A gluténtartalom mérésének lehetőségei, mérési bizonytalanság

Program

A gluténtartalom mérésének lehetőségei, mérési bizonytalanság

Szigeti Tamás János Üzletfejlesztési és értékesítési igazgató WESSLING Hungary Kft. Budapest

Lisztérzékenység

A gyermekkorban kialakuló cöliákiát az angol Samuel Gee írta le először 1888-ban, a felnőttkoriról pedig 1932-ben egy dán orvos, Hess-Thysen számolt be.

Samuel Jones Gee (1839-1911)

Lisztérzékenység

Cöliákia vagy coeliakia, (állandó gluténérzékenység, gluténszenzitív enteropátia, glutén-intolerancia), az egész szervezetet érintő autoimmun-betegség, táplálkozás-élettani zavar. A betegek az étrendben a gliadin jelenlétére érzékenyek. Kiváltói a kalászos gabonafélékben lévő sikér (glutén) egyik fehérjecsoportját képező, gliadinok, amit az ember normálisan az étkezései során fogyaszt el. A lisztérzékenység leggyakoribb formájában glutén fogyasztása hatására a vékonybél nyálkahártyája súlyosan károsodhat, ami emésztőrendszeri panaszokat és súlyos tápanyag-felszívódási zavarokat okoz. Kezelés: kizárólag gluténmentes diétával lehetséges, A diétát egész életen át kell folytatni. A népesség 1-2%-a érintett Magyarországon;

Lisztérzékenység Lisztérzékenység: a népesség 1-2%-a érintett Magyarországon; Glutén immunreakciók székletből: a népesség 30 – 40%-ánál; A diabétesz (1) és a cöliákia esetszáma azonos ütemben emelkedik; Okok: - Megnövekedett gabonafogyasztás, a régi időkhöz képest nagyobb gluténterhelés; - Kenyérgabona-ősök: A-, B- és D-genomok (D-genom: kevés α-gliadint termel), - A korszerű gabonafajták főként a D-genomok tulajdonságait hordozzák;

- Gliadinok: α -, β-, γ- és ω-gliadin; A tönkölybúza "A+B+D" genomú gabonaféle  nem ajánlható gluténérzékenyeknek, mert igen nagy a glutén tartalma! (Vincentini O, Maialetti F, Gazza L, Silano M, Dessi M, De Vincenzi M, Pogna NE. Environmental factors of celiac disease: cytotoxicity of hulled wheat species Triticum monococcum, T. turgidum ssp. dicoccum and T. aestivum ssp. spelta. J Gastroenterol Hepatol. 2007 Nov;22(11):1816-22.).

Gliadinok

Gliadinok: glikoproteinek (a szénhidrát és a fehérje együtt)

• A glutének egyik, 40-70%-os alkoholban oldható alkotórészei; • Prolinban és glutaminban gazdag polipeptidek (prolaminok); • Gliadinok találhatóak búzában és más gabonafélékben, köztük zabban, rozsban, árpában, kölesben, kamutban;

Tritikále, kamut, zab, árpa, rozs

A gliadin aminósav-szekvencája

A gliadinok aminósav-szekvencájának részletei 31 LEU-GLY-GLU-GLU-GLU-PRO-PHE-PRO-PRO-GLU-GLU-TYR-PROGLU-PRO-GLU-PRO-PHE 49

31 LEU-GLY-GLU-GLU-GLU-PRO-PHE-PRO-PRO-GLU-GLU-PRO-TYR 43

44 PRO-GLU-PRO-GLU-PRO-PHE-PRO-S-GLU-GLU-PRO-TYR 55

Az α-gliadin peptidek azon szakaszai, amelyek a cöliákia kialakulásáért felelősek. A gliadinok ezen szakaszai a HLA-DQ2 antigén-felismerő rendszerhez kapcsolódva válthatják ki a lisztérzékenység (glutén-érzékenység, cöliákia) tünetegyüttesét. A lisztérzékeny egyén – főként a-gliadin – fogyasztása révén súlyos egészségkárosodást szenvedhet. A CÖLIÁKIÁS EGYÉNEK ÉLELMISZEREIT ELLENŐRIZNI KELL!

