PANNON EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI- ÉS ANYAGTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA
A biohidrogén Escherichia coli-val megvalósított előállításának és membrános szeparálásának vizsgálata DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS KÉSZÍTETTE: Bakonyi Péter OKLEVELES KÖRNYEZETMÉRNÖK
TÉMAVEZETŐ: Dr. Nemestóthy Nándor TUDOMÁNYOS MUNKATÁRS
PANNON EGYETEM BIOMÉRNÖKI, MEMBRÁNTECHNOLÓGIAI ÉS ENERGETIKAI KUTATÓ INTÉZET
2012
A biohidrogén Escherichia coli-val megvalósított előállításának és membrános szeparálásának vizsgálata Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében *a Pannon Egyetem …................................. Doktori Iskolájához tartozóan*. Írta: Bakonyi Péter **Készült a Pannon Egyetem Vegyészmérnöki- és Anyagtudományok Doktori iskolája/ programja/alprogramja keretében Témavezető: Dr. Nemestóthy Nándor Elfogadásra javaslom (igen / nem) (aláírás)** A jelölt a doktori szigorlaton ........%-ot ért el, Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem ………………………. (aláírás) Bíráló neve: …........................ ….................) igen /nem ………………………. (aláírás) ***Bíráló neve: …........................ ….................) igen /nem ………………………. (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …..........%-ot ért el. Veszprém/Keszthely,
…………………………. a Bíráló Bizottság elnöke
A doktori (PhD) oklevél minősítése…................................. ………………………… Az EDHT elnöke Megjegyzés: a * közötti részt az egyéni felkészülők, a ** közötti részt a képzésben résztvevők használják, *** esetleges
2
Tartalomjegyzék Absztrakt ............................................................................................................................... 5 Summary ............................................................................................................................... 6 Auszug.................................................................................................................................... 7 1.
Bevezetés ..................................................................................................................... 8
1.1.
A hidrogén biológiai előállításának koncepciója, megoldandó problémái ................ 10
2.
Célkitűzések ............................................................................................................. 13
3.
Irodalmi áttekintés .................................................................................................. 14
3.1. A H2 előállítás biológiai módszerei ............................................................................ 14 3.1.1. Direkt biofotolízis ...................................................................................................... 15 3.1.2. Indirekt biofotolízis ................................................................................................... 16 3.1.3. Fotofermentáció ......................................................................................................... 17 3.1.4. Sötét fermentáció ....................................................................................................... 19 3.2.
Lehetőségek a hidrogéntermelés hatékonyságának növelésére ................................. 23
3.3.
Fermentációs hidrogéntermelés Escherichia coli-val................................................ 24
3.4.
Az Escherichia coli hidrogenázainak, hidrogén metabolizmusának részletes bemutatása ................................................................................................................. 26
3.5.
Hatékony biohidrogén termelő rendszerek kialakítása .............................................. 30
3.6.
A kísérlettervezés ...................................................................................................... 30
3.7.
A biohidrogén fermentáció kísérlettervezéssel történő optimalizálásának lépései ... 31
3.8.
A baktériumok növekedésének kinetikája ................................................................. 33
3.9.
A hidrogén szeparációja ............................................................................................ 36
3.10. A membrános gáz szeparáció .................................................................................... 38 3.11. A hidrogén szeparációja pórusmentes, polimer membránokkal ................................ 41 4.
Kísérleti rész ............................................................................................................. 44
4.1. A fermentációs kísérletek során alkalmazott anyagok, eszközök, módszerek ........... 44 4.2.
A membrános gáz szeparációhoz használt anyagok, eszközök, módszerek .............. 52
5.
Eredmények és értékelésük..................................................................................... 58
5.1.
Kísérletek a formiát szubsztrát hatásának vizsgálatára ............................................. 58
5.2.
A biohidrogén fermentáció optimalizálása kísérlettervezéssel ................................. 59
5.2.1. A fermentációs paraméterek hatásának, a kulcsfaktorok körének meghatározása .... 60 5.2.2. Az optimális formiát koncentráció meghatározása.................................................... 64 5.3.
Az Escherichia coli (XL1-BLUE) szaporodási kinetikájának vizsgálata ................. 66
5.4.
Biohidrogén fermentáció folyamatos rendszerben .................................................... 70 3
5.5.
Az Escherichia coli (XL1-BLUE) és (DJT 135) baktériumtörzsek hidrogéntermelésének összehasonlítása .................................................................... 75
5.6.
Gáz szeparációs kísérletek az ME1 membrán modul használatával ......................... 81
5.7.
Gáz szeparációs kísérletek az UBE „NM-B01A” membrán modullal a GSMS-100 membrántesztelő készülékben ................................................................................... 83
6.
Összefoglalás ............................................................................................................ 88
7.
Új tudományos eredmények ................................................................................... 90
8.
Novel scientific results ............................................................................................. 92
9.
Irodalomjegyzék ...................................................................................................... 94
10.
Publikációs jegyzék................................................................................................ 103
11.
Köszönetnyilvánítás ............................................................................................... 106
4
Absztrakt Munkám első részében fermentációs kísérleteket végeztem biohidrogén előállítása céljából különböző Escherichia coli baktériumtörzsekkel. A kísérletek első részében szakaszos rendszerben, E. coli (XL1-BLUE)-ot alkalmazva, kísérlettervezéses
alapon
változtattam
a
fermentációs
körülményeket
(formiát-,
élesztőkivonat-, tripton-, NaCl- és sejtkoncentráció, keverési sebesség) a minél hatékonyabb biohidrogén előállítás érdekében, s meghatároztam a hidrogénképződés szempontjából optimális paraméterkombinációkat. Következő lépésként formiát szubsztrát alkalmazásával vizsgáltam az E. coli (XL1BLUE)-ra jellemző szaporodási kinetikáját, melynek során megállapítottam a növekedés exponenciális szakaszának, s ezzel együtt a legintenzívebb gáztermelésnek az időszakát. Ezen túlmenően számítottam a folyamatos rendszer tervezéséhez fontos kinetikai konstansok, a maximális szaporodási sebesség és a szubsztrát féltelítési állandó értékeit is, majd folyamatos üzemű, tökéletesen kevert bioreaktort alakítottam ki és meghatároztam az optimális hidraulikus tartózkodási idő értékét. A biohidrogén termelés fokozására bemutattam a metabolikusan módosított törzsek alkalmazása és a folyamatoptimálás adta lehetőségeket, melynek során összehasonlító vizsgálatot végeztem az E. coli (XL1-BLUE) és az expressziós mutáns E. coli (DJT 135) között, a formiát koncentráció és pH hatását vizsgálva. Az eredmények tükrében elmondható, hogy utóbbi törzs optimális körülmények között 50%-kal nagyobb hidrogén hozam elérését teszi lehetővé az előző organizmushoz képest. A kísérletek második felében célom az volt, hogy a keletkezett gázból – amely összetételében egy több komponensű gázelegynek tekinthető – a biohidrogént valamilyen módon elválasszam, ami a hidrogén végfelhasználása érdekében fontos. Az elválasztáshoz két pórusmentes, kapilláris csöves, poliimid anyagú membránt (ME1 és UBE „NM-B01A” modulok) teszteltem. A kísérleteket a gázelegyre jellemző egykomponensű gázokkal, valamint biner – hidrogén és szén-dioxid tartalmú – gázeleggyel folytattam, s meghatároztam az adott gázokra jellemző, a vizsgált membránokra vonatkozó permeabilitás és szelektivitás értékeket különböző szeparációs körülmények (hőmérséklet, retentátum elvételi arány) mellett. Az eredmények alapján elmondható, hogy ezen típusú membránok potenciálisan alkalmasak a biohidrogén szeparációjára.
5
Summary In this dissertation biohydrogen fermentation by using various E. coli strains and the purification of biohydrogen from multicomponent gaseous mixture by membranes were aimed to study. Firstly, the optimal conditions (formate-, yeast extract-, tryptone-, NaCl concentration, inoculum size, stirring speed) for batch biohydrogen fermentation using E. coli (XL1-BLUE) were investigated by experimental design. It was found that among the several variables only formate compound plays a key role in hydrogen formation and the optimal conditions for biohydrogen production were determined. Secondly, a kinetic investigation was performed on formate supplemented broth by employing the same bacteria and the exponential growth phase – when the most intense gas formation takes place – was determined. Furthermore, important process design parameters such as saturation constant and maximal growth rate were calculated. Afterwards, based on the kinetic study, continuous hydrogen fermentations using the cultures of E. coli (XL1BLUE) were carried out in a CSTR reactor at various hydraulic retention times (HRT) and its optimum value for biohydrogen formation was determined. Thirdly, the benefit of simultaneous application of metabolic engineered strains and process optimization through a comparative study of wild-type E. coli (XL1-BLUE) and expression mutant E. coli (DJT 135) was demonstrated. The effect of two major operational factors (formate concentration and pH) on bioH2 production was investigated and the results revealed that using E. coli (DJT 135) strain under optimized conditions 1.5 times higher yield could be obtained compared to the wild-type E. coli (XL1-BLUE). In addition to production purposes, biohydrogen recovery was also investigated by testing different non-porous, hollow-fiber, polyimide membranes (ME1 and UBE „NMB01A”) at various operational conditions (temperature, retentate and feed flow ratio). Based on the obtained permeability and selectivity data – determined in single and binary gas experiments, as well – it was concluded that such membranes possess real potential for efficient hydrogen enrichment.
6
Auszug. Im ersten Teil der Arbeit wurden Fermentationsversuche durchgeführt, um Biowasserstoff aus verschiedenen Escherichia coli Bakterien-Stämmen herzustellen. Zuerst wurden die Bedingungen der Fermentation (Formiat-, Inokulum, Trypton-, NaCl- und Zellkonzentration, Geschwindigkeit der Mischung) unter Verwendung von E. coli (XL1-BLUE) in einem diskontinuerlichem System durch experimentelle Versuchsplanung untersucht, um die Biowasserstobbausbeute zu erhöhen. Als näschster Schritt wurde die charakteristische Wachstumkinetik der E. coli (XL1BLUE) unter Verwendung von Formiatsubstrat untersucht wodurch der Zeitinterwall der Phase des exponentiellen Wachstums und gleichzeitig der der intensivsten Gasproduktion festgestellt. Es wurden weiterhin die zur Planung des kontinuierlichen Systems wichtigen kinetischen Kostanten, die maximale Wachstumrate und die Sättigungskonzentration berechnet. Dann wurde ein kontinuierlich durchströmter Rührkesselreaktor ausgestattet und die optimalen hydraulischen Verweilzeiten wurden ermittelt. Um die Biowasserstoffproduktion zu erhöhen, wurden die Möglichkeiten, die durch die Anwendung von metabolisch modifizierten Stämmen und Prozessoptimierung gegeben werden demonstriert. Vergleichuntersuchungen wurden zwischen E. coli (XL1-BLUE) und Expressionsmutant E. coli (DJT 135) gemacht, wobei die Wirkung der Formiatkonzentration und des pH-Wertes untersucht wurden. Im Spiegel der Ergebnisse kann gesagt werden, dass der letztere Stamm im Vergleich zum vorherigen Organismus bei optimalen Bedingungen die Erreichung von um 50 % höhere Wasserstoffausbeute ermöglicht. In dem zweiten Teil der Versuche mein Ziel war es, aus dem produziertem Gas – das als ein mehrkomponentes Gasgemisch betrachtet werden kann – das Biowasserstoff irgendwie abzutrennen, was für die Endverwendung des Wasserstoffes wichtig ist. Zur Trennung wurden zwei porenlose, kapillare Membrane bestehend aus Polyimid (ME1 and UBE „NMB01A”) getestet. Die Versuche wurden mit einkoponenten Gasen sowie mit bineren, Wasserstoff und Kohlendioxid enthaltenden Gasgemischen durchgeführt und es wurden die auf die gegeben Gase charakterische Permeabilität- und Selektivität-Werte bei verschiedenen Separationsbedingungen bestimmt. Aufgrund der Ergebnisse kann man sagen, dass die Membranen von solcher Typ potenziell für die Trennung von Biowasserstoff geeignet sind.
7
1. Bevezetés Mára a fosszilis energiahordozók (kőolaj, kőszén, földgáz) féktelen „habzsolása” következtében a Föld nem megújuló energiatartalékai mind inkább a kimerülés szélére kerülnek, mellyel párhuzamosan környezetünk is egyre növekvő károkat szenved el. Napjainkban a kőolaj-finomítók minden 1 millió tonna feldolgozott kőolajra vonatkoztatva (az európai üzemek feldolgozó kapacitása 0.5-20 millió tonna/év) 20000-820000 tonna széndioxidot, 60-700 tonna nitrogén-oxidot, 10-3000 tonna port, 30-6000 tonna kén-dioxidot és 50-6000 tonna illékony szerves vegyületet (VOC) bocsátanak ki [Kovács, 2010]. Nyilvánvaló, hogy
bolygónk
további
kizsákmányolásának
és
a
környezet
elszennyeződésének
visszaszorítása érdekében szükség van a fosszilis készletek felhasználásának csökkentésére az azokat helyettesíteni képes megújuló energiaforrások használatának segítségével. A fosszilis energiahordozók (kőszén, kőolaj, földgáz) uralma 1960-1970-es évekig az energiaellátás minden területén töretlen volt. Az élhető környezet iránti egyre növekvő igény felerősödésével
párhuzamosan
1967-1972
között
jelentek
meg
az
első
olyan
kezdeményezések, melyek a környezetbarát energiaforrások kutatását célozták meg, majd az 1973-as energiaválság ébresztette rá az emberiséget arra, hogy itt az ideje cselekedni, itt az ideje az alternatív energiahordozók irányába fordulni, s minél inkább függetleníteni magunkat a nem megújuló forrásoktól. Ennek szellemében még abban az évben megalakult a Miami Egyetemen (USA) a Clean Energy Research Institute (CERI), s ez volt az első olyan kutató intézet, amelynek célja a megújuló, „zöld” energiahordozók kutatása volt. A megújuló energiaforrás olyan közeg, természeti jelenség, melyekből energia nyerhető ki, és amely akár naponta többször ismétlődően rendelkezésre áll, vagy jelentősebb emberi beavatkozás nélkül legfeljebb néhány éven belül újratermelődik. A „zöld” energiaforrások használata lehetővé teszi a fenntartható fejlődés alapelveinek való megfelelést, vagyis ezek alkalmazása nem károsítja, szennyezi a környezetet, ugyanakkor nem gátolja a folyamatos emberi fejlődés lehetőségét sem. A CERI-ben dolgozó kutatók voltak az elsők, akik felvetették egy hidrogén alapú gazdaság, energiaellátó rendszer gondolatát. 1974-ben megalakult az International Association for Hydrogen Energy (IAHE), melynek vezetősége úgy döntött, hogy a hidrogénnel kapcsolatos kutatások eredményeinek, vívmányainak közkinccsé tétele érdekében létrehoznak egy hivatalos folyóiratot International Journal of Hydrogen Energy (IJHE) néven, melynek első kiadása 1976 januárjában jelent
8
meg. Az első hidrogénnel kapcsolatos világméretű konferenciát szintén ebben az évben tartották Miamiban. Az évek múlásával a hidrogénnel kapcsolatos tudományterület egyre nagyobb ismertségre és népszerűségre tett szert, egyre több fontos felfedezés, eredmény látott napvilágot, melyet mi sem bizonyít jobban, minthogy az IJHE kezdetben negyedévi megjelenéssel indult, míg 2008-tól ez a szám már évi 24 kiadványra emelkedett. Az ipar és a hidrogénenergia közötti kapcsolatot illetően elmondható, hogy az 1974-től napjainkig terjedő időszakban a hidrogént az ipar számos területéről egyre fokozódó érdeklődés követi - kivéve a petrolkémiai ipart. Az IAHE vezetői az évek során többször próbálták érdemben felvenni a kapcsolatot az olajipari vállalatokkal, azonban ezek a próbálkozások rendre sikertelennek bizonyultak, ugyanis az olajipar képviselői szerint a hidrogéngazdaság nem volt más, mint egy „romantikus” elképzelés. Mindezek mellett a küzdelem nem bizonyult hiábavalónak, mivel 1998 augusztusában a Shell Oil Co. szakított az addigi általános gondolkodásmóddal, s létrehozta saját „Hidrogén Divízióját” elhagyva ezzel az „anti-hidrogén” konzorciumot. A Shell törekvéseit nem sokra rá követte a BP olajtársaság is, s ezzel az olajipar is elkezdett a hidrogénnel, mint ígéretes energiaforrással foglalkozni. Azt, hogy a hidrogén alapú energiaellátás már nem csak egy „romantikus” gondolat, több tény támasztja alá, melyre példaként szolgálhatnak a világszerte jelenleg is folyó kezdeményezések. Németországban például egy 7 ipari partnerből, 3 olajipari vállalatból, 1 ipari gáz gyártóból és 1 autó gyártóból álló konzorcium támogatásával megvalósuló „H2 mobility” projekt, míg Japánban a petróleum ipar számos tagját (Nippon Oil, Tokyo Gas, Showa Shell, Osaka Gas, Toko Gas, Air Liquid Japan, Idemitsu Kosan) tömörítő szervezet, a „H2 Supply Technology Association” jött létre azért, hogy lépéseket tegyenek egy a hidrogén-t (is) felhasználó energia ellátó rendszer létrehozására. Másik fontos példaként említhető, hogy több autógyártó cég (General Motors, Toyota, Ford, Honda, Daimler, Hyundai, Kia, Renault, Nissan) tervei között szerepel az is, hogy a jövőben üzemanyagcellás, hidrogén-meghajtású autók tömegét gyártsák le és állítsák forgalomba, s ennek elérésére évente dollár milliárdos nagyságrendű összegeket költenek kutatásra, fejlesztésre [Veziroglu, 2010]. A mai várakozások, előrejelzések szerint kb. 2040-2050-re jöhet el azaz időszak, amikor is az előállítási költségek, a szükséges infrastruktúra kiépítettsége, a technikai feltételek és a politika elhivatottsága olyan szintre kerülnek, hogy a hidrogénenergia nagymértékben képes lehet felváltani a hagyományos, jelenleg még szinte kizárólagosan fosszilis energiára épülő energiaellátó rendszereket [Lee, 2008]. 9
1.1.
A hidrogén biológiai előállításának koncepciója, megoldandó
problémái A hidrogén ideális energiahordozó környezetvédelmi, egészségügyi és energetikai szempontokból egyaránt, mivel tömegegységre vonatkoztatott energiatartalma nagyobb (120 MJ/kg), mint a metáné (földgáz), továbbá használatával nincs szennyezőanyag kibocsátás, ha alacsony hőmérsékleten, üzemanyag cellákban hasznosítjuk, hiszen oxidációjának terméke kizárólag
víz,
melynek
eredményeképpen
elkerülhető
a
regionális-
és
globális
légszennyezettségért főként felelős NOx és CO2 gázok kibocsátása. A hidrogén üzemanyagcellákban való hasznosításával jelentősen nagyobb energia átalakítási hatásfok (ηüc~50-60 %) érhető el a hagyományos belsőégésű robbanómotorokhoz képest, melyek további előnye, hogy működésük csendes (mivel nincs bennük mozgó alkatrész), így a hidrogénnel működtetett üzemanyagcellás járműveknek, szállító eszközöknek nincs zajkibocsátása. Ahhoz, hogy a hidrogén a jövő energiaforrása lehessen, mindenképpen környezetbarát eljárásokkal kell azt előállítanunk, napjainkban azonban az ipar különféle területein felhasznált hidrogén kb. 96%-át fosszilis alapon, főként metán vízgőzös reformálásával állítják elő, éves mennyisége mintegy 65-70 millió t (IEA, 2007). A hagyományos eljárásokon túlmenően a hidrogén megújuló forrásból, biológiai úton történő előállítása ígéretes, alternatív lehetőségnek tekinthető, azonban ehhez kapcsolódóan számos probléma vár még megoldásra, melyek döntően az előkezelés, előállítás, szeparálás, tárolás, felhasználás tárgykörét érintik (1.1. ábra).
1.1.
ábra – A biológiai módszerrel történő hidrogén előállítási technológia 10
A növényi biomassza, a mezőgazdasági és ipari (gyümölcsfeldogozó ipar, papíripar, élelmiszeripar, stb.) eredetű cellulóz/hemicellulóz/lignin tartalmú (hulladék)anyagok szinte kimeríthetetlen – szénhidrátban gazdag - forrást jelentenek, s potenciálisan felhasználhatók biohidrogén előállításra. A komplex összetételű anyagok biohidrogénné fermentálhatóságának kulcslépése a hidrolízis, mert a szubsztrátoknak elsőként a baktériumok számára hozzáférhető, felvehető, hasznosítható formába kell alakulniuk. Ahhoz azonban, hogy a hidrolízis jó hatásfokkal működhessen, a legtöbb esetben szükség van valamilyen fizikai (pl. aprítás, darálás, gőz- v. gázrobbantás, ultrahangos előkezelés, stb.), kémiai (savas vagy lúgos előkezelés) vagy enzimatikus előkezelésre. A legjobb természetesen az lenne, ha sikerülne olyan „mindenevő” mikroorganizmusokat azonosítani és alkalmazni, melyek a fizikai/kémiai eljárások elhagyásával is képesek az összetett alapanyagok hatékony lebontására és hasznosítására pusztán a saját maguk által megtermelt specifikus enzimek segítségével közvetlenül a bioreaktorban. Erre potenciálisan olyan mikrobák, mikrobakonzorciumok lehetnek alkalmasak, melyek nagy mennyiségben képesek a különféle enzimek pl. endo- és exoglükonáz, β-glükozidáz, hemicelluláz, xilanáz, stb. enzimek termelésére [Nath, 2004; Lo, 2008; Lee, 2010]. Az előkezelt biomasszából ezt követően hidrogént állítunk elő, melynek helyszíne a bioreaktor. Az előállítás történhet egy- ill. többlépcsős eljárással is. Az első lépcső általában sötét fermentációt jelent, s ehhez opcionálisan valamilyen kiegészítő eljárás kapcsolható (pl. fotofermentáció, mikrobiális üzemanyag cella, mikrobiális elektolízis cella, metán fermentáció), amellyel jelentősen növelhető a folyamat hatékonysága [Liu, 2005; Cooney, 2007;
Laurinavichene,
2010;
Pant,
2010].
Emellett
a
biohidrogén
technológia
versenyképessége növelhető a fermentációs paraméterek megfelelő beállításával is, hiszen ezeken keresztül befolyásolhatjuk a bioreaktorban lévő mikroba, mikrobakonzorcium anyagcsere folyamatait, vagyis a megfelelő kombinációkkal nagyobb hozamok és gázképződési sebességek érhetők el. Továbbá, a biológiai módszerekkel előállított hidrogént – a későbbi felhasználási céltól függően – tisztítani is kell, hiszen az a fermentorban nem önmagában, hanem egyéb komponensekkel együtt (főként CO2, emellett vízgőz, kén-hidrogén) keletkezik [Shao, 2009]. A hidrogén tárolása szintén kulcskérdés, melynek kapcsán még nincsenek kiforrott megoldások. A hidrogén palackokban, komprimált állapotban történő tárolása, szállítása nagyléptékben nem nyújt megfelelő megoldást.
11
A kívánatos megoldás az lenne, hogy olyan anyagokat fejlesszünk ki, melyek nagy kapacitással, biztonságosan teszik lehetővé a hidrogén tárolását. A legújabb eredmények alapján a különböző fémhidridek (pl. LiBH4, NaAlH4, stb.) illetve szénnanocsövek, grafitnanoszálak lehetnek azok az anyagok, melyek fejlesztésével megfelelő üzemanyagtároló egységeket hozhatunk létre, azonban ezek még nem versenyképes alternatívák [Schlapbach, 2001; Cheng, 2001]. Végezetül pedig még jobb hatásfokú, még hosszabb élettartamú, még alacsonyabb előállítási költségű üzemanyagcellákat kellene kifejleszteni annak érdekében, hogy megfizethető áru, megbízható, a vásárlók széles körének elérhető hidrogénüzemű járművek álljanak rendelkezésre [Levin, 2004]. Az
eddigiek
alapján
látható,
hogy
számos
olyan
terület
van,
ahol
a
hidrogéntechnológia fejlesztésébe be lehet kapcsolódni, s doktori munkám során én az 1.1. ábrán feltüntetett két fontos részre, a biohidrogén sötét fermentációs előállítására és annak (membrános) tisztítására, szeparációjára fókuszáltam.
12
2. Célkitűzések Doktori munkám során az alábbiakat tűztem ki célul: 1. E. coli (XL1-BLUE) baktériumtörzset és formiát szubsztrátot alkalmazva a sötét fetmentációs biohidrogén előállítás vizsgálata és optimalizálása szakaszos rendszerben a hidrogéntermelés hatékonyságának maximalizálása érdekében. 2. A baktérium szaporodási kinetikájának tanulmányozása, az exponenciális növekedési szakasz, valamint a kinetikai konstansok (maximális szaporodási sebesség, szubsztrát féltelítési állandó) meghatározása. 3. A szakaszos rendszerben végzett vizsgálatok, valamint az E. coli (XL1-BLUE) szaporodási jellemzőinek meghatározása során nyert eredményekre alapozva a hidrogén fermentáció megvalósítása folyamatos üzemű bioreaktorban, optimális hidraulikus tartózkodási idő meghatározása. 4. A biohidrogén fermentáció hatékonyságának növelésére vonatkozó – a metabolikus mérnökség és a folyamatoptimálás együttes alkalmazásában rejlő – lehetőségek bemutatása, alkalmazása. Ennek keretében az E. coli (XL1-BLUE) és a metabolikusan módosított E. coli (DJT 135) hidrogéntermelő képességének összehasonlító vizsgálata. 5. A fermentáció során keletkező gázelegy szétválaszthatóságának vizsgálata membrános gáz szeparációval a hidrogén kinyerése, koncentrálása céljából. Ehhez kapcsolódóan a potenciális membránok tesztelése, jellemzése egykomponensű, valamint kevert gázokkal, az elválasztás műveleti paramétereinek a szeparációs hatékonyságra gyakorolt hatásának tanulmányozása.
