A nád (Phragmites australis) vizsgálata enzimes bonthatóság és bioetanol termelés szempontjából Dr. Kálmán Gergely
Bevezetés Az úgynevezett második generációs (lignocellulózokból előállított) bioetanol nem csak a CO2 éves periódusú körforgásba zárásának feltételét teljesítheti, hanem a mezőgazdaságban és iparban keletkező növényi melléktermékeket is feldolgozhatná. Így elkerülhető lenne az élelmiszerekre gyakorolt árfelhajtó hatás, a gazdák viszont pótolhatnák kieső jövedelmüket a jelenleg hulladékként kezelt növényi részek bioetanol nyersanyagként történő értékesítésével. Bár a technológia ma még nem kiforrott, jelentős kutatások folynak a problémák megoldása érdekében. A kutatás célja egy új, eddig ebből a szempontból nem tanulmányozott növény, a nád (Phragmites australis) vizsgálata lignocellulóz alapú bioetanol előállítására. Egy hazánk éghajlatán esetlegesen megépülő második generációs bioetanolgyár vagy a nyári nyersanyag raktározásával és annak egész éven át történő feldolgozásával működhet, vagy a termelés növeléséhez a téli időszakra keresni kell egy hasonló tulajdonságú nyersanyagot, mivel a téli időszakban nem keletkezik feldolgozható mennyiségű mezőgazdasági melléktermék. A kutatás során a közönséges nádat, Phragmites australis-t vizsgáltuk ebből a szempontból, hiszen a növényt a téli időszakban aratják, jelentős tartalékai vannak hazánkban és szerte Európában, valamint ökológiai szempontból is hasznos lenne a kevésbé jó minőségű nád feldolgozása.
A kutatás eredményei Előkísérleteim során kétfajta savas (1% foszforsav, 1% kénsav) és kétfajta lúgos (1% kálium-hidroxid, 1% nátrium-hidroxid) előkezelést vizsgáltam annak eldöntésére, hogy melyik kémiai előkezelés bizonyul a leghatékonyabbnak. A kezeletlen és az előkezelt mintákat nyersanyag elemeztem, majd az előkezelés hatékonyságának meghatározásához enzimes hidrolízis kísérleteket végeztem. Nyersanyag elemzések során a minták cellulóz, hemicellulóz, lignin, lignin hamu és hamu tartalmát vizsgáltam, minden egyes mintánál három párhuzamos méréssel. A mérésekből számított szárazanyagra vonatkoztatott összetételek átlaga az 1. táblázatban található. 1. táblázat: A nyersanyag, valamint az előkezelt szilárd maradékok összetétele nád cellulóz hemicellulóz lignin lignin hamu hamu Σ
35,87 21,45 19,42 5,83 2,07 78,82
1% nátrium- 1% káliumhidroxid hidroxid % 55,17 46,92 15,41 14,63 11,47 16,07 0,40 1,90 2,01 3,74 84,06 81,35
1% kénsav 50,47 2,87 23,84 6,11 2,94 80,12
1% foszforsav 39,45 9,90 20,02 5,79 2,47 71,84
Összehasonlításként 2. táblázatban összefoglaltam néhány lignocellulóz összetételét, az irodalmi értékek alapján. Ebből látható, hogy a nád a mezőgazdasági melléktermékekkel hasonlóságot mutat. 2. táblázat: Lignocellulózok összetételei cellulóz keményfák puha fák energiafű kukorica szár búza szalma kezeletlen nád
40-55 40-55 45 41,3 30 35,87
hemicellulózlignin [%] 24-40 18-25 25-35 25-35 31,4 12 27,9 22,1 50 15 21,45 19,42
