7. A b - G A L A K T O Z I D Á Z I N D U K C I Ó J A E S C H E R I C H I A C O L I B A N
7. A b-galaktozidáz indukciója Escherichia coliban dr. Bauer Pál
7.1. Az enzimindukció jelensége Az élõlények valamennyi génjének állandó és folyamatos átírása (transzkripciója), majd az így készített mRNS-en a fehérjék szintézise rendkívül nagy energiafogyasztással járna. Azok az élõlények viszont, amelyek csak akkor készítenek el egy fehérjét, ha szükségük is van rá, sokkal gazdaságosabban hasznosítják a rendelkezésükre álló energiát. A gazdaságos energiafelhasználás több komponensû regulációs rendszeren keresztül valósul meg. A reguláció egyik, mind prokariotákban, mind eukariotákban elõforduló módja az enzimindukció es a represszió. Ezt a szabályozó mechanizmust elsõként Jacob és Monod a b-galaktozidáz indukciójának vizsgálata során mutatta ki. Ez az enzim a tápanyagként felvett laktózt hidrolizálja glukózra és galaktózra, és ez által biztosítja a baktérium szénhidrát tápanyagforrását. Viszont a laktóz nélküli táptalajon növekvõ baktérium nem szintetizál b-galaktozidázt. A DNS-nek a laktóz felhasználását irányító, funkcionálisan egységes szakaszát lac operonnak nevezzük. Az operonhoz tartozik a CAP-et és a DNS-függõ RNS-polimerázt kötõ promoter gén, az operátor gén, valamint a b-galaktozidázt, galaktozid permeázt, galaktozid transzacetilázt kódoló struktúrgének. Az operontól elkülönülten elhelyezkedõ regulátor génrõl folyamatosan mRNS íródik át, ez biztosítja a represszor fehérje konstitutív szintézisét. A represszor az operátor génhez kötõdve megakadályozza a polimeráz kapcsolódását, így a struktúrgének transzkripcióját. Amikor laktózt adunk az energiaforrásként nem glukózt, hanem pl. glicerint tartalmazó táptalajhoz, a b-galaktozidáz (és a másik két enzim) szintje rendkívül gyorsan megemelkedik. Az indukált állapot addig tart, amíg laktóz, van a táptalajban.
7.2. Az indukció mechanizmusa 1. A laktóz a represszor fehérjéhez kötõdve annak konformációját megváltoztatja, aminek következtében a komplex leválik az operator génrõl, így lehetõvé válik a polimeráz kötõdése a promoterhez és az operátorhoz. 2. Megindul az mRNS-ek transzkripciója. 3. A még szintetizálódó RNS 5’-terminálisán már megkezdõdik a fehérjék szintézise. Az induktív enzimszintézis három fázisának tagolódását mutatja az a megfigyelés, miszerint a mRNS szintézis blokkolása után a fehérje szintézis a már korábban elkészült mRNS-en 5-10 percig tovább folyik. 111
II. B I O O R G A N I K U S K É M I A I G Y A K O R L A T O K Az indukció kezdetén adott, mRNS szintézis gátló rifampicin megakadályozza a mRNS szintézisét és az enzimtermelést is. Az indukált enzimszintézist fehérjeszintézis gátlóval, pl. kloramfenikollal is meg lehet akadályozni. A kísérlet során megfigyelhetjük az indukció félidejében adott kloramfenikol, ill. rifampicin hatását az enzimindukcióra. Az indukció mértékét az inkubáció után a b-galaktozidáz aktivitás meghatározásával követjük nyomon.
7.3. A b-galaktozidáz-aktivitás meghatározásának elve A b-galaktozidáz (b-D-galaktozid galaktohidroláz, E.C.3.2.1.23.) a laktózmolekulát glukózra es galaktózra hasítja. laktóz + H2O ® glukóz + galaktóz Az enzim szintetikus szubsztrátokat is bont, így pl. az ortonitrofenil-b-D-galaktozidot galaktózra és színes orto-nitrofenolra hasitja. A keletkezett sárga orto-nitrofenol mennyisége spektrofotométerrel meghatározható. Az enzim indukcióját tehát a b-galaktozidáz aktivitásának merésével mutatjuk ki. A b-galaktozidáz indukcióját úgy a laktóz, mint egy másik galaktozidszármazék, az izopropil-b-tio-galaktozid (IPTG) képes kiváltani. Az IPTG viszont nem szubsztrátja a b-galaktozidáznak, így mennyisége az indukció során nem csökken.