13
3. Irodalmi áttekintés Figyelembe véve azt a tényt, hogy a hidrogén előállítása nagy mennyiségben rendelkezésre álló, megújuló forrásból kívánatos, célszerű a biomasszából kiinduló lehetőségek felé fordulnunk. A hidrogén biomassza, vagyis megújuló alapon történő előállításának több módja is ismeretes, közöttük megkülönböztetünk termokémiai és a biológiai eljárásokat, melyeket a 3.1. ábra szemléltet.
3.1. ábra – A hidrogén biomasszából történő előállításának lehetőségei
3.1. A H2 előállítás biológiai módszerei A
mikrobák
–
élettani
tulajdonságaik
és
metabolizmusuk
sokféleségének
köszönhetően – különböző folyamatok révén képesek hidrogént termelni, melyek mindegyikének megvannak a maguk jellemző tulajdonságai, előnyei és hátrányai [Manish, 2008]. Mérnöki szempontból nézve a hagyományos hidrogén előállító eljárásokhoz (pl. metán vízgőzös reformálása) képest mindenképpen előnyösek, hiszen a mikrobiális sejtek olcsó biokatalizátorok, valamint alkalmazásuk nagyságrendekkel kisebb energia befektetést igényel a reaktorok üzemeltetése során, mivel ezek a környezetihez közeli hőmérsékleti és nyomás tartományban
játszódnak
le.
A
hidrogén
biológiai
módszerekkel
való
előállítási
lehetőségeinek felismerése kb. egy évszázados múltra tekint vissza, s az 1970-es évektől kezdődően ezek a lehetőségek fokozatosan, egyre inkább a figyelem fókuszába kerültek. Közös jellemzőjük, hogy hidrogéntermelő (hidrogenáz és nitrogenáz) enzimek vesznek részt benne, anaerob körülmények között [Manish, 2008; Das, 2001]. A nitrogenáz enzimek fő építőelemei a Mo-, Fe- és V-tartalmú fehérjék. Ezen enzimeknek megvan a képességük arra, hogy ATP-t és elektronokat felhasználva protonokat hidrogénné redukáljanak [Eroglu, 2011].
14
A
hidrogenázok
a
legtöbb
hidrogéntermelésre
képes
mikroorganizmusban
megtalálhatók és 2 fő osztályba, hidrogénfelvevő (uptake) és a reverzibilis hidrogenázok közé sorolhatók be. Elnevezésüknek megfelelően az első csoport képviselői a hidrogén oxidációját katalizálják (H2
2H+ + 2e-), míg a másik osztályba tartozók a hidrogén előállítására (fölös
redukáló erő H2 formájában való eltávolítása) és oxidációjára (H2
2H+ + 2e-) is képesek a
környezeti (pl. redox) feltételek függvényében. A hidrogenázok számos baktériumban, valamint néhány eukariótában (pl. algákban) fordulnak elő. Az aktív centrumban helyet foglaló fémtartalmuk szerint három fő csoportjuk különíthető el: [NiFe]-hidrogenázok, [FeFe]-hidrogenázok és [Fe]-hidrogenázok [Kim, 2011], melyek a nitrogenázokkal való összehasonlításban nagyságrendileg gyorsabb működésre képesek és a katalitikus átalakítás nem igényel energia (ATP) befektetést [Mathews, 2009]. A hidrogenázok működése érzékeny az oxigénre, s oxigéntoleranciájuk tekintetében jelentős különbség mutatkozik közöttük: míg a [FeFe]-hidrogenázok extrém érzékenységgel rendelkeznek, a [NiFe]-hidrogenázok jelentősen nagyobb mértékben képesek ellenállni az oxigén okozta inhibíciónak [Mathews, 2009]. A biológiai hidrogén előállító módszereket 3 fő csoportba különíthetjük el: biofotolízis, fotofermentáció és sötét fermentáció [Das, 2001].
3.1.1. Direkt biofotolízis A hidrogéntermelés eme módja a zöld algákra (pl. Clamydomonas reinhardtii, Chlorella fusca, Scendesmus obliquus, Chlorococcum littorale, Platymonas subcordiformis) és cianobaktériumokra (pl. Synechocystis, Synechococcus, Gloebacter nemzettség tagjai) jellemző. Az organizmusokban jelenlévő PSI és PSII fotokémiai rendszerek fényt nyelnek el, s a PSII rendszer oxidálja a vizet, melyből protonok, elektronok és O2 keletkezik. Ezt követően a keletkezett elektronok a PSI rendszer által felvett fényenergia segítségével egy ferrodoxin molekulára vándorolnak s redukálják azt (Fdred), majd végül a redukált állapotú ferrodoxinról származó elektronok (Fdred→Fdox) és a vízbontásból származó protonok hidrogénné rekombinálódnak [Levin, 2004; Das, 2001; Hallenbeck, 2009a]:
2 H2O
h
2 H2 + O2
h : foton (fény) energiája (h: Planck-állandó; : frekvencia)
15
3.1.1.1. ábra – A direkt biofotolízis folyamata [Hallenbeck, 2009a] Mivel a hidrogenázok rendkívül érzékenyek az oxigénre, mindenképpen szükséges az O2 tartalmat 0.1 %(V/V) alatt tartani [Levin, 2004; Das, 2001; Hallenbeck, 2009a]. A folyamat oxigén toleranciáját, s ezen keresztül a hidrogén termelés hatékonyságát fehérjemérnöki módszerek alkalmazásával, oxigén toleráns hidrogenázok és mutáns törzsek létrehozásával is igyekeznek megnövelni [Ni, 2006; Hallenbeck, 2009a]. Mindemellett, direkt biofotolízissel ma még az extrém magas előállítási ár miatt nem lehet ipari méretekben, gazdaságosan hidrogént előállítani. Előnyök: -
megújuló szubsztrát: víz és napfény
-
zéró CO2 kibocsátás
Hátrányok: -
nincs fenntartható technológia
3.1.2. Indirekt biofotolízis Indirekt biofotolízis alkalmazásával a direkt biofotolízis során fellépő oxigén gátlás elkerülése a cél, amikor is a biomassza képződés és a hidrogén előállítás időben/térben elkülönül. Ez a folyamat szintén zöld algák és cianobaktériumok segítségével valósítható meg. Az 1. lépésben fotoszintézis történik, amikor is az egyes élőlények vízből és széndioxidból, a fotoszintetikus rendszer és napfény segítségével oxigént és szerves anyagot (glükóz) előállítanak elő, melyet különböző formákban (pl. keményítő, glikogén) tárolnak. Ez a növekedés v. biomassza képződés szakasza. A 2. lépésben összegyűjtik, koncentrálják a 16
keletkezett biomasszát, s anaerobizálják a rendszert. Ekkor a felhalmozott poliszacharid fermentatív átalakulása történik meg, melynek során a keletkező elektronok és protonok – az anaerob körülmények hatására aktivizálódó – hidrogéntermelő enzimek által hidrogénné alakulnak. A folyamat koncepciója, lépései tehát a következők [Levin, 2004; Das, 2001; Hallenbeck, 2009a]: (1) fotoszintézis, biomassza termelés; (2) a keletkezett biomassza koncentrálása; (3) anaerob, sötét fermentáció (a sejttömegben felhalmozott poliszacharid átalakítása hidrogénné és acetáttá); (4) a keletkezett acetát hasznosítása A folyamat egyszerűsítve az alábbi reakcióegyenlettel írható le:
12 H2O + 6 CO2 C6H12O6 + 6 H2O
h
C6H12O6 + 6 O2 (biomassza képződés fény jelenlétében) 12 H2 + 6 CO2 (hidrogén képződés sötét fermentáció során)
Előnyök: -
megújuló szubsztrát: víz és napfény
-
O2/H2 termelés külön választása – O2 inhibíció elkerülése
Hátrányok: -
alacsony hidrogéntermelési ráta
-
alacsony fénykonverziós hatékonyság
-
a megvalósítás (fotobioreaktorok tervezése, üzemeltetése) költséges
3.1.3. Fotofermentáció A biohidrogén termelés eme módja bíbor (nem-kén) baktériumok (pl. Rhodospirillum rubrum, Rhodopseudomonas palustris, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus) alkalmazásával valósítható meg, melyek a biofotolízissel ellentétben nem hidrogenáz, hanem nitrogenáz enzim(ek) által katalizálják a hidrogéntermelést. A nitrogenáz enzimek elsődleges feladata a molekuláris nitrogén fixálása, ammóniává alakítása. Anaerob körülmények között, N2 jelenlétében vagy annak hiányában azonban a nitrogenázok hidrogén előállításra képesek 17
rövid szénláncú szerves savak, fermentációs termékek (pl. acetát, butirát, malát, laktát, szukcinát, propionát) és a napenergia felhasználásával [Levin, 2004; Das, 2001; Hallenbeck, 2009a; Eroglu, 2011]:
CH3COOH + 2 H2O
h
4 H2 + 2 CO2
3.1.3.1. ábra – A fotofermentáció folyamata [Hallenbeck, 2002] A bíborbaktériumok fotoszintetikus pigmentjei jellemzően a látható (400-700 nm) és a közeli infravörös (700-950 nm) sugárzás tartományában képesek fényelnyelésre. A fotofermentációs
rendszerekre
vonatkozó
vizsgálatok
döntő
többségét
egyszerű
szubsztrátokkal végezték, azonban ipari szennyvizet hasznosítva is sikerült ígéretes eredményeket elérni [Eroglu, 2011]. Meg kell azonban említeni, hogy az ipari környezetből származó (hulladék)áramok reaktorba történő betáplálását ajánlatos valamilyen előkezelő eljárásnak megelőznie, mivel az ilyen alapanyagok különböző, az adott anyag eredete függvényében mikroorganizmusokra nézve toxikus anyagot tartalmazhatnak, így ezek eltávolítása vagy kívánt szintre, koncentrációra csökkentése szükségszerű lehet. Ez természetesen nem csak a fotofermentáció, hanem a többi eljárás esetében is igaz. Emellett előkezelés abban az esetben is kívánatos, ha a szubsztrát optikai tulajdonságai nem megfelelőek (szín, opálosság, turbiditás), mert ez csökkenti a folyamathoz esszenciálisan szükséges fény reaktortérbe való bejutásának hatékonyságát. Ebből adódóan az ilyen típusú reaktorokban egyrészt nem célszerű túl magas biomassza koncentrációval dolgozni, másrészt a reaktorok konstrukciójakor nem elhanyagolhatóak a geometriai megfontolások, vagyis törekedni kell a minél kisebb keresztmetszet elérésére, annak érdekében, hogy a megvilágító fény útja, s ez által a fény intenzitás csökkenése minél kisebb mértékű legyen a bioreaktor belseje felé haladva. Az ezen a területen elért sikerek ellenére még sok munka, számos 18
kihívás vár a kutatókra és mérnökökre annak érdekében, hogy ipari méretekben, a gazdasági szempontoknak is megfelelő eljárást dolgozzanak ki.
Erre az eljárásra jelenleg úgy
tekinthetünk, amely kiegészítő megoldásként szolgálhat valamilyen más eljáráshoz (pl. sötét fermentáció) csatoltan, növelve így a teljes folyamat hatékonyságát [Eroglu, 2011; Reith, 2003]. Előnyök: -
felhasználható szubsztrátok köre széles
-
napenergia hasznosítása
-
magas hozamok érhetők el
-
nem keletkezik oxigén
-
amennyiben a szubsztrát megújuló forrásból származik, úgy nincs nettó CO2 kibocsátás
Hátrányok: -
alacsony hidrogéntermelési ráta
-
alacsony fénykonverziós hatékonyság
-
költséges bioreaktor tervezés és üzemeltetés, nagy területszükséglet
-
nitrogenáz enzim jelentős ATP szükséglete
3.1.4. Sötét fermentáció Ebben a folyamatban különféle heterotróf, fakultatív (pl. Enterobacteriaceae) ill. obligát (pl. Clostridiaceae) anaerob baktériumok játszanak szerepet, melynek során napenergia közvetlen felhasználása nélkül, a különféle szerves anyagokból (pl. glükóz, keményítő, cellulóz, stb.) oxigénmentes körülmények között H2, CO2 és különféle szerves komponensek, melléktermékek keletkeznek [Levin, 2004; Das, 2001, 2008; Hallenbeck, 2009a].
szerves anyag
H2 + CO2 + szerves melléktermékek
A hidrogénképződés alapvetően 2 fajta mechanizmus szerint játszódhat le. Obligát anaerob szervezetek esetén a beadagolt szubsztrát (pl. glükóz) lebontása során elsőként piruvát és NADH keletkezik. A képződött piruvát ezt követően a piruvát-ferrodoxinoxidoreduktáz (PFOR) enzim által katalizált reakcióban acetil-KoA-vá és CO2-vé alakul, majd az acetil-KoA acetil-foszfáttá konvertálódik, miközben acetát és ATP képződik. 19
A piruvát acetil-KoA-vá oxidációja a ferrodoxin (Fd) redukciójával valósul meg. A redukált állapotú Fd a hidrogenáz által katalizált hidrogénképződés során oxidálódik újra. További hidrogéntermelés érhető el NADH-ból kiindulva, ez az útvonal azonban csak extrém alacsony hidrogén parciális nyomás (<60 Pa) mellett aktivizálódik [Mathews, 2009].
3.1.4.1. ábra –Hidrogéntermelő metabolizmus Clostridium baktériumokban [Mathews, 2009] A 3.1.4.1. ábrán megfigyelhető, hogy attól függően, milyen mellékterméket eredményez a fermentáció, a hidrogén más-más hozammal (mol H2/mol glükóz) keletkezik. Amennyiben acetát a végtermék, úgy a maximális hozam 4 mol H2/mol glükóz [Hawkes, 2002]:
C6H12O6 + 2 H2O
2 CH3COO- + 2 H+ + 2 CO2 + 4 H2
Ha acetát helyett butirátban végződik a folyamat, akkor a hozam maximális értéke 2 mol H2/mol glükóz [Hawkes, 2002]:
C6H12O6
CH3CH2CH2COO- + H+ + 2 CO2 + 2 H2
Fontos
megjegyezni,
hogy
laktát
és
propionát
képződése
nem
vezet
hidrogénképződéshez, vagyis ezek keletkezése minél inkább megelőzendő. A propionát képződés során hidrogén felhasználás történik az alábbi reakcióegyenletnek megfelelően [Hawkes, 2002]:
C6H12O6 + 2 H2
2 CH3CH2COO- + H+ + 2 H2O
20
A fakultatív anaerob mikroorganizmusok hidrogéntermeléssel összefüggő anyagcsere folyamatait a későbbiekben, az E. coli hidrogéntermelése kapcsán mutatom be. Előnyök: -
fény jelenléte nem szükséges
-
a felhasználható szubsztrátok, szerves anyagok köre széles (pl. mezőgazdasági hulladékok is). Hulladék anyagok használatával egy lépésben valósíthatjuk meg mind a hulladékok környezetbarát kezelését, mind pedig a megújuló energia előállítását.
-
egyszerűbb reaktortechnika, olcsóbb üzemeltetés, mint a fotobioreaktorok esetében, nincs nagy területhasználati igény
-
nagy gázképződési sebesség. A szakirodalomban fellelhető legnagyobb volumetrikus képződési gázáram értéke 15 L H2 L-1h-1, melyet 2006-ban publikálták [Wu, 2006]. Ezt mezofil körülmények között, Clostridiaceae által dominált, granulált iszappal sikerült elérni.
-
nem keletkezik oxigén
-
amennyiben a szubsztrát megújuló forrásból származik, úgy nincs nettó CO2 kibocsátás
Hátrányok: -
Relatíve alacsony H2 hozam (fotofermentációs eljárásokhoz képest). Az előnyök között említett 360 L H2 L-1d-1 eddig elért legnagyobb fajlagos képződési gázáram is csupán 3.5 mol H2/mol szacharóz hozammal párosult, mely az elméleti maximum 44%-a.
-
Energiadús melléktermékek képződése (pl. acetát, etanol, butirát, butanol, aceton, propionát, laktát, szukcinát) A 3.1.4.1. táblázatban feltüntetett adatok alapján az látható, hogy a biológiai
módszerek között a sötét fermentációs eljárások igen vonzó alternatívát kínálnak [Krupp, 2009]. 3.1.4.1. táblázat – Adott teljesítményű üzemanyagcella működtetéséhez szükséges bioreaktor mérete a különböző biohidrogén előállító módszerek alkalmazásával [Krupp, 2009]
21
A sötét fermetációs hidrogéntermeléshez kapcsolódó eddigi kutatások meghatározó részében főként az obligát anaerob Clostridiaceae (pl. C. paraputrificum, C. lentocellum, C. bifermentans, C. saccharoperbutylacetonium, C. acetobutilicum, C. pasteurianum) és a fakultatív
anaerob
Enterobacteriaceae
(pl.
E.
coli,
E.
aerogenes,
E.
cloacae)
baktériumcsaládok képviselőit vizsgálták, alkalmazták biohidrogén termelésre. Előbbi csoportba tartozó mikroorganizmusok előnye, hogy hidrogéntermelő képességük általában meghaladja az Enterobacteriaceae-ét, s spórákat képezve hatékonyan tudják átvészelni a kedvezőtlen környezeti körülmények (pH, hőmérséklet, stb.) fennállását, majd azok normalizálódása esetén ismét szaporodásnak indulnak. Emellett azonban extrém módon érzékenyek az oxigénnyomokra is, így alkalmazásuk során tökéletesen anaerob környezetet kell biztosítani, ami azonban pl. ipari méretekben nehezen megoldható, valamint hidrogéntermelő aktivitásukat a fermentorban akkumulálódó hidrogén parciális nyomása jelentősen képes befolyásolni [Hallenbeck, 2009b]. Utóbbiak,
vagyis
az
Enterobacteriaceae
baktériumok
viszonylag
gyorsan
szaporodnak, jellemzően alacsony-közepes, 1-2 mol H2/mol glükóz hozam értékek elérésére képesek [Wang, 2009a]. Előnyük, hogy ezek a fakultatív anaerob mikroorganizmusok kevésbé érzékenyek az oxigén okozta inhibícióra, hiszen képesek annak gyors és hatékony kivonására a rendszerből, s ezt követően visszatérni a hidrogéntermelő életmódra [Yokoi, 2001; Ogino, 2005]. Az eddigiekből következően célszerű lehet ezen mikrobákat kevert tenyészetekben alkalmazni,
ahol
a
Clostridiumok
hatékony
hidrogéntermelését
kiegészítheti
az
Enterobaktériumok oxigénelimináló (és hidrogéntermelő) képessége. A szóbanforgó baktériumokkal a legtöbb vizsgálatot monokultúrás tenyészetekkel, szakaszos kísérletekben, egyszerű szubsztrátokkal, főként glükóz, xilóz, keményítő végeztek. Bár számos figyelemre méltó eredmény született, a mikrobák további tesztelése szükséges folyamatos üzemmódban működő fermentorokban, összetettebb szubsztrátok alkalmazásával, mivel az ilyen körülmények között végzett vizsgálatok sokkal jobban közelítik az ipari körülményeket, s így a kapott eredmények is jobban felhasználhatók egy technológia tervezése során [Hawkes, 2002; Hallenbeck, 2009b].
22
3.2. Lehetőségek a hidrogéntermelés hatékonyságának növelésére
Fejlett, mutáns törzsek létrehozása A mikroorganizmusok egyedi jellemzőinek megfelelően a reaktorba betáplált szubsztrátok a kívánatostól eltérően többféleképpen is metabolizálódhatnak, vagyis felhasználásuk nem kizárólag hidrogénképződésre fordítódik, tehát ezek a mellékreakciók csökkenthetik az elérhető hozamok értékét. A kompetitív útvonalaknak a gátlásával, metabolikus mérnökséggel olyan fejlett, mutáns egyedek hozhatók létre, melyek pl. jóval nagyobb hozamok és gázképződési sebességek biztosítására képesek. A metabolikus mérnökség a fejlett molekuláris biológia és genetika eszköztárát alkalmazza a sejtben lejátszódó reakcióutak módosítására, bizonyos anyagok (pl. H2) termelésének fokozására vagy csökkentésére. A biomérnöki módszerek segítségével csökkenthető pl. a hidrogenázok oxigénérzékenysége, növelhető a hasznosítható szubsztrátok köre (pl. lignocellulóz, pentózok, stb.). [Mathews, 2009; Nath, 2004; Hallenbeck, 2009b; Lee, 2010]. Fermentációs paraméterek optimalizálása A fermentációs paraméterek változtatásával befolyásolhatjuk az adott mikroba, mikrobakonzorcium anyagcseréjét, vagyis a megfelelő kombinációk beállításával a folyamat hatékonysága növelhető. A hidrogéntermelést meghatározó kulcsparaméterek optimalizálásán keresztül a fajlagos képződési gázáram és hozam értékek növelhetők. Ilyen paraméterek lehetnek az alkalmazott mikroba/mikrobák típusa(i), pH, hőmérséklet, szubsztrát anyagi minősége, tápoldat összetétele, térfogati szerves anyag terhelés (OLR: Organic Loading Rate), a reaktor típusa (CSTR, UASB, stb.) és üzemmódja (szakaszos, rátáplálásos, folyamatos, stb.), a tartózkodási idő, a keverés sebessége és módja, stb. A megfelelő keverés fontos a folyadékfázis homogenitásának biztosítására, emellett az is megfontolandó, hogy mechanikus vagy gázbuborékoltatásos keverést célszerű-e alkalmazni. Ipari méretekben az utóbbi gazdaságosabb megoldás lehet, másrészt használatával elkerülhető a túlságosan nagy nyíróerők kialakulása, melyek károsíthatják a sejteket.
23
A hidrogéntermelés általában csökkenésnek indul, ha a sejtek szakaszos üzemmódban elérik a stacioner szaporodás fázisát. Folyamatos rendszerek kialakításával elérhető, hogy a reaktorban lévő biomassza tömegben az exponenciális szaporodás szakaszában lévő sejtek legyenek dominánsak [Eroglu, 2011; Wang, 2009a].
3.3. Fermentációs hidrogéntermelés Escherichia coli-val Biohidrogén termelésre minden olyan mikroorganizmus képes, amely megfelelő enzimekkel rendelkezik, s ezek közé tartozik többek között az Enterobacteriaceae baktérium család képviselője, az Escherichia coli (a továbbiakban E. coli) (3.3.1. ábra) is, amely egy mezofil, fakultatív anaerob, pálcika alakú mikroba. Megtalálható pl. az emberi emésztőrendszerben is, ahol a vastagbél falára tapadva képezi a normál bélflóra fontos részét.
3.3.1. ábra – Az E.coli elektronmikroszkópos képe Az E. coli széleskörűen alkalmazott a biokémiai, molekuláris biológiai kutatásokban, s ebből következően kiterjedt szakirodalom áll róla rendelkezésre, amelyből ismert az is, hogy különböző szerves alapanyagokon pl. glükóz, hangyasav (avagy sói a formiátok), stb. szaporodva sötét fermentációs útvonalon, ún. kevert savas erjedéssel hidrogéntermelésre képes. Több kutatás rámutatott arra, hogy a lehetséges szubsztrátok körében a hangyasav (vagy sója a formiát) olyan alapanyag, amely alkalmas lehet arra, hogy felhasználásával hatékony biohidrogén termelő rendszereket lehessen kialakítani [Yoshida, 2005, 2007]. Természetesen ezek a rendszerek csak akkor lehetnek igazán hatékonyak és válhatnak egyszer széles körben elterjedtté, ha a felhasznált alapanyagokat képesek vagyunk megújuló forrásokból biztosítani.
24
Szerencsére az elmúlt néhány évben sikeresen dolgoztak ki olyan eljárásokat, amelyek lehetővé teszik már pl. nemcsak a glükóz, hanem a hangyasav közvetlenül biomasszából (vagyis akár mezőgazdasági hulladékokból), mint olcsó alapanyagból történő előállítását is [Yun, 2010]. Az E. coli-ban lejátszódó hidrogéntermelés úgynevezett kevert savas fermentációval (mixed-acid fermentation) formiáton, mint kulcs-szubsztráton keresztül játszódik le, mely mechanizmus a fakultatív anaerob szervezetekre általában jellemző. Ha a sejt anaerob körülmények közé kerül, a cukor lebontásból keletkező piruvát legnagyobb részéből a piruvát-formiát-liáz (PFL) segítségével formiát és acetil-KoA keletkezik. Az acetil-KoA további lebomlása acetátot és etanolt eredményez, míg a piruvát egy másik része pedig laktáttá alakul. Oxigén és nitrát, mint elektron akceptorok hiányában a NADHNAD+ átalakulás alternatív úton kell, hogy végbemenjen, így anaerob körülmények között a glikolízishez esszenciálisan szükséges folyamatos NAD+ áram fenntartásában a laktát, etanol és szukcinát képződése játszik szerepet, mivel ezek képződése NAD+-t eredményez, míg az acetát termelés során ATP keletkezik [Mathews, 2009]. A piruvátból keletkező formiát további lehetséges átalakulási útvonala a hidrogén és szén-dioxid gáz képződése enyhén savas (6
25
3.3.2. ábra – Az E. coli hidrogéntermelő metabolizmusa [Mathews, 2009]
3.4. Az
Escherichia
hidrogenázainak,
coli
hidrogén
metabolizmusának részletes bemutatása Az E. coli a hidrogenáz bioszintézis kutatásainak egyik modellorganizmusa. Négy membránkötött hidrogenáza van, ami szinte egyedülálló a mikrobák között. A Hyd-1 és Hyd2 respirációs folyamatokhoz kapcsolódó hidrogenáz, míg a Hyd-3 és az utoljára, nagy erőfeszítésekkel kutatott Hyd-4 a formát metabolizmushoz kapcsolt s mindkettő egy ún. formiát-hidrogén-liáz komplex része [Sawers, 1994; Andrews, 1997].
