A kukorica ZmgstF4 génjének átvitele lúdfűbe (Arabidopsis thaliana) Bittsánszky A1, Gyulai G2, Czakó M3, Gullner G1, Márton L3, Pilinszky K1, Király K1,2, Kőmíves T1 1MTA
ATK NÖVI Budapest; 2SZIE MKK GBI Gödöllő; 3University of South Carolina, Dept. Biol., Columbia, USA e-mail:
[email protected];
[email protected];
[email protected];
[email protected];
[email protected];
[email protected];
[email protected];
[email protected]
1. Összefoglalás A kukorica GLUTATION-S-TRANSZFERÁZ (ZmgstF4, syn.: gst27, NCBI: NP001105366) génjét vittük át lúdfűbe (Arabidopsis thaliana) virágmerítéses módszerrel. A transzformációs vektor (1. ábra) előállításához a standard rekombináns technikát alkalmaztuk. A kukorica ZmgstF4 (korábban gst27) gén cDNS szekvenciáját pCambia 1301 klónozó vektorba klónoztuk. A regenerált transzgénikus növényeket higromicin tartalmú táptalajon szelektáltuk. Három generáció felnevelése után a homozigóta vonalakat kiszelektáltuk, és a továbbiakban ezeket vizsgáltuk. A transzgén jelenlétét PCR-rel, az expresszióját RT-qPCR módszerrel bizonyítottuk. A transzgénikus növényekben a beépült gén kópiaszámát kvantitatív PCR módszerrel állapítottuk meg és a T3 növényeket funkcionálisan jellemeztük nehézfém és gyomirtó szer stresszben.
1. ábra A ZmgstF4 transzgén vektorkonstrukciója a génszakaszok hosszának (DNS bp) jelölésével. LB és RB: az Agrobacterium tumefaciens tumorindukáló Ti plazmidjának a transzgént közrezáró határoló szakaszai (Left/Right Border). T 35S: az átíródó 35S-ZmgstF4-mRNS poli(A) szekvenciáját kódoló génszakasz a karfiol mozaikvírusból (CaMV). hptII: a transzformánsok higromicin-rezisztenciáját kialakító higromicin-foszfotranszferáz szelekciós marker gén. Pp 35S és P 35S: karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promótere dupla felerősítő (enhancer) szekvenciával. ZmgstF4: a kukorica (Zea mays) gstF4 génje. T nos: Az Agrobacterium nopalin szintáz génjének átírását lezáró (terminátor) szekvenciája.
2. A GSTáz enzimek szerepe A GLUTATION-S-TRANSZFERÁZ enzimek (GSTázok, EC 2.5.1.18, MW < 50 kDa) kiemelkedő szerepet játszanak a biotikus és abiotikus stressz elleni védekezésben, növényekben és állatokban egyaránt (2a. ábra). A GSTáz-katalizált reakciókban a káros elektrofil xenobiotikumok kovalens kötésű konjugátumot képeznek a glutation tripeptiddel (GSH), majd, ahogyan ez a herbicidek ’méregtelenítésében’ történik, a GSHherbicid konjugátum (2b. ábra) a sejtüregbe (vakuolum) szállítódik az ABC-transzporterek (ATP binding casette) segítségével, és ezzel kikapcsolódik a sejt életéből.
1
2a. ábra A glutation (GSH) alapú növényi detoxifikációs folyamatok molekuláris rendszere.
GSH-CDNP konjugátum (μM) / gram friss tömeg / perc
Az elektrofil xenobiotikumok (pl. kábítószerek, drogok, herbicidek stb.) olyan alacsony elektronsűrűségű reakciócentrummal rendelkező kémiai szennyezőanyagok, amelyek spontán reakcióba lépnek a nukleofil vegyületekkel, így a fehérjékkel és a nukleinsavakkal, ezzel károsítva a sejt metabolizmusát és genomját. A GSTáz klasszikus méregtelenítő funkciója a méreganyag-GSH konjugátum kialakulásának katalízise. 5
4
3
2
1
0
0
P.canescens (1 %)
4 x 10-9 M PQ
4 x 10-8 M PQ
P.canescens (2 %)
4 x 10-7 M PQ
P. nigra (1 %)
4 x 10-6 M PQ
P. nigra (2 %)
2b. ábra A GTSáz katalizálta GSH-CDNP konjugátum kialakulásának mértéke in vitro paraquat herbicid (4x10-9 – 4x10-6 M) stresszben, két nyárfa (P. nigra és P. canescens) levélkorong-tenyészetében 1% és 2% cukorellátottság mellett.
