNIKERVGAGSFGTVHRAEWNGSDVAVKVLTVQDFHDDQLKD

602 576 613 616 592 555 287


FLREVAIMKRLRHPNIVLFMGAVTQRPNLSIVTEYLSRGSLYRLLHKPGAREVLDERRRL FLQEVAIMKRLRHPNIVLFMGAVTEPPNLSIVTEYLSRGSLYRLLHKPGAREVLDEKRRL SLGEVTIMKRLRHPNIVLFMGAVTKPPNLSIVTEYLSRGSLYRLLHKPGP--VLDERRRL FLREVAIMKRLRHPNIVLFMGAVTKPPNLSIVTEYLSRGSLYRLLHKPGP--ILDERRRL FLREVAIMKRLRHPNIVLFMGAVTQPPNLSIVTEYLSRGSLYRLLHKSGAREQLDERRRL FLREVAIMKSLRHPNIVLFMGAVTQPPKLSIVTEYLSRGSLYRILHKHGARENLDEKRRL FLREVAIMKRVLHPNVVLFMGAVTKRPHLSIVTEYLPRGSLYRLIHRPASGELLDQRRRL

662 636 671 674 652 615 347


SMAYDVAKGMNYLHKRNPPIVHRDLKSPNLLVDKKYTVKVCDFGLSRLKANTFLSSKSAA CMAYDVAKGMNYLHKRKPPVVHRDLKSPNLLVDTKYTVKVCDFGLSRLKANTFLSSKSAA NMAHDVAKGMNYLHRRNPPIVHRDLKSPNLLVDKKYTVKVCDFGLSRLKANTFLSSKSAA YMAHDVAKGMNYLHRRNPPIVHRDLKSPNLLVDKKYTVKVCDFGLSRLKANTFLSSKSAA SMAYDVAKGMNYLHNRNPPIVHRDLKSPNLLVDKKYTVKVCDFGLSRLKASTFLSSKSAA SMAFDVAKGMNYLHKRNPPIVHRDLKSPNLLVDKKYTVKVCDFGLSRLKANTFLSSKTAA RLALDVAKGINYLHCLNPPIVHWDLKSPNLLVDKNWTAKVCDFGLSRFKANTFISSKSVA

722 696 731 734 712 675 407


GTPEWMAPEVLRDEPSNEKSDVYSFGVILWELATLQQPWSNLNPAQVVAAVGFKGKRLDI GTPEWMAPEVLRDEPSNEKSDIYSFGVILWELATLQQPWSNLNPPQVVAAVGFKGMRLEI GTPEWMAPEVLRDEPPNEKSDVYSFGVMLWELATLQQPWGNLNPAQVVAAVGFQNKRLEI GTPEWMAPEVLRDEPSNEKSDVYSFGVILWELATLQQPWGNLNPAQVVAAVGFKNKRLEI GTPEWMAPEVLRDEPSNEKSDVYSFGVILWELATLQQPWGNLNPAQVVAAVGFKCKRLEI GTPEWMAPEVIRDEPSNEKSDVYSFGVILWELMTLQQPWSTLNPAQVVAAVGFNGRRLEI GTPEWMAPEFLRGEPSNEKSDVYSFGVILWELATMQQPWGNLNPAQVVAAVGFKNKRLEI

782 756 791 794 772 735 467


PRDLTPQVASIIEACWAKEPWKRPSFAAIMDMLRPLIKPPVTPPQPGRTDTQLIA PRDLNHPVTTIIEACWVNEPWKRPSFSTIMDMLKPLI-----------------PRDVNPQVASIIEACWANEPWKRPSFASIMESLKPLIKAPTPQPSHADLPILT-PRDLNPQVASIIEACWANEPWKRPSFASIMESLRPLIKAPTPQPSHADMPILT-PRNLNPQVAAIIEGCWTNEPWKRPSFATIMDLLRPLIKSAVPPPNRSDL-----PSSVDPKVAAIMESCWTKEPWRRPSFASIMESLKPLIRTPHQLQEDIS------PRDLNPNVAAIIEACWANEPWKRPSFAVIMDSLTPLIKAPVTQPSRADMPLLT--

837 793 844 847 821 783 520

B.

15. ábra. A FaCTR1 (Fragaria x ananassa, AAT07466) és néhány CTR1 fehérje, AAK40361: CTR1-szerĦ protein kináz (Rosa hybrida), LeCTR3 és LeCTR4 (Lycopersicon esculentum, AAR89823 és AAR89822), XP_466052 feltételezett CTR1-szerĦ protein kináz (Oryza sativa), PcCTR1 (Pyrus communis, AAL66190), AtCTR1 (Arabidopsis thaliana, NP_850760), aminosavszekvenciáinak összehasonlítása a ClustalW programmal. A.: Fehérjeösszehasonlítás. A szürke háttérben bekeretezett aminosavak a konzervált ATP-kötĘ helyet (IGAGSFGTVH) és a szerin/treonin kinázok konzervált doménjét jelölik (IVHRDLKSPNLLV). A szürke háttérben, egy vonallal jelzett aminosavak a CN box-ot képviselik (Huang et al. 2003), a nyíl alatti szekvencia EC (etilén CTR-specifikus) domén (Adams-Phillips et al. 2004). B.: A rokonsági viszonyt ábrázoló kladogram.

44


A FaCTR1 fehérje rendelkezik a szerin/treonin protein kinázok valamennyi jellegzetes tulajdonságával, így megtalálható a valamennyi kinázra jellemzĘ ATP-kötĘ hely (IGAGSFGTVH) (Schenk és Snaar-Jagalska, 1999) és a Ser/Thr kinázokra (mint a Raf és AtCTR1) jellemzĘ aktív centrum (IVHWDLKSPN) (Kieber et al. 1993). A FaCTR1-ben jelen van az AtCTR1 és más CTR fehérjék N-terminális végében azonosított CN-box, egy fehérjefehérje kölcsönhatást biztosító motívum, és a CTR1-ETR1 interakcióért felelĘs (Huang et al. 2003). A CN-box mögött jelen van egy másik konzervált domén, az EC (etilén CTRspecifikus), ami valószínĦleg csak a CTR1-szerĦ szekvenciák jellemzĘje (Adams-Phillips et al. 2004) (15. ábra. A). A filogenetikai analízisbĘl kitĦnik, hogy a FaCTR1 (a FaACS és FaACO-hoz hasonlóan) ismét egy Rosaceae családba tartozó CTR1-szerĦ fehérjével (AAK40361) mutatja a legközelebbi rokonságot. A körte CTR1 valószínĦleg a részleges szekvencia miatt nem került ebbe a csoportba, hanem jóval távolabb, egy rizs CTR1-el (XP_466052) közösen alkotnak egy klasztert (15. ábra. B). Az etilén jelátviteli út downstream elemeinek transzkripciós szabályozásáról kevés kísérleti adattal rendelkezünk. Az Arabidopsis CTR1 expressziója konstitutív, és etilénnel nem indukálható (Kieber et al. 1993, Gao et al. 2003), szemben az LeCTR1-el, ami etilénnel indukálható fiatal gyümölcsben és levélben (Adams-Phillips et al. 2004). Az RT-PCR eredmény alapján a FaCTR1 konstitutív expressziót mutat gyümölcséréskor és vegetatív szövettípusokban egyaránt.

4.3.1. A FaCTR1 promoter izolálása, bioinformatikai elemzése

A TAIL-PCR-el felszaporított CTR1 promoter régió hossza 1590 bp. A PLANTCARE és PLACE adatbázisok segítségével azonosított szabályozó elemek közül említésre méltó motivumokat a 12. táblázat tartalmazza. A szamóca és Arabidopsis CTR1 (AT5G03730) promotereinek szekvenciaszintĦ összehasonlításakor sok, azonos felépítésĦ és feltételezetten hasonló funkciót ellátó motívumot azonosítottunk (16. ábra). A FaCTR1 promoterében egyszer, az AtCTR1 promoterben, közvetlenül egymás mellett kétszer fordul elĘ a (GA)8 ismétlĘdés (-189 pozícióban), és jelen van egy (GA)4 elem is (-120 pozícióban). A (GA)8 ismétlĘdés gyakori a növényi genomokban, különösképp jellemzĘ a növényi promoterekre (Santi et al. 2003). GA/TC – ismétlĘdés - kötĘ proteinek Drosophila-ban GAGA vagy GAF fehérjékként

45


ismertek (Soeller et al. 1993). A Drosophila GAF néhány homeotikus gén expressziójáért felelĘs, kölcsönhatásba lép hĘsokk és hiszton gének promoterével (Soeller et al. 1988).

12. táblázat. A FaCTR1 promoterében azonosított szabályozó régiók szekvenciája, szerepük, elĘfordulásuk száma és helye Motívum szekvenciája GAAAAA TCTCTCTC

Szerepe Patogén és só indukálta stresszválasz Enhancer, nukleáris fehérjékkel történĘ interakció

ElĘfordulásának száma és helye

SzerzĘk

3, -104, -207, -278

Park et al. 2004

2, -140, -130

Pauli et al. 2004

4, -232, -341, -384, -649 1, -298

Haralampidis et al. 2002 Eulgem et al. 1999

1, -524

Santi et al. 2003

2, -240, -322

Dunn et al. 1998 Mohanty et al. 2005 Yamagata et al. 2002 Piechulla et al. 1998 Simpson et al. 2003 Ogawa et al. 2003 Stougaard et al. 1990

CCAAT

HĘstressz

TTGACC

CCGAAA

Elicitor Homeodomén gének szabályozó eleme Hidegstressz

AGCAGC

Anaerob stressz

1, -479

TGTCACA

Enhancer

1, -721

CAANNNNATC

Cirkadián ritmus

1, -1234

(GA/TC)8

ACGTG TAACAA CTCTT

Dehidratáció és sötétség indukálta szeneszcencia Giberellin válasz Feltételezetten a nodulációban van szerepe

1, -1523 1, -410 2, -1225,-997

A homeotikus gének elcsendesítésében szerepet játszó polycomb válasz elemei szintén tartalmaznak GAF kötĘ GA ismétlĘdéseket (Busturia et al. 2001). Növényekben a (GA/TC)8 ismétlĘdések funkciójáról kevés adat van. Arabidopsis-ban az ismétlĘdés több homeodomén gén promoterében is jelen van. Árpában, a BKn3 gén expressziójának szabályozása a BBR (barley b recombinant) fehérjének a gén promoterében és intronjában levĘ (GA/TC)8 ismétlĘdésekhez való kötĘdése által történik (Santi et al. 2003). A BKn3 a homeobox gének csoportjába tartozik és a merisztémák fenntartásában és levélkezdemények kialakulásában játszik szerepet (Santi et al. 2003). Mindkét promoterben jelen vannak a különbözĘ stresszválaszban szerepet játszó szabályozó motívumok, ilyenek például a patogén, só, hĘ, dehidratáció és sötétség indukálta szeneszcenciában, valamint anaerobiózis során fellépĘ stresszválaszokban résztvevĘ elemek.

I 1500 bp

TGGTTT- anaerobiózis

TTTGACT- sebzés

CAANNNCATC-cirkadian ritmus

CAACTG - szárazságstressz

I 1000 bp

TTTCAAA - fényindukálhatóság

TAACAA - giberellin válasz

ACGTG - Dehidratáció és sötétség indukálta szeneszcencia

I 500 bp

I 3' 0 bp

AtCTR1

FaCTR

LeACS7

AtACS2

AtACS6

FaACS


16. ábra. A FaACS, AtACS6, AtACS2, LeACS7, FaCTR1 és AtCTR1 promoterekben megtalálható feltételezett cisz elemek.

TGTCTC - auxin válasz

CCAAT- hĘstressz

(GA)8

GAAAAA - patogén és sóstressz

5' I 2000 bp

46

47


CTR1 promoterek funkcionális elemzésével kapcsolatos irodalmi adattal nem rendelkezünk, így a szabályozó elemek jelenléte csak elméleti síkon utalhat a gén transzkripciós szintĦ szabályozás mechanizmusára. Bár a FaACS és FaCTR1 expressziós mintázata eltérĘ (a gyümölcsben a FaCTR1 konstitutív expressziót mutat, a FaACS expressziója differenciált), mivel a két gén azonos biológiai

folyamat

résztvevĘje,

közös

szabályozó

elemek

azonosítása

céljából

összehasonlítottuk a két promoter régiót. Érdekes megfigyelés, hogy FaACS és FaCTR1 promoterekben egyaránt azonosítható volt a cirkadián szabályozásáért felelĘs elem (CAANNNCATC), ami ugyanakkor nem volt megtalálható az Arabidopsis CTR1 promoterben. A stresszválaszokat befolyásoló szabályozó elemek közül mindkét promoterben jelen van a dehidratáció és sötétség indukálta szeneszcencia szabályozásáért és anaerobiózis indukcióért felelĘs elemek (mindkettĘ jelen van az AtCTR1 promoterben is) (16. ábra). Nem elhanyagolható szempont viszont, a két promoter méretbeli különbsége (a FaACS promoter 1024 bp, a FaCTR1 promoter régió hossza 1590 bp), ami megnehezíti a reális összehasonlítást. Mindkét gén (FaACS és FaCTR1) esetében folyamatban van a promoter további 5' részének izolálása.

48


4.4. A gyümölcsérés során gátolt és indukált gének azonosítása cDNS-AFLP-vel

A szamóca és ezáltal a nem utóérĘ gyümölcsök érési mechanizmusának feltárása érdekében a cDNS-AFLP technika módosított változatát (Breyne et al. 2003) használtuk gyümölcs specifikus és érésindukálta gének azonosítása céljából. Ez a cDNS-AFLP verzió globális, kvantitatív genexpressziós analízisre alkalmas (Breyne et al. 2003). A cDNS-AFLP segítségével ritka mRNS-ek detektálhatók, a technika lehetĘvé teszi a gyümölcsfejlĘdésben és érésben szerepet játszó új gének azonosítását is. A cDNS-AFLP géleken 1403 fragmentumot összegeztünk. Az AFLP-QuantarPro adatok normalizálása után 290 olyan differenciáltan experesszálódó TDF-t találtunk, amelyek CV értéke >1. A hierarchikus klaszterelemzés után (Eisen et al. 1998), a 290 differenciáltan expresszálódó gének három nagy csoportot alkottak (17. ábra), a legnagyobb csoportba a 120 aszmag specifikus fragmentum tömörül, a többi transzkriptum a zöld gyümölcshúsban (86 TDF) valamint az érés során akkumulálódik (84 TDF). Az expressziós mintázatuk, valamint a sávok izolálásra való alkalmasságuk alapján (méret, élesség) 130 TDF-et izoláltunk majd szekvenáltunk. Ezeknek a szekvenciáknak 36%-a gyümölcshús és érés specifikus, 30%-uk a zöld gyümölcsre jellemzĘ, tehát expressziójuk az érés elĘrehaladtával gátlódik, és a TDF-ek 34%-a aszmag specifikus. A BLAST keresés eredménye alapján valamennyi TDF-et funkcionális kategóriákba soroltuk. A szekvenált TDF-ek többsége (34% az érett gyümölcsben, 47% a zöld gyümölcsben és 50% az aszmagban expresszálódó gének közül) nem mutatott ismert szekvenciákkal homológiát, vagy a homológia értéke alacsonyabb volt a megszabott küszöbértéknél (E < e-0,002) (13., 14., 15. táblázat) (Balogh et al. 2005a). Valamennyi E < e-0,002-vel rendelkezĘ szekvenciát az NCBI GenBank adatbázisába leadtuk, azonosító számuk az 13., 14., és 15. táblázatban vannak feltüntetve. A táblázatokban feltüntetett homológiák csak öt esetben azonosak a GenBankba már leadott szamóca génekkel, és másik hét szekvencia hasonló a Rosaceae családba tartozó fajok génjeivel, ami azt mutatja, hogy az adatbázisokban kevés a szamóca génekre vonatkozó információ.

49


Aszmagban expresszálódó gének

Zöld gyümölcshúsban expresszálódó gének

Érés során a gyümölcshúsban expresszálódó gének

17. ábra. A differenciáltan expresszált cDNS-AFLP transzkriptumok hierarchikus klasztere Cluster és TreeView programmal. Piros: génexpresszió, zöld: génexpresszió gátlás.

50


A.

B.

C.

%

%

% 18. ábra. A cDNS-AFLP fragmentumok funkcionális csoportosítása. A: zöld gyümölcsben expresszálódó TDF-ek, B: az érés során expresszálódó TDF-ek, C: aszmag specifikus TDFek.