7.4. Az enzim indukciójára és kimutatására használt oldatok 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
8
baktérium sejtszuszpenzió (kb. 10 / ml) IPTG-oldat (0,5 mg/ml izopropil-b-tio-galaktozid) az induktor toluol, a sejtpermeabilitás fokozására ONPG-oldat (1 mg/ml orto-nitrofenil-b-D-galaktozid deszt. vízben oldva) a b-galaktozidáz szubsztrátja 0,02 M foszfát-puffer, pH 7,4 1 M, Na-karbonát oldat 0,5 mg/ml kloramfenikol 2 mg/ml rifampicin
7.5. A gyakorlat kivitelezése Állítsuk össze az alábbi rendszereket:
112
7. A b - G A L A K T O Z I D Á Z I N D U K C I Ó J A E S C H E R I C H I A C O L I B A N Anyagok / csõ baktériumszuszpenzió víz klóramfenikol 0 perckor rifampicin 0 perckor IPTG induktor klóramfenikol 15 perckor rifampicin 15 perckor inkubálás 37 °C
1 1 0,1 – – 0,1 – – 0'
2 1 0,1 – – 0,1 – – 15'
3 1 0,1 – – 0,1 – – 30'
4 1 – 0,1 – 0,1 – – 30'
5 1 – – – 0,1 0,1 – 30'
6 1 0,2 – – – – – 30'
7 1 – – 0,1 0,1 – – 30'
8 1 – – – 0,1 – 0,1 30'
9 1 0,1 – 0,1 – – – 30'
– Közvetlenül az inkubáció végén adjunk minden csõbe egy csepp (50 µl) toluolt és hûtsük a csöveket jeges vízben. A minták itt várják meg egymást. – Feltárás: 15 percig 37 °C-on, a vízfürdõben rázatva.
7.6. Enzimaktivitás-mérés Minden kémcsõbõl: toluolos baktériumszuszp. foszfátpuffer pH 7,4 ONPG szubsztrát Inkubálás 37 °C-on Na-karbonát-oldat
0,1 ml 0,3 ml 0,1 ml 15 percig 1,0 ml
A leolvasás 420 nm-en 1-5-ig a 6-os csõvel szemben történik. Mivel a rifampicin maga is színes, a 7-8. rendszert a 9. csõvel, mint vakkal szemben mérjük. Mérési eredmények: Csõszám extrinkció
1
2
3
4
5
6
7
8
9
7.7. A mérési eredmények értékelése 1. A b-galaktozidáz indukálhatósága az enzimaktivitás alapján: az extinkció értékek összehasonlitása az 1.,2.,3. csõben. 2. Az indukció gátlása fehérje szintézis gátlással: a 4., 5. csõ a 3-hoz viszonyítva. 3. Az indukció gátlása mRNS szintézis gátlással: 7., 8. csõ a 3-hoz viszonyítva. 4. A kétféle gátlás összehasonlítása: 5. és 8., ill. 4. es 7. csõ. Kérdések: 1. Minek a rövidítése a CAP? 2. Hogyan hat a CAP a lac operonra? 3. Miért nincs indukció glukóz táptalajon növesztett baktériumban? 4. Mi a jelentõsege a pozitív es negatív szabályozásnak?
113
II. B I O O R G A N I K U S K É M I A I G Y A K O R L A T O K
8. A pGL3-Basic vektor restrikciós emésztése és gélelektroforézise dr. Keszler Gergely
8.1. Elméleti háttérismeretek – Plazmidok, vektorok biotechnológiai jelentõsége: riporter gének, rekombináns fehérjék termelése – Restrikciós endonukleázok mûködése – A gélelektroforézis alapelvei
8.2. A kísérlethez elve A pGL3-Basic vektor (http://www.promega.com/tbs/tm033/tm033.pdf) a génexpressziós vizsgálatok során gyakran használt luciferáz-riporterrendszer:
A luciferáz gén elé 5’-irányban, az 5-53. bázispárok területén, a feltüntetett restrikciós hasító helyeknek megfelelõen („multiple cloning site” vagy „polylinker”) tetszõleges promoter-szekvencia klónozható, amelynek transzkripciós aktivitása a vektor eukarióta 114
A pGL3 - B A S I C V E K T O R R E S T R I K C I Ó S E M É S Z T É S E É S G É L E L E K T R O F O R É Z I S E sejtekbe történõ transzfekciójával, majd a luciferáz-aktivitás meghatározásával mérhetõ. Az erõs poliadenilációs szignál (1770-2004. bp.) a luciferáz-mRNS stabilitását biztosítja; az f1 origin-régió a vektor baktériumokban történõ replikációját teszi lehetõvé, míg az Ampr gén az ampicillinnel szembeni rezisztenciáért (szelekció) felelõs b-laktamáz enzimet kódolja. A gyakorlat során egyrészt a plazmid egyszeres hasítása történik XbaI enzimmel (linearizálás), illetve az XbaI és NheI enzimekkel kettõs emésztést végzünk, ami a luciferáz-cDNS plazmidból történõ kimetszését eredményezi. A kettõs emésztést az teszi lehetõvé, hogy a két enzim hõmérséklet-, ionerõsség- és pH-optimuma megegyezik. Mindkét restrikciós endonukleáz ragadós végeket hoz létre 5’-túlnyúlással, amelyek egymással komplementerek, azaz újra összeligálhatók: 5’-G^C T A G C-3’
5’-T^C T A G
A-3’
3’-C G A T C^G-5’
3’-A G A T C^T-5’
(NheI)
(XbaI)