A GSTázok felfedezése (1960) a humán drog-detoxifikációhoz fűződik. Növényekben való szerepük a kukorica atrazin-tűrésének megfejtésekor derült ki az atrazin-GSH konjugátum kimutatásával (1970), amely már nem mérgező a kukoricára. A GSTáz enzimek a növényekben nagy mennyiségben vannak jelen: a levelekben a vízoldható fehérjéknek közel 2%-át alkotják. Sok esetben a GSTáz enzimek a felelősek a növények herbicidrezisztenciájáért. A GST-ázokat többgénes, nagy és diverz géncsaládok kódolják, amelyek, szekvenciájuk alapján ma már 10-12 csoportba (géncsalád) sorolhatók, ezek az A (alfa-), a prokarióta B (béta-), a D (delta-), a mitokondriális K (kappa-), valamint az M (mu-), O (omega-), F (phi-), T (théta-), U (tau-), Z (zéta-), illetve a GST-szerű L (lambda-) és a trimer M (mikroszomális-) GST enzimek. Egy további, az S (sigma)-GST az állati prosztaglandin szintáz enzime.
2
U1 5
U2
100 30
3 U2 U
U2 4 25
95
2 U2 U28
96 3045
33
6 U1 7 U1
5030
65
3 38 220 31
99
99
79
F2 F14
99
50 17
F13
45
15 83
57
46
100
52 54
19
U11 U13
88
F12
U12
69 96
59
100
77
U8
U7
0
U9
U10
100
TClH
QR-a
se
T1
Z1
U3
10 0 38
U6
U1
U2
. U9
U4
Z2
T2 T3
U5
10
F9
2) F9(
U1 4
99
10 0
53
4892
95
99
F 10
U18
97 81
32
ZmGSTF4
1 F1
U19
)
F7
U21
(3 F4
F8 F6
0
U26 U27
F 4(2 )
F4
F5
F3
0.2
3a. ábra A lúdfű (Arabidopsis thaliana) 51 klónozott AtGST izoenzimének (F-, T-, U-, Z-enzimcsaládok) és a kukoricából klónozott ZmGSTF4 (●) enzimének aminosav-szekvencia rokonsági kladogramja. (ME Minimum Evolution módszer, MEGA5, x1000 ismétlés/bootstrap). Az egyes GST géncsaládokat (F, T, U, Z) külön szín jelzi a relatív genetikai távolság (skála: aminosav-eltérések száma per mérce) megadásával.
A baktériumok prokariotikus GST enzimei a B (EcGSTB) (Ec – Escherichia coli) csoportba tartoznak. A teljes Arabidopsis genom szekvenciája alapján ismertté váltak a növényi GST enzimcsaládok, amelyek az F-, Z-, T-, és az U-GST csoportba tartoznak (3a, b, c. ábra; 1. táblázat). A T-GST és a Z-GST-ok közösek az állatokban és a növényekben. Az A-, és M-GST enzimek a klasszikus humán gyógyszer/drog metabolizmus részei, az ismert emberi (Homo sapiens) GST enzim csoportokon belül, melyek a HsGST-A, HsGST-M, HsGST-O, HsGST-S, és a HsGST-T.
NP198937 AtGSTt1 NP198940 AtGSTt2 NP198938 AtGSTt3
10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MMKLKVYADRMSQPSRAVIIFCKVNGIQFDEVLISLAKRQQLSPEFKDINPLGKVPAIVD -.................L......E.....I....G..........E...M........ -.................L......E.....I..Y..N.............M........ 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GRLKLFESHAILIYLSSAFPSVADHWYPNDLSKRAKIHSVLDWHHTNLRRGAAGYVLNSV ..................YA..V..........................P..S....... .K...S............Y...V.....T......R.............P.......... 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| LGPALGLPLNPKAAAEAEQLLTKSLSTLETFWLKGNAKFLLGSNQPSIADLSLVCELMQL .A................NI..N............S......GK................ .........................T..D........M...................T.. 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| QVLDDKDRLRLLSTHKKVEQWIENTKKATMPHFDETHEILFKVKEGFQKRREMGTLSKPGLQSKI .............P.........S.R......S..V..V..RA.DR...Q...A.A....P.... .............P..N........R.........V..V..RA.DRC..Q...A.A....P....
3b. ábra A lúdfű (Arabidopsis thaliana) három AtGSTt1-3 enzimének aminosav-szekvencia illesztése (BioEdit) alacsony fokú diverzitást mutat ellentétben az AtGSTu- és AtGSTf izoenzimekkel (ld. 3a. ábra).