51


4.4.1. Zöld gyümölcsben expresszálódó gének funkcionális csoportosítása

A 86 zöld receptákulumban jelen levĘ TDF közül 39-et szekvenáltunk. A szekvenciák majdnem fele (46%) nem mutatott semmilyen homológiát, míg 6 fragmentum (18%) valószínĦleg ismeretlen funkciójú fehérjéket kódol (18. ábra. A). Az azonosított fragmentumokat, a GenBank-i hivatkozási számokat valamint a szekvenciák homológiáját és funkcionális besorolását a 13. táblázatban foglaltuk össze. Expressziós mintázatuk alapján a zöld gyümölcsben jelen levĘ TDF-ek élesen elkülönülnek az érés indukálta gének csoportjától (17. ábra), ami összhangban van a zöld és érett gyümölcsökben lezajló, eltérĘ fiziológiai és biokémiai folyamatokkal. Ebben a stádiumban (közepes méretĦ zöld gyümölcs), az egyik meghatározó folyamat az auxin hatására történĘ sejtnagyobbodás és gyümölcsnövekedés. Két, sejtnövekedésben kulcsszerepet betöltĘ, gént azonosítottunk. Az egyik, (C13M214M008), a szamóca ß-galaktozidázzal mutat homológiát (Faßgal3), sejtfal hidroláz, ami reverzibilis sejtfallazulást eredményez, a turgor alapú sejtnövekedést más sejtfalmódosító fehérjékkel közösen segíti elĘ. Trainotti (2001) már bizonyította hogy a ß-galaktozidáz gén expressziója intenzív a virágban és a fiatal gyümölcsben, majd fokozatosan csökken a gyümölcs fejlĘdése és érése során, és szinte detektálhatatlanná válik a piros gyümölcsben. Szintén Trainotti (2001) számol be arról hogy a Faßgal3 expressziós mintázatával ellentétben a ß-galaktozidáz két másik izoformáját (Faßgal1 és Faßgal2) az érés indukálja, és a sejtfal szétesésében játszik szerepet. A sejtnövekedésért felelĘs másik gén a (C24M43M007) a transzport funkciót ellátó gének csoportjába tartozik és egy, az almából izolált MdPIP1 (BAD14371) plazma membrán fehérjét (vízcsatorna fehérjét) kódoló génnel homológ. A Faßgal3-al együtt a gyümölcs növekedése során a sejt expanzióért a víz homeosztázisának fenntartása révén lehet felelĘs (Hu et al. 2003). A hormon metabolizmus csoportját egy TDF, a feltételezett nitriláz-rokon fehérjét kódoló klón (C11M32M003) képviseli, a zöld gyümölcsben és aszmagban egyaránt jelen van, és a transzkriptum akkumulációja az érés során csökken. A génrĘl részletesebben a késĘbbiekben számolunk be. A zöld gyümölcsben jelenlevĘ, stressz indukálta transzkriptumok csoportja kisebb hányadot (7,7%) tesz ki, ide tartozik egy peroxidázt (C24M32M014), poligalakturonázt gátló fehérjét (C14M21M010) és egy ubiquitin specifikus proteáz 26-ot (C24M24M013) kódoló transzkriptum.


52

13. táblázat. A zöld gyümölcshúsból izolált transzkriptumpok és homológiájuk cDNS-AFLP fragmentum C11M32M003 C11M32M009 C11M32M010 C11M33M010

GenBank hivatkozási

Feltételezett azonosság

azonosító száma,

funkció

szám

faj neve

Nitriláz szerĦ fehérje

Hormon metabolizmus

AY679616

Feltételezett citokróm P450

Ismeretlen

AY642688

Feltételezett mitokondriális szállító fehérje Feltételezett AAA-típusú ATPáz

Szállítók és hordózók ElsĘdleges anyagcsere Jelátvitel

AY695666

AY946036

C11M34M012

AY679606

Kalretikulin 3

C12M11M005

AY679601

Mal d1 homológ (pruar1gc1)

AY946035

BEL1-szerĦ homeotikus fehérje 30

C12M11M006

Homológia

Feltételezett

Ismeretlen

Szabályozás

3-hidroxivajsav-dehidrogenázszerĦ fehérje Klorofill a/b-kötĘ CP24 prekurszor

DNS/RNS/ fehérje

AJ278705*

Béta-galaktozidáz (beta-gal3)

Sejtfal

C14M12M015

AY679599

Riboszomális (rps12)

Ismeretlen

C14M13M002

AY679613

RING finger fehérje

Szabályozás

C14M13M006

AY961594

Ismeretlen fehérje

Ismeretlen

C14M21M010

AY679598

Poligalakturonáz gátló fehérje

Stressz

C14M33M016

AY961595

NADH-ubiquinon oxidoreduktáz rokon fehérje

ElsĘdleges metabolizmus

C23M13M005

AY679607

Citokróm P450

Ismeretlen

C23M32M007

DQ074727

Feltételezett fehérje

Ismeretlen

C24M14M002

AY873806

C24M24M013

AY679610

C24M32M014

AY679597

C12M12M008

AY679600

C13M214M003

AAX23999

C13M214M008

fehérje

S12

S-adenozil-Lmetionin:carboxil metiltranszferáz Ubiquitin specifikus proteáz 26 (UBP26) Peroxidáz (Prx2b)

Plazma membrán fehérje * Az NCBI adatbankjába már leadott szamóca gének Az aláhúzott TDF-ek teljes hosszúságú cDNS-ét azonosítottuk C24M43M007

DQ022749

Fotoszintézis

Prosztetikus csoport

NP_683307 Arabidopsis NP_566922 Arabidopsis AF145348 Glycine max

Stressz Stressz Szállítók hordozók

AAG52493 Arabidopsis NP_192969 Arabidopsis T00435 Arabidopsis AAO72381 Oryza sativa AY336743 Brassica rapa AF020784 Prunus armeniaca AAN03627 Solanum tuberosum AAM63893 Arabidopsis AAD27882 Vigna radiata AJ278705 Fragaria ananassa AF238068 Gunnera chilensis NP_178507 Arabidopsis BAB02057 Arabidopsis CAD56505 Cicer arietinum At5g52840 Arabidopsis AF386512 Pyrus communis BAD38514 Oryza sativa

és

No hit

E érték 1e-17 2e-14 1e-07 5e-17 8e-20 8e-16 0.002 1e-28 7e-75 2e-77 1e-05 2e-26 2e-07 7e-08 4e-04 4e-06 1e-04 4e-08 1e-13 6e-13 No hit

A szignál transzdukció csoportot a kalretikulin 3 (C11M34M012) képviseli. Állati sejtekben a kalretikulin fontos szerepet tölt be a Ca2+ szignálok összehangolásában (Camacho és

Lechleiter,

1995).

Rizsben

a

kalretikulin

befolyásolhatja

a

sejtszuszpenziók

53


regenerálóképességét, a Ca2+ homeosztázis és jelátvitel szabályozása révén (Li és Komatsu, 2000). A kalretikulin akkumulációját a fitohormonok is befolyásolják (Borisjuk et al. 1998). KülönbözĘ formáiról bizonyították, hogy szövetspecifikus expressziós mintázatot mutatnak, amit stresszfaktorok is befolyásolnak (Persson et al. 2003). A szabályozásban szerepet játszó gének csoportját két klón képviseli: a C14M13M002 fragmentum egy RING-finger fehérjét, a C12M11M006 pedig egy BEL1-rokon homeotikus fehérjét kódol. Arabidopsis-ban a BEL1 a magkezdemény fejlĘdéséért felelĘs az AGAMOUS gén gátlása révén (Ray et al. 1994). Ez utóbbi a MADS box gének csoportjába tartozik, és mint ilyen a vegetatív, virág és gyümölcsfejlĘdést szabályozzák. Az AGAMOUS homológját szamócában is azonosították (STAG1), transzkriptuma a termĘlevelekben, porzókban és fiatal gyümölcsben volt detektálható (Rosin et al. 2003). ElképzelhetĘ, hogy a szamóca BEL1 az Arabidosis-ban ismert szerepet tölti be és a STAG1 szabályozásában vesz részt.

4.4.2. Az érés során expresszálódó gének funkcionális csoportosítása

Az érés által indukált transzkriptumok csoportját a fehér, rózsaszín és piros érési stádiumra jellemzĘ gének alkotják, élesen elkülönülve a zöld gyümölcsben akkumulálódó gének átirataitól, expressziójuk tehát nĘ az érés során. 47 TDF-et szekvenáltunk meg, ezek 34%-a nem vagy megbízhatatlan homológiát mutatott az adtabázisban szereplĘ génekkel, így ezekhez a szekvenciákhoz nem tudtunk funkciót hozzárendelni (18. ábra. B) (14. táblázat). A legnagyobb funkcionális csoportot a stressz válaszban résztvevĘ gének képviselik. A szabadgyökök hatására bekövetkezett peroxidatív károsulás és a membrán integritásának elvesztése jellemzĘek az öregedĘ növényi szövetekre. A szeneszcenciához hasonlóan, a gyümölcsérést is a sejtmembránok károsulása kíséri (Ferrie et al. 1994). A szabadgyökök semlegesítésének csökkent képessége, és az ennek következtében növekvĘ oxidatív stressz lehet azoknak a fizikai-kémiai változásoknak a háttere, amelyek elĘsegítik a fanyarka (Amelanchier alnifolia Nutt.) gyümölcsérését (Rogiers et al. 1998). A szĘlĘ, egy másik nem klimaktérikus gyümölcs esetében, Davis és Robinson (2000) által közölt eredmények szintén igazolják az érés során, a stressz-válaszban szerepet játszó fehérjék akkumulációját. Aharoni et al. (2002) szerint az éréskor fellépĘ oxidatív stressz válaszreakciója aktív génexpresszió, másrészt a szamóca érésének transzkripciós programja oxidatív stressz-indukálta folyamat. Kísérletünk során több, valószínĦleg oxidatív stressz hatására indukálódó gént is azonosítottunk. A rézvirág TED2 génjével (quinon oxidoreduktáz homológ) homológ (C24M13M007) szamóca génrĘl már bizonyították, hogy az érés és oxidatív stressz hatására


54

aktiválódik (Aharoni et al. 2002), eredményeink szerint a transzkriptum akkumulálódása a rózsaszín stádiumban a legnagyobb és csökken az érett gyümölcsben. A C23M11M001 és C23M43M008 jelzésĦ TDF-ek egy fitokelatin szintetázzal illetve egy feltételezhetĘen glutation S-transzferázzal mutatnak homológiát, mindkét génrĘl ismert, hogy éréskor indukálódik. A növények szintetizálnak olyan Cys-gazdag peptideket mint a glutation, fitokelatinok vagy metallotioneinek, a nehézfémek detoxifikációja vagy homeosztázisa céljából (Cobbett, 2000). Ennek a peptid csoportnak számos tagját gyümölcsérés során is kimutatták, például az almában (Reid és Ross, 1997), banánban (Clendennen és May, 1997), szamócában (Aharoni és O’Connell, 2002) és ananászban (Moyle et al. 2005). ValószínĦleg az érési folyamatokat kísérĘ oxidatív stressz válaszban, valamint a szabadgyökök detoxifikálásában van szerepük.

14. táblázat. Az érés során expresszálódó transzkriptumok és homológiájuk cDNS-AFLP fragmentum



szám Aminosav transzport fehérje AAP1 Feltételezett GTP-kötĘ fehérje (DRG)

Homológia

Feltételezett

azonosító száma,

funkció Szállítók hordózók

faj neve és

C11M33M001

AY679582

C11M33M011

AY679605

C11M33M013

AY679583

Glikozil transzferáz család 47


C11M33M014

AY679584

Foszfolipáz PLDb2

Stressz

C11M34M005

AY679581

Transzláció iniciáló faktor

DNS/RNS/ fehérje

C12M11M011

DQ011163

LEA4-25

Stressz

AY961593

U3 snoRNP-szerĦ fehérje

DNS/RNS/ fehérje

C13M214M007

DQ011162

Alkohol dehidrogenáz homológ, érés specifikus

Íz-illatanyag

C14M21M006

AY940166

ReceptorszerĦ fehérje kináz

Jelátvitel

C14M31M010

AF339024 *

Pektát liáz B

Sejtfal bomlás

C14M33M006

AY679611

Szedoheptulóz-1,7-bifoszfatáz prekurszor

ElsĘdleges metabolizmus

C23M11M001

AY642687

Fitokelatin szintetáz

Stressz

C23M12M001

DQ012968

Feltételezett stressz-válasz fehérje

Stressz

C23M21M001

AY679609

Kináz 2

Jelátvitel

C12M12M024

Jelátvitel

T10100 Ricinus communis BAC79856 Oryza sativa NP_565236 Arabidopsis AAG45488 Lycopersicon esculentum AF499740 Pisum sativum AAC49862 Phaseolus vulgaris At4g05410 Arabidopsis S39508 Lycopersicon esculentum AAM62629 Arabidopsis AF339024 Fragaria ananassa AY188797 Oryza sativa BAB10641 Arabidopsis AAT01418 Tamarix androssowii AAA34017 Glycine max

E érték 5e-64 7e-13 3e-05 7e-30

3e-40 3e-12 3e-13 5e-13 1e-12

2e-49 7e-65 4e-34 7e-15


55

C23M21M011

DQ022748

Feltételezett D-glükanáz

endo-1,3;1,4-ȕ-

C23M24M006

AY679593

18S riboszomális RNS gén

C23M31M001

AY679594

Feltételezett integráz

C23M33M002

AY679608

Flavonon-3-hidroxiláz

C23M33M014

AY642689

Feltételezett 3b splicing faktor

C23M42M006

AY679604

AAA-típusú ATPáz

C23M43M001

AY679602

C23M43M008

AAW82451

C24M13M007

AY679595

C24M14M001

AY679596

Feltételezett beta-coat fehérje

C24M14M007

DQ074728

Spermidin szintáz

C24M31M004

AAX09335

Feltételezett foszfatidilinozit glikán

Sejtfal

C24M33M004

AY679615

bHLH fehérje (SPATULA)

Szabályozás

C24M33M008

AY171598 *

UDP-glükózil transzferáz

Szénhidrát anyagcsere

C24M33M010

AY679612

Kináz

Jelátvitel

C24M44M001

AY679603

Glikozil transzferáz


C24M44M003

AY679614

Feltételezett HD-zip fehérje

Szabályozás

Sebzés indukálta P450 hidroxiláz Glutation S-transzferáz Quinon oxidoreduktáz homológ

Sejtfal DNS/RNS/ fehérje DNS/RNS/ fehérje Flavonoid út DNS/RNS/ fehérje ElsĘdleges metabolizmus Stressz Stressz Stressz Szállítók és hordózók Poliamin metabolizmus

AAU10802 Oryza sativa AF321262 Vitis riparia AAD04177 Oryza sativa AB074486 Malus x domestica BAD10377 Oryza sativa NP_849842 Arabidopsis AAG09208 Pisum sativum Q03666 Nicotiana tabacum T11672 Vigna sinensis NP_913038 Orysa sativa AB072915 Malus x domestica NP_187374 Arabidopsis NP_568010 Arabidopsis AY171598 Fragaria ananassa NP_177209 Arabidopsis NP_178963 Arabidopsis AAT39931 Solanum demissum

1e-15 1e-27 1e-38 3e-43 7e-11 e-119 2e-19 2e-30 4e-07 2e-46 0.015 2e-45 2e-40

1e-05 4e-42 0.011

* Az NCBI adtabankjába már leadott szamóca gének Az aláhúzott TDF-ek teljes hosszúságú cDNS-ét azonosítottuk

A C11M33M014 fragmentum egy foszfolipáz D-t kódol, ami a strukturális foszfolipidek hidrolízisét katalizálja, foszfatid savat és a fĘ funkcionális csoportot szabadítva fel. Növényekben a poszfolipázok fokozott aktivitást mutatnak patogénekkel szembeni válaszreakciókban (Van der Luit et al. 2000), szárazság és oxidatív stressz hatására (Munnik et al. 2000), etilén és ABA hatására (Fan et al. 1997, Frank et al. 2000). Régebben a foszfolipázt katabolikus enzimként tartották számon, aktivitását csírázással, éréssel és szeneszcenciával hozták összefüggésbe (Munnik et al. 1998). Ezek az adatok azt mutatják, hogy növényekben a foszfolipáz D különbözĘ funkciókat tölt be. Kísérletünkben a foszfolipáz D érés specifikus, legerĘsebben az érett gyümölcsben expresszálódik. Az érés során indukálódó és stresszválaszban szerepet játszó gének csoportjához tartozik még egy sebzés indukálta P450 hidroxilázzal homológiát mutató fragmentum (C23M43M001), valamint egy stresszválaszban indukálódó fehérjével hasonlóságot mutató fragmentum (C23M12M001) is.

56


Külön funkciós csoportot képviselnek a különbözĘ jelátviteli utak résztvevĘit kódoló gének transzkriptumai. Három kinázt kódoló TDF mutat érés specifikus expressziót (C14M21M006, C23M21M001, C24M33M010). Ezek közül a C23M21M001 klón egy szójából izolált fehérje kináz 2-vel (AAA34017) és egy rizs SAPK3 szerin/ treonin fehérje kinázzal (BAD17999) mutat homológiát. Az utóbbi a SnRK2 család tagja és hiperozmótikus stressz aktiválja, az SnRK2 család néhány tagja abszcizinsavval is indukálható (Kobayashi et al. 2004). A kináz 2 génnel együtt a további két receptorszerĦ fehérje kinázt (C14M21M006, C24M33M010) kódoló gének az érést kísérĘ stressz által indukált jelátviteli útvonalak részei lehetnek. Az utóbbi két receptorszerĦ kinázról a késĘbbiek folyamán részletesen lesz szó. A szabályozásban résztvevĘ gének csoportját két transzkriptum képviseli. A C24M33M004 TDF egy Arabidopsis bHLH fehérjék csoportjába tartozó SPATULA-val mutat homológiát (NP_568010), ami többek között a termĘlevelek kialakulásáért felelĘs (Heisler et al. 2001). A C24M44M003 fragmentum egy Solanum demissum-ból izolált feltételezett homeodomén-leucin cipzár (HDZip) kódoló génnel (AAT39931) mutat homológiát. A HDZip fehérjék a növényekre jellemzĘ transzkripciós faktorok népes csoportját képezik, az eddig azonosított funkciójú gének a növény fejlĘdésében vesznek részt (Hanson et al. 2002). Mindét klónról részletesebben beszámolunk a késĘbbiekben. A sejtfalbomlásban szerepet játszó gének csoportját két TDF képviseli (C14M31M010 és C23M21M011), ezek egy pektát liázt és egy rizs homológ (AAU10802), feltételezett endo1,3;1,4-ȕ-D-glükanázt kódolnak. Az érést a gyümölcsök puhulása és a sejtfal szerkezetének szétesése kíséri, ami néhány enzimcsalád aktiválódásának a következménye. Mindkét génrĘl bizonyították az éréssel kapcsolatos sejtfalbomlásban betöltött szerepét. A pektát liáz akkumulációja szignifikáns az érett receptákulumban, ugyanakkor az auxin erĘsen gátolja a pektát liáz és endo-1,4-ȕ-glükanáz expresszióját is (Aharoni et al. 2002, Aharoni és O’Connell, 2002, Benítez-Burraco et al. 2003,). A glükanáz gén transzkriptuma jelen van a zöld gyümölcsben, majd expressziója gátlódik, de az érett gyümölcsben ismét kifejezĘdik. Bár az 1,3;1,4-ȕ-D-glükanázt kódoló cDNS-AFLP fragmentum nem azonos az eddig azonosított szamóca glükanáz génekkel (Trainotti et al. 1999, Llop-Tous et al. 1999) ahhoz, hogy biztosak legyünk abban, hogy a glükanáz géncsalád új tagját izoláltuk, a teljes hosszúságú cDNS klónozása szükséges. A két ismert glükanáz gén, a FaEG1 és a FaEG3 az érés során expresszálódik, de a FaEG3 transzkriptuma jelen van nagy zöld gyümölcsben és fiatal vegetatív szövetekben (Trainotti et al. 1999, Spolaore et al. 2003). Nincs adat a két glükanáz esetleges etilén-függĘ szabályozásáról. Az adatbázisban megtalálható FaEG1 és FaEG3 promotereinek bioinformatikai elemzése során etilén válaszért felelĘs motívumot


57

azonosítottunk (ATTTCAAA), amely azonos a szegfĦ etilén indukálta glutation-S-transzferáz promoterében behatárolt cisz-elemmel (Itzhaki et al. 1994), és amely jelenléte azt sejteti, hogy a szamóca glükanázok expresszióját, és ezáltal az érési folyamat során bekövetkezĘ sejtfalbomlást

befolyásolhatja

az

etilén.

