7 KARAKTER MOLEKULER Chili veinal mottle virus ISOLAT LEMAH (Molecular Characterization of Weak Isolates of Chili veinal mottle virus)

55

7 KARAKTER MOLEKULER Chili veinal mottle virus ISOLAT LEMAH (Molecular Characterization of Weak Isolates of Chili veinal mottle virus) Abstrak Pre-imunisasi dengan isolat-isolat lemah Chili veinal mottle virus (KAR, SKT, SPR, CSR, dan PGL) efektif melindungi tanaman cabai dari infeksi isolat kuat ChiVMV-CKB. Analisis gen coat protein (CP) dari 5 ChiVMV isolat lemah tersebut dilakukan melalui perunutan sikuen nukleotida dan asam amino, dilanjutkan dengan penyejajaran (alligment) sikuen dan analisis filogeni. Di antara kelima ChiVMV isolat lemah ditemukan keragaman sikuen nukleotida dan asam amino, tetapi analisis filogenetik menunjukkan bahwa kelima ChiVMV isolat lemah memiliki tingkat homologi yang tinggi dan berada dalam satu kelompok dengan isolat kuat ChiVMV-CKB. Hasil analisis karakter molekuler ChiVMV isolat lemah tersebut menjelaskan keefektivan kelima isolat lemah sebagai agens proteksi silang. Kata kunci : Chili veinal mottle virus, kesamaan, nukleotida, sikuen

Abstract Pre-immunization with weak isolates of Chili veinal mottle virus (KAR, SKT, SPR, CSR, and PGL) was able to protect chili pepper from infection of severe isolate ChiVMV-CKB. Analysis of coat protein (CP) gene was done by sequencing, followed by allignment and phyllogenetic analysis. Sequence variability was found among 5 weak isolates, however phyllogenetic analysis showed that all weak isolates has high sequence homology and belong to the same group with severe isolate ChiVMV-CKB. This molecular characterization of weak isolates of ChiVMV explained their effectiveness as agents for cross protection against infection of severe isolates of ChiVMV. Keywords : Chili veinal mottle virus, homolog, nucleotides, sequences

56

Pendahuluan Chili veinal mottle virus (ChiVMV) merupakan salah satu anggota Potyvirus yang menginfeksi cabai, menimbulkan gejala belang hijau tua, malformasi daun, dan pengurangan ukuran daun (Lee et al. 2005), buah lebih sedikit dan lebih kecil (Ong et al 1979). Virus tersebut tersebar luas di Asia (Green dan Kim 1991; Tsai et al. 2008; Wang et al. 2006). Karakterisasi molekuler ChiVMV yang berasal dari daerah dan negara yang berbeda telah dilakukan, umumnya melalui analisis susunan sikuen nukleotida serta asam amino dari gen coat protein (CP). Chiemsombat et al. (1998) berhasil mengamplifkasi gen CP ChiVMV isolat Thailand dengan teknik reverse transcription polymeration chain reaction (RT-PCR). Moury et al. (2005) mendeteksi 2 spesies Potyvirus yaitu ChiVMV dan Pepper veinal mottle virus (PVMV) berdasarkan analisis sikuen gen CP yang diperoleh dengan teknik RTPCR. Selanjutnya Tsai et al. (2008) melaporkan hasil amplifikasi gen CP 24 isolat ChiVMV yang berasal dari Taiwan, Thailand, India, China, dan Indonesia. Pasangan primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen CP isolat ChiVMV dari Indonesia (Pata-F1/R1) berbeda dengan pasangan primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen CP isolat ChiVMV dari negara lainnya (Poty 3 dan Oligo [dT]). Hal tersebut menjadi indikasi adanya perbedaan gen CP isolat ChiVMV dari Indonesia. Analisis sikuen gen CP ChiVMV menunjukkan tingkat homologi yang beragam. Lee et al. (2005) melaporkan gen CP ChiVMV memiliki kesamaan dengan ChiVMV isolat India (kode GeneBank Nc-005778) sebesar 87.1% dan 91.7% berturut-turut berdasarkan sikuen nukleotida dan asam amino. Moury et al. (2005) mempelajari hubungan kekerabatan 3 isolat ChiVMV dari Taiwan, Beijing, Thailand dan melaporkan bahwa ketiga isolat tersebut memiliki tingkat kesamaan sikuen nukleotida 90.3% sampai 92.8%. Analisis sikuen gen CP ChiVMV yang dilakukan oleh Tsai et al. (2008) menunjukkan bahwa 24 isolat ChiVMV dari Taiwan, Thailand, India, China, dan Indonesia memiliki tingkat kesamaan nukleotida dan asam amino berturut-turut 88.6% sampai 99.9% dan 95.1% sampai 100%. Berdasarkan analisis filogenetik sikuen nukleotida gen CP maka 24 isolat ChiVMV dikelompokkan menjadi 3 kelompok, kelompok pertama adalah semua isolat dari China dan Taiwan, 3 isolat dari Thailand, kelompok kedua adalah semua isolat dari Indonesia, 5 isolat dari Thailand, dan Chili vein-banding mottle virus (CVbMV), dan kelompok ketiga adalah semua isolat dari India dan Pepper vein-banding virus (PVBV) (Tsai et al. 2008). Karakterisasi molekuler ChiVMV yang telah dilaporkan umumnya berkaitan dengan ChiVMV isolat kuat yang menyebabkan penyakit pada tanaman cabai. Karakterisasi ChiVMV isolat lemah perlu dilakukan berkaitan dengan pemanfaatannya sebagai agens proteksi silang. Salah satu mekanisme proteksi silang adalah post transcriptional gene silencing (PTGS). Mekanisme ini sangat berkaitan dengan tingginya tingkat kesamaan sikuen antara isolat lemah dengan isolat kuat. Pada penelitian ini dilaporkan analisis sikuen gen CP dari 5 ChiVMV isolat lemah (KAR, SPR, SKT, CSR, dan PGL) yang potensial sebagai agens proteksi silang. Karakteristik molekuler ChiVMV isolat lemah didasarkan pada sikuen gen CP yang akan

57

menjadi informasi dasar untuk pengembangan strategi pengendalian penyakit melalui teknik proteksi silang.