α-gliadin – DQ2 kötőhelyei

Az α-gliadin (baloldal) és a DQ2 szerotípus csoport H-hidas kötései. A HLA-DQ2 antitest felismerő rendszeren belül többek között a DQ2 szerotípus felelelős a lisztérzékenység kialakulásáért.

A számok az atomok közötti kötési távolságot jelölik Å-ben.

Gliadin + Glutenin (búzában kb. 50 – 50 %)

Gliadin

Glutenin

Gliadin + Glutenin = Glutén (vízzel: sikér)

A glutén térszerkezetes hálózatot alkot

A gabona-laboratóriumok egyik alapvető műszere

A sikér a dagasztás során vízben oldhatatlanná válik.

Köles és amarant – nem tartalmaznak gliadinokat

Codex Alimentarius Standard (1979; 1983; 2008)

Gluténmentes élelmiszerek

2.1.1 „Gluténmentes” diétás élelmiszerek a) csak egy vagy több összetevőből álló élelmiszer, amely nem tartalmaz búzát, illetve az összes Triticum fajokat (pl. durumbúzát, tönkölyt, kamutot, rozsot, árpát, zabot, vagy keresztezett fajtákat) és a glutén mennyisége nem haladja meg a 20 mg/kg szintet, vagy b) amely egy vagy több összetevőből áll búzából és egyéb Triticum fajokból származó anyagot tartalmaz, amelyből 20 mg/kg szint alá távolították el a glutént;

<20 mg/kg

Alacsony gluténtartalmú élelmiszerek

2.1.2 Nagyon alacsony gluténtartalmú élelmiszerek Olyan élelmiszerek, amelyekben egy vagy több összetevő búzából, illetve bármely Triticum fajból (pl. durumbúzából, tönkölyből, kamutból, rozsból, árpából, zabból, vagy keresztezett fajtákból) származik. A glutén-tartalmat különleges eljárással 20 és 100 mg/kg szint közé csökkenttették:

20< és <100 mg/kg

A Bizottság 41/2009 EK rendelete

A Bizottság 41/2009 EK rendelete – 3. cikk Gluténérzékenyeknek szánt élelmiszerek összetétele és címkézése (1) Gluténérzékenyeknek szánt élelmiszerek, amelyek egy vagy több olyan, búzából, rozsból, árpából, zabból, vagy ezeknek a keresztezett változataiból készült összetevőt tartalmaznak vagy ezekből állnak, amelyeket különleges eljárással úgy állítottak elő, hogy a gluténtartalmat csökkentsék, nem tartalmazhatnak 100 mg/kg-ot meghaladó szinten glutént a végső fogyasztó számára értékesített élelmiszerben. (2) Az (1) bekezdésben szereplő termékek címkézése, kiszerelése és reklámozása során fel kell tüntetni a „nagyon alacsony gluténtartalmú” kifejezést. A „gluténmentes” kifejezés akkor tüntethető fel, ha gluténtartalmuk a végső fogyasztó számára értékesített élelmiszerben nem haladja meg a 20 mg/kg-ot. (3) A gluténérzékenyeknek szánt élelmiszerekben található zabot olyan speciális módon kell előállítani, elkészíteni és/vagy feldolgozni, hogy a búzával, rozzsal, árpával, vagy ezek keresztezett változataival való szennyeződést elkerüljék, és az ilyen zab gluténtartalma nem haladhatja meg a 20 mg/kg-ot. (4) A gluténérzékenyeknek szánt élelmiszerek, amelyek egy vagy több olyan összetevőt tartalmaznak vagy ezekből állnak, amelyek a búzát, rozst, árpát, zabot vagy ezek keresztezett változatait helyettesítik, nem tartalmazhatnak 20 mg/kg-ot meghaladó szinten glutént a végső fogyasztó számára értékesített élelmiszerben. E termékek címkézése, kiszerelése és reklámozása során a „gluténmentes” kifejezést kell feltüntetni

Hőkezelés hatása a gliadinok kimutathatóságára

A gliadinok kimutathatósága hőterhelés hatására csökken. Ez összefügg a gliadinok hő hatásra bekövetkező denaturációjával, degradációjával, aggregációjával, ami alapvetően megváltoztatja az oldhatóságot. A, hőkezelt lisztekből 40 %-os etanollal több kivonat nyerhető, mint 70 %os etanollal. Dr. Horacsek Márta: A gliadin kimutatása élelmiszerekben. Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet, 1995. PhD tézisek.