A hidrogenázok
poszttranszlációs érési folyamatának jelentős részét a Hyd-3 fehérjén keresztül ismerték meg. Ahhoz, hogy az E. coli hidrogéntermelő képességét maximalizáljuk, szükséges megismerni az egyes hidrogenázokat, azok bioszintézisének körülményeit, valamint az enzimek fiziológiás szerepét. Hyd-1 és Hyd-2 A Hyd-1 egy klasszikus hidrogén felvevő enzim, melyet a hyaABCDEF policisztronos operon kódol [Sawers, 1994; Redwood, 2008]. Két struktúrális alegységből, a kis és nagy alegységből áll (HyaAB), amihez egy harmadik transzmembrán citokróm b típusú fehérje kapcsolódik (HyaC). A többi alegység a bioszintézisben játszik szerepet. A felépítésből már valószínűsíthető, hogy a Hyd-1 egy hidrogénoxidáló enzim, amely a H2 oxidációjából származó elektronokat a CytB segítségével a kinon raktár redukciójára fordítja és végső soron 26
valamilyen terminális elektron akceptorra kerül. Az enzim expresszióját az oxigén és a nitrát is gátolja annak ellenére, hogy az enzim hidrogén oxidációja kapcsolható a nitrát illetve oxigén redukciójához [Laurinavichene, 2001a]. Ez utóbbi széles oxigénkoncentrációs tartományban is működik. Az enzim fiziológiás szerepéről számos javaslat látott napvilágot, egyes kutatások szerint feladata a Hyd-3 hidrogenáz által termelt hidrogén visszaforgatása [Redwood, 2008], mások szerint inkább hidrogén szenzorként funkcionál [Laurinavichene, 2001b]. Ezek alapján úgy tűnik, hogy a Hyd-1 mindenképpen egy hidrogénoxidáló enzim, a biohidrogén termelésben való szerepe inkább negatív, azonban ezt a képet kicsit megváltoztatta az utóbbi évek azon felfedezése, hogy az E. coli a glicerin fermentálás során képes hidrogént termelni és semleges pH-n ebben a Hyd-1 is szerepet játszhat [Trchounian, 2009]. A Hyd-2 egy bonyolult, egyedi struktúrával rendelkező enzim, melyet a hybOABCDEFG operon kódol [Sawers 1994, Redwood, 2008].
Nemcsak az enzim
szerkezete, hanem a gének szerveződése is különleges, ugyanis a kis (HybO) és a nagy (HybC) alegység génje közé két fehérjét kódoló gén ékelődik, melyek valószínűsíthetően egy membránkötött redox-dimer részei. Az enzim, a Hyd-1-hez hasonlóan szintén a hidrogénfelvétel iránya mutat nagyobb aktivitást, a hidrogén oxidációja ebben az esetben is kapcsolható az oxigén és a nitrát redukciójához, igaz az előbbi csak alacsony oxigén parciális nyomás esetén működik. Korábbi elképzelések szerint az enzim fiziológiás szerepe az anaerob respirációs folyamatokhoz kapcsolható, melyek közül is a fumarát, mint terminális elektron akceptor kapott kiemelt szerepet. Az eddigiek alapján következtetésként elmondható, hogy a Hyd-1 és Hyd-2 hidrogénfelvevő hidrogenázok, a biohidrogén termelésben – cukor fermentálás során – nem tudnak részt venni, jellemzően inkább a formiát-hidrogén-liáz (FHL) által termelt hidrogén visszaalakításában van szerepük. A legújabb kutatások azonban kimutatták, hogy a Hyd-1 illetve Hyd-2 képes semleges pH-n, glicerin fermentáció során hidrogént termelni, a pH csökkentése (pH=5.5), azonban az aktivitásuk megfordulásával jár (3.4.1-3.4.2. ábra) [Trchounian, 2009, 2011, 2012a, 2012b]. Hyd-3 és Hyd-4 A Hyd-3-at a hycABCDEFGHI operon kódolja [Sawers 1994, Redwood, 2008]. A HycG és HycE az enzim kis és nagy alegysége, a HycB és HycF elektrontranszfer alegységek, a HycC és HycD membránfehérjék, a HycH egy hidrofil fehérje, a HycI pedig a 27
poszttranszlációs érésben játszik szerepet. A HycA egy transzkripciós faktor, melynek deléciója megnövekedett hidrogéntermelést eredményez. A Hyd-3 hidrogenáz működése a formiát-dehidrogenázhoz (FDH-H) kapcsolt és együtt képezik az ún. formiát-hidrogén-liáz (FHL-1) komplexet, mely a formiát oxidációját hidrogéntermeléssel egybekötve katalizálja. A folyamat nem kapcsolódik energiatermeléshez (ATP), sőt mivel hidrogén távozik a rendszerből jelentős energiaveszteséget jelent a sejteknek [Bagramyan, 2002]. A komplex fiziológiás szerepe a sejtek számára toxikus hangyasav (v. formiát) eltávolítása. Az enzim elsősorban enyhén savas illetve semleges körülmények között mutat aktivitást, de külsőleg hozzáadott formát hatására még alkalikus körülmények között is domináns FHL komplexszé válik. 1997-ben jelent meg a hír, hogy az E. coli rendelkezik egy negyedik hidrogenáz enzimmel (Hyd-4) is [Andrews, 1997], melynek ekkor még csak a génjeit azonosították (hyfABCDEFGHIJR). Az operonnak három új komponense van, ezek a hyfDEF gének, melyek olyan membránkötött fehérjéket kódolnak, melyek hasonlóak a respirációs komplex (NAD-ubikinon-oxidoreduktáz) alegységeihez. Később sikerült olyan aktivitást kimutatni, mely ehhez az enzimhez kapcsolható, és kiderült, hogy ez is egy FDH-H-hoz kapcsolódik, így alkotva egy másik formiát-hidrogén-liáz (FHL-2) enzim komplexet, mely alkalikus körülmények között rendelkezik aktivitással [Bagramyan, 2002]. Ezen felül megállapították azt is, hogy ez az aktivitás ATP szintézishez kapcsolt, tehát egy olyan formiát-hidrogénliázról van szó, mely képes a sejtek számára energiát (ATP-t) generálni. Az FHL-2 speciális esetben (glicerin fermentáció, savas pH) képes a hidrogén oxidációjára is. Mindazonáltal világossá vált, hogy még lúgos közegben is az FHL-1 a domináns enzim, amennyiben külső forrásból formiátot adunk a rendszerhez, s így elmondható, hogy az E. coli elsődleges, formiátból hidrogént termelő enzime az FHL-1. Ha glükózt használunk szubsztrátként pepton háttéren, akkor pH=7.5-n a Hyd-3 és a Hyd-2 aktivitása meghatározó: a Hyd-3 hidrogénfejlesztő, míg a Hyd-2 hidrogénoxidáló irányban működik [Trchounian, 2012]. Összefoglalva, kevert savas fermentáció során érdemes olyan törzsekkel dolgozni, melyek a két, respirációhoz kapcsolt, membránkötött hidrogenázt (Hyd-1, Hyd-2) nem, de a formiát-hidrogén-liázokat (FHL-1, FHL-2) tartalmazzák.
28
3.4.1. ábra – Az E. coli H2 termelő és fogyasztó enzimjeinek működése cukor vagy formiát (A) ill. glicerin (B) fermentáció során. A(H2): a sejtek hidrogéntermelő sebessége; A(Hyd): az egyes hidrogenázok hidrogéntermelő vagy hidrogénoxidáló sebessége [Trchounian, 2009].
3.4.2. ábra – Az E. coli H2 termelő és fogyasztó enzimjeinek működése glicerin fermentáció során pH=7.5 (A) és pH=5.5 (B) mellett. VH2: a sejtek hidrogéntermelő sebessége; V(Hyd): az egyes hidrogenázok hidrogéntermelő vagy hidrogénoxidáló sebessége [Trchounian, 2011].
29
3.5. Hatékony biohidrogén termelő rendszerek kialakítása
Ahhoz, hogy a hidrogén a jövő energiaforrása lehessen, azt környezetbarát módon, megújuló forrásokból kell előállítanunk, például nagyhatékonyságú biológiai rendszerek segítségével. A kérdés tehát az: hogyan, milyen lépéseken keresztül lehet ilyen bioreaktorokat kialakítani. Az ilyen rendszerek létrehozásának 3 fő lépése van: 1, Hidrogéntermelő mikroorganizmusok (vad-típusok) azonosítása. 2, A mikrobák biokémiai, fiziológiai sajátságainak megismerése, jellemzése, amely magában foglalhatja az egyes vad-típusú mikroorganizmusok genetikai, metabolikus módosításának lehetőségét is a nagyobb hidrogéntermelő képességű, hatékonyabb mutáns törzsek létrehozása érdekében. 3, Bioreaktorok tervezése és optimalizálása a – metabolikusan is akár módosított – mikrobák alkalmazásával. Az utolsó lépést, vagyis a bioreaktorok optimalizálását illetően felmerül azonban az a probléma, hogy a vizsgálandó, optimalizálandó paraméterek száma általában nagy, így az optimális működési beállítások megtalálása sokszor nagyszámú és költséges kísérletek elvégzését igényli. A probléma megoldására – vagyis annak a célnak az elérésére, hogy lehetőleg az elvégzendő kísérletek számát csökkentve növeljük a reaktor teljesítőképességét is – alkalmazhatók a kísérlettervezésen alapuló optimalizálási módszerek.
3.6. A kísérlettervezés Minden biotechnológiai eljárás esetében – s nincs ez másképp a biohidrogén fermentáció esetében sem – kiemelten fontos azoknak a paramétereknek a megtalálása, melyeket szabályozva, s optimális értékre beállítva az adott folyamat, rendszer (pl. bioreaktor) minél nagyobb hatékonysággal üzemeltethető. Ilyen tényezők lehetnek pl. a pH, a hőmérséklet, a fermentációs közeg (fermentlé) összetétele, anyagátadási viszonyok stb. A legtöbb esetben elmondható, hogy a vizsgálandó paraméterek száma az optimális rendszer beállítások meghatározásához nagy, az adott rendszerre vonatkozó tényleges kulcs 30
faktoroknak a kiválasztása és optimálása sokszor nagyszámú kísérlet elvégzését igényli, vagyis komoly idő- és költség faktorként jelentkezhet a biotechnológia kutatásokban, fejlesztésekben [Weuster-Botz, 2000]. Mivel a gazdasági- és időtényezők általában korlátozottak, törekedni kell arra, hogy adott problémát minél gazdaságosabban, minél rövidebb idő alatt képesek legyünk megoldani. Az eddigiekből következik, hogy az optimális működés feltételeit nem kereshetjük az összes lehetséges bemeneti (input) beállítás „kipróbálásával”, hanem célszerű csak bizonyos, lehetőleg minél kisebb számú kísérleti beállítás mellett vizsgálódni, s így keresni az egyes input-output kapcsolatokat és az ezekből nyert információk alapján következtethetünk az általunk elérni kívánt optimális beállításokra. Ezeket az elvégzendő kísérleteket, kísérleti beállításokat kell megtervezni úgy, hogy minimális költség- és időráfordítással maximalizáljuk a kinyerhető információk mennyiségét [Márkus, 2012]. Az említett problémák megoldásában nyújthatnak hatékony segítséget a különböző kísérlettervezésen alapuló optimalizálási módszerek. Ezek tulajdonképpen olyan (a matematikai statisztikához szorosan kötődő) eljárások, amelyek célja a valóság „kihámozása” valamilyen mért vagy megfigyelt adatok alapján. Ezekkel a módszerekkel egy adott kísérletben szándékosan változtatunk egy vagy több faktort, s figyeljük annak hatását az elérni kívánt célt jellemző válasz változón. A kísérlettervezés során a vizsgált rendszert ún. „fekete doboznak” tekintjük, amikor is nem keresünk ok-okozati összefüggéseket, vagyis hogy mi miért történik, hanem egyszerűen kvantitatív összefüggést akarunk feltárni az egyes függő és független változók között [Kemény, 2000; Márkus, 2012].
3.7. A biohidrogén fermentáció kísérlettervezéssel történő optimalizálásának lépései
Ahhoz, hogy kísérlettervezéses alapon optimalizáljunk egy biohidrogén fermentációs eljárást, a következő 4 lépéses folyamaton célszerű végigmennünk [Kemény, 2000; Wang, 2009b]: 1, A lehetséges faktorok körének meghatározása, melyek befolyással lehetnek a kívánt cél elérésére pl. a fajlagos képződési gázáramra, a hozamra, stb. („Brainstorming”) 2, A tényleges hatótényező(k) meghatározása („Screening”) 3, A kulcsfaktor(ok) optimumának közelítése („Narrowing”) 4, Optimum érték(ek) meghatározása („Optimum search”) 31
A (szignifikáns) hatótényezők meghatározása A vizsgálandó paraméterek nagy száma a valóságban nem feltétlenül jelenti azt, hogy az összes faktornak jelentős hatása lenne egy adott (optimalizálandó) válasz változóra. Az optimalizáláshoz kizárólag a szignifikáns változók a fontosak, mert ezek határozzák meg a rendszer, a folyamat valamilyen szempontú viselkedését, s ebből a megfontolásból az optimalizálás első lépése a legfontosabb változók körének meghatározása. A szakirodalom szerint a hidrogén fermentáció statisztikai alapon történő optimalizálása során a PlackettBurman-féle, 2-szintes, faktoriális terv a leggyakrabban alkalmazott a kulcsváltozók kiválasztására. Ezzel a típusú tervvel max. n=N-1 db faktor hatását vizsgálhatjuk egy időben, ahol „n” a vizsgálandó faktorok száma; „N” a kísérletek száma (N≤100), vagyis az elvégzendő mérések száma mindig legalább eggyel több kell, hogy legyen, mint a faktorok száma, s az alap kísérleti beállítások számához hozzájöhet még néhány (általában 3) középpontbeli mérés is annak érdekében, hogy becsülhető legyen a szórás. Ezen fajta kísérleti terv alkalmazásakor úgy tekintjük, hogy abban az értéktartományban, ahol az egyes faktorokat vizsgáljuk, nem lépnek fel jelentős kölcsönhatások, így azok hatásainak vizsgálatától eltekintünk [Plackett, 1946; Weuster-Botz, 2000]. A mérési eredmények varianciaanalízissel (ANOVA) történő kiértékelésével a szignifikáns hatótényezők és azok hatásának irányai azonosíthatók [Wang, 2009b; Kuehl, 2000; Montgomery, 2005]. Optimum közelítés A kulcsfaktorok kiválasztását követő fontos lépés azok tovább tanulmányozása, azok optimum környezetének megtalálása. Azokat a változókat, amelyek a “szűrés” szerint nem voltak szingifikáns hatással az adott válasz változóra, nem vizsgáljuk tovább, és legtöbbször azon az értéken rögzítjük, ahol számunkra kedvezőbb hatást váltottak ki. Az optimum közelítés során az előzetesen meghatározott kulcsváltozók faktorszint értékeit addig változtatjuk, ameddig a válasz változón számunkra kedvező (növekvő v. csökkenő) változás tapasztalható, vagyis amíg el nem érjük az egyes faktorok értékeinek olyan kombinációját, együttállását, ahonnan bármely irányba tovább lépve nem tapasztalunk további kedvező hatást, vagyis amíg elérjük az optimum környezetet [Wang, 2009b; Kuehl, 2000; Montgomery, 2005].
32
Optimum keresés Miután megtaláltuk az optimum intervallumot, fontos, hogy azon belül tovább vizsgálódjunk és megkeressük a válasz változó optimumához tartozó tényleges beállításokat, amihez (több kulcsváltozó esetén) a centrális kompozíciós és a Box-Behnken-féle tervek a leggyakrabban használatosak, míg csupán egy szignifikáns faktor optimalizálása a klasszikus módszer szerint történhet.
3.8. A baktériumok növekedésének kinetikája
Ha egy baktériumsejtet megfelelő környezetbe helyezünk, akkor egy adott ún. lappangási időszakot követően az osztódásnak indul, miközben a kultúra egy adott maximális növekedési sebességet ér el, ez azonban csak bizonyos ideig tartható fenn, s egy időt követően lassulni kezd, végül pedig megáll. A mikroorganizmusok növekedését ezen növekedési sebességek változásai szerint több jellemző periódusra lehet felosztani [Nyeste, 1997; Atkinson, 1992; Bailey, 1986]. Ha az élő egyedszámot (N) ill. az összes baktériumszámot az idő függvényeként ábrázoljuk, akkor az ún. növekedési v. szaporodási görbét kapjuk (3.8.1. ábra).
3.8.1. ábra – A baktériumok növekedési görbéje [Búcsú, 2008]
33
1, Lappangási v. „lag” fázis: leghosszabb generációs idő 2, Gyorsuló növekedési szakasz: csökkenő generációs idő 3, Exponenciális szakasz: minimális és állandó generációs idő 4, Kezdeti stacioner fázis: növekvő generációs idő 5, Stacioner szakasz: a szaporodás egyensúlyban van az elhalással 6, Pusztulási (hanyatlási) fázis: az elhalás felülmúlja a szaporodást Az egyes intervallumok hosszúsága jellemző az adott baktériumkultúrára, s rendszerint függ a tápanyag-ellátottságtól, toxikus anyagok jelenlététől, környezeti feltételektől (hőmérséklet, pH, redoxpotenciál, stb.). Ha az élő baktériumszám logaritmusait ábrázoljuk az idő függvényében (fél-logaritmikus ábrázolás), akkor lehajló, inflexiós görbét kapunk, míg abban az esetben, ha az összes baktériumszámot vagy annak logaritmikus értékeit visszük fel az ordináta-tengelyre, akkor egy asszimptotikus görbéhez jutunk, melynél a maximális érték (stacioner fázis) csak egy viszonylag hosszabb idő után kezd csökkenni a mikrobák ún. autolízise következtében. Generációs időnek (tg) a két egymást követő osztódás között eltelt időt nevezzük. A generációs időn kívül az exponenciális szakasz másik jellemzője a specifikus szaporodási v. növekedési sebesség (μ) [Nyeste, 1997; Atkinson, 1992; Bailey, 1986]. Ha a növekedés számára minden szükséges feltétel biztosított, akkor a szaporodási sebesség – az exponenciális szakaszban – arányos a jelenlévő mikroba koncentrációjával (x) a 3.8.1. egyenletnek megfelelően:
3.8.1. egyenlet: A növekedési sebesség értéke az exponenciális növekedés fázisában állandó, amint az a 3.8.1 ábrán látható. A μ meghatározásának folyamata a következő: Ha egy bioreaktorban nyomon követjük a baktériumszám ill. baktériumtömeg időbeli változását (dx/dt) és azt ábrázoljuk a sejttömeg, sejtkoncentráció (x) függvényében, akkor a kapott összefüggés meredekségeként μ értéke meghatározható. A szaporodási sebesség értéke jellemző az adott mikroorganizmusra és arra a táptalajra, amelyen a szaporítás történt. A növekedési sebesség azonban csak akkor állandó, ha a növekedéshez szükséges minden tápanyag elegendő koncentrációban van jelen [Nyeste, 1997; Atkinson, 1992; Bailey, 1986]. Monod volt az első, aki kimutatta, hogy μ és valamely nélkülözhetetlen tápanyagkomponens koncentrációja (S) között egyszerű összefüggés van, melyben μ arányos a tápanyag koncentrációjával, 34
amennyiben az kicsi (1. rendű kinetika, S
KS): 3.8.2. egyenlet : ahol μmax a szaporodási sebesság maximális értéke akkor, ha a szubsztrát a telítettségi koncentráció szintjén van, Ks pedig az ún. féltelítési állandó, amely megegyezik azzal a szubsztrát koncentrációval, ahol μmax értéke a felére csökken. A μ és S közötti kapcsolatot az 3.8.2. ábra szemlélteti. Egy olyan rendszerben, ahol egy fontos szubsztrát (pl. szénforrás) csak egy kis, limitáló koncentrációban van jelen, nyilvánvaló, hogy a mikroba növekedését ennek a korlátozó anyagnak a hasznosítási sebessége fogja meghatározni [Nyeste, 1997; Atkinson, 1992; Bailey, 1986].
3.8.2. ábra – μ és S kapcsolata [Jobbágy, 2012] Ha a baktérium szaporítását – a limitáló szubsztrátot különböző koncentrációban tartalmazó – tápoldatokon végezzük el, és az így kapott μ értékek reciprokait ábrázoljuk a hozzájuk tartozó (limitáló) tápanyag koncentrációk reciprokainak függvényében (LineweaverBurk-féle v. dupla reciprok ábrázolás), akkor μmax és Ks értékei grafikusan meghatározhatók (3.8.3. ábra) [Nyeste, 1997; Atkinson, 1992; Bailey, 1986].
3.8.3. egyenlet: 1/μ = (KS/μmax)*(1/S) + 1/μmax
35
3.8.3. ábra – A μmax és Ks meghatározása a Lineweaver-Burk ábrázolás szerint Ha egy tenyészetben az adott idő alatt keletkezett sejttömeg és a felhasznált szubsztrát mennyiségének hányadosát képezzük, akkor egy hozamkonstans (Y) értéket definiálhatunk:
3.8.4. egyenlet:
amely azt fejezi ki, hogy adott mennyiségű tápanyag felvétel hatására mennyi biomassza képződik. Ha a három növekedési állandó (Ks, μmax, Y) értéke ismert, akkor a szakaszos tenyészet növekedési periódusa kvantitatíve leírható [Nyeste, 1997; Atkinson, 1992; Bailey, 1986].