Bahan dan Metode Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Rumah Kaca Cikabayan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dari bulan Desember 2011 sampai bulan April 2012. Isolat ChiVMV Lima isolat-isolat lemah ChiVMV yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat KAR, SPR, SKT, CSR, dan PGL yang merupakan hasil penelitian sebelumnya (“Interaksi antara Chili veinal mottle virus isolat lemah dengan Isolat Kuat” [BAB 5]). ChiVMV isolat lemah masing-masing diinokulasi secara mekanis ke tanaman cabai C.annuum IPB C13. Tanaman yang telah diinokulasi dipelihara dalam rumah kaca kedap serangga, selanjutnya digunakan untuk ekstraksi RNA. Deteksi ChiVMV Menggunakan Metode RT-PCR Metode RT-PCR terdiri atas 3 tahapan yaitu ekstraksi RNA total, reaksi transkripsi balik (reverse transcription), dan amplifikasi cDNA. Ekstraksi RNA total Ekstraksi RNA total dilakukan menurut metode Xprep dengan menggunakan Xprep Plant RNA Mini Kit (Phile, Korea). Sebanyak 0.1 g daun tanaman cabai yang terinfeksi digerus menggunakan pistil dan mortar yang sebelumnya diberi nitrogen cair hingga menjadi bubuk. Sebanyak 450 μl bufer XPRB yang telah ditambah 4.5 μl merkaptoetanol dimasukkan kedalam hasil gerusan. Sap yang dihasilkan dimasukkan kedalam tabung mikro 1.5 ml. Sap dipindahkan kedalam filter kolom putih, disentrifugasi dengan kecepatan 14 000 rpm selama 2 menit pada suhu kamar. Supernatan diambil dan dipindahkan ke tabung berukuran 2 ml, selanjutnya diberi 0.5 volume etanol 96% dan dicampurkan hingga homogen, kemudian dipindahkan ke XPPLR mini kolom merah, disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 1 menit. XPPLR mini kolom merah ditempatkan diatas tabung lalu ditambahkan 500 μl wash buffer 1, selanjutnya di sentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya XPPLR mini kolom merah ditempatkan diatas tabung dan ditambahkan 750 μl wash buffer 2, disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm selama 1 menit dan diulangi lagi 3 menit untuk mengeringkan kolom. XPPLR mini kolom merah dimasukkan lagi ke tabung ditambahkan 50 μl water free nuclease, didiamkan 1 menit, di sentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm selama 2 menit. Hasil ekstraksi RNA total disimpan pada suhu -80o C sampai akan digunakan.

58

RT-PCR Tabung mikro diisi dengan 25 μl reaksi transkripsi balik terdiri atas 7.5 μl water free nuclease, 5 μl bufer RT 5x, 5 μl dNTP 10 mM, 1.875 oligo d (T) 10 μM, 0.875 μl Rnase inhibitor, 0.875 μl MmLV Rpv, 0.875 μl dTT, 3 μl RNA sampel. Tabung mikro dimasukkan ke dalam thermal cycler ( Gene Amp PCR System 9700) dengan kondisi RT suhu 25oC selama 5 menit, 37 oC selama 90 menit dan 70 oC selama 15 menit. Hasil akhir adalah produk cDNA. Amplifikasi cDNA Amplifikasi cDNA ChiVMV pada daerah coat protein (CP) menggunakan pasangan primer ChiVMV F Ind (1st BASE) (5’ AACCTGAGCGTATAGTTTCA 3’) dan ChiVMV R Ind (1st BASE) (5’ TACGCTTCAGCAAGATTGCT 3’) (Tsai et al. 2008). Tabung mikro diisi dengan reaksi amplifikasi 25 μl terdiri atas 8.5 μl water free nuclease, 12.5 μl 2x kappa master mix, 1 μl primer ChiVMV F Ind, 1 μl primer ChiVMV R Ind, 2 μl cDNA dari RT. Tabung mikro dimasukkan ke dalam thermal cycler ( Gene Amp PCR System 9700). Amplifikasi ChiVMV sebanyak 35 siklus yaitu pemisahan utas DNA pada suhu 94oC selama 1 menit, penempelan primer pada DNA pada suhu 47 oC selama 1 menit dan sintesis DNA pada suhu 72 oC selama 2 menit, untuk siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 15 menit, siklus berakhir pada suhu 4 oC. Fragmen DNA hasil amplifikasi diamati secara elektroforesis pada agarosa 1% dalam larutan penyangga Tris-buffer EDTA (TBE 0.5x), dengan kekuatan 100 volt selama 20 menit. Ukuran produk amplifikasi PCR diperkirakan dengan pembanding menggunakan DNA standar (1 kb ladder), selanjutnya diamati menggunakan sinar UV setelah diberi etidium bromida (10 mg/l). Jika amplifikasi PCR berhasil akan diperoleh fragmen DNA dengan ukuran 900 pasang basa (Tsai et al. 2005). Perunutan dan Analisis Sikuen Gen CP ChiVMV Hasil amplifikasi sampel DNA digunakan untuk mengetahui sikuen nukleotida. Perunutan DNA semua sampel ChiVMV isolat lemah dilakukan di Laboratorium Genetica Science di Singapore. Hasil perunutan selanjutnya digunakan untuk analisis keragaman berdasarkan tingkat kesamaan sikuen nukleotida. Sikuen nukleotida ChiVMV dibandingkan dengan sikuen nukleotida ChiVMV yang tersimpan di GeneBank menggunakan software Blast2.Wu (www.EBI.ac.uk). Analisis similaritas dilakukan dengan membandingkan homologi gen CP ChiVMV isolat lemah dengan 9 isolat ChiVMV dari beberapa negara dan 1 isolat CTV (sebagai out group) (Tabel 7.1) Matriks identitas nukleotida dan asam amino diperoleh dengan mengunakan software Bioedit. Analisis filogenetika menggunakan fasilitas yang tersedia pada http://www.genebee.msu.su.