Egy

másik,

érésindukálta

transzkriptum

(C24M31M004) egy feltételezett foszfatidilinozit glikán-t kódol (PIG) (S osztály), expressziója a rózsaszín és érett gyümölcsben a legkifejezettebb. A PIG gén a glikozilfoszfatidilinozit (GPI) horgony bioszintézisében vesz részt. A GAP fehérjék (GPIanchored proteins) különbözĘ fiziológiai folyamatokban vesznek részt, mint például a gyökérfejlĘdés, a sejtfal integritás és adhézió kialakulása és fenntartása. Arabidopsis-ban 248 GAP-ot azonosítottak, többek között olyan sejtfalbontó enzimek melyek az érés során is szintetizálódnak mint például ȕ-1,3 glükanázok, poligalakturonázok és pektát liázok (Borner et al. 2003). A szamóca érésekor a foszfatidilinozit glikán felelĘs lehet a sejtfal dinamikus átrendezĘdéséért, szerkezetének megváltozásáért.

4.4.3. Az aszmagban expresszálódó gének funkcionális csoportosítása

Kísérletünkben az aszmag transzkriptumainak vizsgálata két megfontolásból történt: egyrészt gyümölcshús és aszmagban közös szabályozóelemek azonosítása volt a cél, másrészt a receptákulum-specifikus gének elkülönítése a mindkét szövettípusban mĦködĘ génektĘl (15. táblázat). A hierarchikus klaszterelemzés (Eisen et al. 1998) alapján az aszmagban expresszálódó gének csoportja élesen elkülönül a gyümölcshúsban jelen levĘ gének csoportjától (17. ábra). Az, hogy az aszmag-specifikus TDF-ek egy klaszterbe csoportosultak azt mutatja, hogy az aszmag érése során nincs szignifikáns változás a génexpressziós mintázatban. Hasonló eredményekrĘl számol be Aharoni és O’Connell (2002), microarray módszerrel a gyümölcsben megfigyelt génexpressziós változásokhoz képest az aszmagban szintén nem tapasztaltak szignifikáns mintázatbeli eltérést. A 120 aszmag-specifikus TDF közül 40-et szekvenáltunk meg. Ezeknek 50%-a kismértékĦ hasonlóságot vagy egyáltalan nem ad homológiát génbanki szekvenciákkal (18.ábra. C). A következĘ nagyobb csoportot a 7 (12,5%), ismeretlen funkciójú fehérjét kódoló klónok reprezentálják. A TDF-ek 10%-a (4 klón) stressz és védekezési reakciókban resztvevĘ transzkriptumokat foglal magába. Ez a géncsoport az aszmag érése során stressz és kiszáradás toleranciát biztosít. A szamóca 1-Cys peroxiredoxin (1-Cys Prx) (C23M21M004)


58

Fagopyrum esculentum-ból (pohánka) izolált homológjáról (AAF12782) bizonyították, hogy a magfejlĘdés során specifikusan expresszálódik (Lewis et al. 2000).

15. táblázat. Aszmagból izolált transzkriptumok és homológiájuk cDNS-AFLP fragmentum C11M31M014



szám

Feltételezett funkció

DQ074726

ACP5 (5-ös típusú sav foszfatáz)

Ismeretlen

C11M31M015

AAT46620

Citokróm P450

Ismeretlen

C11M32M003

AY695666

NitrilázszerĦ fehérje

C11M34M001

AY912491

Nitrit reduktáz

Hormon metabolismus Nitrát metabolizmus

C11M34M002

DQ022747

Kálium csatorna

Ismeretlen

C13M13M002

AJ315844*

Lipid transzfer fehérje gén lpt46

Zsírsavak

C14M12M004

AY679585

HĘsokk fehérje

Stressz

C14M13M001

AY679586

48-kDa glikoprotein prekurszor

Ismeretlen

C14M13M002

AY679613

RING cink-ujj

Szabályozás

C14M21M003

DQ022746

Kalmodulin-kötĘ fehérje

Jelátvitel

C14M31M001

AY679587

Feltételezett foszfatáz 2C (PP2C)

Jelátvitel

C14M33M002

AY679588

Feltételezett nitrát transzporter

Nitrát metabolizmus

C14M33M003

AY679589

Kis hĘsokk fehérje

Stressz

C23M12M004

AY633995

ß-amirin szintáz

Triterpén metabolizmus

C23M21M002

AY679590

Tartalékfehérje

Tartalékfehérje

C23M21M004

AY679591

1-cisz peroxiredoxin

Stressz

C23M31M002

AY679592

UDP-glükuronoziltranszferáz

Szénhidrát anyagcsere

C23M31M009

AY633994

Citokróm P450

Ismeretlen

C23M33M006

X15590*

18S riboszmális rRNS

Ismeretlen

Feltételezett auxin-független növekedés serkentĘ * Az NCBI adatbankjába már leadott szamóca gének C24M43M002

AY912490

Ismeretlen

Homológia

E

azonosító száma,

érték

faj neve NP_566587 Arabidopsis BAD06417 Asparagus officinalis AAG52493 Arabidopsis AB061671 Prunus persica CAB62555 Daucus carota AJ315844 Fragaria ananassa AAN74634 Pisum sativum AAL86739 Corylus avellana NP_178507 Arabidopsis NP_565379 Arabidopsis At2g29380 Arabidopsis BAB56042 Oryza sativa P30222 Petunia x hybrida BAB83088 Betula platyphylla 1905429A Theobroma cacao AAF12782 Fagopyrum esculentum AAB99950 Pisum sativum CAA70575 Nepeta racemosa X15590 Fragaria ananassa BAD69015 Oryza sativa

5e-10 2e-14

1e-17 2e-75 5e-14 3e-06 7e-17 1e-30 1e-25 8e-06 1e-10 5e-25 1e-40 2e-37 4e-23 4e-25

1e-04 2e-16 3e-08 6e-23


59

A peroxiredoxinoknak antioxidáns szerepük van, a reaktív oxigéngyököket és a lipid peroxidázokat bontják, valamint jelátvitelkor szabályozzák a reaktív oxigéngyök és a peroxid szintet. Korábbi funkcionális elemzések szerint az 1-Cys Prx DNS-védĘ enzim, ugyanakkor szerepet játszik a mag nyugalmi állapotának fenntartásában (Stacy et al. 1996). Dohányban túltermeltetett rizs 1-Cys Prx hatására a növények fokozott rezisztenciát mutattak antioxidáns stresszel szemben, és kevésbé befolyásolták a mag nyugalmi állapotát, azt sugallva, hogy az 1-Cys Prx-nak az antioxidáns aktivitás az elsĘdleges szerepe (Lee et al. 2000). A ß-amirin szintáz gén (C23M12M004) a szaponin bioszintézisének egyik kulcsenzime. A szaponinok másodlagos metabolitok, valószínĦleg gombaellenes hatásuk van (Papadopoulou et al. 1999). A másik két, stressz válaszhoz kötött klón (C14M33M003 és C14M12M004), hĘsokk fehérjéket kódoló génekkel mutatott homológiát. A transzkriptumok kisebb százaléka (5%) jelátviteli mechanizmusokért felelĘs. Ide tartozik a kalmodulin (C14M21M003) és egy feltételezett fehérje foszfatázt kódoló gén (C14M31M001). Növényi sejtekben a szabad Ca2+ szint változásának elsĘdleges szenzora a kalmodulin, kalcium kötĘ fehérje (Roberts és Harmon, 1992). A citoszólikus szabad Ca2+ a magban az ABA jelátviteli útvonal másodlagos ‘messengere’ (Leung és Giraudat, 1998). Ismert, hogy az ABA-nak fontos szerepe van a mag érésében. Sok fontos gént indukál (tartalékfehérjék, lipideket kódoló gének, embriogenézisért felelĘs gének), és aktívan gátolja a csírázást. Az ABA válaszban részt vesznek a 2C foszfatázok csoportjába tartozó fehérjék is (Leung et al. 1998). Az általunk azonosított foszfatáz közeli homológiát mutat az Arabidopsis-ból izolált ABI1-el, ami az ABA jelátvitelben negatív szabályozó (Gosti et al. 1999). A klónok 5%-a (két TDF) nitrát metabolizmusban résztvevĘ fehérjéket kódol: C11M34M001 nitrát reduktáz, C14M33M002 feltételezett nitrát transzporter.

4.5. Teljes hosszúságú cDNS-ek izolálása és jellemzése

Mivel a kapott TDF-ek viszonylag rövidek (50-500 bp) és a cDNS 3' végét képviselik (Breyne et al. 2003), a pontosabb szekvenciainformáció érdekében RACE reakcióval 2 génnek felszaporítottuk az 5' végét, 7 génnek pedig a teljes hosszúságú cDNS-ét. Ezeket a fragmentumokat

egyrészt

az

expressziós

mintázatuk

(19.

ábra),

másrészt

a

gyümölcsfejlĘdésben és az érésben betöltött potenciális funkciójuk miatt választottuk. Az eredeti és a RACE reakciók után kapott fragmentum hosszak, valamint ezek homológjai és az E értékek RACE reakciók után az 16. és 17. táblázatokban vannak felsorolva. Bár az eredeti

60


és RACE-el kapott szekvenciák hossza közt szignifikáns különbség van, homológjaik azonosak, kivétel a C24M43M007 klón, ahol, az eredeti 210 bp-nyi szekvenciával nem találtunk homológiát, míg a teljes 5' fragmentum nagyfokú homológiát (E value = e-135) mutat egy almából izolált vízcsatorna fehérje génnel. Ez azt mutatja, hogy táblázatokban felsorolt TDF-ek homológiái megbízható eredmények. 1

2

3

4

C11M32M003 (FaNit) C14M13M002 (FaRingH2) C14M21M006 (FaRLK1) C24M33M004 (FaSPA) C24M33M010 (FaRLK2) C24M44M003 (FaHd) GAPDH (kontroll) 19. ábra. Az érés indukálta gének expressziója szemikvantitatív RT-PCR-rel. Minták: gyümölcshús 1: zöld, 2: fehér, 3: rózsaszín 4: piros érési stádiumban.

16. táblázat. A kiinduló és a teljes hosszúságú 5' végĦ cDNS-ek hossza, homológiájuk és az E értékek és az azonosság mértéke a 5' RACE reakció elĘtt és után cDNS-AFLP fragmentum

Fragmentum hossza 5' RACE elĘtt és után

LegvalószínĦbb homológia 5' RACE elĘtt és után

C23M42M006 346 ĺ 1829 bp

AAA-típusú ATPáz

C24M14M007 160 ĺ 1212 bp

Spermidin szintáz

E érték 5' RACE elĘtt és után (Blastx) 1e-24 ĺ e-119 67/116 (57%) ĺ 294/500 (58%) 0.015 ĺ e-147 ĺ 265/324 (81%)

Az érés specifikus C23M42M006 TDF egy Arabidopsis AAA-típusú ATP-ázt (NP_564824) kódol. Az AAA-típusú ATPázok (ATPases Associated with diverse cellular Activities) szerkezeti sajátossága egy nagyon konzervált AAA motívum jelenléte. KülönbözĘ sejtfunkciók ellátásában vesznek részt, mint például a sejt-ciklus szabályozása, sejtszervecske biogenezis, vezikulum közvetítette fehérjetranszport, fehérje lebomlás és chaperon-szerĦ aktivitás (Patel és Latterich 1998).


61

Az alma spermidin szintázzal (BAC20170) homológiát mutató szamóca klón (C24M14M007) transzkriptum akkumulációja érés specifikus, a rózsaszín és piros gyümölcshúsban és az érett aszmagban van jelen. A spermidin szintáz túltermeltetése Arabidopsis-ban

fokozta

a

transzgénikus

növények

stressztĦrését

környezeti

stresszfaktorokkal szemben, és stresszválaszban szerepet játszó géneket indukált. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a spermidin részt vesz a stressz indukálta jelátviteli utakban, elĘsegítve a növények stressztoleranciájának kialakulását (Kasukabe et al. 2004).

17. táblázat. A kiinduló és a teljes cDNS-ek hossza, homológiájuk és az E értékek és az azonosság mértéke a RACE reakció elĘtt és után cDNS-AFLP fragmentum

Fragmentum hossza RACE elĘtt és után

LegvalószínĦbb homológia

E érték RACE elĘtt és után (Blastx)

7e-14 ĺ 2e-17 C11M32M003 400 ĺ 737 bp 41/64 (64%) ĺ 49/89 (55%) 3e-26 ĺ 2e-45 C14M13M002 271 ĺ 749 bp RING finger fehérje 51/92 (55%) ĺ 94/154 (61%) 1e-12 ĺ 0.0 C14M21M006 181 ĺ 240 bp ReceptorszerĦ kináz 33/49 (67%) ĺ 379/698 (54%) 0.005 ĺ 3e-46 C24M33M004 240 ĺ 1404 bp bHLH fehérje (SPATULA) 21/59 (35%) ĺ 131/229 (57%) 1e-05 ĺ 0.0 C24M33M010 137 ĺ 2077 bp ReceptorszerĦ kináz 26/41 (63%) ĺ 395/593 (66%) *C24M43M007 Plazma membrán ferhérje No hit ĺ 8e-148 120 ĺ 1277 bp (vízcsatorna fehérje) ĺ 261/286 (91%) 0.011 ĺ 5e-111 C24M44M003 Feltételezett homeodomén193 ĺ 1188 bp 21/32 (65%) ĺ 234/318 zip fehérje (73%) *az egyedüli klón, aminek a cDNS-AFLP fragmentumhoz képest változott a homológiája RACE reakció után Feltételezett nitrilázszerĦ fehérje

4.5.1. NitrilázszerĦ fehérjét kódoló gén

A C11M32M003 cDNS-AFLP-fragmentum alapján felszaporított teljes hosszúságú cDNS fehérje szinten a legnagyobb homológiát (55%) egy Arabidopsis-ból származó, feltételezhetĘen nitrilázszerĦ fehérjével (AAG52493) mutatta. A 735 bp hosszúságú teljes cDNS, 98 bp-nyi 5’ UTR-t, 282 bp-os 3’ UTR-t, és 357 bp hosszúságú ORF-t tartalmaz, mely


62

egy 118 aminosavból álló fehérjét kódol (20. ábra). Elnevezése és hivatkozási száma: FaNit, AY695666. A cDNS expressziója az érés folyamán szupresszálódik az aszmagban és a gyümölcshúsban egyaránt, a transzkriptumok leginkább a zöld érési fázisban levĘ aszmagban és gyümölcshúsban halmozódnak fel (19. ábra). A nitrilázok (EC 3.5.5.1) a nitrileket [például indol-3-acetonitril (IAN)] a megfelelĘ karboxilsavvá (indol-3-ecetsav (IES) hidrolizálják, és szerepük lehet az IES bioszintézisében, amely a legnagyobb mennyiségben elĘforduló természetes auxin. Arabidopsis-ban az azonosított négy nitrilázt kódoló gén terméke közül az AtNIT1, AtNIT2 és AtNIT3 képesek az IAN ĺ IES konverzióra (Hillebrand et al. 1998), de az is ismert, hogy az auxin bioszintézisben nem töltenek be elsĘdleges vagy egyedülálló szerepet. Kukoricában szintén bizonyították a nitriláz auxin bioszintézisben betöltött funkcióját, ahol a ZmNIT1 és ZmNIT2 felel az IAN ĺ IES átalakulásért (Park et al. 2003). Néhány nitrilázszerĦ fehérjérĘl bizonyították, hogy kölcsönhatásba lép EREBP-kel (ethyleneresponsive

element-binding

protein),

ezáltal

szabályozva

a

különbözĘ

védekezĘ

mechanizmushoz tartozó génexpressziót (Xu et al. 1998). Szamócában a magas auxin szint elĘsegíti a gyümölcs növekedését (Nitsch 1950), a gyümölcs érése viszont az aszmagból a receptákulumba történĘ auxin transzport megszĦnésével veszi kezdetét, az aszmag érésével párhuzamosan (Archbold és Denni, 1984, Given et al. 1998), az auxin tehát és az érés negatív regulátora, gátolva számos érés specifikus gén mĦködését (Manning 1994, 1998, Aharoni et al. 2002).