3
G
(a)
L N A
W
D
L
A
R
R
A
E
A
M
V
L
H T
G A
A
H
G
I
T
F
N
V
C
L
P
E
F
A
R
L
G
L
V
W
M
S
Y
A
A
A
R K
H S T
G
A L
F
E
E
S
Y
K
A
W E
A
E
K
H
Y
R
L
L
L
S
E
P
R
L
E
K
I
S
R
G
F
T
T
A
V
R V
A
Q
K
K
P
L
W
R
C
E
V
A M
E
L
T
A
T
A P
P V
A
S
G
I
L
H
I
E
C
L
V
S
P
T R Q
E
Y
P S
K
A
N
A
G
Q
D
G
R M
V N
W
W
G I
Q L
E
Q
E
K
N T G H T K T K L F A
E
V
K
E
A
K
G
H
W
V
F
L K V
G
S
F
C
Y L L
K
L
D
R K
M
F
L
H
A
K
W
I
Y
A
L
V
S
P T
E
M
Q
D
P
T
F
G
N
Y
V
L R
D
E
N
F
L P
L
S
D E
A
Q
V
E
D
V
K
K
R
E
D P
P T L
I
L
L
V
P
E
E
P
F L
L
G Q
L
A
E
A
L
V
E
V I R V S H
A
D
V
V
H
L
R
E Q E L
K
G
Y
E
V
A L Q
L
R
I R E
T
D P
K
Q
D V
H Y P
M F
S
Q V
I
E
K E
S
F
K
P L R E
S F
V P
C
D
V H
G
F
S
L A
H Y
V
N
L
V F
T S
G
A
D
L S
A E
T
H
A
P
P
E
M K
F
T
N Y
M
G
V
D
R
N
W
V
H R S
E
Y
M Q
I P
T
A
N
F
N
V
P A
S
V
AI
G
G
A
N
Q
T
L
L D Y
K
E
E
I D
K H
A V
C
D E
L K
P
E P L
V
S
A
K
K
V
R V
K
L
R
T
L V
L
K W
R
M
L L P
P
(b)
Q V
E
L I
R M
E P
S
E
L
N I
T I
T T
A
K
F Q R Q
3c. ábra A lúdfű AtGSTF4 (a) és a kukorica ZmGSTF4 (b) ezimek aminosav-összetételének összehasonlító spirálkerék diagrammjai (helical wheels). (kék - alifás-; piros - negatív töltésű; fekete - pozitív töltésű aminosavak). Apoláros, hidrofób oldalláncú aminosavak: A (alanin), F (fenilalanin), G (glicin), I (izoleucin), L (leucin), M (metionin), P (prolin), V (valin), W (triptofán). Poláros, töltéssel nem rendelkező aminosavak: C (cisztein), G (glicin), N (aszparagin), S (szerin), Q (glutamin), T (treonin), Y (tirozin). Savas oldalláncú (negatív töltésű) aminosavak: D (aszparaginsav), E (glutaminsav). Bázikus oldalláncú (pozitív töltésű) aminosavak: H (hisztidin), K (lizin), R (arginin).
AtGSTF4a NP001030937 AtGSTF4b NP849581 ZmGSTF4 NP001105366 PtGSTF4 Populus t.
1 1 1 1
88 90 69 68
178 180 156 156
10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MDCLQMVFKLFPNWKREAEVKKL--GYKVHGDPFSTNTRRVLAVLHEKRLSYEPITVKLQTGEHKTEPFLSLNPFG-QVPVFEDGSVKLY .......................VA...................................................-............. ---------------MATPAV.V------Y.WAI.PFVS.A.LA.E.AGVD..LVPMSR.D.D.RRPEH.AR....-K...L...DLT.F ----------------M..II.V------..STL..AAQ..F.C.Y..E.EF.F.P.NMAV....K....A.....-...A..Q.DL..F 100 110 120 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ESRAITQYIAYVHSSRGTQLLNLRSHETMATLTMWMEIEAHQFDPPASKLTWEQVIKPIYGLETDQTIVKENEAILEKVLNIYEKRLEES .......................................................................................... .....ARHVLRK.KP---E..GGGRL.QT.MVDV.L.V....LS...IAIVV.C.FA.FL.R.RN.AV.D..VEK.K...EV..A..ATC ..........HGYADK..P.VIPG--KQ....SV...V.......V....N..L.F..MF.IP..NAA.E....K.G...DV..S..AQ. 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|... RFLACNSFTLVDLHHLPNIQYLLGTPTKKLFEKRSKVRKWVDEITSREAWKMACDQEKSWFNKPRN-- 243 ..................................................................-- 245 TY..GDFLS.A..SPFTIMHC.MA.EYAA.VHALPH.SA.WQGLAA.P.ANKVAQFMPVGAGA.KEQE 223 KY.GGDI...A........SCAMR.HV....DS.PH.SA..AD....P..SKVVAMN.---------- 213
4a. ábra Az Arabidopsis (At), a kukorica (Zm) és a nyárfa (Pt) GSTF4 proteinjeinek összehasonlító szekvenciaillesztése (BioEdit) (jelzések: azonos/konszenzus aa (•); hiányzó aa (-); eltérő aa: az aminosavak nevének egybetűs jelölésével).