59

Tabel 7.1 Sikuen nukleotida Chili veinal mottle virus yang berasal dari GeneBank yang digunakan sebagai pembanding pada analisis keragaman isolatisolat lemah ChiVMV No Isolat Daerah asal Kode aksesi Aksesor* 1 CKB Indonesia DQ854960 Tsai et al. 2008*** 2 Pataruman Indonesia DQ854961 Tsai et al. 2008*** 3 Wenchang China GQ981316 Wu et al. 2009** 4 S7 India EF213700 Reddy et al. 2007** 5 HCH9 India EF213695 Reddy et al. 2007** 6 D10 India EF221615 Reddy et al. 2007** 7 Ca Korea Selatan AJ972878 Yoon et al. 2008** 8 CM1 Thailand AB012221 Ikegami et al. 1999*** 9 VN/C2 Vietnam DQ925441 Ha et al. 2008*** 10 CTV-8 Portugal JQ655276 Cerni dan Nelasco 2012** *Aksesor yang mendaftarkan sikuen isolat ChiVMV ke GeneBank; - tidak terdaftar di GeneBank, ** tidak dipublikasikan pada jurnal; *** dipublikasikan pada jurnal.

Hasil dan Pembahasan Amplifikasi DNA dan Perunutan Nukleotida Gen CP Pita DNA berukuran 900 bp berhasil teramplifikasi dari 5 ChiVMV isolat lemah dan 1 isolat kuat ChiVMV-CKB menggunakan pasangan primer ChiVMV F Ind dan ChiVMV R Ind (Gambar 7.1). Setelah dilakukan perunutan nukleotida diperoleh urutan nukleotida sepanjang 913, 907, 907, 905, dan 906 berturut-turut untuk isolat (KAR, SPT, SPR, CSR, dan PGL) (Gambar 7.2) M

1

2

3

4

5

6

7

900 bp

Gambar 7.1 Visualisasi pita DNA hasil amplifikasi dengan primer ChiVMV F Ind dan ChiVMV R Ind pada gel agarosa TBE; M) marker (1 kb ladder), 1) tanaman sehat, 2) KAR, 3) SKT, 4) SPR, 5) CKB, 6) CSR, dan 7) PGL.

60

10 20 30 40 50 60 70 .. ..| .... |.. ..| ... .|.. ..| ... .|.. ..| ... .|. ...| ... .|. ...| ... .|. ... |... .|

KAR SPR SKT CSR PGL CKB_2

AACCTGAGGCGTATAGTTTCAATTCTAGACTGAGGGCAAGACTGTACAACCAGAACACCGACTTGAAGCC AACCTGAAGCGTATAGTTTCAATTCTTGAATG-GGATAGAGCTGAACAGCCAGAACATCGACTTGAAGCT AACCTGAGGCGTATAGTTTCAATTCTTGAGTG-GGATAGAGCTGAACAGCCAGAACATCGACTTGAAGCT AACCTGAGGCGTATAGTTTCAATTCTAGAATG-GGATAGGGCTGAACAACCAGAACACCGACTTGAAGCC AACCTGAAGCGTATAGTTTCAATTCTAGAATG-GGATAGGGCTGAAAAACCAGAACACCGACTTGAAGCC AACCTGA-GCGTATAGTTTCAATTCTAGAATG-GGATAGGGCTGAACAACCAGAACACCGACTTGAAGCC 80 90 100 110 120 130 140 .. ..| .... |.. ..| ... .|.. ..| ... .|.. ..| ... .|. ...| ... .|. ...| ... .|. ... |... .|


ATTTGTGCATCTATGATTGAAGCGTGGGGTTACAAGGAACTTTTACATGAGATAAGGCTTTTCTATAAGT ATTTGTGCATCTATGATTGAAGCATGGGGATACAAAGAACTACTACATGAGATAAGGCTTTTCTATAAAT ATTTGTGCATCTATGATTGAAGCATGGGGTTACAAAGAACTATTACATGAGATAAGGCTTTTCTATAAAT ATTTGTGCATCTATGATTGAAGCGTGGGGTTACAGGGAACTTTTACATGAGATAAGGCTTTTCTATAAGT ATTTGTGCATCTATGATTGAAGCGTGGGGTTACAGGGAACTTTTACATGAGATAAGGCTTTTCTATAAGT ATTTGTGCATCTATGATTGAAGCGTGGGGTTACAAGGAACTTTTACATGAGATAAGGCTTTTCTATAAGT 150 160 170 180 190 200 210 .. ..| .... |.. ..| ... .|.. ..| ... .|.. ..| ... .|. ...| ... .|. ...| ... .|. ... |... .|


GGGTGATTGAACAAGCACCATACTCACAACTTGTTTCTGAGGGAAAAGCACCATACATTTCAGAAACAGC GGGTGATCGAGCAAGCACCATATTCACAACTTGTCTCTGAGGGAAAGGCACCATACATCTCAGAAACAGC GGGTGATCGAGCAAGCACCATATTCACAACTTGTCTCCGAGGGAAAGGCACCATACATCTCAGAAACAGC GGGTGATTGAACAAGCACCATACTCACAACTTGTTTCTGAGGGAAAAGCACCATACATTTCAGAAACAGC GGGTGATTGAACAAGCACCATACTCACAACTTGTTTCTGAGGGAAAAGCACCATACATTTCAGAAACAGC GGGTGATTGAACAAGCACCATACTCACAACTTGTTTCTGAGGGAAAAGCACCATACATTTCAGAAACAGC 220 230 240 250 260 270 280 .. ..| .... |.. ..| ... .|.. ..| ... .|.. ..| ... .|. ...| ... .|. ...| ... .|. ... |... .|


ATTGAGATGCCTCTACATGAGTGGACATGGAGAAAGTGATATCAGCCCATATTTGAGAGCACTCATTGAA ACTGAGGTGCCTCTACATGAGTGAGCATGGAGAGAGTGACATTAGTCCATATTTGAGAGCACTCATTGAA ACTGAGGTGCCTCTACATGAGTGAGCATGGAGAGAGTGACATTAGTCCATATTTGAGAGCACTCATTGAA ATTGAGATGTCTCTACATGAGTGAACATGGAGAAAGTGATATCAGCCCATATCTGAGAGCACTTATTGAA ATTGAGATGTCTCTACATGAGTGAACATGGAGAAAGTGATATCAGCCCATATCTGAGAGCACTTATTGAA ATTGAGATGTCTCTACGTGAGTGAACATGGAGAAAGTGATATCAGCCCATATCTGAGAGCACTTATTGAA 290 300 310 320 330 340 350 .. ..| .... |.. ..| ... .|.. ..| ... .|.. ..| ... .|. ...| ... .|. ...| ... .|. ... |... .|