Part pro million: ppm = 1 : 1 000 000 (mg/kg)

Gluténből 20 mg/kg, azaz 20 ppm mennyiséget megbízhatóan kell tudni kimutatni!

.

Part pro million = Egy a millióhoz (egy millió részből egyetlen rész)

A gluténtartalom ellenőrzésének gyakoribb módszerei

Elválasztási módszerek: - Gél-elektroforézis (Dr. Horacsek Márta PhD tézisek, 1995.); - Gélkromatográfia, gélszűrés, méretkizárásos kromatográfia; - Immun assay; - Enzim Linked Immun Sorbent Assay – ELISA (hagyományos, kompetitív); - Surface Plazmon Resonance Spectroscopy – SPRS; Detektálás:

- UV - FLD - MS (kapcsolt technikák) - Röntgen-diffrakcós eljárások

Néhány analitikai eljárás rövid vázlata

Immunkromatográfiás tisztítás 1/2

A keresett vegyület, most: gliadin

A minta valamely szennyezője

Immunkromatográfiás tisztítás 2/2

Mosás

Eluálás

Immun assay 1/5

Fehérje-molekulák

Egyéb részecskék

Immun-assay felület

Immun assay 2/5

Immun assay 3/5

Antitesteket tartalmazó reagens

Immun assay 4/5

Immun assay 5/5

A Fehérjék mennyiségi és minőségi meghatározása

Gél-elektroforézis 1/5

Mikrofecskendő

Minta oldata a fecskendőben Hordozólap

Poliamid réteg

Gél-elektroforézis 2/5 – a minta felvitele

Gél-elektroforézis 3/5 – Futtatás

Poliamid gél réteg

Felvitt minták


Std1

Std2

Std3

Minta1 Minta2 Minta3


Futtatás vége

Ismeretlen komp. Glutén (gliadin)

Rf3 Rf2

Rf1

Start Std1

Std2

Std3

Minta1 Minta2 Minta3

Poliakrilamid gél és annak elektronmikroszkópos képe

SDS-PAGE, Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis.

A kromatográfia elve

Kolonna

Komponens A

Komponens B

Dt Relatív retenciós idő

Kromatográfiás elválasztás molekulaméret alapján

tR << tR

Surface Plazmon Resonance Spectroscopy – SPRS 1/3

Prizma Elektromágneses hullámok

Dielektrikum

Y Y Y Y Y Y Y

Y Fémlemez (arany)

Rögzített antitestek

Mintatér


Visszavert fénysugár

Y Y Y Y Y Y Y

Beeső fénysugár

Y


D

Y Y Y Y Y Y Y

Beeső fénysugár

Y

Eva Engvall: az ELISA elvének megalkotója

Ph Doctor 1975-óta a Stockholmi Egyetemen.

Később posztgaduális munka Hhelsinkiben, majd a City of Hope National Medical Center in California. Hatékony kutatógárdát szervezett;

1979: Burman Institute Research Stockholm 1994: Tiszteletbeli orvos-doktor: Koppenhágai Egyetem;

Az ELISA elvét 1971-ben publikálta Peter Perlmann-nal a Stockholmi Egyetemen.

ELISA plate vázlatos képe (48 vájulattal)

ELISA plate – egy vájulat sémája

A polisztirol lemezhez antitesteket („Y”) kötnek

Y

ELISA plate – szendvics elrendezés

Y U Y U U Y U Y 3. Enzimhez kötött antitestet adnak az oldathoz

2. Újabb antitesteket adnak az oldathoz

1. A minta kötődik az antitesthez

Y

ELISA plate – szendvics elrendezés

Y U

4. A hozzáadott szubsztrát optikailag mérhető változást szenved

Y

ELISA plate (48 vájulattal, pozitív mintákkal)

Jelnagyság

ELISA mérőgörbék (kalibrációs görbék)

Hagyományos ELISA mérőgörbe

Kompetitív ELISA mérőgörbe

mg/kg (ppm)

Gyakoriság

Mérési bizonytalanság

Ha a mérési eredmények sokasága normális eloszlású: A gyakoriság görbéje egy Gaussfüggvénnyel írható le.