5' UTR 98 bp

ORF

357 bp

ATG 1. INTRON 732 bp

3' UTR 282 bp

TGA 2. INTRON 550bp

20. ábra. A FaNit genomi klón szerkezete. A FaNit genomi klón szerkezete (20. ábra) hasonló az Arabidopsis homológ a 415 bp-bĘl alló genomi klónjához (AT5G15600), ez utóbbi klónban szintén egy intron van az 5' UTR-ben (107 bp) és egy az ORF-ben (74 bp), bár az intronok mérete eltér a szamócában leírthoz képest. A FaNit promoterének bioinformatikai elemzése során (az eddig izolált 482 bp), sem a promoterben, sem az 5' UTR-ben levĘ 732 bp-nyi I. intronban, nem találtunk auxin-válaszért


63

felelĘs szabályozó régiót, amely jelenlétét a FaNit potenciális funkciója és expressziós mintázata miatt feltételeztük. Hormonális szabályozásért felelĘs elemek közül a FaRingH2 és FaSpa promoteréhez hasonlóan a FaNit promoterben is jelen van az etilén válaszért felelĘs cisz-elem egy-egy példánya az I. intronban és a promoterben (Balogh et al. 2005 c).

4.5.2. Ring finger fehérjét kódoló gén

A RING fingert kódoló cDNS-AFLP fragmentum (C14M13M002) jelen van a zöld, gyümölcshúsban ahol az érés során gátlódik (19. ábra), valamint az aszmagban, ahol az érés minden fázisában kimutatható, de expressziója csökken. A teljes hosszúságú cDNS 749 bp, ebbĘl 67 bp az 5’ UTR, 208 bp a 3’ UTR és 474 bp az ORF, amely egy 157 aminosavból álló fehérjét kódol. A genomi klón intront nem tartalmaz (21. ábra). 5'UTR 67 bp

ORF 474 bp

ATG

3'UTR 208 bp

TGA

21. ábra. A FaRingH2 genomi klón szerkezete.

Ez fehérje szintén egy Arabidopsis-ból származó C3HC4 típusú RING finger fehérjével (NP_178507) mutatja a legnagyobb homológiát, míg nukleotid szinten a görögdinnyébĘl (Citrullus lanatus Thunb.) izolált RING fingerrel (AB182936). A fehérje C-terminális régiója a 102 és 143-as aminosavak közt egy jellegzetes RING-H2 domént tartalmaz: C-X2-C-X14C-X-H-X2-H-X2-C-X3-W-X7-C-P-X-C (Jensen et al. 1998) (22, 23. ábra), továbbá a SMART software-el egy transzmembrán domént is azonosítottunk a 10-32 aminosavak közt (22. ábra).

RING

22. ábra. A SMART program által fehérje szinten felismert domének: 10-32 aminosavak közt levĘ transzmembrán domén (henger), 102 és 143-as aminosavak közt RING-H2 domén (rombusz), 33-43 aminosavak közt szerin gazdag régió (elipszis).


64

A RING domén szerkezetébĘl adodóan a szamóca homológot FaRingH2-nek neveztük el, GenBank-i hivatkozási száma: AY679613. A RING fingert (Really Interesting New Gene) (Hanson et al. 1991) eredetileg mint ciszteinben gazdag, feltételezett cink-kötĘ motívumot írták le, ami jelen van egymással nem rokon fehérjékben (Freemont et al. 1991), ugyanakkor az Arabidopsis proteomban a leggyakrabban detektált domén (Kosarev et al. 2002). Aminosav szintén a RING finger egy rövid, Cys/His-gazdag (C3HC/HC3) cink-ujj domén, amely, attól függĘen, hogy a motívum ötödik helyén Cys vagy His van jelen, két különbözĘ változatban fordul elĘ, RING-HC és RING-H2 formában (Freemont 2000). A DNS kötĘ cink ujj doméntĘl eltérĘen a RING domén a fehérje-fehérje kölcsönhatásban vesz részt (Borden 2000). Növényekben, a legtöbb RINGfingert kódoló gént Arabidopsis-ban azonosították, ezek többsége RING-H2 fehérje gén (Jensen et al. 1998, Lechner et al. 2002). Szerkezetileg, a RING-H2 motívumok helyzetét és multi-domén kombinációkat tekintve, ezek a RING-H2 fehérjék nagyon változatosak. Bár a RING-H2 domén legtöbbször multi-domén struktúrákban van jelen, amelyek általában tartalmaznak még egy sejtmembránt átérĘ régiót vagy egy másik cink-ujj domént (Jensen et al. 1998, Stone et al. 2005), legalább 40 olyan egyszerĦ szerkezetĦ RING-H2 fehérje van jelen az Arabidopsis genomban, ami nem tartalmaz egyéb fehérje domént (Lechner et al. 2002, Molnár et al. 2002). A RING finger fehérjék számos szervezetben fontos szerepet játszanak a fejlĘdés szabályozásában. Növényekben eddig csak néhányat jellemeztek funkcionálisan.

A

C-terminális

RING-H2

fehérjét

kódoló

BRH1

expresszióját

brasszinoszteroidok befolyásolják (Molnár et al. 2002), és patogén eredetĦ elicitorok (kitin) indukálják, az RHA2b szállító szövetekben akkumulálódik (Lechner et al. 2002), a RIE1 a mag fejlĘdése során expresszálódik (Xu és Li 2003). Az Arabidopsis SERRATE génje normális hajtásfejlĘdésért felelĘs, és mint ilyen, a fejlĘdés során, a hajtás merisztémákban, valamint a szervkezdeményekben íródik át (Prigge és Wagner 2001), a kukoricából izolált ID1 pedig a virágzás idejét szabályozó fehérjét kódol (Kozaki et al. 2004). Az Arabidopsis PEX12 egy peroxiszómális membrán fehérjét kódol, a mátrix proteinek importjáért felel (Fan et al. 2005). Szintén Arabidopsis-ban számos RING fehérjérĘl bizonyították ubiquitin ligáz aktivításukat (Stone et al. 2005). NP_973416 AAM19707 FaRingH2 AAP46154 BRH1 RHA1b RHA2b OSISAP1

MGLSSLPGPSEGMLCVILVNTALSISIVKG--IVRSFLGIVGISLSPSSS-SPSSVTVSS MGLSSLPGPSEGMLCVILVNTALSISIFKG--IVRSVLHVLGIRLSQSSS-SPSSVTASS MGLSSLPAPSEGFMCVILVNTALSVSIIKG--LVRSILRIVGIRLSSSSSASPASPPSEE MCLSNLPASSEGVICVVVMNTALSISIFKG--IVRSVLHIVDNRLAPFSS-SSSSILFPD MGFP--VGYTEVFLPKLFVQTLSILGFIRT--IVFSIFRFLGLSDFLEMD--------QT MGLP--TDFKELQIPGYVLKTLYVIGFFRD--MVDALCPYIGLPSFLDHN--------ET MGLQG--QLSDVSSDSIPLMLLALLATFFR--HVRSLLLFP------------------MAQRDKKDQEPTELRAPEITLCANSCGFPGNPATQNLCQNCFLAATASTS-SPSSLSSPV

57 57 58 57 48 48 37 59

65


NP_973416 AAM19707 FaRingH2 AAP46154 BRH1 RHA1b RHA2b OSISAP1

ENSSTSESFDFRVCQPESYLEEFRNRTPTLRFESLCRCKKQADNECSVCLSKFQGDSEIN EIP-ASEPFDFRVSHPESFLEEFRNKTPTLRYESLCRCKKHEDNECSVCLSKFEEDSEIN YIEDPSETFELHLSSSGSYIEEIRSRIPAVRFDSVCNLKTEHD--CSVCLSEFQPESEIN YSD--TESFEFPLHSSDDCVRELRSRRPAKRFDAVSSCK-QPQHDCPVCLIQFKPDSEIN WPDYTSYPTRIPETRSPFSALLIREILPVIKFEELTNSGEDLPENCAVCLYEFEGEQEIR S---RSDPTRLALSTS---ATLANELIPVVRFSDLLTDPE---DCCTVCLSDFVSDDKIR -----SSAPVVVVTSNLSVLADQLNLNRLFSYRYSDNAAS----DCIVCLSKLKTGEEVR LDKQPPRPAAPLVEPQAPLPPPVEEMASALATAPAPVAKTSAVNRCSRCRKRVGLTG---

117 116 116 114 108 99 88 116


KLK-CGHLFHKTCLEKWI-DYWNITCPLCRTPLVVVP--EDH----QLSSNVW------KLK-CGHLFHKTCLEKWI-DYWNITCPLCRTPLVVVAAAEDQK---QLSSNVW------HLT-CGHVFHQDCLEKWL-NYWNITCPLCRTPLMPVE----------ETSCFW------CLS-CGHVFHKACLEKWL-DYRKVTCPLCKSPVMPEE---------EDTSSSW------WLRNCRHIFHRSCLDRWM-DHDQKTCPLCRTPFVPDEMQEEFNQRLWAASGVHDFHCPVT QLPKCGHVFHHRCLDRWIVDCNKITCPICRNRFLPEEKSTPFD---WGTSDWFRDEVEST KLD-CRHVFHKQCLEGWL-QHLNFNCPLCRSPLLPHHHQGHGS---DASISAFPLRSTST FRCRCGHLFCGEHRYSDRHGCSYDYKSAARDAIARDNP-------VVRAAKIVRF-----

162 164 157 156 167 156 143 164


------------ELL- 170 N--- 157 ASSH 147 ----

23. ábra. A FaRingH2 (AAV33472) és néhány RING finger fehérje aminosavszekvenciájának összehasonlítása: NP_973416 (Arabidopsis thaliana), AAM19707 (Thellungiella halophila), AAP46154 (Hevea brasiliensis), BRH1 (AAD27870, Arabidopsis thaliana), RHA1b (Q9SUS5, Arabidopsis thaliana), RHA2b (AAD14516, Arabidopsis thaliana), OSISAP1 (AAF74344, Oryza sativa) aminosav szekvenciájának összehasonlítása Clustal W programmal. A jelölt aminosavak a C-X2-C-X14-C-X-H-X2-H-X2-C-X3-W-X7C-P-X-C RING finger domén konzervált aminosavjait képviselik (Jensen et al. 1998). A FaRingH2 sejtszintĦ lokalizációját a FaRingH2-GFP fúzió rizs protoplasztban történĘ tranziens expressziójával határoztuk meg. Eredményeink szerint (26. ábra. C., D) a FaRingH2 a citoplazmában mĦködik, lokalizációja azonos a kontroll (Pro35S-GFP) (26. ábra. A., B) citoplazmatikus jelenlétével. A FaRingH2 promoterének bioinformatikai elemzése során (Balogh et al. 2005c) azonosítottunk egy AuxRR-szerĦ (auxin responsive element) motívumot, ugyanez az elem a szamóca génnel homológ Arabidopsis gén (At2g04240) promoterében is megtalálható. Ez releváns lehet, ugyanis irodalmi adatok szerint valószínĦ, hogy több RING-H2 cink finger motívumot tartalmazó fehérjének is szerepe van az auxin jelátvitelben, mégpedig a szubsztrátspecifikus ubiquitin úton végbemenĘ fehérje degradációban (Xie et al. 2002). Az etilén szabályozó szerepére utalhat az ERE motívum (Itzhaki et al. 1994) jelenléte, a CAAACAC szekvencia tartalékfehérjék promoterének specifikus eleme, valószínĦleg felelĘs a FaRingH2 aszmagi expresszióért (Stalberg et al. 1996).

66


4.5.3. Két receptorszerĦ kináz

A C14M21M006 cDNS-AFLP fragmentum alapján piros gyümölcsbĘl felszaporított teljes hosszúságú cDNS egy receptorszerĦ kinázt kódol. A teljes hosszúságú cDNS 108 bpnyi 5' UTR-t, 2061 bp-nyi kódoló régiót és 322 bp-nyi 3' UTR-t foglal magaba. Fehérje szinten a legnagyobb homológiát (57%) egy Arabidopsis leucin gazdag receptorszerĦ kináz fehérjével mutatja (AK176866). A homológia alapján a szamóca receptorszerĦ kináz gént FaRLK1-nek neveztük el (AY940166). A C24M33M010 cDNS-AFLP fragmentum szintén egy receptorszerĦ kinázt kódol. A RACE-el, piros gyümölcsbĘl izolált teljes hosszúságú cDNS 89 bp-nyi 5' UTR-t, 1875 bp-nyi kódoló régiót és 113 bp-nyi 3' UTR-t foglal magába. A 624 aminosavból alló fehérje a legnagyobb homológiát (66%) egy Arabidopsis kinázzal mutatja (NP_177209), elnevezése és GenBank-i hivatkozási száma: FaRLK2, AY679612. Mindkét szamóca receptorszerĦ kináz transzkriptumának akkumulálódása az érés során indukálódik (19. ábra). Tipikusan, egy receptorszerĦ kináz egy N-terminális szignál peptidbĘl, egy extracelluláris receptor doménbĘl, egy transzmembrán doménbĘl és egy citoplazmatikus szerin/treonin specifitással rendelkezĘ kináz doménbĘl áll. A ligandum kötĘdése az extracelluláris doménhez indukálja a citoplazmatikus kináz domént, ami az RLK autofoszforilációjáhaz és a szubsztrát fehérjék transzfoszforilációjához vezet. A foszforilált fehérjék továbbítják a szignált és ligandum-specifikus választ idéznek elĘ. A receptorszerĦ kinázok (RLK-receptor-like kinase) egy nagy RLK/Pelle géncsaládba tartoznak, amely Arabidopsis-ban több mint 600 tagot tartalmaz (Shiu et al. 2004). Biológiai funkciójuk szerint az RLK/ Pelle géncsalád tagjai két nagy csoportba sorolhatók. Az elsĘ csoportba tartoznak a növény növekedését és fejlĘdését szabályozó gének, mint például az Arabidopsis-ban azonosított és a szervek alakját meghatározó ERECTA (Torii et al. 1996), vagy a merisztéma fenntartásáért felelĘs CLAVATA1 (Clark et al. 1997), és a sejtnövekedést szabályozó BRI1 (Li és Chory, 1997). A második csoportba a növény-mikróba kölcsönhatásért és védekezési mechanizmusokért

felelĘs RLK-k tartoznak. Ilyen például a bakteriális patogén

rezisztenciáért felelĘs rizs Xa21 (Song et al. 1995), a flagellin érzékeléséért felelĘs Arabidopsis FLS2 (Gomez-Gomez és Boller 2000) és a szisztemin jelátvitelben résztvevĘ paradicsom SR160 (Scheer és Ryan 2002). A két szamóca receptor kináz szerkezetileg eltér egymástól (24. ábra). A SMART és Pfam programokkal mindkét fehérjében azonosítható volt egy transzmembrán és egy kináz domén, az N-terminális vég viszont eltérĘ felépítésĦ. A C14M21M006 tartalamaz egy N-

67


terminális leucinben gazdag domént és leucinben gazdag ismétlĘdést (24. ábra A). A C24M33M010 N-terminális végén két ismeretlen funkciójú domén található (24. ábra B). A.

B.

24. ábra. A SMART és Pfam programok által fehérje szinten felismert domének: A: receptorszerĦ kináz (FaRLK1): zöld: leucinben gazdag N-terminális domén (24-65 aminosavak),

piros:

leucinben

gazdag

ismétlĘdések

(93-235

aminosavak),

kék:

transzmembrán domén (323-345 aminosavak), sárga: kináz domén (427-699 aminosavak). B: receptorszerĦ kináz (FaRLK2): zöld: ismeretlen funkciójú domének (29-84 és 141-196 aminosavak), kék: transzmembrán domén (211-233 aminosavak), kináz domén (276-560 aminosavak).

A FaRLK1 és FaRLK2 promoterekben azonosított szabályozóelemek összehasonlítása alapján elmondható, hogy a FaRLK1 az abszcizinsav válaszban vesz részt, a FaRLK2 pedig sebzés és elicitorok hatására aktiválódik. Az RLK2 promoterében metil-jázmonát-, sebzés- és auxinválaszért felelĘs elemeket is azonosítottunk (Koncz, elĘkészületben). A kinázok katalizálta fehérje foszforiláció kulcsszerepet tölt be az eukarióta jelátvitelben, és így valószínĦleg részt vesznek a gyümölcsfejlĘdésben. Jelen esetben, az is elképzelhetĘ, hogy a két receptorszerĦ kináz gén expressziójának indukálódása az érést kísérĘ, patogénekkel szemben fokozott érzékenység válaszreakciója.

4.5.4. Az Arabidopsis SPATULA génnel homológ szamóca gén

A C24M33M004 érésindukálta transzkriptum a bHLH fehérjék csoportjába tartozó transzkripciós faktort kódol. A teljes cDNS 1404-bp méretĦ, amely magába foglalja a 23-bp-

68


nyi 5' UTR-t, a 1098-bp-nyi ORF-t és a 283-bp-nyi 3' UTR-t, egy 365 aminosavból álló fehérjét kódol. Elnevezése és GenBank-i hivatkozási száma: FaSpa, AY679615). A SMART programcsomaggal a 150 és 199 aminosavak közt egy alap spirál-hurok-spirál (bHLH) (basichelix-loop-helix) domént azonosítottunk. Fehérje szinten a legnagyobb homológiát (51%) az Arabidopsis-ból izolált SPATULA-val, egy bHLH fehérjével mutatja (NP_568010). Néhány növényi bHLH fehérje részt vesz az antocianin bioszintézis szabályozásában (Goodrich et al. 1992), másoknak az abszcizinsav és dehidratáció válaszreakcióban van szerepük, vagy a mag tartalékfehérje gének expressziójának szabályozásáért felelnek (Kawagoe és Murai 1996). Az Arabidopsis SPATULA génje a termĘlevelek fejlĘdésében játszik szerepet, de jelen van más szövetekben is, ahol növekedésért lehet felelĘs. A SPATULA mutánsaiban a bibeszál, a bibe és a replum (választófal) növekedése korlátozott (Alvarez és Smyth, 1999; Heisler et al. 2001). Szamócában a transzkriptum érés során akkumulálódik (19. ábra), ugyanakkor RTPCR-el kimutatható volt aszmagban, indában, az inda csúcsi részében és levélben is. A FaSPA esetleges hormonális szabályozására utalhatnak a promoterében megtalálható, hormon-válaszhoz kötött elemek. Az Arabidopsis SPATULA gén promoterében Heisler et al. (2001) több AuxRE-szerĦ motívum jelenlétérĘl számol be, ami arra enged következtetni, hogy az auxin a SPATULA transzkripciós szintjét is befolyásolja. A FaSPA promoterében az AuxRE (auxin responsive element) motívum részeként egy TGA-1 boxot azonosítottunk. Az auxin mellett, az etilén szabályozó szerepére utalhat az ERE (ethylene responsive element) jelenléte. A FaSPA upstream szekvenciájában az Itzhaki et al. (1994) által leírt, etilénhez kapcsolt ERE szabályozó elem (ATTTCAAA) különbözĘ formái négyszer fordulnak elĘ a szamóca esetében, és háromszor az Arabidopsis SPA promoterében (Balogh et al. 2005c). Ismert, hogy bizonyos esetekben egynél több cisz elem jelenlétére van szükség néhány transzkripciós faktor stabil kötĘdéséhez (Ulmasov et al. 1999). Bár a többször elĘforduló ERE-k funkciója hasonló lehet, az ismétlĘdés biológiai jelentĘsége és a szamóca SPATULA génjének hormonális szabályozása bizonyításra szorul. A FaSPA promoter további részletes bioinformatikai és funkcionális elemzést igényel. A szamóca SPATULA gén genomi klónjának szerkezetét még nem határoztuk meg, az Arabidopsis genomi klón (AT4G36930) szerkezete: 5' UTR: 40 bp, ORF: 1778 bp, 3' UTR: 348 bp, az ORF 6 intront tartalmaz (Intron 1: 231 bp, Intron 2: 71 bp, Intron 3: 96 bp, Intron 4: 93 bp, Intron 5: 77 bp, Intron 6: 83 bp).