GGAGCTAGGAGGGAAGAATTAGATGATGAGAGTGGAGAAGTTACCCATCAGTCGGGAGAGAGTGTTGATG GGGGCCAAGGAGGAAGGATTAGATGACGAGGGTGGGGAAGTTGCCCATCAGTCGGGAGAGAGCGTTGATG GGGGCCAAGGAGGAAGGATTAGATGACGAAGGTGGGGAAGTTGCCCATCAGTCAGGAGAGAGCATTGATG GGAGCTAGGAGGGAAGAATTAAATGATGAGGGTGGAGAAGTTACCCATCAGTCGGGAGAAAGTGTTGATG GGAGCTAGGAGGGAAGAATTAAATGATGAGGGTGGAGAAGTTACCCATCAGTCGGGAGAAAGTGTTGATG GGAGCTAGGAGGGAAGAATTAAATGATGAGGGTGGAGAAGTTACCCATCAGTCGGGAGAGAGTGTTGATG 360 370 380 390 400 410 420 .. ..| .... |.. ..| ... .|.. ..| ... .|.. ..| ... .|. ...| ... .|. ...| ... .|. ... |... .|


CTGGAAGAATAAAAGGTGAAGATTCTTCAAACAAGTCAGCTGATAAACAAGCCACAGATAAGAAGAGCAA CTGGAAGAGTTAAGGGCGAAGACTCATCGAGTAAACCAGCTGACAAACAAGCCACAGAGAAGAAGAGCAA CTGGAAGGGTTAAGGGTGAAGACTCATCGAGTAAACCAGCTGACAAACAAGCCACAGAGAAGAAGAGCAA CTGGGAGAGTAAAAGGTGAAGATTCTTCAAATACGTCAGCTGATAAACAAGCCACAGATAAGAAGAACAA CTGGGAGAGTAAAAGGTGAAGATTCTTCAAATACGTCAGCTGATAAACAAGCCACAGATAAGAAGAACAA CTGGGAGAGTAAAAGGTGAAGATTCTTCAAATAAGTCAGCTGATAAACAAGCCACAGATAAGAAGAACAA 430 440 450 460 470 480 490 .. ..| .... |.. ..| ... .|.. ..| ... .|.. ..| ... .|. ...| ... .|. ...| ... .|. ... |... .|


GGTAAGTGAACAAGCTCAGCCACAATCTCGTCAGAGCGAAATGGAAGTACCTCAAGTTCGAGACAGAGAT GGTAAGTGGACAAGCTCAACCACAGTCTCGTCAGAGTGAAATGGAAGTACCCCAAGTTCGAGACAGAGAT GGTAAGTGGACAAGCTCAGCCACAATCTCGTCAGAGTGAAATGGAGGTACCCCAAGTTCGAGACAGAGAC GGTAAGTGGACAAGTTCAGCCACAATCTCGTCAGAGCGAAATGGAAGTACCTCAAGTTCGAGACAGAGAT GGTAAGTGGACAAGTTCAGCCACAATCTCGTCAGAGCGAAATGGAAGTACCTCAAGTTCGAGACAGAGAT GGTAAGTGGACAAGTTCAGCCACAATCTCGTCAGAGCGAAATGGAAGTACCTCAAGTTCGAGACAGAGAT

Gambar 7.2 Perbandingan hasil sikuen nukleotida 5 isolat lemah ChiVMV dan isolat kuat CKB-2 (GeneBank aksesi DQ854960). Huruf dengan latar belakang hitam menunjukkan kesamaan sikuen, sedangkan huruf dengan latar belakang putih menunjukkan ketidaksamaan sikuen dengan isolat lainnya. Allignment menggunakan software Bioedit versi 7.0.0 (Isis Pharmaceuticals, Inc).

61

500 510 520 530 540 550 560 . . .. | . .. . | . .. . | .. . . |. . . .| . . . .| . . .. | . .. . | .. . . |. . . . |. . . .| . . .. | . .. . | . .. . |


GTTAATGTTGGGACCTCAGGGACATTCACAATACCGCGTCTCAAGGGTATTTCCTCAAAGTTAACAATAC GTTAATGTTGGGACCTCAGGGACATTCACAATACCGCGTCTCAAGGGTATTTCTTCAAAGTTAACAATAC GTTAATGTTGGGACCTCAGGGACATTCACAATACCGCGTCTCAAGGGTATTTCTTCAAAGTTAACAATAC GTTAATGTTGGGACCTCAGGGACATTCACAATACCGCGTCTTAAGGGTATTTCTTCAAAGTTAACAATAC GTTAATGTTGGGACCTCAGGGACATTCACAATACCGCGTCTTAAGGGTATTTCTTCAAAGTTAACAATAC GTTAATGTTGGGACCTCAGGGACATTCACAATACCGCGTCTTAAGGGTATTTCTTCAAAGTTAACAATAC 570 580 590 600 610 620 630 . . .. | . .. . | . .. . | .. . . |. . . .| . . . .| . . .. | . .. . | .. . . |. . . . |. . . .| . . .. | . .. . | . .. . |


CAAAGATTAAAACAAAGGCTGTTGTTAACCTTGAACACCTTCTTGATTATGCCCCTGAGCAAATACATTT CAAAGATCAAAACAAAGGCTGTTGTTAACCTTGAACACCTTCTTGATTATGCCCCTGAGCAAATACATTT CAAAGATCAAAACAAAGGCTGTTGTTAACCTTGAACACCTTCTTGATTATGCCCCTGAGCAAATACATTT CAAAGATTAAAACAAAGGCTGTTGTTAACCTTGAACACCTTCTTGATTATGCCCCTGAGCAAATACATTT CAAAGATTAAAACAAAGGCTGTTGTTAACCTTGAACACCTTCTTGATTATGCCCCTGAGCAAATACATTT CAAAGATTAAAACAAAGGCTGTTGTTAACCTTGAACACCTTCTTGATTATGCCCCTGAGCAAATACATTT 640 650 660 670 680 690 700 . . .. | . .. . | . .. . | .. . . |. . . .| . . . .| . . .. | . .. . | .. . . |. . . . |. . . .| . . .. | . .. . | . .. . |