4
1. táblázat. A lúdfű (Arabidopsis thaliana) AtGST1-51 (F-, T-, U-, Z GST) és a kukoricából klónozott (Zea mays) transzgénikus ZmGSTF4 fehérjék aminosav-összetételéből szerkesztett evolúciós divergenciamátrixa (MEGA5) a legmagasabb értékek (2.0 aa változás/lokusz) jelölésével. - [ 1] F2; [ 2] F3; [ 3] F4; [ 4] F4(2); [ 5] F4(3); [ 6] ZmGSTF4; [ 7] F5; [ 8] F6; [ 9] F7; [10] F8; [11] F9; [12] F9(2); [13] F10; [14] F11; [15] F12; [16] F13; [17] F14; - [18] T1; [19] T2; [20] T3; [21] TClHQR-ase; - [22] U1; [23] U2; [24] U3; [25] U4; [26] ; U5; [27] U6; [28] U7; [29] U8; [30] U9; [31] U9.; [32] U10; [33] U11; [34] U12; [35] U13; [36] U14; [37] U15; [38] U16; [39] U17; [40] U18; [41] U19; [42] U20; [43] U21; [44] U22; [45] U23; [46] U24; [47] U25; [48] U26; [49] U27; [50] U28; - [51] Z1; [52] Z2. [ [ 1] [ 2] [ 3] [ 4] [ 5] [ 6] [ 7] [ 8] [ 9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.1 0.6 0.6 0.6 0.8 0.6 0.3 0.3 0.5 0.9 0.9 1.0 0.8 0.9 0.9 0.7 1.5 1.4 1.4 1.4 1.6 1.7 1.7 1.6 1.4 1.5 1.7 1.8 1.6 1.6 1.7 1.6 1.5 1.6 1.7 1.7 1.7 1.6 1.5 1.6 1.6 1.7 1.7 1.5 1.8 1.7 1.7 1.5 1.6 1.2 1.3
0.5 0.5 0.5 0.8 0.6 0.3 0.3 0.5 0.9 1.0 1.0 0.8 0.9 0.9 0.7 1.4 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.7 1.6 1.5 1.6 1.7 1.8 1.6 1.6 1.5 1.5 1.6 1.5 1.7 1.7 1.6 1.6 1.5 1.5 1.6 1.6 1.6 1.4 1.7 1.6 1.7 1.6 1.6 1.3 1.3
0.0 0.0 0.8 0.4 0.6 0.6 0.6 1.0 1.0 1.0 0.9 1.0 0.9 0.7 1.6 1.4 1.5 1.5 1.6 1.6 1.7 1.7 1.6 1.7 1.7 1.6 1.8 1.8 1.6 2.0 1.7 1.7 1.8 1.9 1.8 1.8 1.6 1.8 1.8 1.8 1.8 1.7 1.8 1.9 1.7 1.6 1.7 1.3 1.3
0.0 0.8 0.4 0.6 0.6 0.6 1.0 1.0 1.0 0.9 1.0 0.9 0.7 1.6 1.4 1.5 1.5 1.6 1.6 1.7 1.7 1.6 1.7 1.7 1.6 1.8 1.8 1.6 2.0 1.7 1.7 1.8 1.9 1.8 1.8 1.6 1.8 1.8 1.8 1.8 1.7 1.8 1.9 1.7 1.6 1.7 1.3 1.3
0.8 0.4 0.6 0.6 0.6 1.0 1.0 1.0 0.9 1.0 0.9 0.7 1.6 1.4 1.5 1.5 1.6 1.6 1.7 1.7 1.6 1.7 1.7 1.6 1.8 1.8 1.6 2.0 1.7 1.7 1.8 1.9 1.8 1.8 1.6 1.8 1.8 1.8 1.8 1.7 1.8 1.9 1.7 1.6 1.7 1.3 1.3
1.0 0.8 0.9 0.7 0.9 1.0 0.8 0.9 1.0 0.9 0.9 1.3 1.3 1.4 1.4 1.5 1.4 1.6 1.6 1.5 1.7 1.6 1.5 1.7 1.7 1.6 1.6 1.5 1.6 1.8 1.3 1.5 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.6 1.6 1.8 1.8 1.7 1.8 1.6 1.3 1.4
0.7 0.6 0.7 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.8 1.5 1.4 1.5 1.4 1.7 1.7 1.6 1.7 1.7 1.8 1.7 1.6 1.8 1.8 1.6 2.0 1.8 1.6 1.8 1.7 1.5 1.7 1.6 1.8 1.7 1.8 1.7 1.7 1.8 1.9 1.7 1.7 1.8 1.1 1.2
0.1 0.7 1.0 1.0 1.1 0.8 0.9 0.8 0.8 1.4 1.3 1.3 1.4 1.4 1.5 1.4 1.5 1.5 1.5 1.6 1.7 1.6 1.6 1.6 1.5 1.4 1.4 1.6 1.4 1.4 1.4 1.3 1.5 1.5 1.6 1.6 1.3 1.7 1.6 1.7 1.5 1.4 1.3 1.4
0.7 1.1 1.1 1.1 0.8 0.9 0.9 0.8 1.3 1.3 1.3 1.4 1.5 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.7 1.7 1.6 1.6 1.6 1.6 1.5 1.5 1.6 1.5 1.5 1.5 1.3 1.6 1.6 1.7 1.7 1.4 1.8 1.7 1.7 1.6 1.5 1.3 1.4
10
0.8 0.8 1.0 0.8 1.0 0.9 0.7 1.4 1.3 1.3 1.7 1.7 1.7 1.8 1.7 1.7 1.6 1.7 1.7 1.7 1.7 1.6 1.7 1.8 1.7 1.9 1.8 1.8 1.7 1.8 1.6 1.5 1.7 1.7 1.6 1.7 1.7 1.6 1.6 1.6 1.4 1.4
