15/03/2010
genové čipy
co to je genový čip (DNA microarray)? DNA šikování
• • •
nová technologie zavedená koncem devadesátých let geny nebo fragmenty genů (cDNA, EST) jsou roboticky v přesně daných souřadnicích umístěny na mikroskopické sklo (plast) takto vytvořený genový čip se hybridizuje s RNA nebo cDNA určitého vzorku a následně počítačově srovná se standardem
Northern Blot imobilizována mRNA se hybridizuje se značenou probou reprezentující jeden gen DNA Microarray imobilizované proby hybridizují se značenou mRNA reprezentující všechny exprimované geny
1
15/03/2010
princip genových čipů • do jednoho čipu lze uložit informaci celého genomu (až 50.000) • komerčně připravované čipy se prodávají pro celé organismy, které mají odsekvencovaný genom • u vlastních microarray se používají jen krátké oligonukleotidy reprezentující p j jjednotlivé ggenyy o známe funkci a všechnyy další EST získané z daného organismu • velice náročná příprava (imobilizace desetitisíců prób na velmi malé ploše •
následuje označení srovnávaných populací mRNA většinou fluorescenčně
•
p promytí y takto označené mRNA čipem
•
vyhodnocení rozdílů – je není exprimovaný
•
u nejmodernějších i jak moc
•
vše je řízeno počítačově
Human ~ 30,000 genes
Mouse ~ 30,000 genes
Yeast ~ 6200 genes
E. coli ~ 4200 genes
Phage T4 ~ 200 genes Influenza ~ 12 genes
Macroarray & Microarray & DNA Chips Micro a macroarray: lepené Próby [0.6 kb - 2.4 kb] jsou PCR amplifikované celé cDNA nebo EST [expressed sequence tags] sekvence. Jsou roztříděny a přilepeny roboticky na nepórozní pevný nosič (plast). macroarray 1000 skvrn microarray 10000 skvrn.
DNA čipy: syntetizované umělé (Affymetrix technologie) Próby jsou 20-25 deoxyoligonucleotidy syntetizované na sklo speciální technikou (fotolitografie) Komerční čipy mají 300.000 prób na 3 cm2 Experimentální čipy i s miliónem prób na array.
2
15/03/2010
práce s genovým čipem
Affymetrix technologie 1.28cm
50um
3
15/03/2010
fotolitografie
metoda pro syntézu Affymetrix čipů
• wafer (křemíková destička se předem promyje a aktivuje (reakční hydroxylové skupiny) • ponoří se do silanu který zajistí jednolitou rovnoměrnou vrstvu • ta se překryje maskou která je řízená počítačem a na přesně daných místech se ppak světlem aktivuje j hydroxy y y skupina p na kterou se syntetizuje přesně určený nukleotid (podle databáze) • opět se překryje vrstvou silanu a maskou • maska se přesune a opět aktivuje světlem • a opakuje se 25x • syntéza 25-oligonukleotidu • na jeden gen několik prób
Affymetrix technologie • každé místo próby je obsazeno 22 oligonukleotidy reprezentující jeden gen • 11 z nich je tzv.perfect match (PM) přesně kopírují sekvenci genu • 11 z nich je mismatch (MM) liší se jedním nukleotidem v centrální pozici (12-1-12) • např. U133A human array, obsahuje přes 22.000 různých sekvencí (genů) které jsou reprezentovány zhruba v 500.000 oligonukleotidech
4
15/03/2010
Affymetrix GeneChips
referenční sekvence genu
5’
3’
vzorek mRNA
vymezení DNA próby
pairs …TGTGATGGTGGGAATGGGTCAGAAGGGACTCCTATGTGGGTGACGAGGCC…
TTACCCAGTCTTCCCTGAGGATACAC
Perfect match oligo
TTACCCAGTCTTGCCTGAGGATACAC
Mismatch oligo
Probe Set
PM MM
PM
Probe Pair
PM
Probe Cell
MM
PM - 25 bazí komplementárních k referenční sekvenci MM – prostřední báze je odlišná
Affymetrix technologie značení mRNA populace Cy3-dCTP Cy5-dCTP
5
15/03/2010
Affymetrix technologie značení mRNA populace cy3 and cy5: běžně používané fluorescenční značky cy5 664 nm
emission
cy3
510 nm
cy5
yellow cy3=cy5
emission red cy5>cy3 green cy3>cy5 cy3
www.amersham.com
6
15/03/2010
Affymetrix technologie
Affymetrix technologie
Agilent bioanalyzer
7
15/03/2010