69


4.5.5. Plazma membrán ferhérjét (vízcsatorna fehérjét) kódoló szamóca gén

A C24M43M007 fragmentum alapján felszaporított teljes hosszúságú cDNS fehérje szinten a legnagyobb homológiát (91%) egy alma MdPIP1a (BAD14371) vízcsatorna fehérjével mutatja. Nagy homológiát (89%) mutat továbbá a szintén alma MdPIP1b (BAD14372), valamint a körte Py-PIP1-1 (BAB40142) génekkel is. Az 1277 bp-nyi teljes hosszúságú cDNS egy 101 bp-nyi 5’ UTR-t, 285 bp-os 3’ UTR-t, és 891 hosszúságú ORF-t tartalmaz. Elnevezése és hivatkozási száma: FaPIP, DQ022749. A transzkriptum felhalmozódása zöld gyümölcshúsra jellemzĘ, majd csökken az érés során. A FaPIP fehérje szinten a 47-278 aminosavak között egy, az aquaporinokra jellemzĘ MIP (Major Intrinsic Protein) domént tartalmaz (Pfam adatbázis szerint). A plazma membrán fehérjék (PIP) az aquaporinok alcsaládját alkotják. A PIP1 és PIP2 funkcionális elemzése azt mutatja, hogy ezek a fehérjék részt vesznek a gyökér vízfelvételében, stressz-válaszban és CO2 transzportban (Siefritz et al. 2002). Dohányban, a PIP2-rĘl bizonyították a portok kiszáradásában és ezáltal a portok felnyílásában betöltött szerepét (Bots et al. 2005). Az aquaporinok általánosabb szerepe a sejt növekedésében és ozmotikus szabályozásban van (Maurel et al. 2002). A zöld, növekedésben levĘ szamóca gyümölcsben azonosított FaPIP a MdPIP1-hez hasonlóan a gyümölcs növekedése során a sejt expanziójáért a víz homeosztázisának fenntartása révén lehet felelĘs (Hu et al. 2003).

4.5.6. Homeodomén fehérjét kódoló szamóca gén

A C24M44M003 cDNS-AFLP fragmentum egy homeodomént tartalmazó fehérje génjével mutatott hasonlóságot. A transzkriptum a gyümölcshúsban az érés során akkumulálódik (19. ábra). Az érett gyümölcsbĘl izolált RNS-bĘl RACE-el felszaporított teljes hosszúságú cDNS 1188 bp, ebbĘl 133 bp az 5' UTR, 915 bp az ORF és 140 bp a 3' UTR. Elnevezése és GenBank-i hivatkozási száma: FaHd, AY679614. Fehérje szinten a legnagyobb (72%) azonosságot egy Solanum demissum Lindl.-ban azonosított HD-zip fehérjével mutatja (AAT39931). Továbbá 64% hasonlóságot mutat az Arabidopsis-ban leírt ATHB13 (AAF20996), valamint 43%-ot és HAT7 (NP_568309) fehérjékkel. Fehérje szinten a SMART programmal a 93-157 aminosavak között egy homeodomént azonosítottunk. A homeodoménleucin cipzár (HDZip) fehérjék látszólag csak a növényekre jellemzĘ transzkripciós faktorok népes családját reprezentálják. JellemzĘjük, a homeodomén mellett, egy leucin cipzár domén


70

jelenléte, ezek révén dimereket alkotnak, ami elsĘdleges feltétele a DNS kötésnek. A HDZip géncsaládnak Arabidopsis-ban 47 tagja van (Henriksson et al. 2005). A legtöbb Arabidopsis HDZip gén funkciója ismeretlen, az ismert funkciójú gének a növény fejlĘdésében töltenek be kulcsszerepet (Hanson et al. 2002). Az ATHB13 fehérje a szaharóz szignál transzdukciós út komponense lehet, konstitutív túltermeltetése cukorfüggĘ módosulásokat idéz elĘ a sziklevélés levélfejlĘdésben (Hanson et al. 2001). Az ANTHOCYANINLESS2 az antocianin eloszlást és gyökérfejlĘdést befolyásolja Arabidopsis-ban (Kubo et al. 1999). Két másik HDZip gén, a PHABULOSA és PHAVOLUTA a hajtás sugaras szervezettségét szabályozza (McConnell et al. 2001).

5'UTR 133 bp

ORF

915 bp

ATG

3'UTR 140 bp

TGA 1. INTRON 85 bp

2. INTRON 462 bp

25. ábra. A FaHd genomi klón szerkezete.

A genomi klón szerkezete (25. ábra), intronok száma és helyzete azonos a Solanum demissum Lindl. 304 aminosavat kódoló HD-zip génjével, viszont ezek mérete 901 bp és 422 bp, ami jóval nagyobb a szamóca Hd-zip génben ismertnél. Az Arabidopsis ATHB13 gén szintén két intronos, egy 80 és egy 233 bp-nyi intron szakítja meg a kódoló régiót. A FaHd sejtszintĦ lokalizációját FaHd-GFP fúziós fehérje segítségével határoztuk meg. Eredményeink szerint (26. ábra. E., F) a FaHd a sejtmagban mĦködik, a kontrolltól (Pro35S-GFP) eltérĘ módon (26. ábra. A., B), ahol az expresszió citoplazmatikus, a FaHd-GFP teljes mértékben a sejtmagban lokalizálódik, ami összhangban van a homeodomén fehérjék sejtmagi transzkripciós faktor szerepével. A HD-zip géneket már kapcsolatba hozták a gyümölcséréssel, bár az eddigi adatok csak az érett gyümölcsöt reprezentáló EST gyĦjteményben való jelenlétüket bizonyítják (paradicsom, barack), az érésben betöltött szabályozó szerepük teljesen ismeretlen (Fei et al. 2004, Ziliotto et al. 2005).


71 CaMV35S

GFP

NOS

A.

CaMV35S

B.

FaRing

GFP

NOS

C.

CaMV35S

E.

D.

FaHd

GFP

NOS

F.

26. ábra. A FaRING és FaHd fehérjék szubcelluláris lokalizációja GFP fúzióval. A., B.: Pro35S: GFP, C., D.: Pro35S: FaRingH2-GFP, E., F.: Pro35S: FaHd-GFP tranziens expressziója rizs protoplasztokban. A., C., E. GFP UV-fénnyel gerjesztve, B., D., F. fehér fényben

72

Új tudományos eredmények

4.6. Új tudományos eredmények

1. Az etilén bioszintézis és jelátviteli mechanizmus kulcsgénjeinek azonosítása szamócában. Azonosítottuk az ACC szintáz géncsalád tagját, a FaACS-et. Meghatároztuk szerkezetét és expressziós mintázatát. Izoláltuk a teljes hosszúságú cDNS-t és a genomi klónt. TAIL-PCR-el felszaporítottunk egy 889 bp-nyi promoter régiót, és elvégeztük ennek bioinformatikai elemzését. Azonosítottuk az ACC oxidáz géncsalád tagját, a FaACO-t. Felszaporítottuk a gén teljes hosszúságú cDNS-ét és izoláltuk a genomi szekvenciát. Expressziós mintázata érésindukált. Izoláltuk az etilén jelátviteli útban résztvevĘ szamóca CTR1 gént. Azonosítottuk a teljes hosszúságú cDNS-t. Expressziós mintázata konstitutív. TAIL-PCR-el felszaporítottunk egy 1590 bp-nyi promoter régiót, és elvégeztük ennek bioinformatikai elemzését. Valamennyi gén szekvenciainformációját a GenBankban leközöltük.

2. A szamóca gyümölcsérésre jellemzĘ génexpressziós mintázat jellemzése. Új gének azonosítása. Gyümölcshúsból és aszmagból összesen 72 gént azonosítottunk, amelyek a gyümölcsérés különbözĘ stádiumaira jellemzĘek. Kvantitatív cDNS-AFLP segítségével ezeknek a géneknek az expressziós mintázatáról is elsĘként számolunk be. Szekvenáltunk és az NCBI GenBankba leadtunk 20 zöld gyümölcsbĘl, 29 érésindukálta és 18 aszmag specifikus génszekvenciát. A cDNS-AFLP során azonosított transzkriptumokból kiindulva kiválasztottunk 7, gyümölcsfejlĘdés és érésben potenciálisan szerepet játszó klónt, izoláltuk a teljes hosszúságú cDNS-üket, homológia alapján meghatároztuk funkciójukat. Meghatároztuk a FaRingH2 és FaHd szubcelluláris lokalizációját GFP fúziós fehérjék tranziens expressziójával rizs protoplasztokban. Ezekszerint a FaRingH2 a citoplazmában, míg a FaHd a sejtmagban mĦküdik.

73

Következtetések és javaslatok

5. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK

Az etilén bioszintézis és jelátviteli útvonal kulcsgénjei a szamócában a többi növényhez hasonlóan, jelen vannak. Az általunk azonosított ACS szerepe valószínĦleg hasonló az almából izolált MdACS5-éhez, ugyanis fiatal vegetatív szövettípusokban, valamint a zöld gyümölcsben van jelen, ugyanakkor elicitorokkal is indukálható. Az ACS-el ellentétben az ACO érésindukálta mintázata arra enged következtetni, hogy az érés elĘrehaladtával az etiléntermelés a szamócában is fokozódik. Az etilén válasz jelátviteli útban az etilén negatív regulátoraként mĦködĘ CTR1-et kódoló FaCTR1 expressziója a más növényekbĘl izolált CTR1-ekhez hasonlóan konstitutív. Az általunk izolált ACS, ACO és CTR1 gének és promotereinek bioinformatikai elemzése sok új információval járul hozzá a szamóca etilén bioszintézis és jelátviteli folyamatok tisztázásához, de az etilénnek a szamócában betöltött szerepének pontos meghatározásához szükséges az ACC szintáz és oxidáz géncsalád további tagjainak izolálása és expresziós mintázatuk meghatározása, enzimaktivitásuk mérése, promotereik funkcionális vizsgálata. A cDNS-AFLP technika alkalmazásával sikerült azonosítani a szamóca érésére jellemzĘ új géneket, és az utóérĘ gyümölcsökben már leírt, érés indukálta géneket is. Ezek az érési folyamatok közös elemeit képezik. Sikerült elkülöníteni érési stádiumokra, valamint szövettípusra jellemzĘ szamóca géneket. Az izolált klónok között jelen vannak olyan potenciális szabályozó elemek, amelyek egyaránt jellemzĘek klimaktérikus és nem klimaktérikus érésre. Ezek funkcionális elemzése fényt deríthet a nem klimaktérikus érés szabályozásának ismeretlen láncszemeire. A dolgozatban leírt gének egy részének funkcionális elemzése már folyamatban van. A FaSpa fehérje szerepének vizsgálatához, modellnövényként a paradicsomot használjuk, a szamóca transzformációja is folyamatban van szensz és antiszensz konstrukciókkal. A feltételezetten auxin bioszintézisben szerepet játszó FaNit fehérjét dohányban termeltetjük túl, de tényleges enzimaktivitására vonatkozó kísérlet is megfontolandó. A dolgozatban felsorolt gének szekvenciainformációja kiindulásként szolgál a differenciáltan szabályozott gének promotereinek izolálásához, így a zöld, valamint érés specifikusan expresszálódó gének promotereiben közös szabályozó elemek azonosítását teszi lehetĘvé, és ezáltal meghatározható a szamóca érésének átfogó transzkripciós szabályozása.

Összefoglalás

74

6. ÖSSZEFOGLALÁS A dolgozat a termesztett szamóca gyümölcsérésében szerepet játszó új gének azonosítását és érési folyamatainak feltárását célozta meg. Módszerekben és eredményekben két fĘ témakör köré csoportosul. Az elsĘ részben az etilén bioszintézisében és jelátvitelében kulcsszerepet játszó szamóca gének izolálását és jellemzését tĦztük ki célul. Az ACC-szintáz, ACC-oxidáz és CTR1 fehérjéket kódoló részleges génszakaszokat degenerált primerpárokkal szaporítottuk fel RT-PCR-ben. A részleges génszakaszok szekvenciainformációja alapján 5' és 3' RACE technikával sikerült felszaporítani a gének teljes hosszúságú cDNS-ét, ami lehetĘvé tette az ACS és ACO genomi klónjának, valamint az ACS és CTR promotereinek az izolálását. A genomi klónok izolálása PCR-el, a gének UTR-einek végére tervezett primerekkel, a promoterek izolálása pedig TAIL-PCR-el történt. A 1902 bp-nyi FaACS (AY661301) cDNS 138 bp 5’ és 288 bp 3’ UTR által határolt 1476 bp ORF-bĘl áll. A szekvencia génbanki összehasonlítása alapján a szamóca ACS gén, mind nukleotid mind fehérje szinten a legnagyobb homológiát az alma MdACS-5 (AB034993) génjével mutatja. A genomi klón 2582 bp, és más ACS génekhez hasonlóan 3 intront tartalmaz. A FaACS rendelkezik az ACC szintázokra jellemzĘ konzervált aminosavakkal és aktív centrummal, de tényleges enzimatikus aktivitása még bizonyításra szorul. Expresszióját RT-PCR-el vizsgáltuk, gyümölcshúsban csak a zöld stádiumban volt jelen, és a transzkriptum nem akkumulálódik az érés során, de Botrytis cinerea fertĘzéskor az érett gyümölcsben is kimutatható. A TAIL-PCR-el felszaporított FaACS promoter régió hossza 889 bp. Bioinformatikai

megközelítéssel

abiotikus

és

biotikus

stresszválaszban,

auxin

indukálhatóságért felelĘs szabályozó elemeket azonosítottunk. A teljes FaACO (AY706156) cDNS hossza 1235 bp, ebbĘl 963 bp az ORF, 71 bp az 5’ UTR és 201 bp a 3’ UTR. Nukleotid szinten a legnagyobb homológiát az alma ACO génjével (AB086888), fehérje szinten az Ęszibarack (Prunus persica, CAA54449) ACO génnel mutatja. A két intronból és három exonból álló genomi klón szerkezete eltér az adatbázisokban talált teljes hosszúságú ACO genomi klónok többségétĘl, amelyekre a három intronszekvencia a jellemzĘ. Az enzim valamennyi, ACO enzimaktivitáshoz szükséges aminosavat tartalmazza. A FaACO érés során indukált, de a transzkriptum jelen van valamennyi tesztelt szövettípusban. A FaCTR1 esetében RACE technikával meghatároztuk a 2535 bp-nyi ORF-et, és 541 bp 3' UTR-t. A FaCTR1 (AY538771) nukleotid szinten az alma CTR1-el (AY670703),

Összefoglalás

75

fehérje szinten a rózsa (Rosa hybrida) CTR1-el (AAK40361) mutatja a legnagyobb homológiát A FaCTR1 fehérje rendelkezik a szerin/treonin fehérje kinázok valamennyi jellegzetes tulajdonságával, így megtalálható az ATP kötĘ hely (VGAGSFGTV) és a Ser/Thr kináz domén (IVHWDLKSPN). Expressziós mintázata érés során és a többi tesztelt szövettípusban konstitutív. Az izolált CTR1 promoter régió 1590 bp, és olyan szabályozó elemeket tartalmaz mint biotikus és abiotikus stresszválaszért, cirkadián mĦködésért felelĘs régiók, ‘enhancerek’. Az érésben szerepet játszó génexpressziós változások nyomon követésére, az érésben potenciálisan szerepet játszó új gének izolálására cDNS-AFLP-t használtunk. Az általunk használt cDNS-AFLP verziója globális, kvantitatív génexpressziós analízisre alkalmas, segítségével

ritka

mRNS-ek

detektálhatók,

a

technika

így

lehetĘvé

teszi

a

gyümölcsfejlĘdésben és érésben szerepet játszó új gének azonosítását is. A cDNS-AFLP géleken 1403 fragmentumot összegeztünk. Az AFLP-QuantarPro adatok normalizálása után 290 differenciáltan expresszálódó TDF-t találtunk. Ezek a TDF-ek a hierarchikus klaszterelemzéssel három nagy csoportba tömörültek, a legnagyobb csoport a 120 aszmag specifikus fragmentumból áll, a többi transzkriptum a zöld gyümölcshúsban (86 TDF) valamint az érés során akkumulálódik (84 TDF). Az expressziós mintázatuk, valamint a sávok izolálásra való alkalmasságuk alapján (méret, élesség) 130 TDF-et izoláltunk majd szekvenáltunk. A BLAST keresés eredménye alapján valamennyi TDF-et funkcionális kategóriákba soroltuk. A szekvenált TDF-ek többsége (34% az érett gyümölcsben, 47% a zöld gyümölcsben és 50% az aszmagban expresszálódó gének közül) nem mutatott ismert szekvenciákkal homológiát, vagy a homológia értéke alacsonyabb volt a megszabott küszöbértéknél (E < e-0,002). Valamennyi, E < e-0,002 értékkel rendelkezĘ szekvenciát, az NCBI GenBankba elhelyeztük. Mivel a kapott TDF-ek viszonylag rövidek (50-500 bp) és a cDNS 3' végét képviselik, a pontosabb szekvenciainformáció érdekében RACE reakcióval 2 génnek felszaporítottuk az 5' végét, 7 génnek pedig a teljes hosszúságú cDNS-ét. Ezeket a fragmentumokat egyrészt az expressziós mintázatuk másrészt gyümölcsfejlĘdésben és érésben betöltött potenciális funkciójuk miatt választottuk. Az izolált teljes hosszúságú cDNS-ek a következĘ fehérjéket kódolják (zárójelben a szamóca gének neve és GenBank-i hivatkozási száma): a RING finger (FaRingH2, AY679613), nitrilázszerĦ fehérje (FaNit, AY695666), bHLH Arabidopsis-ból izolált SPATULA homológ (FaSpa, AY679615), Hdzip fehérje (FaHd, AY679614), két receptorszerĦ kináz (FaRLK1, AY940166, FaRLK2, AY679612), és egy plazma membrán fehérje (vízcsatorna fehérje) (FaPIP, DQ022749).