8.3. A kísérlet leírása A restrikciós emésztéseket 20 ml-es végtérfogatban hajtjuk végre az alábbiak szerint.
8.3.1. Egyszeres emésztés (linearizálás) 2 ml pGL3-Basic vektor (c = 0,1 mg/ml) 2 ml 10x tömény reakciópuffer (összetétele: 330 mM Tris-acetát pH 7,9; 100 mM magnézium-acetát, 660 mM kálium-acetát, 0,1 mg/ml BSA) 1 ml XbaI restrikciós endonukleáz (10 U/ml) 15 ml desztillált víz. A csoportok a vektor, a reakció puffer és a víz keverékét elõre elkészítve kapják (19 ml); az emésztést 1 ml enzim hozzáadásával kell elindítani.
8.3.2. Kettõs emésztés 2 ml pGL3-Basic vektor 2 ml 10x tömény reakció puffer 1 ml NheI restrikciós endonukleáz (10 U/ml) 1 ml XbaI restrikciós endonukleáz (10 U/ml) 14 ml desztillált víz. A vektor, a közös reakció puffer és a víz keverékét elõre elkészítve kapják; az emésztés 1-1 ml NheI és XbaI enzim hozzáadásával indul.
115
II. B I O O R G A N I K U S K É M I A I G Y A K O R L A T O K A reakcióelegyeket 60 percig inkubáljuk 37 ºC-os vízfürdõben vagy termoblokkban, majd a DNS futtatása következik horizontális szubmerziós módszerrel, az elõre elkészített 1%-os agaróz géleken. A mintákhoz nagy sûrûségû mintapuffert adunk, amely a futtatás nyomon követése miatt kétféle festéket is tartalmaz (60% glicerin pH 7,6; 0,03% brómfenolkék, 0,03% xilén-cianol). Összehasonlításképpen hasítatlan vektort, a molekulatömeg hozzávetõleges megállapítása céljából pedig DNS-markert is futtatunk, amely 14 különbözõ molekulatömegû DNS-fragmentum keveréke (250 bp – 10 kbp tartományban).
8.4. A gél-elektroforetikus vizsgálat Egyszeresen, ill. kétszeresen emésztett minták: A 20-20 ml reakcióelegyekhez 4-4 ml mintapuffert mérünk; emésztetlen DNS minta: 2 ml pGL3-Basic vektor + 14 ml víz keverékéhez (elõre összemérve kapják) 4 ml mintapuffert pipettázunk. Az így elõkészített mintákból 20–20 ml-t, a készen kapott GeneRuler DNS-markerbõl pedig 6 ml-t pipettázunk a gélzsebekbe. A futtatás 120 V konstans feszültség mellett minimum 45 percet vesz igénybe. Ügyeljünk a polaritásra, a DNS a pozitív pólus felé mozog! Idõnként ellenõrizzük a festékcsíkok helyzetét! A futtatás végeztével a gélt UV-lámpa segítségével átvilágítjuk. A gél GR Safe DNS-festéket tartalmaz, amely a futtatás során megfesti a DNS-sávokat. VIGYÁZAT!! A GR Safe a kettõs spirál bázisai közé interkalálódó festékanyag, ezáltal potenciálisan mutagén. A közismert etídium-bromidnál azonban jóval hidrofilebb molekula, ezért bõrön keresztül sokkal kevésbé szívódik fel. Ennek ellenére a gélt kizárólag gumikesztyûben szabad megfogni. Az UV-fény károsítja a szemet, ezért a lámpát csak akkor szabad bekapcsolni, ha a fényszûrõ plexilappal már leárnyékoltuk az átvilágítót. A gélt megtekintés után az erre a célra kijelölt edénybe dobjuk ki. Figyeljük meg, hogy az emésztetlen vektor (cirkuláris plazmid) szupertekercse gyorsabban fut, mint az egyszeresen emésztett (linearizált) DNS. Az emésztetlen vektor gyakran két sávot ad, közülük a lassabban futó, látszólag sokkal nagyobb molekulatömegû az egyik polinukleotid-láncban nicket tartalmazó, nem szupertekercselt forma. A marker segítségével becsüljük meg az emésztéssel kapott fragmentumok méreteit, és vessük össze a vektortérkép alapján elméletileg várható hasítási termékek hosszúságával!
116
A pGL3 - B A S I C V E K T O R R E S T R I K C I Ó S E M É S Z T É S E É S G É L E L E K T R O F O R É Z I S E
117