GAGTAATACAAGGGCATTACAATCACAATTTGCATCCTGGTATGAAGGTGTTAAGAATGACTATGATGTC AAGTAATACAAGGGCATTACAATCACAATTTGCATCTTGGTATGAAGGTGTTAAGAATGACTATGATGTC AAGTAATACAAGGGCATTACAATCACAATTTGCATCTTGGTATGAAGGTGTTAAGAATGACTATGATGTC GAGTAATACAAGGGCATTACAATCACAATTTGCATCCTGGTATGAAGGTGTTAAGAATGACTACGATGTC GAGTAATACAAGGGCATTACAATCACAATTTGCATCCTGGTATGAAGGTGTTAAGAATGACTACGATGTC GAGTAATACAAGGGCATTACAATCACAATTTGCATCCTGGTATGAAGGTGTTAAGAATGACTATGATGTC 710 720 730 740 750 760 770 . . .. | . .. . | . .. . | .. . . |. . . .| . . . .| . . .. | . .. . | .. . . |. . . . |. . . .| . . .. | . .. . | . .. . |


ACAGATGAACAGATGCAAATAATACTGAATGGATTGATGGTTTGGTGTATTGAGAATGGAACGTCACCAA ACAGATGAACAGATGCAAATAATATTGAATGGATTGATGGTTTGGTGTATTGAGAATGGAACGTCACCAA ACAGATGAACAGATGCAAATAATATTGAATGGATTGATGGTTTGGTGTATTGAGAATGGAACGTCACCAA ACAGATGAACAGATGCAAATAATACTGAACGGATTGATGGTTTGGTGTATTGAGAATGGAACGTCACCAA ACAGATGAACAGATGCAAATAATACTGAACGGATTGATGGTTTGGTGTATTGAGAATGGAACGTCACCAA ACAGATGAACAGATGCAAATAATACTGAACGGATTGATGGTTTGGTGTATTGAGAATGGAGCGTCACCAA 780 790 800 810 820 830 840 . . .. | . .. . | . .. . | .. . . |. . . .| . . . .| . . .. | . .. . | .. . . |. . . . |. . . .| . . .. | . .. . | . .. . |


ACATCAATGGTTATTGGGTTATGATGGATGGAGATGAGCAAGTTGAATATCCAATAAAAGCCATTGATTG ATATCAACGGTTATTGGGTTATGATGGATGGAGATGAACAAGTTGAATATCCAATAAA-GCCATTGATTG ATATCAATGGTTTTTGGGTTATGATGGATGGAGATGAACAAGTTGAATATCCAATAAA-GCCATTGATTG ACATCAATGGTTATTGGGTTATGATGGATGGAGATGAACAAGTTGAATATCCAATAAA-GCCATTAATTG ACATCAATGGTTATTGGGTTATGATGGATGGAGATGAACAAGTTGAATATCCAATAAA-GCCATTAATTG ACATCAATGGTTATTGGGTTATGATGGATGGAGATGAACAAGTTGAATATCCAATAAA-GCCATTGATTG 850 860 870 880 890 900 . . .. | . .. . | . .. . | .. . . |. . . .| . . . .| . . .. | . .. . | .. . . |. . . . |. . . .| . . .. | . .. .


ACCATGCCAAACCATCATTTAGACAAATCATGGCGCATTTTAGCAATCTTGCTG-GAAAGCGTA ATCATGCTAAACCATCATTTAGACAAATCATGGCGCATTTTAGCAATCTTGCTGGAAGCGTAAA ATCATGCTAAACCTTCATTTAGACAAATCATGGCGCATTTTAGCAATCTTGCTGAAAGCGTAAA ACCATGCCAAACCATCATTTTGACAAATCATGGCGCATTTTAGCAATCTTGCTG-AAGCGTAAA ACCATGCCAAACCATCATTTACACAAATCATGGCGCATTTTAGCAATCTTGCTG-AAGCGTAAA ACCATGCCAAACCATCATTTAGACAAATCATGGCGCATTTTAGCAATCTTGCTG-AAGCGTATA

Gambar 7.2.Lanjutan.

62

Berdasarkan hasil penyejajaran (allignment) sikuen nukleotida tersebut ditemukan perbedaan sebanyak 99 posisi basa yang tidak sama urutannya pada kelima ChiVMV isolat lemah dan satu isolat kuat ChiVMV-CKB. Terdapat 51 posisi basa yang sama pada isolat lemah ChiVMV-SPR dan SKT tetapi berbeda pada isolat lemah ChiVMV-KAR, CSR, dan PGL. Ditemukan juga 5 posisi basa yang sama pada isolat lemah ChiVMV-CSR dan PGL tetapi berbeda pada isolat lemah ChiVMV-KAR, SPR dan SKT (Gambar 7.2). Perbedaan sikuen antara isolat lemah dilaporkan pula oleh Wang et al. (2004) dimana isolat lemah ZYMV2002 memiliki perbedaan sebanyak 14 nukleotida dengan isolat ZYMV Z5-1, walaupun kedua isolat mempunyai 9593 nukleotida yang mengkode poliprotein 3080 asam amino.

Analisis Homologi Isolat-isolat Lemah ChiVMV Berdasarkan Sikuen nukleotida Gen CP Berdasarkan analisis homologi sikuen nukleotida gen CP kelima ChiVMV isolat lemah memiliki tingkat kesamaan satu sama lain 92.8% sampai 99.6%. Isolat lemah ChiVMV-CSR dan PGL memiliki hubungan paling dekat dengan tingkat kesamaan sikuen nukleotida 99.6%, dan isolat SPR memiliki hubungan dekat dengan isolat lemah ChiVMV-SKT dengan tingkat kesamaan sikuen nukleotida 97.5%. Kelima ChiVMV isolat lemah memiliki tingkat kesamaan berkisar 92.6% sampai 98.1% dengan isolat kuat ChiVMV-CKB (Tabel 7.2). Tingkat kesamaan yang tinggi antara isolat-isolat ChiVMV tersebut memberikan indikasi bahwa isolat ChiVMV Indonesia memiliki variasi genetik yang rendah. Menurut kriteria Moury et al. (2005) dan Zhao et al. (2003) bahkan dinyatakan bahwa isolat-isolat virus yang memiliki tingkat kesamaan ≥ 90% dapat dinyatakan sebagai isolat virus yang identik. Tingkat kesamaan yang tinggi juga terjadi antara kelima ChiVMV isolat lemah dengan ChiVMV isolat Pataruman yang diidentifikasi oleh Tsai et al. (2008) yaitu berkisar antara 92.8% sampai 99.6%, dengan isolat ChiVMV-S7 (93% sampai 94.1%), isolat ChiVMV-HCH9 (92% sampai 93.3%), dan isolat ChiVMV-D10 (91.8% sampai 93.5%) (Tabel 7.2).