76

SUMMARY This thesis aims the identification of novel genes involved in cultivated strawberry ripening and the better understanding the ripening process. It embraces two main subjects worked out with different techniques. In the first part we describe the isolation and characterization of key genes of the ethylene biosynthesis and signalling pathway. We amplified partial sequences of genes encoding ACC synthase, ACC-oxidase and CTR1 in RT-PCR by using degenerate primers. Based on these sequences by using 5' and 3' RACE technique we cloned the full-length cDNAs of these genes what made also possible the isolation of genomic clones of ACS and ACO and the promoter regions of ACS and CTR1. The isolation of genomic clones was done by PCR using primers designed on the UTR regions; ; the the promoters were amplified by TAIL-PCR. The 1902 bp full-length FaACS (AY661301) consists of 138 bp 5’ and 288 bp 3’ UTR surrounding the 1476 bp ORF. Based on similarities with sequences in the database, the strawberry ACS gene shows the highest homology both at nucleotide and protein level with an apple MdACS-5 (AB034993) gene. The genomic clone is 2582 bp long, and similarly to other ACC synthase genes, it is interrupted by 3 introns. FaACS shares all the conservative amino acids and active site characteristic for ACC synthases, but its enzymatic activity remains to be proven. The expression pattern of FaACS was characterized by RT-PCR, in fruit it was present only in the green stage, and it is not accumulating during ripening, but it was shown to be present in ripe fruit infected by Botrytis cinerea. The promoter region of FaACS isolated by TAIL-PCR is 889 bp long. The presence of regulatory elements involved in biotic and abiotic stress- and auxin response was shown by means of bioinformatic tools. The full-length FaACO (AY706156) is 1235 bp, with a 963 bp ORF, a 71 bp 5’ UTR and 201 bp 3’ UTR. On nucleotide level it shows the highest homology with an apple ACO gene (AB086888), on protein level with a peach ACO (Prunus persica, CAA54449). The genomic clone contains two introns apart from the majority of ACO genomic clones found in the databases, which contain 3 introns. The enzyme shows all the conservative amino acids required for ACO activity. The FaACO is ripening induced, but the transcript is present in all the tissue-types tested. In the case of FaCTR1 (AY538771) we could obtain the complete 2535 bp ORF and the 541 bp 3' UTR by RACE. The nucleotide sequence shows homology to CTR1 from apple (AY670703), on protein level the greatest homology is with a CTR1 from Rosa hybrida

77 (AAK40361). Within its protein kinase domain FaCTR1 has a protein kinase ATP-binding signature (IGAGSFGTVH) as well as a serine/threonine protein kinase active site signature (IVHWDLKSPNLLV). The FaCTR1 expression is constitutive during ripening, and in other tissues tested. The amplified upstream region of CTR1 is 1590 bp. Several enhancer elements, regulatory motives responsible for biotic and abiotic stress, circadian control were identified. In a second approach we used an improved version of cDNA-amplified fragment length polymorphism (cDNA-AFLP) technology to isolate genes associated with ripening of strawberry for understanding the processes underlying fruit maturation in this crop and nonclimacteric ripening in general. cDNA-AFLP, allows the detection of rare mRNAs, in this way making possible the identification of novel genes involved in the process of fruit development and ripening. A total of 1403 cDNA-AFLP fragments were screened. After normalization of the AFLP-QuantarPro expression data and selection of differentially expressed genes based on the coefficient of variation (CV) > 1 criterion, 290 TDFs were found differentially regulated. After the hierarchical average linkage clustering of the 290 differentially expressed genes we were able to distinguish three major groups, the largest group is comprised of 120 achene specific TDFs, the rest of the transcripts belong to the green receptacle specific TDFs (86) and to the group of ripening induced transcripts (84 TDFs). 130 TDFs were isolated and sequenced based on their expression pattern and on suitability of the bands for isolation (size, sharpness). Each TDF was assigned to one of the functional categories on the basis of its BLAST search output. Most TDFs (34% in the ripe receptacle, 47% in the green receptacle and 50% in the achene tissue) did not show any homology to sequences with known functions, or their hits were below an E < e-0.002. All sequences obtained with hits of E < e-0.002 were submitted to NCBI GenBank. As the TDSs are rather short and represent the 3' end of the cDNA we performed 5' RACE for 2 genes and 5' and 3' for 7 RACE to get more precise sequence information. These fragments were selected based on their expression pattern, and also based on the function of their homologues with a potential role in fruit growth, development and ripening. The 7 full length cDNAs encode the following proteins (the strawberry gene names and GenBank accession number in brackets): a RING finger (FaRingH2, AY679613), a nitrilase like protein (FaNit, AY695666), a bHLH, homolog of SPATULA from Arabidopsis (FaSpa, AY679615), a Hdzip protein (FaHd, AY679614), two receptor-like kinase proteins (FaRLK1, AY940166, FaRLK2, AY679612), and a plasma membrane intrinsic protein (FaPIP, DQ022749).

78

Irodalomjegyzék

7. IRODALOMJEGYZÉK Abe H, Urao T, Ito T, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2003) Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell, 15: 63-78 Abel S, Nguyen MD, Chow W, Theologis A (1995) ACS4 a primary indoleacetic acidresponsive gene encoding 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase in Arabidopsis thaliana. Structural characterization, expression in Escherichia coli, and expression characteristics in response to auxin. J Biol Chem, 270: 19093–19099 Abeles FB, Morgan PW, Saltveit ME Jr (1992) Ethylene in Plant Biology. San Diego, CA: Academic Press, 414 p. Adams Phillips L, Barry C, Kannan P, Leclercq J, Bouzayen M, Giovannoni J (2004) Evidence that CTR1-mediated ethylene signal transduction in tomato is encoded by a multigene family whose members display distinct regulatory features. Plant Mol Biol, 54: 387-404 Adams Phillips L, Barry C, Giovannoni J (2004) Signal tranduction systems regulating fruit ripening. Trends Plant Sci, 9: 331-338 Agius F, Gonzalez-Lamothe R, Caballero JL, Munoz-Blanco J, Botella MA, Valpuesta V. 2003 Engineering increased vitamin C levels in plants by overexpression of a Dgalacturonic acid reductase. Nat Biotechnol, 21: 177-181 Aharoni A, O’Connell AP (2002) Gene expression analysis of strawberry achene and receptacle maturation using DNA microarrays. J Exp Bot, 53: 2073-2087 Aharoni A, Keizer LCP, Bouwmeester HJ, Sun Z, Alvarez-Huerta M, Harrie A, Verhoeven HA, Blaas J van Houwelingen AMML, De Vos RCH, van der Voet H, Jansen RC, Guis M, Mol J, Davis RW, Schena M, van Tunen AJ, O'Connell AP (2000) Identification of the SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays. Plant Cell, 12: 647-662 Aharoni A, De Vos CH, Wein M, Sun Z, Greco R, Kroon A, Mol JN, O'Connell AP (2001) The strawberry FaMYB1 transcription factor suppresses anthocyanin and flavonol accumulation in transgenic tobacco. Plant J, 28: 319-332 Aharoni A, Keizer LCP, Van Den Broeck HC, Blanco-Portales R, Munoz-Blanco J, Bois G, Smit P, De Vos RCH, O’Connell AP (2002) Novel insight into vascular, stress, and auxin-dependent and independent gene expression programs in strawberry, a non-climacteric fruit. Plant Physiol, 129: 1019-1031 Alba R, Fei Z, Payton P, Liu Y, Moore SL, Debbie P, Cohn J, D'Ascenzo M, Gordon JS, Rose JK, Martin G, Tanksley SD, Bouzayen M, Jahn MM, Giovannoni J (2004) ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for disecting plant physiology and development. Plant J, 39: 697-714 Alonso JM, Chamaro J, Granell A (1995) Evidence for the involvement of ethylene in the expression of specific RNAs during maturation of the orange, a non-climacteric fruit. Plant Mol Biol, 29: 385-390 Alvarez J, Smyth DR (1999) CRABS CLAW and SPATULA: two Arabidopsis genes that control carpel development in parallel with AGAMOUS. Development, 126: 2377-2386 Archbold DD, Dennis FG Jr (1984) Quantification of free ABA and free and conjugated IAA in strawberry achene and receptacle tissue during fruit development. J Am Soc Hort Sci, 109: 330-335 Balogh A, Koncz T, Tisza V, Kiss E, Heszky L (2005a) Identification of ripeningrelated genes in strawberry fruit by cDNA-AFLP. Int J Hort Sci, 11: 33-41

79

Irodalomjegyzék

Balogh A, Koncz T, Tisza V, Kiss E, Heszky L (2005b) The effect of 1-MCP on the expression of several ripening-related genes in strawberries. HortScience, 40: 2088-2090 Balogh A, Koncz T, Tisza V, Kiss E, Heszky L (2005c) Szamóca gyümölcsfejlĘdésében és érésében szerepet játszó gének és promotereik izolálása. Kertgazdaság, különszám: 105-110 Barry CS, Llop-Tous MI, Grierson D (2000) The regulation of 1-aminocyclopropane1-carboxylic acid synthase gene expression during the transition from system-1 to system-2 ethylene synthesis in tomato. Plant Physiol, 123: 979-986 Beekwilder J, Alvarez-Huerta M, Neef E, Verstappen WAF, Bouwmeester HJ, Aharoni A (2004) Functional characterization of enzymes forming volatile esters from strawberry and banana. Plant Physiol, 135: 1865-1888 Benítez-Burraco A, Blanco-Portales R, Redondo-Nevado J, Bellido ML, Moyano E, Caballero JL, Munoz-Blanco J (2003) Cloning and characterization of two ripening-related strawberry (Fragaria x ananassa cv. Chandler) pectate lyase genes. J Exp Bot, 54: 633-645 Blankenship SM, Dole JM (2003) 1-Methylcyclopropene: a review. Postharvest Biol Technol, 28: 1-25 Blanco-Portales R, Lopez-Raez JA, Bellido ML, Moyano E, Dorado G, GonzalezReyes JA, Caballero JL, Munoz-Blanco J (2004) A strawberry fruit-specific and ripeningrelated gene codes for a HyPRP protein involved in polyphenol anchoring. Plant Mol Biol, 55: 763-780 Borden KL (2000) RING domains: master builders of molecular scaffolds? J Mol Biol, 295: 1103-1112 Borisjuk N, Sitailo L, Adler K, Malysheva L, Tewes A, Borisjuk L, Manteuffel R (1998) Calreticulin expression in plant cells: developmental regulation, tissue specificity and intracellular distribution. Planta, 206: 504-514 Borner GH, Lilley KS, Stevens TJ, Dupree P (2003) Identification of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in Arabidopsis. A proteomic and genomic analysis. Plant Physiol, 132: 568-577 Botella JR, Schlagnhaufer CD, Arteca JM, Arteca RN, Phillips AT (1993) Identification of two new members of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthaseencoding multigene family in mung bean. Gene, 123: 249-253 Bots M, Vergeldt F, Wolters-Arts M, Weterings K, van As H, Mariani C (2005) Aquaporins of the PIP2 class are required for efficient anther dehiscence in tobacco. Plant Physiol. 137: 1049-1056 Breyne P, Dreesen R, Cannoot B, Rombaut D, Vandepoele K, Rombauts S, Vanderhaeghen R, Inzé D, Zabeau M (2003) Quantitative cDNA-AFLP analysis for genomewide expression studies. Mol Gen Genomics, 269: 173-179 Busk PK, Jensen AB, Pages M. (1997) Regulatory elements in vivo in the promoter of the abscisic acid responsive gene rab17 from maize. Plant J, 11: 1285-1295 Busturia A, Lloyd A, Bejarano F, Zavortink M, Xin H, Sakonju S (2001) The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleiohomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. Development, 128: 2163–2173 Camacho P, Lechleiter JD (1995) Calreticulin inhibits repetitive intracellular Ca2+ waves. Cell, 82: 765-771 Castillejo C de la Fuente JI, Iannetta P, Botella MA, Valpuesta V (2004) Pectin esterase gene family in strawberry fruit: study of FaPE1, a ripening-specific isoform. J Exp Bot, 55: 909-918 Cazzonelli CI, Cavallaro AS, Botella JR (1998) Cloning and characterization of ripening-induced ethylene biosynthetic genes from non-climacteric pineapple (Ananas comosus) fruits. Austr J Plant Physiol, 25: 513-518

80

Irodalomjegyzék

Chae HS, Cho YG, Park MY, Lee MC, Eun MY, Kang BG, Kim WT (2000) Hormonal cross-talk between auxin and ethylene differentially regulates the expression of two members of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase gene family in rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Physiol, 41: 354-362 Chervin C, El-Kereamy A, Roustan JP, Latché A, Lamon J, Bouzayen M (2004) Ethylene seems required for the berry development and ripening in grape, a non-climacteric fruit. Plant Sci, 167: 1301-1305 Civello PM, Powell ALT, Sabehat A, Bennett AB (1999) An expansin gene Expressed in ripening strawberry fruit. Plant Physiol, 121: 1273-1279 Clark SE, Jacobsen SE, Levin JZ, Meyerowitz EM (1997) The CLAVATA and SHOOT MERISTEMLESS loci competitively regulate meristem activity in Arabidopsis. Development, 122: 1567-75 Clendennen SK, May GD (1997) Differential gene expression in ripening banana fruit. Plant Physiol, 115: 463-469 Cobbett CS (2000) Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification. Plant Physiol, 123: 825-832 Davies C, Robinson SP (2000) Differential screening indicates a dramatic change in mRNA profiles during grape berry ripening. Cloning and characterization of cDNAs encoding putative cell wall and stress response proteins. Plant Physiol, 122: 803-812 Destefano-Beltran LJ, van Caeneghem W, Gielen J, Richard L, van Montagu M, van der Straeten D (1995) Characterization of three members of the ACC synthase gene family in Solanum tuberosum L. Mol Gen Genet, 246: 496-508 Dunn MA, White AJ, Vural S, Hughes MA (1998) Identification of promoter elements in a low-temperature-responsive gene (blt4.9) from barley (Hordeum vulgare L.). Plant Mol Biol, 38: 551-564 Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D (1998) Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 14863-14868 El-Kereamy A, Chervin C, Roustan JP, Cheynier V, Souquet JM, Moutounet M, Raynal MJ, Ford C, Latché A, Pech JC, Bouzayen M (2003) Exogenous ethylene stimulates the long-term expression of genes related to anthocyanin biosynthesis in grape berries. Physiol Plant, 119: 175-182 El-Sharkawy I, Jones B, Li ZG, Lelievre JM, Pech JC, Latché A (2003) Isolation and characterization of four ethylene perception elements and their expression during ripening in pears (Pyrus communis L.) with/without cold requirement. J Exp Bot, 54: 1615-1625 El-Sharkawy I, Jones B, Gentzbittel L, Lelievre JM, Pech JC, Latche A (2004) Differential regulation of ACC synthase genes in cold-dependent and -independent ripening in pear fruit. Plant Cell Environ, 27: 1197-1210 Eulgem T, Rushton PJ, Schmelzer E, Hahlbrock K, Somssich IE (1999) Early nuclear events in plant defence signalling: rapid gene activation by WRKY transcription factors. EMBO J, 18: 4689-4699 Fan L, Zheng S, Wang X (1997) Antisense supression of phospholipase D retards abscisic acid- and ethylene-promoted senescence of postharvest Arabidopsis leaves. Plant Cell, 9: 2183-2196 Fan J, Quan S, Orth T, Awai C, Chory J, Hu J (2005) The Arabidopsis PEX12 gene is required for peroxisome biogenesis and is essential for development. Plant Physiol, 139: 231239 Fei Z, Tang X, Alba RM, White JA, Ronning CM, Martin GB, Tanksley SD, Giovannoni JJ (2004) Comprehensive EST analysis of tomato and comparative genomics of fruit ripening. Plant J, 40: 47-59