11
0.0 0.3 0.8 0.8 1.2 1.0 1.6 1.4 1.5 1.8 1.7 1.7 1.6 1.8 1.6 1.5 1.6 1.7 2.0 2.0 1.6 1.9 1.7 1.7 1.8 1.7 1.8 1.8 1.7 1.6 1.5 1.6 1.7 1.7 2.0 1.7 1.8 1.8 1.6 1.3 1.3
12
0.3 0.8 0.8 1.2 1.0 1.6 1.4 1.5 1.8 1.7 1.7 1.6 1.8 1.6 1.5 1.6 1.7 2.0 2.0 1.6 1.9 1.7 1.7 1.8 1.7 1.8 1.8 1.7 1.6 1.5 1.6 1.7 1.7 2.0 1.7 1.8 1.8 1.6 1.3 1.3
13
1.0 1.0 1.2 1.0 1.4 1.4 1.5 1.7 1.7 1.7 1.7 1.8 1.6 1.5 1.5 1.6 1.8 1.8 1.5 2.0 1.7 1.7 1.8 1.7 1.8 1.8 1.7 1.5 1.4 1.6 1.5 1.5 1.8 1.5 1.6 1.7 1.5 1.4 1.5
14
15
0.3 0.9 1.0 1.4 1.3 1.4 1.7 1.7 1.6 1.7 1.7 1.7 1.7 1.9 1.6 1.8 1.8 1.9 1.7 1.7 1.6 1.6 1.7 1.8 1.7 1.6 1.7 1.6 2.0 1.8 2.0 2.0 1.8 2.2 1.7 1.6 1.6 1.6
16
0.9 0.9 1.4 1.3 1.3 1.6 1.6 1.5 1.6 1.6 1.5 1.5 1.7 1.5 2.0 2.0 1.7 1.7 1.7 1.7 1.6 1.6 1.7 1.7 1.7 1.6 1.6 1.6 1.6 1.8 1.8 1.7 1.9 1.7 1.5 1.5 1.6
17
0.8 1.5 1.4 1.5 1.4 1.7 1.6 1.7 1.6 1.6 1.8 1.7 1.6 1.8 1.8 1.7 1.8 1.5 1.6 1.7 1.5 1.5 1.7 1.5 1.5 1.5 1.6 1.4 1.6 1.6 1.5 1.7 1.6 1.5 1.3 1.3
18
1.4 1.4 1.5 1.6 1.6 1.7 1.8 1.8 1.6 1.7 1.7 1.7 1.8 1.8 1.7 1.8 1.6 1.7 1.8 1.6 1.6 1.7 1.7 1.6 1.5 1.7 1.5 1.7 1.8 1.7 1.7 1.7 1.6 1.3 1.4
19
0.1 0.1 1.8 1.5 1.5 1.6 1.6 1.4 1.6 1.9 1.7 1.8 1.8 1.7 1.8 1.8 1.7 1.8 1.6 1.8 2.0 2.0 1.8 1.8 2.0 1.8 2.0 1.9 1.8 2.3 1.9 1.7 1.4 1.4
20
0.1 1.9 1.6 1.6 1.6 1.7 1.6 1.8 2.0 1.7 1.9 1.9 1.7 1.8 1.8 1.8 1.8 1.7 1.8 2.0 2.0 1.8 1.8 2.0 1.8 2.0 1.9 1.8 2.3 1.9 1.8 1.3 1.3
21
1.8 1.5 1.5 1.6 1.6 1.5 1.7 1.9 1.7 2.0 2.0 1.7 1.8 1.7 1.7 1.8 1.7 1.9 2.0 2.0 1.8 1.8 2.0 1.8 1.9 1.9 1.8 2.2 1.9 1.8 1.3 1.4
22
1.6 1.7 1.7 1.6 1.5 1.7 1.5 1.7 1.5 1.5 1.7 1.7 1.8 1.6 1.6 1.7 1.6 1.8 1.8 1.7 1.7 1.6 1.5 1.6 1.6 1.6 1.7 1.8 1.8 1.3 1.3
23
0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.5 0.5 0.8 0.8 0.8 0.9 0.9 0.7 0.8 0.7 0.8 0.8 0.9 0.9 0.9 0.7 0.8 0.9 0.8 0.9 0.9 0.8 0.8 1.4 1.4
24
0.3 0.3 0.3 0.4 0.5 0.5 0.9 0.9 0.7 0.9 0.9 0.8 0.9 0.7 0.7 0.8 0.9 0.9 0.8 0.8 0.8 0.9 0.8 0.9 0.9 0.8 0.8 1.4 1.4
25
0.4 0.5 0.5 0.7 0.7 0.9 0.9 0.9 1.0 1.0 0.8 0.9 0.8 0.8 0.8 0.9 1.1 1.0 1.0 1.0 1.1 0.9 1.0 1.1 1.0 1.0 1.5 1.5
26
0.4 0.5 0.6 0.6 1.0 1.0 0.8 1.0 1.0 0.9 1.0 0.8 0.8 0.9 1.0 1.0 0.9 0.9 0.9 1.0 0.9 0.9 1.0 0.9 0.9 1.5 1.4
27
0.2 0.6 0.5 0.8 0.8 0.8 1.1 0.8 0.9 0.9 0.8 0.8 0.9 1.0 0.9 0.8 0.8 0.9 0.9 0.9 1.0 0.9 0.9 0.9 1.5 1.5
5
28
0.5 0.6 0.9 0.9 0.9 1.0 0.9 0.8 0.9 0.9 0.9 0.8 1.0 0.8 0.8 0.7 0.8 0.8 0.9 0.9 0.8 0.9 0.9 1.6 1.6
29
0.7 0.8 0.8 0.8 1.0 1.0 0.9 1.0 0.9 0.9 0.8 1.0 0.8 0.8 0.7 0.8 0.9 0.8 0.8 0.9 1.1 0.9 1.5 1.5
30
0.8 0.8 0.8 1.0 0.9 0.8 0.7 0.7 0.7 0.8 0.9 0.7 0.7 0.7 0.7 0.8 0.8 0.8 0.9 0.8 0.7 1.5 1.5
31
0.0 0.7 1.1 1.1 0.8 0.9 0.9 1.0 0.8 0.8 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 1.0 1.0 1.0 0.9 1.7 1.7
0.7 1.1 1.1 0.8 0.9 0.9 1.0 0.8 0.8 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 1.0 1.0 1.0 0.9 1.7 1.7
32
1.0 1.0 0.9 1.0 1.0 1.0 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.8 0.8 0.9 0.9 0.9 1.0 1.0 1.5 1.5