-3

-2

-1

0 Szórás (σ; s)

1

2

3

Mérési eredmények valószínűsége

Carl Friedrich Gauss (Gauß) (1777. április 30. – 1855. február 23.) német matematikus és természettudós.

Hibaterjedés a mintavételtől a vizsgálati eredményig 1/2

Alapsokaság (tétel)

Mintavételi hiba

Minta

Következtetés a tétel minőségére

Minta-előkészítés Minta-előkészítés hibája Laboratóriumi minta

Analitikai mérés

Mérési hiba Vizsgálati jegyzőkönyv

Hibaterjedés a mintavételtől a vizsgálati eredményig 2/2

+

Mintavételi hiba

+

Előkészítési hiba

=

Mérési hiba

A teljes folyamat hibája (bizonytalansága)

Mérési bizonytalanság – alsó méréshatár

Sávszélességek (intervallumok)

Detektált mennyiség

A mérés alsó határával együtt nő az a sávszélesség, amely a valószínűsíthető eredményt magában foglalja.

érzékenység


Normális eloszlás (Gauss-eloszlás)

99%

-5σ

-4σ

-3σ

-2σ

-1σ

+1σ

Várható érték

+2σ

+3σ

+4σ

+5σ


Ebből következik:

∫

f(x) = 1

Fizikai mérés eredménye sohasem lehet nulla!

A teljes haranggörbe alatti terület 100%, azaz egységnyi

-5σ

-4σ

-3σ

-2σ

-1σ

+1σ

Várható érték

+2σ

+3σ

+4σ

+5σ

Alsó méréshatár (LOQ – a nullától mérhető „távolság”)

Valódi érték

Az alsó méréshatár (LOQ) sohasem lehet nulla, így amennyiben a várható érték zérus, azt csak ésszerű technikai feltételek biztosításával lehet megközelíteni!

Döntési modellek 1/2

Döntés: szabad választás legalább 2 cselekvési lehetőség között.

Döntési helyzet: amikor a döntést hozó legalább két cselekvési változat közötti választás problémájával áll szemben. Döntési helyzet elemei:

• Döntéshozó (egyén v. csoport) • Stratégiák (cselekvési változatok) • Tényállapotok (a cselekvési változat következményeire hatással vannak) • Eredmény (stratégia és tényállapot következménye) • Döntési kritériumok (előírások, amely megmondják, hogyan használjuk fel az előbbi információkat a döntési változat kiválasztására.)

Döntési modellek 2/2

1. Biztos döntés : biztosan tudjuk, melyik következmény lesz az eredmény

2. Bizonytalan döntés: nem ismerjük a tényállapotok (következmények) valószínűségeit 3. Kockázatos döntés: a legtöbb valóságos döntési probléma ide tartozik (ismerjük a következmények valószínűségeit – ne feledjük: a lisztérzékeny egyén sorsa függ helyes döntésünktől!).

Mintavétel, tételminősítés, döntés az áru sorsa felől

Mintavételi előírások csomagolt termékekre 1/5

A tétel csomagolási egységekből áll A vizsgálathoz szükséges elemi minták száma függ: • A tétel nagyságától • A kívánt, elfogadható minőségi szinttől (AQL = Acceptable Quality Level), amelyet a mintavételt megrendelő személy választhat ki ISO 2859-1:1999 sz. szabvány alapján – következő dia…

Mintavételi előírások csomagolt termékekre 2/5

ISO 2859-1:1999 sz. szabvány: ISO 2859-1:1999 Sampling procedures for inspection by attributes -Part 1: Sampling schemes indexed by acceptance quality limit (AQL) for lot-by-lot inspection Revises ISO 2859-1:1999 Corrigendum 1 ICS 03.120.30 Ref. No. ISO 2859-1:1999/Cor.1:2001(E) Printed in Switzerland INTERNATIONAL STANDARD ISO 2859-1:1999 TECHNICAL CORRIGENDUM 1 Published 2001-03

Mintavételi előírások csomagolt termékekre 3/5 AQL = 1,0 % A mintázandó tétel mérete (csomagolási egység)

AQL = 2,5 %

AQL = 4,0 %

AQL = 10 %

Minta mennyisége (csomago-lási egység db)