81

Irodalomjegyzék

Ferrie BJ, Beaudoin N, Burkhart W, Bowsher CG, Rothstein SJ (1994) The cloning of two tomato lipoxygenase genes and their differential expression during fruit ripening. Plant Physiol, 106: 109-118 Folta KM, Staton M, Stewart PJ, Jung S, Bies DH, Jesdurai C, Main D (2005) Expressed sequence tags (ESTs) and simple sequence repeat (SSR) markers from octoploid strawberry (Fragaria × ananassa) BMC Plant Biol, 5: 12. http://www.biomedcentral.com/1471-2229/5/12 Frank W, Munnik T, Kerkmann K, Salamini F, Bartels D (2000) Water deficit triggers phospholipase D activity in the resurrection plant Craterostigma plantagineum. Plant Cell, 12: 111-124 Freemont PS (2000) RING for destruction?. Curr Biol, 10: R84-R87 Freemont PS, Hanson IM, Trowsdale J (1991) A novel cysteine-rich sequence motif. Cell, 64: 483-484 Gao Z, Chen YF, Randlett MD, Zhao XC, Findell JL, Kieber JJ, Schaller GE (2003) Localization of the Raf-like kinase CTR1 to the endoplasmic reticulum of Arabidopsis through participation in ethylene receptor signaling complexes. J Biol Chem, 278: 3472534732 Giovannoni JJ (2004) Genetic regulation of fruit development and ripening. Plant Cell, 16 Suppl: 170-180 Given NK, Venis MA, Grierson D (1988) Hormonal regulation of ripening in the strawberry, a non-climacteric fruit. Planta, 17: 402-406 Goldschmidt EE, Huberman M, Goren R (1993) Probing the role of endogenous ethylene in the degreening of citrus fruits with ethylene antagonists. Plant Growth Regulators, 12: 325-329. Gomez-Gomez L, Boller T (2000) FLS2: an LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Mol Cell, 5: 1003-1011 Goodrich J, Carpenter R, Coen ES (1992) A common gene regulates pigmentation pattern in diverse plant species. Cell, 68: 955-964 Gosti F, Beaudoin N, Serizet C, Webb AAR, Vartanian N, Giraudat J (1999) ABI1 protein phosphatase 2C is a negative regulator of abscisic acid signaling. Plant Cell, 11: 1897–1909 Hanson IM, Poustka A, Trowsdale J (1991) New genes in the class II region of the human major histocompatibility complex. Genomics, 10: 417-24 Hanson J, Johannesson H, Engstrom P (2001) Sugar-dependent alterations in cotyledon and leaf development in transgenic plants expressing the HDZhdip gene ATHB13. Plant Mol Biol, 45: 247-262 Hanson J, Regan S, Engström P (2002) The expression pattern of the homeobox gene ATHB13 reveals a conservation of transcriptional regulatory mechanisms between Arabidopsis and hybrid aspen. Plant Cell Rep, 21: 81-89 Harada T, Sunako T, Sakuraba W, Goto S, Akada S, Senda M, Ishikawa R, Niizeki M (1997) Genomic nucleotide sequence of a ripening-related 1-aminocyclopropane-1carboxylate synthase gene (MdACS-1) in apple (Accession No. U89156) (PGR97-066). Plant Physiol, 113: 1465 Haralampidis K, Milioni D, Rigas S, Hatzopoulos P (2002) Combinatorial interaction of cis elements specifies the expression of the Arabidopsis AtHsp90-1 gene. Plant Physiol, 129: 1138-1149 Harpster MH, Brummell DA, Dunsmuir P (1998) Expression analysis of a ripeningspecific, auxin-repressed endo-1,4-beta-glucanase gene in strawberry. Plant Physiol, 118: 1307-1316

82

Irodalomjegyzék

Harrison EP, McQueen-Mason SJ, Manning K (2001) Expression of six expansin genes in relation to extension activity in developing strawberry fruit. J Exp Bot, 52: 14371446 Heisler MG, Atkinson A, Bylstra YH, Walsh R, Smyth DR (2001) SPATULA, a gene that controls development of carpel margin tissues in Arabidopsis, encodes a bHLH protein. Development, 128: 1089-1098 Henskens JA, Rouwendal GJ, ten Have A, Woltering EJ (1994) Molecular cloning of two different ACC synthase PCR fragments in carnation flowers and organ-specific expression of the corresponding genes. Plant Mol Biol, 26: 453-458 Henriksson E, Olsson AS, Johannesson H, Johansson H, Hanson J, Engstrom P, Soderman E (2005) Homeodomain leucine zipper class I genes in Arabidopsis. Expression patterns and phylogenetic relationships. Plant Physiol, 139: 509-518 Higo K, Ugawa Y, Iwamoto M, Korenaga T (1999) Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database. Nucleic Acids Res, 27: 297-300 Hillebrand H, Bartling D, Weiler E-W (1998) Structural analysis of the NIT2/NIT1/NIT3 gene cluster encoding nitrilases, enzymes catalyzing the terminal activation step in indole-acetic acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol, 36: 89-99 Hirayama T, Ugajin T (2003) Molecular mechanism of ethylene perception and signal transduction. Gamma Field Symposia nr 42, Plant Hormone Research and Mutation. 91-53 Holdsworth MJ, Schuch W, Grierson D (1988) Organization and expression of a wound/ripening-related small multi-gene family from tomato. Plant Mol Biol, 11: 81–88 Hu CG, Hao YJ, Honda C, Kita M, Moriguchi T (2003) Putative PIP1 genes isolated from apple: expression analyses during fruit development and under osmotic stress. J Exp Bot, 54: 2193-2194 Hua J, Meyerowitz EM (1998) Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis thaliana. Cell, 94: 261-271 Huang PL, Parks JE, Rottmann WH, Theologis A (1991) Two genes encoding 1aminocyclopropane-1-carboxylate synthase in zucchini (Cucurbita pepo) are clustered and similar but differentially regulated. Proc Natl Acad Sci USA, 88: 7021-7025 Huang Y, Li H, Hutchison C, Laskey J, Kieber JJ (2003) Biochemical and functional analysis of CTR1, a protein kinase that negatively regulates ethylene signaling in Arabidopsis. Plant J, 33: 221-233 Hwang ES, Bowen PE (2002) Can the consumption of tomatoes or lycopene reduce cancer risk? Integr Cancer Ther, 1: 121-132 Itzhaki H, Maxson JM, Woodson WR (1994) An ethylene-responsive enhancer element is involved in the senescence-related expression of the carnation glutathione-Stransferase (GST1) gene. Proc Natl Acad Sci USA, 91: 8925-8929 Jenes B, Moore H, Cao J, Zhang W, Wu R (1992) Techniques for gene transfer. In: Transgenic Plants, (Kung SD and Wu R eds.) Academic Press, Inc., San Diego, California, pp 125-146 Jensen RB, Jensen KL, Jespersen HM, Skriver K (1998) Widespread occurence of a highly conserved RING-H2 zinc finger motif in the model plant Arabidopsis thaliana. FEBS Letters, 436: 283-287 Jiang Y, Joyce DC, Terry LA (2001) 1-Methylcyclopropene treatment affects strawberry fruit decay. Postharvest Biol Technol, 23: 227-232 Kasukabe Y, He L, Nada K, Misawa S, Ihara I, Tachibana S (2004) Overexpression of spermidine synthase enhances tolerance to multiple environmental stresses and up-regulates the expression of various stress-regulated genes in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol, 45: 712-722

83

Irodalomjegyzék

Kawagoe Y, Murai N (1996) A novel basic region/helix-loop-helix protein binds to a G-box motif CACGTG of the bean storage protein E-phaseolin gene. Plant Sci, 116: 47-57 Kende H (1993) Ethylene biosynthesis. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 44: 283-307 Kieber JJ, Rothemberg M, Roman G, Feldmann KA, Ecker JR (1993) CTR1, a negative regulator of the ethylene response pathway in Arabidopsis, encodes a member of the Raf family of the protein kinases. Cell, 72: 427–441 Kim IJ, Chung WI (1998) Molecular characterization of a cytosolic ascorbate peroxidase in strawberry fruit. Plant Sci, 133: 69–77 Kobayashi Y, Yamamoto S, Minami H, Kagaya Y, Hattori T (2004) Differential activation of the rice sucrose nonfermenting1-related protein kinase2 family by hyperosmotic stress and abscisic acid. Plant Cell, 16: 1163-1177 Kosarev P, Mayer KFX, Hardtke CS (2002) Evaluation and classification of RINGfinger domains encoded by the Arabidopsis genome. Genome Biol, 3: 1-12 Kozaki A, Hake S, Colasanti J (2004) The maize ID1 flowering time regulator is a zinc finger protein with novel DNA binding properties. Nucleic Acids Res, 32: 1710-1720 Ku VVV, Willis RBH, Ben-Yehoshua S (1999) 1-Methylcyclopropene can differentially affect the postharvest life of strawberries exposed to ethylene. HortScience, 34: 119-120 Kubo H, Peeters AJ, Aarts MG, Pereira A, Koornneef M (1999) ANTHOCYANINLESS2, a homeobox gene affecting anthocyanin distribution and root development in Arabidopsis. Plant Cell, 11: 1217-1226 Lashbrook CC, Tieman DM, Klee HJ (1998) Differential regulation of the tomato ETR gene family throughout plant development. Plant J, 15: 243-252 Lasserre E, Bouquin T, Hernandez JA, Bull J, Pech JC, Balague C (1996) Structure and expression of three genes encoding ACC oxidase homologs from melon (Cucumis melo). Mol Gen Genet, 251: 81-90 Lay-Yee M, Knighton ML (1995) A full-length cDNA encoding 1aminocyclopropane-1-carboxylate synthase from apple. Plant Physiol, 107: 1017-1018 Lechner E, Xie D, Grava S, Pigaglio E, Planchais S, Murray J, Parmentier Y, Mutterer J, Bureucq B, Shen WH (2002) The AtRbx1 protein is part of plant SCF complexes and its down-regulation causes severe growth and developmental defects. J Biol Chem, 277: 50069– 50080 Lee KO, Jang HH, Jung BG, Chi YH, Lee JY, Choi YO, Lee JR, Lim CO, Cho MJ, Lee SY (2000) Rice 1-Cys-peroxiredoxin over-expressed in transgenic tobacco does not maintain dormancy but enhances antioxidant activity. FEBS Lett, 486: 103-106 Lelièvre JM, Latche A, Jones B, Bouzayen M, Pech JC (1997) Ethylene and fruit ripening. Physiol Plant, 101: 727-739 Letunic I, Copley RR, Schmidt S, Ciccarelli FD, Doerks T, Schultz J, Ponting CP, Bork P (2004) SMART 4.0: towards genomic data integration Nucleic Acids Res, 32: 142-144 Leung J, Merlot S, Giraudat J (1997) The Arabidopsis ABSCISIC ACIDINSENSITIVE2 (ABI2) and ABI1 genes encode homologous protein phosphatases 2C involved in abscisic acid signal transduction. Plant Cell, 9: 759–771 Lewis ML, Miki K, Ueda T (2000) FePer 1, a gene encoding an evolutionarily conserved 1-Cys peroxiredoxin in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench), is expressed in a seed-specific manner and induced during seed germination. Gene, 246: 81-91 Li J, Chory J (1997) A putative leucine-rich repeat receptor kinase involved in brassinosteroid signal transduction. Cell, 90: 929-38

84

Irodalomjegyzék

Li Z, Komatsu S (2000) Molecular cloning and characterization of calreticulin, a calcium-binding protein involved in the regeneration of rice cultured suspension cells. Eur J Biochem, 267: 737-745 Liang XS, Abel JA, Keller NF, Shen, Theologis A (1992) The 1-aminocyclopropane1-carboxylate synthase gene family of Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 11046–11050 Liang XY, Oono NF, Shen C, Kohler K, Li P, Scolnik A, Theologis A (1995) Characterization of two members (ACS1 and ACS3) of the 1-aminocyclopropane-1carboxylate synthase gene family of Arabidopsis thaliana. Gene, 167: 17-24 Liu Y, Roof S, Ye Z, Barry C, van Tuinen A, Vrebalov J, Bowler C, Giovannoni J (2004) Manipulation of light signal transduction as a means of modifying fruit nutritional quality in tomato. Proc Natl Acad Sci USA, 101: 9897-9902 Llop-Tous I, Dopercguez-Puigjaner E, Palomer X, Vendrell M (1999) Characterization of two divergent endo-beta-1,4-glucanase cDNA clones highly expressed in the nonclimacteric strawberry fruit. Plant Physiol, 119: 1415-1422 Lunkenbein S, Bellido M, Aharoni A, Salentijn EM, Kaldenhoff R, Coiner HA, Munoz-Blanco J, Schwab W (2006) Cinnamate metabolism in ripening fruit: Characterization of an UDP-glucose: cinnamate glucosyltransferase from strawberry (Fragaria x ananassa). Plant Physiol, Epub 0: 105074955 Ma QH, Wang XM (2003) Characterization of an ethylene receptor homologue from wheat and its expression during leaf senescence. J Exp Bot, 54: 1489-1490 Manning K (1994) Changes in gene expression during strawberry fruit ripening and their regulation by auxin. Planta, 194: 62-68 Manning K (1998) Isolation of a set of ripening-related genes from strawberry: their identification and possible relationship to fruit quality traits. Planta, 205: 622-631 Martinez GA, Chaves AR, Civello PM (2004) beta-xylosidase activity and expression of a beta-xylosidase gene during strawberry fruit ripening. Plant Physiol Biochem, 42:89-96 Martinez M, Abraham Z, Gambardella M, Echaide M, Carbonero P, Diaz I (2005) The strawberry gene Cyf1 encodes a phytocystatin with antifungal properties. J Exp Bot, 56: 1821-1829 Maurel C, Javot H, Lauvergeat V, Gerbeau P, Tournaire C, Santoni V, Heyes J (2002) Molecular physiology of aquaporins in plants. Int Rev Cytol, 215: 105–148 McCarthy DL, Capitani G, Feng L, Gruetter MG, Kirsch JF (2001) Glutamate 47 in 1aminocyclopropane-1-carboxylate synthase is a major specificity determinant. Biochemistry, 40: 12276-12284 McConnell JR, Emery J, Eshed Y, Bao N, Bowman J, Barton MK (2001) Role of PHABULOSA and PHAVOLUTA in determining radial patterning in shoots. Nature, 411: 709-713 Medina-Escobar N, Cárdenas J, Moyano E, Caballero JL, MuĔoz-Blanco J (1997) Cloning molecular characterisation and expression pattern of a strawberry ripening-specific cDNA with sequence homology to pectate lyase from higher plants. Plant Mol Biol, 34: 867– 877 Michiels A, Tucker M, Van Den Ende W, Van Laere A (2003) Chromosomal walking of flanking regions from short known sequences in GC-rich plant genomic DNA. Plant Mol Biol Rep, 21: 295-302 Mohanty B, Krishnan SP, Swarup S, Bajic VB (2005) Detection and preliminary analysis of motifs in promoters of anaerobically induced genes of different plant species. Ann Bot, 96: 669-681 Molnar G, Bancos S, Nagy F, Szekeres M (2002) Characterisation of BRH1, a brassinosteroid-responsive RING-H2 gene from Arabidopsis thaliana. Planta, 215: 127-133

85

Irodalomjegyzék

Moyle R, Fairbairn DJ, Ripi J, Crowe M, Botella JB (2005) Developing pineapple fruit has a small transcriptome domainated by metallothionein. J Exp Bot, 56: 101-112 Munnik T, Irvine RF, Musgrave A (1998) Phospholipid signalling in plants. Biochim Biophys Acta, 1389: 222-272 Munnik T, Meijer HJ, Riet TB, Hirt H, Frank W, Bartels D, Musgrave A (2000) Hyperosmotic stress stimulates phospholipase D activity and elevates the levels of phosphatidic acid and diacylglycerol pyrophosphate. Plant J, 22: 147-154 Mustilli AC, Fenzi F, Ciliento R, Alfano F, Bowler C (1999) Phenotype of the tomato high pigment-2 mutant is caused by a mutation in the tomato homolog of DEETIOLATED1. Plant Cell, 11: 145-157 Müller R, Stummann BM, Serek M (2000) Characterization of an ethylene receptor family with differential expression in rose (Rosa hybrida L.) flowers. Plant Cell Rep, 19: 1232-1239 Nakatsuka A, Murachi S, Okunishi H, Shiomi S, Nakano R, Kubo Y, Inaba A (1998) Differential expression and internal feedback regulation of 1-aminocyclopropane-1carboxylate synthase, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase, and ethylene receptor genes in tomato fruit during development and ripening. Plant Physiol, 118: 1295-1305 Nam YW, Tichit L, Leperlier M, Cuerq B, Marty I, Lelievre JM (1999) Isolation and characterization of mRNAs differentially expressed during ripening of wild strawberry (Fragaria vesca L.) fruits. Plant Mol Biol, 39: 629-636 Nitsch JP (1950) Growth and morphogenesis of the strawberry as related to auxin. Amer J Bot, 37: 211-215 Ogawa M, Hanada A, Yamauchi Y, Kuwahara A, Kamiya Y, Yamaguchi S (2003) Gibberellin biosynthesis and response during Arabidopsis seed germination. Plant Cell,15: 1591-1604 Overmyer K, Tuominen H, Kettunen R, Betz C, Langebartels C, Sandermann H, Kangasjärvi J (2000) Ozone-sensitive Arabidopsis rcd1 mutant reveals opposite roles for ethylene and jasmonate signaling pathways in regulating superoxide-dependent cell death. Plant Cell, 12: 1849–1862 Papadopoulou K, Melton RE, Leggett M, Daniels MJ, Osbourn AE (1999) Compromised disease resistance in saponin-deficient plants. Proc Natl Acad Sci USA, 96: 12923-12928 Papp J. és Porpáczy A. (1999) Szamóca, málna. BogyósgyümölcsĦek I. MezĘgazda Kiadó, Budapest, 231 p. Park WJ, Kriechbaumer V, Moller A, Piotrowski M, Meeley RB, Gierl A, Glawischnig E (2003) The nitrilase ZmNIT2 converts indole-3-acetonitrile to indole-3-acetic acid. Plant Physiol, 133: 794-802 Park HC, Kim ML, Kang YH, Jeon JM, Yoo JH, Kim MC, Park CY, Jeong JC, Moon BC, Lee JH, Yoon HW, Lee SH, Chung WS, Lim CO, Lee SY, Hong JC, Cho MJ (2004) Pathogen- and NaCl-induced expression of the SCaM-4 promoter is mediated in part by a GT1 box that interacts with a GT-1-like transcription factor. Plant Physiol, 135: 2150-2161 Patel S, Latterich M (1998) The AAA team: related ATPases with diverse functions. Trends Cell Biol, 8: 65-71 Pauli S, Rothnie HM, Chen G, He X, Hohn T (2004) The cauliflower mosaic virus 35S promoter extends into the transcribed region. J Virol, 78: 12120-12128 Perkins-Veazie PM, Huber DJ, Brecht JK (1996) In vitro growth and ripening of strawberry fruit in the presence of ACC, STS or propylene. Ann Appl Biol, 128: 105-116 Persson S, Rosenquist M, Svensson K, Galvão R, Boss WF, Sommarin M (2003) Phylogenetic analyses and expression studies reveal two distinct groups of calreticulin isoforms in higher plants. Plant Physiol, 133: 1385-1396