3.9. A hidrogén szeparációja A különféle módszerekkel előállított hidrogén tisztasága eltérő, s tisztasági fokát a felhasználási terület szabja meg, pl. hidrokrakkolás, üzemanyagcella. A követelmény általában a 70-99% közötti tisztaság. A hidrogén tisztítására, koncentrálására hagyományos és újdonságot jelentő módszerek is alkalmazhatók. A legelterjedtebb H2 szeparációs eljárások a nyomásváltásos adszorpció (PSA) [Fonyó, 2004; Sircar, 2000; Yang, 2008], aminos abszorpció [Favre, 2007], a kriogén desztilláció [Hinchliffe, 2000], valamint a membrános szeparáció [Strathmann, 2006; Mulder; 1996; Bélafiné, 2002]. Az első három eljárás hatékony, de üzemeltetésük jelentős mennyiségű energia befektetését igényli, mely gazdaságossági és környezetvédelmi szempontból nagy hátrányt jelent. Ezzel szemben megfelelő, energiahatékony alternatívát kínálnak a membrán szeparációs eljárások. A membrános műveletek, technológiák egyre elterjedtebbek az iparban, 36
nincs ez másként a gáz szeparáció területén sem [Strathmann, 2006; Mulder; 1996], amely az egyik legdinamikusabban fejlődő ágazat a membrános technológiákon belül. Ennek oka az, hogy az egyre jobb, előnyösebb tulajdonságú membránanyagok kifejlesztésével javul a gázok elválasztásának hatásfoka (szelektivitás) és növekszik a gázok fluxusa, amelyek a membrános műveletek két legfőbb jellemző paraméterei. Mindemellett a membráneljárások számos kedvező tulajdonsággal is rendelkeznek, melyek előnyössé teszik alkalmazásukat [Bélafiné, 2002]: egyszerű üzemeltethetőség, az elválasztás könnyen folyamatossá tehető energiaigénye általában kicsi, mivel nincs fázisváltás Ez különösen fontos szempont, ha a hidrogént energiahordozóként hasznosítjuk könnyen kombinálható más műveletekkel (csatolható bioreaktorhoz is) enyhe körülmények (hőmérséklet, nyomás) szükségesek nem termel hulladékot, így nincs szükség használt oldószer és adszorbens regenerálásra, utókezelésre, vagyis környezetbarát működtetése könnyű és megbízható, mivel nincs mozgó alkatrész jó automatizálhatóság költséghatékony a berendezések kompakt kivitele, relatíve könnyű mozgathatóság, szállíthatóság
3.9.1. ábra – A membrán szeparáció folyamata A membrános eljárások közül szakirodalmi adatok szerint a membrános gáz szeparáció, a membrán kontaktorok és a folyadékmembránok azok a műveletek, melyek alkalmasak lehetnek a hidrogén szeparálására. 37
3.10. A membrános gáz szeparáció A gáz szeparáció pórusos és pórusmentes membránokon egyaránt megvalósítható, melyek mechanizmusa azonban lényegesen eltérő egymástól [Mulder, 1997]. Pórusmentes membránok használata során a gázoknak a permszelektív gáton keresztüli áramlása alapvetően ún. oldódásos-diffúziós mechanizmus szerint megy végbe [Mulder, 1997; Koros, 1993]. Ennek első lépéseként a gázmolekula a betáplálási oldalon megkötődik, s beoldódik a membrán anyagának felületén, majd diffúzióval a membrán permeátum oldalára vándorol, ahol deszorbeálódik. Ilyen membránok esetén az elválasztás alapját a gázok membrán anyagában való oldhatóságának és diffúziós sebességének különbsége szolgáltatja, melynek hajtóereje a membrán két oldala között fennálló koncentráció-különbség [Bélafiné, 2002]:
3.10.1. egyenlet: J
D
dc dx
ahol J a fluxus, D a diffúziós együttható és dc/dx a hajtóerő, vagyis a koncentráció-gradiens a membrán keresztmetszetén. Állandósult állapotban az összefüggés integrált alakja:
3.10.2. egyenlet: J i
Di (c0,i cl ,i ) l
ahol c0,i és cl,i a két oldalon mérhető koncentráció, míg l a membrán vastagsága. A koncentrációkat (ci) a Henry-törvényben szereplő parciális nyomások (pi) határozzák meg: 3.10.3. egyenlet: ci = Sipi ahol Si az i. komponens oldhatósági koefficiense a membránban. Az eddigiek kombinálásával kapjuk meg a gáz szeparáció leírására általában használt egyenletet:
3.10.4. egyenlet: J i
Di S i ( p0,i
p l ,i )
l
Ebből, a diffúziós és oldhatósági koefficiens szorzataként kapjuk meg az úgynevezett permeabilitási együtthatót (k):
38
3.10.5. egyenlet: k
D S
Így a 3.10.4. egyenlet a következőképpen egyszerűsíthető:
3.10.6. egyenlet: J i
k i ( p 0 ,i
p l ,i )
l
ki pi l
Ez alapján megállapítható, hogy a membránon keresztüli fluxus egyenesen arányos a (parciális) nyomáskülönbséggel és fordítottan arányos a membrán vastagságával. A szelektivitás i és j gázpárok esetén (αi/j), ideális esetben megadható a permeabilitási koefficiensek hányadosaként:
3.10.7. egyenlet:
i/ j
ki kj
Számos gázelegy esetén a valós szelektivitás azonban nem egyezik meg az ily módon számított elméleti szeparációs faktorral, mert nagy nyomás alkalmazásakor, amikor a gáz és a polimer között kölcsönhatás lép fel, a membrán anyaga módosulhat, valamint az egyes gázok jelentősen
befolyásolhatják
egymás
permeációs
tulajdonságait
Az
említettek
következményeként általában nő a permeabilitás, a szelektivitás viszont legtöbbször csökken. A permeabilitási együttható (k) viszonylag könnyen mérhető, két leggyakrabban alkalmazott mértékegysége a Barrer és a GPU (Gas Permeation Unit):
3.10.8. egyenlet: 1 Barrer
3.10.9. egyenlet: 1 GPU
10
10
cm 3 ( STP) cm cm 2 s Hgcm
10 6 cm 3 ( STP) cm 2 s Hgcm
STP: Standard Temperature and Pressure (hőmérséklet: T=273 K, nyomás: p=105 Pa) Mindkettő egy adott gáz permációs képességét írja le adott nyomáskülönbség és membrán(anyag) esetén. A különbség a kettő között annyi, hogy a Barrer a membrán vastagságát is figyelembe veszi. Egy adott gáz permeabilitása nagyságrendileg különbözhet az 39
alkalmazott polimertől, a membrán típusától függően. A gáz szeparációs műveletekhez az adott elválasztási célnak megfelelően nagyon sokféle anyag felhasználható. A gáz szeparációs műveletek teljesítőképességének értékelésénél, jellemzésénél mind a szelektivitást, mind pedig a permeabilitást figyelembe kell venni, pl. nem elég, ha egy membrán nagy szelektivitással rendelkezik, miközben csak kis gázáramok kezelését teszi lehetővé [Bélafiné, 2002]. A hidrogén szeparációs célokat szolgáló membránok lehetnek szervetlen és szerves anyagúak egyaránt. A szervetlen membránok között megtalálhatók a fém (pl. palládium) [Paglieri, 2002], szilika [Iwamoto, 2005], kerámia [Balachandran, 2006], szén [Kim, 2005], zeolit [Fotou, 1995], stb. membránok, melyek alapjában véve nagy szeparációs hatékonysággal és kémiai ellenállással rendelkeznek, azonban törékenyek, valamint előállításuk nehézkes és drága. Ezzel szemben a szerves polimer membránok előnye, hogy előállításuk költségvonzata lényegesen kisebb, kezelhetőségük egyszerűbb, s élettartamuk – a körülmények függvényében – jónak tekinthető, vagyis következésképpen elmondható, hogy a membránok körében hidrogén szeperációt pórusmentes, polimer membránok segítségével érdemes megvalósítani, s legtöbbször a hidrogén szén-dioxidtól való elválasztása a legfontosabb feladat, valamint szintén fontos a vízgőz és kén-hidrogén eltávolítása. Az ilyen célra készített membránok lehetnek H2 vagy CO2 szelektívek attól függően, hogy melyik gáz dúsul a permeátum oldalon, így az első esetben a hidrogénben dúsabb permeátumot, míg a másodikban hidrogénben töményebb koncentrátumot (v. retentátumot) kapunk [Shao, 2009]. Ahogy az említésre került, az elméleti szelektivitás megadható a permeabilitások hányadosaként, melyek pedig az oldhatóságtól és a diffúziótól függnek: αi/j = (Di/Dj)*(Si/Sj) ahol a Di/Dj az úgynevezett diffúziós szelektivitás, míg az Si/Sj az oldhatósági szelektivitás. A diffúziós szelektivitás függ a gázmolekula méretétől, a membránanyag szerkezeti merevségétől, a polimerláncok közötti távolságtól, stb. Az oldhatósági szelektivitás értékét pedig a polimer és a permeáló anyag(ok) között kialakuló kölcsönhatások, a membrán anyagában rendelkezésre álló szabad gáztérfogat, stb. határozza meg. Ezek alapján alapvetően két módszer, s azok kombinációja használatos a polimer membránanyagok fejlesztésében [Shao, 2009]:
40
-
membránok szelektivitásának növelése a Di/Dj növelésével (H2 szelektív membránok) pl. αH2/CO2 növelése DH2/DCO2 növelésével
-
membránok szelektivitásának növelése a Si/Sj növelésével (CO2 szelektív membránok) pl. αCO2/H2 növelése SCO2/SH2 növelésével Többkomponensű, vagyis kevert gázok esetében a valós szelektivitás (αi/j) a 3.10.10.
egyenlet szerint számítható: 3.10.10. egyenlet: α i/j = (xi/xj)/(yi/yj) ahol xi és xj az i illetve j komponens koncentrációja a permeátumban, míg yi és yj a betáplálásra vonatkozó – vagyis kiindulási – koncentrációk.
3.11. A hidrogén szeparációja pórusmentes, polimer membránokkal H2 szelektív membránok A hidrogén tisztítását a legtöbb esetben a CO2-tól való elválasztás jelenti. E feladat megoldásához hidrogén- illetve szén-dioxid szelektív membránok alkalmazásával két stratégia alakítható ki. A hidrogén szelektív membránok fejlesztése közben a cél az, hogy növeljék a diffúziós szelektivitást (DH2/DCO2 ), miközben lehetőleg minél inkább csökkentsék az oldhatósági különbségekből származó szelektivitást (SCO2/SH2 ). Erre a célra potenciálisan alkalmasak s merev szerkezettel jellemezhető „üvegszerű” polimerek, köztük a poliimid, poliéterimid, poliéterszulfon, poliéterketon, etil-cellulóz stb. anyagok, melyek alkalmazásával mintegy 2-87 Barrer hidrogén permeabilitás, s 2-7.5 közötti elméleti szelektivitás érhető el [Abetz, 2006; Orme, 2003; Li, 2008; Wang, 2000; Maiera, 1998; David, 2011; Bélafi-Bakó, 2006]. A másik lehetőség polimerkeverékek, mint membránanyagok alkalmazása, melynek során a különféle előnyös tulajdonságokkal rendelkező polimerek kombinálásával még jobb teljesítményű membránok készíthetők. Fontos, hogy olyan keveréket válasszunk, melyekben az alkotó komponensek között megfelelő kölcsönhatások tudnak létrejönni ahhoz, hogy így homogén
és
reprodukálható
membránokat
lehessen
kialakítani,
példaul
cellulóz-
acetát/polietilén-glikol, poliszulfon/polikarbonát, poliimid/polianalin, stb. keverékből [Shao, 2009; Acharya, 2008; Sue, 1997]. 41
Az eddigieken túlmenően a kémiai keresztkötések kialakítása is ígéretes terület a hidrogén szelektív membránok fejlesztésében [Shao, 2008; Tin, 2003]. Ezek során pl. diamino keresztkötéseket alakítanak ki a polimerláncok, pl. poliimid között, mellyel jelentős H2/CO2 szelektivitás növekedés – akár 50-100-as érték – érhető el, emellett azonban a permeabilitások számottevő csökkenését figyelték meg. Szintén egy potenciális lehetőség a szervetlen és szerves polimerek keveréséből, úgynevezett hibrid membránok kialakítása, melyek egyesítik a szervetlen membránok kitűnő szelektivitás tulajdonságait a polimerek nyújtotta lehetőségekkel [Sholl, 2005; Chen, 2006]. Az ilyen membránokban valamilyen szervetlen anyag pl. zeolit, szénnanocsövek van(nak) szétoszlatva egy adott polimerben, például poliszulfon/zeolit keverék, mellyel 72 H2/CO2 szelektivitást s 7.1 Barrer permeációs sebességet értek el. Fontos azonban megjegyezni, hogy ez a módszer még nem kiforrott, az előállítási költségek magasak, így további fejlesztések szükségesek. CO2 szelektív membránok A szén-dioxid szelektív membránok esetében – a hidrogénhez viszonyítva – nagyobb oldhatósággal rendelkező szén-dioxid a permeátumban dúsul fel, míg a retentátumban a betáplált gázáramhoz képest koncentrációja lecsökken. Az ilyen membránanyagok esetében jellemzően az oldhatósági szelektivitás a meghatározó (SCO2/SH2 ), mely mellett igyekeznek minimalizálni a diffúziós tulajdonságbeli különbségek okozta szelekciós hatást (DH2/DCO2 ). A hidrogén szelektív membránokkal ellentétben ezek a polimerek nem merev, üvegszerű, hanem rugalmasabb szerkezettel rendelkeznek. Ide sorolhatók többek között a poliéter, poli(dimetil-sziloxán), poli(etilén-oxid) tartalmú (ko)polimerek, poli(propilén-oxid), poli(amid-6-b-etilén-oxid)
vagy
másnéven
Pebax,
poli(etilén-oxid)/poli(etilén-glikol)
(rövidítve PEG), poli(4-metil-2-pentin) stb. anyagok, melyekkel 15-10700 Barrer CO2 permeabilitás, s 1.8-31 CO2/H2 szelektivitás érhető el. A hidrogénszelektív membránoknál leírt módszerek, úgymint a polimerkeverékek (pl. Pebax/PEG, PEG/poliimid) alkalmazása, valamint a kémiai keresztkötések polimerláncok közötti kialakítása itt is megjelenik, mint fejlesztési lehetőség [Shao, 2009; Husken, 2010; Car, 2008; Reijerkerk, 2010; Yavea, 2009; Lin, 2004]. A CO2 szelektív membránok között különlegesnek számítanak az ún. vivőanyagos membrán polimerek, amikor is valamilyen mobil vagy helyhez kötött hordozóanyagot adnak a membrán anyagához.
42
Ezek a típusú membránok kivételesen nagy CO2/H2 szelektivitással bírnak, azonban a vivőanyag telítődésének kérdése problémát jelent a hosszúidejű használat során [Shao, 2009]. A H2- és CO2 szelektív membránok összehasonlítása, előnyök-hátrányok A H2 és CO2 szelektív membránokat összehasonlítva elmondható, hogy az előbbi csoport képviselői általában nagyobb termikus- és nyomásállósággal rendelkeznek, így magasabb
hőmérsékleti
tartományban,
nagyobb
nyomású
gázáram
kezelésére
is
alkalmazhatók. Hátrányuk azonban, hogy a hidrogén a permeátumban, vagyis alacsony – legtöbbször atmoszférikus – nyomáson dúsul, s így a felhasználási módtól függően energiaigényes rekompresszió válhat szükségessé. Ezzel szemben a CO2 szelektív membránok nagy előnye, hogy a hidrogén, mint termék dúsulása a retentátum áramban történik meg, melynek nyomása megegyezik, vagy csak némileg alacsonyabb a betáplálás oldali gáznyomásához viszonyítva, így a kialakuló nyomásveszteség elhanyagolható, vagyis nincs szükség jelentős rekomprimálásra. Emellett a kezelendő gázáram szén-dioxid tartalma jellemzően kisebb a hidrogén tartalomhoz viszonyítva, s így a gázelegy kezeléséhez kisebb méretű membrán is elegendő lehet, aminek pozitív hatása lehet a beruházás költségvonzatára. Az ilyen membránok hátránya, hogy nem használhatók magas hőmérsékleti régiókban, mint hidrogén szelektív társaik, vagyis a túl magas hőmérsékletű gázokat le kell hűteni a megfelelő szeparációs hatékonyság eléréséhez, mivel általában alacsony hőmérsékleten dolgoznak hatékonyan, s a szükséges hűtés biztosítása energiaigényes tényezőként jelenhet meg [Shao, 2009]. A műveleti paraméterek hatása a hidrogén szeparációjára Ahogy eddig ismertetésre került, a membrán anyagának megválasztásával jelentősen befolyásolható a hidrogén elválasztás hatékonysága mind az elérhető permeabilitások, mind a szelektivitások tekintetében. Ezen túlmenően azonban a műveleti paraméterek, úgymint hőmérséklet, nyomásviszonyok, kitermelés (retentát/permeátum áram és a betáp gázáram egymáshoz viszonyított aránya, amely megmutatja, hogy a betáplált gázáram hányad része nyerhető ki termékként), a membránmodul konfigurációja, a betáplált gázáram összetétele, permeátum oldali ún. söprőgáz alkalmazása stb. nagymértékben képes a szeparáció hatékonyságának befolyásolására [David, 2011; Car, 2008; Reijerkerk, 2010, 2011; Lin, 2004].
43
4. 4.1.
Kísérleti rész A
fermentációs
kísérletek
során
alkalmazott
anyagok,
eszközök, módszerek A baktériumtenyészetek fenntartása Kísérleteim legnagyobb részében E. coli (XL1-BLUE) baktériumtörzset alkalmaztam. A mikroorganizmus szaporítása agaros Luria-Bertani (LB) táptalajon történt, mely egy általánosan alkalmazott tápközeg az E. coli szaporítására. Összetétele 10 g tripton, 5 g élesztőkivonat, 10 g nátrium-klorid (és 30 g agar a szilárd táptalaj esetében) 1 L-re vonatkoztatva. A kísérleti munka során alkalmazott, genetikailag módosított E. coli (DJT 135) törzset Patrick C. Hallenbeck professzor (University of Montreal, Kanada) biztosította, melynek fenntartása a már ismertetett E. coli (XL1-BLUE)-hoz hasonló körülmények között történt. Ez a mikroba a hidrogénfelvevő hidrogenázok ( Hyd-1,
Hyd-2), a laktát-dehidrogénáz
enzim ( ldh), valamint a hidrogéntermelésért felelős FHL enzim szabályozásában szerepet játszó fhlA tekintetében hordoz mutációkat. Ezen módosításoknak köszönhetően a baktérium nem képes a megtermelt hidrogén oxidálására (elfogyasztására), glükóz szubsztrát adagolása esetén annak laktáttá alakítása, vagyis ezen kompetitív anyagcsere úton történő katabolizmusa nem mehet végbe, valamint megnövelt FHL enzim expressziós szinttel rendelkezik.
4.1.1. ábra – Az E. coli (XL1-BLUE) Petri-csészében felnövesztve
44
Antibiotikum oldat készítése A kísérletek során fontos, hogy a rendszert megvédjük az esetleges fertőzésekkel szemben, így a kísérletek során a tápoldathoz minden esetben antibiotikum oldatot adagoltam. Ezek E. coli (XL1-BLUE) esetében tetraciklin, míg az E. coli (DJT 135) esetében kloramfenikol voltak. Az oldat készítésének menete a következő volt: Az antibiotikumot abszolút etanolban oldva készítettem 5 mg/mL-es törzsoldatot, melyből a későbbiek során a megfelelő mennyiséget mikropipetta segítségével adagoltam a tápoldathoz. A tetraciklin előírt alkalmazási aránya 10 µg/mL tápoldat, míg a kloramfenikolé 20 µg/mL. Az inokulum készítése Az inokolumot – másnéven beoltókultúrát – minden kísérletet megelőzően frissen, vagyis előző nap készítettem az agaros LB-táptalajon felnövesztett, szaporított baktériumok felhasználásával. Az átoltásokat steril box alatt dolgozva, aerob körülmények között, előzetesen sterilizált lombikokba végeztem. A lombikok mindegyikét mintegy félig LB szubsztráttal töltöttem fel, melyekhez minden esetben hozzáadtam a megfelelő mennyiségű antibiotikum oldatot, ezt követően a lombikot steril záró kupakkal láttam el és 24 órára 37 oCon termosztált rázógépbe tettem (rázatási intenzitás 110 rpm). Az inkubálás aerob körülmények között zajlott, a tenyészet ilyen körülmények között gyorsabban nő, így azonban nem termel hidrogént. Optikai sűrűség (OD620) meghatározása spektrofotométerrel A kísérletek összehasonlíthatósága miatt fontos, hogy a kiindulási sejtszám jól kontrollálható legyen. Ennek érdekében minden egyes fermentálás előtt mértem a frissen felnövesztett inokulum optikai sűrűségét, s ez alapján számoltam a szükséges beoltó kultúra mennyiségét. Ehhez elsőként hígítási sort készítettem, melyben a sor egyes tagjainak össztérfogata azonos volt, és mindegyik különböző, de ismert mennyiségű inokulumot tartalmazott. Ezt követően spektrofotométerrel mértem az egyes oldatok abszorbanciáját 620 nm-en (OD620) desztillált vízzel szemben, majd a mintákat centrifugáltam (10 perc, 12000 perc-1), végül az oldatokról a tiszta fázist leöntve a kémcsövek alján visszamaradó biomasszát 105 oC-on tömegállandóságig szárítva mértem a hígítási sor minden tagjának szárazanyag tartalmát. A kapott szárazanyag értékek és az ismert oldattérfogatok alapján számítottam a sejtkoncentrációkat (mg sejt szárazanyag (sz.a.)/mL inokulum) majd a hozzájuk tartozó abszorbancia adatokkal együtt ábrázoltuk őket (4.1.2. ábra). 45
Abszorbancia (620 nm)
2
y = 1.703x + 0.248 R² = 0.998
1.6 1.2 0.8 0.4
0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
C (mg sejt sz.a./mL) 4.1.2. ábra – A sejtkoncentráció és az abszorbancia összefüggése A szükséges inokulum mennyiségének számítása 4.1.1. egyenlet szerint történt: 4.1.1. egyenlet: Csejti * Vi = Csejtt * (Vi + Vt) Az egyenlet tulajdonképpen azt adja meg, hogy adott sejtkoncentrációjú (Csejti) inokulumból mennyit (Vi) kell kivenni és hozzáadni adott (Vt) térfogatú tápoldathoz, annak érdekében, hogy a (Vi+Vt) össztérfogatú fermentlében a kiindulási sejtkoncentráció Csejtt legyen. A manometrikus gázmérő készülék Az E. coli (XL1-BLUE)-ra vonatkozó fermentációs (elő)kísérleteket WTW OXITOP 100 típusú manometrikus gázmérő készülékben végeztem (4.1.3. ábra), melynek össztérfogata 500 mL volt, melyből a folyadék- és a gázfázis térfogata egyaránt 250-250 mL tett ki. A készülék mérőfeje alkalmas a gáztér nyomásváltozásának mérésére, s a kísérletek során ezt használtam ki, vagyis a zárt rendszerben, a fermentáció során keletkező gáz(ok) nyomásának növekedését mértem. Az edényekhez a különböző összetételű tápoldatok betöltését követően mágneses keverőszálat adtam, majd a szeptumok és zárókupakok segítségével lezártam. Az így összeállított berendezéseket a tetraciklin oldat steril beméréséhez szükséges pipetta heggyel, az inert gáz steril bevezetéséhez szükséges szűrővel együtt autoklávban sterilizáltam.
46
A környezeti hőmérsékletre visszahűlt rendszerhez – lamináris box alatt – a frissen felnövesztett inokulumból annyit adagoltam, hogy a kiindulási sejtszámok azonosak legyenek. A kísérletek kezdetén a tápközegek pH-ját 6.5-re állítottam be s a reakcióelegyet 10 percen át inert gáz (nitrogén) steril szűrőn keresztüli bevezetésével öblítettem át annak érdekében, hogy a gázmérő edény gázterében, valamint a folyadékfázisban oldott állapotban jelen lévő oxigént is kihajtsam az anaerob, oxigénmentes körülmények biztosítása érdekében. A készülék mérőfeje nem sterilezhető, így azt etanollal átitatott steril vatta segítségével alaposan megtisztítottam, s csatlakoztattam az üvegedényekhez.. Az ily módon összeállított berendezést 37 oC-os légtermosztátba helyeztem (5.1.1. ábra), s 24 órán keresztül mértem a rendszerben a gázfejlődés hatására bekövetkező nyomásváltozást. A kísérletek későbbi szakaszában, az E. coli (XL1-BLUE) és E. coli (DJT 135) törzsek összehasonlító vizsgálata során a biorektorként szolgáló gázmérő edényeket az eddig leírtakhoz hasonló módon állítottam össze, azzal a különbséggel, hogy ekkor az üvegeket a kísérleti terv által kijelöltek szerinti pH értékű foszfát pufferrel töltöttem fel (5.5.1 táblázat), melyhez különböző koncentrációkban (5.5.1 táblázat) formiátot, valamint 10 g/L triptont, 5 g/L élesztőkivonatot és 3.33 g/L NaCl-t adtam. Ezen kívül változás volt az is, hogy a gáztérben elhelyezkedő gumikosarában NaOH pasztillákat helyeztem el abból a célból, hogy a fermentáció során keletkező H2 és CO2 tartalmú gázelegyből a CO2 megkötődjön, így a hidrogén keletkezésének folyamatát önmagában nyomon lehessen követni. A készülék gázmintavevő szeptumán vett minták összetételének vizsgálata igazolta, hogy a gáztérben jelenlévő nátrium-hidroxid a keletkező CO2-t hatékonyan adszorbeálta. A manometrikus mérőfej csatlakoztatását követően az edényeket 37 oC-os termosztátba helyeztem, s 24 óráig végeztem a fermentációkat.
4.1.3. ábra – A manometrikus gázmérő készülék 47
A szakaszos üzemű bioreaktor Az
E.
coli
(XL1-BLUE)-val
végzett,
szakaszos
biohidrogén
fermentáció
optimalizálását egy laboratóriumi méretű fermentor alkalmazásával végeztem (4.1.4. ábra). A fermentor tulajdonképpen olyan bioreaktor, aminek az üzemeltetési paraméterei (ellentétben a gázmérő készülékkel) kiterjedten ellenőrizhetők és szabályozhatóak. Az előkísérleteket követően célom az optimális paraméterek meghatározása volt a minél hatékonyabb hidrogéntermelő bioreaktor létrehozása érdekében.
A biomérnöki laboratóriumunkban
használt fermentor egy 3.5 L össztérfogatú, termosztálható, félautomata szabályozású (pH szabályzása automatikus, míg a hőmérséklet és a keverési sebesség manuálisan szabályozható) üvegedény. A fedőlapján kialakított szeptumok, csatlakozók segítségével lehetőség van gáz- és folyadékminta vételre. Szintén a fedőlapon kialakított csonkon keresztül történik a fermentor gáz- és folyadék terének inert gázos (nitrogénes) átöblítése is a kísérletekhez szükséges anaerob körülmények biztosítása érdekében. A mérések előtt az összeállított berendezést minden esetben nyomástesztnek vetettem alá, s csak a tökéletesen záródó rendszerben kapott mérési eredményeket fogadtam el. A kísérletek során a reaktorban a folyadéktérfogat 3100 mL, míg a gáztérfogat 400 mL volt. A fermentlé pH-ját irodalmi adatok alapján 6.5-es értéken szabályoztam, s a reaktor hőmérsékletét 37 oC-ra termosztáltam.