Affymetrix technologie po promytí dvěma různýma populacemi mRNA se zeleným a červeným značením je celá array skenována a vyhodnocena ve speciálních programech nejdřív se vyhodnotí rozdíl mezi PM a MM (tím se velmi redukuje chyba) MM próby vychytávají nespecifický signál následně se srovnají vzájemně i t intenzity it v ideálním případě by dvě naprosto totožné populace mRNA dávali celou žlutou array PM MM
Affymetrix technologie
8
15/03/2010
Affymetrix technologie
PG2
• tento komerční genový čip obsahuje 5 arrayi • Array B,C,D,E obsahují 4x cca 12.000 prób pro klustry komprimované z lidských EST klonů • array A obsahuje b h j cca 12 12.000 000 prób ób pro lidské lid ké geny o známé funkci
• tento čip obsahuje genetickou informaci ze dvou organismů
Saccharomyces cerevisiae a Schizosaccharomyces pombe • čip obsahuje próby pro 5,841 5 841 z 55,845 845 všech genů přítomných v S.cerevisiae a 5,021 z 5,031 genů přítomných v S. pombe. • divergence mezi oběma kvasinkami proběhla zhruba před 500 milióny lety a proto je mezi nimi taková odlišnost, která vyžaduje samostatné próby. • informace z obou genomů je ale uložena pouze v jednom arrayi. • Sekvence pro navržení prób byly vygenerovány z veřejných databázi GenBank® (květen 2004) a Sanger Center (červen 2004)
9
Snímek 18 PG2
S. cerevisiae has approximately 5600 open reading frames; S. pombe has approximately 4970 open reading frames. S. cerevisiae has 16 chromosomes, S. pombe has 3. S. cerevisiae is often diploid while S. pombe is usually haploid. Both species share genes with higher eukaryotes that they do not share with each other. S. pombe has heterochromatin and RNAi machinery genes like those in vertebrates, while these are missing from S. cerevisiae. Conversely, S. cerevisiae has well developed peroxisomes, while Sch. pombe does not. galuszka; 19/03/2009
15/03/2010
další typ genového čipu jednotlivé array jsou rozděleny podle orgánu ze kterého byl získán daný EST
Lung 20,224 Liver 37,807 P Prostate t t 7,971 Skin 3,043
Brain 67,679
Brain
Lung
Heart 9,400 Colon 4,832
Liver
Liver Tumor
Bone 4,832
• vznikají i čipy pro organismy, které nemají odsekvenovaný genom • např. Affymetrix čip pro ječmen (srpen 2004) • přes 22.500 prób • z toho 1.145 známých genů (včetně alel) • z databázi bylo extrahováno zhruba 400.000 ječmenných EST klonů, ty byly počítačově zpracovány a bylo vytvořeno 26.634 26 634 kontigů a 24.396 singletonů • všechny tři zdroje byly znova zpracovány a bylo vybráno 22.500 jedinečných genů či jejich fragmentů s kompaktním 3´koncem pro vytvoření prób Potencionální využití studium t di kkvality lit sladu, l d kontrola proti škůdcům a nemocem, abiotický stres, nutriční charakteristika
10
15/03/2010
cena největší problém (2OO2)
využžití genových čip vyu ipů ů • • • • •
Studium exprese genů (regulace genů) Funkce nových genů (neobjevené metabolické pochody) Detekce mutantů Diagnóza nemocí(analýza polymorfismu) Hl dání nových Hledání n ý h léčebných léč bný h postupů p tupů (jestli (j li určitý či ý
ddruh h rakoviny zvyšuje expresi daných genů, můžeme zjistit které další podmínky způsobují expresi těchto genů a případně zjistit, která látka ji zpětně snižuje - potenciální lék)
• Farmakogenomika (testování nových léčiv před uvedením na trh) • Toxikogenomika (hledání korelace mezi odpovědi na toxickou látku a změny jí vyvolané v genetickém profilu)
11
15/03/2010
studium expres expresee gen genů ů
ZMĚNY V EXPRESI GENů VYVOLANÉ KOUŘENÍM transcriptony z buňek plicního epitelu nekuřáků, kuřáků, bývalých kuřáků a kuřáku různých ras a věku byly izolovány a podstoupeny hybridizaci z GeneChip® U133A NEKUŘÁCI • Bylo zjištěno že v jejich buňkách se exprimuje cca 2,000 genů • Exprese těchto genů není ovlivněna věkem, rasou ani pohlavím • Většina genů tvoří geny spojené z oxidativním stresem, ion/elektronové přenašeče, chaperony, vezikulární transportery atd.