63

Tabel 7.2 Homologi Chili veinal mottle virus isolat lemah dan isolat ChiVMV dari beberapa negara berdasarkan sikuen nukleotida gen CP Tingkat kesamaan (%)* No.

Isolat

1

2

3

4

5

6

7

1

KAR

-

2

SPR

93.9

-

3

SKT

93.4

97.5

-

4

CSR

96.7

93.5

93.0

-

5

PGL

96.9

93.3

92.8

99.6

-

6

CKB

96.9

93.2

92.6

97.9

98.1

-

7

Pataruman

96.6

93.0

92.0

95.0

95.2

95.2

-

8

Wenchang

89.6

91.3

90.9

90.0

90.1

90.0

89.2

9

8

9

10

11

12

13

14

15

-

S7

93.2

94.1

93.2

93.0

93.2

92.8

92.6

91.3

-

10

HCH9

93.0

93.3

92.8

92.0

92.2

91.7

92.0

89.6

93.7

-

11

D10

92.8

93.5

93.0

91.8

92.0

91.6

91.6

90.0

93.9

97.1

-

12

Ca

88.3

90.0

89.6

88.4

88.6

88.4

88.1

93.0

90.5

90.0

89.8

-

13

CM1

89.2

90.3

90.0

88.6

88.8

88.3

87.9

91.6

90.3

89.8

89.8

91.3

-

14

VN/C2

91.7

92.4

91.5

90.7

90.9

90.5

90.7

89.0

92.6

92.0

91.6

88.1

87.3

-

15

CTV_8

37.7

37.3

36.9

37.9

38.0

37.7

38.2

37.7

37.9

37.1

37.1

37.7

37.9

36.9

* Tingkat kesamaan nukleotida dihitung menggunakan software Bioedit versi 7.0.0 (Isis Pharmaceuticals, Inc).

Gambar 7.3 Pohon filogenetika berdasarkan sikuen nukleotida Chili veinal mottle virus, dibuat dengan software Geenbee yang tersedia pada http://www.genebee.msu.su.

-

64

Dari hasil allignment oleh Moury et al. (2005) antara sesama isolat ChiVMV mempunyai kesamaan sikuen nukleotida sebesar 90.3% sampai 92.8%, kemudian Tsai et al. (2008) menyatakan dari 24 isolat ChiVMV yang diuji ternyata menunjukkan kesamaan sikuen nukleotida sebesar 89.9% sampai 99.9%, dan dengan isolat ChiVMV meliputi PVBV, CVbMV dan CVbMV-CM1 sebagai pembanding menunjukkan kesamaan sikuen nukleotida sebesar 89.5% sampai 97.8%. Analisis filogenetik menggunakan perbedaan sikuen nukleotida dari 5 isolat ChiVMV yang diuji dan sikuen ChiVMV lain yang tersedia di GeneBank menunjukkan terbentuknya 2 kelompok, kelompok pertama terdiri dari isolat ChiVMV-KAR, CSR, PGL, CKB, Pataruman, SPR, SKT, S7, HCH9, D10, dan VN/C2, kelompok kedua terdiri dari isolat ChiVMV-Ca, Wenchang, dan CM1. Kelima ChiVMV isolat lemah membentuk kelompok yang sama dengan isolat kuat ChiVMV-CKB, pengelompokan ini menunjukkan bahwa keenam isolat tersebut memiliki kekerabatan yang sangat erat. ChiVMV isolat lemah terbagi lagi menjadi 2 sub kelompok, yaitu sub kelompok pertama terdiri dari isolat lemah ChiVMV-KAR, CSR, dan PGL, dan sub kelompok kedua yaitu isolat lemah ChiVMV-SPR dan SKT. Isolat lemah ChiVMV-CSR dan PGL dekat dengan isolat kuat ChiVMV-CKB, ke 3 isolat tersebut berasal dari pertanaman cabai di provinsi Jawa Barat. isolat lemah ChiVMV-SKT lebih dekat dengan isolat lemah ChiVMV-SPR, kedua isolat tersebut diperoleh dari provinsi Sumatera Barat. Sedangkan isolat lemah ChiVMV-KAR yang diperoleh dari provinsi Jambi lebih dekat hubungan kekerabatannya dengan isolat ChiVMV dari Jawa Barat (Gambar 7.3). Hasil tersebut menunjukkan kecendrungan adanya hubungan kekerabatan yang berkorelasi dengan daerah asal isolat.

Analisis Homologi Isolat-isolat Lemah ChiVMV Berdasarkan Sikuen Asam Amino Gen CP Berdasarkan hasil penyejajaran sikuen asam amino terdapat perbedaan sebanyak 51 posisi asam amino yang tidak sama pada kelima ChiVMV isolat lemah. Antara isolat lemah ChiVMV-SPR dan SKT terdapat perbedaan sebanyak 9 asam amino dengan isolat lemah ChiVMV-KAR, CSR, dan PGL, sedangkan antara isolat lemah ChiVMV-CSR dan PGL dengan isolat lemah ChiVMV-KAR, SPR dan SKT terdapat perbedaan sebanyak 2 asam amino (Gambar 7.4). Perbandingan sikuen asam amino antara 5 ChiVMV isolat lemah dengan 9 isolat ChiVMV dari berbagai negara menunjukkan kesamaan sikuen asam amino sebesar 88.0% sampai 99.6%. Perbandingan 5 isolat lemah ChiVMV dengan 2 isolat ChiVMV Indonesia (CKB dan Pataruman) menunjukkan kesamaan sikuen asam amino sebesar 90.8% sampai 97.5%. Perbandingan antara sesama ChiVMV isolat lemah menunjukkan kesamaan sikuen asam amino sebesar 90.5% sampai 99.6%. Penyejajaran antar sesama ChiVMV isolat lemah menunjukkan kesamaan sikuen asam amino tertinggi yaitu 99.6% antara isolat ChiVMV-CSR dan PGL (Tabel 7.3).