4.1.4. ábra – A szakaszos üzemű fermentor
48
A folyamatos üzemű bioreaktor rendszer Az E. coli (XL1-BLUE)-val folytatott folyamatos üzemű kísérletekhez – praktikussági okokból – egy 2 L össztérfogatú bioreaktort alkalmaztam. A folyamatos üzemű bioreaktor (4.1.5. ábra) indítása szakaszos üzemmódban kezdődött, melynek célja az volt, hogy az inokulálást követően, a folyamatos üzemmódba történő átváltás előtt a sejteket megfelelő mértékben felszaporítsam. Ennek szellemében a reaktor inokulálását követően a baktériumokat 8 órán keresztül, szakaszos üzemmódban növesztettem a szakaszos kísérletekben optimálisnak talált körülmények alkalmazásával (formiát konc. 30 mM, élesztőkivonat konc.: 5 g/L, tripton konc.: 10 g/L, NaCl konc.: 3.33 g/L, kezdeti sejtkonc.: 0.05 g sejt sz.a./L, keverési sebesség: 220 rpm). A kezdeti 8 órát követően, amikor a sejtek elérték az exponenciális szakasz végét, egy két munkahelyes perisztaltikus pumpa segítségével elindítottam a friss tápközeg betáplálását az adott tartózkodási időnek megfelelő áramlási sebességgel (mL/h), s ezzel szimultán, azonos sebességgel az elhasznált tápközeg reaktorból történő elvételét. A folyamatos üzemű kísérletek az adott tartózkodási idő mintegy 4.1-4.2 szeresét kitevő ideig tartottak. A kísérletek során a reaktor folyadékterének térfogata konstans 1000 mL, míg a gáztérfogat a csatlakozó csövekkel együtt 1100 mL voltak. Az előzetesen sterilizált, friss tápleves egy külső, 4.5 L hasznos térfogattal rendelkező tartályból került betáplálásra, melynek összetétele az alábbiakban adható meg: formiát konc. 30 mM, élesztőkivonat konc.: 5 g/L, tripton konc.: 10 g/L, NaCl konc.: 3.33 g/L. A képződő gázelegy hidrogéntartalmát on-line módon, a BlueSens hidrogénszenzor használatával mértem, melyhez egy gázrecirkulációs ágat alakítottam ki a rendszerben. A szenzor mintavételi frekvenciáját 1 h-1-ra állítottam. A kísérletek alatt a fermentlé pH-ját 6.5-es értéken szabályoztam, a hőmérsékletet 37 oC-ra termosztáltam.
49
4.1.5. ábra – A folyamatos üzemű hidrogéntermelő bioreaktor rendszer 1: Fermentor; 2,3: sav- ill. lúgtartály; 4: pH szabályzó; 5: sav- ill. lúg adagolópumpa; 6: gázmennyiség mérő („kotyogó”); 7: keverő; 8,9: BlueSens gázanalizátor; 10: gázrecirkulációs pumpa; 11: betáp tartály; 12: elfolyó tartály; 13: betáp-elvét pumpa; 14: termosztát; 15: PC A keletkező gáz összetételének meghatározása GC-vel A szakaszos üzemű fermentorban végzett kísérletek során a képződött gázelegy hidrogén tartalmát gázkromatográfiás módszerrel határoztam meg, amelyhez GOW-MAC Series 600 típusú gázkromatográfot használtam. Az analízishez hélium vivőgázt (30 mL/min), egy 2 m hosszú, zeolit töltetes kolonnát, illetve hővezetőképességi detektort (TCD) alkalmaztam. A keletkező gáz összetételének meghatározása BlueSens hidrogénszenzorral A folyamatos rendszerben végzett biohidrogén fermentációk során keletkezett gázelegy hidrogéntartalmának mérését, valamint a kevert gázzal végzett membrán szeparációs vizsgálatok során a betáp, a permeátum és retentátum áramok hidrogén koncentrációjának nyomonkövetését on-line módon, a BlueSens (BlesSens Gas Sensor GmbH) hidrogénszenzor használatával végeztem (4.1.6. ábra). 50
Ez a készülék képes a többkomponensű gázelegyek hidrogén tartalmának real-time módon történő meghatározására 0-100 %(V/V) koncentráció tartományban, két tizedes pontossággal, minimálisan 20 s-os válaszidő alkalmazása mellett.
4.1.6. ábra – A BlueSens hidrogénszenzor A keletkező gáz mennyiségének mérése A keletkező biogáz mennyiségének mérése egy módosított U-cső („kotyogó”) segítségével történt, melynek bal és jobb oldali szára között egy átvezető csőszakasz helyezkedett el. A módosított U-cső mindkét szárába egy-egy fémdrótot vezettem be, majd csapvízzel töltöttem fel a készüléket. A bal szárban lévő elektród folyamatosan érintkezett a vízzel, míg a jobb oldali elektród alapesetben szárazon volt (nyitott állás). A bal oldali rész felül zárt (felső harmadán lévő csonk segítségével csatlakozott a fermentorhoz), míg a jobb oldali szár felül nyitott kialakítású volt. A biohidrogén fermentáció során keletkező gáz az Ucső bal szárában folyamatosan szorította ki a folyadékot, mellyel párhuzamosan az átvezető csőszakaszban és az U-cső jobb szárában emelkedett a vízszint. Abban a pillanatban, amikor a folyadék szintje a jobb oldalon is elérte az elektródot, az áramkör zárult (zárt állás). Amikor a keletkező gáz az átvezető csőszakaszból teljesen kinyomta a vizet, a nyomáskülönbség a két szár között kiegyenlítődött, a jobb oldali elektród ezzel ismét szárazra került, vagyis nyílt az áramkör [Szentgyörgyi, 2010]. A nyitott és zárt állapotok közötti változás egy jelet generált, amit multiméter segítségével mértem. A nyitott-zárt-nyitott ciklusokat „kotyogásnak” neveztem el. A „kotyogás” térfogatát a mérés előtt kalibráltam, így a kotyogások számából (amelyet a multiméterhez kapcsolt számítógép segítségével regisztráltunk) a kumulált gáztérfogat számolhatóvá vált. A „kotyogó” fényképe a 4.1.7. ábrán látható. 51
4.1.7. ábra – A „kotyogó” fényképe A keletkező biohidrogén mennyisége a fermentáció során keletkező gázelegy össztérfogatából (kotyogások száma) és a fermentor gáztér összetételének időközönkénti analíziséből számítottam a 4.1.2. egyenlet szerint: 4.1.2. egyenlet: VHi = V0(CHi - CHi-1) + CHi(VGi - VGi-1) ahol VHi az (i) időintervallum alatt keletkezett hidrogén mennyisége (mL); V0 a bioreaktor gázterének térfogata (mL); CHi a hidrogén gázfázisbeli koncentrációja (i) időpontban (%(V/V)); CHi-1 a hidrogén gázfázisbeli koncentrációja (i-1) időpontban (%(V/V)); VGi az (i) időintervallum alatt keletkezett gáz mennyisége (mL); VGi-1 az (i-1) időintervallum alatt keletkezett gáz mennyisége (mL).
4.2. A membrános gáz szeparációhoz használt anyagok, eszközök, módszerek ME1 membrán modul A hidrogén elválasztását célzó kísérletek első részében a Twentei Egyetem Membrános Csoportja által készített gáz szeparációs membránt (ME1) teszteltem. A szóbanforgó membrán kapilláris csöves elrendezésű, mely elrendezéssel nagyobb aktív felület/térfogat arány érhető el, amely az elválasztás szempontjából előnyös. A kapilláris szálak Matrimid 5218 és PI84 típusú poliimid keverékéből készültek. 52
A membrán szálak egy nyomásálló, rozsdamentes acélmodulba lettek beépítve. A modul effektív átadási felülete 9 cm2 volt, mely 6 szálon oszlott el. A csövecskék a betáp oldal fele nyitottak voltak, a másik végüket kétkomponensű epoxiragasztóval zártam le. Az elválasztandó gázokat a szálak belsejébe tápláltam be, a permeátumot a köpeny oldalon, atmoszférikus viszonyok mellett nyertem. A membrán modul felépítése a 4.2.1. és 4.2.2. ábrán látható.
Koncentrátum (zárva) Betáplálás
Permeátum 4.2.1. ábra – Az ME1 gáz szeparációs modul sematikus rajza
4.2.2. ábra – Az ME1 kapilláris modul fényképe
A kísérleteket a biohidrogén előállítás során keletkező gázelegyben található tiszta, egy komponensű gázokkal végeztem el. Kísérleteim során egy olyan acéltartályt töltöttem meg az adott gázzal, amelynek végén egy nyomásmérő található, amelyben egy piezokristály helyezkedik el. A piezokristálynak a tartályban uralkodó nyomás hatására változik a mérete és 53
ennek függvényében változik a mérhető elektromos feszültség mértéke, amely a tartályhoz (a nyomásmérő egységhez) kapcsolt multiméter segítségével mérhető. A tartályt a gázzal való megtöltést követően összeköttetésbe hoztam a membrán modullal (4.2.3. ábra), majd a membrán másik végére egy légmentesített ballont húztam. Ezt követően a készüléket egy fermentációs hőmérséklethez közeli, T=40 oC-os termosztátba helyeztem, és megvártam, míg a gáz felveszi ezt a hőmérsékletet. Következő lépésként a tartályon található csap megnyitásával megindítottam a gáz(ok) betáplálását a membrán modulba. A számítógéppel összekapcsolt multiméter segítségével folyamatosan mértem és tároltam a tartályon található nyomásmérő egység által adott jelet (feszültség), amellyel így információkat kaptam arra vonatkozóan, hogy a gáz hogyan, mennyi idő alatt képes átjutni a membránon, vagyis a fluxusára és a szelektivitására, amelyekkel az adott membrán jellemezhető.
4.2.3. ábra – Az ME1 membrán vizsgálatára szolgáló kísérleti berendezés UBE membrán modul és a GSMS 100 gáz szeparációs membrántesztelő készülék A gáz szeparációs vizsgálatok második részében az intézetünkben található GSMS100 mobil membrántesztelő készüléket alkalmaztam az UBE Industries Ltd. „NM-B01A” elnevezésű kapilláris csöves, poliimid membránjának vizsgálatára (hossza: 235 mm, külső átmérője: 55 mm, belső átmérője: 50 mm). A membrán modul fényképe a 4.2.4. ábrán, míg a gáz szeparációs berendezés elvi sémája a 4.2.5. ábrán, fényképe az 4.2.6. ábrán látható.
54
4.2.4. ábra – Az UBE NM-B01A membrán modul
4.2.5. ábra – A membrántesztelő készülék működésének sematikus ábrája 1; gázpalack, 2; reduktor szelep, 3; betáp szelep, 4; betápnyomás mérő, 5; termosztát, 6; membrán modul, 7; differenciál nyomásmérő, 8; permeátum odali nyomásmérő, 9,10; permeátum oldali szabályozó szelepek, 11,15,18; digitális áramlásmérők, 12,16; BlueSens H2 szenzor, 13; permeátum frakció, 14; retentátum oldali szabályozó szelep, 17; retentátum frakció
55
4.2.6. ábra – A GSMS-100 membrántesztelő készülék képe A berendezés mérési adatgyűjtő rendszerének alapját egy Labview 8.5 szoftverben készített program szolgáltatta. A membrántesztelő készülék termosztálható, a belsejében elhelyezett membránmodul fűthető, így különböző hőmérsékleteken tesztelhetőek a membrán(ok) szeparációs tulajdonságai. Emellett a primer oldali nyomásváltoztatással módosíthatók a nyomásviszonyok a rendszerben. Munkám során kísérleteket végeztem a membrán permeábilitásának (áteresztőképesség) és szelektivitásának meghatározására különböző nyomásokon, hőmérsékleteken, valamint retentátum elvételi arányok beállítása mellett. A membránmodul tesztelését kétfajta üzemmódban lehetett elvégezni: 1, Retentátum elvétel nélkül Ezzel az elrendezéssel az egyes tiszta gázokra vonatkozó permeációs áramok gyorsan és pontosan határozhatók meg. Ez a beállítás a 14-es szelep zárásával, a 10-es szelep szabályzásával, a 3-as és 9-es szelepek nyitott állapota mellett alakítható ki. 2, Retentátum elvétel mellett A gázelegyek szeparációjának vizsgálata esetén mindenképpen szükség van a retentátum frakció elvételére. Ezen mérési elrendezéshez a 3-as, 9-es szelepeket nyitni, míg a 10-es és 14-es szelepeket szabályozni kell.
56
A kísérletekhez felhasznált tiszta gázokat (hidrogén, szén-dioxid, nitrogén) gázpalackokból nyertem, hidrogén esetében 99.5 %(V/V)-os, szén-dioxid esetében 99.9 %(V/V)-os, nitrogén esetében 99.9 %(V/V) tisztaságban (Messer Hungarogáz Kft., Budapest).
57
5. Eredmények és értékelésük 5.1. Kísérletek a formiát szubsztrát hatásának vizsgálatára Ahogy az irodalmi részben ismertetésre került, az E. coli hidrogéntermelő képessége közvetlen kapcsolatban áll a formiát jelenlétével. Elsőként tehát annak vizsgálatára végeztem kísérletet, hogy a rendelkezésre álló E. coli (XL1-BLUE) baktérium hidrogéntermelő potenciáljára vonatkozóan a formiát jelenléte milyen hatást fejt ki. A kísérleteket a WTW OXITOP 100 gázmérő készülékben hajtottam végre a „Kísérleti részben” leírtak szerint, a baktérium növekedéséhez szükséges táptalaj összetételét változtatva: az egyik esetben tiszta LB táptalajt, másik esetben LB táptalaj és formiát (75 mM) elegyét alkalmaztam.
5.1.1. ábra – A fermentációs készülékek a termosztátban A formiát hatására vonatkozó eredményeket az 5.1.2. ábra szemlélteti.
Nyomás [hPa]
500 400
300 200 100 0
0
5
10
15
20
25
Idő [h]
5.1.2. ábra – A formiát hatásának vizsgálata (piros:LB + 75 mM formiát; kék: LB) 58
Amint az 5.1.2. ábrán látható, a módosított táptalaj alkalmazása, tehát formiát hozzáadása esetén jelentősen nagyobb mértékű gázképződés volt tapasztalható, mint annak elhagyása esetén, tehát a formiát alkalmazása – az irodalmi adatokkal összhangban – előnyösnek bizonyult, így a további munka során a formiát hozzáadásával készült LB tápoldatot alkalmazva végeztem a kísérleteket.
5.2. A biohidrogén fermentáció optimalizálása kísérlettervezéssel
A szakirodalomban közölt adatok szerint számos faktor, többek között a fermentáció körülményei, úgymint a hőmérséklet, a pH, a tápközeg összetétele, a metabolitok (pl. etanol, acetát, butirát, stb.) koncentrációja a folyadékfázisban, stb. befolyásolhatja a rendszer hatékonyságát, vagyis hatással lehet a hidrogéntermelés két legfontosabb paraméterére, a fajlagos képződési gázáramra és a hozamra [Collet, 2004; Khanal, 2004; Kim, 2006; Van Ginkel, 2005], amelyek meghatározzák az adott eljárás gazdasági és ipari szempontú alkalmazhatóságát, sikerességét. A felsorolt tényezők között például a fermentációs közeg összetétele (szén forrás, nitrogén forrás, ásványi sók, nyomelemek, vitaminok, stb.) különösen fontos, mivel az határozza meg a sejtek, mint biokatalizátorok számára a kémiai környezetet a reaktorban, s így befolyással van a a mikrobák hidrogéntermelő képességére [Weuster-Botz, 2000]. Ahogy a 3.5. fejezetben ismertetésre került, a hatékony hidrogéntermelő bioreaktor kialakításához fontos a hidrogéntermelő mikrobák azonosítása, azok biokémiai-fiziológiai szempontú jellemzése (esetleg metabolikus mérnökség alkalmazása is), s végezetül a mikrobák alkalmazásával optimalizált teljesítményű rendszerek kialakítása. A munkám során az E. coli
(XL1-BLUE) baktériumot alkalmaztam, amelyről ismert, hogy hidrogén
előállítására képes, emellett biokémiai, fiziológiai szempontú jellemzését is elvégezték (3.3.3.4. fejezet), s így munkámat az utolsó lépésre, a bioreaktor hatékonyságának növelésére fókuszáltam, amelyet a 3.6.-3.7. fejezetekben leírtak szerint kísérlettervezéssel kívántam elvégezni. A szakirodalmban megjelent publikációk alapján elmondható, hogy a hidrogénfermentáció kísérlettervezéssel történő optimalizálására csak néhány példát lehet találni, vagyis az optimális kondíciók ilyen módszerrel történő meghatározása újszerűnek tekinthető.
59
5.2.1. A fermentációs paraméterek hatásának, a kulcsfaktorok körének meghatározása A kísérleti terv végrehajtása előtt meghatároztam azon változók körét, amelyekről úgy gondoltam,
hogy
befolyással
lehetnek
az
E.
coli
hidrogéntermelő
potenciáljára
(„Brainstorming”). Ezek a következők voltak: a fermentációs közeg összetétele, a keverési sebesség és a kiindulási sejtkoncentráció. Ezt követően Statistica 8 szoftver segítségével elkészítettem a kísérleti tervet, melyben az egyes faktoroknak a hidrogén fajlagos képződési gázáramára gyakorolt hatását vizsgáltam. Az egyes változók kódolása és vizsgált szintjei az 5.2.1. táblázatban, míg a kísérleti terv mátrix a mért kimeneti értékekkel együtt az 5.2.2. táblázatban látható. 5.2.1. táblázat – A változók kódolása és vizsgálati értékei Kód X1
Változó Formiát konc. (mM)
Alacsony szint (-1) 30
Magas szint (+1) 60
X2
Sejt konc. (g sejt sz.a./L)
0.01
0.05
X3
Élesztőkivonat konc. (g/L)
1.66
5
X4 X5
NaCl konc. (g/L)
3.33
10
Tripton konc. (g/L)
3.33
10
X6
Keverési sebesség (rpm)
110
220
5.2.2. táblázat – A kísérleti terv mátrix a mért gázképződési adatokkal formiát konc. sejtkonc. élesztőkivonat konc. -1 -1 1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 1 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
NaCl konc. tripton konc. keverési seb. 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
fajlagos képződési gázáram (mL H2 L-1d-1) 268 438 357 289 250 682 557 443 320 370 310
Az egyes változók vizsgálati tartományának kiválasztása szakirodalmi adatok és korábbi tapasztalatok alapján került megállapításra. Mint az 5.2.2 táblázatban látható, a választott 6 faktor hatását összesen 11 kísérleti beállítás mellett vizsgáltam, amely tartalmaz 3 centrumpontbeli mérést (9-11) a szórás becsléséhez. A fermentorban elvégzett kísérletek időbeli lefutásai az 5.2.1. és az 5.2.2. ábrán láthatóak. 60
H2 képződési sebesség (mL/h)
300 2
250
1 7
200
5 4
150
8 6
100
3 9
50
10 11
0 0
5
10
15
20
25
Idő (h) 5.2.1. ábra – Hidrogén képződési sebességek az idő függvényében
Kumulatív H2 termelés (mL)
2500 2 1
2000
7 5
1500
4 8 6
1000
3 9
500
10 11
0 0
5
10
15
20
25
Idő (h) 5.2.2. ábra – Kumulatív hidrogén képződés az idő függvényében A kísérleti terv kiértékelése Statistica 8 szoftvert alkalmazva varianciaanalízissel (ANOVA) történt, s ennek eredménye a pozitívabb hatás szintjének megjelölésével az 5.2.3. táblázatban látható. 61
5.2.3. táblázat – Az ANOVA eredménye Kód X1
Változó Formiát konc.
Szignifikancia ( ) Pozitívabb hatás szintje 0.007 +1
X2
Sejtkonc.
0.19
+1
X3
Élesztőkivonat konc.
0.07
+1
X4
NaCl konc.
0.99
-1
X5 X6
Tripton konc.
0.16
+1
Keverési sebesség
0.344
+1
A statisztikai kiértékelésből kapott szignifikancia adatok alapján elmondható, hogy többé-kevésbé minden faktor (kivéve a NaCl) befolyásolja a biohidrogén képződést. A változók
relatív
fontosságukat
tekintve
a
következő
rangsorba
helyezhetők:
X1>X3>X5>X2>X6>>X4. A vizsgált paraméterek közül azok tekinthetők kulcsváltozóknak, amelyek szignifikancia szintje teljesíti az α<0.05 kritériumot. Ennek megfelelően egyedül az X1-el kódolt változó, vagyis a formiát (szén forrás) az, amely szignifikáns hatással van a biohidrogén képződésre. A formiát ilyen mértékű hatásának hátterében valószínüleg az áll, hogy – mint 3.3.-3.4. fejezetben ismertetésre került – hidrogéntermelő anyagcsere folyamatai közvetlen kapcsolatban vannak a formiát jelenlétével. Az eredmények alapján magasabb fajlagos képződési gázáram érhető el magasabb formiát koncentráció alkalmazásával, de a tényleges optimum érték meghatározása még további vizsgálatot igényel. Az ANOVA eredményei szerint a formiátot követően a nitrogén forrás(ok) (X3,X5) játszák a legfontosabb szerepet a bioreaktor hatékonyságának növelésében. A nitrogén az egyike azon elemeknek, amely a sejtek anyagában nagy mennyiségben megtalálható. Az élesztőkivonat és a tripton széles körben alkalmazott, komplex összetételű fehérje, aminosav és nyomelem források. A hidrogén termelés folyamatában azonban ezek az összetevők csak közvetve játszanak szerepet, mivel a fehérjék anaerob körülmények közötti lebontása nem eredményez hidrogént. Ezek az anyagok aminosavakká hidrolizálnak, s az aminosavak az ún. Strickland-reakciók során párokban oxidálják-redukálják egymást, amely nem jár hidrogén képződéssel [Hallenbeck, 2009b; Gottschalk, 1986]. Biohidrogén előállításra kifejtett közvetett hatásuk abban nyilvánul meg, hogy a gázképződés arányos a sejtnövekedéssel, sejtszaporodással (5.2.4. ábra), vagyis a hidrogén ún. primer anyagcsere termék.
62
1600
0.8
1200
0.6 800 0.4 400
Sejtkoncentráció
0.2
Képződött gáz mennyisége
0
Képződött gáz mennyisége (mL)
Sejtkoncentráció (mg sejt sz.a./mL)
1
0 0
5
10
15
20
25
Idő (h) 5.2.4. ábra – A sejtnövekedés és a gázképződés kapcsolata Ennek értelmében pedig a hatékony hidrogéntermelés egyik kulcsa a baktériumok optimális
szaporodása,
amelyhez
pedig
szükséges
a
nitrogénforrások
(megfelelő
koncentrációban való) jelenléte. Az irodalomban található információk szerint a magas Na+ koncentráció inhibíciós hatást fejthet ki a hidrogén képződésre [Dong-Hoon, 2009]. Az ANOVA által szolgáltatott adatok azonban azt mutatták, hogy az általam vizsgálat rendszerben ilyen jellegű gátló hatás nem érvényesült, mindazonáltal érdemes minél alacsonyabb só koncentrációt alkalmazni az esetleges akkumuláció elkerülése érdekében és gazdasági megfontolások alapján is. A statisztikai kiértékelés eredménye alapján elmondható, hogy a hidrogénképződés és a beoltó kultúra kiindulási mennyisége között nem volt szignifikáns összefüggés, de elmondható, hogy a nagyobb kiindulási biomassza koncentráció mindenképpen növeli a reaktor sikeres inokulálásának, indításának esélyét, így annak alkalmazása előnyös. Amint az ismert, az elégtelen anyagátadási viszonyok erősen korlátozhatják egy adott reakció lejátszódását, a reaktor teljesítőképességét, ezért vizsgáltam a keverési sebesség hatását is a hidrogénképződésre. A kapott adatok alapján elmondható, hogy a hidrogénképződés során diffúziós gátlás nem lépett fel, azonban magasabb keverési sebesség alkalmazása pozitívan befolyásolta az E. coli (XL1-BLUE) hidrogéntermelését.