Megengedett hibás csom. db



Minta mennyisége (csomagolási egység db)



Megen gedett hibás csom. db

2–8

Mind

0

Mind

0

Mind

0

Mind

1

9 – 15

13

0

5

0

3

0

5

1

16 – 25

13

0

5

0

8

0

5

1

26 – 50

13

0

8

0

8

1

8

2

51 – 90

13

0

13

1

13

1

13

3

91 – 150

20

0

20

1

20

2

20

5

151 – 280

32

1

32

2

32

3

32

7

281 – 500

50

1

50

3

50

5

50

10

501 – 1200

80

2

80

5

80

7

80

14

1 201 – 3 200

125

3

125

7

125

19

125

21

3 201 – 1 0000

200

5

200

10

200

14

125

21

10 001- 35 000

315

7

315

14

315

21

125

21

35 001 – 150 000

500

10

500

21

315

21

125

21

150 001 – 500 000

800

14

500

21

315

21

125

21

500 000 felett

1 250

21

500

21

315

21

125

21


AQL = 2,5 %

AQL = 4,0 %

AQL = 10 %









2–8

Mind

0

Mind

0

Mind

0

Mind

1

9 – 15

13

0

5

0

3

0

5

1

16 – 25

13

0

5

0

8

0

5

1

26 – 50

13

0

8

0

8

1

8

2

51 – 90

13

0

13

1

13

1

13

3

91 – 150

20

0

20

1

20

2

20

5

151 – 280

32

1

32

2

32

3

32

7

281 – 500

50

1

50

3

50

5

50

10

501 – 1200

80

2

80

5

80

7

80

14

1 201 – 3 200

125

3

125

7

125

19

125

21

3 201 – 1 0000

200

5

200

10

200

14

125

21

10 001- 35 000

315

7

315

14

315

21

125

21

35 001 – 150 000

500

10

500

21

315

21

125

21

150 001 – 500 000

800

14

500

21

315

21

125

21

500 000 felett

1 250

21

500

21

315

21

125

21


AQL = 2,5 %

AQL = 4,0 %

AQL = 10 %









2–8

Mind

0

Mind

0

Mind

0

Mind

1

9 – 15

13

0

5

0

3

0

5

1

16 – 25

13

0

5

0

8

0

5

1

26 – 50

13

0

8

0

8

1

8

2

51 – 90

13

0

13

1

13

1

13

3

91 – 150

20

0

20

1

20

2

20

5

151 – 280

32

1

32

2

32

3

32

7

281 – 500

50

1

50

3

50

5

50

10

501 – 1200

80

2

80

5

80

7

80

14

1 201 – 3 200

125

3

125

7

125

19

125

21

3 201 – 1 0000

200

5

200

10

200

14

125

21

10 001- 35 000

315

7

315

14

315

21

125

21

35 001 – 150 000

500

10

500

21

315

21

125

21

150 001 – 500 000

800

14

500

21

315

21

125

21

500 000 felett

1 250

21

500

21

315

21

125

21

Első és másodfajú hibák 1/5

A tétel „valódi” minősége

Döntés: Megfelelő a tétel

Döntés: Kifogásolható a tétel

Valóban megfelelő tétel

Nincs döntési hiba

Másodfajú döntési hiba: 

Valóban kifogásolható tétel

Elsőfajú döntési hiba: 






















Első és másodfajú hibák 4/5 Határérték

Elfogadás valószínűsége

1

0

Fals pozitív (eladói kockázat) Másodfajú hiba: β

Megfelelő tétel

Kifogásolt tétel

Fals negatív (vevői kockázat) Elsőfajú hiba: α

A tétel mintájának mérési eredményei (pl µg/kg)

Relatív szórás %


Várható érték

1

2

3

4

5

6

7

Ismételt mérések sorszáma

Megoldások a másodfajú hiba csökkentésére:

• Mintaszám növelésével (ennek hatására az α is csökken) • Tűréshatárok csökkentésével.

Konfidencia-számítás (egyik a sokféle közül)

±s * t n S = szórás, t = t-táblázat értékei (student tábla), n = szabadsági fokok száma

Köszönöm megtisztelő figyelmüket!

A gluténtartalom mérésének lehetőségei, mérési bizonytalanság

Recommend Documents