33
0.8 0.6 0.6 0.8 0.8 0.6 0.8 1.0 1.0 0.9 0.9 0.9 1.0 0.9 1.1 1.1 1.0 1.3 1.3
34
0.5 0.6 0.7 0.7 0.8 0.8 1.0 0.9 1.0 0.8 1.0 1.1 1.1 1.1 1.1 0.9 1.6 1.6
35
0.3 0.6 0.7 0.6 0.6 0.9 0.8 0.8 0.8 0.8 0.9 0.9 1.0 1.0 0.9 1.3 1.2
36
0.7 0.7 0.6 0.6 0.9 0.9 0.8 0.8 0.8 0.8 0.9 1.0 0.9 0.9 1.3 1.3
37
0.2 0.6 0.7 0.8 0.8 0.8 0.8 0.9 0.8 0.8 1.0 1.0 0.8 1.4 1.4
38
0.5 0.7 0.8 0.8 0.8 0.7 0.9 0.8 0.8 1.0 0.9 0.8 1.4 1.3
39
40
0.3 0.8 0.9 0.8 0.9 0.8 0.8 0.9 1.0 0.9 0.9 1.4 1.5
41
0.9 0.9 0.8 0.9 0.9 0.8 0.9 1.1 1.0 0.9 1.5 1.4
42
0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.5 0.4 1.6 1.6
43
0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.5 0.5 0.4 1.6 1.6
44
0.4 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 1.6 1.5
45
0.4 0.4 0.3 0.5 0.5 0.4 1.4 1.4
46
0.3 0.3 0.5 0.5 0.5 1.5 1.5
47
0.2 0.5 0.5 0.5 1.6 1.5
48
0.5 0.4 0.4 1.7 1.6
49
50
51 52 ]
0.6 0.6 0.5 1.6 2.0 1.7 1.7 1.8 1.7 0.1
s may Z ea ys ma s Zea ay s am Ze may r a lo Ze bico or ol m bic on hu rg um c hy on y a So h ist ch rg So m d ista diu m d u po di hy po ac hy Br ac Br
Ho rd eu m
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
bi co lo
r
0.35
Glycine max Glycine ma x Vitis vi nifera Vitis v in ifera Pop u Pop lus trich ocarp ulus Po a tr ic p h oca P o ulus t rpa r p Ric ulus ichoca rpa P i inus t rich oca c c Pi ea om rpa C c ea si tch m un at is ha sitc ens is ya he ar nsi s gy ro ph yll a
So rg hu m
es id s ro p su oide ou o r y Gr m osu p s ica ou y r n u ur s m po aG ec uru a J a onic p p c o iv Al ope sat a Ja Al yza sati v olor Or yza bi c r n m r u olo hyo O rgh bic tac So ghum ium dis roup r aG So hypod ic d In c roup Bra ativa ica G za s apon Ory tiva J rou p a G s a a ic Oryz Japon sativa Oryza ol or bic m hu Sorg sum Da sypyrum villo Hordeum vulgare subsp vulgare
Triticum aestivum Ana nas com osus Zea may s s ynth etic co nstruct Ze a mays Zea m Zea ays Ze mays a So m a y s P e rgh um bi c Ph nnis Br r ag etum olor Ho ach mite gl rd ypo s a aucu eu m diu ust m ra lis vu m d ist lg ac ar e hy su on bs p vu lg ar e
re lga vu um p iv bs st um u s ae tiv p m aes gare rou l cu lon ica G vu iti um Tr i tic um acty p on u p o r Tr rde on d Ja aG p Ho nod at iva d ic rou C y yza s tiva In ica G on Ind Or za sa y h c iva is ta Ory za sat md on y iu h Ory pod istac d ch y p Bra ypodium Grou h Indica Brac sativa Group Oryza po nica sativa Ja Oryza Grou p a Ja ponica Oryza sa tiv p Oryza sativa Indic a Grou Glycine max