63
5.2.2. Az optimális formiát koncentráció meghatározása A hidrogénképződést jelentősen befolyásoló faktor (formiát) azonosítását követően a cél az optimum intervallumának és optimum értékének meghatározása volt. Mivel mindösszesen 1 faktor optimalizálását kellett végrehajtani, azt célszerűen a klasszikus módszerrel, a változók egyenkénti változtatásának módszerével végeztem el. Ezekben a kísérletekben kizárólag a formiát koncentrációját változtattam, s emellett az összes többi vizsgált paramétert azon az értékén, szintjén rögzítettem, ahol a hidrogéntermelés szempontjából előnyösebb hatásuk mutatkozott, vagyis a mérések háttere az alábbiakban adható meg: 10 g/L tripton, 5 g/L élesztőkivonat, 3.33 g/L nátrium-klorid, 220 rpm keverési sebesség, 0.05 g sejt sz.a./L, pH=6.5, T=37
o
C). Elsőként az optimum intervallum
megkeresése volt a cél, s 15, 45, 75 mM formiát koncentrációk mellett vizsgálódtam, majd számoltam a hidrogén fajlagos képződési gázárama és a formiátra vonatkoztatott hozam értékeit. A kapott adatok azt mutatták, hogy növelve a formiát koncentrációt nagyobb fajlagos képződési gázáramok érhetőek el, másrészt azonban a hozamokat tekintve csökkenés mutatkozott a magasabb szubsztrát koncentrációk alkalmazása mellett. Mivel a hidrogén előállítás folyamatában mindkét paraméter meghatározó jelentőségű, az eredmények alapján nyilvánvalóvá vált, hogy egy olyan formiát koncentrációt kell optimumként meghatározni, amelynek alkalmazásával a hidrogén fajlagos képződési gázáramban bekövetkező növekedés mellett a hozam értéke lehetőleg nem csökken. Ennek megfelelően optimum tartománynak a 15-45 mM közötti formiát koncentrációt fogadtam el, s a tényleges optimumot ezen belül kerestem tovább. Az optimum keresés során 15, 30 és 45 mM formiát koncentrációkkal végeztem vizsgálatokat. Az optimum keresés eredményeit az 5.2.4. táblázat tartalmazza, illetve grafikusan az 5.2.5. ábra szemlélteti. A feltűntetett értékek három párhuzamos mérés eredményének átlagát reprezentálják, a meghatározás hibája mintegy 10% volt. 5.2.4. táblázat – A formiát koncentráció optimum meghatározásának eredményei Formiát konc. (mM) 15 30 45 75
Fajlagos képződési gázáram (mL H2 L-1d-1) 210 426 562 725
64
Hozam (mol H2/mol formiát) 0.4 0.41 0.37 0.28
0.45
600
0.40
400
0.35
200
0.30
Hozam (mol H 2/mol formiát)
Fajlagos képződési gázáram (mL H 2 L-1d-1)
800
Fajlagos képződési gázáram Hozam
0
0.25 0
15
30
45
60
75
90
Formiát konc. (mM) 5.2.5. ábra – Formiát koncentráció hatása a H2 fajlagos képződési gázáramára és a hozamra Az 5.2.5. ábrán megfigyelhető, hogy 30 mM-ig növelhető úgy a formiát koncentráció, hogy a fajlagos képződési gázáram emelkedésével párhuzamosan a hozam értékében csökkenés ne következzen be, vagyis a formiát koncentráció optimumát 30 mM-ban állapítottam meg. E feletti koncentrációknál a hozzáadott szubsztrátra vonatkoztatott hozam értéke csökkent, melynek hátterében feltehetően az áll, hogy a formiátnak magasabb koncentráció tartományban már toxikus hatása van. Összefoglalva elmondható, hogy a hidrogén fermentáció szempontjából optimálisnak talált beállítások az következők szerint adhatók meg: 30 mM formiát, 5 g/L élesztőkivonat, 10 g/L tripton, 3.33 g/L NaCl, 0.05 g sejt sz.a./L kiindulási sejtkoncentráció, 220 rpm keverési sebesség, ahol a hidrogén fajlagos képződési gázárama 426 ml H2 L-1d-1 (17 mmol H2 L-1d-1), míg a hozam 0.41 mol H2/mol formiát voltak.
65
5.3. Az Escherichia coli (XL1-BLUE) szaporodási kinetikájának vizsgálata Ezen kísérlet sorozatban az E. coli szaporodásának vizsgálata, a szaporodás kinetikai paramétereinek, a szubsztrát féltelítési állandónak (Ks) és a maximális szaporodási sebességnek (μmax) a meghatározása volt a cél, mivel ezek fontos paraméterekként szolgálhatnak a folyamatos rendszerek tervezéséhez, kialakításához. Például, a μmax megmutatja azt, hogy mi az a maximális hígítási sebesség v. minimális hidraulikus tartózkodási idő, melyet a folyamatos üzemvitel esetén mindenképpen biztosítani kell ahhoz, hogy a sejtek – vagyis a biokatalizátorok – kimosódását elkerüljük. Emellett a Ks értéke az enzim adott szubsztráthoz való affinitását fejezi ki. Amennyiben ez az affinitás nagy, úgy Ks értéke kicsi, illetve fordítva. Továbbá, a féltelítési állandó azt a szubsztrát koncentrációt is reprezentálja, amely szükséges a maximális szaporodási sebesség felének eléréséhez [Nyeste, 1997; Atkinson, 1992; Bailey, 1986], vagyis ennek megállapítása segíthet a betáplálás szubsztrát koncentrációjának megfelelő beállításában. Ahogy az 5.2.4. ábrán látható, az E. coli (XL1-BLUE) gáztermelése a sejtnövekedéssel arányos. Ezért számítással kívántam megállapítani, hogy pontosan hol található a baktérium exponenciális növekedésének szakasza (a mikroorganizmus itt szaporodik a legjobban, s így itt a legnagyobb a hidrogéntermelési rátája). Ezen felül szintén meg akartam határozni, mi az a minimális tartózkodási idő, amelyet biztosítani kell ahhoz, hogy egy szabadsejtes, folyamatos rendszerben megelőzzük a biomassza kimosódását. A kinetikai konstansok meghatározása a 3.8. fejezetben ismertetettek szerint történt. Ennek során elsőként elvégeztem a baktérium szaporítását a formiátot különböző koncentrációban (22 mM-110 mM) tartalmazó LB (10 g/L tripton, 5 g/L élesztőkivonat, 3.33 g/L nátrium-klorid, pH= 6.5, T= 37 oC, 220 rpm) tápoldatokon, s a fermentléből időközönként mintát véve mértem annak optikai sűrűségét (OD620). A mérések során kapott adatokat az 5.3.1. ábra és az 5.3.1. táblázat foglalja össze. A 88 mM formiát koncentráció esetében feltehetően mérési hiba történt, így a kiértékelésnél nem vettem figyelembe.
66
0.9
Sejtkoncentráció (g sejt sz.a/L)
0.75 0.6 0.45 0.3
22 mM 44 mM
0.15
66 mM
110 mM 0 0
5
10
15
20
25
Idő (h) 5.3.1. ábra – A különböző formiát koncentrációk mellett kapott szaporodási görbék 5.3.1. táblázat – dx/dt vs. x adatok a különböző kiindulási formiát koncentrációk mellett Idő (h) 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 21
22 mM formiát x (g/L) dx/dt 0.05 0.08 0.03 0.16 0.08 0.22 0.06 0.3 0.08 0.4 0.1 0.53 0.13 0.57 0.04 0.61 0.04 0.65 0.04 0.79 0.14
44 mM formiát 66 mM formiát x (g/L) dx/dt x (g/L) dx/dt 0.05 0.05 0.08 0.03 0.06 0.01 0.15 0.07 0.16 0.1 0.19 0.04 0.19 0.03 0.26 0.07 0.25 0.06 0.35 0.09 0.33 0.08 0.48 0.13 0.45 0.12 0.57 0.09 0.53 0.08 0.65 0.08 0.61 0.08 0.68 0.03 0.66 0.05 0.8 0.12 0.82 0.16
110 mM formiát x (g/L) dx/dt 0.05 0.07 0.02 0.09 0.02 0.12 0.03 0.17 0.05 0.25 0.08 0.37 0.12 0.43 0.06 0.53 0.1 0.6 0.07 0.84 0.24
A 3.8. fejezetben leírtak szerint, ha a sejtkoncentráció függvényében ábrázoljuk annak időbeli változását (dx/dt vs. x), akkor a kapott összefüggés iránytangense (ahol az összetartozó adatok között lineáris összefüggés van) μ-vel egyenlő [Nyeste, 1997; Atkinson, 1992; Bailey, 1986]. Az 5.3.1. táblázatban kiemelve láthatóak azok az adatok, melyekből az egyes szaporodási sebességek meghatározása történt. 67
Ezek alapján elmondható, hogy az exponenciális növekedés szakasza 5-7 óra között található. A különböző formiát koncentrációkhoz tartozó μ értékek megállapításához használt (dx/dt vs. x) összefüggések az 5.3.2. ábrán láthatóak. Az egyenesek meredekségei megfeleltethetők az egyes μ értékeknek.
5.3.2. ábra – A μ értékek meghatározása A kinetikai paraméterek (KS, μmax) meghatározásához a Lineweaver-Burk-féle ábrázolást használtam. Az ehhez szükséges adatokat az 5.3.2. táblázat tartalmazza, s a μ-1 vs. S-1 összefüggést az 5.3.3. ábra szemlélteti. 5.3.2. táblázat – A dupla reciprok ábrázoláshoz szükséges adatok Kísérleti beállítás 22 mM formiát 44 mM formiát 66 mM formiát 110 mM formiát
S (mM) 22 44 66 110
1/S (mM-1) 0.045 0.023 0.015 0.009
68
μ (h-1) 0.22 0.28 0.31 0.35
1/μ (h) 4.59 3.64 3.21 2.87
μ-1 (h)
5 4
y = 43.67x + 2.577 R² = 0.998
3 2 1
-0.08
-0.06
-0.04
-0.02
0 0.00
0.02
0.04
0.06
S-1 (mM-1) 5.3.3. ábra – A kettős reciprok ábrázolás μmax és KS meghatározásához A pontokra illeszkedő egyenes tengelymetszeteiből – a 3.8.3. ábra szerint – meghatároztam a féltelítési állandó és a maximális szaporodási sebesség értékeit: KS = 18 mM és μmax = 0.39 h-1, melynek alapján elmondható, hogy μmax-1 = 2.6 h az a minimális tartózkodási idő, amely folyamatos üzem esetén szüksége a biomassza kimosódásának megelőzésére. Ezt megerősíti az 5.3.1. ábra is, ahol látható, hogy a sejtkoncentráció csupán a fermentáció 2-3. óráját követően kezdett el emelkedni, vagyis addig a biomassza szaporulat elhanyagolható volt (lag fázis). A KS és μmax értékeket felhasználásával az E. coli (XL1BLUE)-ra vonatkozó Monod kinetikát az 5.3.4. ábra mutatja be. A féltelítési állandó relatíve alacsony értéke az E. coli (XL1-BLUE) jó formiát hasznosítási képességét mutatja [Turcot, 2008].
5.3.4. ábra – Monod kinetika az E.coli (XL1-BLUE)-ra vonatkozóan 69
5.4. Biohidrogén fermentáció folyamatos rendszerben Az eddigi eredmények alapján elmondható, az E. coli (XL1-BLUE) anaerob körülmények között, szakaszos bioreaktorban hidrogén előállításra képes. A szakaszos rendszerben végzett méréseket és a baktérium növekedésének kinetikai vizsgálatát követően, a célom az volt, hogy a mikroba felhasználásával tanulmányozzam a hidrogén fermentáció megvalósíthatóságát folyamatos körülmények között. A vonatkozó kísérleteket folyamatos, tökéletesen kevert reaktorban (CSTR – Continuously Stirred Tank Reactor) végeztem, ahol is a folyamatos rendszerek egyik legfontosabb paraméterének, a hidraulikus tartózkodási időnek (HRT) a hidrogénképződés folyamatára gyakorolt hatásának vizsgálatát és optimális értékének meghatározását tűztem ki célul. Ismereteim szerint az általam alkalmazni kívánt stratégia, vagyis a hidrogéntermelés számára megfelelő HRT-nek a mikroba növekedési kinetikája alapján történő kiválasztása újszerű, eddig még nem alkalmazott módszer. A szuszpendált, szabadsejtes CSTR rendszerben a hidraulikus tartózkodási idő, valamint a biomassza tartózkodási idő megegyezik, vagyis a kettő nem függetleníthető egymástól, következésképpen olyan tartózkodási időt célszerű alkalmazni, mely lehetővé teszi a sejtek biokatalitikus aktivitásának minél nagyobb mértékű fenntartását. Az előző fejezetekben végzett mérések eredményei megmutatták, hogy egyrészt a gáztermelés és a sejtszaporodás egymással szorosan összefügg (5.2.4. ábra), másrészt kiderült az is, hogy a legrövidebb generációs idő, vagyis az exponenciális szaporodás szakasza 5-7 óra között található. Továbbá irányadó érték az is, hogy 2.6 órás minimális tartózkodási időt kell biztosítani ahhoz, hogy a sejtek fermentorból való kimosódása elkerülhető legyen. A szakirodalomban fellelhető adatok szerint az E. coli-ban található hidrogenázoknak különböző indukciós fázisai vannak [Sawers, 1994]. Ezen felül Kim és munkatársai vizsgálatokat végeztek az E. coli-hoz nagyon hasonló hidrogenáz enzimrendszerrel rendelkező fakultatív anaerob baktériumon [Kim, 2008]. Ennek során megállapították, hogy a hidrogéntermelésért felelős enzimek aktivitása a sejtszaporítás kezdetétől gyorsan növekszik, s az exponenciális növekedés szakaszában maximumot ér el, míg ezzel ellentétben a hidrogénoxidációért felelős enzimek aktivitása időben lassabban növekszik, s maximális értéke az exponenciális növekedési szakaszon túl, a stacioner szaporodási fázisban mutatkozik. Az eddigieket összegezve következik, hogy a folyamatos üzemvitel során olyan hígítási sebességet ajánlatos beállítani, mely nem teszi lehetővé a rendszerben lévő sejtek számára az exponenciális szakaszon túl történő növekedést, tehát a hidrogéntermelő enzimek 70
megfelelő aktivitásának fenntartásához a kinetikai vizsgálatok eredményei alapján a hidraulikus tartózkodási idő becsült, optimális értéke 7 óra. Ennek vizsgálatára kísérleteket végeztem különböző hidraulikus tartózkodási idők (5 h, 7 h, 9 h) beállítása mellett, melyek közül a kinetikai vizsgálatok alapján az első kettő az exponenciális szaporodási szakaszhoz, míg az utóbbi pedig a sejtnövekedési görbe stacioner fázisához tartozik. A fermentáció során mért eredményeket, a kapott adatokat az 5.4.1.-5.4.3. ábra reprezentálja. Az 5.4.2. ábra a folyamatos rendszerben, különböző hidraulikus tartózkodási idők mellett végzett hidrogén fermentációk során mért hidrogénképződési sebességek időbeli változását mutatja. Az ábra alapján a folyamat 3 főbb szakaszra bontható: 1. szakasz (0-8 óra): szakaszos üzemmód, melynek célja az, hogy a mikroorganizmusokat a megfelelő mértékben felszaporítsuk a folyamatos üzemvitelre való átállás előtt. 2. szakasz (9-15 óra): a 8. óra végén történik a bioreaktor folyamatos üzemmódba való kapcsolása, vagyis megkezdődik az adott tartózkodási időnek megfelelő mértékű friss tápoldat beadagolása és az azzal ekvivalens mennyiségű elfolyó elvétele. Ahogy az ábrán látható, ebben az időszakban valamiféle tranziens állapot valósul meg, hiszen elsőként 912 óra között az alkalmazott HRT értékétől függetlenül meredek csökkenés, majd a 13-15 óra között meredek növekedés látható. Ez valószínűleg annak tudható be, hogy az E. coli baktériumnak adaptálódni kellett a megváltozott körülményekhez. 3.
szakasz (16. órától): minden HRT esetében erősen csökken a hidrogénképződés sebessége. Ennek vizsgálatára vonatkozó eredményeimet a későbbiekben, az 5.4.1. táblázatot követően részletezem.
71
50 5h
7h
9h
H2 konc. %(V/V)
40
30
20
10
0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Idő (h) 5.4.1. ábra – A gázfázisbeli hidrogénkoncentrációk alakulása az egyes HRT-k esetében
70
H2 képződési sebesség (mL/h)
5h
7h
9h
60 50 40
30 20 10 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
Idő (h) 5.4.2. ábra – A mért hidrogénképződési sebességek az egyes HRT-k esetében
72
45
1200
Kumulatív H2 termelés (mL)
5h
7h
9h
1000 800 600
400 200 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Idő (h) 5.4.3. ábra – Kumulatív hidrogénképződés az egyes HRT-k esetében Az első 8 óra adatainak, vagyis a mikroorganizmus kellő mértékű felszaporítása, a bioreaktor szakaszos üzeme során kapott adatok kiértékeléséből látható, hogy az egyes lefutások jó egyezést mutatnak, amely a mérés megfelelő reprodukálhatóságát mutatja. A folyamatos biohidrogén termelés hatékonyságának megítélése, a különböző üzemállapotok során kapott eredmények összehasonlítása érdekében számítottam mind a fajlagos képződési gázáramok, mind pedig a hozamok értékeit, melyek az 5.4.1. táblázatban láthatók. 5.4.1. táblázat – A HRT biohidrogén képződésre gyakorolt hatásának értékelése
szakaszos folyamatos
Működési idő (h) Ciklusok száma folyamatos üzemmódban Keletkezett hidrogén (mmol) Összesen hozzáadott formiát (mmol) Hozam (mmol H2 mmol-1 formiát) -1 -1
Fajlagos képződési gázáram (mmol H2 L d )
73
5 8 21 4.2 27 156
HRT (h) 7 8 29 4.15 40 155
9 8 37 4.1 36 153
0.17
0.26
0.23
4.3
5.1
3.8
A táblázatból kiolvasható, hogy a legmagasabb értékeket mindkét paraméter esetében HRT= 7 óra esetében sikerült elérni, ekkor a fajlagos képződési gázáram 5.1 mmol H2 L-1d-1, míg a hozam 0.26 mmol H2/mmol formiát voltak. Az eredmények alapján elmondható, hogy 7 órás hidraulikus tartózkodási idő beállítása optimális a hidrogéntermelés szempontjából. Ez alátámasztja azt a hipotézist, mely szerint az exponenciális szaporodási szakasz végére vonatkozó időtartam tartózkodási időként, folyamatos rendszerben való alkalmazása növeli a hidrogéntermelés hatékonyságát. Mindamellett, hogy HRT=7 óra esetén sikerült a legjobb eredményeket elérni, a folyamatos rendszer hatékonysága alulmúlta a szakaszos rendszerben mért gázképződési és hozam értékeket, s megkíséreltem kideríteni, mi állhat ennek hátterében. Elsőként optikai sűrűség mérésével vizsgáltam a fermentlében a baktérium populációt, s azt tapasztaltam, hogy az idő múlásával a mért értékek nem a vártak szerint alakultak, vagyis nem állt be egy kvázi stacioner állapot, ezzel szemben a mért optikai denzitás értéke az idővel folyamatosan nőtt. Ebből arra következtettem, hogy talán autolízis történhet, vagyis a sejtek elhalása egyre nagyobb mértéket ölt. A sejtek elhalásának további vizsgálatára a folyadékfázisból
időközönként
mintát véve fluoreszcens
mikroszkópos
felvételeket
készítettem, amellyel az élő, vagyis aktív (kék) és az elhalt, inaktív (piros) sejtek szín alapján elkülöníthetők (5.4.4-5.4.7. ábra).
5.4.4. ábra – 15 h (HRT= 7h)
5.4.5. ábra – 20 h (HRT=7 h)
74
5.4.6. ábra – 25 h (HRT=7 h)
5.4.7. ábra – 30 h (HRT=7 h)
A felvételekről az látszik, hogy az idő előre haladtával egyre nagyobb számban jelentek meg a pirossal látható elhalt sejtek, következésként elmondható, hogy a hidrogén termelés visszaesésének oka feltehetően a sejtek egyre jelentősebb pusztulása volt. Azt, hogy a sejteket miért nem sikerült megfelelően életben tartani, egyenlőre még nem sikerült kideríteni.
5.5. Az Escherichia coli (XL1-BLUE) és (DJT 135) baktériumtörzsek hidrogéntermelésének összehasonlítása Ahogy az irodalmi részben ismertettem, a biohidrogén sötét fermentációs eljárással való előállítása attraktív lehetőség, mindemellett az ilyen rendszerek többségében csupán alacsony hozamok (mol H2/mol szubsztrát) elérését teszik lehetővé. Következésképpen ahhoz, hogy ezek a megoldások ipari és gazdasági szempontokat figyelembe véve idővel versenyképesek lehessenek, a szubsztrát konverziós hatékonyságot célszerű növelni. Erre megfelelő stratégia lehet a metabolikus mérnökség adta lehetőségek kihasználásával megnövelt hidrogéntermelő potenciállal rendelkező mutáns törzsek létrehozása, s az ily módon
megnövelt
körülményeinek
hidrogéntermelő
meghatározásával.
képesség Az
ilyen
realizálása
a
fermentáció
megközelítésben
rejlő
optimális lehetőségek
demonstrálására kísérlettervezést alkalmazva összehasonlító vizsgálatokat végeztem a vadtípusú E. coli (XL1-BLUE), valamint a genetikailag módosított E. coli (DJT 135) törzs hidrogéntermelésével kapcsolatosan. Mindkét törzsre vonatkozóan Statistica 8 segítségével egy 32 típusú teljes kísérleti tervet készítettem (5.5.2. táblázat), amelyben a pH és a formiát koncentráció hatását a hozam értékek tükrében vizsgáltam a manometrikus gázmérő
75
készülékben. Ezzel a típusú kísérleti tervvel lineáris, négyzetes kapcsolatok, valamint az egyes változük között esetlegesen fennálló kölcsönhatások is vizsgálhatók. Az illesztett modell: 5.5.1. egyenlet: y = b11X12 + b22X22 + b1X1 + b2X2 + b12 X1X2 + Y0 ahol y a válaszváltozó (H2 hozam); X12 és X22 a független változók (pH, formiát koncentráció) négyzetes hatásai, X1 és X2 a független változók lineáris hatásai, míg X1X2 a független változók kölcsönhatása; b11 és b22 négyzetes, b1 és b2 lineáris, míg b12 kölcsönhatás együttható; Y0: ordináta metszet. Cél volt az is, hogy a formiát koncentráció optimumára vonatkozóan megerősítő kísérleteket végezzek, valamint hogy információt kapjak a reakció valódi pH optimumára vonatkozóan. 5.5.1. táblázat – A változók és kódolásuk Változók pH Formiát konc. (mM)
-1 6 0
Kódolt érték 0 6.5 20
1 7 40
Az elvégzett kísérleti tervet a számolt hozam értékekkel együtt az 5.5.2. táblázat tartalmazza. Ahogy látható, mindkét baktérium törzs esetében összesen 12 kísérlet végeztem, melyek tartalmaztak 3-3 középpontbeli ismétlést. A keletkezett hidrogén mennyiségét (mmol) a mért hidrogénnyomásokból az ideális gáztörvény alapján számoltam. A fermentációk időbeli lefutását az 5.5.1-5.5.2. ábrák reprezentálják. 5.5.2. táblázat – A kísérleti terv az eredményül kapott hozam értékekkel Kísérleti beállítás
pH
Formiát konc. (mM)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
6 6 6 6.5 6.5 6.5 7 7 7 6.5 6.5 6.5
0 20 40 0 20 40 0 20 40 20 20 20
76
Hozam (mol H2/mol formiát) E. coli (XL1-BLUE) E. coli (DJT 135) 0 0 0.35 0.53 0.34 0.5 0 0 0.39 0.59 0.36 0.54 0 0 0.34 0.51 0.3 0.48 0.38 0.58 0.37 0.58 0.37 0.59
400
H2 nyomás (hPa)
300 2 3
5
200
6 8 9
100
10 11 12
0 0
300
600
900
1200
1500
Idő (min) 5.5.2. ábra – Hidrogénképződési lefutások az E. coli (XL1-BLUE)-ra vonatkozóan
H2 nyomás (hPa)
600
2
400
3 5 6 8
200
9 10 11 12
0 0
300
600
900
1200
1500
Idő (min) 5.5.3. ábra – Hidrogénképződési lefutások az E. coli (DJT 135)-ra vonatkozóan
77
Az elvégzett statisztikai kiértékelés (ANOVA) alapján az illesztett modell mindkét esetben megbízhatóan írja le a hidrogénképződést (XL1-BLUE: R2 = 0.996; DJT 135: R2 = 0.994). 5.5.3. táblázat – Az egyes faktorok hatásai a hidrogénképződésre Szignifikancia (α) E. coli (XL1-BLUE) E. coli (DJT 135) Faktor pH Formiát konc. pH x Formiát konc.
0.02582 <0.0001 0.1622
0.018 <0.0001 0.6065
Ahogy az 5.5.3. táblázatban látható, mind a pH, mind pedig a formiát koncentráció szignifikánsan (α<0.05) befolyásolta a hidrogénképződés folyamatát. Ezen felül az is látszik, hogy a szubsztrát koncentráció hatása nagyobbnak bizonyult a pH hatásánál. Az 5.5.3. ábra példaként az E. coli (XL1-BLUE)-ra vonatkozóan szemlélteti a mért és az illesztett modell által számított hozam értékek közötti korrelációt, melyek között szoros egyezés mutatkozik, amely az illesztett modell megbízhatóságát tükrözi.
5.5.4. ábra – A mért és az illeszett modell által számolt értékek közötti korreláció az E. coli (XL1-BLUE)-ra vonatkozóan
78
Az egyes E. coli törzsekre vonatkozó, a pH és a formiát koncentráció hozamra gyakorolt hatását az 5.5.4. és 5.5.5. ábrák reprezentálják. Ahogy az megfigyelhető, mindkét felületnek jól kivehető szélsőértéke van, vagyis a maximális hozam a faktorok vizsgálati tartományán belül érhető el.
5.5.5. ábra – A pH és formiát koncentráció hatása a hozamra E.coli (XL1-BLUE) esetében Ahogy az 5.5.4. és 5.5.5. ábrák alapján megállapítható, az elérhető hozam értéke mindkét törzs esetében növekedett, az E. coli (XL1-BLUE) esetében maximum 29 mM, míg az E. coli (DJT 135) esetében 28 mM formiát koncentrációnál adódott. Ezen értékek felett mindkét esetben erős csökkenés mutatkozott, mely feltehetően a szubsztrát inhibíció következménye.
79
5.5.6. ábra – A pH és formiát koncentráció hatása a hozamra E.coli (DJT 135) esetében Ahogy az 5.5.2. táblázatban megfigyelhető, zérus kiindulási formiát koncentráció alkalmazásakor egyik baktérium esetében sem tapasztaltam hidrogénfejlődést.