.
KUŘÁCI . • Zvýšená exprese 97 genů – spojené s buněčnou adhezí, oxidativním stresem, metabolismem gluthationu, transportem elektronů, metabolismem a sekrecí xenobiotik a několik onkogenů • Downregulovány byly supresory tumorů a zánětové regulátory. • Profil tři dlouhodobých kuřáků stejný jako u nekuřáku !!! • Profil daleko výraznější u starších kuřáků • Pohlaví nemá vliv, rasa ano • Kavkazská rasa daleko slabší profil než negroidní BÝVALI KUŘÁCI • Návrat k normální expresi do dvou let • Stále vysoká hladina supresorů tumorů a některých onkogenů
.
VÝZNAM . • Objeveno spousta genů které nebyly s kouřením spojovány (metabolismus gluthationu) • Dají se identifikovat kuřáci s vysokým rizikem ke vzniku rakoviny plic
12
15/03/2010
• pro diagnostické účely se budou používat čipy s limitovaným počtem prób (metoda bude daleko levnější)- prediktivní medicína • Affymetrix technologie je značně spolehlivá (při testování 34 stejných vzorků byla 94-97% shoda).
• DNA bi biočipy či jjsou považovány ž á za nejobjevnější j bj ější genetický ti ký nástroj á t j poslední dekády
PROBLÉMY GENOVÝCH ČIP IPů ů: • znalost sekvence genu a míry její exprese mnohdy nestačí k předpovězeni povahy a množství proteinu jí kódovaného (mno množžství mRNA není vž vždy úměrné množ množství proteinu) proteinu • alternativní splicing – jeden gen produkuje více proteinů • syntéza proteinů je ovlivněna i vnějšími vlivy a může se lišit i v čase • význam proteomiky
13
15/03/2010
obrana proti bioterorismu
biologická válečná agens jsou bez barvy a bez zápachu a většinou trvá dny až týdny než vyvolají symptomy
obrana proti bioterorismu • nejnovější detektory biologických zbraní dokážou odlišit patogeny od neškodných organismů tím,že srovnávají jejich genetickou výbavu • systém GeneXpert nebo(americká firma Cepheid) • obsahuje koncentrátor vzduchu a filtr zachycující patogeny • dezintegrátor buněk • DNA patogenů pak jde do speciálního čipu obsahující ssDNA ze všech možných pathogenů, který má po stranách elektrody • čip se pak hybridizuje s krátkými komplementárními próbami značenými zlatými částečkami • pokud dojde k hybridizaci sepne se pomocí zlatých částeček obvod • jiný typ detektoru je založen na real-time l ti PCR • databáze TIGER triangulační genetická evaluace biologických rizik • amplifikace úseku genomu odpovědného za proteosyntesu, nelze zneužít mutací patogena
14
15/03/2010
• Swiss Federal Institute for Technology • sledování exprese 23,750 genů u modelové rostliny Arabidopsis thaliana v jednotlivých orgánech a v závislosti na ontogenezi, a biotických a abiotických faktorech • proč Arabidopsis? • 25 498 genů zhruba u 60% je předpovězena nebo objasněná funkce • databáze zpracovává data z 2317 arrayí (listopad 2005)
15
15/03/2010
16