A 3. táblázatban a kezeletlen nádhoz viszonyított eltéréseket mutatom be, amiből látható, hogy a nyers nádhoz képest minden kezelésnél megnőtt a cellulóz aránya, legnagyobb mértékben az 1% nátrium-hidroxidos kezelés esetében. A savas kezelések lényegesen nagyobb mennyiségű hemicellulózt bontottak el, ahogy ez a szakirodalom alapján várható is volt. A 3. táblázat adataiból az is látható, hogy a lignintartalom a lúgos kezelések esetén több mint 6%-kal csökkent, míg savas kezelések esetén inkább nőtt. Ezt a lúgok hatására jobban bomló ligninszerkezettel lehet magyarázni, valamit azzal, hogy a savas kezelések igen nagy mennyiségű hemicellulózt vittek oldatba. Összetétel alapján az 1% nátrium-hidroxidos kezelés tűnt a legígéretesebbnek, hiszen nem csak a cellulózarány növekedését sikerült elérni, hanem a ligninarány csökkenését is. 3. táblázat: Előkezelések hatása az összetételre 1% nátrium- 1% kálium1% 1% hidroxid hidroxid kénsav foszforsav Δ% cellulóz 19,30 11,04 14,59 3,58 hemicellulóz -6,05 -6,83 -18,58 -11,55 lignin -7,95 -3,35 4,42 0,60 lignin hamu -5,42 -3,92 0,28 -0,04 hamu -0,05 1,67 0,87 0,40
Előkezelt anyagok enzimes hidrolíziseinek eredményei:
kezeletlen nád 1% nátrium-hidroxid 1% kálium-hidroxid 1% kénsav 1% foszforsav
12
redukáló cukor [g/l]
10
8
6
4
2
0 0
10
20
30
idõ [h]
40
50
A továbbiakban felállítottam egy 23 kísérleti tervet, hogy megpróbáljak javítani a nátrium-hidroxidos előkezelés hatásán. A kísérleti tervemben 3 faktor hatását vizsgáltam, két szinten. Ezeket 4. táblázatban foglaltam össze. 4. táblázat: Kísérleti terv előkezelő oldat koncentrációja [%] 2 2 2 2 1 1 1 1
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
előkezelés ideje [h]
előkezelés hőmérséklete [°C] 140 120 140 120 140 120 140 120
2 2 1 1 2 2 1 1
Az egyes faktorok hatásának kiértékelését Statistica 7.0 softwer-rel végeztem. Az előkezelések eredményei: 5. táblázat: Kísérleti terv szerint előkezelt nád összetétele 2%; 2h; 2%; 2h; 2%; 1h; 2%; 1h; 1%; 2h; 1%; 2h; 1%; 1h; 1%; 1h; 140°C 120°C 140°C 120°C 140°C 120°C 140°C 120°C % 59,02 63,39 50,05 61,60 54,27 55,25 55,39 53,31 20,33 19,53 18,49 19,41 22,68 20,55 20,34 15,71 14,89 12,24 14,79 12,50 17,28 14,57 17,06 12,86 0,10 0,06 0,10 0,01 0,90 0,25 0,28 0,36 1,56 1,58 1,65 1,47 2,10 1,64 1,62 1,37 95,79 96,74 84,98 94,97 96,33 92,01 94,40 83,25
cellulóz hemicellulóz lignin lignin hamu hamu Σ
A kísérleti terv szerint nátrium-hidroxid oldattal előkezelt minták enzimes hidrolízisét is elvégeztem. Az enzimes hidrolízisek eredményeit az alábbi ábra mutatja be. 100 90 80
60 50 40 30 20 10
12 0° C
1%
;1 h;
14 0° C
1%
;1 h;
12 0° C
1%
;2 h;
14 0° C
1%
;2 h;
12 0° C
2%
;1 h;
14 0° C
2%
;1 h;
12 0° C ;2 h;
2%
;2 h;
14 0° C
0
2%
konverzió [%]
70
A különböző előkezelésekkel kapott szilárd maradékokkal SSF (egyidejű cukrosítás és erjesztés) kísérleteket is végeztem. Így megvizsgálható az előkezelés hatása a tényleges alkohol konverzióra, valamint kiderül, hogy előkezelés során nem keletkeznek-e jelentős mennyiségben inhibitorok, amik gátolnák a fermentációt. 6. táblázat: SSF kísérletek konverzióinak átlaga és szórása átlag konverzió [%] 2%; 2h; 140°C 2%; 2h; 120°C 2%; 1h; 140°C 2%; 1h; 120°C 1%; 2h; 140°C 1%; 2h; 120°C 1%; 1h; 140°C 1%; 1h; 120°C
95,78 82,18 82,44 88,40 63,41 55,51 67,06 73,33
korrigalt tapasztalati szórás [-] 2,596 1,001 7,402 5,374 4,662 13,977 3,783 14,430