T vu Br Ho lga ritic ac rde u re hy um s m po Ho di u ubs aes vu r de lga p ti um m re dis vu vum vul su l ga bs t ach gar re e p Hor y su vu on bs deu Trit lga p mv icu ulg m a vulg re are a e r Bra stiv e sub chy um sp pod vu ium Brac dista lgare hypo ch dium dista yon c hy Triticu m aest on Ho rdeu m vulg ar ivum e subsp vulgare Zea mays Zea mays Sorghum bicolor onica Group Oryza sativa Jap a Group tiva Indic O ryza sa Group po nica p tiva Ja Grou sa za ic Ory on a p a roup J a a G up ic sativ d a z a In Ory Gro p ativ u ica za s pon a Gro p Ory u a Ja onic a Gro up ativ p s a a z aJ nic Gr o up Ory iv o t ap sa ca Gro n J i a n z o o iva Ory ap dica chy are sat aJ In i sta ulg yza at iv tiv a v d Or a as m p s z u s y a b di Or yz su po Or hy are ac lg Br vu m eu rd Ho
Oryza sativa Indica Group Oryza sativa Japo nica Grou p Brac hypodiu m distachy on S orghum bicolor Sorgh u Hord m bicolor eum B ra vulg c are s Hor hypod ubs p ium vulg Trit deum dista are v ic ch y u um lga Tri on r t e a sub Br icum estiv sp um Br achy aes v u lga A ach pod tivu re Al lope y po ium m op cu di dis ec ru um t ac s dis ur hy us my on ta ch m osu yo yo r n su oi d e ro s id es
A gst gének nagy száma és a kromoszómán való csoportosulásuk (klasztereik) evolúciós génsokszorozódás következményei. Arabidopsisban 51 gst gén található (3a. ábra), a kukoricában 42 (12 F-, 28 T-, és 2 Z-gst) (4a, b. ábra), a szójában 25 (20 T-, 4 F-, és 1 Z-gst). A GST-M enzimcsalád enzimei emlősökben hasznos evolúciós markerek (4c. ára).
4b. ábra A kukorica (Zea mays) ZmGSTF4 (223 aa, NCBI # NP_001105366) evolúciós rokonsági dendrogramja és diverzitása a kukorica (Zea mays) különböző mintáinak genomjaiban az ősi kapcsolatot mutató nyitvatermőkig (NJ – Neighbour Joining NCBI; MEGA5, x 1000 ismétlés/bootstrap). Az egyszikű fajokon (zöld) belül a kukorica GST izoenzimeit (piros), a kétszikűekét (kék) és a nyitvatermő fajokét (lila) eltérő színek jelzik, a genetikai rokonságot skála (0,35) jelzi.
A GST enzimek dimer felépítésűek (homo- és heterodimerek), ezért valószínű, hogy génduplikációval jöttek létre az evolúció során. A dimer mindkét aminosav (aa) láncának aminocsoport végén (N-terminális) található a konzervatív aa-szekvenciájú GSH-kötő szakasz (G-domén), a karboxilcsoport végén pedig (Cterminális) a hidrofób szubsztrát-kötő H-domén. A két szakasz között rövid (10-15 aa) kapcsoló szakasz található. A homodimer GSTk (az F-, és a T-GST) két alegységét, értelemszerűen, ugyanaz a gén, míg a heterodimerekét két különböző gén kódolja. A szabad heterodimer GST kombinációk tovább növelték (elsősorban a növényekben) a GST enzimek funkcionális diverzitását, és ezzel a növények evolúciós alkalmazkodó képességét, melyben a gyomirtó szerek megjelenésének indukciós hatása is feltételezhető. Pl. a kukorica F-GST-je a ZmGSTF1-1 homodimer (az 1-1 jelzés mutatja). Herbicid ellen védő kezelés után azonban kimutatható a heterodimer ZmGSTF1-2 GST is. A gst gének expressziója szövetspecifikus, de az F- és az U-gst gének stresszinduktívak is; pl. a kukorica ZmGSTF2 génje csak a gyökérben működik, de herbicidkezelésre a levélben is expresszálódik. A U-gst gének hormon által indukálhatóak is (auxinokkal és citokininekkel).