86

Irodalomjegyzék

Piechulla B, Merforth N, Rudolph B (1998) Identification of tomato Lhc promoter regions necessary for circadian expression. Plant Mol Biol, 38: 655-662 Prescott AG, John P (1996) DIOXYGENASES: Molecular structure and role in plant metabolism. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 47: 245-271 Prigge MJ, Wagner DR (2001) The Arabidopsis SERRATE gene encodes a zinc-Finger protein required for normal shoot development. Plant Cell, 13: 1263-1280 Ray A, Robinson-Beers K, Ray S, Baker SC, Lang JD, Preuss D, Milligan SB, Gasser CS (1994) Arabidopsis floral homeotic gene BELL (BEL1) controls ovule development through negative regulation of AGAMOUS gene (AG). Proc Natl Acad Sci USA, 91: 57615765 Raz V, Ecker JR (1999) Regulation of differential growth in the apical hook of Arabidopsis. Development, 126: 3661-3668 Reid SJ, Ross GS (1997) Up-regulation of two cDNA clones encoding metallothionein-like proteins in apple fruit during cool storage. Physiol Plant, 100: 183-189 Roberts DM, Harmon AC (1992) Calcium-modulated proteins: targets of intracellular calcium signals in higher plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 43: 375–414 Rodrigues-Pousada RA, De Rycke R, Dedonder A, Van Caeneghem W, Engler G, Van Montagu M, Van Der Straeten D (1993) The Arabidopsis 1-aminocyclopropane-1carboxylate synthase gene 1 is expressed during early development. Plant Cell, 5: 897-911 Rogiers SY, Kumar GNM, Knowles NR. (1998) Maturation and ripening of fruit of Amelanchier alnifolia Nutt. are accompanied by increasing oxidative stress. Ann Bot, 81: 203211 Rombauts S, Dehais P, Van Montagu P, Rouze P (1999) PlantCARE. a plant cisacting regulatory element database. Nucleic Acids Res, 27: 295-296 Rosenfield CL, Kiss E, Hrazdina G (1996) Md-ACS-2 and Md-ACS3: Two new 1aminocyclopropane-1-carboxylate-synthase in ripening apple fruit. Plant Gene Register PGR96-122. Plant Physiol, 112: 1735 Rosin FM, Aharoni A, Salentijn EMJ, Schaart JG, Boone JM, Hannapel DJ (2003) Expression patterns of a putative homolog of AGAMOUS, STAG1, from strawberry. Plant Sci, 165: 959-968 Rottmann WH, Peter GF, Oeller PW, Keller JA, Shen NF, Nagy BP, Taylor LP, Campbell AD, Theologis A (1991) 1-Aminocyclopropane-1-carboxylate synthase in tomato Is encoded by a multigene family whose transcription is induced during fruit and floral Senescence. J Mol Biol, 222: 937-961 Salzman RA, Fujita T, Zhu-Salzman K, Hasegawa PM, Bressan RA (1999) An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep, 17: 11-17 Samach A. Onouchi H. Gold SE, Ditta GS, Schwarz-Sommer Z, Yanofsky MF, Coupland G (2000) Distinct roles of CONSTANS target genes in reproductive development of Arabidopsis. Science, 288: 1613-1616 Santi L, Wang Y, Stile MR, Berendzen K, Wanke D, Roig C, Pozzi C, Muller K, Muller J, Rohde W, Salamini F (2003) The GA octodinucleotide repeat binding factor BBR participates in the transcriptional regulation of the homeobox gene Bkn3. Plant J, 34: 813-826 Scheer JM, Ryan CA Jr (2002) The systemin receptor SR160 from Lycopersicon peruvianum is a member of the LRR receptor kinase family. Proc Natl Acad Sci USA, 99: 9585-9590 Schenk PW, Snaar-Jagalska BE (1999) Signal perception and transduction: the role of protein kinases. Biochim Biophys Acta, 1449: 1-24

87

Irodalomjegyzék

Shiu OY, Oetiker JH, Yip WK, Yang SF (1998) The promoter of LE-ACS7, an early flooding-induced 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene of the tomato, is tagged by a Sol3 transposon Proc Natl Acad Sci USA, 95: 10334-10339 Shiu SH, Karlowski WM, Pan R, Tzeng YH, Mayer KFX, Li WH (2004) Comparative analysis of the receptor-like kinase family in Arabidopsis and rice. Plant Cell, 16: 1220-1234 Siefritz F, Tyree MT, Lovisolo C, Schubert A, Kaldenhoff R (2002) PIP1 plasma membrane aquaporins in tobacco: from cellular effects to function in plants. Plant Cell, 14: 869–876 Simpson SD, Nakashima K, Narusaka Y, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2003) Two different novel cis-acting elements of erd1, a clpA homologous Arabidopsis gene function in induction by dehydration stress and dark-induced senescence. Plant J, 33: 259-270 Sisler EC, Serek M (1997) Inhibitors of ethylene responses in plants at the receptor level: recent developments. Physiol Plant, 100: 577-582 Sisler EC, Dupille E, Serek M (1996) Effect of 1-methylcyclopropene and methylenecyclopropane on ethylene binding and ethylene action on cut carnation. Plant Growth Regul, 18: 79-86 Smith JM, Arteca RN (2000) Molecular control of ethylene production by cyanide in Arabidopsis thaliana. Physiol Plant, 109: 180–187 Soeller WC, Poole SJ, Kornberg T (1988) In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev, 2: 68-81 Soeller WC, Oh CE, Kornberg TB (1993) Isolation of cDNAs encoding the Drosophila GAGA transcription factor. Mol Cell Biol, 13: 7961–7970 Song WY, Wang GL, Chen LL, Kim HS, Pi LY, Holsten T, Gardner J, Wang B, Zhai WX, Zhu LH, Fauquet C, Ronald P (1995) A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21. Science, 270:1804-1806 Sonnhammer EL, Eddy SR, Birney E, Bateman A, Durbin R (1998) Pfam: multiple sequence alignments and HMM-profiles of protein domains. Nucleic Acids Res, 26: 320-322 Spolaore SL, Trainotti A, Pavanello Casadoro G (2003) Isolation and promoter analysis of two genes encoding different endo-beta-1,4-glucanases in the non-climacteric strawberry. J Exp Bot, 54: 271-277 Stacy RA, Munthe E, Steinum T, Sharma B, Aalen RB (1996) A peroxiredoxin antioxidant is encoded by a dormancy-related gene, Per1, expressed during late development in the aleurone and embryo of barley grains. Plant Mol Biol, 31: 1205-1216 Stalberg K, Ellerstom M, Ezcurra I, Ablov S, Rask L (1996) Disruption of an overlapping E-box/ABRE motif abolished high transcription of the napA storage-protein promoter in transgenic Brassica napus seeds. Planta, 199: 515-519 Stone SL, Hauksdottir H, Troy A, Herschleb J, Kraft E, Callis J. (2005) Functional Analysis of the RING-Type Ubiquitin Ligase Family of Arabidopsis. Plant Physiol, 137: 1330 Stougaard J, Jorgensen JE, Christensen T, Kuhle A, Marcker KA (1990) Interdependence and nodule specificity of cis-acting regulatory elements in the soybean leghemoglobin lbc3 and N23 gene promoters. Mol Gen Genet, 220: 353-360 Sunako T, Ishikawa R, Senda M, Akada S, Niizeki M, Harada T (2000) MdACS-5A (Accession No. AB034992) and 5B (Accession No. AB034993), two wound-responsive genes encoding 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase in apple. (PGR00-030). Plant Physiol, 122: 620 Tesniere C, Pradal M, El-Kereamy A, Torregrosa L, Chatelet P, Roustan JP, Chervin C (2004) Involvement of ethylene signalling in a non-climacteric fruit: new elements regarding the regulation of ADH expression in grapevine. J Exp Bot, 55: 2235-2240

88

Irodalomjegyzék

Thain SC, Vandenbussche F, Laarhoven LJ, Dowson Day MJ, Wang ZY, Tobin EM, Harren FJ, Millar AJ, Van Der Straeten D (2004) Circadian rhythms of ethylene emission in Arabidopsis. Plant Physiol, 136: 3751-3761 Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positionsspecific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res, 22: 4673-4680 Tian MS, Prakash HJ, Young H, Burmeister DM, Ross GS (2000) Responses of strawberry fruit to 1-methylcyclopropene (1-MCP) and ethylene. Plant Growth Regul, 32: 8390 Trainotti L, Spolaore S, Pavanello A, Baldan B, Casadoro G (1999) A novel E-type endo-beta-1,4-glucanase with a putative cellulose-binding domain is highly expressed in ripening strawberry fruits. Plant Mol Biol, 40: 323-332 Trainotti L, Spinello R, Piovan A, Spolaore S, Casadoro G (2001) ß-Galactosidases with a lectin-like domain are expressed in strawberry. J Exp Bot, 52: 1635-1645 Trainotti L, Pavanello A, Casadoro G (2005) Different ethylene receptors show an increased expression during the ripening of strawberries: does such an increment imply a role for ethylene in the ripening of these non-climacteric fruits J Exp Bot, 56: 2037-2046 Torii KU, Mitsukawa N, Oosumi T, Matsuura Y, Yokoyama R, Whittier RF, Komeda Y (1996) The Arabidopsis ERECTA gene encodes a putative receptor protein kinase with extracellular leucine-rich repeats. Plant Cell, 8: 735-46 Ulmasov T, Hagen G, Guilfoyle TJ (1999) Activation and repression of transcription by auxin-response factors. Proc Natl Acad Sci USA, 96: 5844-5849 Vahala J, Schlagnhaufer CD, Pell EJ (1998) Induction of an ACC synthase cDNA by ozone in light-grown Arabidopsis thaliana leaves. Physiol Plant, 103: 45-50 van der Luit AH, Piatti T, van Doorn A, Musgrave A, Felix G, Boller T, Munnik T (2000) Elicitation of suspension-cultured tomato cells triggers the formation of phosphatidic acid and diacylglycerol pyrophosphate. Plant Physiol, 123: 1507-1516 Van der Straeten D, Rodrigues-Pousada RA, Villarroel R, Hanley S, Goodman HM, Van Montagu M (1992) Cloning, genetic mapping, and expression analysis of an Arabidopsis thaliana gene that encodes 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 9969–9973 Verries C, Pradala M, Chatelet P, Torregrosa L, Catherine T (2004) Isolation and analysis of the promoter of VvAdh2, a grapevine (Vitis vinifera L.) ripening-related gene. Plant Sci, 167: 1067-1074 Vogel JP, Woeste KE, Theologis A, Kieber JJ (1998) Recessive and dopercant mutations in the ethylene biosynthetic gene ACS5 of Arabidopsis confer cytokinin insensitivity and ethylene overproduction, respectively. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 4766– 4771 Vriezen WH, Achard P, Harberd NP, Van Der Straeten D (2004) Ethylene-mediated enhancement of apical hook formation in etiolated Arabidopsis thaliana seedlings is gibberellin dependent. Plant J, 37: 505-516 Vrebalov J, Ruezinsky D, Padmanabhan V, White R, Medrano D, Drake R, Schuch W, Giovannoni J (2002) A MADS-box gene necessary for fruit ripening at the tomato RipeningInhibitor (Rin) locus. Science, 296: 343-346 Wang KLC, Hai Li, Joseph R Ecker (2002) Ethylene biosynthesis and signaling networks. Plant Cell, 14: 131-151 Wang D, Fan J, Ranu RS (2004) Cloning and expression of 1-aminocyclopropane 1carboxylate synthase cDNA from rosa (Rosa x hybrida). Plant Cell Rep, 22: 422-429 Wilkinson JQ, Lanahan MB, Yen HC, Giovannoni JJ, Klee HJ (1995a) An ethyleneinducible component of signal transduction encoded by Never-ripe. Science, 270: 1807–1809

89

Irodalomjegyzék

Wilkinson JQ, Lanahan MB, Conner TW, Klee HJ (1995b) Identification of mRNAs with enhanced expression in ripening strawberry fruit using polymerase chain reaction differential display. Plant Mol Biol, 27: 1097-1108 Xie Q, Guo HS, Dallman G, Fang S, Weissman AM, Chua NH (2002) SINAT5 promotes ubiquitin-related degradation of NAC1 to attenuate auxin signals. Nature, 419: 167170 Xu R, Li QQ (2003) A RING-H2 zinc-finger protein gene RIE1 is essential for seed development in Arabidopsis. Plant Mol Biol, 53: 37-50 Xu P, Narasimhan ML, Samson T, Coca MA, Huh GH, Zhou J, Martin GB, Hasegawa PM, Bressan RA (1998) A nitrilase-like protein interacts with GCC box DNA-binding proteins involved in ethylene and defense responses. Plant Physiol, 118: 867-874 Yamagami T, Tsuchisaka A, Yamada K, Haddon FW, Harden LA, Theologis A (2003) Biochemical diversity among the 1-amino-cyclopropane-1-carboxylate synthase isozymes encoded by the Arabidopsis gene family. J Biol Chem, 278: 49102-49112 Yamada Y, Zhi-Gui Y, Ding-Tai T (1986) Plant regeneration of protoplast derived callus of rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Rep, 5: 85-88 Yamagata H, Yonesu K, Hirata A, Aizono Y (2002) TGTCACA motif is a novel cisregulatory enhancer element involved in fruit-specific expression of the cucumisin gene. J Biol Chem, 277: 11582-11590 Yang SF, Hoffmann NE (1984) Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants. Annu Rev Plant Physiol, 35: 155-189 Yoshida H, Nagata M, Saito K, Wang KLC, Ecker JR (2005) Arabidopsis ETO1 specifically interacts with and negatively regulates type 2 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthases. BMC Plant Biology, 5: 14 Zarembinski TI, Theologis A (1993) Anaerobiosis and plant growth hormones induce two genes encoding 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase in rice (Oryza sativa L.). Mol Biol Cell, 4: 363-73 Zhong GV, Burns JK (2003) Profiling ethylene-regulated gene expression in Arabidopsis thaliana by microarray analysis. Plant Mol Biol, 53: 117-131 Ziliotto F, Begheldo M, Rasori A, Bonghi C, Ramina A, Tonutti P (2005) Molecular and genetic aspects of ripening and qualitative traits in peach and nectarine fruits. V International Postharvest Symposium. Acta Horticulturae, 682: 237-24

Köszönetnyilvánítás

90

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

TémavezetĘmnek, Dr. Kiss Erzsébetnek, hálásan köszönöm önzetlen segítségét a kísérletek megtervezésében és kivitelezésében, tanácsait, amelyek elĘsegítették tudományos szemléletmódom

kialakulását.

Köszönöm

továbbá,

hogy

támogatására

bármikor

számíthattam, megtorpanáskor bíztatása segített újrakezdeni és folytatni. Kiemelt köszönetem illeti Dr. Heszky Lászlót, belém vetett bizalma, szakmai tanácsai valamint a kutatásaim anyagi hátterének biztosításáért. Köszönöm Dr. Jenes Barnabásnak, a disszertációm befejezéséhez nyújtott szakmai és anyagi segítségét, valamint türelmét disszertációm írásakor. Köszönettel tartozom Ádám Zoltánnénak lelkesítĘ szavaiért és a szövettenyésztésben nyújtott segítségért, szakmai tanácsaiért, amelyek nélkül sokkal nehezebb lett volna beilleszkednem a labor életébe. Köszönöm Kaszta Karolának, hogy a jelenlegi munkahelyemen otthonos légkört biztosított, tudásával és lelkesedésével megkönnyítette munkám, hozzájárulva dolgozatom befejezéséhez. Köszönöm Tisza Viktóriának és Koncz Tímeának szorgos segítségét, hogy sokszor hajlandók voltak estéiket és hétvégéiket feláldozni a kísérleteink elĘrehaladása végett. Köszönöm továbbá a tanszék valamennyi dolgozójának az inspiratív és motiváló légkört. Külön szeretném megköszönni Dr. Gyulai Gábornak tanácsaiért és vitakészségéért, ami hozzájárult tudományos szemléletmódom fejlĘdéséhez. Köszönöm barátaimnak a bíztatást, a türelmet és lelkesítést, munkám iránti csodálatuk sokszor ösztönzĘ erĘként hatott a továbbhaladáshoz. Hálásan

köszönöm

szüleimnek

és

testvéreimnek

lankadatlan

támogatását,

megértésüket és az anyagi hátteret, ami lehetĘvé tette tanulmányaim befejezését.

Köszönöm az Európai Uniónak, hogy Marie Curie ösztöndíjjal Belgiumban és Franciaországban dolgozhattam. Köszönöm a Magyar Államnak, hogy PhD tanulmányaimat Magyarországon végezhettem.

Kísérleteinket az alábbi pályázatok támogatták: OTKA 37861, OTKA TS 040887, OTKA M 36630

A termesztett szamóca gyümölcsfejl désében és érésében szerepet játszó gének izolálása

Recommend Documents