Ez
alátámasztja a már ismertetett irodalmi adatokat, miszerint E. coli esetében a fehérjékből nem keletkezik hidrogén. A pH optimum tekintetében kapott optimum értékek jó egyezést mutatnak a korábban a szakirodalomban közölt s a kísérleti munka megelőző részéhez adaptált pH=6.5 értékkel. Az egyes törzsekre vonatkozó optimális pH és formiát koncentráció értékek, valamint a hozzájuk tartozó hozam értékek az 5.5.4. táblázatban láthatók. 5.5.4. táblázat – Az optimális fermentációs körülmények E. coli (XL1-Blue) E. coli (DJT 135)
pH 6.4 6.5
Formiát konc. (mM) 29 28
Hozam (mol H2/mol formiát) 0.42 0.63
Az 5.5.4 táblázatból kiolvasható, hogy a metabolikus mérnökséggel létrehozott E. coli (DJT 135) törzs optimális feltételek mellett az E. coli (XL1-BLUE)-hoz képest mintegy 50%kal magasabb hozam elérését tette lehetővé.
80
Ezen felül, az E. coli (XL1-BLUE)-ra kapott optimális kondíciók és a hozzátartozó maximális hozam jó egyezést mutat a fermentáció korábban meghatározott optimális viszonyaival, tehát megerősíti azokat (formiát konc.: 30 mM, pH=6.5, hozam: 0.41 mol H2/mol formiát). A kapott eredmények rámutattak arra, hogy a hidrogéntermelő baktériumok speciális módosítása jelentős mértékben képes a hidrogén előállítás hatékonyságának növelésére, azonban a potenciálok maximális realizálásához mindenképpen szükséges a fermentációs paraméterek optimalizálása, vagyis a két módszer kombinálása lehetőséget adhat a kellően hatékony hidrogéntermelő bioreaktorok kialakításához. Az 5.5.5. táblázatban a jelen dolgozat, valamint más, szakirodalomban található publikációk eredményeinek az összehasonlítása látható. 5.5.5. táblázat – Különböző Enterobacteriaceae baktériumokkal, formiát szubsztráton megvalósított biohidrogén fermentációk eredményei H2 FKG
Mikroorganizmus Escherichia coli (XL1-BLUE)
426 mL L d
Enterobacter asburiae (SNU-1)
NM
*Escherichia coli (DJT 135)
NM
*Escherichia coli (SH5) *Escherichia coli (BW25113)
-1 -1
-1 -1
2400 mL L h NM
szeparációs
Referencia
0.42 mol H2/mol formiát szabadsejtes, szakaszos 0.43 mol H2/mol formiát szabadsejtes, szakaszos
jelen dolgozat
0.63 mol H2/mol formiát szabadsejtes, szakaszos
jelen dolgozat
Shin, 2007
NM immobilizált, rátáplálásos Seol, 2011 1.2 mol H2/mol formiát szabadsejtes, szakaszos Maeda, 2007
*Escherichia coli (SR13) 300 L L-1 d-1 *: metabolikusan áttervezett törzs NM: Nincs Megadva H2 FKG: H2 Fajlagos Képződési Gázáram
5.6. Gáz
Megjegyzés
Hozam
NM
kísérletek
szabadsejtes, folyamatos Yoshida, 2005
az
ME1
membrán
modul
használatával Az ME1 membrán modul vizsgálata során hidrogén, nitrogén, szén-dioxid gázokra vonatkozóan végeztem kísérleteket, s a mért (idő, feszültség), valamint ismert (gáztartály térfogata, hőmérséklet, membrán felülete) paraméterek alapján számítottam a következőket: tartályban uralkodó nyomás, a membránon átpermeált gáz mennyisége, amelyből számíthatóvá vált a permeabilitás (a membrán egységnyi felületén egységnyi idő alatt áthaladó gáz mennyisége a nyomásváltozás adatok alapján) GPU-ban megadva. A gáztartályban uralkodó nyomásviszonyok, valamint a permeációs gázáramok időbeli változását az 5.6.1. ábra demonstrálja. 81
20
0.235
Permeabilitás (GPU)
0.225 12 0.220 8 0.215 4
0.210
0
Betép nyomás (MPa)
0.230
16
CO2 permeabilitás H2 permeabilitás N2 permeabilitás CO2 nyomás H2 nyomás N2 nyomás
0.205 0
20
40
60
80
100
120
Idő (min) 5.6.1. ábra – Az ME1 membrán modullal mért gázpermeációs adatok, T= 40 oC Ahogy az 5.6.1. ábra mutatja, a vizsgált gázok közül a hidrogén nyomása csökkent a leggyorsabban a gáztartályban, vagyis annak permeációja volt a legnagyobb mértékű. A széndioxid és nitrogén esetén a nyomás csökkenése, tehát a membránon keresztüli transzport rendre lassabb volt, így a permeációs gázáramok értékei is kisebbnek adódtak. A betáp (tartály) nyomásokat 0.225-0.235 MPa közötti tartományban állítottam be, s megállapítható volt, hogy még ilyen relatíve alacsony értékek mellett is jó fluxus értékeket sikerült elérni, vagyis a szeparáció során nem feltétlenül szükséges magas nyomások biztosítása. Ez mindenképpen előnyös a biohidrogénes rendszereknél, hiszen valós körülmények között, ha lehet, el kell kerülni a közel atmoszférikus nyomáson keletkező gáz komprimálását, ugyanis ez a megtermelt hidrogénből kinyerhető energia jelentős hányadát felemészti. Az egyes gázokra vonatkozó elméleti szelektivitást az adott komponensekre számított permeabilitások kvázi stacioner körülmények között kialakult értékének hányadosaként adtam meg. A kapott permeabilitás és elméleti szelektivitás adatokat az 5.6.1. és 5.6.2. táblázat tartalmazza.
82
5.6.1. táblázat – Az egyes gázok permeabilitása (T=40 oC)
Permeabilitás [GPU]
Hidrogén
Szén-dioxid
Nitrogén
16.1
3.55
0.76
5.6.2. táblázat – Az elméleti szelektivitási értékek (T=40 oC) Hidrogén
Szén-dioxid
Nitrogén
Hidrogén
1
4.53
21.2
Szén-dioxid
0.22
1
4.67
Nitrogén
0.05
0.22
1
A mérések alapján megállapítható, hogy a tesztelt poliimid anyagú twentei membrán előnyös permeabilitás és szelektivitás értékekkel rendelkezik. A hidrogén-nitrogén szeparációjára kapott szelektivitási érték kiemelkedően magas, a hidrogén-szén-dioxid szelektivitás bár kisebb, de a membrán alkalmas lehet a hidrogén szeparációjára. Mivel azonban az ME1 membrán modul kialakítása nem tette lehetővé kevert gázos kísérletek elvégzését (retentátum elvétel technikai okokból nem volt megvalósítható), ezért a továbbiakban egy szintén poliimid anyagú UBE membránnal végeztem kísérleteket a GSMS100 membrántesztelő berendezés használatával.
5.7. Gáz szeparációs kísérletek az UBE „NM-B01A” membrán modullal a GSMS-100 membrántesztelő készülékben Egykomponensű, tiszta gázokkal végzett kísérletek Az UBE „NM-B01A” poliimid membrán tesztelése tiszta gázokkal kezdődött, melynek során hidrogénnel és szén-dioxiddal végeztem permeációs kísérleteket a GSMS-100 használatával. Tudomásom szerint ezt, az általam használt poliimid anyagú, ipari UBE membránt hidrogén szeparációs célokra még sehol sem vizsgálták, alkalmazták.
A
kísérletekben elsőként a hőmérséklet permeabilitásra és elméleti szelektivitásra gyakorolt hatását vizsgáltam. Ennek keretében széles hőmérséklettartományban, 21-65 oC-ig teszteltem a modult.
83
A mért permeációs áramok – 0.5 MPa betáp nyomásra (pF) számítva – a hőmérséklet függvényében az 5.7.1. ábrán, valamint a számolt elméleti szelektivitásokkal együtt az 5.7.1.
160
50
hidrogén szén-dioxid
40
120
30 80 20 40
10
0
0 0
10
20
30
40
50
60
CO2 permeáció (L (STP) min-1)
H2 permeáció (L (STP) min-1)
táblázatban láthatók.
70
Hőmérséklet (oC) 5.7.1. ábra – A hőmérséklet hatása a permeációs áramokra, pF= 0.5 MPa
5.7.1. táblázat – Hőmérséklet hatása az elméleti szelektivitásra, pF= 0.5 MPa o
Hőmérséklet ( C) 21 30 37 45 55 65
-1
Permeációs áram (L (STP) min ) H2 CO2 38.5 20 53.0 24.5 65.5 27.7 78.9 31.8 96 36.4 115.4 41.2
Elméleti szelektivitás 1.93 2.17 2.36 2.48 2.64 2.8
Ahogy az megfigyelhető, a hőmérséklet emelésének mind a permeációs áramokra, mind pedig az elméleti szeparációs faktorra pozitív hatása volt, vagyis magasabb hőmérsékleten elméletileg nagyobb szelektivitás érhető el. Ez valószínűleg annak tulajdonítható, hogy a hőmérséklet emelésének különböző hatásai vannak a szeparációt meghatározó oldódási-diffúziós folyamatokra: az oldhatóság alapvetően csökken, míg a diffúzió nő a magasabb hőmérsékleteken. 84
A H2-nek és CO2-nak a membrán anyagában való oldhatósága és diffúziója szempontjából jelentősen eltérő tulajdonságai vannak [Shao, 2009]. A CO2 jellemzően jóval nagyobb oldhatósággal rendelkezik, míg a H2 nagyobb diffúziós sebességgel bír, mivel lényegesen kisebb molekula. Továbbá, ahogy az irodalmi részben ismertettem, a H2-szelektív membránanyagok – vagyis amelyek esetében a hidrogén a permeátumban dúsul (pl. a poliimid) – fejlesztésében a cél a diffúziós tulajdonságok közötti különbségek érvényesítése (DH2/DCO2 ), míg az oldhatóságból adódó eltérő viselkedés hatásának minimalizálására (SCO2/SH2 ) törekednek, tehát az ilyen membránok alkalmazásánál jellemzően a diffúzió a szelektivitást meghatározó tényező. Az eddig leírtak alapján tehát elmondható, hogy a széndioxid permeációs sebességének hőmérséklettel való emelkedése a hidrogénénél kisebb mértékű, vagyis a H2/CO2 elméleti szelektivitás a hőmérséklet növelésével nő. Kétkomponensű, H2/CO2 gázkeverékkel végzett kísérletek A tiszta gázokkal végzett vizsgálatok eredményei lényegesen eltérhetnek a valós, kevert gázos kísérletek során elérhető szeparációs jellemzőktől, mivel a gázelegyet alkotó gázkomponensek
nagymértékben
befolyásolhatják
egymás
oldódási
és
diffúziós
tulajdonságait s így a membránon keresztüli transzportot, vagyis a pusztán ezen eredményekre alapozva nem lehet az elválasztás hatékonyságát megítélni, ezért szükség van a membrán kevert gázos tesztelésére is. Mindazonáltal a tiszta gázos kísérletek eredményei nagymértékben segíthetnek annak eldöntésében, hogy az adott membrán egyáltalán alkalmase az adott feladat megoldására vagy nem, érdemes-e tovább vizsgálni vagy nem, valamint összehasonlítási alapul szolgálhatnak a gázelegyekkel mért valós értékekhez. Az eddig felsoroltak miatt az UBE membrán tesztelését kevert gázzal is elvégeztem. Ennek összetétele 55 %(V/V) hidrogén és 45 %(V/V) CO2 volt, amely nagyjából megfelel a valós biohidrogén fermentációk során keletkező gázelegy összetételének. Az eddigi eredmények megmutatták, hogy az UBE modul alkalmazásával magasabb hőmérsékleten a H2/CO2 szétválasztása hatékonyabban végezhető el. Azonban tekintettel arra, hogy a hidrogén fermentációk nagy része – köztük az E. coli-val megvalósított is – mezofil hőmérséklet tartományban mennek végbe, a gázeleggyel történt méréseket 37 oC-on hajtottam végre. Ebben a kísérletsorozatban a retentátum elvételi arány, vagyis tulajdonképpen a retentátum (QR) és betáp (QF) anyagáramok arányának (QR/QF) valós szelektivitásra gyakorolt hatását tanulmányoztam, mely paramétert tudomásom szerint a hidrogén membrános elválasztásával kapcsolatos szakirodalomban megjelent publikációk jellemzően nem 85
vizsgálták. A QR/QF hányados értéke 0 és 1 között változhat: ha értéke 0, az azt jelenti, hogy nincs retentátum elvétel, vagyis a betáplált gáz teljes mennyisége a permeátum frakcióba kerül. Ha értéke 1, akkor pedig nincs permeátum elvétel, vagyis a betáp teljes egészében a retentátumba kerül. Nyilvánvaló, hogy egyik szélsőséges esetben sem lép fel szeparáció, hiszen vagy permeátum vagy retentátum áram nincsen, azonban ha 0
0.110 0.179 0.180 0.152 0.147 0.146 0.144
Q (L (STP) min-1) Betáp Permeátum Retentátum 4 10.6 16.8 18 21.7 25.5 29.6
3.7 9.3 10.5 9 7.7 7.1 5.5
QR/QF 0 0.07 0.12 0.37 0.5 0.64 0.72 0.82
0.3 1.3 6.3 9 14 18.4 24.1
H2 %(V/V) CO2 %(V/V) Valós szelektivitás (α) Permeátum Retentátum Permeátum Retentátum 55 45 1 62.02 6.11 37.98 93.89 1.34 62.45 31.44 37.55 68.56 1.36 64.75 47.68 35.25 52.32 1.5 65.1 50.42 34.9 49.58 1.53 65.5 52.39 34.5 47.61 1.55 65.65 53.16 34.35 46.84 1.56 64.8 54 35.2 46 1.51
Valós szelektivitás
67
64
1.4
61
1.2 Szelektivitás
58
Hiidrogén konc. %(V/V)
1
Permeátum H2 tartalma %(V/V)
1.6
55 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
QR/QF arány 5.7.2. ábra – A QR/QF hatása a szelektivitásra Ahogy az eredmények alapján látható, a retentátum elvételi arány változtatása jelentősen befolyásolta a hidrogénben dúsabb permeátum összetételét, vagyis a valós szelektivitást. Kivehető az is, hogy a QR/QF arány növelésével a szeparáció hatékonysága is növelhető. 86
A mérési adatok szerint a szeparációs faktor maximális értékét QR/QF=0.72 mellett sikerült elérni, a további növelés rontotta az elválasztás hatékonyságát. Továbbá az is elmondható, hogy a membrán egy széles dinamikus tartománnyal rendelkezik, hiszen 0.4
87
6.
Összefoglalás Doktori munkám során az E. coli baktériumokkal megvalósított sötét fermentációs
biohidrogén
előállítást
tanulmányoztam,
valamint
a
biohidrogén
végfelhasználása
szempontjából fontos kérdést, annak membrán szeparációs koncentrálását vizsgáltam. Elsőként – az E. coli hidrogén fermentációval összefüggő anyagcsere folyamatai, s szakirodalmi adatok alapján kiválasztott – formiát szubsztrát hidrogén előállításra gyakorolt hatásának vizsgálatát végeztem el a manometrikus gázmérő készülékben, melynek eredményei azt mutatták, hogy a formiát mint szénforrás fermentléhez való adagolása elősegíti a gázképződést. Ezt követően E. coli (XL1-BLUE) baktérium használatával, elsőként szakaszos bioreaktorban vizsgáltam a fermentációs paraméterek (formiát-, élesztőkivonat-, tripton-, nátrium-klorid- és a sejtkoncentráció, valamint a keverési sebesség) hidrogéntermelésre gyakorolt hatásait kísérlettervezéssel az elérhető fajlagos képződési gázáram és hozam növelése céljából. Ennek során megállapítottam, hogy a biohidrogén előállítását a formiát, mint kulcs-faktor koncentrációja határozza meg, majd egy következő kísérleti sorozatban meghatároztam annak optimális értékét, s összességében a rendszer műveleti paramétereinek a hidrogén termelés szempontjából optimális beállításait. Az ezt követő mérések során az E. coli (XL1-BLUE) szaporodási kinetikáját tanulmányoztam, melynek során meghatároztam a fermentációra jellemző kinetikai konstansok (maximális szaporodási sebesség, szubsztrát féltelítési állandó), valamint a mikroorganizmus exponenciális szaporodási szakasza időtartamának értékeit. A szakaszos rendszerben végzett fermentációk, valamint a mikroba növekedési kinetikájának vizsgálatával nyert adatok alapján tanulmányoztam a biohidrogén folyamatos bioreaktor rendszerben, E. coli (XL1-BLUE)-val történő előállítását, melyben a hidraulikus tartózkodási idő hatását vizsgáltam, s meghatároztam annak a hidrogén fajlagos képződési gázárama és hozam szempontjából optimális értékét. A folyamatos rendszerben végzett vizsgálatok után a metabolikus mérnökség és a folyamatoptimálás adta, a hidrogén fermentáció hatékonyságának növelésére vonatkozó lehetőségeket kutattam, melynek során az eddigiekben is alkalmazott E. coli (XL1-BLUE) és a genetikailag módosított E. coli (DJT 135) törzsek hidrogéntermelő képességét hasonlítottam össze, kísérlettervezéses alapon a manometrikus gázmérő készülékben.
88
A kapott eredmények azt mutatták, hogy az utóbbi törzs – az elvégzett metabolikus módosításoknak köszönhetően – 50%-kal nagyobb hidrogén hozam elérését teszi lehetővé, azonban a benne rejlő potenciálok realizálása megkívánja a fermentációs paraméterek (pH, formiát
koncentráció)
megfelelő
megválasztását.
Ezen
túlmenően
az
eredmények
megerősítésül szolgáltak az E. coli (XL1-BLUE)-val korábban végzett kísérletek során, a formiát koncentráció optimumára vonatkozó érték tekintetében is. A fermentációval kapcsolatos munkát követően a hidrogén membrános szeparációjára fókuszáltam. Elsőként elvégeztem egy poliimid anyagú membrán (ME1) hidrogén szeparációs célra vonatkozó alkalmazhatósági vizsgálatát, s a tiszta gázos (hidrogén, szén-dioxid, nitrogén) kísérletek során kapott permeabilitások és elméleti szelektivitások meghatározása alapján a poliimid membránt alkalmasnak találtam a hidrogén kinyerésére, koncentrálására. Ezt
követően
egy
UBE
„NM-B01A”
poliimid
membránnal,
GSMS-100
tesztberendezésben végeztem méréseket elsőként az előbbiekhez hasonlóan tiszta gázokkal (hidrogén, szén-dioxid), melyben a hőmérséklet ideális szeparációs faktorra vonatkozó hatását vizsgáltam, s megállapítottam, hogy a hőmérséklet emelése pozitívan befolyásolja a hidrogén és szén-dioxid gázok elválaszthatóságát. Következő lépésben fermentációs hőmérsékleten, H2 és CO2 tartalmú modell gázeleggyel teszteltem a membránt, ahol is a betáp áramhoz viszonyított retentátum elvételi arány elválasztási hatékonyságra vonatkozó hatását tanulmányoztam. A kapott eredmények alapján az UBE „NM-B01A” membránnal, optimális retentátum elvételi
arány
beállításával
hidrogéntartalmának
a
egy
lépésben
permeátumban
való
lehetőség
van
töményítésére,
a
betáplált
mellyel
65
gázáram %(V/V)
hidrogéntartalmú gázáram állítható elő alacsony betáplálási nyomás mellett, 55 %(V/V) hidrogént és 45 %(V/V) szén-dioxidot tartalmazó kiindulási biner gázelegyeből, vagyis a membrán potenciálisan alkalmas lehet a hidrogén tisztítására, annak a fermentáció során keletkező gázelegyből való szeparálására. Következtetésként elmondható, hogy a membrán modul optimális üzemvitelű bioreaktorhoz való csatolással egy hatékony integrált rendszer, membrán bioreaktor lenne kialakítható, amely képes lehetne a megfelelő tisztaságú biohidrogén, mint alternatív energiahordozó előállítására.
89
7.
Új tudományos eredmények A Ph.D. kutatómunkám során elért új tudományos eredményeket az alábbi 4
tézispontban fogalmaztam meg: 1. Megállapítottam, hogy a szakirodalmi adatokkal összhangban E. coli (XL1-BLUE) baktérium törzset alkalmazva a formiát, mint szubsztrát jelenléte jelentősen, s pozitív mértékben befolyásolja a gázképződés mértékét. Ezt követően szakaszos üzemű bioreaktorban, kísérlettervezést alkalmazva kimutattam, hogy a fermentációs paraméterek (formiát-, élesztőkivonat-, tripton-, nátrium-klorid- és sejtkoncentráció, keverési sebesség) közül a formiát koncentrációja befolyásolja statisztikailag szignifikáns mértékben a folyamat hatékonyságát, s meghatároztam a rendszer optimális üzemviteli beállításait (30 mM formiát, 5 g/L élesztőkivonat, 10 g/L tripton, 3.33 g/L nátrium-klorid, 0.05 g sejt száraz anyag/L kiindulási sejtkoncentráció, 220 rpm keverési sebesség), ahol a hidrogén fajlagos képződési gázárama, valamint a hozam értékei 426 mL H2 L-1d-1 (17 mmol H2 L-1d-1) és 0.41 mol H2/mol formiát voltak [1,2]. 2. Az E. coli (XL1-BLUE) szaporodási kinetikájának vizsgálatával meghatároztam a folyamatos rendszer tervezéséhez fontos konstansok, a maximális szaporodási sebesség (μmax = 0.39 h-1) és a formiátra vonatkozó szubsztrát féltelítési állandó értékét (Ks = 18 mM), valamint megállapítottam, hogy a sejtszaporodás exponenciális szakasza – s ezzel párhuzamosan a legintenzívebb gázképződés is – az 5-7 óra közötti intervallumban játszódik le. Az így kapott eredményekre alapozva folyamatos üzemű bioreaktor rendszert alakítottam ki, s az optimális hidraulikus tartózkodási idő értékét 7 órában határoztam meg, ahol a hidrogén fajlagos képződési gázárama 5.1 mmol H2 L-1d-1, míg a hozam 0.26 mol H2/mol formiát voltak [3].
90
3. A biohidrogén fermentáció hatékonyságának növelésére vonatkozóan vizsgáltam a metabolikus mérnökség alkalmazásában és a folyamatoptimalizálásban rejlő lehetőségeket. Ennek során megállapítottam, hogy az expressziós mutáns E. coli (DJT 135) törzs a számára optimális körülmények (pH = 6.5, formiát konc.=28 mM) között 50%-al nagyobb hozam, 0.63 mol H2/mol formiát elérését teszi lehetővé az E. coli (XL1-BLUE)-val optimális esetben elérhető értékhez mérten [4]. 4. Tiszta gázokkal (H2, CO2, N2) végzett kísérletekben megállapítottam, hogy az ME1 poliimid membrán modul a mért permeabilitás és a gázpárokra számolt elméleti szelektivitás (H2/CO2 = 4.53; H2/N2 = 21.2) értékek alapján alkalmas lehet a biohidrogén elválasztására. Ezt követően egy UBE „NM-B01A” poliimid membrán modult teszteltem a GSMS-100 membrán gáz szeparációs berendezésben, elsőként tiszta, majd kevert gázokkal, s megállapítottam, hogy a magasabb hőmérséklet kedvezően befolyásolja a szeparációs tényező értékét H2/CO2 gázpárok esetében. Az UBE „NM-B01A” membránnal a fermentáció hőmérsékletén (37 oC), biner gázeleggyel (55 %(V/V) H2, 45 %(V/V) CO2) végzett kísérletekben meghatároztam a betáp áramhoz (QF) viszonyított retentátum (QR) elvételi arány optimális értékét (0.4
91
8.
Novel scientific results During my Ph.D. work the following novel scientific results have been achieved:
1. In accordance with literature, it was found that formate compound can remarkably increase the gas production potential of E. coli (XL1-BLUE). Furthermore, the impacts of process variables – formate-, tryptone-, yeast extract- and sodium-chloride concentration, cell density and stirring speed – on biohydrogen production were studied in batch cultures by experimental design. It was concluded that formate concentration was the sole statistically significant factor influencing biohydrogen formation and the optimal fermentation conditions were determined as follows: 30 mM formate, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 3.33 g/L sodium-chloride, 0.05 g dry cell weight/L cell density and 220 rpm stirring rate, where the volumetric productivity and the hydrogen yield was calculated as 426 mL H2 L-1d-1 (17 mmol H2 L-1d-1) and 0.41 mol H2/mol formate, respectively [1,2].
2. The design parameters of continuous hydrogen producing biosystem, namely the maximal growth rate and the Michealis-Menten constant was estimated as μmax = 0.39 h-1 and K s= 18 mM, respectively on formate supplemented media with E. coli (XL1blue). According to the growth kinetic measurements the exponential phase – coupled with the most intense gas production – was identified to take place between 5-7 hours of proliferation. Based on these findings, a continuous bioreactor was constructed where the highest volumetric hydrogen productivity and yield could be achieved at 7 hours of hydraulic retention time as 5.1 mmol H2 L-1d-1 and 0.26 mol H2/mol formate, respectively [3].