65

10 20 30 40 50 60 70 .... |....|....|.... |....|.... |.... |....|....|.... |....|....|....|....|


GV-FQF-TEGKTVQPEHRLEAICASMIEAWGYKELLHEIRLFYKWVIEQAPYSQLVSEGKAPYISETALR KRIVSILEWDRAEQPEHRLEAICASMIEAWGYKELLHEIRLFYKWVIEQAPYSQLVSEGKAPYISETALR RRIVSILEWDRAEQPEHRLEAICASMIEAWGYKELLHEIRLFYKWVIEQAPYSQLVSEGKAPYISETALR RRIVSILEWDRAEQPEHRLEAICASMIEAWGYRELLHEIRLFYKWVIEQAPYSQLVSEGKAPYISETALR KRIVSILEWDRAEKPEHRLEAICASMIEAWGYRELLHEIRLFYKWVIEQAPYSQLVSEGKAPYISETALR ERIVSILEWDRAEQPEHRLEAICASMIEAWGYKELLHEIRLFYKWVIEQAPYSQLVSEGKAPYISETALR 80 90 100 110 120 130 140 .... |....|....|.... |....|.... |.... |....|....|.... |....|....|....|....|


CLYMSGHGESDISPYLRALIEGARREELDDESGEVTHQSGESVDAGRIKGEDSSNKSADKQATDKKSKVS CLYMSEHGESDISPYLRALIEGAKEEGLDDEGGEVAHQSGESVDAGRVKGEDSSSKPADKQATEKKSKVS CLYMSEHGESDISPYLRALIEGAKEEGLDDEGGEVAHQSGESIDAGRVKGEDSSSKPADKQATEKKSKVS CLYMSEHGESDISPYLRALIEGARREELNDEGGEVTHQSGESVDAGRVKGEDSSNTSADKQATDKKNKVS CLYMSEHGESDISPYLRALIEGARREELNDEGGEVTHQSGESVDAGRVKGEDSSNTSADKQATDKKNKVS CLYVSEHGESDISPYLRALIEGARREELNDEGGEVTHQSGESVDAGRVKGEDSSNKSADKQATDKKNKVS 150 160 170 180 190 200 210 .... |....|....|.... |....|.... |.... |....|....|.... |....|....|....|....|


EQAQPQSRQSEMEVPQVRDRDVNVGTSGTFTIPRLKGISSKLTIPKIKTKAVVNLEHLLDYAPEQIHLSN GQAQPQSRQSEMEVPQVRDRDVNVGTSGTFTIPRLKGISSKLTIPKIKTKAVVNLEHLLDYAPEQIHLSN GQAQPQSRQSEMEVPQVRDRDVNVGTSGTFTIPRLKGISSKLTIPKIKTKAVVNLEHLLDYAPEQIHLSN GQVQPQSRQSEMEVPQVRDRDVNVGTSGTFTIPRLKGISSKLTIPKIKTKAVVNLEHLLDYAPEQIHLSN GQVQPQSRQSEMEVPQVRDRDVNVGTSGTFTIPRLKGISSKLTIPKIKTKAVVNLEHLLDYAPEQIHLSN GQVQPQSRQSEMEVPQVRDRDVNVGTSGTFTIPRLKGISSKLTIPKIKTKAVVNLEHLLDYAPEQIHLSN 220 230 240 250 260 270 280 .... |....|....|.... |....|.... |.... |....|....|.... |....|....|....|....|


TRALQSQFASWYEGVKNDYDVTDEQMQIILNGLMVWCIENGTSPNINGYWVMMDGDEQVEYPIKAID-PC TRALQSQFASWYEGVKNDYDVTDEQMQIILNGLMVWCIENGTSPNINGYWVMMDGDEQVEYPIKPLIDHA TRALQSQFASWYEGVKNDYDVTDEQMQIILNGLMVWCIENGTSPNINGFWVMMDGDEQVEYPIKPLIDHA TRALQSQFASWYEGVKNDYDVTDEQMQIILNGLMVWCIENGTSPNINGYWVMMDGDEQVEYPIKPLIDHA TRALQSQFASWYEGVKNDYDVTDEQMQIILNGLMVWCIENGTSPNINGYWVMMDGDEQVEYPIKPLIDHA TRALQSQFASWYEGVKNDYDVTDEQMQIILNGLMVWCIENGASPNINGYWVMMDGDEQVEYPIKPLIDHA


QTII-TNHGAFQSCWKA KPSFRQIMAHFSNLAGS KPSFRQIMAHFSNLAES KPSF-QIMAHFSNLAEA KPSFTQIMAHFSNLAEA KPSFRQIMAHFSNLAEA

290 .... |....|....|..

Gambar 7. 4 Perbandingan hasil sikuen asam amino 5 isolat lemah Chili veinal mottle virus dan isolat kuat CKB-2 (GeneBank aksesi DQ854960). Huruf dengan latar belakang hitam menunjukkan kesamaan sikuen, sedangkan huruf dengan latar belakang putih menunjukkan ketidaksamaan sikuen dengan isolat lainnya. Allignment menggunakan software Bioedit versi 7.0.0 (Isis Pharmaceuticals, Inc).

66

Tabel 7.3 Homologi Chili veinal mottle virus isolat lemah dan isolat ChiVMV dari beberapa negara berdasarkan sikuen asam amino gen CP No

Tingkat kesamaan (%)*

Isolat 1

2

1

KAR

-

2

SPR

90.9

-

3

SKT

90.5

98.9

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

-

4

CSR

91.9

94.9

94.5

-

5

PGL

91.9

95.2

94.8

99.6

-

6

CKB

90.8

93.2

92.3

97.5

97.5

-

7

Pataruman

92.0

95.6

94.5

95.6

96.0

95.6

8

Wenchang

88.7

96.0

94.9

92.7

93.0

92.3

93.0

-

9

S7

90.1

97.0

96.0

94.5

94.9

93.7

94.5

94.1

-

10

HCH9

90.5

97.8

96.7

94.5

94.9

92.7

94.9

94.1

97.0

-

11

D10

90.9

98.1

97.0

94.9

95.2

93.2

95.2

94.5

97.4

98.9

12

Ca

88.0

96.0

94.9

91.6

92.0

89.9

92.3

94.5

93.8

94.5

94.9

-

13

CM1

88.0

95.2

94.1

92.7

93.0

91.3

93.4

94.9

95.2

95.2

95.6

93.8

-

14

VN/C2

87.2

94.9

93.8

92.0

91.6

88.9

91.6

91.6

93.4

94.5

94.5

90.9

91.6

-

15

CTV_8

10.9

10.4

9.9

10.9

10.9

10.9

10.9

10.4

10.4

9.9

10.4

9.9

10.4

9.9

-

-

-

* Tingkat kesamaan asam amino dihitung menggunakan software Bioedit versi 7.0.0 (Isis Pharmaceuticals, Inc).