6
NP000839.GST Mu2 Homo sapiens 85 93
NP001127487 GST Mu2 Pongo abelii BAB40442 GST M2 Macaca fuscata
93
AFH32107 GST Mu2 Macaca mulatta
58
XP 003479258 GST Mu2 Cavia porcellus XP513625 GST Mu4 Pan troglodytes XP001495425 GST Mu Equus caballus XP537038 GST Mu1 Canis lupus familiaris
80
NP034489 GST Mu3 Mus musculus
5
4c. ábra Az emlősök GST-M enzimcsaládjának rokonsági MP (maximum parsimony) dendrogramja (MEGA5; x 1000 ismétlés/bootstrap). A genetikai rokonságot skála (5 aa eltérés/mérce) jelzi.
3. A ZmgstF4 transzformáns lúdfű (Arabidopsis thaliana) funkcionális jellemzése gyomirtó szer (metolaklór) és nehézfém (Cd, Zn) stresszben A transzgénikus vonalak funkcionális igazolására biotesztet végeztünk gyomirtó szer és nehézfém stresszben.
(b)
(a)
WT
GMO ZmgstF4
WT
GMOZmgstF4
5. ábra Metolaklór herbicid teszt. A természetes (WT) lúdfű (Arabidopsis thaliana) klónja (Col-gl1) és a ZmgstF4 génnel transzformált lúdfű (GMO) T3 regeneránsai csírázási tesztben 200 µM metolaklór tartalmú ½MS táptalajon (a) és tőzegkockában (b) 3 nap hidegkezelést követően 20 nap után, 16/8 fény/sötét fotoperiódus alatt nevelve, 22°C-on).
A metolaklórral átitatott szűrőpapíron csíráztatott transzgénikus T3 Arabidopsis növények magvai, valamint levelei a metolaklór gyomirtó szer permetezése után minden kezelésben nagyfokú rezisztenciát mutattak (5. ábra). A GST-emzimaktivitás szignifikánsan magasabb volt a T3 ZmgstF4 növényekben kadmiumstresszben, viszont a cinkstressz nem indukált szignifikáns GST-aktivitásváltozást még extrém magas koncentrációban (1500 μM) sem (6. ábra).
7
6. ábra GST-aktivitás CdSO4 és ZnSO4 stresszben. A ZmgstF4 kukoricagénnel transzformált lúdfű (Arabidopsis thaliana) GLUTATION-S-TRANSZFERÁZ (GSTáz) aktivitása (az 1-klór-2,4-dinitrobenzol CDNB-GSH konjugátum képződésének mértéke alapján) a (■) kadmium Cd- (a) és (■) cink Zn- (b) stresszben összehasonlítva a WT (■) lúdfűvel.
A stabil homozigóta transzgénikus ZmgstF4 lúdfűvonalak kiváló modellként szolgálhatnak különböző xenobiotikumok fitoremediációs folyamatainak vizsgálatához, és készen állnak keresztes virágúakba (Cruciferae) történő átvitelre keresztezéssel.
Irodalom: Bittsánszky A, G Gyulai, T Kőmíves (2010) Arabidopsis thaliana overexpressing Zea mays glutathione S-transferase: modelling an effective phytoremediation. J Biotechnology 150, Supplement 1: 486. Czakó M, X Feng, Y He, D Liang, M Márton (2006) Transgenic Spartina alterniflora for phytoremediation. Environmental Geochemistry and Health (2006) 28: 103–110. Gullner G, G Gyulai, A Bittsánszky, J Kiss, L Heszky, T Kőmíves (2005) Enhanced inducibility of glutathione S-transferase activity by paraquat in poplar leaf discs in the presence of sucrose. Phyton 45: 39–44. Gyulai G, A Bittsánszky, G Gullner, Gy Heltai, K Pilinszky, E Molnár, T Kőmíves (2012) Gene reactivation induced by DNA demethylation in Wild Type and 35S-gshI-rbcS transgenic poplars (Populus x canescens). Novel plant sources for phytoremediation. J Chemical Science and Technology 1: 9–13. Kőmíves T, G Gullner (2005) Phase I xenobiotic metabolic systems in plants. Z Naturforsch 60c: 179–185. Márton, L, GJ Wullems, L Molendijk, RA Schilperoort (1979) In vitro transformation of cultured cells from Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens. Nature 277: 129–131. Pilinszky K, A Bittsánszky, G Gyulai, T Kőmíves (2012) Response of Arabidopsis thaliana to stress by zinc and cadmium. Növénytermelés DOI: 10.1556/Növényterm.61.2012. Suppl. 5: 451–454.
A vizsgálatokat az OTKA-K77641 és az OTKA-PD75169 pályázat támogatta.
8