6. táblázat eredményei alapján látható, hogy az alkohol konverziók is hasonlóan magasak lettek, mint a cukorkonverziós értékek. Ez a hasonlóság az inhibitorok hiányára enged következtetni, és igen kedvezővé teszi ezeket az előkezeléseket. Statistica 7.0-val elvégezve a kiértékelést, meghatároztam a faktorok hatását az alkohol konverzióra. Az alkoholkonverzióra az előkezelő oldat töménysége volt szignifikáns hatással. Az enzimes hidrolízis konverziójára az előkezelő oldat mellet a hőmérséklet is szignifikáns hatással volt, bár az utóbbi hatása lényegesen kevesebb – mintegy harmada – volt az előbbihez képest. Összefoglalás Célkitűzésem alapján nádat (Phragmites communis) elemeztem, mint egy lehetséges alternatív nyersanyagot, egy feltételezett többféle nyersanyagot feldolgozó második generációs bioetanolt előállító gyár számára. A kísérleteimhez egy enyhén leromlott minőségű balatoni nádasból vettem a nyersanyagot, ezzel is demonstrálva, hogy a kevésbé jó minőségű nádasok rendszeres vágással történő javítása esetén keletkező nádrészek is hasznosíthatóvá tehetők, és az égetésük elkerülhető. Elvégezve a nyers nád anyagelemzését, annak összetétele jelentős hasonlóságot mutatott más mezőgazdasági melléktermékekkel 36% cellulóztartalmával, 21% hemicellulóz-tartalmával, 19% lignintartalmával. Ezek után megfelelő kémiai előkezelést kerestem, amivel jelentősen növelhető az enzimes hidrolízisének hatásfoka, mert a nyers nád 48. órai konverziója nem érte el a 9%-ot. Először 2 savas és két lúgos előkezelést próbáltam ki, amelyek közül az 1% nátriumhidroxid oldattal 120°C-on 1 órán keresztül végzett előkezelés volt a legjobb mind az enzimes bonthatóság, – 48. órai konverzió 45%-ra nőtt – mind az összetétel szempontjából, hiszen itt értem el a legmagasabb cellulózarányt (több mint 56 %), és legalacsonyabb lignintartalmat ( kevesebb mint 12%) Munkám folytatásaként megvizsgáltam, hogy az általam párhuzamosként kezelt előkezelések statisztikailag is elfogadhatóak-e párhuzamosként. Elvégeztem az eddigi legjobb (1% nátriumhidroxid oldattal, 120°C, 1 óra) előkezelést 3 párhuzamossal, majd ismét megvizsgáltam az összetételt és az enzimes bonthatóságot. Minden mért érték a Student-féle t eloszlás szerint
számított 95% konfidencia intervallumon belül volt, tehát tényleg párhuzamosnak tekinthetőek a mérések. Következó lépésében felállítottam egy 3 faktoros (előkezelő oldat töménysége; előkezelés hőmérséklete; előkezelés ideje) két szintes kísérleti tervet a nátrium-hidroxidos előkezelés további javítására. A kísérleti tervben az enzimes hidrolízis 48. órai összes szénhidrátra vonatkoztatott konverzióira számítottam ki a faktorok hatásait. A hatások alapján szignifikáns lett az előkezelő oldat töménysége és a az előkezelés hőmérséklete. Így a legmagasabb konverziót a 2% nátrium-hidroxid oldattal 1 órán keresztül 140°C-on előkezelt náddal értem el (95%). Utolsó lépésként egyidejű hidrolízis és fermentációval teszteltem a kísérleti terv szerint előkezelt nádat így megvizsgálva, hogy nem képződtek-e a fermentációt akadályozó inhibitorok. Ezeket a kísérleteket a bemért minta glükóz tartalmára vonatkoztatott etanol kinyeréssel jellemeztem, és erre is kiszámítottam a kísérleti terv faktorainak hatását. Itt már csak az előkezelő oldat hatása bizonyult szignifikánsnak. A legmagasabb kinyerést a 2% nátrium-hidroxiddal 2 órán keresztül 140°C-n előkezelt náddal értem el (95%). Ezek alapján levonható az a következtetés, hogy egy esetlegesen nádat is feldolgozó második generációs bioetanol gyár számára a nád egy alkalmas nyersanyag lenne a téli holt időszak áthidalására, és kémiai előkezeléssel igen kedvező enzimes hidrolízis értékek érhetőek el. A továbbiakban érdemes a náddal mint potenciális nyersanyaggal foglalkozni, és további környezetbarátabb előkezelési módszereket is kipróbálni.