92
3. For process development purposes, metabolic engineered E. coli (DJT 135) was employed for biohydrogen fermentation. In comparison with the wild-type E. coli (XL1-BLUE) it was revealed that under optimal circumstances the former strain was able to ensure 50% higher efficiency since 0.63 mol hydrogen/mol formate yield could be obtained at pH=6.5 and formate concentration of 28 mM. These results confirmed that the simultaneous application of expression mutant strains and process optimization is a proper strategy to enhance the performance of biological hydrogen production [4]. 4. In single gas experiments – by using H2, CO2, N2 – based on the measured permeability and theoretical selectivity data (H2/CO2 = 4.53; H2/N2 = 21.2) it was found that the polyimide ME1 membrane gas separation module is a potential candidate for hydrogen concentration. Afterwards, a commercially available UBE „NM-B01A” polyimide membrane was studied in the GSMS-100 membrane testing apparatus both with single and binary gas mixtures (55 %(V/V) H2, 45 %(V/V) CO2), as well. It was demonstrated that at higher temperature higher theoretical separation factor could be obtained. Furthermore, it was shown that the so-called recovery factor – the ratio of retentate stream to the feed flow – plays a key role in hydrogen/carbondioxide separation, and its optimal value at fermentation temperature (37 oC) was determined in the range of 0.4-0.8, where the highest real selectivity value of 1.5 was achieved. Under such conditions, permeate gas with 65 %(V/V) hydrogen content could be obtained by 1-step separation of the initial gas mixture (55 %(V/V) H2, 45 %(V/V) CO2) therefore, the membrane module would appear to be suitable for hydrogen purification [1,3].
93
9.
Irodalomjegyzék
Abetz A, T Brinkmann, M Dijkstra, K Ebert, D Fritsch, K Ohlrogge. Developments in membrane research: from material via process design to industrial application. Adv Eng Mater 2006;8:328-58. Acharya NK, V Kulshrestha, K Awasthi, AK Jain, M Singh, YK Vijay. Hydrogen separation in doped and blend polymer membranes. Int J Hydrogen Energy 2008;33:327-31. Atkinson B, F Mavituna. Biochemical engineering and biotechnology handbook. 2nd edition; Stockton Press; 1992. Andrews SC, BC Berks, J McClay, A Ambler, MA Quail, P Golby, JR Guest. A 12-cistron Escherichia coli operon (hyf) encoding a putative proton-translocating formate hydrogenlyase system. Microbiology 1997;143:3633-47. Bailey EJ, FD Ollis. Biochemical engineering fundamentals. McGraw-Hill Science; 1986. Balachandran U, TH Lee, L Chen, SJ Song, JJ Picciolo, SE Dorris. Hydrogen separation by dense cermet membranes. Fuel 2006;85:150-5. Bagramyan K, N Mnatsakanyan, A Poladian, A Vassilian, A Trchounian. The roles of hydrogenases 3 and 4. and the F0F1-ATPase in H2 production by Escherichia coli at alkaline and acidic pH. FEBS Lett 2002;516:172-8. Bélafi-Bakó K, D Búcsú, Z Pientka, B Bálint, Z Herbel, K. Kovács, M Wessling. Integration of biohydrogen fermentation and gas separation processes to recover and enrich hydrogen. Int J Hydrogen Energy 2006;31:1490-5. Bélafiné Bakó K: Membrános műveletek, Veszprémi Egyetemi Kiadó, Veszprém, 2002 Búcsú D. Membrános gázszeparáció alkalmazása biohidrogén kinyerésére és koncentrálására. Doktori (Ph.D.) értekezés, Pannon Egyetem, 2008. Car A, C Stropnik, W Yave, KV Peinemann. Pebax/polyethylene glycol blend thin film composite membranes for CO2 separation: Performance with mixed gases. Sep Purif Technol 2008;62:110-7. Chen HB, DS Sholl. Predictions of selectivity and flux for CH4/H2 separations using single walled carbon nanotube membranes. J Membr Sci 2006;269:152-60.
94
Cheng HM, QH Yang, C Liu. Hydrogen storage in carbon nanotubes. Carbon 2001;39:144754. Chittibabu G, K Nath, D Das. Feasibility studies on the fermentative hydrogen production by recombinant Escherichia coli BL-21. Process Biochem 2006;41:682-8. Collet C, N Adler, JP Schwitzguebel, P Peringer. Hydrogen production by Clostridium thermolacticum during continuous fermentation of lactose. Int J Hydrogen Energy 2004;29:1479-85. Cooney M, N Maynard, C Cannizzaro, J Benemann. Twophase anaerobic digestion for production of hydrogen–methane mixtures. Bioresource Technol 2007;98(14):2641-51. Das D, TN Veziroglu. Hydrogen production by biological processes: a survey of literature. Int J Hydrogen Energy 2001;26:13-28. Das D, TN Veziroglu. Advances in biological hydrogen production processes. Int J Hydrogen Energy 2008;33:6046-57. David OC, D Gorri, A Urtiaga, I Ortiz. Mixed gas separation study for the hydrogen recovery from H2/CO/N2/CO2 post combustion mixtures using a Matrimid membrane. J Membr Sci 2011;378:359-68. Dong-Hoon K, K Sang-Hyoun, S Hang-Sik. Sodium inhibition of fermentative hydrogen production. Int J Hydrogen Energy 2009;34:3295-304. Eroglu E, A Melis. Photobiological hydrogen production: Recent advances and state of the art, Bioresour Technol 2011;102:8403-13. Favre E. Carbon dioxide recovery from post-combustion processes: can gas permeation membranes compete with absorption? J Membr Sci 2007;294:50-9. Fonyó Zs, Gy Fábry. Vegyipari művelettani alapismeretek. Nemzeti Tankönyvkiadó, Budapest, 2004. Fotou GP, YS Lin, SE Pratsinis. Hydrothermal stability of pure and modified microporous silica membranes. J Mater Sci 1995;30:2803-8. Gottschalk G. Bacterial metabolism. 2nd edition; Springer; 1986. Hallenbeck PC, Benemann JR. Biological hydrogen production; fundamentals and limiting processes. Int J Hydrogen Energy 2002;27:1185-93.
95
Hallenbeck PC, D Ghosh, MT Skonieczny, V Yargeau. Microbiological and engineering aspects of biohydrogen production. Indian J Microbiol 2009;49:48-59. Hallenbeck PC. Fermentative hydrogen production: Principles, progress, and prognosis. Int J Hydrogen Energy 2009;34:7379-89 Hawkes F, R Dinsdale, DL Hawkes, I Hussy. Sustainable fermentative hydrogen production: challenges for process optimization. Int J Hydrogen Energy 2002;27:1339-47. Hinchliffe AB, KE Porter. A comparison of membrane separation and distillation. Chem Eng Res Des 2000;78:255-68. Husken D, T Visser, M Wessling, RJ Gaymans. CO2 permeation properties of poly(ethylene oxide)-based segmented block copolymers. J Membr Sci 2010;346:194-201. IEA
Energy
Technology
Essentials.
Hydrogen
production
and
distribution.
http://www.iea.org/techno/essentials5.pdf (2012.02.10.) Iwamoto Y, K Sato, T Sato, T Inada, Y Kubo. A hydrogen-permselective amorphous silica membrane derived from polysilazane. J Eur Ceram Soc 2005;25:257-64. Jobbágy A, V Bakos. Szennyvíztisztítási biotechnológiák http://vegyeszkar2005.ch.bme.hu/Biomernoki/Biologia,%20biotechnologia%20%28MSc%29/ bioszenny_kepnelkul.pdf (2012.02.10). Kemény S, A Deák. Kísérletek tervezése és értékelése; Műszaki Könyvkiadó; 2000. Khanal SK, WH Chen, L Ling, S Sung. Biological hydrogen production: effects of pH and intermediate products. Int J Hydrogen Energy 2004;29:1123-31. Kim DH, MS Kim. Hydrogenases for biological hydrogen production, Bioresour Technol 2011;102:8423-31. Kim DH, SK Han, SH Kim, HS Shin. Effect of gas sparging on continuous fermentative hydrogen production. Int J Hydrogen Energy 2006;31:2158-69. Kim S, E Seol, M Ra, S Park, YK Oh, D Ryu. Various hydrogenases and formatedependent hydrogen production in Citrobacter amalonaticus Y19. Int J Hydrogen Energy 2008;33:150915. Kim YK, HB Park, YM Lee. Gas separation properties of carbon molecular sieve membranes derived from polyimide/polyvinylpyrrolidone blends: effect of the molecular weight of polyvinylpyrrolidone. J Membr Sci 2005;251:159-67. 96
Koros WJ, KG Fleming. Membrane-based gas separation. J Membr Sci 1993;83:1-80. Kovács L: Az „élő” tömítés (LL) hatása az illékony szerves vegyületek emissziójára a Dunai Finomítóban; Magyar Kémikusok Lapja LXV. évf. 2010 November; 355-60. Krupp M, R Widmann. Biohydrogen production by dark fermentation: Experiences of continuous operation in large lab scale. Int J Hydrogen Energy 2009;34:4509-16. Kuehl RO. Design of experiments: statistical principles of research design and analysis. Pacific Grove (CA): Duxbury Press; 2000. Laurinavichene TV, AA Tsygankov. H2 consumption by Escherichia coli coupled via hydrogenase 1 or hydrogenase 2 to different terminal electron acceptors. FEMS Microbiol Lett 2001;202:121-4. Laurinavichene TV, A Chanal, LF Wu, AA Tsygankov. Effect of O2, H2 and redox potential on the activity and synthesis of hydrogenase 2 in Escherichia coli. Res Microbiol 2001:152;793-8. Laurinavichene TV, BF Belokopytov, KS Laurinavichius, DN Tekucheva, M Seibert, AA Tsygankov. Towards the integration of dark- and photo-fermentative waste treatment. 3. Potato as substrate for sequential dark fermentation and light-driven H2 production. Int J Hydrogen Energy 2010;35:8536-43. Lee DH, DJ Lee. Hydrogen economy in Taiwan and biohydrogen. Int J Hydrogen Energy 2008;33:1607-18. Lee HS, WFJ Vermaas, BE Rittmann. Biological hydrogen production: prospects and challenges; Trends Biotechnol 2010;5:262-71. Levin DB, L Pitt, M Love. Biohydrogen production: prospects and limitations to practical application. Int J Hydrogen Energy 2004;2:173-85. Li Y, TS Chung. Highly selective sulfonated polyethersulfone (SPES)-based membranes with transition metal counterions for hydrogen recovery and natural gas separation. J Membr Sci 2008;308:128-35. Lin H, BD Freeman. Gas solubility, diffusivity and permeability in poly(ethylene oxide). J Membr Sci 2004;239:105-17. Liu H, S Grot, BE Logan. Electrochemically assisted microbial production of hydrogen from acetate. Environ Sci Technol 2005;39;4317-20. 97
Lo YC, Bai MD, Chen WM, Chang JS. Cellulosic hydrogen production with a sequencing bacterial hydrolysis and dark fermentation. Bioresour Technol 2008;99:8299-303. Maeda T, V Sanchez-Torres, TK Wood. Metabolic engineering to enhance bacterial hydrogen production. Microb Biotechnol 2007; doi:10.1111/j.1751-7915.2007.00003.x Maiera G, M Wolfa, M Blehab, Z Pientka. Gas permeabilities of polymers with indan groups in the main chain.1: Poly(ether ketone)s. J Membr Sci 1998:143:105-13. Maiera G, M Wolfa, M Blehab, Z Pientka. Gas permeabilities of polymers with indan groups in the main chain.2: Polyimides. J Membr Sci 1998:143:115-23. Manish S, R Banerjee. Comparison of biohydrogen production processes. Int J Hydrogen Energy 2008; 33:279-86. Marbán G, T Valdés-Solís. Towards the hydrogen economy?. Int J Hydrogen Energy 2007;32:1625-37. Márkus
L.
Kísérlettervezés
–
Az
ipari
kísérlettervezés
statisztikai
módszerei.
http://www.math.elte.hu/probability/markus/index.m.html (2012.02.10.) Mathews J, G Wang. Metabolic pathway engineering for enhanced biohydrogen production. Int J Hydrogen Energy 2009;34:7404-16. Montgomery DC. Design and analysis of experiments. NY: John Wiley & Sons; 2005. Mulder MHV: Basic Principles of Membrane Technology. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1996. Nath K, D Das. Improvement of fermentative hydrogen production: various approaches., Appl Microbiol Biotechnol 2004;65:520-29. Ni M, DYC Leung, MKH Leung, K Sumathy. An overview of hydrogen production from biomass. Fuel Process Technol 2006;87:461-72. Nyeste L.: Biomérnöki Műveletek és Alapfolyamatok. Műegyetemi Kiadó; 1997 Ogino H, T Miura , K Ishimi, M Seki, H Yoshida. Hydrogen Production from Glucose by Anaerobes. Biotechnol Prog 2005;21:1786-8. Orme CJ, ML Stone, MT Benson, ES Peterson. Testing of polymer membranes for selective permeability of hydrogen. Sep Sci Technol 2003;38:3225-38.
98
Paglieri SN, JD Way. Innovations in palladium membrane research. Sep Purif Methods 2002;31:1-169. Pant D, GV Bogaert, L Diels, K Vanbroekhoven. A review of the substrates used in microbial fuel cells (MFCs) for sustainable energy production. Bioresour Technol 2010;101:1533-43. Plackett RL, JP Burman. The design of optimum multifactorial experiments. Biometrika 1946;33:305-25. Redwood MD, IP Mikheenko, F Sargent, LE Macaskie. Dissecting the roles of Escherichia coli hydrogenases in biohydrogen production. FEMS Microbiol Lett 2008;27:48-55. Reijerkerk SR, MH Knoef, K Nijmeijer, M Wessling. Poly(ethylene glycol) and poly(dimethyl siloxane): Combining their advantages into efficient CO2 gas separation membranes. J Membr Sci 2010;352:126-35. Reijerkerk SR, K Nijmeijer, CP Ribeiro, BD Freeman, M Wessling. On the effects of plasticization in CO2/light gas separation using polymeric solubility selective membranes. J Membr Sci 2011;367:33-44. Reith JH, RH Wijffels, H Barten. Bio-methane & Bio-hydrogen: Status and perspectives of biological methane and hydrogen production, Dutch Biological Hydrogen Foundation, 2003. Sawers G. The hydrogenases and formate dehydrogenases of Escerichia coli. Antonie van Leeuwenhoek 1994;66:57-88. Sawers G. Formate and its role in hydrogen production in Escherichia coli. Biochem Soc Trans 2005;33:42-6. Schlapbach L, A Züttel. Hydrogen-storage materials for mobile applications. Nature 2001;414:353-8. Self WT, A Hasona, KT Shanmugam. Expression and regulation of a silent operon, hyf, coding for hydrogenase 4 isoenzyme in Escherichia coli. J Bacteriol 2004; 186:580–7. Seol E, A Manimaran, Y Jang, S Kim, YK Oh, S Park. Sustained hydrogen production from formate using immobilized recombinant Escherichia coli SH5. Int J Hydrogen Energy 2011:36;8681-6. Shao L, L Liu, SX Cheng, YD Huang, J Ma. Comparison of diamino cross-linking in different polyimide solutions and membranes by precipitation observation and gas transport. J Membr Sci 2008;312:174-85. 99
Shao L, BT Low, TS Chung, AR Greenberg. Polymeric membranes for the hydrogen economy: Contemporary approches and prospects for the future. J Membr Sci 2009;327:1831. Shin JH, JH Yoon, EK Ahn, MS Kim, JS Sim, TH Park. Fermentative hydrogen production by newly isolated Enterobacter asburiae SNU-1. Int J Hydrogen Energy 2007;32:192-9. Sholl DS, JK Johnson. Making high flux membranes with carbon nanotubes. Science 2005;312:1003-4. Sircar S, TC Golden. Purification of hydrogen by pressure swing adsorption. Sep Sci Technol 2000;35:667-87. Skibinski DA, P Golby, YS Chang, F Sargent, R Hoffman, R Harper. Regulation of the hydrogenase-4 operon of Escherichia coli by the sigma(54)-dependent transcriptional activators FhlA and HyfR. J Bacteriol 2002;184:6642-53. Strathmann H, L Giorno, E Drioli: An Introduction to Membrane Science and Technology, Ufficio Pubblicazioni e Informazioni Scientifiche, Italy, Rome, 2006 Sue TM, IJ Ball, JA Concklin, SC Huang, RK Larson, SL Nguyen. Polyaniline/polyimide blends for pervaporation and gas separation studies. Synth Met 1997;84:801-2. Szentgyörgyi E. Membránok alkalmazási lehetőségei a biogáz előállításánál. Doktori (Ph.D.) értekezés, Pannon Egyetem, 2010. Tin PS, TS Chung, Y Liu, R Wang, SL Liu, KP Pramoda. Effects of cross-linking modification on gas separation peformance of Matrimid membranes. J Membr Sci 2003;225:77-90. Trchounian K, V Sanchez-Torres, TK Wood, A Trchounian. Hydrogenase 2 is most and hydrogenase 1 is less responsible for H2 production by Escherichia coli under glycerol fermentation at neutral and slightly alkaline pH. Int J Hydrogen Energy 2009:34;8839-45. Trchounian K, V Sanchez-Torres, TK Wood, A Trchounian. Escherichia coli hydrogenase activity and H2 production under glycerol fermentation at a low pH. Int J Hydrogen Energy 2011:36;4323-31. Trchounian K, A Poladyan, A Vassilian, A Trchounian. Multiple and reversible hydrogenases for hydrogen production by Escherichia coli: dependence on fermentation substrate, pH and the F(0)F(1)-ATPase. Crit Rev Biochem Mol Biol 2012:47:236-49.
100
Trchounian K, C Pinske, RG Sawers, A Trchounian. Characterization of Escherichia coli [NiFe]-hydrogenase distribution during fermentative growth at different pHs. Cell Biochem Biophys. 2012;62:433-40. Turcot J, A Bisaillon, PC Hallenbeck. Hydrogen production by continuous cultures of Escherchia coli under different nutrient regimes. Int J Hydrogen Energy 2008;33:1465-70. Van Ginkel S, BE Logan. Inhibition of biohydrogen production by undissociated acetic and butyric acids. Environ Sci Technol 2005;39:9351-6. Veziroglu TN. Saga of Hydrogen Civilization. APEC Advanced Biohydrogen Technology Conference, Taichung, Taiwan, 2010. Wang J, W Wan. Factors influencing fermentative hydrogen production: A review. Int J Hydrogen Energy 2009;34:799-811. Wang J, W Wan: Experimental design methods for fermentative hydrogen production: A review; Int J Hydrogen Energy 2009;34:235-44. Wang ZG, TL Chen, JP Xu. Gas transport properties of novel cardo poly(aryl ether ketone)s with pendant alkyl groups. Macromolecules 2000;33:5672-9. Weuster-Botz D. Experimental Design for Fermentation Media Development: Statistical Design or Global Random Search?. J Biosci Bioeng 2000;90:473-83. Wu SY, CH Hung, CN Lin, HW Chen, AS Lee, JS Chang. Fermentative hydrogen production and bacterial community structure in high-rate anaerobic bioreactors containing siliconeimmobilized and self-flocculated sludge. Biotechnol Bioeng 2006;93:934-46. Yang SI, DY Choi, SC Jang, SH Kim, DK Choi. Hydrogen separation by multi-bed pressure swing adsorption of synthesis gas. Adsorption 2008;14:583-90. Yavea W, A Car, KV Peinemann, MQ Shaikh, K Rätzke, F Faupel. Gas permeability and free volume in poly(amide-b-ethylene oxide)/polyethylene glycol blend membranes. J Membr Sci 2009;339:177-83. Yokoi H, A Saitsu, H Uchida, J Hirose, S Hayashi, Y Takasaki. Microbial hydrogen production from sweet potato starch residue. J Biosci Bioeng 2001;91:58-63. Yoshida A, T Nishimura, H Kawaguchi, M Inui, H Yukawa. Enhanced Hydrogen Production from Formic Acid by Formate Hydrogen Lyase-Overexpressing Escherichia coli Strains. Appl Environ Microbiol 2005;71:6762-8. 101
Yoshida A, T Nishimura, H Kawaguchi, M Inui, H Yukawa. Efficient induction of formate hydrogen lyase of aerobically grown Escherichia coli in a three-step biohydrogen production process. Appl Environ Microbiol 2007;74:754-60. Yun J, F Jin, A Kishita, K Tohji, H Enomoto. Formic Acid Production from Carbohydrates Biomass by Hydrothermal Reaction; J Phys Conf Ser 2010;215:121-6.
102
10. Publikációs jegyzék Angol nyelvű publikációk 1. K. Bélafi-Bakó, P. Bakonyi, N. Nemestóthy, Z. Pientka: Biohydrogen production in integrated system Desalination and Water Treatment 2010;14:116-8. IF: 0.752 2. P. Bakonyi, N. Nemestóthy, É. Lövitusz, K. Bélafi-Bakó: Application of Plackett-Burman experimental design to optimize biohydrogen fermentation by E. coli (XL1-BLUE) International Journal of Hydrogen Energy 2011;36:13949-54. IF: 4.053 3. P. Bakonyi, N. Nemestóthy, J Ramirez, G Ruiz-Filippi, K. Bélafi-Bakó: E. coli (XL1BLUE) for continuous fermentation of bioH2 and its separation by polyimide membrane International Journal of Hydrogen Energy 2012;37:5623-30. IF: 4.053 4. Péter Bakonyi, Nándor Nemestóthy, Katalin Bélafiné Bakó: Comparative study of various E. coli strains for biohydrogen production applying response surface methodology The Scientific World Journal, 2012;doi:10.1100/2012/819793. IF: 1.524
103
Magyar nyelvű publikációk Bakonyi Péter: A biohidrogén, mint potenciális lehetőség Természet világa, 2011. november Bakonyi Péter: Biohidrogén előállítás és koncentrálás Egy csepp tudomány – Válogatott munkák a VII. Jedlik Ányos Szakmai Napok előadóitól ISBN 978-963-06-9374-5, Veszprém, 2010 Angol nyelvű előadások és poszterek P. Bakonyi, N. Nemestóthy, É. Lövitusz, K. Bélafi-Bakó: Optimization of the operational conditions for biohydrogen fermentation using E. coli (XL1-BLUE) The World Congress on Industrial Biotechnology and Bioprocessing Toronto, Kanada, Május 8-11 (2011) P. Bakonyi, N. Nemestóthy, É. Lövitusz, K. Bélafi-Bakó: Application of Plackett-Burman experimental design to optimize biohydrogen fermentation by E. coli (XL1-BLUE) Asian Biohydrogen Symphosium and APEC Advanced BioH2 Technology Symphosium Taichung, Taiwan, November 15-20 (2010) P. Bakonyi, N. Nemestóthy, K. Bélafi-Bako: Concentration of biohydrogen by gas separation membranes European Membrane Society Summer School Bukarest, Románia, Június 14-18 (2010), Poszter P. Bakonyi, Z. Pientka, N. Nemestóthy, K. Bélafi-Bakó: Application of gas separation membranes in biohydrogen production Biotech World Moszkva, Oroszország (2010), Poszter
104
Magyar nyelvű előadások Bakonyi P., Nemestóthy N., Lövitusz É., Bélafiné Bakó K.: Az E. coli (XL1-BLUE)-val megvalósított biohidrogén fermentáció vizsgálata és optimalizálása Műszaki Kémiai Napok, 2011 Bakonyi P., Pientka Z., Nemestóthy N., Lövitusz É., Bélafiné Bakó K.: Biohidrogén előállítása és tisztítása gázszeparációs membránok segítségével Műszaki Kémiai Napok, 2010
Bakonyi Péter: Az E.coli (XL1-BLUE)-val megvalósított biohidrogén fermentáció optimalizálása IX. Jedlik Ányos Szakmai Napok Veszprém, 2012, különdíj Bakonyi Péter: Az E.coli (XL1-BLUE)-val megvalósított biohidrogén fermentáció optimalizálása VIII. Jedlik Ányos Szakmai Napok Veszprém, 2011, I. helyezés Bakonyi Péter: Biohidrogén előállítás és koncentrálás VII. Jedlik Ányos Szakmai Napok Veszprém, 2010, I. helyezés Bakonyi P., Cserjési P., Nemestóthy N., Bélafiné Bakó K.: Gázok diffúziójának és oldhatóságának vizsgálata ionos folyadékokban PhD hallgatók anyagtudományi napja, Veszprém, 2009
105
11. Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretném megköszönni a Biomérnöki, Membrántechnológiai és Energetikai Kutató Intézet mindazon munkatársainak segítségét, akik a dolgozat elkészüléséhez bármilyen módon hozzájárultak. Kiemelt köszönet illeti témavezetőmet, Dr. Nemestóthy Nándort, akinek széleskörű tudása és szakmai tapasztalatai nélkül a dolgozat nem jöhetett volna létre. Szeretném megköszönni továbbá Bélafiné Dr. Bakó Katalinnak áldozatos munkáját, valamint szakmai és emberi tanácsait, melyekkel jelentősen hozzájárult disszertációm sikeres elkészüléséhez. Szintén elismerés illeti Dr. Gubicza Lászlót, akinek jó szándékú, kritikus megjegyzései, s kiváló németnyelv ismerete sokat segítettek a dolgozat színvonalának emelésében. Külön köszönöm Lövitusz Éva segítségét is, aki a fermentációs munkával kapcsolatos kérdéseimet mindig türelmesen fogadta és válaszolta meg, jelentősen hozzájárulva ezzel a gyakorlati munka sikeres megvalósításához. Hálás vagyok továbbá családomnak és barátaimnak, akik mindvégig mellettem álltak és támogattak.
106