Gambar 7.5 Pohon filogenetika berdasarkan sikuen asam amino Chili veinal mottle virus, dibuat dengan software Geenbee yang tersedia pada http://www.genebee.msu.su.

67

Antara 5 ChiVMV isolat lemah (KAR, SPR, SKT, CSR, dan PGL) dengan isolat kuat ChiVMV-CKB menunjukkan kesamaan sikuen asam amino masingmasing berturut-turut 90.8%, 93.2%, 92.3%, 97.5%, dan 97.5%. Kesamaan sikuen asam amino antara ChiVMV isolat lemah dengan isolat kuat ChiVMV-CKB tertinggi yaitu 97.5% terdapat pada isolat lemah ChiVMV-PGL dan CSR, sedangkan kesamaan sikuen asam amino terendah (90.8%) terdapat pada isolat lemah ChiVMV-KAR. Walaupun demikian secara umum kesamaan sikuen asam amino kelima ChiVMV isolat lemah dengan isolat kuat ChiVMV-CKB tergolong tinggi yaitu ≥ 90%. Perbandingan sikuen asam amino antara 7 isolat ChiVMV Indonesia (5 ChiVMV isolat lemah, CKB, dan Pataruman) dengan isolat ChiVMV dari negara lain menunjukkan kesamaan tertinggi (90.9% sampai 98.1%) dengan isolat D10 dari India, dan kesamaan terendah (87.2% sampai 94.9%) dengan isolat VN/C2 dari Vietnam (Tabel 7.3). Analisis kekerabatan sesama isolat ChiVMV yang digambarkan melalui pohon filogenetika asam amino menghasilkan 2 kelompok. Kelompok pertama terdiri dari isolat KAR, CSR, PGL, CKB, Pataruman, SPR, SKT, S7, HCH9, D10, CM1, Wenchang, Ca, kelompok kedua adalah isolat VN/C2. ChiVMV isolat lemah terpecah menjadi 2 sub kelompok sama halnya dengan filogenetika nukleotida, sub kelompok pertama adalah ChiVMV isolat lemah (KAR, CSR, dan PGL), dan sub kelompok kedua adalah ChiVMV isolat lemah (SPR, dan SKT). Bila dibandingkan antara pohon filogenetika nukleotida dengan asam amino tidak terdapat perbedaan pengelompokan ChiVMV isolat lemah, dengan demikian dapat dikatakan mutasi nukleotida pada ChiVMV isolat lemah tidak bermakna terhadap pohon filogenetika asam amino (Gambar 7.5). Pentingnya Karakter Molekuler Isolat Virus untuk Penerapan Proteksi Silang Derajat kesamaan sikuen nukleotida dan asam amino antara ChiVMV isolat lemah dengan isolat kuat ChiVMV-CKB dapat menentukan efektivitas proteksi silang. Dilaporkan oleh Hanssen et al. (2010) bahwa proteksi silang pada tanaman tomat yang terinfeksi Pepino mosaic virus (PepMV) lebih baik hasilnya bila menggunakan isolat lemah PepMV-CH2 dibandingkan menggunakan isolat lemah PepMV-EU atau -LP. Ternyata kesamaan sikuen nukleotida isolat lemah PepMV-CH2 dengan isolat kuat PepMV adalah 99.4%, sedangkan antara isolat lemah PepMV-EU dan -LP dengan isolat kuat adalah 79%. Hal yang sama dilaporkan untuk kasus Papaya ringspot virus (PRSV) oleh Yeh dan Gonsalves (1984) yaitu isolat lemah PRSV-P lebih efisien dibandingkan PRSV-W. Albiach-Marti et al. (2000) menyatakan bahwa CTV strain lemah mampu melindungi tanaman jeruk di Florida dan Spanyol karena strain lemah tersebut memiliki kesamaan sikuen yang tinggi terhadap CTV strain kuat. Lebih lanjut Zhou et al. (2002) membuktikan bahwa isolat lemah CTV-PB61 lebih efektif melindungi tanaman jeruk terhadap isolat kuat CTV-PB 235 dari pada isolat CTV-PB 155. Kesamaan sikuen nukleotida CP antara CTV-PB61 dan CTV-PB 235 lebih tinggi dari pada antara CTV-PB61 dan CTV-PB 155 yaitu masingmasing 97.6% dan 91.2%. Proteksi silang berhasil bila tanaman tidak menimbulkan gejala atau hanya menimbulkan gejala lemah setelah inokulasi strain kuat, sedangkan pada kontrol

68

(inokulasi dengan strain kuat saja) memperlihatkan gejala yang parah (You et al. 2005). Gen CP berperan penting dalam proteksi silang, karena coat protein virus strain lemah akan menghalangi uncoating virus strain kuat yang menginfeksi setelah strain lemah (Culver 1996; You et al. 2005). Selain mekanisme menghalangi uncoating strain kuat, mekanisme proteksi silang kemungkinan berkaitan dengan induksi RNA silencing (Gal-on dan Shiboleth 2006). Kedua mekanisme tersebut berlangsung dengan efisien bila virus-virus yang menginfeksi tanaman inang yang sama memiliki hubungan kekerabatan yang dekat.

KESIMPULAN Karakter molekuler ChiVMV isolat lemah (KAR, SPR, SKT, CSR, dan PGL) menunjukkan kesamaan sikuen nukleotida dan asam amino yang lebih dekat dengan isolat ChiVMV dari Indonesia (isolat Pataruman) dan India (isolat S7). Analisis filogenetika sikuen nukleotida dan asam amino menunjukkan bahwa kelima ChiVMV isolat lemah berada pada kelompok yang sama dengan isolat kuat ChiVMV-CKB.

7 KARAKTER MOLEKULER Chili veinal mottle virus ISOLAT LEMAH (Molecular Characterization of Weak Isolates of Chili veinal mottle virus)

Recommend Documents